改良された特性を有するインターフェロンアルファムテインの融合タンパク質
本発明は、ヒトインターフェロンアルファ、特に改良された特性を有する修飾型インターフェロンアルファ２に関する。改良タンパク質は、生物学的アッセイにおいて増大した相対活性を与える特定位置にアミノ酸置換を含む。本発明はまた、修飾インターフェロンアルファを提供し、タンパク質は低減された免疫原性能と共に改良された生物活性を有する。改良タンパク質はヒトの疾患の治療における治療的使用を意図したものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(分野)
本発明は、ヒトインターフェロンアルファ、特に、改良された特性を有する修飾型インターフェロンアルファ２に関する。改良タンパク質は、生物学的アッセイにおいて増大した相対活性を与える特定位置のアミノ酸置換を含む。本発明はまた、修飾インターフェロンアルファを提供し、タンパク質においては、低減された免疫原性能と共に改良された生物活性を有する。改良タンパク質はヒトの疾患の治療における治療的使用を意図したものである。
【０００２】
(背景)
インターフェロンアルファ２(ＩＦＮα２)は、活性化されたマクロファージによって発現される重要な糖タンパク質サイトカインである。タンパク質は、広域抗ウイルス剤、抗増殖剤および免疫調節剤としてかなりの臨床的重要性を有している。ＩＦＮα２の組換えおよび他の製剤が、ヒトにおける種々の癌および抗ウイルス性の適応で治療的に用いられてきた[Sen, G.G.およびLengyel P(1992年)J.Biol.Chem.267：5017〜5020頁において論評]。現在、臨床的に使用されている多くのＩＦＮα製剤があり、これらは、E.coliで産生された天然組換えＩＦＮα２(ＩＦＮα２ａ、ＲｏｆｅｒｏｎＡ(登録商標)、Hoffman-La Roche社；ＩＦＮα２ｂ、ＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標)、Schering-Plough社；ＩＦＮα２ｃ、Ｂｅｒｏｆｏｒ(登録商標)、Basotherm社)、さらに最近では、全サブタイプの共通配列に基づいたE.coliで産生された合成ＩＦＮα(Ｉｎｆｅｒｇｅｎ(登録商標)、InterMune社)を含む。
【０００３】
ＩＦＮα２の主要な用途は、Ｃ型慢性肝炎ウイルス(ＨＣＶ)感染の治療である。ＩＦＮα単独での治療は、約10％の患者において持続されたウイルス除去をもたらす。なお、最近では、40％の持続されたウイルス応答が、ＩＦＮα２にリバビリンを組み合わせることによって達成されている[Davis GLら(1998年)N.Engl.J.Med.339：1493〜1499頁；McHutchison JGら(1998年)N.Engl.J.Med.339：1485〜1492頁；Reichard Oら(1998年)Lancet.351：83〜87頁]。ＩＦＮα治療は、集中的であり、重症な副作用を伴い、治療を中止する例が20％に及ぶ。集中的治療の理論的根拠は、ＩＦＮα２ｂが比較的短い血清半減期を有する[Glue Pら(2000年)Clin.Pharmacol.Ther.68：556〜567頁]ことであり、抗ウイルス効果を考慮すると１日１回または週３回の皮下注射による投与が必要になる。
【０００４】
この短い半減期と頻繁な投薬は、長期の治療では問題があると認識されてきた。これに取り組むために、ＲｏｆｅｒｏｎＡ(登録商標)とＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標))のＰＥＧ化バージョン(Ｐｅｇａｓｙｓ(登録商標)とＰｅｇ-Ｉｎｔｒｏｎ(登録商標))が導入されており、Ｉｎｆｅｒｇｅｎ(登録商標)の同様のバージョンが第II相臨床試験中である。これらの修飾されたインターフェロンはポリエチレングリコール部分に結合されており、血清半減期が10から20倍に増大し(６、７)、これによって、臨床的な効力に悪影響を及ぼすことなく、投薬頻度を週１回(Ｐｅｇ-Ｉｎｔｒｏｎ(商標)とＰｅｇａｓｙｓ(商標)についてそれぞれ180μｇまたは1.4μｇ/Ｋｇ)に減らす[Glue P.ら(2000年)前掲書；Perry CMら(2001年)Drugs 61：2263〜2288頁；Glue Pら(2000年)Hepatology 32：647〜653頁]。これらの試験において、副作用プロフィールは、無修飾のインターフェロンと類似している。
【０００５】
血清半減期を増大させるためのもう１つの戦略は、ＩＦＮαをヒト血清アルブミンに連結することである[Osborn BLら(2002年)J.Pharmacol.Exp.Ther.303：540〜548頁]。Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ(登録商標)は、ヒト血清アルブミンのＣ末端に連結されたＩＦＮαからなり、カニクイザルにおいては、ＰＥＧ化ＩＦＮαの３倍、無修飾ＩＦＮαの18倍の半減期を有する。この分子については、ヒトにおける試験によるデータは、未だ入手可能ではない。しかしながら、ＰＥＧ化ＩＦＮαおよびアルブミン連結されたＩＦＮαの両方について、修飾タンパク質のin vitroの比活性は、天然タンパク質と比べて、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ(登録商標)で28％に低減し[Grace Mら(2001年)Cytokine Res.21：1103〜1115頁]、およびＰｅｇａｓｙｓ(登録商標)とＡｌｂｕｆｅｒｏｎ(登録商標)では10％以下に低減される[Osborn BLら(2002年)前掲書；Bailon Pら(2001年).Bioconjug Chem.12：195から202頁]。
【０００６】
ＩＦＮαの利用において見られる重要な治療的利点にもかかわらず、或る患者における治療に対する抵抗性が記録されており、抵抗の重要な仕組みの１つが、治療中の患者の血清において検出可能な中和抗体の発生であることが示された[Quesada, J.R.ら(1985年)J.Clin.Oncology ３：1522〜1528頁；Stein R.G.ら(1988年)前掲書；Russo, D.ら(1996年)Br.J.Haematol.94：300〜305頁；Brooks M.G.ら(1989年)Gut 30：1116〜1122頁]。少なくとも同一の一次構造の分子がヒトにおいて内因的に産生されるという事実にもかかわらず、これらの患者において治療的インターフェロンに対して免疫応答が生じる。数カ月にわたって投薬が繰り返されると、適応症に依存して80％までの患者において抗ＩＦＮα中和抗体が誘起され[Schellekens Ｈら(1997年)J Interferon Cytokine Res.17、補足１：Ｓ５〜８頁]、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染についての報告された頻度は、７％から60％の範囲である[Schellekens Hら(1997年)前掲書]。入手可能な証拠は、中和抗体を生じる患者は、抗体を生じない患者に比べて、治療に反応せず、再発しやすいことを示唆している[Ross Cら(2002年)J Interferon Cytokine Res.22：421〜426頁；McKenna R.Mら(1997年)J.Interferon Cytokine Res.17：141〜143頁；Russo Dら(1996年)前掲書；Milella Mら(1993年)Liver、13：146〜150頁；Primmer O.(1993年)Cancer、71：1828〜1834頁]。しかし、ある場合には、精製された白血球インターフェロンをその後に使用することによって治療を続行することができる[Russo Dら(1996年)前掲書；Oberg K.とAlm G.(1997年)Biotherapy、10：１〜５頁；Tefferi A.とGrendahl D.C.(1996年)、Am.J.Hermatol.52：231〜233頁；Milella Mら(1995年)Hepatogastroenterology 42：201〜204頁]。
【０００７】
組換えＩＦＮαに対する抗体の発生の理由は明らかではない。なぜなら、タンパク質が天然に存在し、ウイルス感染のような事象に応答して発現が散発的に増大するからである。投薬の経路と頻度、ＩＦＮαの免疫調節効果、および医薬製剤におけるタンパク質凝集体の存在がすべて、免疫寛容の崩壊において或る役割を果たしているかもしれない。しかしながら、いかなる促進要因とも無関係に、免疫応答の誘起へとつながる中心的な特徴は、ＭＨＣクラスII分子上での提示を介してＴ細胞の活性を刺激することができるペプチドがタンパク質内に存在していることである。そのようなペプチド配列は、「Ｔ細胞エピトープ」であり、一般に、ＭＨＣクラスII分子に結合する能力を有するアミノ酸残基配列のすべてとして定義される。「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合すると、Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)によって認識されうるものであり、少なくとも原則的には、ＴＣＲをしてＴ細胞応答を促進させることによってＴ細胞の活性化を引き起こすことができるエピトープを暗に意味する。
【０００８】
前述のことから、増強された特性を有するＩＦＮα２に対する継続した必要性が明らかに存在する。望まれる強化点は、上記医薬品の発現と精製のための代替のスキームとモダリティを含み、また、特に、タンパク質の生物学的特性の改良も含む。ヒト対象に投与した場合のin vivoの特徴を増強することが特に必要である。この点において、免疫応答を誘起する能力が欠失または減退しておりかつヒト対象における生物学的力価が増強されているＩＦＮα２を提供することが高く望まれている。
【０００９】
本発明者らは、先に、自己タンパク質に対する免疫応答を推進するＴ細胞エピトープを含むＩＦＮα２分子の重要な領域を開示し、そして、Ｔ細胞エピトープとして作用できなくなるようにこれらの配列をすべて消去しまたは有効性を低減した組成物を提供した[WO 02/085941]。そのような組成物は、ＩＦＮα２タンパク質のアミノ酸配列の改変、例えば置換、によって達成され、本発明はまた、アミノ酸置換およびまたは置換の組合せが行われたＩＦＮα２分子に関する。しかし、本件では、なされた新規の置換および置換の組合せは、分子の生物活性を大きく増強するという驚くべき特性を与え、タンパク質について低減された免疫原性プロフィールを達成する置換と組み合わせたそのような増強は、改良されたＩＦＮα２分子をもたらす。
【００１０】
他のものたちは、修飾ＩＮＦα２および使用方法を提供し、例えば、米国特許第4,496,537号、米国特許第5,972,331号、米国特許第5,480,640号、米国特許第5,190,751号、米国特許第4,959,210号、米国特許第5,609,868号、米国特許第5,028,422号、およびその他を含む。
【００１１】
米国特許第5,723,125号は、ペプチドリンカーを介してヒト免疫グロブリンＦｃフラグメントに接続された野生型ヒトＩＦＮαを含む融合タンパク質について記述している。ＩＦＮαドメインは、特許請求した融合タンパク質においてＦｃドメインに対してＮ末端配向されている。
【００１２】
米国特許第6,204,022号は、特に１９、２０、２２、２４および２７の位置でＷＴからの置換を有し、生物学的アッセイにおいて低減された細胞毒性を特徴とするＩＦＮα類似体について記述している。
【００１３】
「ヒトＦｃ融合タンパク質」の一般的なカテゴリーおよびそれらの産生のための適当なベクターは、先に記述されている[米国特許第5,541,087号、米国特許第5,726,044号、Loら(1998年)Protein Engineering 11：495〜500頁]。
【００１４】
(発明の概要）
本発明は、アミノ酸置換を含むヒトインターフェロンアルファ２分子を提供する。アミノ酸置換は改良された特性をタンパク質に与える。改良された特性は、タンパク質の特定の生物活性に関し、タンパク質の免疫原性の特性にも関する。
【００１５】
本発明の分子はヒトＩＦＮαムテインに連結されたヒト免疫グロブリン定常領域部分を含む融合タンパク質である。
【００１６】
本発明の分子は新規かつ進歩性のある特性を有する。そのような分子は、疾患を有する患者、特にＣ型慢性肝炎ウイルス感染患者に恩恵をもたらすことができる。
【００１７】
本発明の分子は本明細書に配列番号２〜22として定義されるタンパク質配列を特徴とする。
【００１８】
本発明の分子はさらに、信号伝達アッセイにおける相対活性が1.3倍超と10倍との間であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、信号伝達アッセイにおける相対活性は、２倍または３倍または５倍または７倍または10倍または17倍である。
【００１９】
本発明の分子はさらにまた、抗ウイルスアッセイにおける相対活性が２倍と36倍との間であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、抗ウイルスアッセイにおける相対活性は、２倍以上、または３倍以上、または４倍以上、または７倍以上、または約36倍である。
【００２０】
本発明の非常に好ましい分子は、配列番号２のタンパク質配列を特徴とし、さらに、相対活性が信号伝達アッセイにおいて９倍超であり、抗ウイルスアッセイにおいて相対活性が約36倍であり、抗増殖アッセイにおいて約１であることを特徴とする。
【００２１】
本発明の別の好ましい分子は、配列番号３のタンパク質配列を特徴とし、さらに、相対活性が信号伝達アッセイにおいて1.3倍超であり、抗ウイルスアッセイにおいて相対活性が約7.4倍であり、抗増殖アッセイにおいて約１であることを特徴とする。
【００２２】
本発明の分子はさらにまた、抗増殖アッセイにおける活性がｍｌ(ミリリットル)あたりインターフェロンα１３ｐｇ(ピコグラム)と１６ｐｇの間であることを特徴とする。本発明の最も好ましい分子はまたさらに、ヒト細胞において低減された免疫原性を示すために表された配列を含むことを特徴とする。
【００２３】
まとめると本発明は下記の課題に関する；
・１つまたは複数のアミノ酸置換を含むヒトインターフェロンアルファ２の生物活性を有する修飾インターフェロンアルファ２分子、
・ヒトインターフェロンアルファ２の生物活性を有し、ヒト免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)ドメインを含み、上記または下記に特定されるようなインターフェロンアルファ２ドメイン内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む修飾インターフェロンアルファ２分子、
・ヒトインターフェロンアルファ２の生物活性を有し、ヒトＦｃドメインを含み、インターフェロンアルファドメイン内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、そして、特に本発明のアミノ酸置換を含まないインターフェロンアルファ分子と比較して、ヒトに対する低減された免疫原性を示すことをさらに特徴とする修飾インターフェロンアルファ２分子、
・改良された特性を有するＩＦＮαムテインを回収するための、下記を含む一般的な方法：
ａ)Ｔ細胞エピトープの同定、
ｂ)Ｔ細胞エピトープ領域内において１つのアミノ酸置換を行い、機能的に活性のムテインを選択すること、
ｃ)任意選択で、Ｔ細胞活性化に関与する重要な残基についての細密なマッピング研究を行い、二重または三重のより多くの置換体を免疫原性に関して検査すること、
ｄ)多重置換ムテインとしての構成のために最も好都合な機能および免疫原性プロフィールを有するムテインを選択し、前記新たなタンパク質の機能検査をすること、
ｅ)経時的免疫原性アッセイを用いて、機能的に活性な多重置換ムテイン配列を、低減された免疫原性について検査すること。
【００２４】
・下記構造の修飾インターフェロンアルファ２分子。
【００２５】
【化１】
【００２６】
（式中、
Ｘ0＝ＦｃまたはＦｃリンカー、
Ｆｃ＝抗体のＦｃドメイン
リンカー＝６から２５個のアミノ酸からなるリンカーペプチド
Ｘ1＝Ｉ、Ｑ
Ｘ2＝Ｈ、Ｙ
Ｘ3＝Ｉ、Ｔ；
Ｘ4＝Ｆ、Ｔ、Ａ
Ｘ5＝Ｗ、Ｈ；
Ｘ6＝Ｙ、Ｄ；
Ｘ7＝Ｉ、Ｎ、Ｔ、Ｐ、Ｒ
Ｘ8＝Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｄ、Ｓ、Ｎおよび
Ｘ9＝Ｎ、Ｓ；
ただし、同時にＸ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝ＮであるＩＦＮα分子を除外する、換言すれば、野生型ＩＦＮ融合タンパク質を除外する）。
【００２７】
特に、本発明は下記に関する
・Ｘ5＝ＨおよびＸ8＝ＮであるＩＦＮα２ムテイン
・Ｘ3＝ＴおよびＸ4＝ＡであるＩＦＮα２ムテイン
・下記の化合物からなる群から選択したＩＦＮα２ムテイン
(i)Ｘ1＝Ｑ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｒ、Ｘ8＝ＮおよびＸ9＝Ｎ
(ii)Ｘ1＝Ｑ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
(iii)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｔ、ＲまたはＮ、Ｘ8＝ＮおよびＸ9＝Ｎ
(iv)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
(v)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｙ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｔ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
(vi)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｐ、ＴまたはＮ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
(vii)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
(viii)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
(ix)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
(x)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝Ｔ、Ｓ、Ｎ、ＨまたはＤおよびＸ9＝Ｎ
(xi)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
(xii)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｄ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
・Ｆｃがヒト免疫グロブリン重鎖定常領域ドメインであるＩＦＮα２ムテインであって、前記ドメインはそのＣ末端によって前記ムテインに連結されているムテイン
・Ｆｃドメインが単量体であるＩＦＮα２ムテイン
・リンカーペプチドが12から20個のアミノ酸からなるＩＦＮα２ムテイン
・リンカーペプチドが(Ｇ)４Ｓ(Ｇ４)Ｓ(Ｇ４)ＳＧであるＩＦＮα２ムテイン。
【００２８】
疑念回避のため、発明の実施形態であるところの、ＩＦＮα２の特に有利なムテインは、図１の詳細を特徴とする。
【００２９】
本発明の突然変異タンパク質は、当技術分野においてよく知られる組換えＤＮＡ手法を用いて容易に作られ、本発明は、そのような分子の組換え産生のための方法を提供する。
【００３０】
この発明が修飾ＩＦＮα２に関するものであるかぎり、そのような修飾ＩＮＦα２タンパク質を含む組成物または修飾ＩＦＮα２タンパク質のフラグメントおよび関連組成物は、本発明の範囲内であると見なされるべきである。もう１つの態様では、本発明は修飾ＩＮＦα２実体物をコードする核酸に関する。別の態様では、本発明は修飾ＩＦＮα２タンパク質を用いたヒトの治療処置のための方法に関する。
【００３１】
(発明の詳細な説明)
自然界において、成熟したＩＦＮα２タンパク質は、165個のアミノ酸の単一ポリペプチドである。数種の異なるサブタイプのヒトＩＦＮα２が知られおり、それぞれ一次アミノ酸配列において若干の差異を示す。例えば、ＩＮＦα２ａとＩＮＦα２ｂは、成熟タンパク質鎖の位置23の１つの残基においてのみ異なり、ＩＮＦα２ａではリジン、ＩＮＦα２ｂではアルギニンである。本発明の開示はＩＮＦα２ｂの配列に向けられるが、あらゆる実際的な目的において、ＩＦＮα２ａの配列を本発明の対象のＩＮＦα２ｂサブタイプと交換可能に考えてよいことがわかるであろう。ＩＮＦα２ｂのアミノ酸配列(一文字コードで示す)は以下の通りである：
【００３２】
【化２】
【００３３】
用語「ＩＦＮα」は、ここではヒトインターフェロンアルファ２を表すために用いられる。いくつかの場合では、この用語はより広く用いられて、インターフェロンアルファ部分およびまたは特にインターフェロンアルファムテインを含む融合タンパク質を含むこともある。
【００３４】
用語「ムテイン」は、ここでは上記の天然配列とは異なる１つまたは複数のアミノ酸置換を含むように設計されたＩＦＮαタンパク質を表すために用いられる。
【００３５】
ここで用いられる用語「ペプチド」は、２個またはそれ以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸はペプチド結合によって互いに連結されている。
【００３６】
ペプチド結合は、すべてのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の直鎖骨格構造においてアミノ酸間の唯一の共有結合連結である。ペプチド結合は、共有結合であり、構造においては平面状であり、化学的には置換アミドを構成する。「アミド」は、基−ＣＯＮＨ−を含む有機化合物の一群のすべてものである。
【００３７】
20種の異なる天然存在アミノ酸がペプチドの生物学的産生に関与し、それらはどんな順番にいくつ連結しても、ペプチド鎖または環を形成しうる。ペプチドの生物学的産生に用いられる天然存在アミノ酸はすべてＬ立体配置を有する。合成ペプチドは、従来の合成方法を用い、Ｌアミノ酸、Ｄアミノ酸または２つの異なる立体配置のアミノ酸の多様な組合せを利用して作製することができる。いくつかのペプチドは、わずかに２、３個のアミノ酸単位のみを含む。短いペプチド、例えば10個未満のアミノ酸を有するものは、ときに「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは、多数のアミノ酸残基、例えば100個までまたはそれを超えるアミノ酸残基を含み、「ポリペプチド」と呼ばれる。慣例では、「ポリペプチド」は３個またはそれ以上のアミノ酸を含むいかなるペプチド鎖と考えてもよく、一方、「オリゴペプチド」は、通常は「短い」ポリペプチドの特定のタイプとして考えてもよい。このように用いられるので、「ポリペプチド」に対するあらゆる言及はオリゴペプチドをも含む。さらに、「ペプチド」に対するあらゆる言及は、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を含む。アミノ酸の異なる配列はそれぞれ、異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。ポリペプチドの数および形成できる異なるタンパク質の数は事実上無限である。
【００３８】
ペプチド結合がアミノ酸間の唯一の連結構造であるので、すべてのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、「Ｎ末端」または「Ｎ末端」残基および「Ｃ末端」または「Ｃ末端残基」と従来から呼ばれる定義された末端を有する。Ｎ末端残基は遊離アミノ基を有し、一方Ｃ末端残基は遊離カルボキシル基を有する。
【００３９】
したがって、すべての連続したアミノ酸の配列はＮ末端からＣ末端への配向性を有する。融合タンパク質が構成される場合すなわち異なるドメインが１つのタンパク質種内で接続されている場合、それらの相対的配向を「Ｎ末端」または「Ｃ末端」として記述してもよい。
【００４０】
用語「融合タンパク質」は、ここでは単一のポリペプチド鎖内に２個またはそれ以上の機能的に区別されるタンパク質ドメインを含むタンパク質分子を指すために用いられる。融合タンパク質のタンパク質部分は、直接に結合していてもよいし、リンカーペプチドを介して合体されていてもよい。
【００４１】
「リンカー」または「リンカーペプチド」は、ここでは融合タンパク質の２つの部分を合体するペプチドセグメントを指す。この発明に適したリンカーペプチドは、５〜25個のアミノ酸、好ましくは10〜20個のアミノ酸、さらに好ましくは15〜20個のアミノ酸を有するペプチドを含む。リンカーペプチドの１つの例は、一般式((Ｇ)4Ｓ)xＧであり、ここでｘは１、２、３または４である。本発明において好ましいリンカーペプチドは、(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4ＳＧである。しかし、10個を超えるアミノ酸を有する先行技術の他のリンカーペプチドも好適である。
【００４２】
米国特許第5,723,125号は、リンカー配列がＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであるＩＦＮ−Ｌ−Ｆｃ(ここで、Ｌ＝リンカー)型のハイブリッドインターフェロン分子を特許請求している。前記のリンカーは16残基であり、「比較的長い」とみなされる。上記のリンカーは、Hustonら[Hustonら(1988年)Proc Natl.Acad.Sci.USA 85：5879頁]によって記述されたよく知られたペプチドリンカー(ＧＧＧＧＳ)3の変異体である。このリンカーのさらに短い配列変異体が知られている。例えば、(ＧＧＧＧＳ)ｎであり、ここで５個、10個または15個の残基を与えるようにｎ＝１、２または３である[Holliger, P.ら(1993年)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90：6444頁］。４個の残基(ＧＧＧＧ)を含むこのリンカーの特に短いバージョンは、米国特許第6,686,179号で用いられている。
【００４３】
当技術分野で認識されるペプチドリンカーの他の例は次のすべてを含む：
(Ａ)3、(Ａ)4、(Ａ)5、ＧＧ、ＧＳ、ＧＧＧ、(Ｇ)7、ＧＰＧ、ＧＧＰＧＧ、ＥＦＧＧＧＧＧＴＡ。
【００４４】
融合タンパク質は、組換えＤＮＡ手法の手段によって広く生成されており、したがって、自然界に直接の対応物を有していない人工タンパク質であると考えることができる(天然融合タンパク質は、例えば、染色体転座によって発生しうるが、ここでは考慮しない)。融合タンパク質の１つの例は、免疫グロブリンＦｃ領域がＩＦＮαのような別のタンパク質のＮ末端に置かれた融合体である。そのような融合体は「Ｆｃ−Ｘ」融合体と呼ばれる。ここで、Ｘは(ＩＦＮαのような)リガンドである。Ｆｃ−Ｘタンパク質は多くの特有の有利な生物学的特性を有している。特に、そのような融合タンパク質でも細胞表面の関連Ｆｃレセプターと結合することができるが、リガンドがそのレセプターに結合すると、Ｆｃ領域の配向が変わり、抗体依存細胞介在性細胞毒性および補体結合が、Ｆｃドメインに存在する配列によって活性化されるようになる。Ｆｃ−Ｘ融合体は本発明では好ましい。
【００４５】
用語「免疫グロブリン」は、ここでは免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指すために用いられる。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４)、σ、εおよびμ定常領域遺伝子および自然界では多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。
【００４６】
用語Ｆｃは、ここでは免疫グロブリン重鎖定常領域ドメインを指すために用いられ、抗体のＦｃ部分の単量体型だけでなく二量体型も含む。単鎖Ｆｃ融合体(単量体)型が好ましい。
【００４７】
用語「Ｔ細胞エピトープ」は、この発明の理解に従えば、ＭＨＣクラスIIと結合することができ、Ｔ細胞を刺激することができ、かつ／またはＭＨＣクラスIIと複合してＴ細胞に結合(必ずしも測定可能に活性化せずに)することができるアミノ酸配列を意味する。
【００４８】
「実質的に非免疫原性」または「低減された免疫原性能」への言及は、検査部分の野生型または天然アミノ酸配列を含む融合タンパク質にまたは親タンパク質に比較して低減された免疫原性を含む。
【００４９】
用語「免疫原性」は、宿主動物、特に「宿主動物」がヒトである場合において、体液性およびまたはＴ細胞介在性応答を誘発、誘起またはさもなくば促進する能力を含む。
【００５０】
用語「Ｔ細胞アッセイ」および「免疫原性アッセイ」は、免疫反応性のex vivo測定手段に関する。したがって、これらは、検査免疫原、例えば、タンパク質またはペプチドを生体ヒト免疫細胞に接触させ、その反応性を測定することを含む。誘起された反応性の典型的なパラメータは増殖である。適する対照を決定することはアッセイにおいて重要であり暗黙の絶対的な条件である。
【００５１】
「経時的アッセイ」は、ある時間にわたって連続的に測定を行う増殖アッセイのような生物学的アッセイを指す。本文脈においては、「経時的Ｔ細胞アッセイ」は、検査免疫原(ペプチド)への曝露に続いて多数回にわたる検査免疫原に応答したＴ細胞増殖の測定を指す。用語「経時的Ｔ細胞」および「経時的免疫原性アッセイ」は、ここでは交換可能に用いてもよい。
【００５２】
Ｔ細胞アッセイを表現する１つの慣用法は、「刺激指数」すなわち「ＳＩ」を用いることによる。刺激指数(ＳＩ)は、従来から、ペプチドのような検査免疫原に対して測定した増殖スコア(例えば、3Ｈ−チミジン取り込みを用いる場合には、放射線の一分間あたりの計数)を、検査免疫原と接触さていない細胞において測定されたスコアによって除算することによって導出される。応答をまったく惹起しない免疫原(ペプチド)はＳＩ＝1.0となるが、実際には0.8〜1.2の範囲のＳＩ値は一般的である。本発明者らは、そのような免疫原性アッセイの操作において、2.0以上の刺激指数が有意の誘起増殖の有用な目安であることを確立した。
【００５３】
ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞、特にドナーの血液試料から得られたものを意味する。ＰＢＭＣは、当分野でよく理解された濃度勾配遠心法を用いて全血液試料から容易に単離され、大量のリンパ球(ＢおよびＴ細胞)および単球を含む。他の細胞型も表される。
【００５４】
「相対活性」は、本文脈においては、いかなるアッセイにおいても検査タンパク質について測定された活性が、同じアッセイにおいて、通常は平行して行われ、ポジティブコントロールタンパク質について測定された活性に相対的に表現されるものである。したがって、検査タンパク質およびコントロールタンパク質の測定活性が同じ場合、相対活性は１であるという。
【００５５】
抗ウイルスアッセイは、対象とする検査タンパク質に関して、ウイルス物質が適当な宿主細胞に対して機能することを阻害する何らかの能力を測定する生物学的アッセイである。そのようなアッセイは、一般に、抗ウイルス活性が、細胞変性を引き起こす投与量のウイルスの存在下において、延長された細胞生存または増殖と同等となるように設定される。これを有用な尺度とするために適した対照検査を平行して行う。適した対照測定の存在はアッセイにおいて重要であり暗黙の絶対的な条件である。ある１つの特に適した抗ウイルスアッセイがRubinsteinらによって記述されており[Rubinstein Ｓら(1981年)J Virol.37：755から758頁]、ここに例示される。他のアッセイ方式を考えることが可能であり、それらもＥＤ50測定を可能にする検査分子の特定の活性の定量的な推定値を与える。
【００５６】
本文脈による「信号伝達アッセイ」は、生きた細胞内における特定の測定可能な応答を惹起する検査タンパク質の能力の指標を与えることができる生物学的アッセイを意味する。特に、検査タンパク質を細胞の外表面に接触させ、測定される応答は、１つの非常に小さい特定のレセプタータンパク質と、転写因子のような細胞の内部にある多数の細胞性因子とが関与することによってのみ発生可能な現象とする。ひとまとめにしてレセプターおよび他の多数の細胞性因子は「信号伝達経路」を構成し、そのような経路は、機能的に活性なＩＦＮタンパク質によって活性化されることが知られている[Williams, B.R.(1991年)Eur.J.Biochem.15：１〜11頁；David, M.(1995年)Pharmacol.Ther.65：149〜161頁]。特に適した信号伝達アッセイをここに例示し、他のアッセイ方式も、検査分子の特定の活性の定量的な推定値を与えることが考えられる。
【００５７】
「抗増殖」アッセイは、対象とする検査タンパク質に関して、指標培養細胞の生育を阻害する何らかの能力を測定する生物学的アッセイである。これを有用な尺度とするために、適したコントロール検査を平行して行う。ある１つの特に適した抗増殖アッセイがMarkらによって記述されており[Mark, D.F.(1984年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：5662〜5666頁]、ここに修飾した型で例示する。他のアッセイ方式を考えることが可能であり、それらも、ＥＤ50測定を可能にする検査分子の特定の活性の定量的な推定値を与える。
【００５８】
もう１つの態様では、本発明は修飾ＩＦＮα実体物をコードする核酸に関する。そのような核酸は好ましくは発現ベクターに内包される。原核生物に適したコントロール配列は、例えば、プロモーター、任意選択でオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化信号を利用することが知られている。そのような核酸は一般に、選択手段、典型的には、宿主細胞の生存を助けることができるタンパク質をコードする付加的な遺伝子を含む。そのような選択遺伝子の一例は、いくつかのE.coli宿主細胞に適したベータラクタマーゼであり、この遺伝子や他のものは当技術分野においてよく知られている[「Molecular Cioning：A Laboratory Manual」第２版(Sambrookら、1989年)「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M.Miller ＆ M.P.Calos編、1987年)「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubelら編、1987年)]。核酸は、別の核酸配列との機能的な関係におかれると、機能できる形で連結される。例えば、プレ配列すなわち分泌リーダー配列のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに機能できる形で連結されており、プロモーターやエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合、配列に機能できる形で連結されており、あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易化するように位置される場合、コード配列に機能できる形で連結されている。一般に、「機能できる形で連結」とは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダー配列の場合では、隣接しておりかつ同一の読み枠内にあることを意味する。しかしエンハンサーは隣接している必要はない。連結は都合のよい制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合には合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来からの常法に従って使用する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、発現制御配列に機能できる形で連結されたＩＦＮα変異体をコードする核酸配列を含む。多様な実施形態では、発現ベクターは、配列番号２から配列番号22までを包含的に含む群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む。そのような発現ベクターは、適した発現制御および選択配列に機能できる形で連結された前記複数のタンパク質のうちの１つのタンパク質のＩＦＮαコードドメインを少なくとも含む。そのような発現ベクターは、核酸の縮重バージョンを含み、ここで、ポリヌクレオチドに関する縮重とは、遺伝暗号において多くのアミノ酸が複数のコドンにより特定されるというよく認識された事実を指している。暗号の縮重は、ＤＮＡを構成する４種の異なる塩基によって可能な64種のトリプレット配列を用いた20種の異なるアミノ酸がコードされていることを物語るものである。
【００６０】
本発明のもう１つの態様は、上記ベクターの少なくとも１つを含む培養細胞である。
【００６１】
本発明の別の態様は、修飾ＩＦＮαを調製するための方法であって、前記発現ベクターからのＩＦＮαの発現を可能にする条件下で上記細胞を培養することと、細胞からＩＦＮαを精製することとを含む方法である。
【００６２】
別の態様では、本発明は、ＩＦＮα組成物を使用したヒトの治療処置のための方法に関する。個人への投与のために、いかなる修飾組成物も、好ましくは少なくとも80％の純度であり、発熱因子や他の混在物を含まないように製造される。また、ＩＦＮαタンパク質の治療用組成物は、医薬的に許容される賦形剤と共に使用してもよいことが理解される。本発明による医薬組成物は、従来法により調製され、賦形剤、担体、アジュバントおよび緩衝剤など、医薬品において通常に使われる物質、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(Alfonso R. Gennaro編、第18版、1990年)を含む。組成物は、例えば、ある効果を達成するために有用な非経口、経腸、筋肉内、皮下、静脈内または他の経路によって投与してもよい。従来の賦形剤は、作用剤と有害な反応をすることのない非経口、経腸および他の投与経路に適した医薬的に許容される有機または無機担体物質を含む。非経口的適用では、注射用滅菌液、好ましくは、油または水溶液、および懸濁液、乳化液や、座薬を含むインプラントが特に適している。アンプル剤は便利な単位用量投与法である。医薬調製物は、滅菌することが可能であり、所望により、活性な化合物と有害な反応をしない安定化剤や、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、または他の物質と混合することができる。
【００６３】
本発明の主要な実施形態は、配列番号２〜22のタンパク質配列によって達成される。タンパク質は、融合タンパク質「Ｆｃ−Ｘ」であり、本例におけるＸはＩＦＮαムテインである。そのような融合タンパク質は、野生型(ＷＴ)ＩＦＮα部分を含む融合タンパク質と比べて、増大した活性を示すことが見出されている。本発明者らによって構築された「ＷＴ」または「天然」融合タンパク質は、ここにＩＦＮ120(配列番号23)およびＩＦＮ５(配列番号１)と名付け、(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4ＳＧ構造のリンカーペプチドの有無についてのみ異なる。明言するとＩＦＮ５はリンカーを含まない。
【００６４】
信号伝達アッセイを用いて、天然融合タンパク質は、リンカーのあるものないものどちらも、4.5および５ｎｇ/ｍｌという非常によく似たＥＤ50値を有することが見出されている。この知見は、天然ＩＦＮαに関しては、ＦｃとＩＦＮα分子の間のリンカーの存在は、活性に対して何ら効果を有していない。
【００６５】
対照的に、幾分驚くべきことであるが、本発明の最も好ましい分子ＩＦＮ３１１(配列番号３)およびＩＦＮ３１６(配列番号２)は、信号伝達アッセイにおいて3.4および0.5ｎｇ/ｍｌというＥＤ50値を有し、したがって、コントロールの＞１．３倍および＞９倍の活性であることが見出された。これらの分子がＩＦＮαムテインであるとすると、これらの結果は、配列に対する変更が活性に対して有益な効果をもたらしたことを示唆する。
【００６６】
２つまたは３つまたは４つまたは５つのアミノ酸置換を含む他のＩＦＮαムテインも、信号伝達アッセイについて改良された相対活性を有することが見出された。各２つの置換を含む例は、ＩＦＮαタンパク質ＩＦＮ１９７(配列番号12)、ＩＦＮ２０１(配列番号11)、ＩＦＮ２０２(配列番号10)、ＩＦＮ３０６(配列番号４)を含み、それぞれ２、７、５および４倍の改良を活性において示す。また、各３つの置換を有するタンパク質ＩＦＮ１７３(配列番号15)、ＩＦＮ１７６(配列番号13)、ＩＦＮ２１９(配列番号９)は、それぞれ10、５および17倍の改良を活性において示す。４つの置換を有するＩＮＦαタンパク質ＩＦＮ１７４(配列番号14)は、信号伝達活性において５倍の改良を示した。
【００６７】
信号伝達アッセイにおける活性についてのそのような有益な効果は、複数の置換を含むムテインにとどまらない。すなわち、例えば、１つの突然変異体ＩＦＮαタンパク質ＩＦＮ２８(配列番号22)は、10倍増大した相対活性を示す。同様に、信号伝達活性について、タンパク質ＩＦＮ６４(配列番号21)は３倍超増大した活性を示し、ＩＦＮ１６４(配列番号20)は３倍増大した活性を示し、タンパク質ＩＦＮ１６７(配列番号19)とＩＦＮ１６８(配列番号18)は両方とも２倍の改良を示し、タンパク質ＩＦＮ１７１(配列番号17)は４倍の改良を示し、タンパク質ＩＦＮ１７２(配列番号16)は７倍の改良を示す。
【００６８】
信号伝達活性は、ＩＦＮαタンパク質の機能性の有用な指標であり、ＩＦＮαムテインに対する迅速スクリーニングアッセイとして本発明者らによって使用されているが、一方で、抗ウイルス活性は、ＩＦＮαの力価を測定するための認知された国際標準であり、ある程度まで、可能な臨床活性のより現実的な代用法である。抗ウイルス活性は、したがって、異なるＩＦＮα分子の活性を比較するために使うことが可能であり、本発明者らは本件においてそれを用いて、本発明の最も好ましい分子が、臨床的に有効とされたＩＦＮα調製物の範囲内で活性を示すことを確認した。より具体的に言えば、融合タンパク質ＩＦＮ３１６は13％標準活性を有し、一方、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ(登録商標)、Ｐｅｇａｓｙｓ(登録商標)およびＡｌｂｕｆｅｒｏｎ(登録商標)は、それぞれ28％、10％および７％を有すると報告されている[Osborn BLら(2002年)J Pharmacol Exp Ther.303：540〜548頁；Grace Mら(2001年)J Interferon Cytokine Res.21：1103〜1115頁；Bailon Pら(2001年)Bioconjug Chem.12：195〜2029頁、10、11]
タンパク質の抗ウイルス活性は、インターフェロンレセプターから細胞の核内の新しい遺伝子発現までの細胞内信号伝達経路を惹起するタンパク質の能力の関数である。信号伝達活性および抗ウイルス活性における改良の間の一致は、予想された結果であり、本発明のＩＦＮαムテインに当てはまることが示されている。したがって、ＩＦＮαタンパク質である、各５つの置換を有するＩＦＮ２７０(配列番号７)、ＩＦＮ２７３(配列番号６)およびＩＦＮ２７６(配列番号５)は、相対信号伝達活性においてそれぞれ２倍、３倍、同じく３倍の改良を示し、一方で、相対抗ウイルス活性においてそれぞれ６倍、４倍超、同じく４倍超の改良を示した。１つのＩＦＮαムテインは、信号伝達活性においてはコントロールと等しく、まったく改良を示さなかったが、抗ウイルス活性においては２倍超(約2.8倍)の改良を示した。このムテインは、タンパク質ＩＦＮ２４８(配列番号８)であり、３つの置換を含んでいた。
【００６９】
本件のＩＦＮαムテインは、親分子よりも免疫原性を低くして構築された。個々のムテインの設計は、機能的活性のデータに加えて免疫学的考慮から方向付けを行った。分子内の免疫的に重要な３つの領域を、健康なドナーおよび治療的ＩＦＮα ＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標)を過去に受けたことのある個人の両方からのＰＢＭＣ調製物を使ったスクリーニングアッセイを用いて規定した。大まかに言えば、３つの同定された免疫原性遺伝子内に突然変異を含むＩＦＮαムテインを構築した。残基は、ＨＬＡ−ＤＲ分子の公知の結合特性、すなわち、それらの分子はポケット１内に疎水性アミノ酸に対するほぼ排他的な優先度を有しさらにこれがペプチド結合の最も重要な決定因子であるという特性に基づいて標的化した[Jardetzky, T.S.ら(1990年)EMBO J.9：1797〜1803頁；Hill、C.M.ら(1994年)J.Immunol.152：2890〜2898頁]。徹底的な突然変異解析によって、これらの領域内において融合タンパク質の活性に悪影響を及ぼすことなく改変されうる残基を同定した(表２)。代替残基の選定は、解明されたＮＭＲ構造における標的の位置[Klaus, Wら(1997年)J Mol.Biol.274：661から675頁]と、他のヒトＩＦＮαタンパク質および他の種からの同タンパク質との比較とによって案内された。埋没残基を、アラニンまたは似た大きさの非疎水性残基のどちらかで置き換え、一方、露出残基をすべての可能な非疎水性代替物でスキャンした。
【００７０】
Ｔ細胞アッセイを、ヒトＴ細胞の機能的活性化に関与する重要な残基の細密なマッピングを可能にするための方式で適用した。この研究は、問題とされる領域のスキャンのために変異合成ペプチド族のファミリーを使いかつ公知の応答性ドナー試料を用いて行った。突然変異スキャニングＴ細胞アッセイは、活性のデータが既に得られていて選定を案内できる場合を除いて、スキャニングアミノ酸としてアラニンを用いて実行した。そのようなアプローチは、その場所を含むＴ細胞エピトープの免疫原性に対する個々のアミノ酸残基の貢献を明らかにすることができる。免疫原性に関与する重要な残基を改変することは最も望ましいであろうが、一方で、これは、タンパク質の機能を保持することと常に両立するとは限らない。多くの置換を採用して、それらの置換は単独では免疫原性を消すことはできないにもかかわらず、それらの組合せが、本来免疫原性の領域の免疫原性能を低下させる効果を有するということが可能である。本件では、組合せ突然変異体のＴ細胞アッセイ(表５)に先立つエピトープ細密マッピング研究(表４)によって、機能を保持しかつ問題とされる領域において低減された免疫原性を示すことが最もよくできる置換の組合せを規定することができた。
【００７１】
さらに補強のＴ細胞アッセイを、多数の突然変異セット(表３)のすべての組合せを含む合成ペプチドを用いて行い、最も望ましい置換セットにおいて低減された免疫原性を示した。これら後者のアッセイは、合成ペプチドを用いて行い、合成ペプチドは、その分子の３つの免疫原性領域のそれぞれに跨っており、さらに、健康なドナーおよび過去にＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標)で治療されたことのある患者の両方からのＰＢＭＣを用いて経時的Ｔ細胞アッセイとして実行した。Ｔ細胞アッセイにおいて精製タンパク質を検査することは、それらの抗増殖性特性のために不可能であると認識されるであろう。
【００７２】
従って、改良された特性を有するＩＦＮαムテインの回収のための一般的な方法は：
ａ)Ｔ細胞エピトープの同定、
ｂ)Ｔ細胞エピトープ内で単一のアミノ酸置換を行い、機能的に活性なムテインを選択すること、
ｃ)任意選択で、Ｔ細胞活性化に関与する重要な残基の細密マッピング研究を行い、(任意選択で)免疫原性のための二重または三重のより多くの置換を検査すること、
ｄ)多重置換されたムテインとしての構成のために最も好都合な機能および免疫原性プロフィールを有する個々のムテインを選択し、前記新たなタンパク質の機能検査をすること、
ｅ)経時的免疫原性アッセイを用いて、機能的に活性な多重置換ムテイン配列を、低減された免疫原性について検査すること。
【００７３】
まとめると、本発明者らは、下記の構造で表すことができる改良されたＩＦＮαタンパク質を規定することができた。
【００７４】
【化３】
【００７５】
ここで、
Ｘ0＝ＦｃまたはＦｃ−リンカーであり、
Ｆｃ＝抗体のＦｃドメイン
リンカー＝６から２５個のアミノ酸からなるリンカーペプチド
Ｘ1＝Ｉ、Ｑ
Ｘ2＝Ｈ，Ｙ
Ｘ3＝Ｉ，Ｔ；
Ｘ4＝Ｆ，Ｔ，Ａ
Ｘ5＝Ｗ，Ｈ；
Ｘ6＝Ｙ，Ｄ；
Ｘ7＝Ｉ，Ｎ，Ｔ，Ｐ，Ｒ
Ｘ8＝Ｌ，Ｔ，Ｈ，Ｄ，Ｓ，Ｎおよび
Ｘ9＝Ｎ，Ｓ；
ただし、条件として同時にＸ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝ＮであるＩＦＮα分子を除外する。
【００７６】
下記の図、配列リストおよび実施例は本発明の理解を助けるために設ける。本発明の精神から逸脱することなく示された手順に修飾を加えることが可能であることは理解されている。
【００７７】
(配列の説明)
本発明の理解を助けるために、下記の表１は融合タンパク質ＩＦＮαムテインを説明するものである。これらのタンパク質の由来および特性は実施例の中でもさらに詳細に開示される。
【００７８】
【表１】
【００７９】
(図の説明)
図１は、本発明の好ましいＩＦＮαムテインのそれぞれの相対生物学的活性を示す。クローンＩＤ番号および各クローン内で行われた置換は図示の通りである。図は、実施例に述べた生物学的アッセイを用いてＩＦＮレセプター介在細胞活性(＝信号伝達アッセイ)、抗ウイルス活性および抗増殖活性について求めた相対活性を示す。すべての活性は、Ｆｃ−ＩＦＮαタンパク質ＩＦＮ５に相対的に表されており、ＩＦＮ５は、Ｎ末端Ｆｃドメインに直接融合されたＷＴ ＩＦＮα部分を有する。
【００８０】
図２は、細胞培養上清のレセプター信号伝達アッセイの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞は、ＩＦＮ５、ＩＦＮ１２０、ＩＦＮ３１６およびＩＦＮ３１１をコードするプラスミドで過渡的に形質移入した。上清中のタンパク質濃度は、Ｆｃ ＥＬＩＳＡで定量し、２００ｎｇ/ｍｌに希釈した。活性は３倍段階希釈による滴定で測定した。
【００８１】
図３は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＩＦＮα２ａに対する精製ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６の活性の比較を示す
(a)レセプター信号伝達アッセイ。滴定を200ｎｇ/ｍｌから始め、続いて３倍段階希釈を行った。
【００８２】
(b)Daudi細胞抗増殖アッセイ。滴定を200ｎｇ/ｍｌから始め、続いて４倍段階希釈を行った。
【００８３】
(c)抗ウイルスアッセイ。初濃度を、ＩＦＮ３１１には250ｐｇ/ｍｌ、ＩＦＮ３１６には62.5ｐｇ/ｍｌ、ＩＦＮα２ａには6.25ｐｇ/ｍｌとし、滴定を２倍段階希釈で行った。各グラフは、３回の実験から平均によって得たデータを示す。
【００８４】
図４は、合成ペプチド(ＮＢ：ペプチド配列を表３に示す)を用いた経時的免疫原性アッセイの結果を示す。20人の健常人と20人のＨＣＶ患者(ＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標)で治療)を用いて、野生型および修飾ＩＦＮαペプチドの免疫原性を評価した。ＰＢＭＣの増殖を、刺激後の第６、７、８および９日目のトリチウムチミジン取り込みによって評価した
(a)領域１、２および３に跨がるペプチドによる刺激の後での健常人からの正の応答(ＳＩ＞２)。
【００８５】
(b)領域１、２および３に跨るペプチドによる刺激の後でのＨＣＶ患者からの正の応答(ＳＩ＞２)。
【００８６】
(c)領域１、２および３に跨るペプチドに対して、20人の健常人と20人のＨＣＶ患者の一群からいかなる時点でもＳＩ＞２の応答が観察された頻度。
【００８７】
図５．１から５．１２は、本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。配列は一文字コードで示す。各融合タンパク質のＦｃおよびＦｃ−リンカー部分に下線を付けた。ＩＦＮαドメインは下線なしである。クローンＩＤ番号を各配列に対して示す。
【００８８】
(例示的実施例)
実施例１
ＩＦＮα２ｂのクローニングと突然変異誘発
本発明の修飾ＩＦＮαタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ手法を用いて作った。成熟したＩＦＮα２ｂのコード配列は、ＰＣＲを用いてヒト胎盤のＤＮＡ(Sigma社、英国プール)からクローニングした。野生型遺伝子を、コントロール試剤と、部位特異的突然変異誘発によって修飾ＩＦＮタンパク質を派生する鋳型との両方として用いた。ＷＴおよび修飾遺伝子を、発現ベクターｐｄＣ−ｈｕＦｃ[Lo K-Mら(1998年)Protein Eng 11：495〜500頁]に、ＩＦＮα２ｂ配列がヒトＩｇＧ１のヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ Ｆｃ領域に対する直接融合部となるように挿入した。このベクター内のＷＴ ＩＦＮタンパク質をＩＦＮ５と名付けた。
【００８９】
直接融合に加えて、ＣＨ３のＣ末端とＩＦＮα２ｂのＮ末端との間に可撓性リンカーを含むというベクターの修飾を行った。このリンカーのアミノ酸配列は、(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)3ＳＧであり、リンカーを有するＷＴ ＩＦＮタンパク質をＩＦＮ１２０と名付けた。突然変異ＴＮタンパク質のいくつかは、両方の型のベクターで発現され、したがって、例えば、変異体ＩＦＮ３１１(配列番号３)およびＩＦＮ３１６(配列番号２)は、ＩＦＮドメイン内に同じ置換セットを含む一方で、(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4Ｓ(Ｇ）3ＳＧリンカーについて異なっている。ＩＦＮ３１１は直接融合体であり、ＩＦＮ３１６は前記リンカーを含む。
【００９０】
ＤＮＡ配列決定をすべての構築物について行った。これは、所望の置換の導入を確認しかつ、例えば、ＰＣＲのエラーによって外来性の(望まれない)置換が導入されていないことを確立するために入念に行った。
【００９１】
これらの手法の詳細と、ＷＴおよび変異ＩＦＮタンパク質のためのクローニング戦略とは、他で詳細に説明されており[WO 02/085941]、当分野では一般に理解されている。
【００９２】
(実施例２)
ＩＦＮαムテインの設計
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたＩＦＮα２ｂの変異体は、タンパク質の前記３つの免疫原性領域内に突然変異を含んで構築された。構築および機能検査が関与する突然変異解析の複数のサイクルによって、Ｆｃ連結タンパク質の活性に影響を与えることなく改変できる、これらの領域内の残基を同定した。ここに説明するような信号伝達アッセイ(実施例５を参照)はこの態様における主要なスクリーニング手段であった。突然変異解析の結果を表２に示す。
【００９３】
【表２】
【００９４】
代替残基の選定は、解明されたＮＭＲ構造における標的の位置[Klaus,Wら(1997年)J Mol.Biol.274：661から675頁]と、他のヒトＩＦＮαタンパク質および他の種からの同タンパク質との比較とによって案内された。埋没残基を、アラニンまたは似た大きさの非疎水性残基のどちらかで置き換え、一方、露出残基をすべての可能な非疎水性代替物でスキャンした。
【００９５】
領域１において、成功裏に、すなわち、活性に有意の改良をともなって、置き換えることができた唯一の疎水性残基はＩ２４であった。Ｌ２６、Ｆ２７およびＬ３０は、よく露出されていたが、おそらくは、分子間官能性を有するよく規定された疎水パッチを形成することが理由で、変更することができなかった。
【００９６】
領域２において、よく露出された残基はＦ６４のみであり、それを、活性に幾分の低下をともなってＡに変更した。残基Ｉ６０およびＩ６３は、ほとんど埋没しているが、成功裏にＴに変更することができた。Ｔは、これらの残基が存在するアルファへリックスに水素結合を加えることができる類似した大きさの残基である。残基Ｗ７６は、分子の一方の先端にむかって存在しているが、これを、活性において有意の有益性をもってＨに変更した。
【００９７】
領域３において、成功裏に改変できた残基はすべてよく露出された残基であった。Ｉ１１６およびＬ１２８への変更は、活性において有意の有益性を与え、Ｌ１１７の改変は、若干低減した活性となった。
【００９８】
免疫原性領域３について行われたスキャニングＴ細胞アッセイからのデータも含めることで、設計処理をさらに洗練させた(表４および５，実施例９参照)。免疫学的には最も好都合な単一置換はＦ１２３であったであろうが、これは、信号伝達活性のいかなる有用なレベルにも適合しなかった。対照的に、残基Ｉ１１６とＬ１２８での置換の組合せは、この領域に対するＴ細胞応答を変調することが確認された。良好な活性を示した側鎖の大きさの或る範囲を包含するために、各位置での別の置換も検査した。置換は、Ｉ１１６のＴ、ＮおよびＲへの、Ｌ１２８のＮ、ＨおよびＲへの置換であった。これらの残基の各組合せを、許容できる活性を与えた領域１および２の突然変異(Ｉ２４Ｑ、Ｉ６０Ｔ、Ｆ６４Ａ、Ｗ７６Ｈ)と共に含む９つの突然変異体を作った。
【００９９】
Ｉ１１６ＲおよびＬ１２８ＮをＩ２４Ｑ、Ｉ６０Ｔ、Ｆ６４ＡおよびＷ７６Ｈと共に含む組合せムテインを、ＦｃおよびＩＦＮα融合対の間に可撓性リンカーを含むまたは含まない方式で構築した(それぞれ、ＩＦＮ３１６およびＩＦＮ３１１)。
【０１００】
(実施例３)
融合タンパク質の形質移入と精製
ＨＥＫ２９３(ATCC＃ CRL-1573)細胞とLipofectamine 2000(Invitrogen社、英国ペーズリー)を製造元による記述のように用いて過渡的な形質移入を行った。安定的な形質移入体は、先に記述された[Baum Cら(1994年)Biotechniques 17：1058〜106224頁]ように電気穿孔法を用いてＮＳ０細胞(ECACC＃ 85110503)において作り、100ｎＭメトトレキセートを含む培養液で選択した。すべての細胞系は、10％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ内で抗生物質および抗真菌物質と共に維持した。融合タンパク質は、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａクロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)によって精製した。簡単に説明すると、１ｍｌのＰｒｏｓｅｐ(登録商標)−Ａカラム(Millipore社、英国ワットフォード)をｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化した後で、１/20倍体積の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４でｐＨ調節された０．２μＭの濾過細胞培養液上清(５００ｍｌまで)を載せた。カラムを５０ｍｌのＰＢＳ ｐＨ７．４で洗い、融合タンパク質を０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で溶出させ、０．９ｍｌ分画を集めた。分画は、すぐに０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。ＳＥＣは、０．１％のＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化および流下した３．２／３０カラムのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００(Amersham Pharmacia社、英国アマシャム)で行った。主要ピークを跨ぐ分画を集めて、融合タンパク質を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ(商標)ソフトウェア(Dnastar社、米国ウィスコンシン州マジソン)を用いて計算した２８０ｎｍでのモル吸光係数を用いて定量した。濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ(Pierce社、英国チェスター)を用いて確認した。ＩＦＮα成分は融合タンパク質の分子量の42％を示しており、したがって濃度をこの因子によって調節した。
【０１０１】
(実施例４)
細胞培養液上清中の融合タンパク質の定量
融合タンパク質を、下記の方式のＥＬＩＳＡ中のヒトＩｇＧ１ Ｆｃの量を検出することによって定量した。ＥＬＩＳＡプレート(Ｄｙｎｅｘ Ｉｍｍｕｌｏｎ４)に、ＰＢＳ ｐＨ７．４で１/1500に希釈したマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体を100μｌ/ウェルで、２時間、37℃でコーティングした。プレートを、100μｌ/ウェルのＰＢＳ／0.05％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗った。ヒトＩｇＧ標準品(The Binding Site社、英国バーミンガム)をＰＢＳ／２％ＢＳＡで２μｇ/ｍｌに希釈し、プレートの縦方向に二組２倍希釈液を作った。検査試料を、二組、ＰＢＳ／２％ＢＳＡで１/100および１/500に希釈し、アッセイした。プレートを、室温で１時間インキュベートし、前回のように洗った。100μｌ/ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ペルオキシダーゼ複合物(The Binding Site社、英国バーミンガム)のＰＢＳによる１/1000希釈液を用いて検出を行い、プレートを前回のように洗い、ＳｉｇｉｍａＦａｓｔ ＯＰＤを100μｌ/ウェル(Sigma社、英国プール)用いて発色させた。呈色反応を５０μｌの２Ｍ硫酸の添加によって止め、Ａｎｔｈｏｓ ＨＴＩＩプレートリーダーで４９２ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１０２】
(実施例５)
Ｆｃ−ＩＦＮα２ｂ活性のためのアッセイ(信号伝達アッセイ)
変異体およびＷＴ ＩＦＮ融合タンパク質をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に過渡的に形質移入し、３日後に細胞培養液上清中の融合体のＦｃ部分について定量した。上清の活性を信号伝達アッセイを用いてアッセイした。このアッセイにおける活性の測定は、細胞表面に発現されたＩ型インターフェロンレセプターの引き金を引くこと(活性化)を必要とする。活性化されたレセプターは、細胞内のＪａｋ／ＳＴＡＴ１信号伝達経路の活性化へと繋がる。経路は、タンパク質ＳＴＡＴ１のリン酸化へと達して、それがインターフェロン刺激応答要素(ＩＳＲＥ)に結合することを可能にする。ＩＳＲＥは、シス作動性のＤＮＡセグメントであり、その下流に連結された遺伝子(例えば、レポーター遺伝子)の転写を促進することができる。
【０１０３】
Ｉ型インターフェロンレセプターからの信号伝達を誘起する本発明の融合タンパク質の能力を、市販の信号伝達レポーターベクターｐＩＳＲＥ−ＴＡ−ｌｕｃ(Clonetech Europe社、ベルギー国ブリュッセル)を用いてアッセイした。ベクターは、インターフェロン刺激応答要素(ＩＳＲＥ)の制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む。ＩＳＲＥ／ルシフェラーゼカセット(ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ断片上)を、エピソームの哺乳動物発現ベクターｐＲＥＰ４(Invitrogen社、英国ペーズリー)へＲＳＶプロモーター／ＭＣＳ／ＳＶ４０ポリＡ(ＳａｌＩ分解で除去)の代わりとして移して、ｐＲＥＰ−ＩＳＲＥを作製した。このベクターをＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、安定した形質移入体を100μｇ/ｍｌのハイグロマイシンで選択してＨＥＫ−ＩＳＲＥ細胞を作製した。Ｆｃ−ＩＦＮα２ｂ活性についてのアッセイは、ＨＥＫ−ＩＳＲＥ細胞を４×１０5細胞/ｍｌの密度で、黒い壁で透明な底の96ウェル照度計プレート(Greiner社、英国グロスター、ストーンハウス)のウェルにプレーティングし(100μｌ/ウェル)て、抗生物質の非存在下の通常の条件下で24時間インキュベートすることによって行った。
【０１０４】
プレート上で、標準ＩＦＮα２ａの２×１０8ＩＵ/ｍｇ(Peprotech社、英国ロンドン)および融合タンパク質の二組段階希釈液を抗生物質なしの培養液で作り、一晩インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、製造者による指示に従って調製した100μｌのSteady-Glo試剤(Promega社、英国サウサンプトン)の添加によって検出し、Wallac Microbeta Trilux照度計を用いて発光測定を行った。
【０１０５】
図１は、各ＩＦＮαムテインの相対活性を表にしたものである。図２は、融合タンパク質ＩＦＮ５、ＩＦＮ１２０、ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６の信号伝達活性曲線を示す。これらの結果は、変異体融合タンパク質が、天然融合タンパク質(ＩＦＮ１２０およびＩＦＮ５、それぞれリンカーを有するおよび有していないもの)と比べて活性を改良させたことを示す。天然融合タンパク質は、リンカーのあるものとないものどちらも、それぞれ４．５および５ｎｇ/ｍｌという非常によく似たＥＤ50値を有し、天然ＩＦＮαに関しては、ＦｃおよびＩＦＮα分子の間のリンカーの存在は活性に対して何ら作用を有していないことを示している。ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６は、３．４および０．５ｎｇ/ｍｌのＥＤ50値を有し、したがって、コントロールの＞1.3倍および＞９倍の活性であり、配列に対する変更が活性に有益な効果をもたらしたことを示している。このアッセイにおける驚くべき結果が、天然ＩＦＮαの構成と対照的に、ＦｃおよびＩＦＮα分子の間のリンカーの存在が融合タンパク質の活性を改良した、ということに見られる。
【０１０６】
融合タンパク質ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６の信号伝達活性も、天然ＩＦＮα調製物(Perotech、英国ロンドン)と比較したが、その活性曲線を図３ａに示す。
【０１０７】
(実施例６)
修飾Ｆｃ−ＩＦＮα２ｂ融合タンパク質の活性(抗増殖)：
融合タンパク質の抗増殖特性を、Daudi細胞増殖の阻害によって評価し、次のように実行した。Daudi細胞(ATCC＃ CCL−213)を、抗体を加え10％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０(Daudi培養液)中で生育した。中間対数期の細胞を、２×１０5細胞/ｍｌに希釈し、７５μｌ/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートにプレーティングした。標準ＩＦＮα２ａ(Peprotech)および融合タンパク質の希釈液を７５μｌのDaudi培養液で三組作り、細胞に添加した。段階１/４希釈液をプレートにわたって作った。したがって、プレート毎に１つの標準品と１つの検査試料をアッセイした。プレートを３日間インキュベートした。検出は、製造元による記述のように調製したAqueous One試剤(Promega社)を用いて行った。３０μｌの試剤を各ウェルに添加し、プレートを４時間インキュベートし、４９２ｎｍでの吸光度をＡｎｔｈｏｓ ＨＴＩＩプレートリーダーを用いて調べた
図３ｂは、天然(非融合タンパク質)ＩＦＮα調製物(Peprotech社)に相対的に融合タンパク質ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６に関してプロットされた抗増殖特性を示す。
【０１０８】
(実施例７)
修飾Ｆｃ−ＩＦＮα２ｂ融合タンパク質の活性(抗ウイルス性)：
融合タンパク質の抗ウイルス特性を、先に記述された[Rubinstein Ｓら(1981年)Ｊ Virol.37：755〜758頁]ように、ヒト肺癌腫Ａ５４９細胞(ATCC＃ CCl-185)に対する脳心筋炎ウイルス(ＥＭＣＶ)の細胞変性効果の阻害アッセイによってアッセイした。
【０１０９】
図１は、このアッセイにおけるいくつかのＩＦＮαムテインの相対活性を表にしたものである。最大相対活性は、融合タンパク質ＩＦＮ３１６によって示され、コントロールに対する算出増大倍率は36であった。驚くべき結果は、ＩＦＮ３１６におけるリンカーの存在が、リンカーなしの対応物質ＩＦＮ３１１(相対活性＝7.4)に比べて、その抗ウイルス活性に顕著な有益効果を有することである。この顕著な差異は、リンカーありおよびなしのＷＴおよびＩＦＮα融合タンパク質の比較(ＩＦＮ５対ＩＦＮ１２０)では見られない。図３ｃは、天然(非融合タンパク質)ＩＦＮα調製物(Peprotech社)に相対的に融合タンパク質ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６についてプロットした抗ウイルス活性特性を示す。
【０１１０】
(実施例８)
ヒトＩＦＮαのＴ細胞エピトープマッピングおよび経時的Ｔ細胞アッセイによる免疫原性領域の解析
ヒトＩＦＮαの初期Ｔ細胞エピトープマッピング研究を、合成ペプチドと健康なドナーからのＰＢＭＣとを用いて行ったが、このアッセイの結果と詳細は他で記述されている[WO 02/085941]。ＩＦＮα内で同定されＲ１、Ｒ２およびＲ３と名付けられた３つの免疫原性領域について別の解析を、経時的Ｔ細胞アッセイを用いて行った。このアッセイは、20人の健常人(通常ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子の＞80％をカバーするように選ばれた)から供与された血液、およびＮＩＣＥガイドラインに従って過去にＩＦＮα２ｂ(ＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標))で治療を受けた20人の慢性ＨＣＶ感染患者からの血液から単離されたＰＢＭＣを用いて行った(患者研究は、英国ケンブリッジのAddenbrooke's病院のG.Alexander医師と協力して行った)。免疫原性のエピトープＲ１、Ｒ２およびＲ３は、無処理のＩＦＮαタンパク質の免疫活性特性がこのアッセイに適合しないので、合成ペプチドとして検査した。これらのアッセイでは、24ウェルプレートでの２〜４×１０6個のＰＢＭＣ/ウェルのバルク培養を６から９日間、免疫原性領域にわたるペプチドと共にインキュベートした(表３参照)。増殖は多様な時点で下記のようにして評価した。すなわち、バルク培養を穏やかに再懸濁し、ＰＢＭＣの試料を移して、Ｕ字形底の96ウェルプレートの三組ウェル内で１μＣｉ/ウェルのトリチウムチミジンと共に18時間インキュベートした後、Tomtec Mach IIIプレートハーベスターを用いてガラス繊維フィルターマット上に収集し、ｃｐｍ値をWallac microplate betaカウンターを用いたシンチレーション計数によって測定した。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
図４ａは、免疫原性領域１、２および３に跨るペプチドによる刺激に対する健常人の正の応答(ＳＩ＞２)のすべてを示す。修飾ペプチドは健常人において増殖を誘起することはできなかったが、一方で、野生型ペプチドに対する正の応答が６人のドナーにおいて観察された(図４ａ)。ＨＣＶ患者は、３つの領域すべての野生型ペプチドに対して応答することが確認されたが、一方で、修飾ペプチドについては、領域３に対してのみ応答した(図４ｂ)。ペプチドに対する応答の頻度の解析によれば、領域２と３が、最高頻度の増殖を、すなわち、検査された健康なドナーの15％において増殖を誘起することを示した(図４ｃ)。一方で、ＨＣＶ患者では、領域３が最高頻度の応答(25％)を誘起し、続いて領域１(10％)そして領域２(５％)であった(図４ｃ)。
【０１１３】
本データおよび他のデータから、Ｔ細胞エピトープマッピングの結果が、領域３から派生したペプチドもまた健康なドナーにおいて最高頻度で増殖を誘起することを示すので、領域３は免疫優性Ｔ細胞エピトープを含むと考えられる[WO 02/085941]。健常人において領域１ペプチドに対する応答は第７日目に観察され(図４ａで、ドナー11、ドナー13)、一方でＨＣＶ患者限定Ｔ細胞応答において６日目で増殖が検出された。領域２ペプチドは健康なドナーでは９日目において増殖を誘起する傾向があった(図４ａで、ドナー６とドナー18)一方でＨＣＶ患者限定Ｔ細胞応答は８日目で観察された(図４ｃで、ドナー13)。領域１および２の応答とは異なり、領域３ペプチドは、７および８日目にそれぞれ観察された増殖についてＨＣＶ患者よりも健常人においてより急速な応答を誘起した。
【０１１４】
(実施例９)
ＩＦＮα免疫原性領域３のスキャニングＴ細胞アッセイ
免疫原性領域３のスキャニングＴ細胞アッセイからのデータも含めることでムテイン設計プロセスをさらに洗練させた。Ｔ細胞アッセイを13人のドナーの試料からのＰＢＭＣを用いて行った。試料の過半数は、少なくとも、問題とされていたＷＴペプチド配列に対して応答することが前もって決定されていた。ＩＦＮαの残基Ｔ１０８〜ＷＩ４０に跨る８つの合成ペプチドのファミリーを作製した。ペプチドのファミリーは、ＷＴ配列と、表４に同定するような７つの異なる置換配列とを含んでいた。すべてのアッセイは三組行った。13人のドナーの試料の平均ＳＩを算出した。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】
アラニンをスキャニングアミノ酸として用いた。ただし選定を助ける活性データが利用可能である場合を除く(Ｙ１２２は突然変異体が活性でなかったのでスキャンしなかった)。Ｆ１２３Ｈが、野生型と比べてＳＩが13人のドナー全体にわたって常に低く、全体的なＴ細胞応答を低減することにおいて最も効果的な突然変異であることが判明した。しかしＦ１２３を突然変異させて十分な活性を回復することはできなかった。変化のうちのいくつかは、ＷＴに対する正の応答の頻度が等しかった(表４)が、それらが応答したのは、いくらか重なってはいたが、同じサブセットのドナーではなかった。突然変異体の平均ＳＩは一般にＷＴペプチドよりも低く、増大した正の応答の頻度を与えたＬ１２８Ａに関してさえも低くかった。Ｖ１１９Ａは、ドナーのセットよりも常に高いＳＩを与えたが、正の応答の頻度はＷＴに似ていた。領域３ムテインの代替組合せを免疫原性アッセイを用いて検査した。領域３を跨ぎアミノ酸の各組合せを含む９つのペプチドを合成し、Ｔ細胞増殖アッセイで再検査した(表５)。
【０１１７】
【表５】
【０１１８】
15％のドナーが、ＷＴペプチドにＳＩ＞１．９５で応答した。すべてのドナー試料におけるＷＴペプチドに対する平均ＳＩは１．４３であった。変化の組合せはどれも、20人のドナーの一群に対する平均ＳＩがＷＴペプチドよりも低かったが、Ｉ１１６Ｎ＋Ｌ１２８Ｒを含むペプチドについては、一人のドナーで正の応答(ＳＩ＞１．９５)となった。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】本発明の好ましいＩＦＮαムテインのそれぞれの相対生物学的活性を示す。
【図２】細胞培養上清のレセプター信号伝達アッセイの結果を示す。
【図３】Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＩＦＮα２ａに対する精製ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６の活性の比較を示す。
【図４ａ】合成ペプチドを用いた経時的免疫原性アッセイの結果を示す。
【図４ｂ】合成ペプチドを用いた経時的免疫原性アッセイの結果を示す。
【図４ｃ】合成ペプチドを用いた経時的免疫原性アッセイの結果を示す。
【図５．１】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．２】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．３】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．４】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．５】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．６】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．７】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．８】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．９】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．１０】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．１１】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．１２】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
(分野)
本発明は、ヒトインターフェロンアルファ、特に、改良された特性を有する修飾型インターフェロンアルファ２に関する。改良タンパク質は、生物学的アッセイにおいて増大した相対活性を与える特定位置のアミノ酸置換を含む。本発明はまた、修飾インターフェロンアルファを提供し、タンパク質においては、低減された免疫原性能と共に改良された生物活性を有する。改良タンパク質はヒトの疾患の治療における治療的使用を意図したものである。
【０００２】
(背景)
インターフェロンアルファ２(ＩＦＮα２)は、活性化されたマクロファージによって発現される重要な糖タンパク質サイトカインである。タンパク質は、広域抗ウイルス剤、抗増殖剤および免疫調節剤としてかなりの臨床的重要性を有している。ＩＦＮα２の組換えおよび他の製剤が、ヒトにおける種々の癌および抗ウイルス性の適応で治療的に用いられてきた[Sen, G.G.およびLengyel P(1992年)J.Biol.Chem.267：5017〜5020頁において論評]。現在、臨床的に使用されている多くのＩＦＮα製剤があり、これらは、E.coliで産生された天然組換えＩＦＮα２(ＩＦＮα２ａ、ＲｏｆｅｒｏｎＡ(登録商標)、Hoffman-La Roche社；ＩＦＮα２ｂ、ＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標)、Schering-Plough社；ＩＦＮα２ｃ、Ｂｅｒｏｆｏｒ(登録商標)、Basotherm社)、さらに最近では、全サブタイプの共通配列に基づいたE.coliで産生された合成ＩＦＮα(Ｉｎｆｅｒｇｅｎ(登録商標)、InterMune社)を含む。
【０００３】
ＩＦＮα２の主要な用途は、Ｃ型慢性肝炎ウイルス(ＨＣＶ)感染の治療である。ＩＦＮα単独での治療は、約10％の患者において持続されたウイルス除去をもたらす。なお、最近では、40％の持続されたウイルス応答が、ＩＦＮα２にリバビリンを組み合わせることによって達成されている[Davis GLら(1998年)N.Engl.J.Med.339：1493〜1499頁；McHutchison JGら(1998年)N.Engl.J.Med.339：1485〜1492頁；Reichard Oら(1998年)Lancet.351：83〜87頁]。ＩＦＮα治療は、集中的であり、重症な副作用を伴い、治療を中止する例が20％に及ぶ。集中的治療の理論的根拠は、ＩＦＮα２ｂが比較的短い血清半減期を有する[Glue Pら(2000年)Clin.Pharmacol.Ther.68：556〜567頁]ことであり、抗ウイルス効果を考慮すると１日１回または週３回の皮下注射による投与が必要になる。
【０００４】
この短い半減期と頻繁な投薬は、長期の治療では問題があると認識されてきた。これに取り組むために、ＲｏｆｅｒｏｎＡ(登録商標)とＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標))のＰＥＧ化バージョン(Ｐｅｇａｓｙｓ(登録商標)とＰｅｇ-Ｉｎｔｒｏｎ(登録商標))が導入されており、Ｉｎｆｅｒｇｅｎ(登録商標)の同様のバージョンが第II相臨床試験中である。これらの修飾されたインターフェロンはポリエチレングリコール部分に結合されており、血清半減期が10から20倍に増大し(６、７)、これによって、臨床的な効力に悪影響を及ぼすことなく、投薬頻度を週１回(Ｐｅｇ-Ｉｎｔｒｏｎ(商標)とＰｅｇａｓｙｓ(商標)についてそれぞれ180μｇまたは1.4μｇ/Ｋｇ)に減らす[Glue P.ら(2000年)前掲書；Perry CMら(2001年)Drugs 61：2263〜2288頁；Glue Pら(2000年)Hepatology 32：647〜653頁]。これらの試験において、副作用プロフィールは、無修飾のインターフェロンと類似している。
【０００５】
血清半減期を増大させるためのもう１つの戦略は、ＩＦＮαをヒト血清アルブミンに連結することである[Osborn BLら(2002年)J.Pharmacol.Exp.Ther.303：540〜548頁]。Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ(登録商標)は、ヒト血清アルブミンのＣ末端に連結されたＩＦＮαからなり、カニクイザルにおいては、ＰＥＧ化ＩＦＮαの３倍、無修飾ＩＦＮαの18倍の半減期を有する。この分子については、ヒトにおける試験によるデータは、未だ入手可能ではない。しかしながら、ＰＥＧ化ＩＦＮαおよびアルブミン連結されたＩＦＮαの両方について、修飾タンパク質のin vitroの比活性は、天然タンパク質と比べて、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ(登録商標)で28％に低減し[Grace Mら(2001年)Cytokine Res.21：1103〜1115頁]、およびＰｅｇａｓｙｓ(登録商標)とＡｌｂｕｆｅｒｏｎ(登録商標)では10％以下に低減される[Osborn BLら(2002年)前掲書；Bailon Pら(2001年).Bioconjug Chem.12：195から202頁]。
【０００６】
ＩＦＮαの利用において見られる重要な治療的利点にもかかわらず、或る患者における治療に対する抵抗性が記録されており、抵抗の重要な仕組みの１つが、治療中の患者の血清において検出可能な中和抗体の発生であることが示された[Quesada, J.R.ら(1985年)J.Clin.Oncology ３：1522〜1528頁；Stein R.G.ら(1988年)前掲書；Russo, D.ら(1996年)Br.J.Haematol.94：300〜305頁；Brooks M.G.ら(1989年)Gut 30：1116〜1122頁]。少なくとも同一の一次構造の分子がヒトにおいて内因的に産生されるという事実にもかかわらず、これらの患者において治療的インターフェロンに対して免疫応答が生じる。数カ月にわたって投薬が繰り返されると、適応症に依存して80％までの患者において抗ＩＦＮα中和抗体が誘起され[Schellekens Ｈら(1997年)J Interferon Cytokine Res.17、補足１：Ｓ５〜８頁]、慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染についての報告された頻度は、７％から60％の範囲である[Schellekens Hら(1997年)前掲書]。入手可能な証拠は、中和抗体を生じる患者は、抗体を生じない患者に比べて、治療に反応せず、再発しやすいことを示唆している[Ross Cら(2002年)J Interferon Cytokine Res.22：421〜426頁；McKenna R.Mら(1997年)J.Interferon Cytokine Res.17：141〜143頁；Russo Dら(1996年)前掲書；Milella Mら(1993年)Liver、13：146〜150頁；Primmer O.(1993年)Cancer、71：1828〜1834頁]。しかし、ある場合には、精製された白血球インターフェロンをその後に使用することによって治療を続行することができる[Russo Dら(1996年)前掲書；Oberg K.とAlm G.(1997年)Biotherapy、10：１〜５頁；Tefferi A.とGrendahl D.C.(1996年)、Am.J.Hermatol.52：231〜233頁；Milella Mら(1995年)Hepatogastroenterology 42：201〜204頁]。
【０００７】
組換えＩＦＮαに対する抗体の発生の理由は明らかではない。なぜなら、タンパク質が天然に存在し、ウイルス感染のような事象に応答して発現が散発的に増大するからである。投薬の経路と頻度、ＩＦＮαの免疫調節効果、および医薬製剤におけるタンパク質凝集体の存在がすべて、免疫寛容の崩壊において或る役割を果たしているかもしれない。しかしながら、いかなる促進要因とも無関係に、免疫応答の誘起へとつながる中心的な特徴は、ＭＨＣクラスII分子上での提示を介してＴ細胞の活性を刺激することができるペプチドがタンパク質内に存在していることである。そのようなペプチド配列は、「Ｔ細胞エピトープ」であり、一般に、ＭＨＣクラスII分子に結合する能力を有するアミノ酸残基配列のすべてとして定義される。「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合すると、Ｔ細胞レセプター(ＴＣＲ)によって認識されうるものであり、少なくとも原則的には、ＴＣＲをしてＴ細胞応答を促進させることによってＴ細胞の活性化を引き起こすことができるエピトープを暗に意味する。
【０００８】
前述のことから、増強された特性を有するＩＦＮα２に対する継続した必要性が明らかに存在する。望まれる強化点は、上記医薬品の発現と精製のための代替のスキームとモダリティを含み、また、特に、タンパク質の生物学的特性の改良も含む。ヒト対象に投与した場合のin vivoの特徴を増強することが特に必要である。この点において、免疫応答を誘起する能力が欠失または減退しておりかつヒト対象における生物学的力価が増強されているＩＦＮα２を提供することが高く望まれている。
【０００９】
本発明者らは、先に、自己タンパク質に対する免疫応答を推進するＴ細胞エピトープを含むＩＦＮα２分子の重要な領域を開示し、そして、Ｔ細胞エピトープとして作用できなくなるようにこれらの配列をすべて消去しまたは有効性を低減した組成物を提供した[WO 02/085941]。そのような組成物は、ＩＦＮα２タンパク質のアミノ酸配列の改変、例えば置換、によって達成され、本発明はまた、アミノ酸置換およびまたは置換の組合せが行われたＩＦＮα２分子に関する。しかし、本件では、なされた新規の置換および置換の組合せは、分子の生物活性を大きく増強するという驚くべき特性を与え、タンパク質について低減された免疫原性プロフィールを達成する置換と組み合わせたそのような増強は、改良されたＩＦＮα２分子をもたらす。
【００１０】
他のものたちは、修飾ＩＮＦα２および使用方法を提供し、例えば、米国特許第4,496,537号、米国特許第5,972,331号、米国特許第5,480,640号、米国特許第5,190,751号、米国特許第4,959,210号、米国特許第5,609,868号、米国特許第5,028,422号、およびその他を含む。
【００１１】
米国特許第5,723,125号は、ペプチドリンカーを介してヒト免疫グロブリンＦｃフラグメントに接続された野生型ヒトＩＦＮαを含む融合タンパク質について記述している。ＩＦＮαドメインは、特許請求した融合タンパク質においてＦｃドメインに対してＮ末端配向されている。
【００１２】
米国特許第6,204,022号は、特に１９、２０、２２、２４および２７の位置でＷＴからの置換を有し、生物学的アッセイにおいて低減された細胞毒性を特徴とするＩＦＮα類似体について記述している。
【００１３】
「ヒトＦｃ融合タンパク質」の一般的なカテゴリーおよびそれらの産生のための適当なベクターは、先に記述されている[米国特許第5,541,087号、米国特許第5,726,044号、Loら(1998年)Protein Engineering 11：495〜500頁]。
【００１４】
(発明の概要）
本発明は、アミノ酸置換を含むヒトインターフェロンアルファ２分子を提供する。アミノ酸置換は改良された特性をタンパク質に与える。改良された特性は、タンパク質の特定の生物活性に関し、タンパク質の免疫原性の特性にも関する。
【００１５】
本発明の分子はヒトＩＦＮαムテインに連結されたヒト免疫グロブリン定常領域部分を含む融合タンパク質である。
【００１６】
本発明の分子は新規かつ進歩性のある特性を有する。そのような分子は、疾患を有する患者、特にＣ型慢性肝炎ウイルス感染患者に恩恵をもたらすことができる。
【００１７】
本発明の分子は本明細書に配列番号２〜22として定義されるタンパク質配列を特徴とする。
【００１８】
本発明の分子はさらに、信号伝達アッセイにおける相対活性が1.3倍超と10倍との間であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、信号伝達アッセイにおける相対活性は、２倍または３倍または５倍または７倍または10倍または17倍である。
【００１９】
本発明の分子はさらにまた、抗ウイルスアッセイにおける相対活性が２倍と36倍との間であることを特徴とする。いくつかの実施形態では、抗ウイルスアッセイにおける相対活性は、２倍以上、または３倍以上、または４倍以上、または７倍以上、または約36倍である。
【００２０】
本発明の非常に好ましい分子は、配列番号２のタンパク質配列を特徴とし、さらに、相対活性が信号伝達アッセイにおいて９倍超であり、抗ウイルスアッセイにおいて相対活性が約36倍であり、抗増殖アッセイにおいて約１であることを特徴とする。
【００２１】
本発明の別の好ましい分子は、配列番号３のタンパク質配列を特徴とし、さらに、相対活性が信号伝達アッセイにおいて1.3倍超であり、抗ウイルスアッセイにおいて相対活性が約7.4倍であり、抗増殖アッセイにおいて約１であることを特徴とする。
【００２２】
本発明の分子はさらにまた、抗増殖アッセイにおける活性がｍｌ(ミリリットル)あたりインターフェロンα１３ｐｇ(ピコグラム)と１６ｐｇの間であることを特徴とする。本発明の最も好ましい分子はまたさらに、ヒト細胞において低減された免疫原性を示すために表された配列を含むことを特徴とする。
【００２３】
まとめると本発明は下記の課題に関する；
・１つまたは複数のアミノ酸置換を含むヒトインターフェロンアルファ２の生物活性を有する修飾インターフェロンアルファ２分子、
・ヒトインターフェロンアルファ２の生物活性を有し、ヒト免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)ドメインを含み、上記または下記に特定されるようなインターフェロンアルファ２ドメイン内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む修飾インターフェロンアルファ２分子、
・ヒトインターフェロンアルファ２の生物活性を有し、ヒトＦｃドメインを含み、インターフェロンアルファドメイン内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、そして、特に本発明のアミノ酸置換を含まないインターフェロンアルファ分子と比較して、ヒトに対する低減された免疫原性を示すことをさらに特徴とする修飾インターフェロンアルファ２分子、
・改良された特性を有するＩＦＮαムテインを回収するための、下記を含む一般的な方法：
ａ)Ｔ細胞エピトープの同定、
ｂ)Ｔ細胞エピトープ領域内において１つのアミノ酸置換を行い、機能的に活性のムテインを選択すること、
ｃ)任意選択で、Ｔ細胞活性化に関与する重要な残基についての細密なマッピング研究を行い、二重または三重のより多くの置換体を免疫原性に関して検査すること、
ｄ)多重置換ムテインとしての構成のために最も好都合な機能および免疫原性プロフィールを有するムテインを選択し、前記新たなタンパク質の機能検査をすること、
ｅ)経時的免疫原性アッセイを用いて、機能的に活性な多重置換ムテイン配列を、低減された免疫原性について検査すること。
【００２４】
・下記構造の修飾インターフェロンアルファ２分子。
【００２５】
【化１】
【００２６】
（式中、
Ｘ0＝ＦｃまたはＦｃリンカー、
Ｆｃ＝抗体のＦｃドメイン
リンカー＝６から２５個のアミノ酸からなるリンカーペプチド
Ｘ1＝Ｉ、Ｑ
Ｘ2＝Ｈ、Ｙ
Ｘ3＝Ｉ、Ｔ；
Ｘ4＝Ｆ、Ｔ、Ａ
Ｘ5＝Ｗ、Ｈ；
Ｘ6＝Ｙ、Ｄ；
Ｘ7＝Ｉ、Ｎ、Ｔ、Ｐ、Ｒ
Ｘ8＝Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｄ、Ｓ、Ｎおよび
Ｘ9＝Ｎ、Ｓ；
ただし、同時にＸ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝ＮであるＩＦＮα分子を除外する、換言すれば、野生型ＩＦＮ融合タンパク質を除外する）。
【００２７】
特に、本発明は下記に関する
・Ｘ5＝ＨおよびＸ8＝ＮであるＩＦＮα２ムテイン
・Ｘ3＝ＴおよびＸ4＝ＡであるＩＦＮα２ムテイン
・下記の化合物からなる群から選択したＩＦＮα２ムテイン
(i)Ｘ1＝Ｑ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｒ、Ｘ8＝ＮおよびＸ9＝Ｎ
(ii)Ｘ1＝Ｑ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
(iii)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｔ、ＲまたはＮ、Ｘ8＝ＮおよびＸ9＝Ｎ
(iv)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
(v)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｙ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｔ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
(vi)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｐ、ＴまたはＮ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
(vii)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
(viii)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
(ix)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
(x)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝Ｔ、Ｓ、Ｎ、ＨまたはＤおよびＸ9＝Ｎ
(xi)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
(xii)Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｄ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
・Ｆｃがヒト免疫グロブリン重鎖定常領域ドメインであるＩＦＮα２ムテインであって、前記ドメインはそのＣ末端によって前記ムテインに連結されているムテイン
・Ｆｃドメインが単量体であるＩＦＮα２ムテイン
・リンカーペプチドが12から20個のアミノ酸からなるＩＦＮα２ムテイン
・リンカーペプチドが(Ｇ)４Ｓ(Ｇ４)Ｓ(Ｇ４)ＳＧであるＩＦＮα２ムテイン。
【００２８】
疑念回避のため、発明の実施形態であるところの、ＩＦＮα２の特に有利なムテインは、図１の詳細を特徴とする。
【００２９】
本発明の突然変異タンパク質は、当技術分野においてよく知られる組換えＤＮＡ手法を用いて容易に作られ、本発明は、そのような分子の組換え産生のための方法を提供する。
【００３０】
この発明が修飾ＩＦＮα２に関するものであるかぎり、そのような修飾ＩＮＦα２タンパク質を含む組成物または修飾ＩＦＮα２タンパク質のフラグメントおよび関連組成物は、本発明の範囲内であると見なされるべきである。もう１つの態様では、本発明は修飾ＩＮＦα２実体物をコードする核酸に関する。別の態様では、本発明は修飾ＩＦＮα２タンパク質を用いたヒトの治療処置のための方法に関する。
【００３１】
(発明の詳細な説明)
自然界において、成熟したＩＦＮα２タンパク質は、165個のアミノ酸の単一ポリペプチドである。数種の異なるサブタイプのヒトＩＦＮα２が知られおり、それぞれ一次アミノ酸配列において若干の差異を示す。例えば、ＩＮＦα２ａとＩＮＦα２ｂは、成熟タンパク質鎖の位置23の１つの残基においてのみ異なり、ＩＮＦα２ａではリジン、ＩＮＦα２ｂではアルギニンである。本発明の開示はＩＮＦα２ｂの配列に向けられるが、あらゆる実際的な目的において、ＩＦＮα２ａの配列を本発明の対象のＩＮＦα２ｂサブタイプと交換可能に考えてよいことがわかるであろう。ＩＮＦα２ｂのアミノ酸配列(一文字コードで示す)は以下の通りである：
【００３２】
【化２】
【００３３】
用語「ＩＦＮα」は、ここではヒトインターフェロンアルファ２を表すために用いられる。いくつかの場合では、この用語はより広く用いられて、インターフェロンアルファ部分およびまたは特にインターフェロンアルファムテインを含む融合タンパク質を含むこともある。
【００３４】
用語「ムテイン」は、ここでは上記の天然配列とは異なる１つまたは複数のアミノ酸置換を含むように設計されたＩＦＮαタンパク質を表すために用いられる。
【００３５】
ここで用いられる用語「ペプチド」は、２個またはそれ以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸はペプチド結合によって互いに連結されている。
【００３６】
ペプチド結合は、すべてのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の直鎖骨格構造においてアミノ酸間の唯一の共有結合連結である。ペプチド結合は、共有結合であり、構造においては平面状であり、化学的には置換アミドを構成する。「アミド」は、基−ＣＯＮＨ−を含む有機化合物の一群のすべてものである。
【００３７】
20種の異なる天然存在アミノ酸がペプチドの生物学的産生に関与し、それらはどんな順番にいくつ連結しても、ペプチド鎖または環を形成しうる。ペプチドの生物学的産生に用いられる天然存在アミノ酸はすべてＬ立体配置を有する。合成ペプチドは、従来の合成方法を用い、Ｌアミノ酸、Ｄアミノ酸または２つの異なる立体配置のアミノ酸の多様な組合せを利用して作製することができる。いくつかのペプチドは、わずかに２、３個のアミノ酸単位のみを含む。短いペプチド、例えば10個未満のアミノ酸を有するものは、ときに「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは、多数のアミノ酸残基、例えば100個までまたはそれを超えるアミノ酸残基を含み、「ポリペプチド」と呼ばれる。慣例では、「ポリペプチド」は３個またはそれ以上のアミノ酸を含むいかなるペプチド鎖と考えてもよく、一方、「オリゴペプチド」は、通常は「短い」ポリペプチドの特定のタイプとして考えてもよい。このように用いられるので、「ポリペプチド」に対するあらゆる言及はオリゴペプチドをも含む。さらに、「ペプチド」に対するあらゆる言及は、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を含む。アミノ酸の異なる配列はそれぞれ、異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。ポリペプチドの数および形成できる異なるタンパク質の数は事実上無限である。
【００３８】
ペプチド結合がアミノ酸間の唯一の連結構造であるので、すべてのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、「Ｎ末端」または「Ｎ末端」残基および「Ｃ末端」または「Ｃ末端残基」と従来から呼ばれる定義された末端を有する。Ｎ末端残基は遊離アミノ基を有し、一方Ｃ末端残基は遊離カルボキシル基を有する。
【００３９】
したがって、すべての連続したアミノ酸の配列はＮ末端からＣ末端への配向性を有する。融合タンパク質が構成される場合すなわち異なるドメインが１つのタンパク質種内で接続されている場合、それらの相対的配向を「Ｎ末端」または「Ｃ末端」として記述してもよい。
【００４０】
用語「融合タンパク質」は、ここでは単一のポリペプチド鎖内に２個またはそれ以上の機能的に区別されるタンパク質ドメインを含むタンパク質分子を指すために用いられる。融合タンパク質のタンパク質部分は、直接に結合していてもよいし、リンカーペプチドを介して合体されていてもよい。
【００４１】
「リンカー」または「リンカーペプチド」は、ここでは融合タンパク質の２つの部分を合体するペプチドセグメントを指す。この発明に適したリンカーペプチドは、５〜25個のアミノ酸、好ましくは10〜20個のアミノ酸、さらに好ましくは15〜20個のアミノ酸を有するペプチドを含む。リンカーペプチドの１つの例は、一般式((Ｇ)4Ｓ)xＧであり、ここでｘは１、２、３または４である。本発明において好ましいリンカーペプチドは、(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4ＳＧである。しかし、10個を超えるアミノ酸を有する先行技術の他のリンカーペプチドも好適である。
【００４２】
米国特許第5,723,125号は、リンカー配列がＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳであるＩＦＮ−Ｌ−Ｆｃ(ここで、Ｌ＝リンカー)型のハイブリッドインターフェロン分子を特許請求している。前記のリンカーは16残基であり、「比較的長い」とみなされる。上記のリンカーは、Hustonら[Hustonら(1988年)Proc Natl.Acad.Sci.USA 85：5879頁]によって記述されたよく知られたペプチドリンカー(ＧＧＧＧＳ)3の変異体である。このリンカーのさらに短い配列変異体が知られている。例えば、(ＧＧＧＧＳ)ｎであり、ここで５個、10個または15個の残基を与えるようにｎ＝１、２または３である[Holliger, P.ら(1993年)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90：6444頁］。４個の残基(ＧＧＧＧ)を含むこのリンカーの特に短いバージョンは、米国特許第6,686,179号で用いられている。
【００４３】
当技術分野で認識されるペプチドリンカーの他の例は次のすべてを含む：
(Ａ)3、(Ａ)4、(Ａ)5、ＧＧ、ＧＳ、ＧＧＧ、(Ｇ)7、ＧＰＧ、ＧＧＰＧＧ、ＥＦＧＧＧＧＧＴＡ。
【００４４】
融合タンパク質は、組換えＤＮＡ手法の手段によって広く生成されており、したがって、自然界に直接の対応物を有していない人工タンパク質であると考えることができる(天然融合タンパク質は、例えば、染色体転座によって発生しうるが、ここでは考慮しない)。融合タンパク質の１つの例は、免疫グロブリンＦｃ領域がＩＦＮαのような別のタンパク質のＮ末端に置かれた融合体である。そのような融合体は「Ｆｃ−Ｘ」融合体と呼ばれる。ここで、Ｘは(ＩＦＮαのような)リガンドである。Ｆｃ−Ｘタンパク質は多くの特有の有利な生物学的特性を有している。特に、そのような融合タンパク質でも細胞表面の関連Ｆｃレセプターと結合することができるが、リガンドがそのレセプターに結合すると、Ｆｃ領域の配向が変わり、抗体依存細胞介在性細胞毒性および補体結合が、Ｆｃドメインに存在する配列によって活性化されるようになる。Ｆｃ−Ｘ融合体は本発明では好ましい。
【００４５】
用語「免疫グロブリン」は、ここでは免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされている１つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指すために用いられる。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ(ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４)、σ、εおよびμ定常領域遺伝子および自然界では多くの免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。
【００４６】
用語Ｆｃは、ここでは免疫グロブリン重鎖定常領域ドメインを指すために用いられ、抗体のＦｃ部分の単量体型だけでなく二量体型も含む。単鎖Ｆｃ融合体(単量体)型が好ましい。
【００４７】
用語「Ｔ細胞エピトープ」は、この発明の理解に従えば、ＭＨＣクラスIIと結合することができ、Ｔ細胞を刺激することができ、かつ／またはＭＨＣクラスIIと複合してＴ細胞に結合(必ずしも測定可能に活性化せずに)することができるアミノ酸配列を意味する。
【００４８】
「実質的に非免疫原性」または「低減された免疫原性能」への言及は、検査部分の野生型または天然アミノ酸配列を含む融合タンパク質にまたは親タンパク質に比較して低減された免疫原性を含む。
【００４９】
用語「免疫原性」は、宿主動物、特に「宿主動物」がヒトである場合において、体液性およびまたはＴ細胞介在性応答を誘発、誘起またはさもなくば促進する能力を含む。
【００５０】
用語「Ｔ細胞アッセイ」および「免疫原性アッセイ」は、免疫反応性のex vivo測定手段に関する。したがって、これらは、検査免疫原、例えば、タンパク質またはペプチドを生体ヒト免疫細胞に接触させ、その反応性を測定することを含む。誘起された反応性の典型的なパラメータは増殖である。適する対照を決定することはアッセイにおいて重要であり暗黙の絶対的な条件である。
【００５１】
「経時的アッセイ」は、ある時間にわたって連続的に測定を行う増殖アッセイのような生物学的アッセイを指す。本文脈においては、「経時的Ｔ細胞アッセイ」は、検査免疫原(ペプチド)への曝露に続いて多数回にわたる検査免疫原に応答したＴ細胞増殖の測定を指す。用語「経時的Ｔ細胞」および「経時的免疫原性アッセイ」は、ここでは交換可能に用いてもよい。
【００５２】
Ｔ細胞アッセイを表現する１つの慣用法は、「刺激指数」すなわち「ＳＩ」を用いることによる。刺激指数(ＳＩ)は、従来から、ペプチドのような検査免疫原に対して測定した増殖スコア(例えば、3Ｈ−チミジン取り込みを用いる場合には、放射線の一分間あたりの計数)を、検査免疫原と接触さていない細胞において測定されたスコアによって除算することによって導出される。応答をまったく惹起しない免疫原(ペプチド)はＳＩ＝1.0となるが、実際には0.8〜1.2の範囲のＳＩ値は一般的である。本発明者らは、そのような免疫原性アッセイの操作において、2.0以上の刺激指数が有意の誘起増殖の有用な目安であることを確立した。
【００５３】
ＰＢＭＣは、末梢血単核細胞、特にドナーの血液試料から得られたものを意味する。ＰＢＭＣは、当分野でよく理解された濃度勾配遠心法を用いて全血液試料から容易に単離され、大量のリンパ球(ＢおよびＴ細胞)および単球を含む。他の細胞型も表される。
【００５４】
「相対活性」は、本文脈においては、いかなるアッセイにおいても検査タンパク質について測定された活性が、同じアッセイにおいて、通常は平行して行われ、ポジティブコントロールタンパク質について測定された活性に相対的に表現されるものである。したがって、検査タンパク質およびコントロールタンパク質の測定活性が同じ場合、相対活性は１であるという。
【００５５】
抗ウイルスアッセイは、対象とする検査タンパク質に関して、ウイルス物質が適当な宿主細胞に対して機能することを阻害する何らかの能力を測定する生物学的アッセイである。そのようなアッセイは、一般に、抗ウイルス活性が、細胞変性を引き起こす投与量のウイルスの存在下において、延長された細胞生存または増殖と同等となるように設定される。これを有用な尺度とするために適した対照検査を平行して行う。適した対照測定の存在はアッセイにおいて重要であり暗黙の絶対的な条件である。ある１つの特に適した抗ウイルスアッセイがRubinsteinらによって記述されており[Rubinstein Ｓら(1981年)J Virol.37：755から758頁]、ここに例示される。他のアッセイ方式を考えることが可能であり、それらもＥＤ50測定を可能にする検査分子の特定の活性の定量的な推定値を与える。
【００５６】
本文脈による「信号伝達アッセイ」は、生きた細胞内における特定の測定可能な応答を惹起する検査タンパク質の能力の指標を与えることができる生物学的アッセイを意味する。特に、検査タンパク質を細胞の外表面に接触させ、測定される応答は、１つの非常に小さい特定のレセプタータンパク質と、転写因子のような細胞の内部にある多数の細胞性因子とが関与することによってのみ発生可能な現象とする。ひとまとめにしてレセプターおよび他の多数の細胞性因子は「信号伝達経路」を構成し、そのような経路は、機能的に活性なＩＦＮタンパク質によって活性化されることが知られている[Williams, B.R.(1991年)Eur.J.Biochem.15：１〜11頁；David, M.(1995年)Pharmacol.Ther.65：149〜161頁]。特に適した信号伝達アッセイをここに例示し、他のアッセイ方式も、検査分子の特定の活性の定量的な推定値を与えることが考えられる。
【００５７】
「抗増殖」アッセイは、対象とする検査タンパク質に関して、指標培養細胞の生育を阻害する何らかの能力を測定する生物学的アッセイである。これを有用な尺度とするために、適したコントロール検査を平行して行う。ある１つの特に適した抗増殖アッセイがMarkらによって記述されており[Mark, D.F.(1984年)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：5662〜5666頁]、ここに修飾した型で例示する。他のアッセイ方式を考えることが可能であり、それらも、ＥＤ50測定を可能にする検査分子の特定の活性の定量的な推定値を与える。
【００５８】
もう１つの態様では、本発明は修飾ＩＦＮα実体物をコードする核酸に関する。そのような核酸は好ましくは発現ベクターに内包される。原核生物に適したコントロール配列は、例えば、プロモーター、任意選択でオペレーター配列およびリボソーム結合部位を含む。真核生物細胞は、プロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル化信号を利用することが知られている。そのような核酸は一般に、選択手段、典型的には、宿主細胞の生存を助けることができるタンパク質をコードする付加的な遺伝子を含む。そのような選択遺伝子の一例は、いくつかのE.coli宿主細胞に適したベータラクタマーゼであり、この遺伝子や他のものは当技術分野においてよく知られている[「Molecular Cioning：A Laboratory Manual」第２版(Sambrookら、1989年)「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」(J.M.Miller ＆ M.P.Calos編、1987年)「Current Protocols in Molecular Biology」(F.M.Ausubelら編、1987年)]。核酸は、別の核酸配列との機能的な関係におかれると、機能できる形で連結される。例えば、プレ配列すなわち分泌リーダー配列のＤＮＡは、それがポリペプチドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに機能できる形で連結されており、プロモーターやエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を与える場合、配列に機能できる形で連結されており、あるいは、リボソーム結合部位は、それが翻訳を容易化するように位置される場合、コード配列に機能できる形で連結されている。一般に、「機能できる形で連結」とは、連結されているＤＮＡ配列が隣接しており、分泌リーダー配列の場合では、隣接しておりかつ同一の読み枠内にあることを意味する。しかしエンハンサーは隣接している必要はない。連結は都合のよい制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合には合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを従来からの常法に従って使用する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは、発現制御配列に機能できる形で連結されたＩＦＮα変異体をコードする核酸配列を含む。多様な実施形態では、発現ベクターは、配列番号２から配列番号22までを包含的に含む群から選択されるタンパク質をコードする核酸配列を含む。そのような発現ベクターは、適した発現制御および選択配列に機能できる形で連結された前記複数のタンパク質のうちの１つのタンパク質のＩＦＮαコードドメインを少なくとも含む。そのような発現ベクターは、核酸の縮重バージョンを含み、ここで、ポリヌクレオチドに関する縮重とは、遺伝暗号において多くのアミノ酸が複数のコドンにより特定されるというよく認識された事実を指している。暗号の縮重は、ＤＮＡを構成する４種の異なる塩基によって可能な64種のトリプレット配列を用いた20種の異なるアミノ酸がコードされていることを物語るものである。
【００６０】
本発明のもう１つの態様は、上記ベクターの少なくとも１つを含む培養細胞である。
【００６１】
本発明の別の態様は、修飾ＩＦＮαを調製するための方法であって、前記発現ベクターからのＩＦＮαの発現を可能にする条件下で上記細胞を培養することと、細胞からＩＦＮαを精製することとを含む方法である。
【００６２】
別の態様では、本発明は、ＩＦＮα組成物を使用したヒトの治療処置のための方法に関する。個人への投与のために、いかなる修飾組成物も、好ましくは少なくとも80％の純度であり、発熱因子や他の混在物を含まないように製造される。また、ＩＦＮαタンパク質の治療用組成物は、医薬的に許容される賦形剤と共に使用してもよいことが理解される。本発明による医薬組成物は、従来法により調製され、賦形剤、担体、アジュバントおよび緩衝剤など、医薬品において通常に使われる物質、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(Alfonso R. Gennaro編、第18版、1990年)を含む。組成物は、例えば、ある効果を達成するために有用な非経口、経腸、筋肉内、皮下、静脈内または他の経路によって投与してもよい。従来の賦形剤は、作用剤と有害な反応をすることのない非経口、経腸および他の投与経路に適した医薬的に許容される有機または無機担体物質を含む。非経口的適用では、注射用滅菌液、好ましくは、油または水溶液、および懸濁液、乳化液や、座薬を含むインプラントが特に適している。アンプル剤は便利な単位用量投与法である。医薬調製物は、滅菌することが可能であり、所望により、活性な化合物と有害な反応をしない安定化剤や、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、または他の物質と混合することができる。
【００６３】
本発明の主要な実施形態は、配列番号２〜22のタンパク質配列によって達成される。タンパク質は、融合タンパク質「Ｆｃ−Ｘ」であり、本例におけるＸはＩＦＮαムテインである。そのような融合タンパク質は、野生型(ＷＴ)ＩＦＮα部分を含む融合タンパク質と比べて、増大した活性を示すことが見出されている。本発明者らによって構築された「ＷＴ」または「天然」融合タンパク質は、ここにＩＦＮ120(配列番号23)およびＩＦＮ５(配列番号１)と名付け、(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4ＳＧ構造のリンカーペプチドの有無についてのみ異なる。明言するとＩＦＮ５はリンカーを含まない。
【００６４】
信号伝達アッセイを用いて、天然融合タンパク質は、リンカーのあるものないものどちらも、4.5および５ｎｇ/ｍｌという非常によく似たＥＤ50値を有することが見出されている。この知見は、天然ＩＦＮαに関しては、ＦｃとＩＦＮα分子の間のリンカーの存在は、活性に対して何ら効果を有していない。
【００６５】
対照的に、幾分驚くべきことであるが、本発明の最も好ましい分子ＩＦＮ３１１(配列番号３)およびＩＦＮ３１６(配列番号２)は、信号伝達アッセイにおいて3.4および0.5ｎｇ/ｍｌというＥＤ50値を有し、したがって、コントロールの＞１．３倍および＞９倍の活性であることが見出された。これらの分子がＩＦＮαムテインであるとすると、これらの結果は、配列に対する変更が活性に対して有益な効果をもたらしたことを示唆する。
【００６６】
２つまたは３つまたは４つまたは５つのアミノ酸置換を含む他のＩＦＮαムテインも、信号伝達アッセイについて改良された相対活性を有することが見出された。各２つの置換を含む例は、ＩＦＮαタンパク質ＩＦＮ１９７(配列番号12)、ＩＦＮ２０１(配列番号11)、ＩＦＮ２０２(配列番号10)、ＩＦＮ３０６(配列番号４)を含み、それぞれ２、７、５および４倍の改良を活性において示す。また、各３つの置換を有するタンパク質ＩＦＮ１７３(配列番号15)、ＩＦＮ１７６(配列番号13)、ＩＦＮ２１９(配列番号９)は、それぞれ10、５および17倍の改良を活性において示す。４つの置換を有するＩＮＦαタンパク質ＩＦＮ１７４(配列番号14)は、信号伝達活性において５倍の改良を示した。
【００６７】
信号伝達アッセイにおける活性についてのそのような有益な効果は、複数の置換を含むムテインにとどまらない。すなわち、例えば、１つの突然変異体ＩＦＮαタンパク質ＩＦＮ２８(配列番号22)は、10倍増大した相対活性を示す。同様に、信号伝達活性について、タンパク質ＩＦＮ６４(配列番号21)は３倍超増大した活性を示し、ＩＦＮ１６４(配列番号20)は３倍増大した活性を示し、タンパク質ＩＦＮ１６７(配列番号19)とＩＦＮ１６８(配列番号18)は両方とも２倍の改良を示し、タンパク質ＩＦＮ１７１(配列番号17)は４倍の改良を示し、タンパク質ＩＦＮ１７２(配列番号16)は７倍の改良を示す。
【００６８】
信号伝達活性は、ＩＦＮαタンパク質の機能性の有用な指標であり、ＩＦＮαムテインに対する迅速スクリーニングアッセイとして本発明者らによって使用されているが、一方で、抗ウイルス活性は、ＩＦＮαの力価を測定するための認知された国際標準であり、ある程度まで、可能な臨床活性のより現実的な代用法である。抗ウイルス活性は、したがって、異なるＩＦＮα分子の活性を比較するために使うことが可能であり、本発明者らは本件においてそれを用いて、本発明の最も好ましい分子が、臨床的に有効とされたＩＦＮα調製物の範囲内で活性を示すことを確認した。より具体的に言えば、融合タンパク質ＩＦＮ３１６は13％標準活性を有し、一方、Ｐｅｇ−Ｉｎｔｒｏｎ(登録商標)、Ｐｅｇａｓｙｓ(登録商標)およびＡｌｂｕｆｅｒｏｎ(登録商標)は、それぞれ28％、10％および７％を有すると報告されている[Osborn BLら(2002年)J Pharmacol Exp Ther.303：540〜548頁；Grace Mら(2001年)J Interferon Cytokine Res.21：1103〜1115頁；Bailon Pら(2001年)Bioconjug Chem.12：195〜2029頁、10、11]
タンパク質の抗ウイルス活性は、インターフェロンレセプターから細胞の核内の新しい遺伝子発現までの細胞内信号伝達経路を惹起するタンパク質の能力の関数である。信号伝達活性および抗ウイルス活性における改良の間の一致は、予想された結果であり、本発明のＩＦＮαムテインに当てはまることが示されている。したがって、ＩＦＮαタンパク質である、各５つの置換を有するＩＦＮ２７０(配列番号７)、ＩＦＮ２７３(配列番号６)およびＩＦＮ２７６(配列番号５)は、相対信号伝達活性においてそれぞれ２倍、３倍、同じく３倍の改良を示し、一方で、相対抗ウイルス活性においてそれぞれ６倍、４倍超、同じく４倍超の改良を示した。１つのＩＦＮαムテインは、信号伝達活性においてはコントロールと等しく、まったく改良を示さなかったが、抗ウイルス活性においては２倍超(約2.8倍)の改良を示した。このムテインは、タンパク質ＩＦＮ２４８(配列番号８)であり、３つの置換を含んでいた。
【００６９】
本件のＩＦＮαムテインは、親分子よりも免疫原性を低くして構築された。個々のムテインの設計は、機能的活性のデータに加えて免疫学的考慮から方向付けを行った。分子内の免疫的に重要な３つの領域を、健康なドナーおよび治療的ＩＦＮα ＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標)を過去に受けたことのある個人の両方からのＰＢＭＣ調製物を使ったスクリーニングアッセイを用いて規定した。大まかに言えば、３つの同定された免疫原性遺伝子内に突然変異を含むＩＦＮαムテインを構築した。残基は、ＨＬＡ−ＤＲ分子の公知の結合特性、すなわち、それらの分子はポケット１内に疎水性アミノ酸に対するほぼ排他的な優先度を有しさらにこれがペプチド結合の最も重要な決定因子であるという特性に基づいて標的化した[Jardetzky, T.S.ら(1990年)EMBO J.9：1797〜1803頁；Hill、C.M.ら(1994年)J.Immunol.152：2890〜2898頁]。徹底的な突然変異解析によって、これらの領域内において融合タンパク質の活性に悪影響を及ぼすことなく改変されうる残基を同定した(表２)。代替残基の選定は、解明されたＮＭＲ構造における標的の位置[Klaus, Wら(1997年)J Mol.Biol.274：661から675頁]と、他のヒトＩＦＮαタンパク質および他の種からの同タンパク質との比較とによって案内された。埋没残基を、アラニンまたは似た大きさの非疎水性残基のどちらかで置き換え、一方、露出残基をすべての可能な非疎水性代替物でスキャンした。
【００７０】
Ｔ細胞アッセイを、ヒトＴ細胞の機能的活性化に関与する重要な残基の細密なマッピングを可能にするための方式で適用した。この研究は、問題とされる領域のスキャンのために変異合成ペプチド族のファミリーを使いかつ公知の応答性ドナー試料を用いて行った。突然変異スキャニングＴ細胞アッセイは、活性のデータが既に得られていて選定を案内できる場合を除いて、スキャニングアミノ酸としてアラニンを用いて実行した。そのようなアプローチは、その場所を含むＴ細胞エピトープの免疫原性に対する個々のアミノ酸残基の貢献を明らかにすることができる。免疫原性に関与する重要な残基を改変することは最も望ましいであろうが、一方で、これは、タンパク質の機能を保持することと常に両立するとは限らない。多くの置換を採用して、それらの置換は単独では免疫原性を消すことはできないにもかかわらず、それらの組合せが、本来免疫原性の領域の免疫原性能を低下させる効果を有するということが可能である。本件では、組合せ突然変異体のＴ細胞アッセイ(表５)に先立つエピトープ細密マッピング研究(表４)によって、機能を保持しかつ問題とされる領域において低減された免疫原性を示すことが最もよくできる置換の組合せを規定することができた。
【００７１】
さらに補強のＴ細胞アッセイを、多数の突然変異セット(表３)のすべての組合せを含む合成ペプチドを用いて行い、最も望ましい置換セットにおいて低減された免疫原性を示した。これら後者のアッセイは、合成ペプチドを用いて行い、合成ペプチドは、その分子の３つの免疫原性領域のそれぞれに跨っており、さらに、健康なドナーおよび過去にＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標)で治療されたことのある患者の両方からのＰＢＭＣを用いて経時的Ｔ細胞アッセイとして実行した。Ｔ細胞アッセイにおいて精製タンパク質を検査することは、それらの抗増殖性特性のために不可能であると認識されるであろう。
【００７２】
従って、改良された特性を有するＩＦＮαムテインの回収のための一般的な方法は：
ａ)Ｔ細胞エピトープの同定、
ｂ)Ｔ細胞エピトープ内で単一のアミノ酸置換を行い、機能的に活性なムテインを選択すること、
ｃ)任意選択で、Ｔ細胞活性化に関与する重要な残基の細密マッピング研究を行い、(任意選択で)免疫原性のための二重または三重のより多くの置換を検査すること、
ｄ)多重置換されたムテインとしての構成のために最も好都合な機能および免疫原性プロフィールを有する個々のムテインを選択し、前記新たなタンパク質の機能検査をすること、
ｅ)経時的免疫原性アッセイを用いて、機能的に活性な多重置換ムテイン配列を、低減された免疫原性について検査すること。
【００７３】
まとめると、本発明者らは、下記の構造で表すことができる改良されたＩＦＮαタンパク質を規定することができた。
【００７４】
【化３】
【００７５】
ここで、
Ｘ0＝ＦｃまたはＦｃ−リンカーであり、
Ｆｃ＝抗体のＦｃドメイン
リンカー＝６から２５個のアミノ酸からなるリンカーペプチド
Ｘ1＝Ｉ、Ｑ
Ｘ2＝Ｈ，Ｙ
Ｘ3＝Ｉ，Ｔ；
Ｘ4＝Ｆ，Ｔ，Ａ
Ｘ5＝Ｗ，Ｈ；
Ｘ6＝Ｙ，Ｄ；
Ｘ7＝Ｉ，Ｎ，Ｔ，Ｐ，Ｒ
Ｘ8＝Ｌ，Ｔ，Ｈ，Ｄ，Ｓ，Ｎおよび
Ｘ9＝Ｎ，Ｓ；
ただし、条件として同時にＸ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝ＮであるＩＦＮα分子を除外する。
【００７６】
下記の図、配列リストおよび実施例は本発明の理解を助けるために設ける。本発明の精神から逸脱することなく示された手順に修飾を加えることが可能であることは理解されている。
【００７７】
(配列の説明)
本発明の理解を助けるために、下記の表１は融合タンパク質ＩＦＮαムテインを説明するものである。これらのタンパク質の由来および特性は実施例の中でもさらに詳細に開示される。
【００７８】
【表１】
【００７９】
(図の説明)
図１は、本発明の好ましいＩＦＮαムテインのそれぞれの相対生物学的活性を示す。クローンＩＤ番号および各クローン内で行われた置換は図示の通りである。図は、実施例に述べた生物学的アッセイを用いてＩＦＮレセプター介在細胞活性(＝信号伝達アッセイ)、抗ウイルス活性および抗増殖活性について求めた相対活性を示す。すべての活性は、Ｆｃ−ＩＦＮαタンパク質ＩＦＮ５に相対的に表されており、ＩＦＮ５は、Ｎ末端Ｆｃドメインに直接融合されたＷＴ ＩＦＮα部分を有する。
【００８０】
図２は、細胞培養上清のレセプター信号伝達アッセイの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞は、ＩＦＮ５、ＩＦＮ１２０、ＩＦＮ３１６およびＩＦＮ３１１をコードするプラスミドで過渡的に形質移入した。上清中のタンパク質濃度は、Ｆｃ ＥＬＩＳＡで定量し、２００ｎｇ/ｍｌに希釈した。活性は３倍段階希釈による滴定で測定した。
【００８１】
図３は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＩＦＮα２ａに対する精製ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６の活性の比較を示す
(a)レセプター信号伝達アッセイ。滴定を200ｎｇ/ｍｌから始め、続いて３倍段階希釈を行った。
【００８２】
(b)Daudi細胞抗増殖アッセイ。滴定を200ｎｇ/ｍｌから始め、続いて４倍段階希釈を行った。
【００８３】
(c)抗ウイルスアッセイ。初濃度を、ＩＦＮ３１１には250ｐｇ/ｍｌ、ＩＦＮ３１６には62.5ｐｇ/ｍｌ、ＩＦＮα２ａには6.25ｐｇ/ｍｌとし、滴定を２倍段階希釈で行った。各グラフは、３回の実験から平均によって得たデータを示す。
【００８４】
図４は、合成ペプチド(ＮＢ：ペプチド配列を表３に示す)を用いた経時的免疫原性アッセイの結果を示す。20人の健常人と20人のＨＣＶ患者(ＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標)で治療)を用いて、野生型および修飾ＩＦＮαペプチドの免疫原性を評価した。ＰＢＭＣの増殖を、刺激後の第６、７、８および９日目のトリチウムチミジン取り込みによって評価した
(a)領域１、２および３に跨がるペプチドによる刺激の後での健常人からの正の応答(ＳＩ＞２)。
【００８５】
(b)領域１、２および３に跨るペプチドによる刺激の後でのＨＣＶ患者からの正の応答(ＳＩ＞２)。
【００８６】
(c)領域１、２および３に跨るペプチドに対して、20人の健常人と20人のＨＣＶ患者の一群からいかなる時点でもＳＩ＞２の応答が観察された頻度。
【００８７】
図５．１から５．１２は、本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。配列は一文字コードで示す。各融合タンパク質のＦｃおよびＦｃ−リンカー部分に下線を付けた。ＩＦＮαドメインは下線なしである。クローンＩＤ番号を各配列に対して示す。
【００８８】
(例示的実施例)
実施例１
ＩＦＮα２ｂのクローニングと突然変異誘発
本発明の修飾ＩＦＮαタンパク質は、従来の組換えＤＮＡ手法を用いて作った。成熟したＩＦＮα２ｂのコード配列は、ＰＣＲを用いてヒト胎盤のＤＮＡ(Sigma社、英国プール)からクローニングした。野生型遺伝子を、コントロール試剤と、部位特異的突然変異誘発によって修飾ＩＦＮタンパク質を派生する鋳型との両方として用いた。ＷＴおよび修飾遺伝子を、発現ベクターｐｄＣ−ｈｕＦｃ[Lo K-Mら(1998年)Protein Eng 11：495〜500頁]に、ＩＦＮα２ｂ配列がヒトＩｇＧ１のヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３ Ｆｃ領域に対する直接融合部となるように挿入した。このベクター内のＷＴ ＩＦＮタンパク質をＩＦＮ５と名付けた。
【００８９】
直接融合に加えて、ＣＨ３のＣ末端とＩＦＮα２ｂのＮ末端との間に可撓性リンカーを含むというベクターの修飾を行った。このリンカーのアミノ酸配列は、(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)3ＳＧであり、リンカーを有するＷＴ ＩＦＮタンパク質をＩＦＮ１２０と名付けた。突然変異ＴＮタンパク質のいくつかは、両方の型のベクターで発現され、したがって、例えば、変異体ＩＦＮ３１１(配列番号３)およびＩＦＮ３１６(配列番号２)は、ＩＦＮドメイン内に同じ置換セットを含む一方で、(Ｇ)4Ｓ(Ｇ)4Ｓ(Ｇ）3ＳＧリンカーについて異なっている。ＩＦＮ３１１は直接融合体であり、ＩＦＮ３１６は前記リンカーを含む。
【００９０】
ＤＮＡ配列決定をすべての構築物について行った。これは、所望の置換の導入を確認しかつ、例えば、ＰＣＲのエラーによって外来性の(望まれない)置換が導入されていないことを確立するために入念に行った。
【００９１】
これらの手法の詳細と、ＷＴおよび変異ＩＦＮタンパク質のためのクローニング戦略とは、他で詳細に説明されており[WO 02/085941]、当分野では一般に理解されている。
【００９２】
(実施例２)
ＩＦＮαムテインの設計
ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたＩＦＮα２ｂの変異体は、タンパク質の前記３つの免疫原性領域内に突然変異を含んで構築された。構築および機能検査が関与する突然変異解析の複数のサイクルによって、Ｆｃ連結タンパク質の活性に影響を与えることなく改変できる、これらの領域内の残基を同定した。ここに説明するような信号伝達アッセイ(実施例５を参照)はこの態様における主要なスクリーニング手段であった。突然変異解析の結果を表２に示す。
【００９３】
【表２】
【００９４】
代替残基の選定は、解明されたＮＭＲ構造における標的の位置[Klaus,Wら(1997年)J Mol.Biol.274：661から675頁]と、他のヒトＩＦＮαタンパク質および他の種からの同タンパク質との比較とによって案内された。埋没残基を、アラニンまたは似た大きさの非疎水性残基のどちらかで置き換え、一方、露出残基をすべての可能な非疎水性代替物でスキャンした。
【００９５】
領域１において、成功裏に、すなわち、活性に有意の改良をともなって、置き換えることができた唯一の疎水性残基はＩ２４であった。Ｌ２６、Ｆ２７およびＬ３０は、よく露出されていたが、おそらくは、分子間官能性を有するよく規定された疎水パッチを形成することが理由で、変更することができなかった。
【００９６】
領域２において、よく露出された残基はＦ６４のみであり、それを、活性に幾分の低下をともなってＡに変更した。残基Ｉ６０およびＩ６３は、ほとんど埋没しているが、成功裏にＴに変更することができた。Ｔは、これらの残基が存在するアルファへリックスに水素結合を加えることができる類似した大きさの残基である。残基Ｗ７６は、分子の一方の先端にむかって存在しているが、これを、活性において有意の有益性をもってＨに変更した。
【００９７】
領域３において、成功裏に改変できた残基はすべてよく露出された残基であった。Ｉ１１６およびＬ１２８への変更は、活性において有意の有益性を与え、Ｌ１１７の改変は、若干低減した活性となった。
【００９８】
免疫原性領域３について行われたスキャニングＴ細胞アッセイからのデータも含めることで、設計処理をさらに洗練させた(表４および５，実施例９参照)。免疫学的には最も好都合な単一置換はＦ１２３であったであろうが、これは、信号伝達活性のいかなる有用なレベルにも適合しなかった。対照的に、残基Ｉ１１６とＬ１２８での置換の組合せは、この領域に対するＴ細胞応答を変調することが確認された。良好な活性を示した側鎖の大きさの或る範囲を包含するために、各位置での別の置換も検査した。置換は、Ｉ１１６のＴ、ＮおよびＲへの、Ｌ１２８のＮ、ＨおよびＲへの置換であった。これらの残基の各組合せを、許容できる活性を与えた領域１および２の突然変異(Ｉ２４Ｑ、Ｉ６０Ｔ、Ｆ６４Ａ、Ｗ７６Ｈ)と共に含む９つの突然変異体を作った。
【００９９】
Ｉ１１６ＲおよびＬ１２８ＮをＩ２４Ｑ、Ｉ６０Ｔ、Ｆ６４ＡおよびＷ７６Ｈと共に含む組合せムテインを、ＦｃおよびＩＦＮα融合対の間に可撓性リンカーを含むまたは含まない方式で構築した(それぞれ、ＩＦＮ３１６およびＩＦＮ３１１)。
【０１００】
(実施例３)
融合タンパク質の形質移入と精製
ＨＥＫ２９３(ATCC＃ CRL-1573)細胞とLipofectamine 2000(Invitrogen社、英国ペーズリー)を製造元による記述のように用いて過渡的な形質移入を行った。安定的な形質移入体は、先に記述された[Baum Cら(1994年)Biotechniques 17：1058〜106224頁]ように電気穿孔法を用いてＮＳ０細胞(ECACC＃ 85110503)において作り、100ｎＭメトトレキセートを含む培養液で選択した。すべての細胞系は、10％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ内で抗生物質および抗真菌物質と共に維持した。融合タンパク質は、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａクロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ)によって精製した。簡単に説明すると、１ｍｌのＰｒｏｓｅｐ(登録商標)−Ａカラム(Millipore社、英国ワットフォード)をｐＨ７．４のＰＢＳ中で平衡化した後で、１/20倍体積の１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４でｐＨ調節された０．２μＭの濾過細胞培養液上清(５００ｍｌまで)を載せた。カラムを５０ｍｌのＰＢＳ ｐＨ７．４で洗い、融合タンパク質を０．１Ｍクエン酸緩衝液ｐＨ３．０で溶出させ、０．９ｍｌ分画を集めた。分画は、すぐに０．１ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０で中和した。ＳＥＣは、０．１％のＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化および流下した３．２／３０カラムのＳｕｐｅｒｄｅｘ２００(Amersham Pharmacia社、英国アマシャム)で行った。主要ピークを跨ぐ分画を集めて、融合タンパク質を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ(商標)ソフトウェア(Dnastar社、米国ウィスコンシン州マジソン)を用いて計算した２８０ｎｍでのモル吸光係数を用いて定量した。濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイ(Pierce社、英国チェスター)を用いて確認した。ＩＦＮα成分は融合タンパク質の分子量の42％を示しており、したがって濃度をこの因子によって調節した。
【０１０１】
(実施例４)
細胞培養液上清中の融合タンパク質の定量
融合タンパク質を、下記の方式のＥＬＩＳＡ中のヒトＩｇＧ１ Ｆｃの量を検出することによって定量した。ＥＬＩＳＡプレート(Ｄｙｎｅｘ Ｉｍｍｕｌｏｎ４)に、ＰＢＳ ｐＨ７．４で１/1500に希釈したマウスモノクローナル抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体を100μｌ/ウェルで、２時間、37℃でコーティングした。プレートを、100μｌ/ウェルのＰＢＳ／0.05％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗った。ヒトＩｇＧ標準品(The Binding Site社、英国バーミンガム)をＰＢＳ／２％ＢＳＡで２μｇ/ｍｌに希釈し、プレートの縦方向に二組２倍希釈液を作った。検査試料を、二組、ＰＢＳ／２％ＢＳＡで１/100および１/500に希釈し、アッセイした。プレートを、室温で１時間インキュベートし、前回のように洗った。100μｌ/ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的ペルオキシダーゼ複合物(The Binding Site社、英国バーミンガム)のＰＢＳによる１/1000希釈液を用いて検出を行い、プレートを前回のように洗い、ＳｉｇｉｍａＦａｓｔ ＯＰＤを100μｌ/ウェル(Sigma社、英国プール)用いて発色させた。呈色反応を５０μｌの２Ｍ硫酸の添加によって止め、Ａｎｔｈｏｓ ＨＴＩＩプレートリーダーで４９２ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１０２】
(実施例５)
Ｆｃ−ＩＦＮα２ｂ活性のためのアッセイ(信号伝達アッセイ)
変異体およびＷＴ ＩＦＮ融合タンパク質をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３細胞に過渡的に形質移入し、３日後に細胞培養液上清中の融合体のＦｃ部分について定量した。上清の活性を信号伝達アッセイを用いてアッセイした。このアッセイにおける活性の測定は、細胞表面に発現されたＩ型インターフェロンレセプターの引き金を引くこと(活性化)を必要とする。活性化されたレセプターは、細胞内のＪａｋ／ＳＴＡＴ１信号伝達経路の活性化へと繋がる。経路は、タンパク質ＳＴＡＴ１のリン酸化へと達して、それがインターフェロン刺激応答要素(ＩＳＲＥ)に結合することを可能にする。ＩＳＲＥは、シス作動性のＤＮＡセグメントであり、その下流に連結された遺伝子(例えば、レポーター遺伝子)の転写を促進することができる。
【０１０３】
Ｉ型インターフェロンレセプターからの信号伝達を誘起する本発明の融合タンパク質の能力を、市販の信号伝達レポーターベクターｐＩＳＲＥ−ＴＡ−ｌｕｃ(Clonetech Europe社、ベルギー国ブリュッセル)を用いてアッセイした。ベクターは、インターフェロン刺激応答要素(ＩＳＲＥ)の制御下のホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む。ＩＳＲＥ／ルシフェラーゼカセット(ＮｏｔＩ／ＢａｍＨＩ断片上)を、エピソームの哺乳動物発現ベクターｐＲＥＰ４(Invitrogen社、英国ペーズリー)へＲＳＶプロモーター／ＭＣＳ／ＳＶ４０ポリＡ(ＳａｌＩ分解で除去)の代わりとして移して、ｐＲＥＰ−ＩＳＲＥを作製した。このベクターをＨＥＫ２９３細胞に形質移入し、安定した形質移入体を100μｇ/ｍｌのハイグロマイシンで選択してＨＥＫ−ＩＳＲＥ細胞を作製した。Ｆｃ−ＩＦＮα２ｂ活性についてのアッセイは、ＨＥＫ−ＩＳＲＥ細胞を４×１０5細胞/ｍｌの密度で、黒い壁で透明な底の96ウェル照度計プレート(Greiner社、英国グロスター、ストーンハウス)のウェルにプレーティングし(100μｌ/ウェル)て、抗生物質の非存在下の通常の条件下で24時間インキュベートすることによって行った。
【０１０４】
プレート上で、標準ＩＦＮα２ａの２×１０8ＩＵ/ｍｇ(Peprotech社、英国ロンドン)および融合タンパク質の二組段階希釈液を抗生物質なしの培養液で作り、一晩インキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、製造者による指示に従って調製した100μｌのSteady-Glo試剤(Promega社、英国サウサンプトン)の添加によって検出し、Wallac Microbeta Trilux照度計を用いて発光測定を行った。
【０１０５】
図１は、各ＩＦＮαムテインの相対活性を表にしたものである。図２は、融合タンパク質ＩＦＮ５、ＩＦＮ１２０、ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６の信号伝達活性曲線を示す。これらの結果は、変異体融合タンパク質が、天然融合タンパク質(ＩＦＮ１２０およびＩＦＮ５、それぞれリンカーを有するおよび有していないもの)と比べて活性を改良させたことを示す。天然融合タンパク質は、リンカーのあるものとないものどちらも、それぞれ４．５および５ｎｇ/ｍｌという非常によく似たＥＤ50値を有し、天然ＩＦＮαに関しては、ＦｃおよびＩＦＮα分子の間のリンカーの存在は活性に対して何ら作用を有していないことを示している。ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６は、３．４および０．５ｎｇ/ｍｌのＥＤ50値を有し、したがって、コントロールの＞1.3倍および＞９倍の活性であり、配列に対する変更が活性に有益な効果をもたらしたことを示している。このアッセイにおける驚くべき結果が、天然ＩＦＮαの構成と対照的に、ＦｃおよびＩＦＮα分子の間のリンカーの存在が融合タンパク質の活性を改良した、ということに見られる。
【０１０６】
融合タンパク質ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６の信号伝達活性も、天然ＩＦＮα調製物(Perotech、英国ロンドン)と比較したが、その活性曲線を図３ａに示す。
【０１０７】
(実施例６)
修飾Ｆｃ−ＩＦＮα２ｂ融合タンパク質の活性(抗増殖)：
融合タンパク質の抗増殖特性を、Daudi細胞増殖の阻害によって評価し、次のように実行した。Daudi細胞(ATCC＃ CCL−213)を、抗体を加え10％ＦＢＳを加えたＲＰＭＩ１６４０(Daudi培養液)中で生育した。中間対数期の細胞を、２×１０5細胞/ｍｌに希釈し、７５μｌ/ウェルで96ウェルマイクロタイタープレートにプレーティングした。標準ＩＦＮα２ａ(Peprotech)および融合タンパク質の希釈液を７５μｌのDaudi培養液で三組作り、細胞に添加した。段階１/４希釈液をプレートにわたって作った。したがって、プレート毎に１つの標準品と１つの検査試料をアッセイした。プレートを３日間インキュベートした。検出は、製造元による記述のように調製したAqueous One試剤(Promega社)を用いて行った。３０μｌの試剤を各ウェルに添加し、プレートを４時間インキュベートし、４９２ｎｍでの吸光度をＡｎｔｈｏｓ ＨＴＩＩプレートリーダーを用いて調べた
図３ｂは、天然(非融合タンパク質)ＩＦＮα調製物(Peprotech社)に相対的に融合タンパク質ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６に関してプロットされた抗増殖特性を示す。
【０１０８】
(実施例７)
修飾Ｆｃ−ＩＦＮα２ｂ融合タンパク質の活性(抗ウイルス性)：
融合タンパク質の抗ウイルス特性を、先に記述された[Rubinstein Ｓら(1981年)Ｊ Virol.37：755〜758頁]ように、ヒト肺癌腫Ａ５４９細胞(ATCC＃ CCl-185)に対する脳心筋炎ウイルス(ＥＭＣＶ)の細胞変性効果の阻害アッセイによってアッセイした。
【０１０９】
図１は、このアッセイにおけるいくつかのＩＦＮαムテインの相対活性を表にしたものである。最大相対活性は、融合タンパク質ＩＦＮ３１６によって示され、コントロールに対する算出増大倍率は36であった。驚くべき結果は、ＩＦＮ３１６におけるリンカーの存在が、リンカーなしの対応物質ＩＦＮ３１１(相対活性＝7.4)に比べて、その抗ウイルス活性に顕著な有益効果を有することである。この顕著な差異は、リンカーありおよびなしのＷＴおよびＩＦＮα融合タンパク質の比較(ＩＦＮ５対ＩＦＮ１２０)では見られない。図３ｃは、天然(非融合タンパク質)ＩＦＮα調製物(Peprotech社)に相対的に融合タンパク質ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６についてプロットした抗ウイルス活性特性を示す。
【０１１０】
(実施例８)
ヒトＩＦＮαのＴ細胞エピトープマッピングおよび経時的Ｔ細胞アッセイによる免疫原性領域の解析
ヒトＩＦＮαの初期Ｔ細胞エピトープマッピング研究を、合成ペプチドと健康なドナーからのＰＢＭＣとを用いて行ったが、このアッセイの結果と詳細は他で記述されている[WO 02/085941]。ＩＦＮα内で同定されＲ１、Ｒ２およびＲ３と名付けられた３つの免疫原性領域について別の解析を、経時的Ｔ細胞アッセイを用いて行った。このアッセイは、20人の健常人(通常ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子の＞80％をカバーするように選ばれた)から供与された血液、およびＮＩＣＥガイドラインに従って過去にＩＦＮα２ｂ(ＩｎｔｒｏｎＡ(登録商標))で治療を受けた20人の慢性ＨＣＶ感染患者からの血液から単離されたＰＢＭＣを用いて行った(患者研究は、英国ケンブリッジのAddenbrooke's病院のG.Alexander医師と協力して行った)。免疫原性のエピトープＲ１、Ｒ２およびＲ３は、無処理のＩＦＮαタンパク質の免疫活性特性がこのアッセイに適合しないので、合成ペプチドとして検査した。これらのアッセイでは、24ウェルプレートでの２〜４×１０6個のＰＢＭＣ/ウェルのバルク培養を６から９日間、免疫原性領域にわたるペプチドと共にインキュベートした(表３参照)。増殖は多様な時点で下記のようにして評価した。すなわち、バルク培養を穏やかに再懸濁し、ＰＢＭＣの試料を移して、Ｕ字形底の96ウェルプレートの三組ウェル内で１μＣｉ/ウェルのトリチウムチミジンと共に18時間インキュベートした後、Tomtec Mach IIIプレートハーベスターを用いてガラス繊維フィルターマット上に収集し、ｃｐｍ値をWallac microplate betaカウンターを用いたシンチレーション計数によって測定した。
【０１１１】
【表３】
【０１１２】
図４ａは、免疫原性領域１、２および３に跨るペプチドによる刺激に対する健常人の正の応答(ＳＩ＞２)のすべてを示す。修飾ペプチドは健常人において増殖を誘起することはできなかったが、一方で、野生型ペプチドに対する正の応答が６人のドナーにおいて観察された(図４ａ)。ＨＣＶ患者は、３つの領域すべての野生型ペプチドに対して応答することが確認されたが、一方で、修飾ペプチドについては、領域３に対してのみ応答した(図４ｂ)。ペプチドに対する応答の頻度の解析によれば、領域２と３が、最高頻度の増殖を、すなわち、検査された健康なドナーの15％において増殖を誘起することを示した(図４ｃ)。一方で、ＨＣＶ患者では、領域３が最高頻度の応答(25％)を誘起し、続いて領域１(10％)そして領域２(５％)であった(図４ｃ)。
【０１１３】
本データおよび他のデータから、Ｔ細胞エピトープマッピングの結果が、領域３から派生したペプチドもまた健康なドナーにおいて最高頻度で増殖を誘起することを示すので、領域３は免疫優性Ｔ細胞エピトープを含むと考えられる[WO 02/085941]。健常人において領域１ペプチドに対する応答は第７日目に観察され(図４ａで、ドナー11、ドナー13)、一方でＨＣＶ患者限定Ｔ細胞応答において６日目で増殖が検出された。領域２ペプチドは健康なドナーでは９日目において増殖を誘起する傾向があった(図４ａで、ドナー６とドナー18)一方でＨＣＶ患者限定Ｔ細胞応答は８日目で観察された(図４ｃで、ドナー13)。領域１および２の応答とは異なり、領域３ペプチドは、７および８日目にそれぞれ観察された増殖についてＨＣＶ患者よりも健常人においてより急速な応答を誘起した。
【０１１４】
(実施例９)
ＩＦＮα免疫原性領域３のスキャニングＴ細胞アッセイ
免疫原性領域３のスキャニングＴ細胞アッセイからのデータも含めることでムテイン設計プロセスをさらに洗練させた。Ｔ細胞アッセイを13人のドナーの試料からのＰＢＭＣを用いて行った。試料の過半数は、少なくとも、問題とされていたＷＴペプチド配列に対して応答することが前もって決定されていた。ＩＦＮαの残基Ｔ１０８〜ＷＩ４０に跨る８つの合成ペプチドのファミリーを作製した。ペプチドのファミリーは、ＷＴ配列と、表４に同定するような７つの異なる置換配列とを含んでいた。すべてのアッセイは三組行った。13人のドナーの試料の平均ＳＩを算出した。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】
アラニンをスキャニングアミノ酸として用いた。ただし選定を助ける活性データが利用可能である場合を除く(Ｙ１２２は突然変異体が活性でなかったのでスキャンしなかった)。Ｆ１２３Ｈが、野生型と比べてＳＩが13人のドナー全体にわたって常に低く、全体的なＴ細胞応答を低減することにおいて最も効果的な突然変異であることが判明した。しかしＦ１２３を突然変異させて十分な活性を回復することはできなかった。変化のうちのいくつかは、ＷＴに対する正の応答の頻度が等しかった(表４)が、それらが応答したのは、いくらか重なってはいたが、同じサブセットのドナーではなかった。突然変異体の平均ＳＩは一般にＷＴペプチドよりも低く、増大した正の応答の頻度を与えたＬ１２８Ａに関してさえも低くかった。Ｖ１１９Ａは、ドナーのセットよりも常に高いＳＩを与えたが、正の応答の頻度はＷＴに似ていた。領域３ムテインの代替組合せを免疫原性アッセイを用いて検査した。領域３を跨ぎアミノ酸の各組合せを含む９つのペプチドを合成し、Ｔ細胞増殖アッセイで再検査した(表５)。
【０１１７】
【表５】
【０１１８】
15％のドナーが、ＷＴペプチドにＳＩ＞１．９５で応答した。すべてのドナー試料におけるＷＴペプチドに対する平均ＳＩは１．４３であった。変化の組合せはどれも、20人のドナーの一群に対する平均ＳＩがＷＴペプチドよりも低かったが、Ｉ１１６Ｎ＋Ｌ１２８Ｒを含むペプチドについては、一人のドナーで正の応答(ＳＩ＞１．９５)となった。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】本発明の好ましいＩＦＮαムテインのそれぞれの相対生物学的活性を示す。
【図２】細胞培養上清のレセプター信号伝達アッセイの結果を示す。
【図３】Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ＩＦＮα２ａに対する精製ＩＦＮ３１１およびＩＦＮ３１６の活性の比較を示す。
【図４ａ】合成ペプチドを用いた経時的免疫原性アッセイの結果を示す。
【図４ｂ】合成ペプチドを用いた経時的免疫原性アッセイの結果を示す。
【図４ｃ】合成ペプチドを用いた経時的免疫原性アッセイの結果を示す。
【図５．１】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．２】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．３】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．４】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．５】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．６】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．７】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．８】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．９】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．１０】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．１１】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【図５．１２】本発明の好ましい分子のタンパク質配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改良された生物学的および免疫原性特性を有し、下記アミノ酸配列を有する修飾ヒトインターフェロンアルファ２(ＩＦＮα２)分子
【化１】
（式中、
Ｘ0＝ＦｃまたはＦｃリンカー、
Ｆｃ＝抗体のＦｃドメイン
リンカー＝６から２５個のアミノ酸からなるリンカーペプチド
Ｘ1＝Ｉ、Ｑ
Ｘ2＝Ｈ、Ｙ
Ｘ3＝Ｉ、Ｔ；
Ｘ4＝Ｆ、Ｔ、Ａ
Ｘ5＝Ｗ、Ｈ；
Ｘ6＝Ｙ、Ｄ；
Ｘ7＝Ｉ、Ｎ、Ｔ、Ｐ、Ｒ
Ｘ8＝Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｄ、Ｓ、Ｎおよび
Ｘ9＝Ｎ、Ｓ；
ただし、同時にＸ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝ＮであるＩＦＮα分子を除外する）。
【請求項２】
Ｘ5＝ＨおよびＸ8＝Ｎ
である請求項１に記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項３】
Ｘ3＝ＴおよびＸ4＝Ａ
である請求項２に記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項４】
下記の化合物からなる群から選択した請求項１から５のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテイン。
（ｉ）Ｘ1＝Ｑ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｒ、Ｘ8＝ＮおよびＸ9＝Ｎ
（ｉｉ）Ｘ1＝Ｑ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
（ｉｉｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｔ、ＲまたはＮ、Ｘ8＝ＮおよびＸ9＝Ｎ
（ｉｖ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
（ｖ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｙ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｔ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
（ｖｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｐ、ＴまたはＮ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
（ｖｉｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
（ｖｉｉｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
（ｉｘ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
（ｘ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝Ｔ、Ｓ、Ｎ、ＨまたはＤおよびＸ9＝Ｎ
（ｘｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
（ｘｉｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｄ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
【請求項５】
Ｆｃが、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域ドメインであり、そのＣ末端で前記ムテインに連結された請求項１から４のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項６】
Ｆｃドメインが単量体である請求項５に記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項７】
リンカーペプチドが１２から２０個のアミノ酸からなる請求項１から６のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項８】
前記リンカーペプチドが(Ｇ)４Ｓ(Ｇ４)Ｓ(Ｇ４)ＳＧである請求項７に記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項９】
増強された免疫原性特性が免疫原性の損失をもたらし、前記免疫原性の損失は、元々無修飾であった分子に提示されるＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを欠失させることによって達成される請求項１から８のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項１０】
生物学的Ｔ細胞増殖アッセイにおいてタンパク質全体として検査したときに、親の無修飾のＩＦＮ分子よりも小さくかつ２未満の刺激指数(ＳＩ)を示す請求項９に記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテインをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１２】
前記請求項のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテインを、任意選択で、薬剤として許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物。
【請求項１３】
Ｃ型肝炎ウイルス感染患者を治療するための薬物の製造のための請求項１から１１のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテインの使用。
【請求項１】
改良された生物学的および免疫原性特性を有し、下記アミノ酸配列を有する修飾ヒトインターフェロンアルファ２(ＩＦＮα２)分子
【化１】
（式中、
Ｘ0＝ＦｃまたはＦｃリンカー、
Ｆｃ＝抗体のＦｃドメイン
リンカー＝６から２５個のアミノ酸からなるリンカーペプチド
Ｘ1＝Ｉ、Ｑ
Ｘ2＝Ｈ、Ｙ
Ｘ3＝Ｉ、Ｔ；
Ｘ4＝Ｆ、Ｔ、Ａ
Ｘ5＝Ｗ、Ｈ；
Ｘ6＝Ｙ、Ｄ；
Ｘ7＝Ｉ、Ｎ、Ｔ、Ｐ、Ｒ
Ｘ8＝Ｌ、Ｔ、Ｈ、Ｄ、Ｓ、Ｎおよび
Ｘ9＝Ｎ、Ｓ；
ただし、同時にＸ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝ＮであるＩＦＮα分子を除外する）。
【請求項２】
Ｘ5＝ＨおよびＸ8＝Ｎ
である請求項１に記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項３】
Ｘ3＝ＴおよびＸ4＝Ａ
である請求項２に記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項４】
下記の化合物からなる群から選択した請求項１から５のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテイン。
（ｉ）Ｘ1＝Ｑ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｒ、Ｘ8＝ＮおよびＸ9＝Ｎ
（ｉｉ）Ｘ1＝Ｑ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
（ｉｉｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｔ、ＲまたはＮ、Ｘ8＝ＮおよびＸ9＝Ｎ
（ｉｖ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ａ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
（ｖ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｙ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｔ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
（ｖｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｐ、ＴまたはＮ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
（ｖｉｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
（ｖｉｉｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
（ｉｘ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｔ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＴおよびＸ9＝Ｓ
（ｘ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝Ｔ、Ｓ、Ｎ、ＨまたはＤおよびＸ9＝Ｎ
（ｘｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｈ、Ｘ6＝Ｙ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
（ｘｉｉ）Ｘ1＝Ｉ、Ｘ2＝Ｈ、Ｘ3＝Ｉ、Ｘ4＝Ｆ、Ｘ5＝Ｗ、Ｘ6＝Ｄ、Ｘ7＝Ｉ、Ｘ8＝ＬおよびＸ9＝Ｎ
【請求項５】
Ｆｃが、ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域ドメインであり、そのＣ末端で前記ムテインに連結された請求項１から４のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項６】
Ｆｃドメインが単量体である請求項５に記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項７】
リンカーペプチドが１２から２０個のアミノ酸からなる請求項１から６のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項８】
前記リンカーペプチドが(Ｇ)４Ｓ(Ｇ４)Ｓ(Ｇ４)ＳＧである請求項７に記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項９】
増強された免疫原性特性が免疫原性の損失をもたらし、前記免疫原性の損失は、元々無修飾であった分子に提示されるＭＨＣクラスＩＩ結合Ｔ細胞エピトープを欠失させることによって達成される請求項１から８のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項１０】
生物学的Ｔ細胞増殖アッセイにおいてタンパク質全体として検査したときに、親の無修飾のＩＦＮ分子よりも小さくかつ２未満の刺激指数(ＳＩ)を示す請求項９に記載のＩＦＮα２ムテイン。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテインをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１２】
前記請求項のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテインを、任意選択で、薬剤として許容される担体、希釈剤または賦形剤と共に含む医薬組成物。
【請求項１３】
Ｃ型肝炎ウイルス感染患者を治療するための薬物の製造のための請求項１から１１のいずれかに記載のＩＦＮα２ムテインの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００７−５２４３５１（Ｐ２００７−５２４３５１Ａ）
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０１８７４（Ｐ２００６−５０１８７４）
【出願日】平成１６年２月１８日（２００４．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００１５２４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４４８６
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年２月１８日（２００４．２．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００１５２４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７４４８６
【国際公開日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【出願人】（５９１０３２５９６）メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフトング (1,043)
【氏名又は名称原語表記】Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ
【住所又は居所原語表記】Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ Ｓｔｒ． ２５０，Ｄ−６４２９３ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｇｅｒｍａｎｙ
【Ｆターム（参考）】
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