修飾ヌクレオチドを含む転写物を生成させるための材料および方法
修飾ヌクレオチド三リン酸が配列に導入されたアプタマー治療薬を生成するための、材料および方法が提供される。一実施形態において、本発明は、核酸を転写する方法を提供し、この方法は、ａ）（ｉ）修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（ｉｉ）少なくとも一つの核酸転写テンプレートおよび（ｉｉｉ）ヌクレオチド三リン酸を含む、転写反応混合物を調製するステップと；ｂ）一本鎖核酸が生じる条件下で、前記転写反応混合物を転写するステップとを含む、方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を転写する方法であり、
ａ）（ｉ）２’―ＯＭｅ ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ ＧＴＰ、２’―ＯＭｅ ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ ＴＴＰおよび２’―ＯＭｅ ＵＴＰより選択される２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ ＮＴＰ）のいずれかを導入することが可能な修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、前記修飾ＲＮＡポリメラーゼが、対応する非修飾ＲＮＡポリメラーゼの２’―修飾ＮＴＰを導入する能力と比較して、前記２’―修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―修飾ＮＴＰ）を導入する能力が増加している、修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、（ｉｉｉ）ヌクレオチド三リン酸であり、前記ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、前記グアニジン三リン酸が全て２’―ＯＭｅ修飾されている、ヌクレオチド三リン酸とを含む、転写反応混合物を調製するステップと；
ｂ）一本鎖核酸が生じる条件下で、前記転写反応混合物を転写するステップであり、前記生じる一本鎖核酸の、最初のグアノシンヌクレオチドの後の全てのグアニジンヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記転写反応混合物が、マグネシウムイオン、マンガンイオン、またはマグネシウムおよびマンガンイオンの両方をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸転写テンプレートが、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸転写テンプレートが、完全二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生じた一本鎖核酸における最初のグアノシヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ポリメラーゼに対して６３９位および７８４位で改変されたアミノ酸を含み、前記７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには、前記６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位にロイシン、７８４位にアラニンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖オリゴヌクレオチド転写テンプレートが、前記オリゴヌクレオチド転写テンプレートの５’末端の固定領域に導入されたリーダー配列をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記リーダー配列が、全てプリンのリーダー配列である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記全てプリンのリーダー配列が、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長；少なくとも１２ヌクレオチド長；および少なくとも１４ヌクレオチド長より選択される長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が、マンガンイオンの濃度より３．０〜３．５倍高い、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約０．５ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約５．０ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約１．５ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約１．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．０ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約２．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約９．６ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．９ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記転写反応混合物が、置換グアノシンまたはグアノシンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記置換グアノシンまたはグアノシンが、ＧＭＰである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記転写反応混合物が、ポリアルキレングリコールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記転写反応混合物が、無機ピロホスファターゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシシチジン三リン酸（２’―デオキシＣＴＰ）、２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅウリジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＵＴＰ）または２’―ＯＭｅチミジンヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ ＴＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシチミジン三リン酸（２’―デオキシＴＴＰ）または２’―デオキシウリジン三リン酸（２’―デオキシＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記転写反応混合物が、２’―ＯＨチミジン三リン酸（２’―ＯＨ ＴＴＰ）または２’―ＯＨウリジン三リン酸（２’―ＯＨ ＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記転写反応混合物が、側鎖で修飾された核酸塩基をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸塩基が、ウリジンの５―および６―位、チミジンの５―および６―位、シチジンの５および６―位および環外アミン、アデノシンの２―、７―および８―位および環外アミン、グアノシンの７―および８―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
修飾核酸塩基が、ウラシル、シトシンまたはチミジンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記側鎖が、疎水性芳香族側鎖である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記側鎖が、ベンジルまたはインドリルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アプタマーを同定する方法であり、前記アプタマーが２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む、方法であり、
ａ）（ｉ）２’―ＯＭｅ ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ ＧＴＰ、２’―ＯＭｅ ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ ＴＴＰおよび２’―ＯＭｅ ＵＴＰより選択される２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ ＮＴＰ）のいずれかを導入することが可能な修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、前記修飾ＲＮＡポリメラーゼが、対応する非修飾ＲＮＡポリメラーゼの２’―修飾ＮＴＰを導入する能力と比較して、前記２’―修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―修飾ＮＴＰ）を導入する能力が増加している、修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、（ｉｉｉ）ヌクレオチド三リン酸であり、前記ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、前記グアニジン三リン酸が全て２’―ＯＭｅ修飾されている、ヌクレオチド三リン酸とを含む、転写反応混合物を調製するステップと；
ｂ）前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、一本鎖核酸の候補混合物の前記核酸分子に、少なくとも一つの修飾２’―ＯＭｅヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ ＮＴＰ）が導入される条件下で、前記転写反応混合物を転写することにより、前記一本鎖核酸の候補混合物を調製するステップであり、前記候補混合物の前記一本鎖核酸分子の、最初のグアノシンヌクレオチドの後の全てのグアニジンヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、ステップと；
ｃ）前記候補混合物を前記標的分子と接触させるステップと、
ｄ）前記候補混合物の親和性と比較して、標的分子に対する親和性が増加した前記核酸を、前記候補混合物から分離するステップと、
ｅ）アプタマーが濃縮された混合物を生じるために、前記親和性が増加した核酸を増幅するステップを含み、それによって、アプタマーの前記グアニジンヌクレオチドの一つを選択的に除いて、全て２’―ＯＭｅ修飾されたグアニジンヌクレオチドを含む、前記標的分子に対する前記アプタマーが、同定される、
方法。
【請求項２９】
前記転写反応混合物が、マグネシウムイオン、マンガンイオンまたはマグネシウムおよびマンガンイオンの両方をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸転写テンプレートが、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸転写テンプレートが、完全二本鎖である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記生じた一本鎖核酸における最初のグアノシヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ポリメラーゼに対して６３９位および７８４位で改変されたアミノ酸を含み、前記７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには、前記６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位にロイシン、７８４位にアラニンを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記二本鎖オリゴヌクレオチド転写テンプレートが、前記オリゴヌクレオチド転写テンプレートの５’末端の固定領域に導入されたリーダー配列をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記リーダー配列が、全てプリンのリーダー配列である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記全てプリンのリーダー配列が、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長；少なくとも１２ヌクレオチド長；および少なくとも１４ヌクレオチド長より選択される長さを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が、マンガンイオンの濃度より３．０〜３．５倍高い、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約０．５ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約５．０ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約１．５ｍＭである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約１．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．０ｍＭである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約２．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約９．６ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．９ｍＭである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記転写反応混合物が、置換グアノシンまたはグアノシンをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記置換グアノシンまたはグアノシンが、ＧＭＰである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記転写反応混合物が、ポリアルキレングリコールをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記転写反応混合物が、無機ピロホスファターゼをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシシチジン三リン酸（２’―デオキシＣＴＰ）、２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅウリジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＵＴＰ）または２’―ＯＭｅチミジンヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ ＴＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシチミジン三リン酸（２’―デオキシＴＴＰ）または２’―デオキシウリジン三リン酸（２’―デオキシＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４９】
前記転写反応混合物が、２’―ＯＨチミジン三リン酸（２’―ＯＨ ＴＴＰ）または２’―ＯＨウリジン三リン酸（２’―ＯＨ ＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項５０】
前記転写反応混合物が、側鎖で修飾された核酸塩基をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸塩基が、ウリジンの５―および６―位、チミジンの５―および６―位、シチジンの５および６―位および環外アミン、アデノシンの２―、７―および８―位および環外アミン、グアノシンの７―および８―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
修飾核酸塩基が、ウラシル、シトシンまたはチミジンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記側鎖が、疎水性芳香族側鎖である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記側鎖が、ベンジルまたはインドリルである、請求項５３に記載の方法。
【請求項１】
核酸を転写する方法であり、
ａ）（ｉ）２’―ＯＭｅ ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ ＧＴＰ、２’―ＯＭｅ ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ ＴＴＰおよび２’―ＯＭｅ ＵＴＰより選択される２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ ＮＴＰ）のいずれかを導入することが可能な修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、前記修飾ＲＮＡポリメラーゼが、対応する非修飾ＲＮＡポリメラーゼの２’―修飾ＮＴＰを導入する能力と比較して、前記２’―修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―修飾ＮＴＰ）を導入する能力が増加している、修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、（ｉｉｉ）ヌクレオチド三リン酸であり、前記ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、前記グアニジン三リン酸が全て２’―ＯＭｅ修飾されている、ヌクレオチド三リン酸とを含む、転写反応混合物を調製するステップと；
ｂ）一本鎖核酸が生じる条件下で、前記転写反応混合物を転写するステップであり、前記生じる一本鎖核酸の、最初のグアノシンヌクレオチドの後の全てのグアニジンヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記転写反応混合物が、マグネシウムイオン、マンガンイオン、またはマグネシウムおよびマンガンイオンの両方をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸転写テンプレートが、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸転写テンプレートが、完全二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記生じた一本鎖核酸における最初のグアノシヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ポリメラーゼに対して６３９位および７８４位で改変されたアミノ酸を含み、前記７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには、前記６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位にロイシン、７８４位にアラニンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記二本鎖オリゴヌクレオチド転写テンプレートが、前記オリゴヌクレオチド転写テンプレートの５’末端の固定領域に導入されたリーダー配列をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記リーダー配列が、全てプリンのリーダー配列である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記全てプリンのリーダー配列が、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長；少なくとも１２ヌクレオチド長；および少なくとも１４ヌクレオチド長より選択される長さを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が、マンガンイオンの濃度より３．０〜３．５倍高い、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約０．５ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約５．０ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約１．５ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約１．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．０ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約２．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約９．６ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．９ｍＭである、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
前記転写反応混合物が、置換グアノシンまたはグアノシンをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記置換グアノシンまたはグアノシンが、ＧＭＰである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記転写反応混合物が、ポリアルキレングリコールをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記転写反応混合物が、無機ピロホスファターゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシシチジン三リン酸（２’―デオキシＣＴＰ）、２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅウリジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＵＴＰ）または２’―ＯＭｅチミジンヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ ＴＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシチミジン三リン酸（２’―デオキシＴＴＰ）または２’―デオキシウリジン三リン酸（２’―デオキシＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記転写反応混合物が、２’―ＯＨチミジン三リン酸（２’―ＯＨ ＴＴＰ）または２’―ＯＨウリジン三リン酸（２’―ＯＨ ＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記転写反応混合物が、側鎖で修飾された核酸塩基をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸塩基が、ウリジンの５―および６―位、チミジンの５―および６―位、シチジンの５および６―位および環外アミン、アデノシンの２―、７―および８―位および環外アミン、グアノシンの７―および８―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
修飾核酸塩基が、ウラシル、シトシンまたはチミジンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記側鎖が、疎水性芳香族側鎖である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記側鎖が、ベンジルまたはインドリルである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
アプタマーを同定する方法であり、前記アプタマーが２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチドを含む、方法であり、
ａ）（ｉ）２’―ＯＭｅ ＡＴＰ、２’―ＯＭｅ ＧＴＰ、２’―ＯＭｅ ＣＴＰ、２’―ＯＭｅ ＴＴＰおよび２’―ＯＭｅ ＵＴＰより選択される２’―ＯＭｅ修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ ＮＴＰ）のいずれかを導入することが可能な修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼであり、前記修飾ＲＮＡポリメラーゼが、対応する非修飾ＲＮＡポリメラーゼの２’―修飾ＮＴＰを導入する能力と比較して、前記２’―修飾ヌクレオチド三リン酸（２’―修飾ＮＴＰ）を導入する能力が増加している、修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと、（ｉｉ）少なくとも一つの核酸転写テンプレートと、（ｉｉｉ）ヌクレオチド三リン酸であり、前記ヌクレオチド三リン酸がグアニジン三リン酸を含み、前記グアニジン三リン酸が全て２’―ＯＭｅ修飾されている、ヌクレオチド三リン酸とを含む、転写反応混合物を調製するステップと；
ｂ）前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより、一本鎖核酸の候補混合物の前記核酸分子に、少なくとも一つの修飾２’―ＯＭｅヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ ＮＴＰ）が導入される条件下で、前記転写反応混合物を転写することにより、前記一本鎖核酸の候補混合物を調製するステップであり、前記候補混合物の前記一本鎖核酸分子の、最初のグアノシンヌクレオチドの後の全てのグアニジンヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、ステップと；
ｃ）前記候補混合物を前記標的分子と接触させるステップと、
ｄ）前記候補混合物の親和性と比較して、標的分子に対する親和性が増加した前記核酸を、前記候補混合物から分離するステップと、
ｅ）アプタマーが濃縮された混合物を生じるために、前記親和性が増加した核酸を増幅するステップを含み、それによって、アプタマーの前記グアニジンヌクレオチドの一つを選択的に除いて、全て２’―ＯＭｅ修飾されたグアニジンヌクレオチドを含む、前記標的分子に対する前記アプタマーが、同定される、
方法。
【請求項２９】
前記転写反応混合物が、マグネシウムイオン、マンガンイオンまたはマグネシウムおよびマンガンイオンの両方をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記核酸転写テンプレートが、少なくとも部分的に二本鎖である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸転写テンプレートが、完全二本鎖である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記生じた一本鎖核酸における最初のグアノシヌクレオチドが、２’―ＯＭｅ修飾されている、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、野生型Ｔ７ポリメラーゼに対して６３９位および７８４位で改変されたアミノ酸を含み、前記７８４位の改変アミノ酸がアラニンであるときには、前記６３９位の改変アミノ酸がフェニルアラニンでない、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記修飾Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼが、６３９位にロイシン、７８４位にアラニンを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記二本鎖オリゴヌクレオチド転写テンプレートが、前記オリゴヌクレオチド転写テンプレートの５’末端の固定領域に導入されたリーダー配列をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記リーダー配列が、全てプリンのリーダー配列である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記全てプリンのリーダー配列が、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも１０ヌクレオチド長；少なくとも１２ヌクレオチド長；および少なくとも１４ヌクレオチド長より選択される長さを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が、マンガンイオンの濃度より３．０〜３．５倍高い、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約０．５ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約５．０ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約１．５ｍＭである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約１．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約６．５ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．０ｍＭである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
各ＮＴＰ、２’―修飾ＮＴＰまたは２’―ＯＭｅ ＮＴＰが、約２．０ｍＭの濃度で存在し、前記反応転写条件が、マグネシウムおよびマンガンイオンの両方を含み、マグネシウムイオンの濃度が約９．６ｍＭであり、マンガンイオンの濃度が約２．９ｍＭである、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記転写反応混合物が、置換グアノシンまたはグアノシンをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記置換グアノシンまたはグアノシンが、ＧＭＰである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記転写反応混合物が、ポリアルキレングリコールをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記転写反応混合物が、無機ピロホスファターゼをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４７】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシシチジン三リン酸（２’―デオキシＣＴＰ）、２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅウリジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＵＴＰ）または２’―ＯＭｅチミジンヌクレオチド三リン酸（２’―ＯＭｅ ＴＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４８】
前記転写反応混合物が、２’―デオキシチミジン三リン酸（２’―デオキシＴＴＰ）または２’―デオキシウリジン三リン酸（２’―デオキシＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４９】
前記転写反応混合物が、２’―ＯＨチミジン三リン酸（２’―ＯＨ ＴＴＰ）または２’―ＯＨウリジン三リン酸（２’―ＯＨ ＵＴＰ）および２’―Ｏ―Ｍｅアデノシン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＡＴＰ）、２’―ＯＭｅグアノシン三リン酸ＧＴＰ（２’―ＯＭｅ ＧＴＰ）、および２’―ＯＭｅシチジン三リン酸（２’―ＯＭｅ ＣＴＰ）の混合物をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項５０】
前記転写反応混合物が、側鎖で修飾された核酸塩基をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項５１】
前記核酸塩基が、ウリジンの５―および６―位、チミジンの５―および６―位、シチジンの５および６―位および環外アミン、アデノシンの２―、７―および８―位および環外アミン、グアノシンの７―および８―位および環外アミンからなる群より選択される位置で修飾される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
修飾核酸塩基が、ウラシル、シトシンまたはチミジンである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記側鎖が、疎水性芳香族側鎖である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記側鎖が、ベンジルまたはインドリルである、請求項５３に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２０１１−５０４３５７（Ｐ２０１１−５０４３５７Ａ）
【公表日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４２２６７（Ｐ２００９−５４２２６７）
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００４１４６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７８１８０
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５０７２７２８９８）アーケミックス コーポレイション (7)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月１０日（２０１１．２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００７／００４１４６
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０７８１８０
【国際公開日】平成２０年７月３日（２００８．７．３）
【出願人】（５０７２７２８９８）アーケミックス コーポレイション (7)
【Ｆターム（参考）】
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