抗体又は標的の同定のための方法
本開示は、サンプル中の免疫グロブリンのレパートリ配列データを分析することによって、及び前記サンプル中にある最も優性のＶＨ及びＶＬ鎖を決定することによって、抗体、標的分子、又は病原体を同定するための方法、ならびにその方法で用いられる材料に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物学的サンプル中の免疫グロブリンの配列データを分析することによって、及び、前記生物学的サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定することによって、抗体、標的分子、又は病原体を同定するための方法に関する。それに用いられる材料も更に提供される。
【背景技術】
【０００２】
抗体又は標的分子を同定するための従来の方法は、活性化させたヒトＢ細胞から抗体を単離する困難なプロセスを含む。例えば、免疫化した、あるいは癌患者のＢ細胞からの完全ヒト抗体の単離は、完全ヒト抗体に対する有効な経路と見なされる。いくつかの企業はヒトから単一のＢ細胞を単離するための商業上のサービスを提供する。これらのＢ細胞は不死化されるか、あるいは単一細胞の免疫グロブリンの遺伝情報が回収されるかである。これらの方法は、困難かつ高価な高処理技術を含み、細胞ごとに遺伝情報を単離し、数千の細胞を不死化し、標的組織でそれらの各出力をスクリーニングするための技術を含む。
【０００３】
近年、いくつかの企業が全ゲノム配列決定サービス、あるいは各タスクを実現するために用いることができる機械を提供している。これはＲｏｃｈｅ社の４５４システム、Ｉｌｌｕｍｉｎａｓ社のＳｏｌｅｘａシステム、及びＨｅｌｉｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステムを含む。例えば、Ｈｅｌｉｃｏ社のシステムは、標的配列の定量的分布を更に維持することによって、単一機械で２４時間内に２×１０９の塩基を配列決定できる。
【０００４】
米国特許第７，２８８，２４９号は、２又はそれ以上の別個の細胞集団の表面に特異的に発現される抗原を同定するための方法を開示する。免疫化はＢ細胞でトリガされ、増殖（クローン増殖）するために、及び対応する抗体を分泌するために、免疫原に結合するＶＨ−ＶＬの組合せを産生する。しかしながら、米国特許第７，２８８，２４９号によるプロセスは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のクローン化を含み（ＶＨ及びＶＬ遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローン化される）、ＶＨ及びＶＬ遺伝子はファージライブラリ中でランダムに組換えられ（すなわち、最も豊富なＶＨ及びＶＬ遺伝子の選択がない）、その後、Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）；に記載のように抗原結合クローンについて検索される。抗体の可変型遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコード化した核酸は、対象の細胞から回収されて、増幅される。再配列されたＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合においては、所望のＤＮＡがリンパ球からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離することによって取得され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が後に続き、プライマーが再配列されたＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端と合致する。有用な抗体を見つけるために、未処理の抗体ファージライブラリが実際の癌細胞に対してスクリーニングされる。
【０００５】
米国特許第６，８９７，０２８号は、タンパク質がリガンドに結合する分子標的の同定方法について記載し、ペプチド又はタンパク質ライブラリに対するリガンドをスクリーニングし、ここでペプチド又はライブラリのタンパク質メンバは、細胞から得られるｃＤＮＡライブラリの発現産物、及びその発現産物のフラグメントから選択される。このプロセスは更に、ライブラリから分離されたメンバをコード化する核酸配列を決定するステップと、これらの核酸配列をペプチド配列に翻訳するステップと、タンパク質を同定するステップとを含む。
【０００６】
米国特許出願公開第２００６０１４１５３２号明細書（出願番号１１／２８６９１７）は、Ｉｗａｓａｋｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２８７４−２８８１，１９９４；に開示されるように、抗イディオタイプの抗体の特定のＶＨ又はＶＬ領域のアミノ酸配列を決定するためのプロトコルを用いることによって、免疫原性ペプチドを同定及び設計するための方法を開示する。抗原のアミノ酸は標準的なアミノ酸分析技術によって、あるいは化学的配列決定によって決定され、抗イディオタイプの抗体のＶＨ及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列は、当該技術分野で周知の技術による、各領域をコード化するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを配列決定することによって決定される。
【０００７】
国際公開第２００５／０９４１５９号は、不死化リンパ球からの結合ペプチドの単離と、健常組織ではない腫瘍組織に選択的に結合する、これらの結合ペプチド、通常はＩｇＭ１免疫グロブリンの試験とについて記載する。結合ペプチドは腫瘍の増殖を阻害できる。
【０００８】
国際公開第０３／０５２４１６号は、Ｂ細胞からの候補のＶＨ及びＶＬ配列の単離及び配列決定のためのアプローチについて記載する。前記候補のＶＨ及びＶＬ配列によってコード化された免疫グロブリンは感染症の治療に有用な可能性がある。国際公開第０３／０５２４１６号に記載された方法論、ならびに先行技術で開示された総ての他の方法は、配列決定前の核酸の操作を要求する。特に、時間のかかるクローニングステップが必須であり、本発明に開示のような範囲の方法を実行することを不可能にしている。
【０００９】
国際公開第０３／０５２４１６号の場合にあるように、上述の総ての方法は、標的をコード化する核酸を単離する困難なプロセス、及び／又は超高処理によるゲノム配列決定を含む。しかしながら、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析することによって、及び最も優性のＶＨ及びＶＬを決定することによって標的分子を同定する、困難が少なく、対費用効果の高い、及び／又はより簡単な方法は有用である。
【発明の概要】
【００１０】
本開示の実施形態は一般的に、生物学的サンプル中にある免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の配列データを分析することによって、抗体、標的分子、又は病原体を同定する方法に関する。この実施形態の一部は、所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定することと、ベクタにおける発現用に最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成することと、発現した抗体を試験して標的分子を同定することとに関する。他の実施形態は、所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定することと、ベクタにおける発現用に最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成することと、特定の標的分子又は標的組織に結合する発現した抗体のどちらかを試験することとに関する。特定の実施形態においては、サンプルは事前選択又は事前濃縮されない生物学的サンプルである。
【００１１】
一実施形態は、サンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、
ａ）サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得するステップであって、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｂ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の各々を配列決定するステップであって、これによってサンプル中にある免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｃ）所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｄ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成し、哺乳類発現ベクタを用いて抗体を産生するステップと；
ｅ）抗体を試験するステップであって、これによって特定の標的分子又は組織に結合する抗体を同定するか、あるいは特定の抗体に結合する標的分子を同定するステップと；
を具える。
【００１２】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、
ａ）ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマといった、免疫化されるか、あるいは病原体又は標的分子に感染する哺乳類から、生物学的サンプルを提供するステップと；
ｂ）生物学的サンプルからＢ細胞を収集するステップと；
ｃ）収集されたＢ細胞中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡ（例えば、ＩｇＧ）を取得するステップと；
ｄ）免疫グロブリンのｃＤＮＡを産生するステップであって（例えば、逆転写ＰＣＲによって、及び増幅用のＩｇＧに特異的なプライマーを用いることによって）、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｅ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の各々を配列決定するステップであって（例えば、ＶＨ及びＶＬの別個の配列を取得することによって）、これによってサンプル中にある免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｆ）ＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析して、サンプル中にある最も優性のＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｇ）所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｈ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成するステップと；
ｉ）合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを、哺乳類発現ベクタに組み込むステップと；
ｊ）ＶＨ及びＶＬポリヌクレオチド組み込み型ベクタが培養基中で発現するのを可能にするステップであって、これによって抗体又はそのフラグメントを産生するステップと；
ｋ）イムノアッセイを用いることによって抗体を試験するステップであって、これによって抗体、標的分子、又は標的分子に対する病原体を同定するステップと；
を具える。特定の実施形態においては、哺乳類は罹患哺乳類である。
【００１３】
特定の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥの免疫グロブリンクラスのうちの少なくとも１つ、あるいはそのフラグメントである。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００１４】
特定の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の免疫グロブリンＧのサブクラスのいずれか１つである。
【００１５】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、免疫グロブリンのｃＤＮＡは逆転写ＰＣＲによって産生される。
【００１６】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、ＩｇＧに特異的なプライマーは逆転写ＰＣＲ増幅で用いられる。
【００１７】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、プライマーはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の免疫グロブリンＧのサブクラスのいずれか１つに対して特異的な逆転写ＰＣＲ増幅で用いられる。
【００１８】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖に対する別個の配列データが取得される。ＶＨ及びＶＬ鎖の配列データはデータベースに保存され、最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖がコンピュータに実装されるアルゴリズムを介して決定される。
【００１９】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。
【００２０】
別の実施形態はサンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、
ａ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析するステップと；
ｂ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の存在量を決定するステップと；
を具える。方法は更に、ステップｂ）で同定された豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を含む１又はそれ以上の免疫グロブリンを調製するステップを具える。
【００２１】
特定の実施形態においては、ヒトは癌患者であるか、あるいは免疫化されるか、あるいは病原体又は標的分子に感染している。
【００２２】
更に、本開示の別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、生物学的サンプル中にある可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の免疫グロブリンの配列データを分析することによって、抗体、標的分子、又は病原体を同定するための方法、ならびに本明細書中に開示された方法で用いられる材料を提供する。本開示は更に、所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定し、ベクタにおける発現用に最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成し、発現した抗体を試験して標的分子を同定する方法に関する。
【００２４】
一態様によると、本開示は「免疫ゲノム（ｉｍｍｕｎｏｎｏｍｅ）」の配列決定によって、抗体、標的分子、又は病原体を同定又は検出するため方法を提供し、それは哺乳類サンプル（ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマなど）中で免疫グロブリン（ＩｇＧなど）をコード化する完全なｍＲＮＡ（あるいは、逆転写ＰＣＲ後のｃＤＮＡ）のことであり、哺乳類は標的分子で免疫化されるか、癌患者であるか、あるいは特定のウイルス性、細菌性、又は原生動物の種に感染する。特定の実施形態においては、哺乳類（例えば、ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマ）はワクチンといった標的分子で免疫化される。他の実施形態においては、前記哺乳類は癌患者である。
【００２５】
別の態様によると、Ｂ細胞は免疫化された哺乳類又は癌患者から単離され、ｍＲＮＡは各サンプルから抽出され、ｍＲＮＡによってコード化された免疫グロブリンは逆転写及び配列決定される。いくつかの実施形態においては、少なくとも１０４のＢ細胞が免疫化された哺乳類又は癌患者から単離され、他の実施形態においては、少なくとも１０５のＢ細胞、１０６のＢ細胞、又は更に１０７のＢ細胞が免疫化された哺乳類又は癌患者から単離される。免疫グロブリンの可変鎖をコード化する遺伝子は一般的には、約１０００ヌクレオチドの長さを有する。従って、配列情報の約２×１０９の塩基の配列決定は、少なくとも２倍の免疫ゲノム全体を包含する。優性のＣＤＲ配列ならびにその（高頻度）変異が同定される。これらの配列は特異的であるか、あるいは免疫刺激に対し少なくとも代表的である。重鎖及び軽鎖配列（相互に回復できない）は、優性の頻度によって、すなわちその存在量によってクラスター形成される。最も豊富なＶＨ及びＶＬは合成され、哺乳類発現ベクタに（１つごとに、あるいは集団で）導入される。ベクタは好適な培地で発現され、スクリーニングされて、対象の標的に対し特異性の免疫グロブリン、又はそのフラグメントを取得する。得られた結合剤は治療効果について試験され、薬剤として用いるために産生され、新しい抗体又は分子標的を同定するのに用いられうる。
【００２６】
本開示の実施形態は利点を提供し、以下のものを含む。
― 本明細書中に記載の実施形態は、超高処理の従来の生物学（ｗｅｔ ｂｉｏｌｏｇｙ）を情報生物学、及び有意に減少した時系列中の多くの患者からのＢ細胞を分析する場合に並列化が可能な、単一で広範囲の並列型分子配列決定技術に置換できる（通常、ショットガン配列決定のみが実行され、７５ないし５００の塩基対の比較的短い伸長を産生し、アセンブリは取得されたフラグメントの配列分析によってなされる）。
― 免疫グロブリンの定常領域中の高い相同性は、配列分析アルゴリズムと干渉しない。
― 本明細書中に記載の実施形態はクローニングステップの回避を可能にする。
― 本明細書中に記載の実施形態は、ＩｇＧ選択性のプライマー、つまりＩｇＧサブクラスに特異的なプライマーを用いることによって、低品質ＩｇＭの単離の問題を克服できる。
― 本明細書中の方法は、診断方法のために免疫ゲノムを用いることを可能にする。例えば、同一のアレルゲンに対するアレルギーを受ける患者はその免疫反応において同様の配列パターンを示しうる。従って、原則的にバイオマーカーとしての免疫ゲノムのプロファイルの使用は更に十分な大きさのデータセットが取得された場合に実現可能である。
― 免疫ゲノムの情報は更に、合成型のヒト、ネズミ、又はげっ歯類全体の抗体ライブラリの設計を促進できる。
【００２７】
本開示の一実施形態によると、サンプル中、例えば、免疫化されるか、あるいは病原体又は標的分子に感染する哺乳類（例えば、ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマ）由来の生物学的サンプル中の抗体、標的分子、疾病マーカー、病原体、又は標的分子に対する病原体は、
ａ）サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得するステップであって（例えば、サンプルからＢ細胞を収集することによって）、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｂ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の各々を配列決定するステップであって、これによってサンプル中にある免疫グロブリン（ＩｇＧ等）のＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｃ）サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと（例えば、所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析することによって）；
ｄ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成し、哺乳類発現ベクタを用いて抗体を産生するステップと（例えば、合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを哺乳類発現ベクタに組み込むことによって）；
ｅ）抗体を試験するステップであって（例えば、イムノアッセイを用いることによって）、これによって、サンプル中の抗体、標的、又は標的分子に対する病原体を同定するステップと；
を具える方法によって、同定、決定、検出又は診断される。
【００２８】
本開示の別の実施形態によると、抗体、標的分子、疾病マーカー、病原体、又は標的分子に対する病原体は、
ａ）免疫化されるか、あるいは病原体又は標的分子に感染する哺乳類（例えば、ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマ）由来の生物学的サンプル、あるいは疾病マーカー又は標的分子に対する抗体を含むサンプルを提供するステップと；
ｂ）生物学的サンプルからＢ細胞を収集するステップと；
ｃ）収集されたＢ細胞中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡを取得するステップと；
ｄ）免疫グロブリンのｃＤＮＡを産生するステップであって、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｅ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の各々（ＶＨ及びＶＬの配列に好適で、かつ別個に得られる）を配列決定するステップであって、これによってサンプル中にある免疫グロブリン（ＩｇＧ等）のＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｆ）ＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析して、サンプル中にある最も優性のＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｇ）所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｈ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成するステップと；
ｉ）合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを哺乳類発現ベクタに組み込むステップと；
ｊ）ＶＨ及びＶＬポリヌクレオチド組み込み型ベクタが培養基で発現するのを可能にするステップであって、これによって抗体を産生するステップと；
ｋ）イムノアッセイを用いることによって抗体を試験するステップであって、これによって、抗体、標的、標的分子、疾病マーカー、病原体、又は標的分子に対する病原体を同定するステップと；
を具える方法によって、同定、決定、検出又は診断される。
【００２９】
本開示の実施形態においては、免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡはＩｇＧクラスである。
【００３０】
本開示の他の実施形態においては、免疫グロブリンのｃＤＮＡは逆転写ＰＣＲによって産生される。
【００３１】
本開示の他の実施形態によると、ＩｇＧに特異的なプライマーは逆転写ＰＣＲ増幅で用いられる。
【００３２】
本開示の他の実施形態においては、免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖に対する別個の配列データは、コンピュータに実装されるアルゴリズムを決定するために取得される。
【００３３】
本開示の別の実施形態においては、哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。
【００３４】
本開示の別の実施形態によると、抗体、標的分子、疾病マーカー、病原体、又は標的分子に対する病原体は、
ａ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析するステップと；
ｂ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の存在量を決定するステップと；
を具える方法によって同定、決定、検出又は診断される。
【００３５】
別の実施形態においては、その方法は更にステップｂ）で同定された豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を含む１又はそれ以上の免疫グロブリンを調製するステップを具える。本開示の他の実施形態においては、サンプルは生物学的サンプルである。他の実施形態においては、生物学的サンプルは哺乳類由来である。更に他の実施形態においては、前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。他の実施形態においては、前記ヒトは癌患者であるか、免疫化されるか、あるいは病原体又は標的分子に感染する。他の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００３６】
［定義及び本開示の他の実施形態］
用語「免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ：Ｉｇ）」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコード化される１又はそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質のことである。免疫グロブリンは限定しないが、抗体を含む。免疫グロブリンは多数の構造形態を有してもよく、限定しないが全長型抗体、抗体フラグメント、及び別個の免疫グロブリンドメインを含む。本明細書中の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、タンパク質構造の技術分野の当業者によって確認されるような異なる構造主体として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。本明細書中で用いられるような用語「ＩｇＧ」は、認識された免疫グロブリンγ遺伝子によって実質的にコード化される抗体のクラスに属するタンパク質を意味する。
【００３７】
用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」はポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト、ネズミ又はげっ歯類の完全抗体、ならびにＦ（ａｂ’）２及びＦａｂタンパク質分解フラグメントといった抗原結合性フラグメントを含む。キメラ抗体、Ｆｖフラグメント、及び単鎖抗体等といった、遺伝子改変された未処理の抗体又はフラグメント、ならびに合成型の抗原結合性ペプチド及びポリペプチドは更に含まれる。本開示による抗体は、抗体クラスのいずれかに属する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコード化されてもよい。抗体はＩｇＧクラスの抗体に属する配列を含み、ヒトサブクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。この抗体は、ＩｇＡ（ヒトサブクラスのＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭクラスの抗体に属する配列を含む。
【００３８】
本明細書中で用いられるような用語「可変鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ ｃｈａｉｎ）」又は「可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、軽鎖（κ及びλを含む）及び重鎖の免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成する、ＶＬ（Ｖκ及びＶλを含む）、ＶＨ、ＪＬ（Ｊκ及びＪλを含む）、及びＪＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコード化される１又はそれ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。軽鎖又は重鎖の可変領域（ＶＬ及びＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と称される３の超可変領域によって割り込まれる「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は正確に規定されてきた（Ｋａｂａｔ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，９１５−９２０．；Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７−８８３；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８）。抗体のフレームワーク領域は、構成要素である軽鎖及び重鎖の結合フレームワーク領域であり、ＣＤＲを配置及び配列比較するように作用し、主に抗原への結合を担当する。
【００３９】
用語「生物学的サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」は生物学的起源の任意のサンプルのことであってもよく、組織又は体液、全血、血清又は血漿のサンプル、あるいはタンパク質、ポリペプチド、核酸、又はポリヌクレオチドといった任意の成分を含むサンプルを含んでもよい。特定の実施形態においては、生物学的サンプルは、ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマ由来といった、哺乳類由来である。他の実施形態においては、生物学的サンプルは哺乳類由来であり、哺乳類（例えばヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマ）は標的分子で免疫化されるか、癌患者であるか、あるいは特定のウイルス性、細菌性、又は原生動物の種に感染する。
【００４０】
「標的（ｔａｒｇｅｔ）」又は「標的分子（ｔａｒｇｅｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、抗体といった免疫グロブリンと反応し、それに結合する分子のことである。標的は既知又は未知であってもよく、及び／あるいは、例えば、免疫沈降、それに続く質量分光分析、Ｎ末端タンパク質配列決定などの当該技術分野で周知の方法によって同定できる。
【００４１】
用語「哺乳類（ｍａｍｍａｌ）」は、例えばヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、及びウマなどの哺乳類として分類される任意の生物のことである。実施形態においては、哺乳類はマウスである。本開示の他の実施形態においては、哺乳類はヒト又はラットである。
【００４２】
配列情報は任意のフォーマットで保存でき、ひいては本明細書中で用いられるような用語「データベース（ｄａｔａｂａｓｅ）」は、データベースファイル、ルックアップ表、又はＥｘｃｅｌのスプレッドシートといった、任意の情報の集合、特に配列情報のことである。特定の実施形態においては、データベースは、コンピュータ可読型の記憶装置といった電子工学的な形態で保存される。これはサーバ、クライアント、ハードディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、Ｐａｌｍ Ｐｉｌｏｔといった携帯情報端末、テープ、ｚｉｐディスク、コンピュータ内部のＲＯＭ（読み出し専用メモリ）、あるいはインターネット又はワールドワイドウェブといった媒体を含む。コンピュータによりアクセス可能なファイルの保存のための他の媒体は、当該技術分野の当業者にあきらかである。
【００４３】
この状況で用いられるような「コンピュータに実装されるアルゴリズム（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）」は、ＶＨ及びＶＬ鎖がある特定の生物学的サンプル中で最も豊富であることを決定するのに用いられうる任意の統計学的手段のことである。このようなコンピュータに実装されるアルゴリズムは、より大きなソフトウェアパッケージの一部あるいはスタンドアロン型のソフトウェアパッチ又はアプリケーションであってもよい。コンピュータに実装されるアルゴリズムは一般的に、ＶＨ及びＶＬ鎖の変異体の配列データを含むデータベース上で動作する。コンピュータに実装されるアルゴリズムの出力は一般的に、生物学的サンプル中にある最も優性又は豊富な配列、例えば別個のＶＨ鎖又はＶＬ鎖のリストである。
【００４４】
本開示の実施形態によると、コンピュータに実装されるアルゴリズムを介して同定される最も優性又は豊富な配列は合成され、本明細書中に記載のような発現用の発現ベクタに組み込まれる。
【００４５】
用語「（ポリ）ペプチド（（ｐｏｌｙ）ｐｅｐｔｉｄｅ）」はペプチド結合を介して連結される、複数、すなわち２又はそれ以上のアミノ酸の１又はそれ以上の鎖からなる分子と関連する。
【００４６】
用語「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、（ポリ）ペプチドの少なくとも一部分が、１又は複数の（ポリ）ペプチド鎖内及び又はその間に二次、三次、又は四次構造を形成することによって規定された三次元配列を有するか、あるいはそれを取得できる（ポリ）ペプチドのことである。この定義は天然型又は少なくとも部分的に人工型のタンパク質といったタンパク質を含み、同様に、すべてのタンパク質のフラグメント又はドメインを、これらのフラグメント又はドメインが上述したような規定された三次元配列を取得できる限りにおいては含む。１の鎖からなる（ポリ）ペプチド／タンパク質の例は単鎖Ｆｖ抗体フラグメントであり、２以上の鎖からなる（ポリ）ペプチド／タンパク質の例はＦａｂ抗体フラグメントである。
【００４７】
特定の実施形態においては、本開示はＩｇＧクラスの免疫グロブリンといった、免疫グロブリンのスーパーファミリの、好適には免疫グロブリンのメンバ又は誘導体の少なくとも一部を含む（ポリ）ペプチドのライブラリを提供する。いくつかの実施形態はヒト抗体のライブラリを提供する。他の実施形態は哺乳類又はげっ歯類の抗体のライブラリを提供する。可変重鎖領域及び可変軽鎖領域は好適には、フレームワーク領域（ＦＲ）１、２、３、及び４ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３を含む。
【００４８】
最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖をコード化するこれらの人工遺伝子は次いで、例えば、遺伝子全体の合成によって、あるいは合成型の遺伝子サブユニットによって構築される。これらの遺伝子サブユニットは（ポリ）ペプチドレベルでの構造的な下位要素に、例えば１又はそれ以上のフレームワーク領域及び／又は１又はそれ以上のフレームワーク領域に対応する。ＤＮＡレベルでは、これらの遺伝子サブユニットは各々の下位要素の始点及び終点での切断部位によって規定してもよい。特定の実施形態においては、米国特許第７，２６４，９６３号に記載のように、下位要素はＨｕＣＡＬ（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ）と互換性がある。
【００４９】
このＤＮＡ分子の集合は次いで、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、又はＦａｂフラグメントといった、抗体又は抗体フラグメントのライブラリを産生するのに用いることができ、新しい標的の抗原に対する特異性の供給源として用いてもよい。更に、抗体の親和性は事前に構築されたライブラリカセット及び周知の成熟化手順を用いて最適化できる。
【００５０】
本開示は標的に結合する１又はそれ以上の抗体又は抗体フラグメントをコード化する１又はそれ以上の遺伝子を同定するための方法を提供し、抗体又は抗体フラグメントを発現するステップと、所定の標的分子に結合する１又はそれ以上の抗体又は抗体フラグメントを単離するためにそれらをスクリーニングするステップとを具える。
【００５１】
遺伝子発現：用語「遺伝子発現（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は生体内又は生体外プロセスのことであり、これによって遺伝子の情報はｍＲＮＡに転写され、次いでタンパク質／（ポリ）ペプチドに翻訳される。従って、遺伝子発現という用語は、細胞内部に生じるプロセスのことであり、これによって遺伝子の情報はｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される。発現という用語は更に、翻訳後の修飾及び輸送の総ての事象を含み、これは（ポリ）ペプチドが機能的であるために必要である。相同遺伝子の分析：２又はそれ以上の遺伝子の対応するアミノ酸配列は、総ての位置での同一又は類似のアミノ酸残基間で相関性を最大化する方法で、相互に配列比較される。これらの配列比較された配列は、同一及び／又は類似の残基の合計の割合が規定されたしきい値を超える場合に、相同的であると称される。
【００５２】
用語「ベクタ（ｖｅｃｔｏｒ）」は、異なる遺伝子環境間で、動作可能に結合された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子のことである。好適なベクタはそれらが結合される核酸の自律増殖及び／又は発現を可能にするベクタである。動作可能に結合された遺伝子の発現に向かわせることが可能なベクタは、本明細書中で「発現ベクタ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」と称される。ベクタの選択は所定のベクタの特異的な要求及び機能的特性に依存する。
【００５３】
本開示の一実施形態においては、ベクタは原核生物のレプリコン、すなわち、細菌性宿主細胞といった、それとともに形質転換される原核生物の宿主細胞中の染色体的に余分な組換えＤＮＡ分子の自律増殖及び維持に向かう能力を有するＤＮＡ配列を含む。このようなレプリコンは当該技術分野で公知である。加えて、原核生物のレプリコンを含むそれらの実施形態は更に、発現がそれとともに形質転換される細菌性宿主に対する薬物耐性といった選択的な利点を提供する遺伝子を含む。
【００５４】
原核生物のレプリコンを含むベクタは更に、それとともに形質転換される、大腸菌といった細菌性宿主細胞中で、ＶＨ及び／又はＶＬでコード化する相同体の発現（転写及び翻訳）に向かわせうる原核生物のプロモーターを含む。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼの結合及び生じさせるべき転写を可能にする、ＤＮＡ配列によって形成される発現制御要素である。細菌性宿主で互換性のあるプロモータ配列は一般的には、ＤＮＡセグメントの挿入に都合の良い制限部位を含むプラスミドベクタで提供される。このようなベクタプラスミドの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、ｐＰＬ、ならびにｐＫＫ２２３を含み、商業上利用可能である。このようなベクタは「原核生物の発現ベクタ（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」と称される。
【００５５】
それらを含む好適な真核生物の発現ベクタは、脊椎動物細胞と互換性がある。用語「真核生物の発現ベクタ（ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、真核生物の宿主細胞中の核酸の発現に有用な任意の発現ベクタのことである。本開示の特定の実施形態においては、真核生物のベクタは哺乳類発現ベクタである。用語「哺乳類発現ベクタ（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は哺乳類宿主細胞中の核酸の発現に有用な任意の発現ベクタのことである。
【００５６】
真核生物の発現ベクタは当該技術分野で公知であり、更に商業上利用可能である。一般的には、このようなベクタは所望のＤＮＡ相同体の挿入に都合の良い制限部位を含んで提供される。このようなベクタの例は、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１／ＰＭＬ２ｄ、ならびにｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ寄託番号３１２５５）を含む。
【００５７】
本開示の別の実施形態においては、真核生物の発現ベクタは真核細胞に有効な選択マーカ、好適には薬物耐性選択マーカを含む。好適な薬物耐性マーカはネオマイシン耐性を生じさせる遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ネオ）遺伝子である。Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，１：３２７−３４１（１９８２）。
【００５８】
ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡ相同体の遺伝子を発現するためのレトロウイルス性の発現ベクタは更に予期される。用語「レトロウイルス発現ベクタ（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、レトロウイルスゲノムの末端反復配列（ＬＴＲ）領域から得られるプロモータ配列を含むＤＮＡ分子のことである。
【００５９】
１又はそれ以上の、ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡ構造は、個別に、あるいは組合せでのいずれかで、ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡ相同体の増幅及び／又は発現を提供するために好適な宿主に導入される。ＶＨ及びＶＬのポリペプチドが異なる生物で発現する場合、各ポリペプチドは単離され、次いで抗体又はそのフラグメントを形成するために好適な培地に混合される。ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡ相同体を含有する構成が導入された細胞性宿主は、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）」された、あるいは「形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）」であると本明細書中で称される。
【００６０】
宿主細胞は原核生物又は真核生物のもののいずれかにできる。細菌性細胞は好適には原核生物の宿主細胞であり、一般的には例えば、メリーランド州ベセズダのＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手可能な、大腸菌株ＤＨ５といった大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株である。好適な真核生物の宿主細胞は酵母菌、ならびにネズミ及びげっ歯類を含む哺乳類細胞、好適にはマウス、ラット、サル、又はヒトの細胞株由来のものといった脊椎動物細胞を含む。
【００６１】
組換えＤＮＡ分子を有する好適な宿主細胞の形質転換は、用いられるベクタの型に一般的に依存する方法によって実現される。原核生物の宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．６９，Ｐ．２１１０（１９７２）；及びＭａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；を参照。ｒＤＮＡを含むレトロウイルスベクタを有する脊椎動物細胞の形質転換に関しては、例えばＳｏｒｇｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：１７３０−１７３７（１９８４）；Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌ．，５２：４５６（１９７３）；及びＷｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７６，Ｐ．１３７３−１３７６（１９７９）；を参照。
【００６２】
ＶＨ及び／又はＶＬのポリペプチドの発現用のスクリーニング：正常に形質転換された細胞、すなわち、ベクタに動作可能に結合される、ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡ相同体を含む細胞は、受容体のリガンドへの結合、又は、受容体、好適にはその活性部位をコード化するポリヌクレオチドの存在を検出する任意の好適な公知の技術によって同定できる。一実施形態においては、スクリーニングアッセイは、受容体によるリガンドの結合が検出可能なシグナルを、直接的にか、あるいは間接的にかのいずれかで産生するように行われる。このようなシグナルは例えば、複合体の産生、触媒反応産物の形成、及びエネルギの放出又は取り込み等を含む。対象の組換えＤＮＡとともに形質転換に供される集団からの細胞はクローニングされて、例えばモノクローナルなコロニーを産生する。これらのコロニーを形成する細胞は収集及び溶解され、そのＤＮＡ成分は、例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５）；又は、Ｂｅｒｅｎｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：２０８（１９８５）；に記載のような当該技術分野に周知の方法を用いて、組換えＤＮＡの存在について試験される。
【００６３】
ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡの存在について直接的にアッセイする他に、正常な形質転換は更に、産生されるＶＨ及び／又はＶＬのポリペプチドが事前選択されたエピトープを含む場合に特に、公知の免疫学的方法によって確認できる。形質変換されることとなる細胞のサンプルは、例えばエピトープに対する抗体を用いて事前選択されたエピトープの存在についてアッセイされる。
【００６４】
本明細書中で用いられるような「イムノアッセイ（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」は、抗原と、抗体のような免疫グロブリンとの間の特異的な結合反応の任意の測定のことである。一般的には、抗原は（ポリ）ペプチド又はタンパク質であるが、核酸、脂質、脂肪酸、又は有機小分子といったその他の物質が抗原として作用してもよい。当業者はイムノアッセイが抗原と免疫グロブリンとの間の特異的な結合を測定するのに最適であることを容易に理解及び決定するであろう。
【００６５】
本発明の状況で用いられるような用語「代表的なサンプル（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ）」は、前記サンプル中にある免疫グロブリンの可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖の概要を得るために、配列決定する必要のある、サンプルの免疫グロブリンの可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖の代表的なサンプルに関する。このような概要を得るのに要求される配列の総数は各サンプルの性質に依存するが、少なくとも大きくすべきであるので、合理的な概算は免疫グロブリンのどの可変軽（ＶＬ）鎖と、どの可変重（ＶＨ）鎖とが前記サンプル中で最も豊富であるかでなされる。前記サンプル中にある免疫グロブリンの可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖のうち少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が配列決定される。更に、好適には前記サンプル中にある免疫グロブリンの可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖のうち、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、あるいは少なくとも１００，０００が配列決定される。
【００６６】
本発明の状況で用いられるような用語「最も豊富な（ｍｏｓｔ ａｂｕｎｄａｎｔ）」はサンプルが配列決定される場合に最も頻繁に同定される可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖のことである。最も豊富な可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖は一般的にはあるサンプル中で最も大きい数であるものである。
【００６７】
特定の実施形態においては、本発明は、サンプル中の抗体、標的、又は病原体の同定のための方法を提供し、
ａ）サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得するステップであって、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｂ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを配列決定するステップであって、これによって、サンプル中にある免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｃ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｄ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成し、哺乳類発現ベクタを用いて前記ＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗体を産生するステップと；
ｅ）抗体を試験するステップであって、これによって抗体又は標的を同定するステップと；
を具える。好適には、前記サンプルは生物学的サンプルである。好適には、前記生物学的サンプルは哺乳類由来である。好適には、前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。好適には、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。サンプル中で前記免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡは、サンプルからＢ細胞を収集又は単離することによって取得される。好適には、前記免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。好適には、サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡから取得されるｃＤＮＡは逆転写ＰＣＲによって産生される。好適には、ＩｇＧに特異的なプライマーは、免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡからのｃＤＮＡの産生に用いられる。好適には、サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖はサンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析することによって決定される。最も好適には、本発明の方法はいずれのクローニングステップも要求しない。特に、コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いてサンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖の決定まで行われる総ての方法ステップは、いずれのクローニングステップも要求しない。好適には、ステップ（ｄ）の最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドは哺乳類発現ベクタに組み込まれる。好適には、前記ステップで産生された抗体は培養基に放出される。好適には、本方法のステップ（ｅ）の抗体の試験は、イムノアッセイを用いることによって行われる。好適には、本方法のステップ（ｅ）においては、抗体は同定され、特定の標的分子又は組織に結合する。好適には、本方法のステップ（ｅ）においては、標的分子は同定され、特定の抗体に結合する。
【００６８】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）免疫化され、病原体又は標的分子に感染し、癌に罹患する、哺乳類由来の生物学的サンプルを提供するステップと
ｂ）生物学的サンプルからＢ細胞を収集するステップと；
ｃ）収集されたＢ細胞からｍＲＮＡを取得するステップと；
ｄ）ｍＲＮＡによってコード化された免疫グロブリンのｃＤＮＡを産生するステップであって、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｅ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを配列決定するステップであって、これによってサンプル中にある免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｆ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｈ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成するステップと；
ｉ）合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを哺乳類発現ベクタに組み込むステップと；
ｊ）ＶＨ及びＶＬポリヌクレオチド組み込み型ベクタがＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを発現するのを可能にするステップであって、これによって抗体を産生するステップと；
ｋ）イムノアッセイを用いることによって抗体を試験するステップであって、これによって抗体、標的、又は病原体を同定するステップと；
を具える、抗体、標的、又は病原体の同定のための方法を提供する。好適には、前記サンプルは生物学的サンプルである。好適には、前記生物学的サンプルは哺乳類由来である。好適には、前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。好適には、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。好適には、前記免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００６９】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析するステップと；
ｂ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の存在量を決定するステップと；
を具えるサンプル中の抗体、標的、又は病原体の同定のための方法を提供する。好適には、前記方法は更に、ステップｂ）で同定された豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を含む１又はそれ以上の免疫グロブリンを調製するステップを具える。好適には、前記サンプルは生物学的サンプルである。好適には、前記生物学的サンプルは哺乳類由来である。好適には、前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。好適には、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。好適には、前記免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００７０】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得するステップであって、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｂ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを直接的に配列決定するステップであって、
ｃ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｄ）サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖をコード化するポリヌクレオチドを合成し、発現ベクタを用いて前記ＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗体を産生するステップと；
ｅ）抗体を試験するステップであって、これによって抗体又は標的を同定するステップと；
を具える、サンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供する。
【００７１】
上に列挙した方法のステップ（ｂ）の状況で用いられるような用語「直接的に配列決定するステップ（ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」は、ステップ（ａ）で取得されるｃＤＮＡが、任意の更なる分子生物学的な修飾ステップなしに、配列決定される状況のことである。具体的には、クローニングステップが要求されない。
【００７２】
好適な実施形態においては、サンプルは生物学的サンプルである。更に好適な実施形態においては、生物学的サンプルは哺乳類由来である。前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマであってもよい。前記生物学的サンプルは更にヒト由来であってもよく、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。
【００７３】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ａ）での免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡは、サンプルからＢ細胞を収集又は単離することによって取得される。免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００７４】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ａ）での前記免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡは逆転写ＰＣＲによって産生される。更に好適な実施形態においては、ＩｇＧに特異的なプライマーは前記逆転写ＰＣＲで用いられる。
【００７５】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｃ）でのサンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖は、サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析することによって決定される。
【００７６】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ａ）ないし（ｃ）はいずれのクローニングステップも要求しない。
【００７７】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｄ）で合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドは、発現ベクタに組み込まれる。更に好適には、前記発現ベクタは哺乳類発現ベクタである。
【００７８】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｄ）で産生された抗体は、培養基に放出される。
【００７９】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｅ）での抗体の試験はイムノアッセイを用いることによって実行される。
【００８０】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｅ）で、抗体は同定され、特定の標的分子又は組織に結合する。好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｅ）で、標的分子は同定され、特定の抗体に結合する。
【００８１】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）免疫化され、病原体又は標的分子に感染し、癌に罹患する、哺乳類由来の生物学的サンプルを提供するステップと；
ｂ）生物学的サンプルからＢ細胞を収集するステップと；
ｃ）収集されたＢ細胞からｍＲＮＡを取得するステップと；
ｄ）ｍＲＮＡによってコード化された免疫グロブリンのｃＤＮＡを産生するステップであって、ｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｅ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを直接的に配列決定するステップであって、これによってサンプル中にある免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｆ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｈ）サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖をコード化するポリヌクレオチドを合成するステップと；
ｉ） 合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを哺乳類発現ベクタに組み込むステップと；
ｊ）ＶＨ及びＶＬポリヌクレオチド組み込み型ベクタがＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを発現するのを可能にするステップであって、これによって抗体を産生するステップと；
ｋ）イムノアッセイを用いることによって抗体を試験するステップであって、抗体、標的、又は病原体を同定するステップと；
を具える、抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供する。好適な実施形態においては、前記サンプルは生物学的サンプルである。更に好適な実施形態においては、前記生物学的サンプルは哺乳類由来である。前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマにできる。更に好適な実施形態においては、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。更に好適な実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００８２】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析するステップと；
ｂ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の存在量を決定するステップと；
を具える、サンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供する。更なる実施形態においては、前記方法は更に、ステップｂ）で同定された豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を含む１又はそれ以上の免疫グロブリンを調製するステップを具える。好適な実施形態においては、前記サンプルは生物学的サンプルである。更に好適な実施形態においては、前記生物学的サンプルは哺乳類由来である。前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマにできる。更に好適な実施形態においては、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。更に好適な実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧクラスである．
【００８３】
本開示は以下の実施例によって更に記載されるが、いかなる方法でも開示の範囲を限定しない。
【実施例】
【００８４】
［免疫化／感染した患者からのＢ細胞の収集］
Ｂ細胞は様々な異なる方法で、免疫化あるいは感染した患者から単離でき、このような技術は当業者に周知である。多くのこのような技術において、静止Ｂリンパ球（Ｂ細胞）は、例えば磁気マイクロビーズを介して、抗ＣＤ４３及び抗Ｍａｃ−１／ＣＤ１１ｂのモノクローナル抗体とともに負の選択を用いて、脾臓から単離される。このストラテジは脾細胞の混合集団から非Ｂ細胞を枯渇させ、静止脾臓Ｂ細胞を除いて、最も成熟した白血球がＣＤ４３を発現するという事実に依拠する（実際に、ＣＤ４３の発現は、顆粒球、単球、マクロファージ、血小板、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、胸腺細胞、ならびに末梢性のＣＤ８陽性Ｔ細胞及びほとんどのＣＤ４陽性Ｔ細胞に加えて、未成熟のＢ細胞、形質細胞、及びいくつかの成熟Ｂ１細胞に示されていた）。抗Ｍａｃ−１／ＣＤ１１ｂマイクロビーズは負の選択に含まれて、骨髄系細胞の除去を改善する。Ｂ細胞の単離は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ自動式磁気ビーズセルソータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて自動化してもよい。Ｂ２２０＋細胞の蛍光分析により評価されるように、このような単離は常に、脾臓につき約４×１０ｅ７の、９５％より高い純度のＢ細胞を産生する。更に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｓ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ，Ｗｅｉｃｈｅｌ Ｗ，及びＲａｄｂｒｕｃｈ Ａ．（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１１（２），２３１−２３８参照。
【００８５】
［ｍＲＮＡ抽出及び逆転写］
免疫グロブリン、好適にはＩｇＧ型の免疫グロブリンは、ｍＲＮＡの抽出、次いで逆転写を介してＢ細胞から選択的に増幅できる。
【００８６】
Ｂ細胞といった真核細胞からのｍＲＮＡ抽出は公知の技術的手順である。多数のプロトコルが存在し、商用のキットが利用可能である。ＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（米国ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ社）又は様々なＲＮｅａｓｙ及びＯｌｉｇｏｔｅｘ ＤｉｒｅｃｔｍＲＮＡキット（双方が、ドイツ連邦共和国ヒルデンのＱｉａｇｅｎ社）など。これらの技術の多くは、例えばオリゴチミジンセルロースといったオリゴチミジン基質に対するアフィニティ精製を介して真核生物ｍＲＮＡのポリＡ尾部を利用する。
【００８７】
免疫グロブリンは特異的なプライマーを用いた逆転写、その後の従来のＰＣＲを介して、単離したｍＲＮＡから選択的に増幅できる。特異的なプライマーは、免疫グロブリンに対し、あるいは、ある免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥのいずれかに対し、あるいは、あるいは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４といった、ある免疫グロブリンサブクラスに対してさえも特異的にできる。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖遺伝子を増幅するために用いられうるプライマーは例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ １９９７；３０：２１−４４、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ１９９４；４７：４９３−６、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １９９０；４３：８８８−９０、又はＭｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．２００２ Ａｐｒｉｌ；５５（２）：９８−１０１に開示される。
【００８８】
［ｃＤＮＡのゲノム配列決定］
免疫グロブリンの全配列が配列決定される。Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）といったゲノム全体を配列決定できる様々な企業が存在する。そのＴｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（登録商標）技術をもって、Ｈｅｌｉｃｏｓ社は高速かつ高効率でＤＮＡ又はＲＮＡの単一分子を直接的に配列決定することを可能にする。同様の配列の努力を行うことが可能な他の企業は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ；Ｓｏｌｅｘａシステム）及びＲｏｃｈｅ社（スイス連邦バーゼル州；４５４システム）を含む。クローニングステップは配列決定の前に要求されない。
【００８９】
免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列が別個に決定される。１０３より多いＶＨ及びＶＬ鎖の別個の配列が決定され、１０４より多い別個の配列であることが好ましく、１０５より多い別個の配列であることが更に好ましく、１０６より多い別個の配列であることが更に好ましい。
【００９０】
決定された配列は任意のデータベースシステムに保存してもよい。このようなデータベースシステムは、用いられる配列決定システムの一部であってもよい。代替的に、配列情報はＥｘｃｅｌのスプレッドシートの形態、あるいはタブ区切りフォーマットといった他のフォーマットで保存してもよい。
【００９１】
［事前決定されたアルゴリズムによる優性／豊富なＶＨ及びＶＬ配列の決定］
配列決定された免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の存在量は、様々なアルゴリズムによって決定できる。ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は好適には別個に分析される。
【００９２】
第１のステップは同一の免疫グロブリンから得られるＶＨ及びＶＬ鎖の配列を同定することであってもよい。同一の免疫グロブリンから得られる配列は、必ずしも完全に同一とは限らない。それらの配列が、各配列について全く同じヌクレオチドで開始又は終了しないために、あるいは、ヌクレオチドが、このような大きな範囲の配列決定配列プロジェクト中に生じうる事象である、決定プロセスで誤読されるために、このようなわずかな差異は生じうる。特定のヌクレオチド、特に特定のヌクレオチド配列が他のもの（例えば、ＧＣリッチなヌクレオチド伸長）よりも誤読を更に起こしやすいことは周知である。生体情報学的なツール及びアルゴリズムは、その多くは各配列決定システムの一部であるが、このような場合を決定でき、あるいは少なくとも実例を示唆でき、そこではこのようなエラーが生じうる。
【００９３】
ＶＨ及びＶＬ鎖の存在量は様々な統計検定によって決定してもよい。最も容易には、別個のＶＨ及びＶＬ鎖が単に計数される。より複雑な統計検定は様々な他のパラメータを考慮する。限定されない例によると、以下の統計検定及び文献はこのような又は同様の分析を為す多数のアプローチの実施例として誘導できる：Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ（例えば、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５９（２００３）：４７６−４８６参照）、ＤＡＤＡ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃＤＮＡ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ；例えば、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００２，３：７参照）、線形モデリング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，１９９９，４：４１−５２）、及び様々なクラスタリング手法（ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００６，７：３９７，Ｆｏｕｒｔｈ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ（ＩＣＤＭ’０４），ｐｐ．４０３−４０６）。
【００９４】
［ＶＨ及びＶＬの合成］
最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖の遺伝子は従来の方法によって合成される。このような合成は標準的な技術であり、例えば数例を挙げると、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ社（ドイツ共和国レーゲンスブルク）、Ｇｅｎｅａｒｔ社（ドイツ共和国レーゲンスブルク）、又はＳｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ドイツ共和国プッフハイム）といった多くの企業が、それぞれのサービスを提供している。理想的には、各遺伝子が既に、好適なベクタにクローニングするための好適な制限部位を保有する。
【００９５】
［優性のＶＨ及びＶＬ鎖のクローニング及び発現］
ＶＨ及びＶＬ鎖の合成された遺伝子は、各発現ベクタにクローニングされる。そうするために、各発現ベクタは合成された遺伝子と互換性のある好適な制限酵素で消化される。上記のように、合成された遺伝子は好適には既にベクタと互換性がある、すなわち、各制限部位は既に合成された遺伝子中に存在する。例示的なベクタはｐｃＤＮＡ、ｐＭＯＲＰＨ、ｐＵＣ、ｐＢＲ、ｐＢＡＤ、及び他のベクタを含む。ベクタによる発現は、合成されたＶＨ及びＶＬ鎖を含む全長免疫グロブリンの産生を引き起こし、更に後のステップで特徴づけられるか、あるいは修飾できる。
【００９６】
［発現されたポリペプチドをスクリーニングするためのイムノアッセイ及びＶＨ及びＶＬの組合せの選択］
ｐｃＤＮＡ、ｐＭＯＲＰＨ、ｐＵＣ、ｐＢＲ、ｐＢＡＤ、及び他のベクタといった各ベクタによる発現後に産生される全長免疫グロブリンは、様々な型のアッセイで用いられうる。例えば、イムノアッセイを行ってもよい。
【００９７】
例えば、免疫グロブリンの、抗原といった、ある標的分子への結合をアッセイしてもよい。これはＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、又はその他の等価的な手段といった標準的な検査法によって取得してもよい。このような実験はある標的分子に結合する免疫グロブリンの同定を引き起こしうる。このような実験は更に、より定量的な方法で行ってもよい、すなわち、各免疫グロブリンがある標的分子に結合するか否かを決定するだけではなく、そのような相互作用がどのくらい強く生じるかを決定する。これは免疫グロブリンの所定の標的分子に対する結合親和性、解離定数、又はその他の等価パラメータの決定を介して得てもよい。代表的な技術は、表面プラズモン共鳴法、溶解平衡滴定、カンチレバー、聴覚バイオセンサ、及び当該技術分野に周知の他の方法を含む。
【００９８】
所定の免疫グロブリンが結合する標的分子を同定することは更に可能である。そうするために、ある免疫グロブリンが選択され、免疫グロブリンの混合物の少なくとも１の標的分子への結合を可能にする条件下で、結合可能性のあるタンパク質の混合物に供される。代表的な結合条件は、バッファ組成及びストリンジェンシといった好適なパラメータの選択によって調整してもよい。
【００９９】
［標的／抗体の同定］
所定の標的分子に結合する免疫グロブリンの同定、又は所定の免疫グロブリンに結合する標的分子の同定は、任意の周知の方法論によって実現できる。多くのこのような方法は当業者に周知であり、例示的な文献として以下のものが提供される：Ｖａｌｌｅ ＲＰ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．２００３ Ｍａｒ；６（２）：１９７−２０３、Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ＢＬ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００７ Ａｐｒ；４（２）：１７５−８６及びＡｎｄｅｒｓｏｎ ＫＳ Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００５ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；４（４）：１１２３−３３。
【０１００】
説明、特定の実施例、及びデータは例示的な実施形態を示すが、例示のために与えられ、開示を限定することを意図しないことは理解すべきである。本開示にある様々な変形及び変更は、本明細書中に含まれる考察、開示及びデータから当業者に明らかになり、従って、本開示の一部と見なされる。
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物学的サンプル中の免疫グロブリンの配列データを分析することによって、及び、前記生物学的サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定することによって、抗体、標的分子、又は病原体を同定するための方法に関する。それに用いられる材料も更に提供される。
【背景技術】
【０００２】
抗体又は標的分子を同定するための従来の方法は、活性化させたヒトＢ細胞から抗体を単離する困難なプロセスを含む。例えば、免疫化した、あるいは癌患者のＢ細胞からの完全ヒト抗体の単離は、完全ヒト抗体に対する有効な経路と見なされる。いくつかの企業はヒトから単一のＢ細胞を単離するための商業上のサービスを提供する。これらのＢ細胞は不死化されるか、あるいは単一細胞の免疫グロブリンの遺伝情報が回収されるかである。これらの方法は、困難かつ高価な高処理技術を含み、細胞ごとに遺伝情報を単離し、数千の細胞を不死化し、標的組織でそれらの各出力をスクリーニングするための技術を含む。
【０００３】
近年、いくつかの企業が全ゲノム配列決定サービス、あるいは各タスクを実現するために用いることができる機械を提供している。これはＲｏｃｈｅ社の４５４システム、Ｉｌｌｕｍｉｎａｓ社のＳｏｌｅｘａシステム、及びＨｅｌｉｃｏ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＨｅｌｉｓｃｏｐｅシステムを含む。例えば、Ｈｅｌｉｃｏ社のシステムは、標的配列の定量的分布を更に維持することによって、単一機械で２４時間内に２×１０９の塩基を配列決定できる。
【０００４】
米国特許第７，２８８，２４９号は、２又はそれ以上の別個の細胞集団の表面に特異的に発現される抗原を同定するための方法を開示する。免疫化はＢ細胞でトリガされ、増殖（クローン増殖）するために、及び対応する抗体を分泌するために、免疫原に結合するＶＨ−ＶＬの組合せを産生する。しかしながら、米国特許第７，２８８，２４９号によるプロセスは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のクローン化を含み（ＶＨ及びＶＬ遺伝子はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個にクローン化される）、ＶＨ及びＶＬ遺伝子はファージライブラリ中でランダムに組換えられ（すなわち、最も豊富なＶＨ及びＶＬ遺伝子の選択がない）、その後、Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）；に記載のように抗原結合クローンについて検索される。抗体の可変型遺伝子セグメント（ＶＨ及びＶＬセグメントを含む）をコード化した核酸は、対象の細胞から回収されて、増幅される。再配列されたＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合においては、所望のＤＮＡがリンパ球からゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離することによって取得され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が後に続き、プライマーが再配列されたＶＨ及びＶＬ遺伝子の５’及び３’末端と合致する。有用な抗体を見つけるために、未処理の抗体ファージライブラリが実際の癌細胞に対してスクリーニングされる。
【０００５】
米国特許第６，８９７，０２８号は、タンパク質がリガンドに結合する分子標的の同定方法について記載し、ペプチド又はタンパク質ライブラリに対するリガンドをスクリーニングし、ここでペプチド又はライブラリのタンパク質メンバは、細胞から得られるｃＤＮＡライブラリの発現産物、及びその発現産物のフラグメントから選択される。このプロセスは更に、ライブラリから分離されたメンバをコード化する核酸配列を決定するステップと、これらの核酸配列をペプチド配列に翻訳するステップと、タンパク質を同定するステップとを含む。
【０００６】
米国特許出願公開第２００６０１４１５３２号明細書（出願番号１１／２８６９１７）は、Ｉｗａｓａｋｉら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：２８７４−２８８１，１９９４；に開示されるように、抗イディオタイプの抗体の特定のＶＨ又はＶＬ領域のアミノ酸配列を決定するためのプロトコルを用いることによって、免疫原性ペプチドを同定及び設計するための方法を開示する。抗原のアミノ酸は標準的なアミノ酸分析技術によって、あるいは化学的配列決定によって決定され、抗イディオタイプの抗体のＶＨ及び／又はＶＬ領域のアミノ酸配列は、当該技術分野で周知の技術による、各領域をコード化するゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを配列決定することによって決定される。
【０００７】
国際公開第２００５／０９４１５９号は、不死化リンパ球からの結合ペプチドの単離と、健常組織ではない腫瘍組織に選択的に結合する、これらの結合ペプチド、通常はＩｇＭ１免疫グロブリンの試験とについて記載する。結合ペプチドは腫瘍の増殖を阻害できる。
【０００８】
国際公開第０３／０５２４１６号は、Ｂ細胞からの候補のＶＨ及びＶＬ配列の単離及び配列決定のためのアプローチについて記載する。前記候補のＶＨ及びＶＬ配列によってコード化された免疫グロブリンは感染症の治療に有用な可能性がある。国際公開第０３／０５２４１６号に記載された方法論、ならびに先行技術で開示された総ての他の方法は、配列決定前の核酸の操作を要求する。特に、時間のかかるクローニングステップが必須であり、本発明に開示のような範囲の方法を実行することを不可能にしている。
【０００９】
国際公開第０３／０５２４１６号の場合にあるように、上述の総ての方法は、標的をコード化する核酸を単離する困難なプロセス、及び／又は超高処理によるゲノム配列決定を含む。しかしながら、ＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析することによって、及び最も優性のＶＨ及びＶＬを決定することによって標的分子を同定する、困難が少なく、対費用効果の高い、及び／又はより簡単な方法は有用である。
【発明の概要】
【００１０】
本開示の実施形態は一般的に、生物学的サンプル中にある免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の配列データを分析することによって、抗体、標的分子、又は病原体を同定する方法に関する。この実施形態の一部は、所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定することと、ベクタにおける発現用に最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成することと、発現した抗体を試験して標的分子を同定することとに関する。他の実施形態は、所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定することと、ベクタにおける発現用に最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成することと、特定の標的分子又は標的組織に結合する発現した抗体のどちらかを試験することとに関する。特定の実施形態においては、サンプルは事前選択又は事前濃縮されない生物学的サンプルである。
【００１１】
一実施形態は、サンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、
ａ）サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得するステップであって、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｂ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の各々を配列決定するステップであって、これによってサンプル中にある免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｃ）所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｄ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成し、哺乳類発現ベクタを用いて抗体を産生するステップと；
ｅ）抗体を試験するステップであって、これによって特定の標的分子又は組織に結合する抗体を同定するか、あるいは特定の抗体に結合する標的分子を同定するステップと；
を具える。
【００１２】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、
ａ）ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマといった、免疫化されるか、あるいは病原体又は標的分子に感染する哺乳類から、生物学的サンプルを提供するステップと；
ｂ）生物学的サンプルからＢ細胞を収集するステップと；
ｃ）収集されたＢ細胞中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡ（例えば、ＩｇＧ）を取得するステップと；
ｄ）免疫グロブリンのｃＤＮＡを産生するステップであって（例えば、逆転写ＰＣＲによって、及び増幅用のＩｇＧに特異的なプライマーを用いることによって）、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｅ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の各々を配列決定するステップであって（例えば、ＶＨ及びＶＬの別個の配列を取得することによって）、これによってサンプル中にある免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｆ）ＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析して、サンプル中にある最も優性のＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｇ）所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｈ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成するステップと；
ｉ）合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを、哺乳類発現ベクタに組み込むステップと；
ｊ）ＶＨ及びＶＬポリヌクレオチド組み込み型ベクタが培養基中で発現するのを可能にするステップであって、これによって抗体又はそのフラグメントを産生するステップと；
ｋ）イムノアッセイを用いることによって抗体を試験するステップであって、これによって抗体、標的分子、又は標的分子に対する病原体を同定するステップと；
を具える。特定の実施形態においては、哺乳類は罹患哺乳類である。
【００１３】
特定の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥの免疫グロブリンクラスのうちの少なくとも１つ、あるいはそのフラグメントである。いくつかの実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００１４】
特定の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の免疫グロブリンＧのサブクラスのいずれか１つである。
【００１５】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、免疫グロブリンのｃＤＮＡは逆転写ＰＣＲによって産生される。
【００１６】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、ＩｇＧに特異的なプライマーは逆転写ＰＣＲ増幅で用いられる。
【００１７】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、プライマーはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４の免疫グロブリンＧのサブクラスのいずれか１つに対して特異的な逆転写ＰＣＲ増幅で用いられる。
【００１８】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖に対する別個の配列データが取得される。ＶＨ及びＶＬ鎖の配列データはデータベースに保存され、最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖がコンピュータに実装されるアルゴリズムを介して決定される。
【００１９】
別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。
【００２０】
別の実施形態はサンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、
ａ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析するステップと；
ｂ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の存在量を決定するステップと；
を具える。方法は更に、ステップｂ）で同定された豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を含む１又はそれ以上の免疫グロブリンを調製するステップを具える。
【００２１】
特定の実施形態においては、ヒトは癌患者であるか、あるいは免疫化されるか、あるいは病原体又は標的分子に感染している。
【００２２】
更に、本開示の別の実施形態は抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供し、哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、生物学的サンプル中にある可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の免疫グロブリンの配列データを分析することによって、抗体、標的分子、又は病原体を同定するための方法、ならびに本明細書中に開示された方法で用いられる材料を提供する。本開示は更に、所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定し、ベクタにおける発現用に最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成し、発現した抗体を試験して標的分子を同定する方法に関する。
【００２４】
一態様によると、本開示は「免疫ゲノム（ｉｍｍｕｎｏｎｏｍｅ）」の配列決定によって、抗体、標的分子、又は病原体を同定又は検出するため方法を提供し、それは哺乳類サンプル（ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマなど）中で免疫グロブリン（ＩｇＧなど）をコード化する完全なｍＲＮＡ（あるいは、逆転写ＰＣＲ後のｃＤＮＡ）のことであり、哺乳類は標的分子で免疫化されるか、癌患者であるか、あるいは特定のウイルス性、細菌性、又は原生動物の種に感染する。特定の実施形態においては、哺乳類（例えば、ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマ）はワクチンといった標的分子で免疫化される。他の実施形態においては、前記哺乳類は癌患者である。
【００２５】
別の態様によると、Ｂ細胞は免疫化された哺乳類又は癌患者から単離され、ｍＲＮＡは各サンプルから抽出され、ｍＲＮＡによってコード化された免疫グロブリンは逆転写及び配列決定される。いくつかの実施形態においては、少なくとも１０４のＢ細胞が免疫化された哺乳類又は癌患者から単離され、他の実施形態においては、少なくとも１０５のＢ細胞、１０６のＢ細胞、又は更に１０７のＢ細胞が免疫化された哺乳類又は癌患者から単離される。免疫グロブリンの可変鎖をコード化する遺伝子は一般的には、約１０００ヌクレオチドの長さを有する。従って、配列情報の約２×１０９の塩基の配列決定は、少なくとも２倍の免疫ゲノム全体を包含する。優性のＣＤＲ配列ならびにその（高頻度）変異が同定される。これらの配列は特異的であるか、あるいは免疫刺激に対し少なくとも代表的である。重鎖及び軽鎖配列（相互に回復できない）は、優性の頻度によって、すなわちその存在量によってクラスター形成される。最も豊富なＶＨ及びＶＬは合成され、哺乳類発現ベクタに（１つごとに、あるいは集団で）導入される。ベクタは好適な培地で発現され、スクリーニングされて、対象の標的に対し特異性の免疫グロブリン、又はそのフラグメントを取得する。得られた結合剤は治療効果について試験され、薬剤として用いるために産生され、新しい抗体又は分子標的を同定するのに用いられうる。
【００２６】
本開示の実施形態は利点を提供し、以下のものを含む。
― 本明細書中に記載の実施形態は、超高処理の従来の生物学（ｗｅｔ ｂｉｏｌｏｇｙ）を情報生物学、及び有意に減少した時系列中の多くの患者からのＢ細胞を分析する場合に並列化が可能な、単一で広範囲の並列型分子配列決定技術に置換できる（通常、ショットガン配列決定のみが実行され、７５ないし５００の塩基対の比較的短い伸長を産生し、アセンブリは取得されたフラグメントの配列分析によってなされる）。
― 免疫グロブリンの定常領域中の高い相同性は、配列分析アルゴリズムと干渉しない。
― 本明細書中に記載の実施形態はクローニングステップの回避を可能にする。
― 本明細書中に記載の実施形態は、ＩｇＧ選択性のプライマー、つまりＩｇＧサブクラスに特異的なプライマーを用いることによって、低品質ＩｇＭの単離の問題を克服できる。
― 本明細書中の方法は、診断方法のために免疫ゲノムを用いることを可能にする。例えば、同一のアレルゲンに対するアレルギーを受ける患者はその免疫反応において同様の配列パターンを示しうる。従って、原則的にバイオマーカーとしての免疫ゲノムのプロファイルの使用は更に十分な大きさのデータセットが取得された場合に実現可能である。
― 免疫ゲノムの情報は更に、合成型のヒト、ネズミ、又はげっ歯類全体の抗体ライブラリの設計を促進できる。
【００２７】
本開示の一実施形態によると、サンプル中、例えば、免疫化されるか、あるいは病原体又は標的分子に感染する哺乳類（例えば、ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマ）由来の生物学的サンプル中の抗体、標的分子、疾病マーカー、病原体、又は標的分子に対する病原体は、
ａ）サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得するステップであって（例えば、サンプルからＢ細胞を収集することによって）、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｂ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の各々を配列決定するステップであって、これによってサンプル中にある免疫グロブリン（ＩｇＧ等）のＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｃ）サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと（例えば、所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析することによって）；
ｄ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成し、哺乳類発現ベクタを用いて抗体を産生するステップと（例えば、合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを哺乳類発現ベクタに組み込むことによって）；
ｅ）抗体を試験するステップであって（例えば、イムノアッセイを用いることによって）、これによって、サンプル中の抗体、標的、又は標的分子に対する病原体を同定するステップと；
を具える方法によって、同定、決定、検出又は診断される。
【００２８】
本開示の別の実施形態によると、抗体、標的分子、疾病マーカー、病原体、又は標的分子に対する病原体は、
ａ）免疫化されるか、あるいは病原体又は標的分子に感染する哺乳類（例えば、ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマ）由来の生物学的サンプル、あるいは疾病マーカー又は標的分子に対する抗体を含むサンプルを提供するステップと；
ｂ）生物学的サンプルからＢ細胞を収集するステップと；
ｃ）収集されたＢ細胞中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡを取得するステップと；
ｄ）免疫グロブリンのｃＤＮＡを産生するステップであって、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｅ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖の各々（ＶＨ及びＶＬの配列に好適で、かつ別個に得られる）を配列決定するステップであって、これによってサンプル中にある免疫グロブリン（ＩｇＧ等）のＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｆ）ＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析して、サンプル中にある最も優性のＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｇ）所定のコンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｈ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成するステップと；
ｉ）合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを哺乳類発現ベクタに組み込むステップと；
ｊ）ＶＨ及びＶＬポリヌクレオチド組み込み型ベクタが培養基で発現するのを可能にするステップであって、これによって抗体を産生するステップと；
ｋ）イムノアッセイを用いることによって抗体を試験するステップであって、これによって、抗体、標的、標的分子、疾病マーカー、病原体、又は標的分子に対する病原体を同定するステップと；
を具える方法によって、同定、決定、検出又は診断される。
【００２９】
本開示の実施形態においては、免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡはＩｇＧクラスである。
【００３０】
本開示の他の実施形態においては、免疫グロブリンのｃＤＮＡは逆転写ＰＣＲによって産生される。
【００３１】
本開示の他の実施形態によると、ＩｇＧに特異的なプライマーは逆転写ＰＣＲ増幅で用いられる。
【００３２】
本開示の他の実施形態においては、免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖に対する別個の配列データは、コンピュータに実装されるアルゴリズムを決定するために取得される。
【００３３】
本開示の別の実施形態においては、哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。
【００３４】
本開示の別の実施形態によると、抗体、標的分子、疾病マーカー、病原体、又は標的分子に対する病原体は、
ａ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析するステップと；
ｂ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の存在量を決定するステップと；
を具える方法によって同定、決定、検出又は診断される。
【００３５】
別の実施形態においては、その方法は更にステップｂ）で同定された豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を含む１又はそれ以上の免疫グロブリンを調製するステップを具える。本開示の他の実施形態においては、サンプルは生物学的サンプルである。他の実施形態においては、生物学的サンプルは哺乳類由来である。更に他の実施形態においては、前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。他の実施形態においては、前記ヒトは癌患者であるか、免疫化されるか、あるいは病原体又は標的分子に感染する。他の実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００３６】
［定義及び本開示の他の実施形態］
用語「免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ：Ｉｇ）」は、免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコード化される１又はそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質のことである。免疫グロブリンは限定しないが、抗体を含む。免疫グロブリンは多数の構造形態を有してもよく、限定しないが全長型抗体、抗体フラグメント、及び別個の免疫グロブリンドメインを含む。本明細書中の「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、タンパク質構造の技術分野の当業者によって確認されるような異なる構造主体として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。本明細書中で用いられるような用語「ＩｇＧ」は、認識された免疫グロブリンγ遺伝子によって実質的にコード化される抗体のクラスに属するタンパク質を意味する。
【００３７】
用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」はポリクローナル抗体、アフィニティー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト、ネズミ又はげっ歯類の完全抗体、ならびにＦ（ａｂ’）２及びＦａｂタンパク質分解フラグメントといった抗原結合性フラグメントを含む。キメラ抗体、Ｆｖフラグメント、及び単鎖抗体等といった、遺伝子改変された未処理の抗体又はフラグメント、ならびに合成型の抗原結合性ペプチド及びポリペプチドは更に含まれる。本開示による抗体は、抗体クラスのいずれかに属する免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコード化されてもよい。抗体はＩｇＧクラスの抗体に属する配列を含み、ヒトサブクラスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。この抗体は、ＩｇＡ（ヒトサブクラスのＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭクラスの抗体に属する配列を含む。
【００３８】
本明細書中で用いられるような用語「可変鎖（ｖａｒｉａｂｌｅ ｃｈａｉｎ）」又は「可変領域（ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）」は、軽鎖（κ及びλを含む）及び重鎖の免疫グロブリン遺伝子座をそれぞれ構成する、ＶＬ（Ｖκ及びＶλを含む）、ＶＨ、ＪＬ（Ｊκ及びＪλを含む）、及びＪＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコード化される１又はそれ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。軽鎖又は重鎖の可変領域（ＶＬ及びＶＨ）は、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」と称される３の超可変領域によって割り込まれる「フレームワーク」又は「ＦＲ」領域からなる。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は正確に規定されてきた（Ｋａｂａｔ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，９１５−９２０．；Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７７−８８３；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉら，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８）。抗体のフレームワーク領域は、構成要素である軽鎖及び重鎖の結合フレームワーク領域であり、ＣＤＲを配置及び配列比較するように作用し、主に抗原への結合を担当する。
【００３９】
用語「生物学的サンプル（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ）」は生物学的起源の任意のサンプルのことであってもよく、組織又は体液、全血、血清又は血漿のサンプル、あるいはタンパク質、ポリペプチド、核酸、又はポリヌクレオチドといった任意の成分を含むサンプルを含んでもよい。特定の実施形態においては、生物学的サンプルは、ヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマ由来といった、哺乳類由来である。他の実施形態においては、生物学的サンプルは哺乳類由来であり、哺乳類（例えばヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマ）は標的分子で免疫化されるか、癌患者であるか、あるいは特定のウイルス性、細菌性、又は原生動物の種に感染する。
【００４０】
「標的（ｔａｒｇｅｔ）」又は「標的分子（ｔａｒｇｅｔ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、抗体といった免疫グロブリンと反応し、それに結合する分子のことである。標的は既知又は未知であってもよく、及び／あるいは、例えば、免疫沈降、それに続く質量分光分析、Ｎ末端タンパク質配列決定などの当該技術分野で周知の方法によって同定できる。
【００４１】
用語「哺乳類（ｍａｍｍａｌ）」は、例えばヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、及びウマなどの哺乳類として分類される任意の生物のことである。実施形態においては、哺乳類はマウスである。本開示の他の実施形態においては、哺乳類はヒト又はラットである。
【００４２】
配列情報は任意のフォーマットで保存でき、ひいては本明細書中で用いられるような用語「データベース（ｄａｔａｂａｓｅ）」は、データベースファイル、ルックアップ表、又はＥｘｃｅｌのスプレッドシートといった、任意の情報の集合、特に配列情報のことである。特定の実施形態においては、データベースは、コンピュータ可読型の記憶装置といった電子工学的な形態で保存される。これはサーバ、クライアント、ハードディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、Ｐａｌｍ Ｐｉｌｏｔといった携帯情報端末、テープ、ｚｉｐディスク、コンピュータ内部のＲＯＭ（読み出し専用メモリ）、あるいはインターネット又はワールドワイドウェブといった媒体を含む。コンピュータによりアクセス可能なファイルの保存のための他の媒体は、当該技術分野の当業者にあきらかである。
【００４３】
この状況で用いられるような「コンピュータに実装されるアルゴリズム（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）」は、ＶＨ及びＶＬ鎖がある特定の生物学的サンプル中で最も豊富であることを決定するのに用いられうる任意の統計学的手段のことである。このようなコンピュータに実装されるアルゴリズムは、より大きなソフトウェアパッケージの一部あるいはスタンドアロン型のソフトウェアパッチ又はアプリケーションであってもよい。コンピュータに実装されるアルゴリズムは一般的に、ＶＨ及びＶＬ鎖の変異体の配列データを含むデータベース上で動作する。コンピュータに実装されるアルゴリズムの出力は一般的に、生物学的サンプル中にある最も優性又は豊富な配列、例えば別個のＶＨ鎖又はＶＬ鎖のリストである。
【００４４】
本開示の実施形態によると、コンピュータに実装されるアルゴリズムを介して同定される最も優性又は豊富な配列は合成され、本明細書中に記載のような発現用の発現ベクタに組み込まれる。
【００４５】
用語「（ポリ）ペプチド（（ｐｏｌｙ）ｐｅｐｔｉｄｅ）」はペプチド結合を介して連結される、複数、すなわち２又はそれ以上のアミノ酸の１又はそれ以上の鎖からなる分子と関連する。
【００４６】
用語「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、（ポリ）ペプチドの少なくとも一部分が、１又は複数の（ポリ）ペプチド鎖内及び又はその間に二次、三次、又は四次構造を形成することによって規定された三次元配列を有するか、あるいはそれを取得できる（ポリ）ペプチドのことである。この定義は天然型又は少なくとも部分的に人工型のタンパク質といったタンパク質を含み、同様に、すべてのタンパク質のフラグメント又はドメインを、これらのフラグメント又はドメインが上述したような規定された三次元配列を取得できる限りにおいては含む。１の鎖からなる（ポリ）ペプチド／タンパク質の例は単鎖Ｆｖ抗体フラグメントであり、２以上の鎖からなる（ポリ）ペプチド／タンパク質の例はＦａｂ抗体フラグメントである。
【００４７】
特定の実施形態においては、本開示はＩｇＧクラスの免疫グロブリンといった、免疫グロブリンのスーパーファミリの、好適には免疫グロブリンのメンバ又は誘導体の少なくとも一部を含む（ポリ）ペプチドのライブラリを提供する。いくつかの実施形態はヒト抗体のライブラリを提供する。他の実施形態は哺乳類又はげっ歯類の抗体のライブラリを提供する。可変重鎖領域及び可変軽鎖領域は好適には、フレームワーク領域（ＦＲ）１、２、３、及び４ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２、及び３を含む。
【００４８】
最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖をコード化するこれらの人工遺伝子は次いで、例えば、遺伝子全体の合成によって、あるいは合成型の遺伝子サブユニットによって構築される。これらの遺伝子サブユニットは（ポリ）ペプチドレベルでの構造的な下位要素に、例えば１又はそれ以上のフレームワーク領域及び／又は１又はそれ以上のフレームワーク領域に対応する。ＤＮＡレベルでは、これらの遺伝子サブユニットは各々の下位要素の始点及び終点での切断部位によって規定してもよい。特定の実施形態においては、米国特許第７，２６４，９６３号に記載のように、下位要素はＨｕＣＡＬ（Ｈｕｍａｎ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｌｉｂｒａｒｙ）と互換性がある。
【００４９】
このＤＮＡ分子の集合は次いで、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、又はＦａｂフラグメントといった、抗体又は抗体フラグメントのライブラリを産生するのに用いることができ、新しい標的の抗原に対する特異性の供給源として用いてもよい。更に、抗体の親和性は事前に構築されたライブラリカセット及び周知の成熟化手順を用いて最適化できる。
【００５０】
本開示は標的に結合する１又はそれ以上の抗体又は抗体フラグメントをコード化する１又はそれ以上の遺伝子を同定するための方法を提供し、抗体又は抗体フラグメントを発現するステップと、所定の標的分子に結合する１又はそれ以上の抗体又は抗体フラグメントを単離するためにそれらをスクリーニングするステップとを具える。
【００５１】
遺伝子発現：用語「遺伝子発現（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は生体内又は生体外プロセスのことであり、これによって遺伝子の情報はｍＲＮＡに転写され、次いでタンパク質／（ポリ）ペプチドに翻訳される。従って、遺伝子発現という用語は、細胞内部に生じるプロセスのことであり、これによって遺伝子の情報はｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳される。発現という用語は更に、翻訳後の修飾及び輸送の総ての事象を含み、これは（ポリ）ペプチドが機能的であるために必要である。相同遺伝子の分析：２又はそれ以上の遺伝子の対応するアミノ酸配列は、総ての位置での同一又は類似のアミノ酸残基間で相関性を最大化する方法で、相互に配列比較される。これらの配列比較された配列は、同一及び／又は類似の残基の合計の割合が規定されたしきい値を超える場合に、相同的であると称される。
【００５２】
用語「ベクタ（ｖｅｃｔｏｒ）」は、異なる遺伝子環境間で、動作可能に結合された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子のことである。好適なベクタはそれらが結合される核酸の自律増殖及び／又は発現を可能にするベクタである。動作可能に結合された遺伝子の発現に向かわせることが可能なベクタは、本明細書中で「発現ベクタ（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」と称される。ベクタの選択は所定のベクタの特異的な要求及び機能的特性に依存する。
【００５３】
本開示の一実施形態においては、ベクタは原核生物のレプリコン、すなわち、細菌性宿主細胞といった、それとともに形質転換される原核生物の宿主細胞中の染色体的に余分な組換えＤＮＡ分子の自律増殖及び維持に向かう能力を有するＤＮＡ配列を含む。このようなレプリコンは当該技術分野で公知である。加えて、原核生物のレプリコンを含むそれらの実施形態は更に、発現がそれとともに形質転換される細菌性宿主に対する薬物耐性といった選択的な利点を提供する遺伝子を含む。
【００５４】
原核生物のレプリコンを含むベクタは更に、それとともに形質転換される、大腸菌といった細菌性宿主細胞中で、ＶＨ及び／又はＶＬでコード化する相同体の発現（転写及び翻訳）に向かわせうる原核生物のプロモーターを含む。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼの結合及び生じさせるべき転写を可能にする、ＤＮＡ配列によって形成される発現制御要素である。細菌性宿主で互換性のあるプロモータ配列は一般的には、ＤＮＡセグメントの挿入に都合の良い制限部位を含むプラスミドベクタで提供される。このようなベクタプラスミドの例は、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２及びｐＢＲ３２９、ｐＰＬ、ならびにｐＫＫ２２３を含み、商業上利用可能である。このようなベクタは「原核生物の発現ベクタ（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」と称される。
【００５５】
それらを含む好適な真核生物の発現ベクタは、脊椎動物細胞と互換性がある。用語「真核生物の発現ベクタ（ｅｕｃａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、真核生物の宿主細胞中の核酸の発現に有用な任意の発現ベクタのことである。本開示の特定の実施形態においては、真核生物のベクタは哺乳類発現ベクタである。用語「哺乳類発現ベクタ（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は哺乳類宿主細胞中の核酸の発現に有用な任意の発現ベクタのことである。
【００５６】
真核生物の発現ベクタは当該技術分野で公知であり、更に商業上利用可能である。一般的には、このようなベクタは所望のＤＮＡ相同体の挿入に都合の良い制限部位を含んで提供される。このようなベクタの例は、ｐＳＶＬ及びｐＫＳＶ−１０、ｐＢＰＶ−１／ＰＭＬ２ｄ、ならびにｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ寄託番号３１２５５）を含む。
【００５７】
本開示の別の実施形態においては、真核生物の発現ベクタは真核細胞に有効な選択マーカ、好適には薬物耐性選択マーカを含む。好適な薬物耐性マーカはネオマイシン耐性を生じさせる遺伝子、すなわちネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ネオ）遺伝子である。Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ，１：３２７−３４１（１９８２）。
【００５８】
ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡ相同体の遺伝子を発現するためのレトロウイルス性の発現ベクタは更に予期される。用語「レトロウイルス発現ベクタ（ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）」は、レトロウイルスゲノムの末端反復配列（ＬＴＲ）領域から得られるプロモータ配列を含むＤＮＡ分子のことである。
【００５９】
１又はそれ以上の、ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡ構造は、個別に、あるいは組合せでのいずれかで、ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡ相同体の増幅及び／又は発現を提供するために好適な宿主に導入される。ＶＨ及びＶＬのポリペプチドが異なる生物で発現する場合、各ポリペプチドは単離され、次いで抗体又はそのフラグメントを形成するために好適な培地に混合される。ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡ相同体を含有する構成が導入された細胞性宿主は、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）」された、あるいは「形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）」であると本明細書中で称される。
【００６０】
宿主細胞は原核生物又は真核生物のもののいずれかにできる。細菌性細胞は好適には原核生物の宿主細胞であり、一般的には例えば、メリーランド州ベセズダのＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手可能な、大腸菌株ＤＨ５といった大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の菌株である。好適な真核生物の宿主細胞は酵母菌、ならびにネズミ及びげっ歯類を含む哺乳類細胞、好適にはマウス、ラット、サル、又はヒトの細胞株由来のものといった脊椎動物細胞を含む。
【００６１】
組換えＤＮＡ分子を有する好適な宿主細胞の形質転換は、用いられるベクタの型に一般的に依存する方法によって実現される。原核生物の宿主細胞の形質転換に関しては、例えば、Ｃｏｈｅｎら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．６９，Ｐ．２１１０（１９７２）；及びＭａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；を参照。ｒＤＮＡを含むレトロウイルスベクタを有する脊椎動物細胞の形質転換に関しては、例えばＳｏｒｇｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，４：１７３０−１７３７（１９８４）；Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌ．，５２：４５６（１９７３）；及びＷｉｇｌｅｒら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７６，Ｐ．１３７３−１３７６（１９７９）；を参照。
【００６２】
ＶＨ及び／又はＶＬのポリペプチドの発現用のスクリーニング：正常に形質転換された細胞、すなわち、ベクタに動作可能に結合される、ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡ相同体を含む細胞は、受容体のリガンドへの結合、又は、受容体、好適にはその活性部位をコード化するポリヌクレオチドの存在を検出する任意の好適な公知の技術によって同定できる。一実施形態においては、スクリーニングアッセイは、受容体によるリガンドの結合が検出可能なシグナルを、直接的にか、あるいは間接的にかのいずれかで産生するように行われる。このようなシグナルは例えば、複合体の産生、触媒反応産物の形成、及びエネルギの放出又は取り込み等を含む。対象の組換えＤＮＡとともに形質転換に供される集団からの細胞はクローニングされて、例えばモノクローナルなコロニーを産生する。これらのコロニーを形成する細胞は収集及び溶解され、そのＤＮＡ成分は、例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８：５０３（１９７５）；又は、Ｂｅｒｅｎｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：２０８（１９８５）；に記載のような当該技術分野に周知の方法を用いて、組換えＤＮＡの存在について試験される。
【００６３】
ＶＨ及び／又はＶＬでコード化するＤＮＡの存在について直接的にアッセイする他に、正常な形質転換は更に、産生されるＶＨ及び／又はＶＬのポリペプチドが事前選択されたエピトープを含む場合に特に、公知の免疫学的方法によって確認できる。形質変換されることとなる細胞のサンプルは、例えばエピトープに対する抗体を用いて事前選択されたエピトープの存在についてアッセイされる。
【００６４】
本明細書中で用いられるような「イムノアッセイ（ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）」は、抗原と、抗体のような免疫グロブリンとの間の特異的な結合反応の任意の測定のことである。一般的には、抗原は（ポリ）ペプチド又はタンパク質であるが、核酸、脂質、脂肪酸、又は有機小分子といったその他の物質が抗原として作用してもよい。当業者はイムノアッセイが抗原と免疫グロブリンとの間の特異的な結合を測定するのに最適であることを容易に理解及び決定するであろう。
【００６５】
本発明の状況で用いられるような用語「代表的なサンプル（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅ）」は、前記サンプル中にある免疫グロブリンの可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖の概要を得るために、配列決定する必要のある、サンプルの免疫グロブリンの可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖の代表的なサンプルに関する。このような概要を得るのに要求される配列の総数は各サンプルの性質に依存するが、少なくとも大きくすべきであるので、合理的な概算は免疫グロブリンのどの可変軽（ＶＬ）鎖と、どの可変重（ＶＨ）鎖とが前記サンプル中で最も豊富であるかでなされる。前記サンプル中にある免疫グロブリンの可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖のうち少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％が配列決定される。更に、好適には前記サンプル中にある免疫グロブリンの可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖のうち、少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、あるいは少なくとも１００，０００が配列決定される。
【００６６】
本発明の状況で用いられるような用語「最も豊富な（ｍｏｓｔ ａｂｕｎｄａｎｔ）」はサンプルが配列決定される場合に最も頻繁に同定される可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖のことである。最も豊富な可変軽（ＶＬ）鎖及び可変重（ＶＨ）鎖は一般的にはあるサンプル中で最も大きい数であるものである。
【００６７】
特定の実施形態においては、本発明は、サンプル中の抗体、標的、又は病原体の同定のための方法を提供し、
ａ）サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得するステップであって、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｂ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを配列決定するステップであって、これによって、サンプル中にある免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｃ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｄ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成し、哺乳類発現ベクタを用いて前記ＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗体を産生するステップと；
ｅ）抗体を試験するステップであって、これによって抗体又は標的を同定するステップと；
を具える。好適には、前記サンプルは生物学的サンプルである。好適には、前記生物学的サンプルは哺乳類由来である。好適には、前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。好適には、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。サンプル中で前記免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡは、サンプルからＢ細胞を収集又は単離することによって取得される。好適には、前記免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。好適には、サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡから取得されるｃＤＮＡは逆転写ＰＣＲによって産生される。好適には、ＩｇＧに特異的なプライマーは、免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡからのｃＤＮＡの産生に用いられる。好適には、サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖はサンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析することによって決定される。最も好適には、本発明の方法はいずれのクローニングステップも要求しない。特に、コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いてサンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖の決定まで行われる総ての方法ステップは、いずれのクローニングステップも要求しない。好適には、ステップ（ｄ）の最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドは哺乳類発現ベクタに組み込まれる。好適には、前記ステップで産生された抗体は培養基に放出される。好適には、本方法のステップ（ｅ）の抗体の試験は、イムノアッセイを用いることによって行われる。好適には、本方法のステップ（ｅ）においては、抗体は同定され、特定の標的分子又は組織に結合する。好適には、本方法のステップ（ｅ）においては、標的分子は同定され、特定の抗体に結合する。
【００６８】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）免疫化され、病原体又は標的分子に感染し、癌に罹患する、哺乳類由来の生物学的サンプルを提供するステップと
ｂ）生物学的サンプルからＢ細胞を収集するステップと；
ｃ）収集されたＢ細胞からｍＲＮＡを取得するステップと；
ｄ）ｍＲＮＡによってコード化された免疫グロブリンのｃＤＮＡを産生するステップであって、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｅ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを配列決定するステップであって、これによってサンプル中にある免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｆ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｈ）最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖のポリヌクレオチドを合成するステップと；
ｉ）合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを哺乳類発現ベクタに組み込むステップと；
ｊ）ＶＨ及びＶＬポリヌクレオチド組み込み型ベクタがＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを発現するのを可能にするステップであって、これによって抗体を産生するステップと；
ｋ）イムノアッセイを用いることによって抗体を試験するステップであって、これによって抗体、標的、又は病原体を同定するステップと；
を具える、抗体、標的、又は病原体の同定のための方法を提供する。好適には、前記サンプルは生物学的サンプルである。好適には、前記生物学的サンプルは哺乳類由来である。好適には、前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。好適には、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。好適には、前記免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００６９】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析するステップと；
ｂ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の存在量を決定するステップと；
を具えるサンプル中の抗体、標的、又は病原体の同定のための方法を提供する。好適には、前記方法は更に、ステップｂ）で同定された豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を含む１又はそれ以上の免疫グロブリンを調製するステップを具える。好適には、前記サンプルは生物学的サンプルである。好適には、前記生物学的サンプルは哺乳類由来である。好適には、前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマである。好適には、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。好適には、前記免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００７０】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得するステップであって、これによってｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｂ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを直接的に配列決定するステップであって、
ｃ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｄ）サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖をコード化するポリヌクレオチドを合成し、発現ベクタを用いて前記ＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗体を産生するステップと；
ｅ）抗体を試験するステップであって、これによって抗体又は標的を同定するステップと；
を具える、サンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供する。
【００７１】
上に列挙した方法のステップ（ｂ）の状況で用いられるような用語「直接的に配列決定するステップ（ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」は、ステップ（ａ）で取得されるｃＤＮＡが、任意の更なる分子生物学的な修飾ステップなしに、配列決定される状況のことである。具体的には、クローニングステップが要求されない。
【００７２】
好適な実施形態においては、サンプルは生物学的サンプルである。更に好適な実施形態においては、生物学的サンプルは哺乳類由来である。前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマであってもよい。前記生物学的サンプルは更にヒト由来であってもよく、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。
【００７３】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ａ）での免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡは、サンプルからＢ細胞を収集又は単離することによって取得される。免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００７４】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ａ）での前記免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡは逆転写ＰＣＲによって産生される。更に好適な実施形態においては、ＩｇＧに特異的なプライマーは前記逆転写ＰＣＲで用いられる。
【００７５】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｃ）でのサンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖は、サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析することによって決定される。
【００７６】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ａ）ないし（ｃ）はいずれのクローニングステップも要求しない。
【００７７】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｄ）で合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドは、発現ベクタに組み込まれる。更に好適には、前記発現ベクタは哺乳類発現ベクタである。
【００７８】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｄ）で産生された抗体は、培養基に放出される。
【００７９】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｅ）での抗体の試験はイムノアッセイを用いることによって実行される。
【００８０】
好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｅ）で、抗体は同定され、特定の標的分子又は組織に結合する。好適な実施形態においては、上に列挙した方法のステップ（ｅ）で、標的分子は同定され、特定の抗体に結合する。
【００８１】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）免疫化され、病原体又は標的分子に感染し、癌に罹患する、哺乳類由来の生物学的サンプルを提供するステップと；
ｂ）生物学的サンプルからＢ細胞を収集するステップと；
ｃ）収集されたＢ細胞からｍＲＮＡを取得するステップと；
ｄ）ｍＲＮＡによってコード化された免疫グロブリンのｃＤＮＡを産生するステップであって、ｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｅ）免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを直接的に配列決定するステップであって、これによってサンプル中にある免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｆ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｈ）サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖をコード化するポリヌクレオチドを合成するステップと；
ｉ） 合成されたＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを哺乳類発現ベクタに組み込むステップと；
ｊ）ＶＨ及びＶＬポリヌクレオチド組み込み型ベクタがＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを発現するのを可能にするステップであって、これによって抗体を産生するステップと；
ｋ）イムノアッセイを用いることによって抗体を試験するステップであって、抗体、標的、又は病原体を同定するステップと；
を具える、抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供する。好適な実施形態においては、前記サンプルは生物学的サンプルである。更に好適な実施形態においては、前記生物学的サンプルは哺乳類由来である。前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマにできる。更に好適な実施形態においては、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。更に好適な実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧクラスである。
【００８２】
特定の実施形態においては、本発明は、
ａ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析するステップと；
ｂ）サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の存在量を決定するステップと；
を具える、サンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法を提供する。更なる実施形態においては、前記方法は更に、ステップｂ）で同定された豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を含む１又はそれ以上の免疫グロブリンを調製するステップを具える。好適な実施形態においては、前記サンプルは生物学的サンプルである。更に好適な実施形態においては、前記生物学的サンプルは哺乳類由来である。前記哺乳類はヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマにできる。更に好適な実施形態においては、前記ヒトは癌患者であるか、前記ヒトは免疫化されるか、あるいは前記ヒトは病原体又は標的分子に感染する。更に好適な実施形態においては、免疫グロブリンはＩｇＧクラスである．
【００８３】
本開示は以下の実施例によって更に記載されるが、いかなる方法でも開示の範囲を限定しない。
【実施例】
【００８４】
［免疫化／感染した患者からのＢ細胞の収集］
Ｂ細胞は様々な異なる方法で、免疫化あるいは感染した患者から単離でき、このような技術は当業者に周知である。多くのこのような技術において、静止Ｂリンパ球（Ｂ細胞）は、例えば磁気マイクロビーズを介して、抗ＣＤ４３及び抗Ｍａｃ−１／ＣＤ１１ｂのモノクローナル抗体とともに負の選択を用いて、脾臓から単離される。このストラテジは脾細胞の混合集団から非Ｂ細胞を枯渇させ、静止脾臓Ｂ細胞を除いて、最も成熟した白血球がＣＤ４３を発現するという事実に依拠する（実際に、ＣＤ４３の発現は、顆粒球、単球、マクロファージ、血小板、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、胸腺細胞、ならびに末梢性のＣＤ８陽性Ｔ細胞及びほとんどのＣＤ４陽性Ｔ細胞に加えて、未成熟のＢ細胞、形質細胞、及びいくつかの成熟Ｂ１細胞に示されていた）。抗Ｍａｃ−１／ＣＤ１１ｂマイクロビーズは負の選択に含まれて、骨髄系細胞の除去を改善する。Ｂ細胞の単離は、ＡｕｔｏＭＡＣＳ自動式磁気ビーズセルソータ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて自動化してもよい。Ｂ２２０＋細胞の蛍光分析により評価されるように、このような単離は常に、脾臓につき約４×１０ｅ７の、９５％より高い純度のＢ細胞を産生する。更に、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｓ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｗ，Ｗｅｉｃｈｅｌ Ｗ，及びＲａｄｂｒｕｃｈ Ａ．（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１１（２），２３１−２３８参照。
【００８５】
［ｍＲＮＡ抽出及び逆転写］
免疫グロブリン、好適にはＩｇＧ型の免疫グロブリンは、ｍＲＮＡの抽出、次いで逆転写を介してＢ細胞から選択的に増幅できる。
【００８６】
Ｂ細胞といった真核細胞からのｍＲＮＡ抽出は公知の技術的手順である。多数のプロトコルが存在し、商用のキットが利用可能である。ＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ（登録商標）ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（米国ウィスコンシン州マディソンのＰｒｏｍｅｇａ社）又は様々なＲＮｅａｓｙ及びＯｌｉｇｏｔｅｘ ＤｉｒｅｃｔｍＲＮＡキット（双方が、ドイツ連邦共和国ヒルデンのＱｉａｇｅｎ社）など。これらの技術の多くは、例えばオリゴチミジンセルロースといったオリゴチミジン基質に対するアフィニティ精製を介して真核生物ｍＲＮＡのポリＡ尾部を利用する。
【００８７】
免疫グロブリンは特異的なプライマーを用いた逆転写、その後の従来のＰＣＲを介して、単離したｍＲＮＡから選択的に増幅できる。特異的なプライマーは、免疫グロブリンに対し、あるいは、ある免疫グロブリンクラス、すなわちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、又はＩｇＥのいずれかに対し、あるいは、あるいは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４といった、ある免疫グロブリンサブクラスに対してさえも特異的にできる。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖遺伝子を増幅するために用いられうるプライマーは例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｒｖ １９９７；３０：２１−４４、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ１９９４；４７：４９３−６、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １９９０；４３：８８８−９０、又はＭｏｌ Ｐａｔｈｏｌ．２００２ Ａｐｒｉｌ；５５（２）：９８−１０１に開示される。
【００８８】
［ｃＤＮＡのゲノム配列決定］
免疫グロブリンの全配列が配列決定される。Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）といったゲノム全体を配列決定できる様々な企業が存在する。そのＴｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（登録商標）技術をもって、Ｈｅｌｉｃｏｓ社は高速かつ高効率でＤＮＡ又はＲＮＡの単一分子を直接的に配列決定することを可能にする。同様の配列の努力を行うことが可能な他の企業は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（米国カリフォルニア州サンディエゴ；Ｓｏｌｅｘａシステム）及びＲｏｃｈｅ社（スイス連邦バーゼル州；４５４システム）を含む。クローニングステップは配列決定の前に要求されない。
【００８９】
免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列が別個に決定される。１０３より多いＶＨ及びＶＬ鎖の別個の配列が決定され、１０４より多い別個の配列であることが好ましく、１０５より多い別個の配列であることが更に好ましく、１０６より多い別個の配列であることが更に好ましい。
【００９０】
決定された配列は任意のデータベースシステムに保存してもよい。このようなデータベースシステムは、用いられる配列決定システムの一部であってもよい。代替的に、配列情報はＥｘｃｅｌのスプレッドシートの形態、あるいはタブ区切りフォーマットといった他のフォーマットで保存してもよい。
【００９１】
［事前決定されたアルゴリズムによる優性／豊富なＶＨ及びＶＬ配列の決定］
配列決定された免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の存在量は、様々なアルゴリズムによって決定できる。ＶＨ鎖及びＶＬ鎖は好適には別個に分析される。
【００９２】
第１のステップは同一の免疫グロブリンから得られるＶＨ及びＶＬ鎖の配列を同定することであってもよい。同一の免疫グロブリンから得られる配列は、必ずしも完全に同一とは限らない。それらの配列が、各配列について全く同じヌクレオチドで開始又は終了しないために、あるいは、ヌクレオチドが、このような大きな範囲の配列決定配列プロジェクト中に生じうる事象である、決定プロセスで誤読されるために、このようなわずかな差異は生じうる。特定のヌクレオチド、特に特定のヌクレオチド配列が他のもの（例えば、ＧＣリッチなヌクレオチド伸長）よりも誤読を更に起こしやすいことは周知である。生体情報学的なツール及びアルゴリズムは、その多くは各配列決定システムの一部であるが、このような場合を決定でき、あるいは少なくとも実例を示唆でき、そこではこのようなエラーが生じうる。
【００９３】
ＶＨ及びＶＬ鎖の存在量は様々な統計検定によって決定してもよい。最も容易には、別個のＶＨ及びＶＬ鎖が単に計数される。より複雑な統計検定は様々な他のパラメータを考慮する。限定されない例によると、以下の統計検定及び文献はこのような又は同様の分析を為す多数のアプローチの実施例として誘導できる：Ｂａｙｅｓｉａｎ Ｓｈｒｉｎｋａｇｅ Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ（例えば、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ５９（２００３）：４７６−４８６参照）、ＤＡＤＡ（Ｄｉｇｉｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃＤＮＡ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ；例えば、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２００２，３：７参照）、線形モデリング（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ，１９９９，４：４１−５２）、及び様々なクラスタリング手法（ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００６，７：３９７，Ｆｏｕｒｔｈ ＩＥＥＥ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ（ＩＣＤＭ’０４），ｐｐ．４０３−４０６）。
【００９４】
［ＶＨ及びＶＬの合成］
最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖の遺伝子は従来の方法によって合成される。このような合成は標準的な技術であり、例えば数例を挙げると、Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ社（ドイツ共和国レーゲンスブルク）、Ｇｅｎｅａｒｔ社（ドイツ共和国レーゲンスブルク）、又はＳｌｏｎｉｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ドイツ共和国プッフハイム）といった多くの企業が、それぞれのサービスを提供している。理想的には、各遺伝子が既に、好適なベクタにクローニングするための好適な制限部位を保有する。
【００９５】
［優性のＶＨ及びＶＬ鎖のクローニング及び発現］
ＶＨ及びＶＬ鎖の合成された遺伝子は、各発現ベクタにクローニングされる。そうするために、各発現ベクタは合成された遺伝子と互換性のある好適な制限酵素で消化される。上記のように、合成された遺伝子は好適には既にベクタと互換性がある、すなわち、各制限部位は既に合成された遺伝子中に存在する。例示的なベクタはｐｃＤＮＡ、ｐＭＯＲＰＨ、ｐＵＣ、ｐＢＲ、ｐＢＡＤ、及び他のベクタを含む。ベクタによる発現は、合成されたＶＨ及びＶＬ鎖を含む全長免疫グロブリンの産生を引き起こし、更に後のステップで特徴づけられるか、あるいは修飾できる。
【００９６】
［発現されたポリペプチドをスクリーニングするためのイムノアッセイ及びＶＨ及びＶＬの組合せの選択］
ｐｃＤＮＡ、ｐＭＯＲＰＨ、ｐＵＣ、ｐＢＲ、ｐＢＡＤ、及び他のベクタといった各ベクタによる発現後に産生される全長免疫グロブリンは、様々な型のアッセイで用いられうる。例えば、イムノアッセイを行ってもよい。
【００９７】
例えば、免疫グロブリンの、抗原といった、ある標的分子への結合をアッセイしてもよい。これはＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、又はその他の等価的な手段といった標準的な検査法によって取得してもよい。このような実験はある標的分子に結合する免疫グロブリンの同定を引き起こしうる。このような実験は更に、より定量的な方法で行ってもよい、すなわち、各免疫グロブリンがある標的分子に結合するか否かを決定するだけではなく、そのような相互作用がどのくらい強く生じるかを決定する。これは免疫グロブリンの所定の標的分子に対する結合親和性、解離定数、又はその他の等価パラメータの決定を介して得てもよい。代表的な技術は、表面プラズモン共鳴法、溶解平衡滴定、カンチレバー、聴覚バイオセンサ、及び当該技術分野に周知の他の方法を含む。
【００９８】
所定の免疫グロブリンが結合する標的分子を同定することは更に可能である。そうするために、ある免疫グロブリンが選択され、免疫グロブリンの混合物の少なくとも１の標的分子への結合を可能にする条件下で、結合可能性のあるタンパク質の混合物に供される。代表的な結合条件は、バッファ組成及びストリンジェンシといった好適なパラメータの選択によって調整してもよい。
【００９９】
［標的／抗体の同定］
所定の標的分子に結合する免疫グロブリンの同定、又は所定の免疫グロブリンに結合する標的分子の同定は、任意の周知の方法論によって実現できる。多くのこのような方法は当業者に周知であり、例示的な文献として以下のものが提供される：Ｖａｌｌｅ ＲＰ，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｄｅｖｅｌ．２００３ Ｍａｒ；６（２）：１９７−２０３、Ａｃｋｅｒｍａｎｎ ＢＬ Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２００７ Ａｐｒ；４（２）：１７５−８６及びＡｎｄｅｒｓｏｎ ＫＳ Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ．２００５ Ｊｕｌ−Ａｕｇ；４（４）：１１２３−３３。
【０１００】
説明、特定の実施例、及びデータは例示的な実施形態を示すが、例示のために与えられ、開示を限定することを意図しないことは理解すべきである。本開示にある様々な変形及び変更は、本明細書中に含まれる考察、開示及びデータから当業者に明らかになり、従って、本開示の一部と見なされる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法であって、
ａ）前記サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得するステップであって、これによって前記ｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｂ）前記免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを直接的に配列決定するステップであって、これによって前記サンプル中にある前記免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｃ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、前記サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｄ）前記サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖をコード化するポリヌクレオチドを合成し、発現ベクタを用いて前記ＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗体を産生するステップと；
ｅ）前記抗体を試験するステップであって、これによって前記抗体又は前記標的を同定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記サンプルが生物学的サンプルであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記生物学的サンプルが哺乳類由来であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記哺乳類がヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記ヒトが癌患者であるか、前記ヒトが免疫化されるか、あるいは前記ヒトが病原体又は標的分子に感染することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡが、前記サンプルからＢ細胞を収集又は単離することによって取得されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記免疫グロブリンがＩｇＧクラスであることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡがステップ（ａ）で、逆転写ＰＣＲによって産生されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、ＩｇＧに特異的なプライマーが用いられることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、前記サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖が、前記サンプル中にある前記ＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析することによって決定されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、ステップ（ａ）ないし（ｃ）がいかなるクローニングステップも要求しないことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、ステップ（ｄ）で合成された前記ＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドが発現ベクタに組み込まれることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１３に記載の方法において、前記発現ベクタが哺乳類発現ベクタであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、ステップ（ｄ）で産生される前記抗体が培養基に放出されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、前記抗体の試験がステップ（ｅ）で、イムノアッセイを用いることによって行われることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、抗体がステップ（ｅ）で同定され、特定の標的分子又は組織に結合することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法において、標的分子がステップ（ｅ）で同定され、特定の抗体に結合することを特徴とする方法。
【請求項１８】
抗体、標的、又は病原体を同定する方法であって、
ａ）免疫化されるか、病原体又は標的分子に感染するか、あるいは癌を患う哺乳類から生物学的サンプルを提供するステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルからＢ細胞を収集するステップと；
ｃ）収集された前記Ｂ細胞からｍＲＮＡを取得するステップと；
ｄ）前記ｍＲＮＡによってコード化された、免疫グロブリンのｃＤＮＡを産生するステップであって、これによって前記ｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｅ）前記免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを直接的に配列決定するステップであって、これによって、前記サンプル中にある前記免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｆ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、前記サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｈ）前記サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖をコード化するポリヌクレオチドを合成するステップと；
ｉ）合成されたＶＨ及びＶＬの前記ポリヌクレオチドを、哺乳類発現ベクタに組み込むステップと；
ｊ）ＶＨ及びＶＬポリヌクレオチド組み込み型ベクタが前記ＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを発現するのを可能にするステップであって、これによって抗体が産生されるステップと；
ｋ）イムノアッセイを用いることによって前記抗体を試験するステップであって、これによって前記抗体、標的、又は病原体を同定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１９】
サンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法であって、
ａ）前記サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析するステップと；
ｂ）前記サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の存在量を決定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法が、ステップｂ）で同定される豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を含む１又はそれ以上の免疫グロブリンを調製するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１８ないし２０のいずれかに記載の方法において、前記サンプルが生物学的サンプルであることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、前記生物学的サンプルが哺乳類由来であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、前記哺乳類がヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、前記ヒトが癌患者であるか、前記ヒトが免疫化されるか、あるいは前記ヒトが病原体又は標的分子に感染することを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１８ないし２４のいずれかに記載の方法において、前記免疫グロブリンがＩｇＧクラスであることを特徴とする方法。
【請求項１】
サンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法であって、
ａ）前記サンプル中の免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡを取得するステップであって、これによって前記ｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｂ）前記免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを直接的に配列決定するステップであって、これによって前記サンプル中にある前記免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｃ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、前記サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｄ）前記サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖をコード化するポリヌクレオチドを合成し、発現ベクタを用いて前記ＶＨ及びＶＬ鎖を含む抗体を産生するステップと；
ｅ）前記抗体を試験するステップであって、これによって前記抗体又は前記標的を同定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記サンプルが生物学的サンプルであることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法において、前記生物学的サンプルが哺乳類由来であることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法において、前記哺乳類がヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマであることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法において、前記ヒトが癌患者であるか、前記ヒトが免疫化されるか、あるいは前記ヒトが病原体又は標的分子に感染することを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法において、前記免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡが、前記サンプルからＢ細胞を収集又は単離することによって取得されることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法において、前記免疫グロブリンがＩｇＧクラスであることを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法において、前記免疫グロブリンをコード化するｍＲＮＡのｃＤＮＡがステップ（ａ）で、逆転写ＰＣＲによって産生されることを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、ＩｇＧに特異的なプライマーが用いられることを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法において、前記サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖が、前記サンプル中にある前記ＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析することによって決定されることを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法において、ステップ（ａ）ないし（ｃ）がいかなるクローニングステップも要求しないことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法において、ステップ（ｄ）で合成された前記ＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドが発現ベクタに組み込まれることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１３に記載の方法において、前記発現ベクタが哺乳類発現ベクタであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法において、ステップ（ｄ）で産生される前記抗体が培養基に放出されることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法において、前記抗体の試験がステップ（ｅ）で、イムノアッセイを用いることによって行われることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法において、抗体がステップ（ｅ）で同定され、特定の標的分子又は組織に結合することを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法において、標的分子がステップ（ｅ）で同定され、特定の抗体に結合することを特徴とする方法。
【請求項１８】
抗体、標的、又は病原体を同定する方法であって、
ａ）免疫化されるか、病原体又は標的分子に感染するか、あるいは癌を患う哺乳類から生物学的サンプルを提供するステップと；
ｂ）前記生物学的サンプルからＢ細胞を収集するステップと；
ｃ）収集された前記Ｂ細胞からｍＲＮＡを取得するステップと；
ｄ）前記ｍＲＮＡによってコード化された、免疫グロブリンのｃＤＮＡを産生するステップであって、これによって前記ｃＤＮＡの混合物を取得するステップと；
ｅ）前記免疫グロブリンの可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖のうちの少なくとも代表的なサンプルを直接的に配列決定するステップであって、これによって、前記サンプル中にある前記免疫グロブリンのＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを取得するステップと；
ｆ）コンピュータに実装されるアルゴリズムを用いて、前記サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を決定するステップと；
ｈ）前記サンプル中にある最も豊富なＶＨ及びＶＬ鎖をコード化するポリヌクレオチドを合成するステップと；
ｉ）合成されたＶＨ及びＶＬの前記ポリヌクレオチドを、哺乳類発現ベクタに組み込むステップと；
ｊ）ＶＨ及びＶＬポリヌクレオチド組み込み型ベクタが前記ＶＨ及びＶＬのポリヌクレオチドを発現するのを可能にするステップであって、これによって抗体が産生されるステップと；
ｋ）イムノアッセイを用いることによって前記抗体を試験するステップであって、これによって前記抗体、標的、又は病原体を同定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項１９】
サンプル中の抗体、標的、又は病原体を同定する方法であって、
ａ）前記サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の配列データを分析するステップと；
ｂ）前記サンプル中にあるＶＨ及びＶＬ鎖の存在量を決定するステップと；
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法が、ステップｂ）で同定される豊富なＶＨ及びＶＬ鎖を含む１又はそれ以上の免疫グロブリンを調製するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１８ないし２０のいずれかに記載の方法において、前記サンプルが生物学的サンプルであることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、前記生物学的サンプルが哺乳類由来であることを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、前記哺乳類がヒト、ネズミ、げっ歯類、マウス、ラット、リス、シマリス、ホリネズミ、ヤマアラシ、ビーバー、ハムスター、スナネズミ、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、雌ウシ、又はウマであることを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法において、前記ヒトが癌患者であるか、前記ヒトが免疫化されるか、あるいは前記ヒトが病原体又は標的分子に感染することを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１８ないし２４のいずれかに記載の方法において、前記免疫グロブリンがＩｇＧクラスであることを特徴とする方法。
【公表番号】特表２０１１−５２３３４８（Ｐ２０１１−５２３３４８Ａ）
【公表日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５４５４１７（Ｐ２０１０−５４５４１７）
【出願日】平成２１年２月１１日（２００９．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０００９５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１００８９６
【国際公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（５０２２４７７８７）モルフォシス・アー・ゲー (8)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月１１日（２０１１．８．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１１日（２００９．２．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０００９５３
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１００８９６
【国際公開日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【出願人】（５０２２４７７８７）モルフォシス・アー・ゲー (8)
【Ｆターム（参考）】
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