安定なタンパク質分解酵素含有組成物
【課題】水を含有し安定な液状のタンパク質分解酵素含有を提供すること。
【解決手段】タンパク質分解酵素、水、粘土鉱物を含有することを特徴とする液状形態の酵素活性が安定な組成物。
【解決手段】タンパク質分解酵素、水、粘土鉱物を含有することを特徴とする液状形態の酵素活性が安定な組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質分解酵素、特に液状に加工されたタンパク質分解酵素含有組成物の安定化に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動植物あるいは微生物を起源とする各種の加水分解酵素類を筆頭として各種多様な酵素類が、工業分野や生活の中で使用されている。化粧品や洗剤など日常品にも各種酵素が配合されている。これらの酵素類は固定化酵素を除き、通常水性溶液として使用される。しかし、一般に、酵素は、水溶液状態では不安定であり、時間とともにその酵素活性を失う。
【０００３】
また、酵素類は流通段階での安定性を考えて、粉末もしくは顆粒等の固体状態で製品化されることが多い。しかし粉末の酵素は、取り扱いにあたって飛散の防止や、吸湿などの問題がある。供給される酵素類が長期に安定な溶液状態であれば、使用量の調節や、希釈、混合操作も簡単となり、酵素製剤使用上の利便性が著しく高まる。貯蔵の間の十分な酵素安定性を確保することは、流通あるいは消費に要する時間が長い、一般消費者向けの液体酵素洗剤のような液体酵素系の配合物の場合、特に重要である。最近では、工業向けに一部酵素製剤が溶液状態で流通されるようになって来ているが、その安定性は十分なものとはいえない。
【０００４】
酵素溶液の安定化方法に関しては、各種のものが提案されている。例えば、リパーゼ水溶液に１価又は多価アルコールのポリオキシアルキレンエーテルを添加する方法（特許文献１：特開昭５９−１７３０８０号公報）のように、各種界面活性剤を添加する方法や、各種酵素のアルコール性水溶液にソルビトール、マルチトールのような糖アルコールを添加する方法（特許文献２：特開昭６１−１３９３８４号公報）等が知られている。
【０００５】
また、デキストリンのような水溶性高分子を添加する方法も、提案されている（特許文献３：特開平０２−２６１８９８号公報）。
【０００６】
化粧品などに使用するタンパク質分解酵素の安定化にはイソマルトオリゴ糖、ラフィノース、フルクトースなどの糖類、グリシルグリシンやアルギニルグルタミン酸などのペプチドを使用する技術が開示されている（特許文献４：特開２００５−３０６８２２）。
【０００７】
あるいは多糖類ステロイドのハイドロゲルに酵素を内包させて安定化を果たす方法が提案されている（特許文献５：特開２００２−１４６１００号公報）。
【０００８】
さらに又、液状洗濯用洗剤や自動食器洗浄機用液体洗剤に使用するための洗浄用各種酵素を粘土やシリカなどの多孔性の構造体に吸着させ、その多孔性の構造体をシリコーン油などの疎水性物質でコーティングしておくことで、洗剤中での安定性を保つ技術が提案されている（特許文献６：特表平０９−５１１００５号公報）。これらの提案のいずれも未だ十分なものではない。特に化粧料用途としてタンパク質分解酵素を化粧料に配合するための安定な液状組成物としては、酵素活性の維持と使用感の両方を満たす必要があるが、これらの面からみて必ずしも適切とはいえないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭５９−１７３０８０号公報
【特許文献２】特開昭６１−１３９３８４号公報
【特許文献３】特開平０２−２６１８９８号公報
【特許文献４】特開２００５−３０６８２２号公報
【特許文献５】特開２００２−１４６１００号公報
【特許文献６】特表平０９−５１１００５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
タンパク質分解酵素を含有する酵素活性の安定な液状又はクリーム状組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）タンパク質分解酵素、水、粘土鉱物を含有することを特徴とする液状形態の酵素活性が安定な組成物。
（２）タンパク質分解酵素がパパイン又はブロメラインである（１）に記載の組成物。
（３）粘土鉱物が、タンパク質分解酵素１重量部あたり１〜２００重量部含有する（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）粘土鉱物が膨潤性層状ケイ酸塩を含有するものである（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）粘土鉱物が、スメクタイト系の粘土鉱物、雲母粘土鉱物、カオリン鉱物、タルクのいずれかである（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）スメクタイト系の粘土鉱物がモンモリロナイト、ベントナイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイトから選択される１以上である（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）水の含有量が５重量％以上である（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）さらに、多価アルコールと界面活性剤を含有する（１）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）さらに酵素安定剤を含有する（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）酵素安定剤が亜硫酸の塩である（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は（１）水溶液、（２）界面活性剤存在下の水溶液等液状態において粘土鉱物の添加によって酵素活性が安定化し、品質の維持・向上が顕著な組成物とすることができる。特に本発明の組成物は、含有するタンパク質分解酵素の活性が長期間安定に保たれており、さらに形態が液状であるため種々の食品、薬品、化粧品に配合することができる。特に化粧品の製造に当たって簡便に、液状化粧料に配合することができる。また、粉末状の酵素の場合、配合時に微粉末の飛散を防止したり、作業員が吸引したりすることを予防するための設備や器具が必要となるが、液状のためこのような設備や器具を必要としない。さらに、本発明のタンパク質分解酵素含有組成物を配合した場合、化粧料の使用感が良く、洗浄用化粧料は特に使用感が好ましい。特に注目すべきはパパインにおいて上記効果が顕著であり、粉末でしか提供できなかったパパイン含有組成物を液状で提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】水中でのタンパク質分解酵素の活性変化を示す。
【図２】グリセリンを含有する水中でのタンパク質分解酵素活性の変化を示す。
【図３】酵素安定剤として亜硫酸ナトリウムを含有する水中でのタンパク質分解酵素の活性変化を示す。
【図４】粘土鉱物を含有する水中でのタンパク質分解酵素活性の変化を示す。
【図５】パパインの酵素活性の安定化に粘土鉱物スメクタイトが有効であることを示す。
【図６】パパインの酵素活性の安定化粘土鉱物ベントナイトが有効であることを示す。
【図７】ブロメラインの酵素活性の安定化に粘土鉱物スメクタイトが有効であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明で用いるタンパク質分解酵素としては、化粧料に配合できるものであれば微生物由来、植物由来、動物由来のいずれも使用することができる。微生物由来のタンパク質分解酵素としては、例えば、カビ由来のプロテアーゼ、酵母由来のプロテアーゼ、細菌由来のプロテアーゼ等を例示することができる。植物由来のタンパク質分解酵素としては、例えば、パパイン、キモパパイン、ブロメライン、フィシン等を例示することができる。動物由来のタンパク質分解酵素としては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、パンクレアチン等を例示することができる。洗顔用化粧料に使用する場合には、特にアルカリ性域に至適ｐＨ値を有する酵素が好ましいが、特にパパイン又はブロメラインが好ましい。本発明に使用する酵素は、粗酵素であっても精製酵素であっても良い。また原料の植物から抽出しても良いし、市販の工業や医薬品用の酵素であってもよい。特にパパインは、至適ｐＨが７〜８にある、パパイヤの実から抽出した植物プロテアーゼであり、耐熱性や耐酸性が高く、基質特異性が広く非常に安定な酵素であり好ましい。
本発明においては、使用目的に合わせて所望の酵素活性を調整することができる。酵素の量は、酵素重量または酵素活性で組成物中の含有量を特定することができる。本発明においては、組成物中のタンパク質分解酵素の含有量を０．０１重量％とすることができる。酵素含有量は目的に応じて調整することができ、特に配合量の上限はない。
また本発明組成物は、従来の技術と異なり、水分含量（水分量）を５重量％以上にすることができることが大きな特徴である。本発明においては、水分量は５重量％以上であれば特に制限されない。
【００１５】
本発明においてタンパク質分解酵素の安定化に重要な役割を果たすのは粘土鉱物である。粘土鉱物に含有される膨潤性層状ケイ酸塩は、陽イオン交換能を有し、更に層間に水を取り込んで膨潤していく層状ケイ酸塩で、スメクタイト型粘土や膨潤性雲母等が知られている。
本発明でいう粘土鉱物とはこのような物質を全て包含する。従来技術においても述べたように、粘土鉱物は、その層状構造中にタンパク質分解酵素などのタンパク質を吸着し、安定化させることが知られている。しかし水を含む系においては、水の存在によって酵素活性を失うため、水を極力添加しないかあるいは、水の影響を排除するために酵素を吸着した粘土鉱物の表面をシリコーンなどの疎水性の物質でコーティングする必要があった。しかし本発明の組成物とすることで、タンパク質分解酵素力価を長期間安定に維持することができる。
【００１６】
粘土鉱物の具体例としては、天然物、天然物からの精製物又は合成の何れのものであっても特に限定されないが、例えば、カオリン、ナクライト、ディッカイト、ハロサイトなどのカオリン系粘土鉱物、アンティゴライト、アメサイト、クロンステダイトなどのアンティゴライト系粘土鉱物、パイロフィライト、タルク（滑石）などのパイロフィライト系粘土鉱物、イライト、海緑石、セラドナイト、セリサイト、マイカ（雲母）、白雲母、クロム白雲母、黒雲母などの雲母系粘土鉱物、ベントナイト、モンモリロナイト、バイデライト、ノントナイト、サポナイト、ヘクトライト、ルーセンタイトなどのスメクタイト系粘土鉱物、バーミキュライトなどのバーミキュライト系粘土鉱物；緑泥石（クロライト）などの緑泥石系粘土鉱物、スメクタイト系やバーミキュライト系の粘土鉱物を塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウムなどの第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤で処理した有機変性粘土鉱物などを例示することができる。これら成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を適宜組合せて用いることもできる。
【００１７】
本発明においては、酵素安定性並びに、使用感から、スメクタイト系粘土鉱物であるベントナイト、モンモリロナイト、バイデライト、ノントナイト、サポナイト、ヘクトライト、ルーセンタイトなどの粘土鉱物が好ましい。特に化粧品用途においては、ベントナイト、モンモリロナイト、バイデライト、ノントナイト、サポナイトが特に好ましい。スメクタイト系粘土鉱物以外では、カオリン、タルク、マイカ、セリサイトが好ましい。粘土鉱物は市販品をそのまま用いることができる。スメクタイト系としては、モンモリロナイトとしてクニミネ工業（株）製のクニピアＧ（商品名）及びクニピアＦ（商品名）、アメリカンコロイド社製のウエスタンボンド（商品名）、ドレッサーミネラルズ社製のイエローストーン（商品名）などが市販されている。サポナイトを含有するものとして、バンダービルド社製のビーガム（製品名）、ビーガムＨＶ（製品名）、ビーガムＦ（製品名）、ビーガムウルトラ（製品名）及びビーガムＫ（製品名）などが、また、ヘクトライトを含有するものとして、アメリカンコロイド社製のヘクタブライトＡＷ（製品名）、ヘクタブライト２００（製品名）及びベントンＥＷ（製品名）、ナショナルリード社製のマカロイド（製品名）などが市販されている。また、合成スメクタイトには、例えば水澤化学工業（株）製のイオナイトＨ（製品名）が、コープケミカル（株）製のＳＷＮ（製品名）やＳＡＮ（製品名）が、ラポルテインダストリー社からラポナイト（製品名）がそれぞれ市販されている。
【００１８】
膨潤性合成雲母は、タルクとケイフッ化アルカリの混合物を加熱処理して得られる膨潤性合成雲母が挙げられ、タルクとケイフッ化ナトリウム及び／又はケイフッ化リチウムとを混合した微粉末を６００〜１２００℃に加熱処理して得られるものが好ましい。このような膨潤性合成雲母としては、コープケミカル（株）製の膨潤性合成雲母ＭＥシリーズ（商品名）、トピー工業（株）製のナトリウム四ケイ素雲母（商品名、ＤＰ−ＤＭ及びＤＭクリーン）などが挙げられる。
【００１９】
また、本発明におけるカオリン系粘土鉱物として、酸性白土のアルカリ処理物も用いることができる。この酸性白土は、通常１重量％水溶液分散液のｐＨ５〜６以下、膨潤度１０ｍｌ／２ｇ以下、ＳｉＯ２とＡｌ２Ｏ３のモル比（ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３）６〜１０を有し、このようなものとしては、例えば中条、小戸、上赤谷、糸魚川、水澤、川崎、松根、三川、青梅、上砂見産の酸性白土や、これらの酸性白土と類似の性質を示す英国産のフラーズ・アース（Ｆｕｌｌｅｒ’ｓ ｅａｒｔｈ）、米国産のフロライド・アース（Ｆｌｏｒｉｄｅ ｅａｒｔｈ）、ドイツ産のワルケル・エルデ（Ｗａｒｋｅｌ ｅｒｄｅ）などがある。酸性白土中には、交換性の陽イオンとしてナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオンなどが存在する。これらの酸性白土をアルカリ処理したものは、前記の粘土鉱物と同様に用いることができる。カオリンの市販品としては、例えば、カオリン（商品名，伊那貿易社製）；タルクの市販品としては、例えば、ＴＡＬＫ ＰＰ（商品名，松村産業社製）；マイカの市販品としては、例えば、カシュミール（商品名，触媒化成社製）；ジメチルジステアリルアンモニウムヘクトライトの市販品としては、例えば、ベントン３８Ｖ（商品名，エレメンティスジャパン社製）；ベンジルジメチルステアリルアンモニウムヘクトライトの市販品としては、例えば、ベントン２７Ｖ（商品名，エレメンティスジャパン社製）；ジメチルジステアリルアンモニウムベントナイトの市販品としては、例えば、ベントン３４（商品名，エレメンティスジャパン社製）などを例示することができる。
【００２０】
粘土鉱物の含有量は、タンパク質分解酵素の安定化効果が付与されるのであれば特に限定されない。通常、組成物に含有されるタンパク質分解酵素１に対して、重量として１〜１００倍量、好ましくは１０〜１００倍量を含有させる。また組成物中には０．１〜３０重量％を含有させることが好ましい。
【００２１】
粘土鉱物は結晶であり、市販品は微粉末で提供される。これを水溶液に添加する場合にはできるだけ均一に分散させ、沈降させないことが望ましい。このため、溶液の粘度を調整することが好ましい。粘度調整のために、通常使用される多糖類やポリマー、あるいは多価アルコールを配合することができる。
【００２２】
本発明の組成物は、多価アルコールを含有させることが好ましい。多価アルコールを含有させることで、相対的に水分量が低下し、酵素の安定化に寄与するとともに、防腐効果を付与することができる。このため、化粧品原料として取り扱いやすくなるなどの利点がある。本発明に使用する多価アルコールとしては化粧品の基材として使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やグリセリン、ソルビトールなどの糖アルコール類が好ましい。これ以外の多価アルコールであっても水溶性を有するものであれば本発明に使用可能である。
このような多価アルコールとしては、ジグリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ペンチレングリコール等が例示できる。
これらの多価アルコールの一種以上を必要に応じて混合して用いることができる。多価アルコールを配合する場合には組成物あたり１０〜８０重量％とする。
【００２３】
本発明では、さらに界面活性剤を配合することができる。界面活性剤は、タンパク質の立体構造をリフォールディングするため、水溶液とする場合には、従来は添加は好ましくないとされてきた。本発明により安定に添加できるようになった。用いられる界面活性剤は、含有する水と多価アルコール、粘土鉱物を均等に分散させる機能を有するものであればどのようなものでも良いが、タンパク質分解酵素の安定化の観点から、脂肪酸の塩類を使用することが望ましい。脂肪酸塩の種類については、特に限定されないがラウリン酸カリウム、パルミチン酸カリウム、ミリスチン酸カリウム、ステアリン酸カリウムなどのカリウム塩や、その他脂肪酸のナトリウム塩が好ましい。これらの脂肪酸塩を単独あるいは２種以上を組み合わせて使用することもできる。本発明においては界面活性剤の含有量は１〜５０重量％の範囲内であれば、タンパク質分解酵素に悪影響を及ぼさない。特に好ましくは１〜４０重量％である。
【００２４】
本発明においては、さらに必要に応じてその他の公知のタンパク質分解酵素安定剤を配合することができる。このようなタンパク質分解酵素安定剤としては亜硫酸塩、カルシウム塩（例えば、塩化カルシウムや、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム等）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質又はこれらの組合せ等が挙げられる。本発明においては亜硫酸塩を用いることが好ましい。
【００２５】
以下に試験例、実施例、比較例を示しさらに本発明を詳細に説明する。なお本発明は、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
[試験例]
１．試験試料の調製
本発明のタンパク質分解酵素の安定化効果を確認するために試験試料を調製した。
・使用成分
（１）タンパク質分解酵素
パパイン：
本試験及び実施例で用いるパパインは、パパイヤ(Carica papaya L.)の完熟前果実から採った分泌物ラテックスを、常温で等量の純水で希釈し混合均一化して、第１次遠心分離(５０００ｒｐｍ)、フィルタープレス濾過、第２次遠心分離(１００００ｒｐｍ)、滅菌濾過などの操作を行い凍結乾燥したものである。パパイン成分(ほぼ１００重量％)のみの純品で他の成分は含まれていない。化粧品種別配合成分規格「パパイン」に収載されている定量法に基づき、活性量を定量すると４００００Pa.U.N./g以上の活性量を有する。前記パパインの乾燥の程度は、乾燥減量試験法として「化粧品原料基準一般試験法８.乾燥減量試験法」に従って行い、本実施例のパパインの約１ｇを精密に量り、１０５℃で１時間乾燥するとき、その減量が採取量の１０．０％以下であるものを用いた。
【００２７】
（２）多価アルコール
グリセリン
局方規格品
（３）酵素安定剤
亜硫酸ナトリウム：無水亜硫酸ナトリウム局方品
（４）粘土鉱物
スメクタイト（ケイ酸アルミニウムマグネシウム） ：ビーガムウルトラ（R.T.Vanderbilt C.INC.製、以下「ビーガム」と略記する。）
【００２８】
[試験１]
パパイン０．１重量％、グリセリン３０重量％、精製水６９．１重量％の溶液を調製し室温（約２５℃）で１５０日間保存し、酵素活性の変化を測定した。
【００２９】
[試験２]
パパイン０．１重量％とし、亜硫酸ナトリウム０．５、１、３重量％の３段階の濃度を設定して、水を加えて全量を１００とした溶液を調製し、これを１２０日間室温で保存して、酵素活性の変化を測定した。
【００３０】
[試験３]
パパイン０．１重量％とし、ビーガムを１、３、５、８、１０、１２、１５重量％の７段階にし、水を加えて全量を１００とした溶液を調整した。これを１２０日間室温で保存して、酵素活性の変化を測定した。
なお、参考のため水にパパイン０．１重量％を溶解した溶液を調製し、同様に酵素活性を測定した。
【００３１】
２．酵素活性の測定
（１）力価測定方法
Ａ．検量線用標準液の調製
α-Ｎ-ベンゾイル-Ｌ-アルギニン-エチルエステル（ＢＡＥＥ）塩酸塩３４２．８４ｍｇを正確に量り、水で５０ｍＬとした。これを標準原液(１ｍＬはＢＡＥＥ ２０マイクロｍｏｌを含む)とする。これを酵素基質としても用いた。標準原液の１ｍＬを正確に量り、水で２０ｍＬとし検量線用標準溶液（濃度：１マイクロｍｏｌ ／ ｍＬ)とした。
【００３２】
Ｂ．緩衝液の調製
リン酸水素二カリウム２．１６４ｇとリン酸二水素カリウム１４．６６ｇを水に溶かして１０００ｍＬとし、リン酸緩衝液（ｐＨ５．８）を調製した。
【００３３】
Ｃ．トリクロロ酢酸溶液の調製
トリクロロ酢酸８１．７ｇを水に溶かし１０００ｍＬとし、トリクロロ酢酸溶液を調製した。
【００３４】
Ｄ．活性測定方法
検量線用標準液をＨＰＬＣで測定し、ピーク面積から検量線を作成した。検量線については、適宜１点検量線および２点検量線を用いた。ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りであった。
装置：島津ＨＰＬＣ：検出器 ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ、ポンプ ＬＣ−２０ＡＤ
検出器：ＰＤＡ （測定波長：２５４ｎｍ）
カラム：Ｃｈｅｍｃｏｂｏｎｄ ５−ＯＤＳ−Ｈ（内径４．６ｍｍ、長さ１０ｃｍ）
移動相：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム＋アセトニトリル（８５＋１５）
前記タンパク質分解酵素含有液状組成物０．１ｇを秤量し、前記緩衝液２ｍＬと前記基質１ｍＬを入れた１０ｍＬの試験管に入れた。２５℃で３０分間インキュベートした後、トリクロロ酢酸溶液５ｍＬを加え反応を停止させた。メンブランフィルター（アドバンテック製、ＰＴＦＥ、径：０．４５μｍ）でろ過し、得られたろ液を用いＨＰＬＣにて測定した。ピーク面積を測定し、検量線より基質分解量を計算し、次式によって酵素活性（Ｕ／ｇ）を求めた。
【００３５】
（数１）
パパイン活性（Ｕ／ｇ） ＝ Ｃ×Ｖ１×Ｖ２
Ｖ３×Ｍ×Ｓ
Ｃ：試料の減少量（μｍｏｌ／ｍｌ）
Ｓ：試料の量（ｇ）
Ｍ：反応時間（分）
Ｖ１：反応溶液の最終液量（ｍｌ）
Ｖ２：試料液の量（ｍｌ）
Ｖ３：試料液の採取量（ｍｌ）
【００３６】
３．結果
各試験の結果及び水中での酵素安定性を測定した結果を、各溶液調整時の酵素活性を１００として下記表１〜４、図１〜４に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【００４１】
上記のとおり試験結果から、ビーガムは濃度依存的にタンパク分解酵素水溶液の酵素活性低下を抑制し、安定化することが確認できた。また、酵素活性は調製後１日目に低下するが、その低下はスメクタイトの濃度を高めることで抑制できることがわかった。また、その効果は従来の酵素安定剤である亜硫酸塩に比較して高いことがわかった。そしてその効果は１２０日後も持続していた。一方従来酵素の安定化効果があるといわれていたグリセリンを添加した溶液は、１００日経過後はほとんど酵素活性が消失してしまうことが明らかとなった。
【００４２】
[実施例・比較例]
界面活性剤を含有する化粧品用の原液を調製し、本発明の粘土鉱物の界面活性剤存在下での効果を確認した。なお粘土鉱物としてスメクタイト、ベントナイトを使用した。
【００４３】
１．試料の調製
（１）実施例１、２・比較例１、２の溶液調製
タンパク質分解酵素含有液状組成物用基材の調製
多価アルコール
グリセリン ３０重量部
ＰＥＧ４００ ５重量部
ＰＥＧ１５４０ １５重量部
ソルビトール ５重量部
界面活性剤
ラウリン酸カリウム １０重量部
パルミチン酸カリウム １０重量部
ミリスチン酸カリウム ５重量部
ステアリン酸カリウム ５重量部
水
精製水 ５重量部
各化合物を秤量混合した後、８５℃で１時間撹拌し、均一な基材となる組成物を得た。
【００４４】
この基材となる組成物を６０℃まで冷却した後、スメクタイト系粘土鉱物として、モンモリロナイトを主成分とするビーガムを５重量部、亜硫酸ナトリウムを１重量部添加（実施例１）、又は無添加（実施例２）とし、６０℃で１０分間撹拌し、均一な組成物を得た。この組成物を４０℃まで冷却した後、タンパク質分解酵素としてパパインを０．１重量部加え、４０℃で１０分間撹拌し、均一に分散させた後、水３．９重量部（又は水４．９重量部）を加え、全量を１００重量部とした。これを４０℃で１０分間撹拌し、タンパク質分解酵素含有液状組成物とした。
同様にしてビーガムと亜硫酸ナトリウムを添加しない組成物を調製し、これを比較例１とした。またビーガムを添加しない組成物を調製しこれを比較例２とした。
【００４５】
（２）実施例３、４・比較例３、４の調製
多価アルコール
グリセリン ３０重量部
ＰＥＧ４００ ５重量部
ＰＥＧ１５４０ １５重量部
ソルビトール ５重量部
界面活性剤
ラウリン酸カリウム １０重量部
パルミチン酸カリウム １０重量部
ミリスチン酸カリウム ５重量部
ステアリン酸カリウム ５重量部
水
精製水 ５重量部
各化合物を秤量混合した後、８５℃で１時間撹拌し、均一な基材となる組成物を得た。
【００４６】
この基材となる組成物を６０℃まで冷却した後、スメクタイト系粘土鉱物として、ベントナイト（白石工業株式会社製）を５重量部、亜硫酸カリウムを１重量部添加（実施例３）、又は無添加（実施例４）、６０℃で１０分間撹拌し、均一な組成物を得た。この組成物を４０℃まで冷却した後、タンパク質分解酵素としてパパインを０．１重量部加え、４０℃で１０分間撹拌し、均一に分散させた後、水３．９重量部（又は水４．９重量部）を加え全量を１００重量部とした。これを４０℃で１０分間撹拌した。これを、タンパク質分解酵素含有液状組成物とした。
同様にしてベントナイトと亜硫酸カリウムを添加しない組成物を調製し、これを比較例３とした。またベントナイトを添加しない組成物を調製しこれを比較例４とした。
【００４７】
（３）実施例５、６・比較例５、６の調製
多価アルコール
グリセリン ３０重量部
ＰＥＧ４００ ５重量部
ＰＥＧ１５４０ １５重量部
ソルビトール ５重量部
界面活性剤
ラウリン酸カリウム １０重量部
パルミチン酸カリウム １０重量部
ミリスチン酸カリウム ５重量部
ステアリン酸カリウム ５重量部
水
精製水 ５重量部
各化合物を秤量混合した後、８５℃で１時間撹拌し、均一な基材となる組成物を得た。
【００４８】
この基材となる組成物を６０℃まで冷却した後、スメクタイト系粘土鉱物として、ビーガムを５重量部、亜硫酸ナトリウムを１重量部加え、６０℃で１０分間撹拌し、均一な組成物を得た。この組成物を４０℃まで冷却した後、タンパク質分解酵素としてブロメライン粉末（和光純薬製）を０．１重量部加え、４０℃で１０分間撹拌し、均一に分散させた後、水１３．９重量部（又は水１４．９重量部）を加え、全量を１００重量部とした。これを４０℃で１０分間撹拌し、タンパク質分解酵素含有液状組成物とした。
同様にしてビーガムと亜硫酸ナトリウムを添加しない組成物を調製し、これを比較例５とした。またビーガムを添加しない組成物を調製しこれを比較例６とした。
【００４９】
（４）実施例７の調製
多価アルコール
グリセリン ３５重量部
ＰＥＧ４００ ５重量部
ＰＥＧ１５４０ １５重量部
ソルビトール １０重量部
界面活性剤
ラウリン酸カリウム １５重量部
各化合物を秤量混合した後、８５℃で１時間撹拌し、均一な基材となる組成物を得た。
【００５０】
この基材となる組成物を６０℃まで冷却した後、スメクタイト系粘土鉱物として、ビーガムを５重量部、亜硫酸ナトリウムを１重量部加え、６０℃で１０分間撹拌し、均一な組成物を得た。この組成物を４０℃まで冷却した後、タンパク質分解酵素としてブロメライン粉末を０．１重量部加え、４０℃で１０分間撹拌し、均一に分散させた後、水１３．９重量部を加え、全量を１００重量部とした。これを４０℃で１０分間撹拌し、タンパク質分解酵素含有液状組成物とした。
【００５１】
上述の実施例１〜７、比較例１〜６の組成を一括して下記表５に示す。
【００５２】
【表５】
【００５３】
２．安定性評価
タンパク質分解酵素含有液状組成物の酵素活性が安定化する調製直後（1日目）に活性を測定し、その後一定期間経過後に同じく測定し、タンパク質分解酵素含有液状組成物の酵素活性の安定性を評価した。
実施例１、２、比較例１、２の測定結果を下記表６、及び図５に示す。
【００５４】
【表６】
【００５５】
実施例３、４比較例３、４の測定結果を下記表７、及び図６に示す。
【００５６】
【表７】
【００５７】
実施例５、６、比較例５、６の測定結果を下記表８、及び図７に示す。
【００５８】
【表８】
【００５９】
以上のとおり実施例、比較例の酵素活性を測定した結果、本発明品は界面活性剤の存在する場合であっても水溶液状態のタンパク質分解酵素の活性を長期間安定に保つことがわかった。
なお実施例７の組成物についても、調製の翌日酵素活性を測定したところ２４．１Ｕ／ｇであった。これを室温で１５０日間保存した後酵素活性を測定したところ１９．７Ｕ／ｇであり、酵素活性が安定に維持されていることを確認した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質分解酵素、特に液状に加工されたタンパク質分解酵素含有組成物の安定化に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、動植物あるいは微生物を起源とする各種の加水分解酵素類を筆頭として各種多様な酵素類が、工業分野や生活の中で使用されている。化粧品や洗剤など日常品にも各種酵素が配合されている。これらの酵素類は固定化酵素を除き、通常水性溶液として使用される。しかし、一般に、酵素は、水溶液状態では不安定であり、時間とともにその酵素活性を失う。
【０００３】
また、酵素類は流通段階での安定性を考えて、粉末もしくは顆粒等の固体状態で製品化されることが多い。しかし粉末の酵素は、取り扱いにあたって飛散の防止や、吸湿などの問題がある。供給される酵素類が長期に安定な溶液状態であれば、使用量の調節や、希釈、混合操作も簡単となり、酵素製剤使用上の利便性が著しく高まる。貯蔵の間の十分な酵素安定性を確保することは、流通あるいは消費に要する時間が長い、一般消費者向けの液体酵素洗剤のような液体酵素系の配合物の場合、特に重要である。最近では、工業向けに一部酵素製剤が溶液状態で流通されるようになって来ているが、その安定性は十分なものとはいえない。
【０００４】
酵素溶液の安定化方法に関しては、各種のものが提案されている。例えば、リパーゼ水溶液に１価又は多価アルコールのポリオキシアルキレンエーテルを添加する方法（特許文献１：特開昭５９−１７３０８０号公報）のように、各種界面活性剤を添加する方法や、各種酵素のアルコール性水溶液にソルビトール、マルチトールのような糖アルコールを添加する方法（特許文献２：特開昭６１−１３９３８４号公報）等が知られている。
【０００５】
また、デキストリンのような水溶性高分子を添加する方法も、提案されている（特許文献３：特開平０２−２６１８９８号公報）。
【０００６】
化粧品などに使用するタンパク質分解酵素の安定化にはイソマルトオリゴ糖、ラフィノース、フルクトースなどの糖類、グリシルグリシンやアルギニルグルタミン酸などのペプチドを使用する技術が開示されている（特許文献４：特開２００５−３０６８２２）。
【０００７】
あるいは多糖類ステロイドのハイドロゲルに酵素を内包させて安定化を果たす方法が提案されている（特許文献５：特開２００２−１４６１００号公報）。
【０００８】
さらに又、液状洗濯用洗剤や自動食器洗浄機用液体洗剤に使用するための洗浄用各種酵素を粘土やシリカなどの多孔性の構造体に吸着させ、その多孔性の構造体をシリコーン油などの疎水性物質でコーティングしておくことで、洗剤中での安定性を保つ技術が提案されている（特許文献６：特表平０９−５１１００５号公報）。これらの提案のいずれも未だ十分なものではない。特に化粧料用途としてタンパク質分解酵素を化粧料に配合するための安定な液状組成物としては、酵素活性の維持と使用感の両方を満たす必要があるが、これらの面からみて必ずしも適切とはいえないのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開昭５９−１７３０８０号公報
【特許文献２】特開昭６１−１３９３８４号公報
【特許文献３】特開平０２−２６１８９８号公報
【特許文献４】特開２００５−３０６８２２号公報
【特許文献５】特開２００２−１４６１００号公報
【特許文献６】特表平０９−５１１００５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
タンパク質分解酵素を含有する酵素活性の安定な液状又はクリーム状組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）タンパク質分解酵素、水、粘土鉱物を含有することを特徴とする液状形態の酵素活性が安定な組成物。
（２）タンパク質分解酵素がパパイン又はブロメラインである（１）に記載の組成物。
（３）粘土鉱物が、タンパク質分解酵素１重量部あたり１〜２００重量部含有する（１）又は（２）に記載の組成物。
（４）粘土鉱物が膨潤性層状ケイ酸塩を含有するものである（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）粘土鉱物が、スメクタイト系の粘土鉱物、雲母粘土鉱物、カオリン鉱物、タルクのいずれかである（１）〜（４）のいずれかに記載の組成物。
（６）スメクタイト系の粘土鉱物がモンモリロナイト、ベントナイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイトから選択される１以上である（１）〜（５）のいずれかに記載の組成物。
（７）水の含有量が５重量％以上である（１）〜（６）のいずれかに記載の組成物。
（８）さらに、多価アルコールと界面活性剤を含有する（１）〜（７）のいずれかに記載の組成物。
（９）さらに酵素安定剤を含有する（１）〜（８）のいずれかに記載の組成物。
（１０）酵素安定剤が亜硫酸の塩である（１）〜（９）のいずれかに記載の組成物。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は（１）水溶液、（２）界面活性剤存在下の水溶液等液状態において粘土鉱物の添加によって酵素活性が安定化し、品質の維持・向上が顕著な組成物とすることができる。特に本発明の組成物は、含有するタンパク質分解酵素の活性が長期間安定に保たれており、さらに形態が液状であるため種々の食品、薬品、化粧品に配合することができる。特に化粧品の製造に当たって簡便に、液状化粧料に配合することができる。また、粉末状の酵素の場合、配合時に微粉末の飛散を防止したり、作業員が吸引したりすることを予防するための設備や器具が必要となるが、液状のためこのような設備や器具を必要としない。さらに、本発明のタンパク質分解酵素含有組成物を配合した場合、化粧料の使用感が良く、洗浄用化粧料は特に使用感が好ましい。特に注目すべきはパパインにおいて上記効果が顕著であり、粉末でしか提供できなかったパパイン含有組成物を液状で提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】水中でのタンパク質分解酵素の活性変化を示す。
【図２】グリセリンを含有する水中でのタンパク質分解酵素活性の変化を示す。
【図３】酵素安定剤として亜硫酸ナトリウムを含有する水中でのタンパク質分解酵素の活性変化を示す。
【図４】粘土鉱物を含有する水中でのタンパク質分解酵素活性の変化を示す。
【図５】パパインの酵素活性の安定化に粘土鉱物スメクタイトが有効であることを示す。
【図６】パパインの酵素活性の安定化粘土鉱物ベントナイトが有効であることを示す。
【図７】ブロメラインの酵素活性の安定化に粘土鉱物スメクタイトが有効であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明で用いるタンパク質分解酵素としては、化粧料に配合できるものであれば微生物由来、植物由来、動物由来のいずれも使用することができる。微生物由来のタンパク質分解酵素としては、例えば、カビ由来のプロテアーゼ、酵母由来のプロテアーゼ、細菌由来のプロテアーゼ等を例示することができる。植物由来のタンパク質分解酵素としては、例えば、パパイン、キモパパイン、ブロメライン、フィシン等を例示することができる。動物由来のタンパク質分解酵素としては、例えば、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、カテプシン、パンクレアチン等を例示することができる。洗顔用化粧料に使用する場合には、特にアルカリ性域に至適ｐＨ値を有する酵素が好ましいが、特にパパイン又はブロメラインが好ましい。本発明に使用する酵素は、粗酵素であっても精製酵素であっても良い。また原料の植物から抽出しても良いし、市販の工業や医薬品用の酵素であってもよい。特にパパインは、至適ｐＨが７〜８にある、パパイヤの実から抽出した植物プロテアーゼであり、耐熱性や耐酸性が高く、基質特異性が広く非常に安定な酵素であり好ましい。
本発明においては、使用目的に合わせて所望の酵素活性を調整することができる。酵素の量は、酵素重量または酵素活性で組成物中の含有量を特定することができる。本発明においては、組成物中のタンパク質分解酵素の含有量を０．０１重量％とすることができる。酵素含有量は目的に応じて調整することができ、特に配合量の上限はない。
また本発明組成物は、従来の技術と異なり、水分含量（水分量）を５重量％以上にすることができることが大きな特徴である。本発明においては、水分量は５重量％以上であれば特に制限されない。
【００１５】
本発明においてタンパク質分解酵素の安定化に重要な役割を果たすのは粘土鉱物である。粘土鉱物に含有される膨潤性層状ケイ酸塩は、陽イオン交換能を有し、更に層間に水を取り込んで膨潤していく層状ケイ酸塩で、スメクタイト型粘土や膨潤性雲母等が知られている。
本発明でいう粘土鉱物とはこのような物質を全て包含する。従来技術においても述べたように、粘土鉱物は、その層状構造中にタンパク質分解酵素などのタンパク質を吸着し、安定化させることが知られている。しかし水を含む系においては、水の存在によって酵素活性を失うため、水を極力添加しないかあるいは、水の影響を排除するために酵素を吸着した粘土鉱物の表面をシリコーンなどの疎水性の物質でコーティングする必要があった。しかし本発明の組成物とすることで、タンパク質分解酵素力価を長期間安定に維持することができる。
【００１６】
粘土鉱物の具体例としては、天然物、天然物からの精製物又は合成の何れのものであっても特に限定されないが、例えば、カオリン、ナクライト、ディッカイト、ハロサイトなどのカオリン系粘土鉱物、アンティゴライト、アメサイト、クロンステダイトなどのアンティゴライト系粘土鉱物、パイロフィライト、タルク（滑石）などのパイロフィライト系粘土鉱物、イライト、海緑石、セラドナイト、セリサイト、マイカ（雲母）、白雲母、クロム白雲母、黒雲母などの雲母系粘土鉱物、ベントナイト、モンモリロナイト、バイデライト、ノントナイト、サポナイト、ヘクトライト、ルーセンタイトなどのスメクタイト系粘土鉱物、バーミキュライトなどのバーミキュライト系粘土鉱物；緑泥石（クロライト）などの緑泥石系粘土鉱物、スメクタイト系やバーミキュライト系の粘土鉱物を塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウムなどの第４級アンモニウム塩型カチオン界面活性剤で処理した有機変性粘土鉱物などを例示することができる。これら成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を適宜組合せて用いることもできる。
【００１７】
本発明においては、酵素安定性並びに、使用感から、スメクタイト系粘土鉱物であるベントナイト、モンモリロナイト、バイデライト、ノントナイト、サポナイト、ヘクトライト、ルーセンタイトなどの粘土鉱物が好ましい。特に化粧品用途においては、ベントナイト、モンモリロナイト、バイデライト、ノントナイト、サポナイトが特に好ましい。スメクタイト系粘土鉱物以外では、カオリン、タルク、マイカ、セリサイトが好ましい。粘土鉱物は市販品をそのまま用いることができる。スメクタイト系としては、モンモリロナイトとしてクニミネ工業（株）製のクニピアＧ（商品名）及びクニピアＦ（商品名）、アメリカンコロイド社製のウエスタンボンド（商品名）、ドレッサーミネラルズ社製のイエローストーン（商品名）などが市販されている。サポナイトを含有するものとして、バンダービルド社製のビーガム（製品名）、ビーガムＨＶ（製品名）、ビーガムＦ（製品名）、ビーガムウルトラ（製品名）及びビーガムＫ（製品名）などが、また、ヘクトライトを含有するものとして、アメリカンコロイド社製のヘクタブライトＡＷ（製品名）、ヘクタブライト２００（製品名）及びベントンＥＷ（製品名）、ナショナルリード社製のマカロイド（製品名）などが市販されている。また、合成スメクタイトには、例えば水澤化学工業（株）製のイオナイトＨ（製品名）が、コープケミカル（株）製のＳＷＮ（製品名）やＳＡＮ（製品名）が、ラポルテインダストリー社からラポナイト（製品名）がそれぞれ市販されている。
【００１８】
膨潤性合成雲母は、タルクとケイフッ化アルカリの混合物を加熱処理して得られる膨潤性合成雲母が挙げられ、タルクとケイフッ化ナトリウム及び／又はケイフッ化リチウムとを混合した微粉末を６００〜１２００℃に加熱処理して得られるものが好ましい。このような膨潤性合成雲母としては、コープケミカル（株）製の膨潤性合成雲母ＭＥシリーズ（商品名）、トピー工業（株）製のナトリウム四ケイ素雲母（商品名、ＤＰ−ＤＭ及びＤＭクリーン）などが挙げられる。
【００１９】
また、本発明におけるカオリン系粘土鉱物として、酸性白土のアルカリ処理物も用いることができる。この酸性白土は、通常１重量％水溶液分散液のｐＨ５〜６以下、膨潤度１０ｍｌ／２ｇ以下、ＳｉＯ２とＡｌ２Ｏ３のモル比（ＳｉＯ２／Ａｌ２Ｏ３）６〜１０を有し、このようなものとしては、例えば中条、小戸、上赤谷、糸魚川、水澤、川崎、松根、三川、青梅、上砂見産の酸性白土や、これらの酸性白土と類似の性質を示す英国産のフラーズ・アース（Ｆｕｌｌｅｒ’ｓ ｅａｒｔｈ）、米国産のフロライド・アース（Ｆｌｏｒｉｄｅ ｅａｒｔｈ）、ドイツ産のワルケル・エルデ（Ｗａｒｋｅｌ ｅｒｄｅ）などがある。酸性白土中には、交換性の陽イオンとしてナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオンなどが存在する。これらの酸性白土をアルカリ処理したものは、前記の粘土鉱物と同様に用いることができる。カオリンの市販品としては、例えば、カオリン（商品名，伊那貿易社製）；タルクの市販品としては、例えば、ＴＡＬＫ ＰＰ（商品名，松村産業社製）；マイカの市販品としては、例えば、カシュミール（商品名，触媒化成社製）；ジメチルジステアリルアンモニウムヘクトライトの市販品としては、例えば、ベントン３８Ｖ（商品名，エレメンティスジャパン社製）；ベンジルジメチルステアリルアンモニウムヘクトライトの市販品としては、例えば、ベントン２７Ｖ（商品名，エレメンティスジャパン社製）；ジメチルジステアリルアンモニウムベントナイトの市販品としては、例えば、ベントン３４（商品名，エレメンティスジャパン社製）などを例示することができる。
【００２０】
粘土鉱物の含有量は、タンパク質分解酵素の安定化効果が付与されるのであれば特に限定されない。通常、組成物に含有されるタンパク質分解酵素１に対して、重量として１〜１００倍量、好ましくは１０〜１００倍量を含有させる。また組成物中には０．１〜３０重量％を含有させることが好ましい。
【００２１】
粘土鉱物は結晶であり、市販品は微粉末で提供される。これを水溶液に添加する場合にはできるだけ均一に分散させ、沈降させないことが望ましい。このため、溶液の粘度を調整することが好ましい。粘度調整のために、通常使用される多糖類やポリマー、あるいは多価アルコールを配合することができる。
【００２２】
本発明の組成物は、多価アルコールを含有させることが好ましい。多価アルコールを含有させることで、相対的に水分量が低下し、酵素の安定化に寄与するとともに、防腐効果を付与することができる。このため、化粧品原料として取り扱いやすくなるなどの利点がある。本発明に使用する多価アルコールとしては化粧品の基材として使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やグリセリン、ソルビトールなどの糖アルコール類が好ましい。これ以外の多価アルコールであっても水溶性を有するものであれば本発明に使用可能である。
このような多価アルコールとしては、ジグリセリン、１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ペンチレングリコール等が例示できる。
これらの多価アルコールの一種以上を必要に応じて混合して用いることができる。多価アルコールを配合する場合には組成物あたり１０〜８０重量％とする。
【００２３】
本発明では、さらに界面活性剤を配合することができる。界面活性剤は、タンパク質の立体構造をリフォールディングするため、水溶液とする場合には、従来は添加は好ましくないとされてきた。本発明により安定に添加できるようになった。用いられる界面活性剤は、含有する水と多価アルコール、粘土鉱物を均等に分散させる機能を有するものであればどのようなものでも良いが、タンパク質分解酵素の安定化の観点から、脂肪酸の塩類を使用することが望ましい。脂肪酸塩の種類については、特に限定されないがラウリン酸カリウム、パルミチン酸カリウム、ミリスチン酸カリウム、ステアリン酸カリウムなどのカリウム塩や、その他脂肪酸のナトリウム塩が好ましい。これらの脂肪酸塩を単独あるいは２種以上を組み合わせて使用することもできる。本発明においては界面活性剤の含有量は１〜５０重量％の範囲内であれば、タンパク質分解酵素に悪影響を及ぼさない。特に好ましくは１〜４０重量％である。
【００２４】
本発明においては、さらに必要に応じてその他の公知のタンパク質分解酵素安定剤を配合することができる。このようなタンパク質分解酵素安定剤としては亜硫酸塩、カルシウム塩（例えば、塩化カルシウムや、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム等）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質又はこれらの組合せ等が挙げられる。本発明においては亜硫酸塩を用いることが好ましい。
【００２５】
以下に試験例、実施例、比較例を示しさらに本発明を詳細に説明する。なお本発明は、これに限定されるものではない。
【実施例】
【００２６】
[試験例]
１．試験試料の調製
本発明のタンパク質分解酵素の安定化効果を確認するために試験試料を調製した。
・使用成分
（１）タンパク質分解酵素
パパイン：
本試験及び実施例で用いるパパインは、パパイヤ(Carica papaya L.)の完熟前果実から採った分泌物ラテックスを、常温で等量の純水で希釈し混合均一化して、第１次遠心分離(５０００ｒｐｍ)、フィルタープレス濾過、第２次遠心分離(１００００ｒｐｍ)、滅菌濾過などの操作を行い凍結乾燥したものである。パパイン成分(ほぼ１００重量％)のみの純品で他の成分は含まれていない。化粧品種別配合成分規格「パパイン」に収載されている定量法に基づき、活性量を定量すると４００００Pa.U.N./g以上の活性量を有する。前記パパインの乾燥の程度は、乾燥減量試験法として「化粧品原料基準一般試験法８.乾燥減量試験法」に従って行い、本実施例のパパインの約１ｇを精密に量り、１０５℃で１時間乾燥するとき、その減量が採取量の１０．０％以下であるものを用いた。
【００２７】
（２）多価アルコール
グリセリン
局方規格品
（３）酵素安定剤
亜硫酸ナトリウム：無水亜硫酸ナトリウム局方品
（４）粘土鉱物
スメクタイト（ケイ酸アルミニウムマグネシウム） ：ビーガムウルトラ（R.T.Vanderbilt C.INC.製、以下「ビーガム」と略記する。）
【００２８】
[試験１]
パパイン０．１重量％、グリセリン３０重量％、精製水６９．１重量％の溶液を調製し室温（約２５℃）で１５０日間保存し、酵素活性の変化を測定した。
【００２９】
[試験２]
パパイン０．１重量％とし、亜硫酸ナトリウム０．５、１、３重量％の３段階の濃度を設定して、水を加えて全量を１００とした溶液を調製し、これを１２０日間室温で保存して、酵素活性の変化を測定した。
【００３０】
[試験３]
パパイン０．１重量％とし、ビーガムを１、３、５、８、１０、１２、１５重量％の７段階にし、水を加えて全量を１００とした溶液を調整した。これを１２０日間室温で保存して、酵素活性の変化を測定した。
なお、参考のため水にパパイン０．１重量％を溶解した溶液を調製し、同様に酵素活性を測定した。
【００３１】
２．酵素活性の測定
（１）力価測定方法
Ａ．検量線用標準液の調製
α-Ｎ-ベンゾイル-Ｌ-アルギニン-エチルエステル（ＢＡＥＥ）塩酸塩３４２．８４ｍｇを正確に量り、水で５０ｍＬとした。これを標準原液(１ｍＬはＢＡＥＥ ２０マイクロｍｏｌを含む)とする。これを酵素基質としても用いた。標準原液の１ｍＬを正確に量り、水で２０ｍＬとし検量線用標準溶液（濃度：１マイクロｍｏｌ ／ ｍＬ)とした。
【００３２】
Ｂ．緩衝液の調製
リン酸水素二カリウム２．１６４ｇとリン酸二水素カリウム１４．６６ｇを水に溶かして１０００ｍＬとし、リン酸緩衝液（ｐＨ５．８）を調製した。
【００３３】
Ｃ．トリクロロ酢酸溶液の調製
トリクロロ酢酸８１．７ｇを水に溶かし１０００ｍＬとし、トリクロロ酢酸溶液を調製した。
【００３４】
Ｄ．活性測定方法
検量線用標準液をＨＰＬＣで測定し、ピーク面積から検量線を作成した。検量線については、適宜１点検量線および２点検量線を用いた。ＨＰＬＣの測定条件は以下の通りであった。
装置：島津ＨＰＬＣ：検出器 ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ、ポンプ ＬＣ−２０ＡＤ
検出器：ＰＤＡ （測定波長：２５４ｎｍ）
カラム：Ｃｈｅｍｃｏｂｏｎｄ ５−ＯＤＳ−Ｈ（内径４．６ｍｍ、長さ１０ｃｍ）
移動相：０．０５Ｍ酢酸アンモニウム＋アセトニトリル（８５＋１５）
前記タンパク質分解酵素含有液状組成物０．１ｇを秤量し、前記緩衝液２ｍＬと前記基質１ｍＬを入れた１０ｍＬの試験管に入れた。２５℃で３０分間インキュベートした後、トリクロロ酢酸溶液５ｍＬを加え反応を停止させた。メンブランフィルター（アドバンテック製、ＰＴＦＥ、径：０．４５μｍ）でろ過し、得られたろ液を用いＨＰＬＣにて測定した。ピーク面積を測定し、検量線より基質分解量を計算し、次式によって酵素活性（Ｕ／ｇ）を求めた。
【００３５】
（数１）
パパイン活性（Ｕ／ｇ） ＝ Ｃ×Ｖ１×Ｖ２
Ｖ３×Ｍ×Ｓ
Ｃ：試料の減少量（μｍｏｌ／ｍｌ）
Ｓ：試料の量（ｇ）
Ｍ：反応時間（分）
Ｖ１：反応溶液の最終液量（ｍｌ）
Ｖ２：試料液の量（ｍｌ）
Ｖ３：試料液の採取量（ｍｌ）
【００３６】
３．結果
各試験の結果及び水中での酵素安定性を測定した結果を、各溶液調整時の酵素活性を１００として下記表１〜４、図１〜４に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
【表４】
【００４１】
上記のとおり試験結果から、ビーガムは濃度依存的にタンパク分解酵素水溶液の酵素活性低下を抑制し、安定化することが確認できた。また、酵素活性は調製後１日目に低下するが、その低下はスメクタイトの濃度を高めることで抑制できることがわかった。また、その効果は従来の酵素安定剤である亜硫酸塩に比較して高いことがわかった。そしてその効果は１２０日後も持続していた。一方従来酵素の安定化効果があるといわれていたグリセリンを添加した溶液は、１００日経過後はほとんど酵素活性が消失してしまうことが明らかとなった。
【００４２】
[実施例・比較例]
界面活性剤を含有する化粧品用の原液を調製し、本発明の粘土鉱物の界面活性剤存在下での効果を確認した。なお粘土鉱物としてスメクタイト、ベントナイトを使用した。
【００４３】
１．試料の調製
（１）実施例１、２・比較例１、２の溶液調製
タンパク質分解酵素含有液状組成物用基材の調製
多価アルコール
グリセリン ３０重量部
ＰＥＧ４００ ５重量部
ＰＥＧ１５４０ １５重量部
ソルビトール ５重量部
界面活性剤
ラウリン酸カリウム １０重量部
パルミチン酸カリウム １０重量部
ミリスチン酸カリウム ５重量部
ステアリン酸カリウム ５重量部
水
精製水 ５重量部
各化合物を秤量混合した後、８５℃で１時間撹拌し、均一な基材となる組成物を得た。
【００４４】
この基材となる組成物を６０℃まで冷却した後、スメクタイト系粘土鉱物として、モンモリロナイトを主成分とするビーガムを５重量部、亜硫酸ナトリウムを１重量部添加（実施例１）、又は無添加（実施例２）とし、６０℃で１０分間撹拌し、均一な組成物を得た。この組成物を４０℃まで冷却した後、タンパク質分解酵素としてパパインを０．１重量部加え、４０℃で１０分間撹拌し、均一に分散させた後、水３．９重量部（又は水４．９重量部）を加え、全量を１００重量部とした。これを４０℃で１０分間撹拌し、タンパク質分解酵素含有液状組成物とした。
同様にしてビーガムと亜硫酸ナトリウムを添加しない組成物を調製し、これを比較例１とした。またビーガムを添加しない組成物を調製しこれを比較例２とした。
【００４５】
（２）実施例３、４・比較例３、４の調製
多価アルコール
グリセリン ３０重量部
ＰＥＧ４００ ５重量部
ＰＥＧ１５４０ １５重量部
ソルビトール ５重量部
界面活性剤
ラウリン酸カリウム １０重量部
パルミチン酸カリウム １０重量部
ミリスチン酸カリウム ５重量部
ステアリン酸カリウム ５重量部
水
精製水 ５重量部
各化合物を秤量混合した後、８５℃で１時間撹拌し、均一な基材となる組成物を得た。
【００４６】
この基材となる組成物を６０℃まで冷却した後、スメクタイト系粘土鉱物として、ベントナイト（白石工業株式会社製）を５重量部、亜硫酸カリウムを１重量部添加（実施例３）、又は無添加（実施例４）、６０℃で１０分間撹拌し、均一な組成物を得た。この組成物を４０℃まで冷却した後、タンパク質分解酵素としてパパインを０．１重量部加え、４０℃で１０分間撹拌し、均一に分散させた後、水３．９重量部（又は水４．９重量部）を加え全量を１００重量部とした。これを４０℃で１０分間撹拌した。これを、タンパク質分解酵素含有液状組成物とした。
同様にしてベントナイトと亜硫酸カリウムを添加しない組成物を調製し、これを比較例３とした。またベントナイトを添加しない組成物を調製しこれを比較例４とした。
【００４７】
（３）実施例５、６・比較例５、６の調製
多価アルコール
グリセリン ３０重量部
ＰＥＧ４００ ５重量部
ＰＥＧ１５４０ １５重量部
ソルビトール ５重量部
界面活性剤
ラウリン酸カリウム １０重量部
パルミチン酸カリウム １０重量部
ミリスチン酸カリウム ５重量部
ステアリン酸カリウム ５重量部
水
精製水 ５重量部
各化合物を秤量混合した後、８５℃で１時間撹拌し、均一な基材となる組成物を得た。
【００４８】
この基材となる組成物を６０℃まで冷却した後、スメクタイト系粘土鉱物として、ビーガムを５重量部、亜硫酸ナトリウムを１重量部加え、６０℃で１０分間撹拌し、均一な組成物を得た。この組成物を４０℃まで冷却した後、タンパク質分解酵素としてブロメライン粉末（和光純薬製）を０．１重量部加え、４０℃で１０分間撹拌し、均一に分散させた後、水１３．９重量部（又は水１４．９重量部）を加え、全量を１００重量部とした。これを４０℃で１０分間撹拌し、タンパク質分解酵素含有液状組成物とした。
同様にしてビーガムと亜硫酸ナトリウムを添加しない組成物を調製し、これを比較例５とした。またビーガムを添加しない組成物を調製しこれを比較例６とした。
【００４９】
（４）実施例７の調製
多価アルコール
グリセリン ３５重量部
ＰＥＧ４００ ５重量部
ＰＥＧ１５４０ １５重量部
ソルビトール １０重量部
界面活性剤
ラウリン酸カリウム １５重量部
各化合物を秤量混合した後、８５℃で１時間撹拌し、均一な基材となる組成物を得た。
【００５０】
この基材となる組成物を６０℃まで冷却した後、スメクタイト系粘土鉱物として、ビーガムを５重量部、亜硫酸ナトリウムを１重量部加え、６０℃で１０分間撹拌し、均一な組成物を得た。この組成物を４０℃まで冷却した後、タンパク質分解酵素としてブロメライン粉末を０．１重量部加え、４０℃で１０分間撹拌し、均一に分散させた後、水１３．９重量部を加え、全量を１００重量部とした。これを４０℃で１０分間撹拌し、タンパク質分解酵素含有液状組成物とした。
【００５１】
上述の実施例１〜７、比較例１〜６の組成を一括して下記表５に示す。
【００５２】
【表５】
【００５３】
２．安定性評価
タンパク質分解酵素含有液状組成物の酵素活性が安定化する調製直後（1日目）に活性を測定し、その後一定期間経過後に同じく測定し、タンパク質分解酵素含有液状組成物の酵素活性の安定性を評価した。
実施例１、２、比較例１、２の測定結果を下記表６、及び図５に示す。
【００５４】
【表６】
【００５５】
実施例３、４比較例３、４の測定結果を下記表７、及び図６に示す。
【００５６】
【表７】
【００５７】
実施例５、６、比較例５、６の測定結果を下記表８、及び図７に示す。
【００５８】
【表８】
【００５９】
以上のとおり実施例、比較例の酵素活性を測定した結果、本発明品は界面活性剤の存在する場合であっても水溶液状態のタンパク質分解酵素の活性を長期間安定に保つことがわかった。
なお実施例７の組成物についても、調製の翌日酵素活性を測定したところ２４．１Ｕ／ｇであった。これを室温で１５０日間保存した後酵素活性を測定したところ１９．７Ｕ／ｇであり、酵素活性が安定に維持されていることを確認した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質分解酵素、水、粘土鉱物を含有することを特徴とする液状形態の酵素活性が安定な組成物。
【請求項２】
タンパク質分解酵素がパパイン又はブロメラインである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
粘土鉱物が、タンパク質分解酵素１重量部あたり１〜２００重量部含有する請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
粘土鉱物が膨潤性層状ケイ酸塩を含有するものである請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
粘土鉱物が、スメクタイト系の粘土鉱物、雲母粘土鉱物、カオリン鉱物、タルクのいずれかである請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
スメクタイト系の粘土鉱物がモンモリロナイト、ベントナイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイトから選択される１以上である請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
水の含有量が５重量％以上である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
さらに、多価アルコールと界面活性剤を含有する請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
さらに酵素安定剤を含有する請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
酵素安定剤が亜硫酸の塩である請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１】
タンパク質分解酵素、水、粘土鉱物を含有することを特徴とする液状形態の酵素活性が安定な組成物。
【請求項２】
タンパク質分解酵素がパパイン又はブロメラインである請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
粘土鉱物が、タンパク質分解酵素１重量部あたり１〜２００重量部含有する請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
粘土鉱物が膨潤性層状ケイ酸塩を含有するものである請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
粘土鉱物が、スメクタイト系の粘土鉱物、雲母粘土鉱物、カオリン鉱物、タルクのいずれかである請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
スメクタイト系の粘土鉱物がモンモリロナイト、ベントナイト、バイデライト、ノントロナイト、サポナイトから選択される１以上である請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
水の含有量が５重量％以上である請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
さらに、多価アルコールと界面活性剤を含有する請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
さらに酵素安定剤を含有する請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
酵素安定剤が亜硫酸の塩である請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１３−２３（Ｐ２０１３−２３Ａ）
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１３２１２６（Ｐ２０１１−１３２１２６）
【出願日】平成２３年６月１４日（２０１１．６．１４）
【出願人】（５１０１０６７１７）ニコスタービューテック株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年１月７日（２０１３．１．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年６月１４日（２０１１．６．１４）
【出願人】（５１０１０６７１７）ニコスタービューテック株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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