動物細胞用組み換え発現ベクター
本発明は、ジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）プロモーターに作動的に連結されたＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列を含む動物細胞用組み換え発現ベクター及び前記ベクターにより形質転換された動物細胞株、並びにこれを利用した目的蛋白質の製造方法に関する。本発明のベクターは、既存動物細胞発現ベクターに比べ、著しく少ないメトトレキサート濃度下でも効果的にＤＨＦＲ遺伝子と共に外来遺伝子が増幅された細胞株クローンを選別可能にする。また、本発明によると、蛋白質生産細胞株を確立する過程において、より低い濃度のメトトレキサートの使用で、高い生産性の細胞株を短期間に確保できるため、細胞株作製の点で優れた効果を示す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞用組み換え発現ベクター、該ベクターにより形質転換された細胞株及びこれを利用した目的蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、有用な目的蛋白質を産業的に過剰発現するための技術としては、動物細胞培養が好ましい。その理由は、産業的に有用な蛋白質が大抵ヒトまたは動物由来の蛋白質であって、適切な生物学的活性を有するために要求される特殊な蛋白質の変形メカニズム（糖鎖修飾、リン酸化、アミド化）が動物細胞で容易に行われるからである。現在使用される産業用動物細胞は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、骨髄腫（ミエローマ）細胞などがあり、微生物発現システムと同様に、発現ベクターを前記細胞株に導入して、目的とする外来蛋白質を発現させる。
【０００３】
しかしながら、動物細胞の場合、微生物を利用した発現に比べ、形質転換を通じて導入した外来遺伝子の発現量が著しく低いという短所を有している。このような短所を補完するために現在産業界でよく使用しているシステムがジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）遺伝子と、この遺伝子の活性阻害剤であるメトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ：ＭＴＸ）を利用する外来遺伝子の増幅システムである。このシステムは、目的の蛋白質をコードする遺伝子と選別マーカーのＤＨＦＲ蛋白質をコードする遺伝子が一緒に染色体上のＤＮＡ内の同一領域に挿入されることにより、人為的にＭＴＸ濃度を段階別に高める度に、細胞株で生存に必要なＤＨＦＲ遺伝子と共に近隣に位置した外来遺伝子が同時に増幅される現象を利用するものである。
【０００４】
ＭＴＸを処理すれば、発現ベクター内のＤＨＦＲ遺伝子と付近の他の遺伝子が同時に増幅されることは、既に報告されている（非特許文献１参照）。また、発現ベクター内のＤＨＦＲ遺伝子付近に挿入させた外来遺伝子が同時に増幅されて、動物細胞内で外来遺伝子が高い水準でよく発現されるという報告がある（特許文献１及び非特許文献２参照）。
【０００５】
一般に、遺伝子増幅は、非常に希に起こる現象であるが、遺伝子増幅がなされた細胞の確保過程は、細胞培養時、段階別に高まったＭＴＸの高い濃度下でもよく育つ抵抗性を示す細胞を選別していく過程により現実的に可能になされており、通常ＭＴＸに適応されたコロニーを形成するに３週間〜４週間の時間が必要であって、５０ｎＭのＭＴＸ濃度で始まって、５００ｍＭのＭＴＸ濃度まで、産業的に有意な充分な増幅過程を行うことは、数ヶ月の時間と幾つもの段階の増幅過程を経なければならない。
【０００６】
しかしながら、ＭＴＸ処理による遺伝子増幅誘導過程において、段階別に増加するＭＴＸの濃度によって、細胞株の成長速度及び生産性に問題が生じる場合が多く、実際に、ＭＴＸ濃度を増加させても、組み換え蛋白質の発現が増加せず、却って減少するという報告がある（非特許文献１参照）。このような脈絡で、最近は、発現ベクター内のＤＨＦＲ遺伝子調節因子配列に突然変異を起こし、ＭＴＸによる遺伝子の増幅効果を著しく増加させた事例が報告された（非特許文献３参照）。
【０００７】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４６５６１３４号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｊｕｌ； ５（７）：１７５０−９（１９８５）
【非特許文献２】Ａｌｔ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ． ４２ Ｐｔ ２：６４９−５７（１９７８）
【非特許文献３】Ｂａｉ ｅｔ ａｌ． Ｚｈｏｎｇｈｕａ Ｙｉ Ｘｕｅ Ｚａ Ｚｈｉ． Ｆｅｂ ２５；８３（４）：３３３−７（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ＤＨＦＲ遺伝子を含むベクターで形質転換された動物細胞を利用した蛋白質の発現において、低い発現率の問題点と遺伝子増幅誘導過程で利用されるメトトレキサートの高濃度による低い細胞株の成長速度及び生産性の問題点を解決するために鋭意研究した。その結果、マウス由来のＤＨＦＲプロモーターに作動的に連結されたヒトＤＨＦＲ遺伝子配列が含まれた組み換え発現ベクターを使用して、より低いメトトレキサート濃度下でも外来遺伝子の効率的な増幅を誘導することができ、外来蛋白質を大量に得られる動物細胞用組み換え発現ベクターを開発することにより、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクターを提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記ベクターにより形質転換されたｄｈｆｒ−動物細胞株を提供することにある。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、前記形質転換ｄｈｆｒ−動物細胞株を利用する蛋白質の製造方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）配列番号１または配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）プロモーターと、（ｂ）前記プロモーターに作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）ＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列を含むｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクターを提供する。
【００１６】
本発明者らは、ＤＨＦＲ遺伝子を含むベクターで形質転換された動物細胞を利用した蛋白質の発現において、低い発現率の問題点と遺伝子増幅誘導過程で利用されるメトトレキサートの高濃度による低い細胞株の成長速度及び生産性の問題点を解決するために鋭意研究した。その結果、マウス由来のＤＨＦＲプロモーターに作動的に連結されたヒトＤＨＦＲ遺伝子配列が含まれた組み換え発現ベクターを使用して、より低いメトトレキサート濃度下でも外来遺伝子の効率的な増幅を誘導することができ、外来蛋白質を大量に得られる動物細胞用組み換え発現ベクターを開発した。
【００１７】
本明細書の用語‘ＤＨＦＲ（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）’は、ジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に還元させる酵素であって、核酸合成に必須的な酵素であり、細胞成長に必ず必要な酵素である。
【００１８】
本発明は、ｄｈｆｒ−動物細胞において、低い濃度のＤＨＦＲの阻害剤、特にメトトレキサート（ＭＴＸ）の低い濃度でベクターの増幅が効率的になされ、外来組み換え蛋白質を大量に生産するための発現ベクターに関する。
【００１９】
本明細書において、用語‘ｄｈｆｒ−動物細胞’は、ＤＨＦＲが正常に発現されず、細胞内の前記酵素の活性がないかあるいは殆どないように形質転換された動物細胞を意味する。本発明は、前記宿主細胞の特性、及び選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）されるためのＤＨＦＲ遺伝子を含む遺伝子増幅原理を利用したものである。即ち、ｄｈｆｒ−動物細胞をｄｈｆｒ遺伝子含有ベクターで形質転換させて、形質転換された細胞にＤＨＦＲ阻害剤を処理した場合は、ｄｈｆｒを含むベクターが細胞内で多く増幅された細胞が選択されるようになる。このようにして、ベクターの増幅が達成される。
【００２０】
本発明において、明細書の用語‘ＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）’は、ＤＨＦＲ阻害剤であって、葉酸がジヒドロ葉酸（ＦＨ２）を経てテトラヒドロ葉酸（ＦＨ４）に還元されることを抑制させる。
【００２１】
本発明の好ましい具現例によると、前記ＤＨＦＲプロモーターは、マウス由来であり、ＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列は、ヒト由来である。
【００２２】
本発明で利用されるＤＨＦＲプロモーターは、マウスのｄｈｆｒ遺伝子のプロモーター配列の中、本発明の目的に適したプロモーター活性を有する一部配列である。本発明で使用する配列番号１または配列番号２のプロモーターは、従来の動物細胞発現用プロモーターより相対的に低いプロモーター活性を示し、これにより、このプロモーターに作動的に連結されたｄｈｆｒ遺伝子の発現率が減少されて、著しく少ない量のＭＴＸ濃度下でも、ｄｈｆｒ遺伝子を含むベクターが細胞内で多く増幅された細胞が選択される。結局、ベクターの増幅がなされ、且つ、目的とする外来遺伝子の発現率も増加するようになる。
【００２３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用されるプロモーター配列は、配列番号１または配列番号２に記載のヌクレオチド配列で構成されている。
【００２４】
本発明の組み換え発現ベクターにおいて、ＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列は、前記プロモーターに作動的に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）される。本明細書で用語‘作動的に結合された’は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／またはトランスレーションを調節するようになる。
【００２５】
本発明で利用されるＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列は、好ましくは、ヒト由来ＤＨＦＲ遺伝子であり、最も好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７９１に開示されたヒトＤＨＦＲ遺伝子のＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、４９３番目配列から１，０５６番目配列まで）配列が本発明でＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列として利用できる。
【００２６】
本発明の組み換え発現ベクターは、ｄｈｆｒ−動物細胞に利用される。本発明の好ましい具現例によると、前記動物細胞は、イースト（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞であって、さらに好ましくは、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞株、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株またはＢＨＫ（Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞株であり、最も好ましくは、ＣＨＯ細胞株を意味する。ＤＨＦＲが欠乏されたＣＨＯ細胞は、安全生と効用性が検証され、ＦＤＡから承認を受けて医薬用組み換え蛋白質の生産に広く使用されている。
【００２７】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の発現ベクターは、外来遺伝子ヌクレオチド配列をさらに含む。
【００２８】
本発明で発現しようとする目的の蛋白質をコーディングする外来遺伝子は、あらゆる遺伝子配列を含む。例えば、前記外来遺伝子は、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、信号伝達蛋白質またはその一部分、抗体またはその一部分、単鎖抗体、結合蛋白質またはその結合ドメイン、抗原、付着蛋白質、構造蛋白質、調節蛋白質、毒素蛋白質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子またはワクチン蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む。より詳細には、本発明のベクターにより増幅及び発現される外来遺伝子は、インスリン、ＩＧＦ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １）、成長ホルモン、ＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＧＦ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｈｔ ｆａｃｔｏｒ）、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦｓ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）、ＧＭ−ＣＳＦｓ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１アルファ及びベータ、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−２、ＥＧＦｓ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ＴＮＦＲ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＤＳ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−ｓｕｌｆａｔａｓｅ）、アトビスバン（ａｔｏｂｉｓｂａｎ）、ブセレリン（ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）、セトロレリクス（ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）、デスロレリン（ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）、デスモプレシン（ｄｅｓｍｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ダイノルフィンＡ（ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ Ａ）（１−１３）、エルカトニン（ｅｌｃａｔｏｎｉｎ）、エレイドシン（ｅｌｅｉｄｏｓｉｎ）、エプチフィバチド（ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）、ＧＨＲＨ−II（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ−ＩＩ）、ゴナドレリン（ｇｏｎａｄｏｒｅｌｉｎ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、ヒストレリン（ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ）、リュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ）、リプレシン（ｌｙｐｒｅｓｓｉｎ）、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、オキシトシン （ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、ピトレシン（ｐｉｔｒｅｓｓｉｎ）、セクレチン（ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、シンカライド（ｓｉｎｃａｌｉｄｅ）、テルリプレッシン（ｔｅｒｌｉｐｒｅｓｓｉｎ）、チモペンチン（ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎ）、チモシン（ｔｈｙｍｏｓｉｎｅ）α１、トリプトレリン（ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、ビバリルジン（ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、カルベトシン（ｃａｒｂｅｔｏｃｉｎ）、シクロスポリン、エキセディン（ｅｘｅｄｉｎｅ）、ランレオチド（ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）、ＬＨＲＨ（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ナファレリン（ｎａｆａｒｅｌｉｎ）、副甲状腺ホルモン、プラムリンチド（ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ）、Ｔ−２０（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、サイマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）またはジコノチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
本発明の好ましい具現例によると、前記外来遺伝子ヌクレオチド配列の上流に、真核細胞で作動可能なプロモーター配列が結合されている。前記外来遺伝子を発現させるための真核細胞で作動可能なプロモーター配列は、サイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ＳＶ４０のプロモーター（ＳＶ４０後期プロモーター及びＳＶ４０初期プロモーター）、ＨＳＶ（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）のｔｋプロモーター、アデノウイルス2主要後期プロモーター（Ａｄｅｎｏ ２ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ＰＡｄｍｌ）、アデノウイルス2初期プロモーター（ＰＡｄＥ２）、ＡＡＶ（ｈｕｍａｎ ｐａｒｖｏ ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）のｐ１９プロモーター、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、マウスのメタロチオネインプロモーター（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）、ＭＴプロモーター、ＭＭＴＶ ＬＴＲプロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、そしてヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはヒトメタロチオネイン由来のプロモーターがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の発現ベクターには、転写終結配列として、ポリアデニル化配列が含まれて、例えば、牛成長ホルモンターミネーター（Ｇｉｍｍｉ， Ｅ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：６９８３−６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来ポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ， Ｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：５３８６−５３９３（１９９２））、ＨＩＶ−１ ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ， Ｂ． Ｉ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６：１８７０−１８７６（１９９８））、β−グロビンｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ， Ａ．， ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ４９：３９９−４０６（１９８７））、ＨＳＶ ＴＫ ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ， Ｃ． Ｎ． ａｎｄ Ｔ． Ｐ． Ｓｔａｃｙ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：２１０４−２１１３（１９８５））またはポリオマーウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ， Ｄ． Ｂ ａｎｄ Ｇ． Ｇ． Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：４７８３−４７９０（１９９５））を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
また、本発明の発現ベクターは、選択標識として、当業界で通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含むことができ、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン（Ｇ４１８）、ネオマイシンまたはテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含む。
【００３２】
本発明のより好ましい具現例によると、前記外来蛋白質を大量に生産するための動物細胞用発現ベクターは、図３ａに示された遺伝子地図を有するベクターであり、最も好ましくは、ｐＪＫ−ｄｈｆｒ−１（ＫＣＴＣ １１２９９ＢＰ）またはｐＪＫ−ｄｈｆｒ−２（ＫＣＴＣ １１３００ＢＰ）である。
【００３３】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述のｄｈｆｒ−動物細胞用ベクターにより形質転換されたｄｈｆｒ−動物細胞株を提供する。
【００３４】
本発明において、ｄｈｆｒ−動物細胞を発現ベクターで形質転換する方法は、微量注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ．， Ｃｅｌｌ， ２２：４７９（１９８０））、カルシウムホスフェート沈殿法（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６（１９７３））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １：８４１（１９８２））、リポソーム−媒介形質転換法（Ｗｏｎｇ， Ｔ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １０：８７（１９８０））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．, ５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７：９５６８−９５７２（１９９０））などを含む。
【００３５】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）上述の外来蛋白質を大量に生産するための本発明の細胞株を、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤の添加下で培養する工程と、（ｂ）培養物から外来蛋白質を精製する工程と、を含む製造方法を提供する。
【００３６】
前記ＤＨＦＲの阻害剤は、例えば、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）及びメトトレキサート（ＭＴＸ）などがあるが、これに限定されるものではなく、最も好ましくは、メトトレキサートである。
【００３７】
遺伝子増幅に利用されるＭＴＸは、高価であるため、試験管水準で行われる実験室における実験では重要な考慮要素とされないが、大容量水準で行われる場合は、重要な考慮要素になる。また、例えば、１μＭ濃度まで段階別に細胞を適応させるためには、６ヶ月以上の長い期間が所要されて、ＭＴＸの高濃度培養で細胞成長が低下する副作用がある。
【００３８】
したがって、当業界では、遺伝子増幅のために添加されるＭＴＸの濃度を減少させるために研究を続けている。一方、通常当業界では、遺伝子増幅のために、ＭＴＸ０．０５ｍＭ〜５ｍＭ程度が利用されている。本発明の製造方法に利用される細胞株は、低濃度のＭＴＸでも遺伝子増幅がよくなされるように形質転換されたものである。本発明に添加されるメトトレキサートの濃度は、０．００１μＭ〜１０μＭが好ましく、より好ましくは、０．００３μＭ〜１μＭであり、最も好ましくは、０．００５μＭ〜０．３２μＭである。
【００３９】
本発明の製造方法において、培養する工程は、本発明で通常利用される培地で行うことができる。例えば、本発明で利用できる培地は、動物細胞の培養に通常利用される如何なる培地でも可能であり、例えば、Ｅａｇｌｅｓ’ｓ ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ， Ｅａｇｌｅ， Ｈ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０：４３２（１９５９））、α−ＭＥＭ （Ｓｔａｎｎｅｒ， Ｃ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ． ２３０：５２（１９７１））、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １４７：９２３（１９７８））、１９９培地（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏ． Ｍｅｄ．， ７３：１（１９５０））、ＣＭＲＬ １０６６、ＲＰＭＩ １６４０（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． １９９：５１９（１９６７））、Ｆ１２ （Ｈａｍ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５３：２８８（１９６５））、Ｆ１０ （Ｈａｍ， Ｒ．Ｇ． Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２９：５１５（１９６３））、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ， Ｄｕｌｂｅｃｃｏ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８：３９６（１９５９））、ＤＭＥＭとＦ１２の混合物（Ｂａｒｎｅｓ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５（１９８０））、Ｗａｙ−ｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ， Ｃ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ２２：１００３（１９５９））、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ （ＭｃＣｏｙ， Ｔ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １００：１１５（１９５９））及びＭＣＤＢシリーズ（Ｈａｍ， Ｒ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １４：１１（１９７８））などが利用できる。培地に関する説明は、Ｒ． Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに詳細に記載されており、この文献は、本明細書に参照として取り込まれる。
【００４０】
前記培養工程で、宿主細胞内に発現された外来蛋白質が培地に分泌されて、このように分泌された外来蛋白質を精製すると、目的の蛋白質が多量に得られる。本発明において、前記精製工程は、当業界で通常利用される精製方法を採用して行うことができる。例えば、アンモニウムサルフェートまたはＰＥＧなどを利用した溶解度による分離（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、分子量による限外ろ過分離、多様なクロマトグラフィー（大きさ、電荷、疎水性または親和性による分離のために製作されたもの）による分離など、多様な方法が利用でき、通常、上記の方法の組み合わせを利用して精製する。
【発明の効果】
【００４１】
本発明は、プロモーター活性が減少されたＤＨＦＲプロモーターを含むｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクターを提供する。
【００４２】
本発明のベクターは、既存動物細胞発現ベクターと比較し、著しく少ないメトトレキサート濃度下でも効果的にＤＨＦＲ遺伝子と共に外来遺伝子が増幅された細胞株クローンを選別することができるようにする。
【００４３】
本発明によると、減少された濃度のメトトレキサートの使用による費用節減効果があり、細胞株の成長速度及び生産性側面で優れた効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１ａ及び１ｂは、本発明で使用したＤＨＦＲ基本プロモーターの配列Ａ及びＢである。
【図２】図２は、本発明でルシフェラーゼ発現量の比較によるプロモーター性能実験結果である。
【図３】図３ａは、本発明の動物細胞用組み換え発現ベクターの模式的な遺伝子地図であり、図３ｂは、本発明の動物細胞用組み換え発現ベクターの具体的な一実施例であるｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１の遺伝子である。図３ｃは、本発明の動物細胞用組み換え発現ベクターを構築するために使用されるｐＭＳ発現ベクターの遺伝子地図である。図３ａにおいて、ＤＨＦＲ：ヒト由来ＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列；ｄｈｆｒ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ：配列番号１または２のマウス由来。
【図４】図４は、本発明のｐＪＫ−ＤＨＦＲ−２発現ベクターの構造を示した模式図である。
【図５】図５は、本発明のｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２発現ベクターの構造を示した模式図である。
【図６】図６ａ及び図６ｂは、本発明のｐＪＫＩｇ及びｐＪＫＩｇ−ＲＳＶ ＨＫ発現ベクターの構造を示した模式図である。
【図７】図７は、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターを利用して製作したヒトＴＮＦＲ発現細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果である。
【図８】図８は、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２ベクターを利用して製作したヒトＩＤＳ発現細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果である。
【図９】図９は、ｐＪＫＩｇベクターを利用して製作したＲＳＶ抗体発現細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果である。
【図１０】図１０は、ｐＪＫＩｇベクターを利用して製作したＧＳ０５１抗体発現細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果である。
【図１１】図１１ａは、ｐＪＫＩｇベクターを利用して製作したＧＳ０７１抗体発現細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果であり、図１１ｂは、ＧＳ０７１抗体発現細胞株の、２０ｎＭ ＭＴＸで増幅した後、再びサブクローニングして得た細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果であって、図１１ｃは、ＧＳ０７１抗体発現細胞株の、８０ｎＭ ＭＴＸで増幅した後、再びサブクローニングして得た細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１：マウス由来ＤＨＦＲプロモーター、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターとエンハンサーのクローニング）
ＤＨＦＲプロモーターに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、以下のような方法で行った。
【００４７】
まず、マウスＤＨＦＲ遺伝子の５’端配列に含まれ、強力なＴＡＴＡ配列を有し、基本プロモーター活性を有するＤＨＦＲプロモーター領域を得るために、ゲノムＤＮＡ分離キット（Ｉｎｔｒｏｎ、大韓民国）を使用してマウスのゲノムＤＮＡを分離した。分離されたマウス核酸２００ｎｇを５０ｐｍｏｌのＰ１及びＰ２プライマー、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、並びにＳｏｆｔＭａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｔｒｏｎ、大韓民国）を添加して、９５℃で１分間の変性、５５℃で４０秒間及び７２℃で４０秒間を１サイクルとして２９回繰り返し、最後に７２℃で１０分間ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）して、マウス由来ＤＨＦＲプロモーターを増幅した。
【００４８】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターとプロモーター／エンハンサー（プロモーターと作動的に連結されたエンハンサー）ＤＮＡ断片は、１０ｎｇのｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を鋳型としてＰ３とＰ４、並びにＰ３とＰ５それぞれのプライマー組を使用して、前記マウス由来ＤＨＦＲプロモーターを増幅する方法と同一のＰＣＲ法（温度、時間及びサイクル）を利用して増幅した。それぞれのプライマーの塩基配列とＰＣＲを通じて得られたＤＮＡ断片の大きさを、下記表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
ＰＣＲによって得たそれぞれのＤＮＡ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ制限酵素で処理した後、ジンクリーンＩＩＩターボキット（Ｂｉｏ １０１、米国）で精製して、前記制限酵素と同一の制限酵素で切断されたｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）にサブクローニングし、ｐＧＬ２−ＤＨＦＲベクター、ｐＧＬ２−ＳＶ４０プロモーターベクター及びｐＧＬ２−ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーベクターをそれぞれ製造した。ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクターは、ルシフェラーゼ遺伝子がコードされているベクターである。
【００５１】
（実施例２：ｐＧＬ２−ＤＨＦＲ、ＳＶ４０プロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びエンハンサーにより転写が調節されたルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルを測定することによるプロモーター活性の比較実験）
１）遺伝子導入
ＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ、米国）を、牛胎児血清が１０％添加されたＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ； ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、米国）に接種して、３７℃、 ５％ ＣＯ２恒温器で継代培養した。前記細胞を１００ｍｍ培養皿に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種して、３７℃で一晩中培養した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｍｅｄｉａ I； ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、米国）溶液で３回洗浄した。一方、上記で製造したベクターｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ２−ＤＨＦＲ、ｐＧＬ２−ＳＶ４０Ｐ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）及びｐＧＬ２−ＳＶ４０ Ｐ／Ｅ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ）をそれぞれ５μｇずつ取って、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ ５００μＬで希釈して、２５μＬのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社、米国）も同様にＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ ５００μＬで希釈した。前記発現ベクターとリポフェクタミン希釈液を１５ｍＬチューブに混合してＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を製造した後、これを１５分間以上室温で放置した。上記それぞれのＤＮＡ−リポフェクタミン混合物に５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉを添加して、これをきれいに洗浄されたＣＯＳ７細胞に均一に混合した後、３７℃、５％ ＣＯ２恒温器で４８時間培養した。
【００５２】
２）ルシフェラーゼ発現量比較測定
それぞれのベクターに挿入されたプロモーターの活性を比較するために、各ベクターにより発現されるルシフェラーゼ量を測定した。ベクターが導入されてから４８時間培養した細胞を５ｍＬのＰＢＳで洗浄した後、再び１ｍＬのＰＢＳを入れて、スクレーパーを利用し細胞を集めた。集められた細胞を４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上澄液を除去した。細胞を溶解させるために、上澄液の除去後、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．８）／１ｍＭ ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）溶液を５０μＬ添加した後、液体窒素に１分間浸した後、再び３７℃で１分間放置する過程を３回繰り返した。その後、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、細胞が除去された上澄液のみを取って、−２０℃に保管した。
【００５３】
ルシフェラーゼ測定のために、１２ｍｍ×７５ｍｍの５ｍＬチューブにＡ溶液（２５ｍＭ ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ７．８）、０．２Ｍ ＡＴＰ、１Ｍ ＭｇＳＯ４, Ｈ２Ｏ）を３５０μＬずつ分注した後、Ｂ溶液（２５ｍＭ ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ７．８）、Ｄ−ルシフェリン（５ｍｇ／１６．５ｍＬ Ｈ２Ｏ））を１００μＬ添加して、発光測定器に挿入した。ルシフェラーゼ活性を測定するため、Ａ溶液に測定液を４０μＬ入れて、２５℃で３０秒間ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、新しく選択されたＤＨＦＲの基本プロモーターの活性は、意図通り、既存のＳＶ４０プロモーターや、プロモーターとエンハンサーとが共に入っているプロモーターの活性に比べ、２，３００倍及び３，８００倍程度に著しく低い活性を示すことを確認することができた（表２及び図２）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
（実施例３：ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターの製造）
ＤＨＦＲ遺伝子をクローニングするために、ヒトの血液から、ゲノムＤＮＡ分離キット（Ｉｎｔｒｏｎ、大韓民国）を使用してヒトのゲノムＤＮＡを分離した。純粋分離したヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＤＨＦＲ遺伝子を増幅した。
【００５６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、以下のような方法で行った。まず、ＤＨＦＲ遺伝子の場合、分離したヒトゲノムＤＮＡ２００ｎｇを鋳型として使用し、Ｐ６及びＰ７プライマーをそれぞれ５０ｐｍｏｌ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ及びＳｏｆｔＭａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｔｒｏｎ、大韓民国）を添加して、９５℃で１分間、５５℃で４０秒間及び７２℃で４０秒間を１サイクルとして２９回繰り返した後、７２℃で１０分間反応した。その結果、１，４６２ｂｐのＤＨＦＲ遺伝子を合成した。マウスＤＨＦＲ基本プロモーターは、ｐＧＬ２−ＤＨＦＲを鋳型として、Ｐ８及びＰ９プライマーで上記と同一のＰＣＲ法（温度、時間及びサイクル）を利用してＤＨＦＲプロモーター領域を増幅した。
【００５７】
合成されたＤＨＦＲ基本プロモーターの３’領域とＤＨＦＲ遺伝子の５’領域は、互いに共通的な１９ｂｐ塩基配列領域を有しており、前記共通的な領域をＰ８及びＰ７プライマーでＰＣＲを行って、基本プロモーターとＤＨＦＲ遺伝子が連結された１，６０５ｂｐのDNA断片を合成した。それぞれのプライマーの塩基配列とＰＣＲを通じて得られたDNA断片の大きさは、上記表１に示す。
【００５８】
ＰＣＲによって増幅されたＤＨＦＲプロモーターとＤＨＦＲ遺伝子ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ制限酵素を使用して切断して、ｐＭＳベクター（ＡＰＲＯＧＥＮ、大韓民国）をＢｇｌＩＩ制限酵素で開環し、ＤＨＦＲプロモーターと遺伝子を前記ベクターに挿入してｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターを製造した（図３ａ及び３ｂ）。ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターは、２００８年３月１１日付にて韓国生命工学研究院遺伝子バンクに寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １１２９９ＢＰ）。
【００５９】
（実施例４：ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−２ベクターの製造）
ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターのＤＨＦＲプロモーターをさらに短くして、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−２ベクターを製造した。ＰＣＲ合成は、実施例３と同様の方法で行った。ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターを鋳型として、Ｐ１０及びＰ７プライマー対でＰＣＲ法を使用しＤＨＦＲプロモーター及びＤＨＦＲ遺伝子を合成した。プライマーの塩基配列とＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片の大きさは、上記表１に示す。
【００６０】
ＰＣＲを通じて得られたプロモーターとＤＨＦＲ遺伝子断片を、ＢａｍＨＩ 制限酵素を使用して切断して、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターをＢｇｌＩＩ制限酵素で開環した。ＤＨＦＲプロモーターと遺伝子を前記ベクターに挿入してｐＪＫ−ＤＨＦＲ−２ベクターを製造した（図４）。ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−２ベクターは、２００８年３月１１日付にて韓国生命工学研究院遺伝子バンクに寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １１３００ＢＰ）。
【００６１】
（実施例５：ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２ベクターの製造）
ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１と比較し、ＤＨＦＲ遺伝子が逆方向に挿入されたベクターであるｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２を製作する方法は、以下のようである。上記の実施例３のように、ＰＣＲによりＤＨＦＲプロモーターと遺伝子を増幅して、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターをＢｇｌＩＩで開環し、合成したプロモーターと遺伝子をＢａｍＨＩで処理して挿入した後、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１と比較し、ＤＨＦＲ遺伝子が逆方向に挿入されたベクターをスクリーニングして、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２を製作した（図５）。
【００６２】
（実施例６：ｐＪＫＩｇベクター及びｐＪＫＩｇベクターを利用した組み換え抗体ベクターの製造）
ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターを活用して、以下のように抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子をクローニングするためのベクターであるｐＪＫＩｇベクターを製造した。
【００６３】
まず、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を除去し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素（Ｒｏｃｈｅ、スイス）を処理して連結させて、再びＸｈｏＩ−ＡｐａＩ断片を除去して再び連結して、ＢｓｍＩ酵素でベクターを開環して、クレノウ酵素を処理して用意した。
【００６４】
また他のｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターの多数クローニング部位のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ範囲を除去し、クレノウ酵素とリガーゼを処理して自己連結した。多数クローニング部位にあるＡｐａＩ部位を除去するために、ＸｂａＩ及びＰｖｕＩＩ制限酵素で切断した後、プライマーＰ１１及びＰ１２でＰＣＲを通じてＸｂａＩ−ＰｖｕＩＩ領域の３１６ｂｐ断片を作った後、再挿入した。ＸｂａＩ−ＰｖｕＩＩ断片が挿入されたｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターをＮｒｕＩ−ＰｖｕＩＩ酵素で切断し、１，０７５ｂｐの断片を作って、この断片を、前記制限酵素ＢｓｍＩで開環されたベクターに挿入して、ｐＪＫＩｇベクターを製作した（図６ａ）。ｐＪＫＩｇベクターにＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）抗体の重鎖及び軽鎖が挿入されたｐＪＫＩｇ−ＲＳＶ ＨＫベクターを製作するために、まずＲＳＶに結合する抗体の重鎖の可変及び不変領域がｐＧＥＭ Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）に挿入されたｐＧＥＭ Ｔ／ＲＳＶ ＨｖＨｃベクターの免疫グロブリン重鎖の可変及び不変領域をＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ酵素で切断した後、ｐＪＫＩｇベクターを同一な酵素で切断して挿入した。前述したのと同様の方法で、ｐＧＥＭ Ｔ／ＲＳＶ ＫｖＫｃベクターの免疫グロブリン軽鎖の可変及び不変領域をＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ酵素で切断した後、ｐＪＫＩｇベクターに挿入して、ｐＪＫＩｇ−ＲＳＶ ＨＫベクターを製作した（図６ｂ）。
【００６５】
（実施例７：ｐＪＫ−ＤＨＦＲ及びｐＪＫＩｇベクターの有用性を確認するための組み換え蛋白質及び抗体生産細胞株確立実験）
ｐＪＫ−ＤＨＦＲベクターを使用するために、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１とｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２ベクターをそれぞれＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限酵素で処理し、ヒト由来ＴＮＦ−Ｒ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びＩＤＳ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−ｓｕｌｆａｔａｓｅ）酵素をコードするｃＤＮＡを挿入した。ｐＪＫＩｇ−ＧＳ０５１ Ｈ／Ｋベクターは、前記ｐＪＫＩｇ−ＲＳＶ ＨＫベクターの重鎖領域をＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩ制限酵素で切断した後、ＧＳ０５１抗体の重鎖領域をコードするｃＤＮＡを挿入して、軽鎖領域をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素で切断した後、ＧＳ０５１抗体の軽鎖領域を暗号化するｃＤＮＡを挿入して製造した。また、上記のような方法でＧＳ０７１抗体を発現するｐＪＫＩｇ−ＧＳ０７１ Ｈ／Ｋベクターを製造した。
【００６６】
上記のように製造された目的蛋白質発現または抗体発現ベクターを、ＤＨＦＲ遺伝子機能が欠如されているＣＨＯ ＤＧ４４（コロンビア大学校、米国）細胞にそれぞれ形質導入して、抗生剤Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、米国）を使用して一次的に細胞株を選別した。選別された細胞株培地内ＭＴＸ濃度を２０ｎＭ、８０ｎＭ、３２０ｎＭ及び１，０００ｎＭに漸次的に増加させながらクローン別目的蛋白質または抗体発現量によって高発現細胞株を選別した。この際、発現量は、それぞれ選別された細胞株を６−ウェルプレートに５×１０５細胞を入れて３日間培養した後、培地を回収して、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）方法により測定した。標準品としては、それぞれを精製して濃度を既に知っている蛋白質を使用した。
【００６７】
その結果、図７に示されたように、８０ｎＭのＭＴＸ濃度で高発現細胞株が選別された。図９では、３２０ｎＭ及び１μＭのＭＴＸ濃度で高発現細胞株が選別された。しかしながら、１μＭのＭＴＸ濃度で選別された細胞株は、成長性がよくなかった。図１１では、２０ｎＭと８０ｎＭのＭＴＸで増幅して選別された３−５−６クローンを、再びサブクローニングを通じて高発現細胞株を選別した。このように、既存の目的蛋白質及び抗体発現のために使用してきたＭＴＸ濃度とは違って、弱いＤＨＦＲプロモーターと遺伝子を利用して、０．００５μＭ〜０．３２μＭの少ない濃度でも高発現された目的蛋白質及び抗体を確認することができた。
【００６８】
以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞用組み換え発現ベクター、該ベクターにより形質転換された細胞株及びこれを利用した目的蛋白質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、有用な目的蛋白質を産業的に過剰発現するための技術としては、動物細胞培養が好ましい。その理由は、産業的に有用な蛋白質が大抵ヒトまたは動物由来の蛋白質であって、適切な生物学的活性を有するために要求される特殊な蛋白質の変形メカニズム（糖鎖修飾、リン酸化、アミド化）が動物細胞で容易に行われるからである。現在使用される産業用動物細胞は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）細胞、骨髄腫（ミエローマ）細胞などがあり、微生物発現システムと同様に、発現ベクターを前記細胞株に導入して、目的とする外来蛋白質を発現させる。
【０００３】
しかしながら、動物細胞の場合、微生物を利用した発現に比べ、形質転換を通じて導入した外来遺伝子の発現量が著しく低いという短所を有している。このような短所を補完するために現在産業界でよく使用しているシステムがジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）遺伝子と、この遺伝子の活性阻害剤であるメトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ：ＭＴＸ）を利用する外来遺伝子の増幅システムである。このシステムは、目的の蛋白質をコードする遺伝子と選別マーカーのＤＨＦＲ蛋白質をコードする遺伝子が一緒に染色体上のＤＮＡ内の同一領域に挿入されることにより、人為的にＭＴＸ濃度を段階別に高める度に、細胞株で生存に必要なＤＨＦＲ遺伝子と共に近隣に位置した外来遺伝子が同時に増幅される現象を利用するものである。
【０００４】
ＭＴＸを処理すれば、発現ベクター内のＤＨＦＲ遺伝子と付近の他の遺伝子が同時に増幅されることは、既に報告されている（非特許文献１参照）。また、発現ベクター内のＤＨＦＲ遺伝子付近に挿入させた外来遺伝子が同時に増幅されて、動物細胞内で外来遺伝子が高い水準でよく発現されるという報告がある（特許文献１及び非特許文献２参照）。
【０００５】
一般に、遺伝子増幅は、非常に希に起こる現象であるが、遺伝子増幅がなされた細胞の確保過程は、細胞培養時、段階別に高まったＭＴＸの高い濃度下でもよく育つ抵抗性を示す細胞を選別していく過程により現実的に可能になされており、通常ＭＴＸに適応されたコロニーを形成するに３週間〜４週間の時間が必要であって、５０ｎＭのＭＴＸ濃度で始まって、５００ｍＭのＭＴＸ濃度まで、産業的に有意な充分な増幅過程を行うことは、数ヶ月の時間と幾つもの段階の増幅過程を経なければならない。
【０００６】
しかしながら、ＭＴＸ処理による遺伝子増幅誘導過程において、段階別に増加するＭＴＸの濃度によって、細胞株の成長速度及び生産性に問題が生じる場合が多く、実際に、ＭＴＸ濃度を増加させても、組み換え蛋白質の発現が増加せず、却って減少するという報告がある（非特許文献１参照）。このような脈絡で、最近は、発現ベクター内のＤＨＦＲ遺伝子調節因子配列に突然変異を起こし、ＭＴＸによる遺伝子の増幅効果を著しく増加させた事例が報告された（非特許文献３参照）。
【０００７】
本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第４６５６１３４号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． Ｊｕｌ； ５（７）：１７５０−９（１９８５）
【非特許文献２】Ａｌｔ ｅｔ ａｌ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｓｙｍｐ Ｑｕａｎｔ Ｂｉｏｌ． ４２ Ｐｔ ２：６４９−５７（１９７８）
【非特許文献３】Ｂａｉ ｅｔ ａｌ． Ｚｈｏｎｇｈｕａ Ｙｉ Ｘｕｅ Ｚａ Ｚｈｉ． Ｆｅｂ ２５；８３（４）：３３３−７（２００３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、ＤＨＦＲ遺伝子を含むベクターで形質転換された動物細胞を利用した蛋白質の発現において、低い発現率の問題点と遺伝子増幅誘導過程で利用されるメトトレキサートの高濃度による低い細胞株の成長速度及び生産性の問題点を解決するために鋭意研究した。その結果、マウス由来のＤＨＦＲプロモーターに作動的に連結されたヒトＤＨＦＲ遺伝子配列が含まれた組み換え発現ベクターを使用して、より低いメトトレキサート濃度下でも外来遺伝子の効率的な増幅を誘導することができ、外来蛋白質を大量に得られる動物細胞用組み換え発現ベクターを開発することにより、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクターを提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記ベクターにより形質転換されたｄｈｆｒ−動物細胞株を提供することにある。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、前記形質転換ｄｈｆｒ−動物細胞株を利用する蛋白質の製造方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一様態によると、本発明は、（ａ）配列番号１または配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）プロモーターと、（ｂ）前記プロモーターに作動的に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）ＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列を含むｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクターを提供する。
【００１６】
本発明者らは、ＤＨＦＲ遺伝子を含むベクターで形質転換された動物細胞を利用した蛋白質の発現において、低い発現率の問題点と遺伝子増幅誘導過程で利用されるメトトレキサートの高濃度による低い細胞株の成長速度及び生産性の問題点を解決するために鋭意研究した。その結果、マウス由来のＤＨＦＲプロモーターに作動的に連結されたヒトＤＨＦＲ遺伝子配列が含まれた組み換え発現ベクターを使用して、より低いメトトレキサート濃度下でも外来遺伝子の効率的な増幅を誘導することができ、外来蛋白質を大量に得られる動物細胞用組み換え発現ベクターを開発した。
【００１７】
本明細書の用語‘ＤＨＦＲ（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）’は、ジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に還元させる酵素であって、核酸合成に必須的な酵素であり、細胞成長に必ず必要な酵素である。
【００１８】
本発明は、ｄｈｆｒ−動物細胞において、低い濃度のＤＨＦＲの阻害剤、特にメトトレキサート（ＭＴＸ）の低い濃度でベクターの増幅が効率的になされ、外来組み換え蛋白質を大量に生産するための発現ベクターに関する。
【００１９】
本明細書において、用語‘ｄｈｆｒ−動物細胞’は、ＤＨＦＲが正常に発現されず、細胞内の前記酵素の活性がないかあるいは殆どないように形質転換された動物細胞を意味する。本発明は、前記宿主細胞の特性、及び選択（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）されるためのＤＨＦＲ遺伝子を含む遺伝子増幅原理を利用したものである。即ち、ｄｈｆｒ−動物細胞をｄｈｆｒ遺伝子含有ベクターで形質転換させて、形質転換された細胞にＤＨＦＲ阻害剤を処理した場合は、ｄｈｆｒを含むベクターが細胞内で多く増幅された細胞が選択されるようになる。このようにして、ベクターの増幅が達成される。
【００２０】
本発明において、明細書の用語‘ＭＴＸ（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）’は、ＤＨＦＲ阻害剤であって、葉酸がジヒドロ葉酸（ＦＨ２）を経てテトラヒドロ葉酸（ＦＨ４）に還元されることを抑制させる。
【００２１】
本発明の好ましい具現例によると、前記ＤＨＦＲプロモーターは、マウス由来であり、ＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列は、ヒト由来である。
【００２２】
本発明で利用されるＤＨＦＲプロモーターは、マウスのｄｈｆｒ遺伝子のプロモーター配列の中、本発明の目的に適したプロモーター活性を有する一部配列である。本発明で使用する配列番号１または配列番号２のプロモーターは、従来の動物細胞発現用プロモーターより相対的に低いプロモーター活性を示し、これにより、このプロモーターに作動的に連結されたｄｈｆｒ遺伝子の発現率が減少されて、著しく少ない量のＭＴＸ濃度下でも、ｄｈｆｒ遺伝子を含むベクターが細胞内で多く増幅された細胞が選択される。結局、ベクターの増幅がなされ、且つ、目的とする外来遺伝子の発現率も増加するようになる。
【００２３】
本発明の好ましい具現例によると、本発明で利用されるプロモーター配列は、配列番号１または配列番号２に記載のヌクレオチド配列で構成されている。
【００２４】
本発明の組み換え発現ベクターにおいて、ＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列は、前記プロモーターに作動的に連結（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）される。本明細書で用語‘作動的に結合された’は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター配列）と他の核酸配列間の機能的な結合を意味し、これにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／またはトランスレーションを調節するようになる。
【００２５】
本発明で利用されるＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列は、好ましくは、ヒト由来ＤＨＦＲ遺伝子であり、最も好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００７９１に開示されたヒトＤＨＦＲ遺伝子のＣＤＳ（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ、４９３番目配列から１，０５６番目配列まで）配列が本発明でＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列として利用できる。
【００２６】
本発明の組み換え発現ベクターは、ｄｈｆｒ−動物細胞に利用される。本発明の好ましい具現例によると、前記動物細胞は、イースト（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞または哺乳動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞であって、さらに好ましくは、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞株、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ細胞株またはＢＨＫ（Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ）細胞株であり、最も好ましくは、ＣＨＯ細胞株を意味する。ＤＨＦＲが欠乏されたＣＨＯ細胞は、安全生と効用性が検証され、ＦＤＡから承認を受けて医薬用組み換え蛋白質の生産に広く使用されている。
【００２７】
本発明の好ましい具現例によると、本発明の発現ベクターは、外来遺伝子ヌクレオチド配列をさらに含む。
【００２８】
本発明で発現しようとする目的の蛋白質をコーディングする外来遺伝子は、あらゆる遺伝子配列を含む。例えば、前記外来遺伝子は、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、信号伝達蛋白質またはその一部分、抗体またはその一部分、単鎖抗体、結合蛋白質またはその結合ドメイン、抗原、付着蛋白質、構造蛋白質、調節蛋白質、毒素蛋白質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子またはワクチン蛋白質をコードするヌクレオチド配列を含む。より詳細には、本発明のベクターにより増幅及び発現される外来遺伝子は、インスリン、ＩＧＦ−１（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ １）、成長ホルモン、ＢＭＰ（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＧＦ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｈｔ ｆａｃｔｏｒ）、エリスロポエチン、Ｇ−ＣＳＦｓ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）、ＧＭ−ＣＳＦｓ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン−１アルファ及びベータ、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−６、インターロイキン−２、ＥＧＦｓ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、ＡＣＴＨ（ａｄｒｅｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｃ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＴＮＦ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ）、ＴＮＦＲ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＩＤＳ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−ｓｕｌｆａｔａｓｅ）、アトビスバン（ａｔｏｂｉｓｂａｎ）、ブセレリン（ｂｕｓｅｒｅｌｉｎ）、セトロレリクス（ｃｅｔｒｏｒｅｌｉｘ）、デスロレリン（ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）、デスモプレシン（ｄｅｓｍｏｐｒｅｓｓｉｎ）、ダイノルフィンＡ（ｄｙｎｏｒｐｈｉｎ Ａ）（１−１３）、エルカトニン（ｅｌｃａｔｏｎｉｎ）、エレイドシン（ｅｌｅｉｄｏｓｉｎ）、エプチフィバチド（ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ）、ＧＨＲＨ−II（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ−ＩＩ）、ゴナドレリン（ｇｏｎａｄｏｒｅｌｉｎ）、ゴセレリン（ｇｏｓｅｒｅｌｉｎ）、ヒストレリン（ｈｉｓｔｒｅｌｉｎ）、リュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｒｅｌｉｎ）、リプレシン（ｌｙｐｒｅｓｓｉｎ）、オクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）、オキシトシン （ｏｘｙｔｏｃｉｎ）、ピトレシン（ｐｉｔｒｅｓｓｉｎ）、セクレチン（ｓｅｃｒｅｔｉｎ）、シンカライド（ｓｉｎｃａｌｉｄｅ）、テルリプレッシン（ｔｅｒｌｉｐｒｅｓｓｉｎ）、チモペンチン（ｔｈｙｍｏｐｅｎｔｉｎ）、チモシン（ｔｈｙｍｏｓｉｎｅ）α１、トリプトレリン（ｔｒｉｐｔｏｒｅｌｉｎ）、ビバリルジン（ｂｉｖａｌｉｒｕｄｉｎ）、カルベトシン（ｃａｒｂｅｔｏｃｉｎ）、シクロスポリン、エキセディン（ｅｘｅｄｉｎｅ）、ランレオチド（ｌａｎｒｅｏｔｉｄｅ）、ＬＨＲＨ（ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ナファレリン（ｎａｆａｒｅｌｉｎ）、副甲状腺ホルモン、プラムリンチド（ｐｒａｍｌｉｎｔｉｄｅ）、Ｔ−２０（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、サイマルファシン（ｔｈｙｍａｌｆａｓｉｎ）またはジコノチドをコーディングするヌクレオチド配列を含む。
【００２９】
本発明の好ましい具現例によると、前記外来遺伝子ヌクレオチド配列の上流に、真核細胞で作動可能なプロモーター配列が結合されている。前記外来遺伝子を発現させるための真核細胞で作動可能なプロモーター配列は、サイトメガロウイルスの最初期プロモーター、ＳＶ４０のプロモーター（ＳＶ４０後期プロモーター及びＳＶ４０初期プロモーター）、ＨＳＶ（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）のｔｋプロモーター、アデノウイルス2主要後期プロモーター（Ａｄｅｎｏ ２ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ＰＡｄｍｌ）、アデノウイルス2初期プロモーター（ＰＡｄＥ２）、ＡＡＶ（ｈｕｍａｎ ｐａｒｖｏ ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）のｐ１９プロモーター、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ（ＲＳＶ）プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター、マウスのメタロチオネインプロモーター（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）、ＭＴプロモーター、ＭＭＴＶ ＬＴＲプロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ヒトＩＬ−２遺伝子のプロモーター、ヒトＩＦＮ遺伝子のプロモーター、ヒトＩＬ−４遺伝子のプロモーター、ヒトリンホトキシン遺伝子のプロモーター及びヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子のプロモーター、そしてヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンまたはヒトメタロチオネイン由来のプロモーターがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３０】
本発明の発現ベクターには、転写終結配列として、ポリアデニル化配列が含まれて、例えば、牛成長ホルモンターミネーター（Ｇｉｍｍｉ， Ｅ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：６９８３−６９９８（１９８９））、ＳＶ４０由来ポリアデニル化配列（Ｓｃｈｅｋ， Ｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：５３８６−５３９３（１９９２））、ＨＩＶ−１ ｐｏｌｙＡ（Ｋｌａｓｅｎｓ， Ｂ． Ｉ． Ｆ．， ｅｔ ａｌ．, Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６：１８７０−１８７６（１９９８））、β−グロビンｐｏｌｙＡ（Ｇｉｌ， Ａ．， ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ ４９：３９９−４０６（１９８７））、ＨＳＶ ＴＫ ｐｏｌｙＡ（Ｃｏｌｅ， Ｃ． Ｎ． ａｎｄ Ｔ． Ｐ． Ｓｔａｃｙ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：２１０４−２１１３（１９８５））またはポリオマーウイルスｐｏｌｙＡ（Ｂａｔｔ， Ｄ． Ｂ ａｎｄ Ｇ． Ｇ． Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５：４７８３−４７９０（１９９５））を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
また、本発明の発現ベクターは、選択標識として、当業界で通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含むことができ、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ゲネチシン（Ｇ４１８）、ネオマイシンまたはテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含む。
【００３２】
本発明のより好ましい具現例によると、前記外来蛋白質を大量に生産するための動物細胞用発現ベクターは、図３ａに示された遺伝子地図を有するベクターであり、最も好ましくは、ｐＪＫ−ｄｈｆｒ−１（ＫＣＴＣ １１２９９ＢＰ）またはｐＪＫ−ｄｈｆｒ−２（ＫＣＴＣ １１３００ＢＰ）である。
【００３３】
本発明の他の様態によると、本発明は、上述のｄｈｆｒ−動物細胞用ベクターにより形質転換されたｄｈｆｒ−動物細胞株を提供する。
【００３４】
本発明において、ｄｈｆｒ−動物細胞を発現ベクターで形質転換する方法は、微量注入法（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ．， Ｃｅｌｌ， ２２：４７９（１９８０））、カルシウムホスフェート沈殿法（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６（１９７３））、電気穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １：８４１（１９８２））、リポソーム−媒介形質転換法（Ｗｏｎｇ， Ｔ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １０：８７（１９８０））、ＤＥＡＥ−デキストラン処理法（Ｇｏｐａｌ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．, ５：１１８８−１１９０（１９８５））、及び遺伝子ボンバードメント（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７：９５６８−９５７２（１９９０））などを含む。
【００３５】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、（ａ）上述の外来蛋白質を大量に生産するための本発明の細胞株を、ジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤の添加下で培養する工程と、（ｂ）培養物から外来蛋白質を精製する工程と、を含む製造方法を提供する。
【００３６】
前記ＤＨＦＲの阻害剤は、例えば、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）及びメトトレキサート（ＭＴＸ）などがあるが、これに限定されるものではなく、最も好ましくは、メトトレキサートである。
【００３７】
遺伝子増幅に利用されるＭＴＸは、高価であるため、試験管水準で行われる実験室における実験では重要な考慮要素とされないが、大容量水準で行われる場合は、重要な考慮要素になる。また、例えば、１μＭ濃度まで段階別に細胞を適応させるためには、６ヶ月以上の長い期間が所要されて、ＭＴＸの高濃度培養で細胞成長が低下する副作用がある。
【００３８】
したがって、当業界では、遺伝子増幅のために添加されるＭＴＸの濃度を減少させるために研究を続けている。一方、通常当業界では、遺伝子増幅のために、ＭＴＸ０．０５ｍＭ〜５ｍＭ程度が利用されている。本発明の製造方法に利用される細胞株は、低濃度のＭＴＸでも遺伝子増幅がよくなされるように形質転換されたものである。本発明に添加されるメトトレキサートの濃度は、０．００１μＭ〜１０μＭが好ましく、より好ましくは、０．００３μＭ〜１μＭであり、最も好ましくは、０．００５μＭ〜０．３２μＭである。
【００３９】
本発明の製造方法において、培養する工程は、本発明で通常利用される培地で行うことができる。例えば、本発明で利用できる培地は、動物細胞の培養に通常利用される如何なる培地でも可能であり、例えば、Ｅａｇｌｅｓ’ｓ ＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ， Ｅａｇｌｅ， Ｈ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １３０：４３２（１９５９））、α−ＭＥＭ （Ｓｔａｎｎｅｒ， Ｃ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ． ２３０：５２（１９７１））、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅ， Ｎ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １４７：９２３（１９７８））、１９９培地（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏ． Ｍｅｄ．， ７３：１（１９５０））、ＣＭＲＬ １０６６、ＲＰＭＩ １６４０（Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｍｅｄ． Ａｓｓｏｃ． １９９：５１９（１９６７））、Ｆ１２ （Ｈａｍ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ５３：２８８（１９６５））、Ｆ１０ （Ｈａｍ， Ｒ．Ｇ． Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２９：５１５（１９６３））、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ， Ｄｕｌｂｅｃｃｏ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８：３９６（１９５９））、ＤＭＥＭとＦ１２の混合物（Ｂａｒｎｅｓ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：２５５（１９８０））、Ｗａｙ−ｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ７５２／１（Ｗａｙｍｏｕｔｈ， Ｃ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ２２：１００３（１９５９））、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ （ＭｃＣｏｙ， Ｔ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １００：１１５（１９５９））及びＭＣＤＢシリーズ（Ｈａｍ， Ｒ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ １４：１１（１９７８））などが利用できる。培地に関する説明は、Ｒ． Ｉａｎ Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに詳細に記載されており、この文献は、本明細書に参照として取り込まれる。
【００４０】
前記培養工程で、宿主細胞内に発現された外来蛋白質が培地に分泌されて、このように分泌された外来蛋白質を精製すると、目的の蛋白質が多量に得られる。本発明において、前記精製工程は、当業界で通常利用される精製方法を採用して行うことができる。例えば、アンモニウムサルフェートまたはＰＥＧなどを利用した溶解度による分離（ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）、分子量による限外ろ過分離、多様なクロマトグラフィー（大きさ、電荷、疎水性または親和性による分離のために製作されたもの）による分離など、多様な方法が利用でき、通常、上記の方法の組み合わせを利用して精製する。
【発明の効果】
【００４１】
本発明は、プロモーター活性が減少されたＤＨＦＲプロモーターを含むｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクターを提供する。
【００４２】
本発明のベクターは、既存動物細胞発現ベクターと比較し、著しく少ないメトトレキサート濃度下でも効果的にＤＨＦＲ遺伝子と共に外来遺伝子が増幅された細胞株クローンを選別することができるようにする。
【００４３】
本発明によると、減少された濃度のメトトレキサートの使用による費用節減効果があり、細胞株の成長速度及び生産性側面で優れた効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１ａ及び１ｂは、本発明で使用したＤＨＦＲ基本プロモーターの配列Ａ及びＢである。
【図２】図２は、本発明でルシフェラーゼ発現量の比較によるプロモーター性能実験結果である。
【図３】図３ａは、本発明の動物細胞用組み換え発現ベクターの模式的な遺伝子地図であり、図３ｂは、本発明の動物細胞用組み換え発現ベクターの具体的な一実施例であるｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１の遺伝子である。図３ｃは、本発明の動物細胞用組み換え発現ベクターを構築するために使用されるｐＭＳ発現ベクターの遺伝子地図である。図３ａにおいて、ＤＨＦＲ：ヒト由来ＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列；ｄｈｆｒ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ：配列番号１または２のマウス由来。
【図４】図４は、本発明のｐＪＫ−ＤＨＦＲ−２発現ベクターの構造を示した模式図である。
【図５】図５は、本発明のｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２発現ベクターの構造を示した模式図である。
【図６】図６ａ及び図６ｂは、本発明のｐＪＫＩｇ及びｐＪＫＩｇ−ＲＳＶ ＨＫ発現ベクターの構造を示した模式図である。
【図７】図７は、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターを利用して製作したヒトＴＮＦＲ発現細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果である。
【図８】図８は、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２ベクターを利用して製作したヒトＩＤＳ発現細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果である。
【図９】図９は、ｐＪＫＩｇベクターを利用して製作したＲＳＶ抗体発現細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果である。
【図１０】図１０は、ｐＪＫＩｇベクターを利用して製作したＧＳ０５１抗体発現細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果である。
【図１１】図１１ａは、ｐＪＫＩｇベクターを利用して製作したＧＳ０７１抗体発現細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果であり、図１１ｂは、ＧＳ０７１抗体発現細胞株の、２０ｎＭ ＭＴＸで増幅した後、再びサブクローニングして得た細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果であって、図１１ｃは、ＧＳ０７１抗体発現細胞株の、８０ｎＭ ＭＴＸで増幅した後、再びサブクローニングして得た細胞株の発現力価をＥＬＩＳＡにより分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４６】
（実施例１：マウス由来ＤＨＦＲプロモーター、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターとエンハンサーのクローニング）
ＤＨＦＲプロモーターに対するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、以下のような方法で行った。
【００４７】
まず、マウスＤＨＦＲ遺伝子の５’端配列に含まれ、強力なＴＡＴＡ配列を有し、基本プロモーター活性を有するＤＨＦＲプロモーター領域を得るために、ゲノムＤＮＡ分離キット（Ｉｎｔｒｏｎ、大韓民国）を使用してマウスのゲノムＤＮＡを分離した。分離されたマウス核酸２００ｎｇを５０ｐｍｏｌのＰ１及びＰ２プライマー、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、並びにＳｏｆｔＭａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｔｒｏｎ、大韓民国）を添加して、９５℃で１分間の変性、５５℃で４０秒間及び７２℃で４０秒間を１サイクルとして２９回繰り返し、最後に７２℃で１０分間ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）して、マウス由来ＤＨＦＲプロモーターを増幅した。
【００４８】
ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーターとプロモーター／エンハンサー（プロモーターと作動的に連結されたエンハンサー）ＤＮＡ断片は、１０ｎｇのｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）を鋳型としてＰ３とＰ４、並びにＰ３とＰ５それぞれのプライマー組を使用して、前記マウス由来ＤＨＦＲプロモーターを増幅する方法と同一のＰＣＲ法（温度、時間及びサイクル）を利用して増幅した。それぞれのプライマーの塩基配列とＰＣＲを通じて得られたＤＮＡ断片の大きさを、下記表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
ＰＣＲによって得たそれぞれのＤＮＡ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ制限酵素で処理した後、ジンクリーンＩＩＩターボキット（Ｂｉｏ １０１、米国）で精製して、前記制限酵素と同一の制限酵素で切断されたｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）にサブクローニングし、ｐＧＬ２−ＤＨＦＲベクター、ｐＧＬ２−ＳＶ４０プロモーターベクター及びｐＧＬ２−ＳＶ４０プロモーター／エンハンサーベクターをそれぞれ製造した。ｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃベクターは、ルシフェラーゼ遺伝子がコードされているベクターである。
【００５１】
（実施例２：ｐＧＬ２−ＤＨＦＲ、ＳＶ４０プロモーター、ＳＶ４０プロモーター及びエンハンサーにより転写が調節されたルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルを測定することによるプロモーター活性の比較実験）
１）遺伝子導入
ＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ、米国）を、牛胎児血清が１０％添加されたＤＭＥＭ培養培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ； ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、米国）に接種して、３７℃、 ５％ ＣＯ２恒温器で継代培養した。前記細胞を１００ｍｍ培養皿に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度で接種して、３７℃で一晩中培養した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｍｅｄｉａ I； ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、米国）溶液で３回洗浄した。一方、上記で製造したベクターｐＧＬ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＧＬ２−ＤＨＦＲ、ｐＧＬ２−ＳＶ４０Ｐ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）及びｐＧＬ２−ＳＶ４０ Ｐ／Ｅ（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ）をそれぞれ５μｇずつ取って、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ ５００μＬで希釈して、２５μＬのリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社、米国）も同様にＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉ ５００μＬで希釈した。前記発現ベクターとリポフェクタミン希釈液を１５ｍＬチューブに混合してＤＮＡ−リポフェクタミン混合物を製造した後、これを１５分間以上室温で放置した。上記それぞれのＤＮＡ−リポフェクタミン混合物に５ｍＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ Ｉを添加して、これをきれいに洗浄されたＣＯＳ７細胞に均一に混合した後、３７℃、５％ ＣＯ２恒温器で４８時間培養した。
【００５２】
２）ルシフェラーゼ発現量比較測定
それぞれのベクターに挿入されたプロモーターの活性を比較するために、各ベクターにより発現されるルシフェラーゼ量を測定した。ベクターが導入されてから４８時間培養した細胞を５ｍＬのＰＢＳで洗浄した後、再び１ｍＬのＰＢＳを入れて、スクレーパーを利用し細胞を集めた。集められた細胞を４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して上澄液を除去した。細胞を溶解させるために、上澄液の除去後、２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．８）／１ｍＭ ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）溶液を５０μＬ添加した後、液体窒素に１分間浸した後、再び３７℃で１分間放置する過程を３回繰り返した。その後、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離し、細胞が除去された上澄液のみを取って、−２０℃に保管した。
【００５３】
ルシフェラーゼ測定のために、１２ｍｍ×７５ｍｍの５ｍＬチューブにＡ溶液（２５ｍＭ ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ７．８）、０．２Ｍ ＡＴＰ、１Ｍ ＭｇＳＯ４, Ｈ２Ｏ）を３５０μＬずつ分注した後、Ｂ溶液（２５ｍＭ ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ（ｐＨ７．８）、Ｄ−ルシフェリン（５ｍｇ／１６．５ｍＬ Ｈ２Ｏ））を１００μＬ添加して、発光測定器に挿入した。ルシフェラーゼ活性を測定するため、Ａ溶液に測定液を４０μＬ入れて、２５℃で３０秒間ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、新しく選択されたＤＨＦＲの基本プロモーターの活性は、意図通り、既存のＳＶ４０プロモーターや、プロモーターとエンハンサーとが共に入っているプロモーターの活性に比べ、２，３００倍及び３，８００倍程度に著しく低い活性を示すことを確認することができた（表２及び図２）。
【００５４】
【表２】
【００５５】
（実施例３：ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターの製造）
ＤＨＦＲ遺伝子をクローニングするために、ヒトの血液から、ゲノムＤＮＡ分離キット（Ｉｎｔｒｏｎ、大韓民国）を使用してヒトのゲノムＤＮＡを分離した。純粋分離したヒトゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによりＤＨＦＲ遺伝子を増幅した。
【００５６】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、以下のような方法で行った。まず、ＤＨＦＲ遺伝子の場合、分離したヒトゲノムＤＮＡ２００ｎｇを鋳型として使用し、Ｐ６及びＰ７プライマーをそれぞれ５０ｐｍｏｌ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ及びＳｏｆｔＭａｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｔｒｏｎ、大韓民国）を添加して、９５℃で１分間、５５℃で４０秒間及び７２℃で４０秒間を１サイクルとして２９回繰り返した後、７２℃で１０分間反応した。その結果、１，４６２ｂｐのＤＨＦＲ遺伝子を合成した。マウスＤＨＦＲ基本プロモーターは、ｐＧＬ２−ＤＨＦＲを鋳型として、Ｐ８及びＰ９プライマーで上記と同一のＰＣＲ法（温度、時間及びサイクル）を利用してＤＨＦＲプロモーター領域を増幅した。
【００５７】
合成されたＤＨＦＲ基本プロモーターの３’領域とＤＨＦＲ遺伝子の５’領域は、互いに共通的な１９ｂｐ塩基配列領域を有しており、前記共通的な領域をＰ８及びＰ７プライマーでＰＣＲを行って、基本プロモーターとＤＨＦＲ遺伝子が連結された１，６０５ｂｐのDNA断片を合成した。それぞれのプライマーの塩基配列とＰＣＲを通じて得られたDNA断片の大きさは、上記表１に示す。
【００５８】
ＰＣＲによって増幅されたＤＨＦＲプロモーターとＤＨＦＲ遺伝子ＤＮＡ断片を、ＢａｍＨＩ制限酵素を使用して切断して、ｐＭＳベクター（ＡＰＲＯＧＥＮ、大韓民国）をＢｇｌＩＩ制限酵素で開環し、ＤＨＦＲプロモーターと遺伝子を前記ベクターに挿入してｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターを製造した（図３ａ及び３ｂ）。ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターは、２００８年３月１１日付にて韓国生命工学研究院遺伝子バンクに寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １１２９９ＢＰ）。
【００５９】
（実施例４：ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−２ベクターの製造）
ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターのＤＨＦＲプロモーターをさらに短くして、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−２ベクターを製造した。ＰＣＲ合成は、実施例３と同様の方法で行った。ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターを鋳型として、Ｐ１０及びＰ７プライマー対でＰＣＲ法を使用しＤＨＦＲプロモーター及びＤＨＦＲ遺伝子を合成した。プライマーの塩基配列とＰＣＲで増幅されたＤＮＡ断片の大きさは、上記表１に示す。
【００６０】
ＰＣＲを通じて得られたプロモーターとＤＨＦＲ遺伝子断片を、ＢａｍＨＩ 制限酵素を使用して切断して、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターをＢｇｌＩＩ制限酵素で開環した。ＤＨＦＲプロモーターと遺伝子を前記ベクターに挿入してｐＪＫ−ＤＨＦＲ−２ベクターを製造した（図４）。ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−２ベクターは、２００８年３月１１日付にて韓国生命工学研究院遺伝子バンクに寄託した（受託番号：ＫＣＴＣ １１３００ＢＰ）。
【００６１】
（実施例５：ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２ベクターの製造）
ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１と比較し、ＤＨＦＲ遺伝子が逆方向に挿入されたベクターであるｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２を製作する方法は、以下のようである。上記の実施例３のように、ＰＣＲによりＤＨＦＲプロモーターと遺伝子を増幅して、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターをＢｇｌＩＩで開環し、合成したプロモーターと遺伝子をＢａｍＨＩで処理して挿入した後、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１と比較し、ＤＨＦＲ遺伝子が逆方向に挿入されたベクターをスクリーニングして、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２を製作した（図５）。
【００６２】
（実施例６：ｐＪＫＩｇベクター及びｐＪＫＩｇベクターを利用した組み換え抗体ベクターの製造）
ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターを活用して、以下のように抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子をクローニングするためのベクターであるｐＪＫＩｇベクターを製造した。
【００６３】
まず、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を除去し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素（Ｒｏｃｈｅ、スイス）を処理して連結させて、再びＸｈｏＩ−ＡｐａＩ断片を除去して再び連結して、ＢｓｍＩ酵素でベクターを開環して、クレノウ酵素を処理して用意した。
【００６４】
また他のｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターの多数クローニング部位のＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ範囲を除去し、クレノウ酵素とリガーゼを処理して自己連結した。多数クローニング部位にあるＡｐａＩ部位を除去するために、ＸｂａＩ及びＰｖｕＩＩ制限酵素で切断した後、プライマーＰ１１及びＰ１２でＰＣＲを通じてＸｂａＩ−ＰｖｕＩＩ領域の３１６ｂｐ断片を作った後、再挿入した。ＸｂａＩ−ＰｖｕＩＩ断片が挿入されたｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１ベクターをＮｒｕＩ−ＰｖｕＩＩ酵素で切断し、１，０７５ｂｐの断片を作って、この断片を、前記制限酵素ＢｓｍＩで開環されたベクターに挿入して、ｐＪＫＩｇベクターを製作した（図６ａ）。ｐＪＫＩｇベクターにＲＳＶ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）抗体の重鎖及び軽鎖が挿入されたｐＪＫＩｇ−ＲＳＶ ＨＫベクターを製作するために、まずＲＳＶに結合する抗体の重鎖の可変及び不変領域がｐＧＥＭ Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）に挿入されたｐＧＥＭ Ｔ／ＲＳＶ ＨｖＨｃベクターの免疫グロブリン重鎖の可変及び不変領域をＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ酵素で切断した後、ｐＪＫＩｇベクターを同一な酵素で切断して挿入した。前述したのと同様の方法で、ｐＧＥＭ Ｔ／ＲＳＶ ＫｖＫｃベクターの免疫グロブリン軽鎖の可変及び不変領域をＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩ酵素で切断した後、ｐＪＫＩｇベクターに挿入して、ｐＪＫＩｇ−ＲＳＶ ＨＫベクターを製作した（図６ｂ）。
【００６５】
（実施例７：ｐＪＫ−ＤＨＦＲ及びｐＪＫＩｇベクターの有用性を確認するための組み換え蛋白質及び抗体生産細胞株確立実験）
ｐＪＫ−ＤＨＦＲベクターを使用するために、ｐＪＫ−ＤＨＦＲ−１とｐＪＫ−ＤＨＦＲ−Ｏｒ２ベクターをそれぞれＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩ制限酵素で処理し、ヒト由来ＴＮＦ−Ｒ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）及びＩＤＳ（ｉｄｕｒｏｎａｔｅ−２−ｓｕｌｆａｔａｓｅ）酵素をコードするｃＤＮＡを挿入した。ｐＪＫＩｇ−ＧＳ０５１ Ｈ／Ｋベクターは、前記ｐＪＫＩｇ−ＲＳＶ ＨＫベクターの重鎖領域をＥｃｏＲＩ及びＡｐａＩ制限酵素で切断した後、ＧＳ０５１抗体の重鎖領域をコードするｃＤＮＡを挿入して、軽鎖領域をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｓｉＷＩ制限酵素で切断した後、ＧＳ０５１抗体の軽鎖領域を暗号化するｃＤＮＡを挿入して製造した。また、上記のような方法でＧＳ０７１抗体を発現するｐＪＫＩｇ−ＧＳ０７１ Ｈ／Ｋベクターを製造した。
【００６６】
上記のように製造された目的蛋白質発現または抗体発現ベクターを、ＤＨＦＲ遺伝子機能が欠如されているＣＨＯ ＤＧ４４（コロンビア大学校、米国）細胞にそれぞれ形質導入して、抗生剤Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、米国）を使用して一次的に細胞株を選別した。選別された細胞株培地内ＭＴＸ濃度を２０ｎＭ、８０ｎＭ、３２０ｎＭ及び１，０００ｎＭに漸次的に増加させながらクローン別目的蛋白質または抗体発現量によって高発現細胞株を選別した。この際、発現量は、それぞれ選別された細胞株を６−ウェルプレートに５×１０５細胞を入れて３日間培養した後、培地を回収して、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）方法により測定した。標準品としては、それぞれを精製して濃度を既に知っている蛋白質を使用した。
【００６７】
その結果、図７に示されたように、８０ｎＭのＭＴＸ濃度で高発現細胞株が選別された。図９では、３２０ｎＭ及び１μＭのＭＴＸ濃度で高発現細胞株が選別された。しかしながら、１μＭのＭＴＸ濃度で選別された細胞株は、成長性がよくなかった。図１１では、２０ｎＭと８０ｎＭのＭＴＸで増幅して選別された３−５−６クローンを、再びサブクローニングを通じて高発現細胞株を選別した。このように、既存の目的蛋白質及び抗体発現のために使用してきたＭＴＸ濃度とは違って、弱いＤＨＦＲプロモーターと遺伝子を利用して、０．００５μＭ〜０．３２μＭの少ない濃度でも高発現された目的蛋白質及び抗体を確認することができた。
【００６８】
以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１または配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）プロモーター、及び（ｂ）前記プロモーターに作動的に連結されたＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列を含むことを特徴とするｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項２】
前記ＤＨＦＲプロモーターが、マウス由来であり、ＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列が、ヒト由来である請求項１に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項３】
前記動物細胞が、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞である請求項１に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項４】
前記発現ベクターが、外来遺伝子ヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項５】
前記外来遺伝子ヌクレオチド配列の上流に、真核細胞で作動可能なプロモーター配列が結合されている請求項１に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項６】
前記発現ベクターが、図３ａの遺伝子地図を有する請求項１に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項７】
前記発現ベクターが、ＫＣＴＣ １１２９９ＢＰとして寄託されたベクターである請求項６に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項８】
前記発現ベクターが、ＫＣＴＣ １１３００ＢＰとして寄託されたベクターである請求項６に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のベクターにより形質転換された動物細胞。
【請求項１０】
（ａ）請求項９に記載の動物細胞をメトトレキサートの添加下で培養する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の培養結果物から目的蛋白質を精製する工程と、
を含む目的蛋白質の製造方法。
【請求項１】
（ａ）配列番号１または配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むジヒドロ葉酸還元酵素（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＦＲ）プロモーター、及び（ｂ）前記プロモーターに作動的に連結されたＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列を含むことを特徴とするｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項２】
前記ＤＨＦＲプロモーターが、マウス由来であり、ＤＨＦＲ−コーディングヌクレオチド配列が、ヒト由来である請求項１に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項３】
前記動物細胞が、ＣＨＯ（Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ）細胞である請求項１に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項４】
前記発現ベクターが、外来遺伝子ヌクレオチド配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項５】
前記外来遺伝子ヌクレオチド配列の上流に、真核細胞で作動可能なプロモーター配列が結合されている請求項１に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項６】
前記発現ベクターが、図３ａの遺伝子地図を有する請求項１に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項７】
前記発現ベクターが、ＫＣＴＣ １１２９９ＢＰとして寄託されたベクターである請求項６に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項８】
前記発現ベクターが、ＫＣＴＣ １１３００ＢＰとして寄託されたベクターである請求項６に記載のｄｈｆｒ−動物細胞用組み換え発現ベクター。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載のベクターにより形質転換された動物細胞。
【請求項１０】
（ａ）請求項９に記載の動物細胞をメトトレキサートの添加下で培養する工程と、
（ｂ）前記工程（ａ）の培養結果物から目的蛋白質を精製する工程と、
を含む目的蛋白質の製造方法。
【図２】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【図３ａ】
【図３ｂ】
【図３ｃ】
【図４】
【図５】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１ａ】
【図１１ｂ】
【図１１ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５２７５６７（Ｐ２０１１−５２７５６７Ａ）
【公表日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１７３４５（Ｐ２０１１−５１７３４５）
【出願日】平成２１年７月７日（２００９．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００３７１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００５２２７
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５１１００８０９０）アプロゲン インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月４日（２０１１．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月７日（２００９．７．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００９／００３７１４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００５２２７
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５１１００８０９０）アプロゲン インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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