抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体、その製造法および用途
【課題】イヌのアレルギー疾患を治療する方法は、ヒトの治療に準じ、ステロイドなどの免疫抑制剤や抗ヒスタミン剤が用いられているが、副作用を回避しながら効果を示す薬剤の投与は難しいのが現状である。さらに副作用の少ない有効な治療薬の開発が望まれている。
【解決手段】
本発明はイヌＩｇＥ抗体を特異的に認識するモノクローナル抗体、またはイヌＩｇＥで免疫された動物のＢ細胞と形質細胞腫株との融合細胞株の産生するイヌＩｇＥ抗体と特異的に反応するモノクローナル抗体、およびそのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、さらには該モノクローナル抗体および該ハイブリドーマを製造する方法を提供するものである。
【解決手段】
本発明はイヌＩｇＥ抗体を特異的に認識するモノクローナル抗体、またはイヌＩｇＥで免疫された動物のＢ細胞と形質細胞腫株との融合細胞株の産生するイヌＩｇＥ抗体と特異的に反応するモノクローナル抗体、およびそのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、さらには該モノクローナル抗体および該ハイブリドーマを製造する方法を提供するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はモノクローナル抗体、さらに詳しくは、イヌＩｇＥ抗体に対して作製された、抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、先進諸国を中心にイヌを生活の伴侶として生活を共にする人が増加している。室内で飼育するなどその飼育形態の変化や環境の影響によって飼育されているイヌに人間同様種々のアレルギー疾患が増加している。アレルギーはアレルギー症状を呈するイヌに固有のアレルゲンを吸入すること、アレルゲンに接触することあるいは摂食することによって発症するのであり、アレルギーを予防するにはその原因となるアレルゲンとの接触あるいは摂食を回避すればよい。そのためには、アレルゲンの特定が必要となっている。
従って、人間の場合と同様、アレルギー症状を呈しているイヌの真のアレルゲンを同定することさらにはＩ型アレルギーにおいて重要な役割を果たしているＩｇＥ抗体、特にアレルゲン特異的なＩｇＥ抗体量を正確に測定することが必要である。
【０００３】
先に記述したように、イヌのアレルギー症状を抑制するためにはアレルゲンの回避が必要でありそのためにはアレルゲンの特定やアレルゲン特異的なＩｇＥ抗体量の正確な測定が必要である。その診断を可能とするためには、イヌＩｇＥ抗体に特異性を有する抗体が必要である。しかし、現在入手可能な抗イヌＩｇＥ抗体は、特異性並びに親和性の点から満足できるものではなく信頼性のある診断を可能とする抗イヌＩｇＥ抗体が望まれていた。デボア（Douglas J. Deboer）らが１９９３年にイヌＩｇＥに対するモノクローナル抗体を報告しているが（非特許文献１）、得られた抗体は、ＩｇＥのみならずＩｇＧも僅かに認識したりＥＬＩＳＡで使用できないなど満足できる抗体ではなく市販されるにはいたらなかった。現在、ベッチル社（Bethyl Laboratories, Inc, 米国）からヤギで作製した抗イヌＩｇＥポリクローナル抗体が市販されているが、本抗体は親和性が低く目的に合致したものではない。
【特許文献１】Vet. Immunol. Immunopathol.1993；37：183-199
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
イヌのアレルギー疾患を治療する方法は、ヒトの治療に準じて行われている。ステロイドなどの免疫抑制剤や抗ヒスタミン剤が用いられているが、副作用を回避しながら効果を示す薬剤の投与は難しいのが現状である。さらに副作用の少ない有効な治療薬の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、イヌＩｇＥ抗体を特異的に認識するモノクローナル抗体を得るべく鋭意検討した結果、それを得ることに成功し、本発明を完成させるにいたった。すなわち、本発明はイヌＩｇＥ抗体を特異的に認識するモノクローナル抗体、またはイヌＩｇＥで免疫された動物のＢ細胞と形質細胞腫株との融合細胞株の産生するイヌＩｇＥ抗体と特異的に反応するモノクローナル抗体、およびそのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、さらには該モノクローナル抗体および該ハイブリドーマを製造する方法を提供するものである。また、該モノクローナル抗体を用いる各種疾患の診断薬および該モノクローナル抗体を遺伝子工学的にマウス型からイヌ型に変換したイヌ型抗体としてイヌ生体内のＩｇＥを捕捉することによるアレルギー治療薬を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体は次の各工程を経て製造された。
１．抗原の製造
２．免疫
３．抗体価測定系の設定
４．細胞融合
５．ハイブリドーマの選択およびクローニング
６．モノクローナル抗体の採取
以下、各工程につき説明する。
【０００７】
１．抗原の製造
特異性が高くかつ診断に使用できるレベルの親和性を有する抗ＩｇＥ抗体の取得は、免疫源として用いるイヌＩｇＥ抗体の純度並びに量が重要である。一般にＩｇＥ抗体の存在量は、ＩｇＧなどの他の抗体と比較して極めて微量であり純度の高い抗体を得ることが困難である。また、ＩｇＥ抗体かどうかを確認することも標準品が入手できないため難しいのが現状であった。そのため、純度並びに量も不十分な状態で免疫源としていたため診断などに使用できる抗イヌＩｇＥ抗体を作製できなかった。
そこで、１０頭のビーグル犬にそれぞれ水酸化アルミニウムをアジュバントとしてスギ花粉抗原を投与し免疫した後に採血し血清をゲル濃度４−１２％グラディエントゲルを用いてゲル電気泳動に供した。ＣＢＢ染色並びに抗ヒトＩｇＥ抗体（生化学工業（株）カタログ番号２４０４９１）で検出しヒト精製ＩｇＥをマーカーとして同じ泳動位置にバンドが認められる個体を選択した。続いて、このＩｇＥ抗体価の高いイヌから血清を得た。血清を５０％飽和硫安で抗体画分を沈殿させ分離しＰＢＳに対して一晩透析した。続いて、プロティンＧカラムに供し大量にあるＩｇＧを吸着除去した。プロティンＧカラム操作を繰返しウェスタンブロッティングにてＩｇＥが明確に確認できるレベルまで精製した。次に、Kaptiv-AEカラム（テクノゲン社製）にＩｇＥ抗体を吸着させ緩衝液で十分に洗浄した後、０．１Ｍの酢酸溶液で溶出し直ぐに１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で中和した。各精製過程は、ヒトＩｇＥ抗体を標準品としたゲル電気泳動で確認しながら実施した。得られたＩｇＥ抗体を電気泳動にて分析した結果を図１に示す。ヒトＩｇＥ抗体と同じ位置にバンドが認められ純度もほぼ満足できるレベルに達していることが分かった。ゲル電気泳動の図から概算したＩｇＥ抗体量は全タンパクの３０％以上であった。ＩｇＥ抗体画分を限外瀘過にて濃縮し１ｍｇ／ｍｌとした。
【０００８】
２．免疫
上記のようにして得られた免疫原を哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ラット、マウスなどに投与する。モノクローナル抗体を得るためには、ラット、ハムスター、マウスが好ましく、特にマウスが好ましい。免疫の方法は、動物の皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内などのいずれの経路でも可能であるが、主として静脈内、皮下、腹腔内に投与するのが好ましい。免疫間隔はいかなる設定も可能であるが数日から４週間隔、好ましくは３日〜２週間隔で、２〜１０回免疫し、最終免疫後、１〜５日、好ましくは約２〜４日後に抗体産生細胞を採取すればよい。免疫する際には、種々のアジュバントを用いると免疫の効率がよくなる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ＢＣＧなどが用いられる。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、各部位のリンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞が用いられるが、脾臓細胞を用いるのが一般的である。抗原の免疫量は１回にマウス１匹あたり０．１〜５００μｇ、好ましくは１〜３００μｇ用いることが望ましい。
【０００９】
３．抗体価測定系の設定
免疫した動物の血中抗体価、あるいは後記の抗体産生細胞培養上清中の抗体価を測定する必要がある。抗体検出の方法は、いかなる方法も使用できるがＥＬＩＳＡが便利である。プラスティックプレートの各ウェルに先に精製してあるイヌＩｇＥ抗体画分を加え室温放置して固相化しＢＳＡやスキムミルクでブロッキングする。そこへ、ＰＢＳで希釈した血清あるいはハイブリドーマ培養上清を抗原が固相化されたウェルへ加え反応させた後に洗浄し、酵素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を加え、反応・洗浄後に基質を加えて発色させ、抗イヌＩｇＥ抗体の存在量を測定する。ＥＬＩＳＡでの判定に加えて、精製したイヌＩｇＥを、ヒトＩｇＥを標準品としたウェスタンブロッティングに供し得られた抗体がイヌＩｇＥ抗体と反応することを確認する。
【００１０】
４．細胞融合
上記脾臓細胞と形質細胞腫株との細胞融合は、たとえば摘出したマウスの脾臓細胞を、選択できるようなマーカーを持った同種または異種の、好ましくは同種の細胞腫株と融合させる。細胞腫株としては、ミエローマが好ましくＰＡＩ、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ４．１、６５３、Ｙ３−ＡＧ１．２．３などを用いることができる。細胞融合は、ポリエチレングリコールを融合促進剤として用いる。107〜108 個のミエローマ細胞と脾臓細胞を混合比１：１〜1：１０でＲＰＭＩ−１６４０などの培地中、３０〜３７℃で１〜１０分間混合することによって融合させる。融合促進に使用するポリエチレングリコールの代わりにポリビニルアルコールなどを用いることもできる。濃度は１０〜８０％、好ましくは３０〜５０％で３０秒から３０分、好ましくは３〜１５分処理することによって細胞融合が終了する。
【００１１】
５．ハイブリドーマの選択およびクローニング
融合した細胞は、１０〜２０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地などで希釈し９６穴のマイクロタイタープレートに各ウェルあたり１×105〜１×106個になるように加えＨＡＴ培地を用いてハイブリドーマだけを選択的に増殖させることができる。１０〜１４日ころからＨＴ培地に交換し、さらに培養を継続する。７〜１０日以降に増殖してくる細胞はハイブリドーマだけである。増殖する細胞の培養上清を先に述べた方法で抗体の産生の有無を確認できる。産生を確認できたウェル中の細胞を限界希釈法にてクローニングする。
【００１２】
６．モノクローナル抗体の採取
目的とする抗体を産生するクローニングされたハイブリドーマを適当な濃度、好ましくは１０〜２０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０、ＭＥＭなどの適当な培地、あるいは無血清培地中で１週間程度培養しその培養液から抗体を得ることができる。また、大量の抗体を得るためにはミエローマ細胞由来と同種の動物にプリスタンなどの鉱物油を腹腔内に投与し、その後に該ハイブリドーマを１×104〜107個、好ましくは１×106個を腹腔内に投与する。約４〜３０日、好ましくは６〜２０日後に腹水を採取する。得られた腹水から抗イヌＩｇＥ抗体を精製するには、硫安分画、イオン交換カラムクロマトグラフィーなど通常タンパク質の精製に用いられることのできる種々の精製法を用いることができる。また、プロティンＡあるいはプロティンＧを用いたアフィニティ-カラムクロマトグラフィーによって単離することができる。
得られたモノクローナル抗体は、その抗原特異性が重要であるので、各種の抗体との交差反応性を調べた。イヌ全血清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度４−１２％グラディエントゲル）に供し各タンパク質を分離しウェスタンブロッティングによって該抗体が反応するタンパク質のバンドを検出して反応性を確認した。イヌ精製ＩｇＧ（生化学工業；コード番号251381）、ヒトＩｇＥ（生化学工業；コード番号280645）を対照としてイヌ全血清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離したタンパク質のバンドの中でＩｇＥ相当の位置にのみ反応するクローンを選択し２Ａ５（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２２８）、３Ｄ１０（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２２９）、３Ｈ１２の３クローンを得た。得られたクローンをマウスモノクローナル抗体イソタイピングキット（Amersham Biosciences社製、カタログ番号ＲＰＮ２９）を用いて調べた結果、２Ａ５および３Ｄ１０はＩｇＧ２ａ（κ）、３Ｈ１２はＩｇＧ２ｂ（κ）であった。
以下に実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、本発明はここに記載する実施例に限定されるものでない。
【実施例１】
【００１３】
スギ花粉抗原をビーグル犬（雌、４歳）に水酸化アルミニウムをアジュバントとして静脈内投与した。１週間間隔で４回投与した。さらに４日後に花粉抗原のみを同様に投与した。最終投与の後、３日後に血液を採取した。投与期間中、血液を採取しベッチル社の抗イヌＩｇＥポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にて測定しＩｇＥタイターの上昇を確認した。感作したビーグル犬のうち３頭でタイターの顕著な上昇が見られたため、この３頭から採血し一頭あたり約１００ｍｌの血液を得た。遠心分離にて血清を分離し以後の試験に供した。
【実施例２】
【００１４】
実施例１で得られた血清１０ｍｌに１００％飽和硫安溶液１０ｍｌを撹拌しながらゆっくりと滴下した。撹拌をさらに１０分間続けた後、遠心分離（８０００ｇ、１０分間、５℃）した。沈殿部を５０％飽和硫安溶液で２回洗浄し抗体画分を得た。沈殿している抗体画分をＰＢＳ１０ｍｌに溶解し,透析チューブに入れてＰＢＳに対し１晩透析を行った。ＰＢＳで平衡化したプロティンＧカラム（Amersham Biosciences, Hi Trap Protein G HP 17-0405-01）に供し通過液を集めた。通過液をＰＢＳで平衡化してある５ｍｌ容量のKaptiv-AEカラム（Tecnogen、TG9001）に供した。ＰＢＳ ３０ｍｌで洗浄した後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。２８０ｎｍの吸光度を測定し、溶出してきたタンパク質画分を集め、直ちに０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて中和した。調製した各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離しウェスタンブロッティングした結果を図１に示した。図から明らかなように、Kaptiv-AEカラムで分離したＩｇＥ画分では、ＩｇＥ抗体濃度が濃縮されていることが分かる。発色強度から推定したＩｇＥ抗体濃度は全タンパクの約３０％程度となっていた。なお、本画分にはＩｇＧ抗体は認められなかった。
【実施例３】
【００１５】
実施例２で得られたイヌＩｇＥ画分１００μｇをフロイント完全アジュバントを用いてＢＡＬＢ／ｃ（雌、４週令）マウスに腹腔内に投与した。その後２週間間隔でイヌＩｇＥ画分５０μｇをフロイントの不完全アジュバントと混和して３回追加免疫を行った。さらに追加免疫の２週間後にイヌＩｇＥ画分５０μｇをアジュバントを用いずに投与した。しかる後、３日後に免疫したマウスより脾細胞を得た。
【実施例４】
【００１６】
実施例３で得られた脾細胞１．３６×108個をミエローマ６５３株２．７×107個とポリエチレングリコール（SIGMA P-2906）を用いて常法とおり細胞融合を行った。全量を２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ（SIGMA P-2906）５０ｍｌに懸濁した。９６穴プレート５枚に１００μｌ／ｗｅｌｌずつまいた。週２回ＨＡＴ培地（ICN 1680849）に交換しながら培養し続いてＨＴ培地（ICN 1680949）に交換し培養を継続した。２週間後、ウェル全ての培養上清をＥＬＩＳＡによる１次スクリーニングに供した。マイクロタイタープレート（Nunc社製449824）にイヌＩｇＥおよびイヌＩｇＧをそれぞれ５μｇ／ｍｌ、５０μl／ｗｅｌｌとなるよう固相化した。ＢＳＡ（生化学工業、カタログ番号250080）でプレートをブロッキングした後に、培養上清を５０μｌウェルに加え室温で２時間反応させた後にＰＢＳで３回洗浄した。続いて、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（生化学工業、カタログ番号286005）を１００００倍にＰＢＳで希釈しその溶液５０μｌを各ウェルに加えた。０．０５％のTween 20を含むＰＢＳで３回洗浄した。０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２．５ｍｌに１ｍｇＯＰＤ錠（SIGMA、P-6662）を完全に溶解しそこへ３％Ｈ2Ｏ2を５μｌ加えた基質溶液１００μｌずつ各ウェルへ加えた。１０分後、２Ｎ硫酸を５０μｌ加え反応を停止した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。各ウェルの吸光度から、ＩｇＥに対する吸光度が高くＩｇＧに対する吸光度の低い（差及び比が大）ウェルを選択肢、４８穴プレートにて拡大培養を行った。結果を表１に示した。
【００１７】
【表１】
【実施例５】
【００１８】
４８穴プレートへ移植後、増殖の良いウェルについて培養上清をウェスタンブロッティングに供した（図２）。ε鎖と特異的に反応する４ウェル（１Ｅ１０、２Ａ５、３Ｄ１０、３Ｈ１２）を選択し特に反応の良い３ウェル（２Ａ５、３Ｄ１０、３Ｈ１２）をクローニングへ移行した。クローニングは、５％BriClone（Archport Ltd）を含む２０％ FCS-IMDM（SIGMA I-3390）培地を用い限界希釈法にて実施した。９６穴プレート１枚に１００μｌ／ウェルまき１週間後に培地を追加した。増殖が認められたウェルから、シングルあるいはコロニー数の少ないウェルを選び培養上清を実施例４で行ったのとまったく同じＥＬＩＳＡ法により一次スクリーニングを行った。実施例４と同様の選択基準によりクローンを選択し４８穴プレートに移植した。増殖が良好で、かつイヌＩｇＥと反応しイヌＩｇＧと反応しないクローンを選択しその培養上清をウェスタンブロッティングに供しクローンを選択してクローニングを終了した。
確立したクローンについて、培養上清を用いてマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Amersham
Biosciences、カタログ番号ＲＰＮ２９）を用いてサブクラスを決定した。その結果、２Ａ５及び３Ｄ１０はＩｇＧ２ａ（κ）であり、３Ｈ１２はＩｇＧ２ｂ（κ）であった。
【実施例６】
【００１９】
上記の通り得られた抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体を大量に得るために、確立したクローンをマウス５匹に移植し腹水を採取することとした。ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、１０週令）１匹あたりに０．５ｍｌのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン、フナコシカタログ番号０５−１５０４）をガラス製注射筒を用いて腹腔内へ投与した。１週間後に、先に調製したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの一つ３Ｄ１０をＦＣＳを含まないＩＭＤＭ培地で洗浄し同じ培地に５×１０6細胞／ｍｌとなるように調製した該ハイブリドーマを投与した。５日間飼育し腹水が貯留した事を確認した後、腹水を採取した。採取したマウスは再び飼育ケージに戻し飼育を継続した。３週間の間飼育と腹水採取を繰り返した。
【実施例７】
【００２０】
実施例６で得られた腹水約１０ｍｌに氷冷下、撹拌しながら同量の１００％飽和硫安溶液をゆっくりと加えた。１０分間撹拌した後、８０００ｇで１０分間遠心分離し沈殿部を集めた。氷冷した５０％飽和硫安溶液で沈殿を洗浄した後に、ＰＢＳに溶解し透析チューブに入れＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。透析した後、実施例２で使用したものと同じＰＢＳで平衡化したプロティンＧカラムに供した。カラムをＰＢＳ３０ｍｌで洗浄した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出した。ＵＶモニターで確認しながらタンパク溶出画分を集め直ちに中和した。電気泳動並びにＥＬＩＳＡで抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体であることを確認し目的とする精製抗体約３０ｍｇを得た。
【実施例８】
【００２１】
実施例７で得られた精製抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体３Ｄ１０の３ｍｇを１ｍｌ容量のHiTrap NHS-activated HP(Amersham社製) を用い指定されている取扱法に従ってカラム内の担体に結合させた。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（７５ｍＭ、ｐＨ８．０）で平衡化した後、実施例２で得られた部分精製したイヌＩｇＥ画分１０ｍｌを５０％飽和硫安で沈殿させ沈殿物を１０ｍｌの上記平衡化した緩衝液に溶解した。その溶液を調製したカラムに通しカラムを平衡化したのと同じ緩衝液で２８０ｎｍの吸光度をモニターし吸光度がほぼ０を示すまで洗浄した。その後、０．５ＭのＮａＣｌを含むグリシン−塩酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ２．７）で結合しているイヌＩｇＥ抗体を溶出した。カラム通過画分、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し精製を確認した。結果を図３に示す。これにより、当該モノクローナル抗体を用いてイヌＩｇＥを精製できることが明らかとなった。
【実施例９】
【００２２】
ダニアレルギーと診断されたイヌ血液を用いて抗原特異的ＩｇＥ濃度を測定した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１μｇ／ｍｌ濃度のダニアレルゲンＤｅｒｆ２を５０μｌずつ分注し室温で１時間放置し固相化した。１％ＢＳＡを各ウェルに２００μｌずつ分注し室温で１時間放置してブロッキングした。０．０５％Tween 20を含むＰＢＳで１０倍希釈したイヌ血清５０μｌを各ウェルに加え室温で1時間放置した。０．０５％Tween 20を含むＰＢＳで洗浄した後、１μｇ／ｍｌに希釈した抗体２Ａ５またはBethyl社製ヤギ抗イヌＩｇＥポリクローナル抗体（カタログ番号Ａ40125Ａ）を５０μｌ加え室温で１時間放置した。０．０５％Tween 20を含むＰＢＳで洗浄した後、二次抗体として1μｇ／ｍｌに調製したＨＲＰ標識された抗マウスＩｇＧ（生化学工業、カタログ番号286005）または抗ヤギＩｇＧ（生化学工業、カタログ番号284655）を５０μｌ加え室温で1時間放置した。０．０５％Tween 20を含むＰＢＳで洗浄した後、発色剤であるＯＰＤ１ｍｇ／ｍｌに３０％過酸化水素水1μｌを加えた溶液１００μｌを加えて室温で３０分反応させた。２Ｎ硫酸５０μｌを加えて反応を停止し各ウェルの４９２ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に示した。図の中で△で示した値は、獣医師による患犬の症状である。症状判定とダニアレルゲン特異的ＩｇＥ量との間には、正の相関が認められる。患犬番号８の症例だけが外れているが、この症例はＩＶ型アレルギーと同定されており抗体よりも細胞性免疫による症状であることからＩｇＥ量と症状が関連しないものであった。Bethyl社抗体を用いた場合、本発明による抗体と異なり感度が低く判定できない症例がほとんどであった。これにより本発明である抗体２Ａ５が優れていることが明らかとなった。
【実施例１０】
【００２３】
ハウスダストマイトに対してアレルギー症状を示すイヌ３頭および症状を示さないイヌ３頭の前腕部静脈からそれぞれ１ｍｌを採血した。遠心分離で血清を分離した。一方、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにダニアレルゲンＤｅｒｆ２溶液（生化学工業カタログ番号290452）１００μｇ／ｍｌ溶液）５０μｌを入れＰＢＳで３回洗浄し固相化した。ＢＳＡでブロッキングした後に、各ウェルへ先に調製したイヌ血清をＰＢＳで２倍希釈および４倍希釈してそれぞれ５０μｌ加え室温で２時間放置した。その後、各ウェルをTween 20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した。そこへ、実施例７で得られた抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体３Ｄ１０をＰＢＳに１μｇ／ｍｌ濃度に溶解しその溶液５０μｌ各ウェルに加えた。６０分放置した後、０．０５％Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄した。そこへ、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（生化学工業カタログ番号286015）を ＰＢＳで１μｇ／ｍｌ濃度としその５０μｌを各ウェルへ加えた。０．０５％Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄した。そこへ２．５ｍｌの１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にＯＰＤ錠剤（ＳＩＧＭＡカタログ番号Ｐ−6662）を溶解し３％の過酸化水素水５μｌを加えた基質溶液１００μｌを各ウェルへ加えた。５分経過した後に５０μｌの２Ｎ硫酸を加え反応を止め各ウェルの４９２ｎｍの吸光度を測定した。プリック反応にて確認された各イヌのハウスダストマイトに対する反応強度とＥＬＩＳＡによる吸光度を表２に示した。表から明らかなようにＥＬＩＳＡで確認したアレルゲンとプリック反応で確認したアレルゲンは良く一致し本抗体を用いたＥＬＩＳＡで感作アレルゲンを確認できることが明らかとなった。
【００２４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例２において調製した各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離しウェスタンブロッティングした結果を示す図である。
【図２】実施例５において、培養増殖の良いウェルについて培養上清をウェスタンブロッティングに供した結果を示す図である。
【図３】実施例８において、ＩｇＥのアフィニテイ精製３Ｄ１０を固相化した結果を示す図である。
【図４】実施例９において患犬症状と抗原特異的ＩｇＥ測定の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明はモノクローナル抗体、さらに詳しくは、イヌＩｇＥ抗体に対して作製された、抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体および該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、先進諸国を中心にイヌを生活の伴侶として生活を共にする人が増加している。室内で飼育するなどその飼育形態の変化や環境の影響によって飼育されているイヌに人間同様種々のアレルギー疾患が増加している。アレルギーはアレルギー症状を呈するイヌに固有のアレルゲンを吸入すること、アレルゲンに接触することあるいは摂食することによって発症するのであり、アレルギーを予防するにはその原因となるアレルゲンとの接触あるいは摂食を回避すればよい。そのためには、アレルゲンの特定が必要となっている。
従って、人間の場合と同様、アレルギー症状を呈しているイヌの真のアレルゲンを同定することさらにはＩ型アレルギーにおいて重要な役割を果たしているＩｇＥ抗体、特にアレルゲン特異的なＩｇＥ抗体量を正確に測定することが必要である。
【０００３】
先に記述したように、イヌのアレルギー症状を抑制するためにはアレルゲンの回避が必要でありそのためにはアレルゲンの特定やアレルゲン特異的なＩｇＥ抗体量の正確な測定が必要である。その診断を可能とするためには、イヌＩｇＥ抗体に特異性を有する抗体が必要である。しかし、現在入手可能な抗イヌＩｇＥ抗体は、特異性並びに親和性の点から満足できるものではなく信頼性のある診断を可能とする抗イヌＩｇＥ抗体が望まれていた。デボア（Douglas J. Deboer）らが１９９３年にイヌＩｇＥに対するモノクローナル抗体を報告しているが（非特許文献１）、得られた抗体は、ＩｇＥのみならずＩｇＧも僅かに認識したりＥＬＩＳＡで使用できないなど満足できる抗体ではなく市販されるにはいたらなかった。現在、ベッチル社（Bethyl Laboratories, Inc, 米国）からヤギで作製した抗イヌＩｇＥポリクローナル抗体が市販されているが、本抗体は親和性が低く目的に合致したものではない。
【特許文献１】Vet. Immunol. Immunopathol.1993；37：183-199
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
イヌのアレルギー疾患を治療する方法は、ヒトの治療に準じて行われている。ステロイドなどの免疫抑制剤や抗ヒスタミン剤が用いられているが、副作用を回避しながら効果を示す薬剤の投与は難しいのが現状である。さらに副作用の少ない有効な治療薬の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、イヌＩｇＥ抗体を特異的に認識するモノクローナル抗体を得るべく鋭意検討した結果、それを得ることに成功し、本発明を完成させるにいたった。すなわち、本発明はイヌＩｇＥ抗体を特異的に認識するモノクローナル抗体、またはイヌＩｇＥで免疫された動物のＢ細胞と形質細胞腫株との融合細胞株の産生するイヌＩｇＥ抗体と特異的に反応するモノクローナル抗体、およびそのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、さらには該モノクローナル抗体および該ハイブリドーマを製造する方法を提供するものである。また、該モノクローナル抗体を用いる各種疾患の診断薬および該モノクローナル抗体を遺伝子工学的にマウス型からイヌ型に変換したイヌ型抗体としてイヌ生体内のＩｇＥを捕捉することによるアレルギー治療薬を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本発明の抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体は次の各工程を経て製造された。
１．抗原の製造
２．免疫
３．抗体価測定系の設定
４．細胞融合
５．ハイブリドーマの選択およびクローニング
６．モノクローナル抗体の採取
以下、各工程につき説明する。
【０００７】
１．抗原の製造
特異性が高くかつ診断に使用できるレベルの親和性を有する抗ＩｇＥ抗体の取得は、免疫源として用いるイヌＩｇＥ抗体の純度並びに量が重要である。一般にＩｇＥ抗体の存在量は、ＩｇＧなどの他の抗体と比較して極めて微量であり純度の高い抗体を得ることが困難である。また、ＩｇＥ抗体かどうかを確認することも標準品が入手できないため難しいのが現状であった。そのため、純度並びに量も不十分な状態で免疫源としていたため診断などに使用できる抗イヌＩｇＥ抗体を作製できなかった。
そこで、１０頭のビーグル犬にそれぞれ水酸化アルミニウムをアジュバントとしてスギ花粉抗原を投与し免疫した後に採血し血清をゲル濃度４−１２％グラディエントゲルを用いてゲル電気泳動に供した。ＣＢＢ染色並びに抗ヒトＩｇＥ抗体（生化学工業（株）カタログ番号２４０４９１）で検出しヒト精製ＩｇＥをマーカーとして同じ泳動位置にバンドが認められる個体を選択した。続いて、このＩｇＥ抗体価の高いイヌから血清を得た。血清を５０％飽和硫安で抗体画分を沈殿させ分離しＰＢＳに対して一晩透析した。続いて、プロティンＧカラムに供し大量にあるＩｇＧを吸着除去した。プロティンＧカラム操作を繰返しウェスタンブロッティングにてＩｇＥが明確に確認できるレベルまで精製した。次に、Kaptiv-AEカラム（テクノゲン社製）にＩｇＥ抗体を吸着させ緩衝液で十分に洗浄した後、０．１Ｍの酢酸溶液で溶出し直ぐに１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）で中和した。各精製過程は、ヒトＩｇＥ抗体を標準品としたゲル電気泳動で確認しながら実施した。得られたＩｇＥ抗体を電気泳動にて分析した結果を図１に示す。ヒトＩｇＥ抗体と同じ位置にバンドが認められ純度もほぼ満足できるレベルに達していることが分かった。ゲル電気泳動の図から概算したＩｇＥ抗体量は全タンパクの３０％以上であった。ＩｇＥ抗体画分を限外瀘過にて濃縮し１ｍｇ／ｍｌとした。
【０００８】
２．免疫
上記のようにして得られた免疫原を哺乳動物、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ハムスター、ラット、マウスなどに投与する。モノクローナル抗体を得るためには、ラット、ハムスター、マウスが好ましく、特にマウスが好ましい。免疫の方法は、動物の皮下、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内などのいずれの経路でも可能であるが、主として静脈内、皮下、腹腔内に投与するのが好ましい。免疫間隔はいかなる設定も可能であるが数日から４週間隔、好ましくは３日〜２週間隔で、２〜１０回免疫し、最終免疫後、１〜５日、好ましくは約２〜４日後に抗体産生細胞を採取すればよい。免疫する際には、種々のアジュバントを用いると免疫の効率がよくなる。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ＢＣＧなどが用いられる。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、各部位のリンパ節細胞、胸腺細胞、末梢血細胞が用いられるが、脾臓細胞を用いるのが一般的である。抗原の免疫量は１回にマウス１匹あたり０．１〜５００μｇ、好ましくは１〜３００μｇ用いることが望ましい。
【０００９】
３．抗体価測定系の設定
免疫した動物の血中抗体価、あるいは後記の抗体産生細胞培養上清中の抗体価を測定する必要がある。抗体検出の方法は、いかなる方法も使用できるがＥＬＩＳＡが便利である。プラスティックプレートの各ウェルに先に精製してあるイヌＩｇＥ抗体画分を加え室温放置して固相化しＢＳＡやスキムミルクでブロッキングする。そこへ、ＰＢＳで希釈した血清あるいはハイブリドーマ培養上清を抗原が固相化されたウェルへ加え反応させた後に洗浄し、酵素で標識された抗マウスＩｇＧ抗体を加え、反応・洗浄後に基質を加えて発色させ、抗イヌＩｇＥ抗体の存在量を測定する。ＥＬＩＳＡでの判定に加えて、精製したイヌＩｇＥを、ヒトＩｇＥを標準品としたウェスタンブロッティングに供し得られた抗体がイヌＩｇＥ抗体と反応することを確認する。
【００１０】
４．細胞融合
上記脾臓細胞と形質細胞腫株との細胞融合は、たとえば摘出したマウスの脾臓細胞を、選択できるようなマーカーを持った同種または異種の、好ましくは同種の細胞腫株と融合させる。細胞腫株としては、ミエローマが好ましくＰＡＩ、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ４．１、６５３、Ｙ３−ＡＧ１．２．３などを用いることができる。細胞融合は、ポリエチレングリコールを融合促進剤として用いる。107〜108 個のミエローマ細胞と脾臓細胞を混合比１：１〜1：１０でＲＰＭＩ−１６４０などの培地中、３０〜３７℃で１〜１０分間混合することによって融合させる。融合促進に使用するポリエチレングリコールの代わりにポリビニルアルコールなどを用いることもできる。濃度は１０〜８０％、好ましくは３０〜５０％で３０秒から３０分、好ましくは３〜１５分処理することによって細胞融合が終了する。
【００１１】
５．ハイブリドーマの選択およびクローニング
融合した細胞は、１０〜２０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地などで希釈し９６穴のマイクロタイタープレートに各ウェルあたり１×105〜１×106個になるように加えＨＡＴ培地を用いてハイブリドーマだけを選択的に増殖させることができる。１０〜１４日ころからＨＴ培地に交換し、さらに培養を継続する。７〜１０日以降に増殖してくる細胞はハイブリドーマだけである。増殖する細胞の培養上清を先に述べた方法で抗体の産生の有無を確認できる。産生を確認できたウェル中の細胞を限界希釈法にてクローニングする。
【００１２】
６．モノクローナル抗体の採取
目的とする抗体を産生するクローニングされたハイブリドーマを適当な濃度、好ましくは１０〜２０％のウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０、ＭＥＭなどの適当な培地、あるいは無血清培地中で１週間程度培養しその培養液から抗体を得ることができる。また、大量の抗体を得るためにはミエローマ細胞由来と同種の動物にプリスタンなどの鉱物油を腹腔内に投与し、その後に該ハイブリドーマを１×104〜107個、好ましくは１×106個を腹腔内に投与する。約４〜３０日、好ましくは６〜２０日後に腹水を採取する。得られた腹水から抗イヌＩｇＥ抗体を精製するには、硫安分画、イオン交換カラムクロマトグラフィーなど通常タンパク質の精製に用いられることのできる種々の精製法を用いることができる。また、プロティンＡあるいはプロティンＧを用いたアフィニティ-カラムクロマトグラフィーによって単離することができる。
得られたモノクローナル抗体は、その抗原特異性が重要であるので、各種の抗体との交差反応性を調べた。イヌ全血清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ゲル濃度４−１２％グラディエントゲル）に供し各タンパク質を分離しウェスタンブロッティングによって該抗体が反応するタンパク質のバンドを検出して反応性を確認した。イヌ精製ＩｇＧ（生化学工業；コード番号251381）、ヒトＩｇＥ（生化学工業；コード番号280645）を対照としてイヌ全血清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離したタンパク質のバンドの中でＩｇＥ相当の位置にのみ反応するクローンを選択し２Ａ５（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２２８）、３Ｄ１０（特許生物寄託センター寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−２０２２９）、３Ｈ１２の３クローンを得た。得られたクローンをマウスモノクローナル抗体イソタイピングキット（Amersham Biosciences社製、カタログ番号ＲＰＮ２９）を用いて調べた結果、２Ａ５および３Ｄ１０はＩｇＧ２ａ（κ）、３Ｈ１２はＩｇＧ２ｂ（κ）であった。
以下に実施例をもって本発明をより詳細に説明するが、本発明はここに記載する実施例に限定されるものでない。
【実施例１】
【００１３】
スギ花粉抗原をビーグル犬（雌、４歳）に水酸化アルミニウムをアジュバントとして静脈内投与した。１週間間隔で４回投与した。さらに４日後に花粉抗原のみを同様に投与した。最終投与の後、３日後に血液を採取した。投与期間中、血液を採取しベッチル社の抗イヌＩｇＥポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ法にて測定しＩｇＥタイターの上昇を確認した。感作したビーグル犬のうち３頭でタイターの顕著な上昇が見られたため、この３頭から採血し一頭あたり約１００ｍｌの血液を得た。遠心分離にて血清を分離し以後の試験に供した。
【実施例２】
【００１４】
実施例１で得られた血清１０ｍｌに１００％飽和硫安溶液１０ｍｌを撹拌しながらゆっくりと滴下した。撹拌をさらに１０分間続けた後、遠心分離（８０００ｇ、１０分間、５℃）した。沈殿部を５０％飽和硫安溶液で２回洗浄し抗体画分を得た。沈殿している抗体画分をＰＢＳ１０ｍｌに溶解し,透析チューブに入れてＰＢＳに対し１晩透析を行った。ＰＢＳで平衡化したプロティンＧカラム（Amersham Biosciences, Hi Trap Protein G HP 17-0405-01）に供し通過液を集めた。通過液をＰＢＳで平衡化してある５ｍｌ容量のKaptiv-AEカラム（Tecnogen、TG9001）に供した。ＰＢＳ ３０ｍｌで洗浄した後、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出した。２８０ｎｍの吸光度を測定し、溶出してきたタンパク質画分を集め、直ちに０．５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加えて中和した。調製した各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離しウェスタンブロッティングした結果を図１に示した。図から明らかなように、Kaptiv-AEカラムで分離したＩｇＥ画分では、ＩｇＥ抗体濃度が濃縮されていることが分かる。発色強度から推定したＩｇＥ抗体濃度は全タンパクの約３０％程度となっていた。なお、本画分にはＩｇＧ抗体は認められなかった。
【実施例３】
【００１５】
実施例２で得られたイヌＩｇＥ画分１００μｇをフロイント完全アジュバントを用いてＢＡＬＢ／ｃ（雌、４週令）マウスに腹腔内に投与した。その後２週間間隔でイヌＩｇＥ画分５０μｇをフロイントの不完全アジュバントと混和して３回追加免疫を行った。さらに追加免疫の２週間後にイヌＩｇＥ画分５０μｇをアジュバントを用いずに投与した。しかる後、３日後に免疫したマウスより脾細胞を得た。
【実施例４】
【００１６】
実施例３で得られた脾細胞１．３６×108個をミエローマ６５３株２．７×107個とポリエチレングリコール（SIGMA P-2906）を用いて常法とおり細胞融合を行った。全量を２０％ＦＣＳ−ＩＭＤＭ（SIGMA P-2906）５０ｍｌに懸濁した。９６穴プレート５枚に１００μｌ／ｗｅｌｌずつまいた。週２回ＨＡＴ培地（ICN 1680849）に交換しながら培養し続いてＨＴ培地（ICN 1680949）に交換し培養を継続した。２週間後、ウェル全ての培養上清をＥＬＩＳＡによる１次スクリーニングに供した。マイクロタイタープレート（Nunc社製449824）にイヌＩｇＥおよびイヌＩｇＧをそれぞれ５μｇ／ｍｌ、５０μl／ｗｅｌｌとなるよう固相化した。ＢＳＡ（生化学工業、カタログ番号250080）でプレートをブロッキングした後に、培養上清を５０μｌウェルに加え室温で２時間反応させた後にＰＢＳで３回洗浄した。続いて、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（生化学工業、カタログ番号286005）を１００００倍にＰＢＳで希釈しその溶液５０μｌを各ウェルに加えた。０．０５％のTween 20を含むＰＢＳで３回洗浄した。０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２．５ｍｌに１ｍｇＯＰＤ錠（SIGMA、P-6662）を完全に溶解しそこへ３％Ｈ2Ｏ2を５μｌ加えた基質溶液１００μｌずつ各ウェルへ加えた。１０分後、２Ｎ硫酸を５０μｌ加え反応を停止した。ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定した。各ウェルの吸光度から、ＩｇＥに対する吸光度が高くＩｇＧに対する吸光度の低い（差及び比が大）ウェルを選択肢、４８穴プレートにて拡大培養を行った。結果を表１に示した。
【００１７】
【表１】
【実施例５】
【００１８】
４８穴プレートへ移植後、増殖の良いウェルについて培養上清をウェスタンブロッティングに供した（図２）。ε鎖と特異的に反応する４ウェル（１Ｅ１０、２Ａ５、３Ｄ１０、３Ｈ１２）を選択し特に反応の良い３ウェル（２Ａ５、３Ｄ１０、３Ｈ１２）をクローニングへ移行した。クローニングは、５％BriClone（Archport Ltd）を含む２０％ FCS-IMDM（SIGMA I-3390）培地を用い限界希釈法にて実施した。９６穴プレート１枚に１００μｌ／ウェルまき１週間後に培地を追加した。増殖が認められたウェルから、シングルあるいはコロニー数の少ないウェルを選び培養上清を実施例４で行ったのとまったく同じＥＬＩＳＡ法により一次スクリーニングを行った。実施例４と同様の選択基準によりクローンを選択し４８穴プレートに移植した。増殖が良好で、かつイヌＩｇＥと反応しイヌＩｇＧと反応しないクローンを選択しその培養上清をウェスタンブロッティングに供しクローンを選択してクローニングを終了した。
確立したクローンについて、培養上清を用いてマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Amersham
Biosciences、カタログ番号ＲＰＮ２９）を用いてサブクラスを決定した。その結果、２Ａ５及び３Ｄ１０はＩｇＧ２ａ（κ）であり、３Ｈ１２はＩｇＧ２ｂ（κ）であった。
【実施例６】
【００１９】
上記の通り得られた抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体を大量に得るために、確立したクローンをマウス５匹に移植し腹水を採取することとした。ＢＡＬＢ／ｃマウス（♀、１０週令）１匹あたりに０．５ｍｌのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン、フナコシカタログ番号０５−１５０４）をガラス製注射筒を用いて腹腔内へ投与した。１週間後に、先に調製したモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの一つ３Ｄ１０をＦＣＳを含まないＩＭＤＭ培地で洗浄し同じ培地に５×１０6細胞／ｍｌとなるように調製した該ハイブリドーマを投与した。５日間飼育し腹水が貯留した事を確認した後、腹水を採取した。採取したマウスは再び飼育ケージに戻し飼育を継続した。３週間の間飼育と腹水採取を繰り返した。
【実施例７】
【００２０】
実施例６で得られた腹水約１０ｍｌに氷冷下、撹拌しながら同量の１００％飽和硫安溶液をゆっくりと加えた。１０分間撹拌した後、８０００ｇで１０分間遠心分離し沈殿部を集めた。氷冷した５０％飽和硫安溶液で沈殿を洗浄した後に、ＰＢＳに溶解し透析チューブに入れＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。透析した後、実施例２で使用したものと同じＰＢＳで平衡化したプロティンＧカラムに供した。カラムをＰＢＳ３０ｍｌで洗浄した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）で溶出した。ＵＶモニターで確認しながらタンパク溶出画分を集め直ちに中和した。電気泳動並びにＥＬＩＳＡで抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体であることを確認し目的とする精製抗体約３０ｍｇを得た。
【実施例８】
【００２１】
実施例７で得られた精製抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体３Ｄ１０の３ｍｇを１ｍｌ容量のHiTrap NHS-activated HP(Amersham社製) を用い指定されている取扱法に従ってカラム内の担体に結合させた。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（７５ｍＭ、ｐＨ８．０）で平衡化した後、実施例２で得られた部分精製したイヌＩｇＥ画分１０ｍｌを５０％飽和硫安で沈殿させ沈殿物を１０ｍｌの上記平衡化した緩衝液に溶解した。その溶液を調製したカラムに通しカラムを平衡化したのと同じ緩衝液で２８０ｎｍの吸光度をモニターし吸光度がほぼ０を示すまで洗浄した。その後、０．５ＭのＮａＣｌを含むグリシン−塩酸緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ２．７）で結合しているイヌＩｇＥ抗体を溶出した。カラム通過画分、溶出画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し精製を確認した。結果を図３に示す。これにより、当該モノクローナル抗体を用いてイヌＩｇＥを精製できることが明らかとなった。
【実施例９】
【００２２】
ダニアレルギーと診断されたイヌ血液を用いて抗原特異的ＩｇＥ濃度を測定した。ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに１μｇ／ｍｌ濃度のダニアレルゲンＤｅｒｆ２を５０μｌずつ分注し室温で１時間放置し固相化した。１％ＢＳＡを各ウェルに２００μｌずつ分注し室温で１時間放置してブロッキングした。０．０５％Tween 20を含むＰＢＳで１０倍希釈したイヌ血清５０μｌを各ウェルに加え室温で1時間放置した。０．０５％Tween 20を含むＰＢＳで洗浄した後、１μｇ／ｍｌに希釈した抗体２Ａ５またはBethyl社製ヤギ抗イヌＩｇＥポリクローナル抗体（カタログ番号Ａ40125Ａ）を５０μｌ加え室温で１時間放置した。０．０５％Tween 20を含むＰＢＳで洗浄した後、二次抗体として1μｇ／ｍｌに調製したＨＲＰ標識された抗マウスＩｇＧ（生化学工業、カタログ番号286005）または抗ヤギＩｇＧ（生化学工業、カタログ番号284655）を５０μｌ加え室温で1時間放置した。０．０５％Tween 20を含むＰＢＳで洗浄した後、発色剤であるＯＰＤ１ｍｇ／ｍｌに３０％過酸化水素水1μｌを加えた溶液１００μｌを加えて室温で３０分反応させた。２Ｎ硫酸５０μｌを加えて反応を停止し各ウェルの４９２ｎｍの吸光度を測定した。結果を図４に示した。図の中で△で示した値は、獣医師による患犬の症状である。症状判定とダニアレルゲン特異的ＩｇＥ量との間には、正の相関が認められる。患犬番号８の症例だけが外れているが、この症例はＩＶ型アレルギーと同定されており抗体よりも細胞性免疫による症状であることからＩｇＥ量と症状が関連しないものであった。Bethyl社抗体を用いた場合、本発明による抗体と異なり感度が低く判定できない症例がほとんどであった。これにより本発明である抗体２Ａ５が優れていることが明らかとなった。
【実施例１０】
【００２３】
ハウスダストマイトに対してアレルギー症状を示すイヌ３頭および症状を示さないイヌ３頭の前腕部静脈からそれぞれ１ｍｌを採血した。遠心分離で血清を分離した。一方、ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにダニアレルゲンＤｅｒｆ２溶液（生化学工業カタログ番号290452）１００μｇ／ｍｌ溶液）５０μｌを入れＰＢＳで３回洗浄し固相化した。ＢＳＡでブロッキングした後に、各ウェルへ先に調製したイヌ血清をＰＢＳで２倍希釈および４倍希釈してそれぞれ５０μｌ加え室温で２時間放置した。その後、各ウェルをTween 20を０．０５％含むＰＢＳで３回洗浄した。そこへ、実施例７で得られた抗イヌＩｇＥモノクローナル抗体３Ｄ１０をＰＢＳに１μｇ／ｍｌ濃度に溶解しその溶液５０μｌ各ウェルに加えた。６０分放置した後、０．０５％Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄した。そこへ、ＨＲＰ標識した抗マウスＩｇＧ抗体（生化学工業カタログ番号286015）を ＰＢＳで１μｇ／ｍｌ濃度としその５０μｌを各ウェルへ加えた。０．０５％Tween20を含むＰＢＳで３回洗浄した。そこへ２．５ｍｌの１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）にＯＰＤ錠剤（ＳＩＧＭＡカタログ番号Ｐ−6662）を溶解し３％の過酸化水素水５μｌを加えた基質溶液１００μｌを各ウェルへ加えた。５分経過した後に５０μｌの２Ｎ硫酸を加え反応を止め各ウェルの４９２ｎｍの吸光度を測定した。プリック反応にて確認された各イヌのハウスダストマイトに対する反応強度とＥＬＩＳＡによる吸光度を表２に示した。表から明らかなようにＥＬＩＳＡで確認したアレルゲンとプリック反応で確認したアレルゲンは良く一致し本抗体を用いたＥＬＩＳＡで感作アレルゲンを確認できることが明らかとなった。
【００２４】
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】実施例２において調製した各分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離しウェスタンブロッティングした結果を示す図である。
【図２】実施例５において、培養増殖の良いウェルについて培養上清をウェスタンブロッティングに供した結果を示す図である。
【図３】実施例８において、ＩｇＥのアフィニテイ精製３Ｄ１０を固相化した結果を示す図である。
【図４】実施例９において患犬症状と抗原特異的ＩｇＥ測定の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌＩｇＥ抗体を特異的に認識する、２Ａ５（ＦＥＲＭ Ｐ−２０２２８）および３Ｄ１０（ＦＥＲＭＰ−２０２２９）から選択されるモノクローナル抗体。
【請求項２】
イヌＩｇＥ抗体にて免疫されたマウスのＢ細胞と形質細胞腫との融合細胞株の産生する、イヌＩｇＥ抗体に特異的に反応する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１記載のモノクローナル抗体を用いてアフィニティ-精製したイヌＩｇＥ抗体。
【請求項５】
請求項１記載のモノクローナル抗体を用いたイヌアレルギー診断法。
【請求項６】
請求項１記載のモノクローナル抗体を用いたイヌアレルギー診断キット。
【請求項１】
イヌＩｇＥ抗体を特異的に認識する、２Ａ５（ＦＥＲＭ Ｐ−２０２２８）および３Ｄ１０（ＦＥＲＭＰ−２０２２９）から選択されるモノクローナル抗体。
【請求項２】
イヌＩｇＥ抗体にて免疫されたマウスのＢ細胞と形質細胞腫との融合細胞株の産生する、イヌＩｇＥ抗体に特異的に反応する請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項３】
請求項２記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１記載のモノクローナル抗体を用いてアフィニティ-精製したイヌＩｇＥ抗体。
【請求項５】
請求項１記載のモノクローナル抗体を用いたイヌアレルギー診断法。
【請求項６】
請求項１記載のモノクローナル抗体を用いたイヌアレルギー診断キット。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図１】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００６−１５１８８０（Ｐ２００６−１５１８８０Ａ）
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３４５４８３（Ｐ２００４−３４５４８３）
【出願日】平成１６年１１月３０日（２００４．１１．３０）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月１５日（２００６．６．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１１月３０日（２００４．１１．３０）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
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