新規ポリペプチド、関節リウマチの診断方法、及び診断用キット
【課題】関節リウマチのマーカーとなり得る新規ポリペプチド、そのポリペプチドを検出する工程を含む関節リウマチの診断方法、及びその診断方法に使用される診断用キットを提供する。
【解決手段】本発明に係る関節リウマチの診断方法は、被検動物より採取した生体試料中から下記（ａ）及び（ｂ）の少なくとも一方のポリペプチドを検出する工程を含む。
（ａ）タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
（ｂ）タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
【解決手段】本発明に係る関節リウマチの診断方法は、被検動物より採取した生体試料中から下記（ａ）及び（ｂ）の少なくとも一方のポリペプチドを検出する工程を含む。
（ａ）タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
（ｂ）タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ポリペプチド、そのようなポリペプチドを検出する工程を含む関節リウマチの診断方法、及びそのような診断方法に使用される診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）は、関節の滑膜組織を病変の主座とする慢性炎症性疾患であり、有病率が人口の約１％を占める疾患である。関節リウマチは、その初期には滑膜炎を来し、次第に軟骨や骨が侵され、進行すると関節が破壊され変形する。また、症状の経過は、関節炎の寛解・再燃を繰り返し、完治する例や急速に進行する例など多彩である。
【０００３】
関節リウマチの診断は主に症状によってなされるが、近年、患者の血清中に含まれる自己抗体をマーカーとした診断方法が注目されている。そのような自己抗体としては、リウマトイド因子（変性ＩｇＧに対する自己抗体）、抗環状シトルリン化ペプチド抗体（抗ＣＣＰ抗体）等が知られている（非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、これまでの報告では、リウマトイド因子の感度は７５〜８０％、特異度は５０〜７０％、抗ＣＣＰ抗体の感度は５０〜７５％、特異度は８５〜９５％であり、必ずしも満足のいくものではなかった（非特許文献２，３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ａ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒ．， ４： ８７−９３， ２００２
【非特許文献２】Ａｖｏｕａｃ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｈｅｕｍ． Ｄｉｓ． ６５： ８４５−８５１， ２００６
【非特許文献３】ｖａｎ Ｖｅｎｒｏｏｉｊ ＷＪ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １１４３： ２６８−２８５， ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、これまでに知られていない新規マーカーの探索を行い、見出された新規マーカーをもとに関節リウマチの診断方法及び診断用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
関節リウマチ患者では、血中のリンパ球が活性化されて血管内皮細胞との細胞接着が亢進するのと同時にリンパ球遊走も亢進する結果、血管外にリンパ球が浸潤し、この浸潤リンパ球が様々な炎症を引き起こすことが知られている。そこで本件発明者は、新規マーカーの探索を行うにあたり、細胞と基質とが接着する領域、特にリンパ球内では細胞接着領域に主に集中して発現される高分子細胞骨格タンパク質であるタリン（Ｔａｌｉｎ）に着目した。
【０００８】
タリンは、ＦＥＲＭ領域を含む分子量４７ｋＤａのＮ末端領域と、一束のαヘリックスからなる分子量１９０ｋＤａのＣ末端領域とから構成されるタンパク質である。ＦＥＲＭ領域はさらに、Ｎ末端側からＦ１ドメイン、Ｆ２ドメイン、Ｆ３ドメインの３つのサブ領域に分けられている。生体内では、カルパイン（Ｃａｌｐａｉｎ）によって切断されたＮ末端領域のポリペプチド、その中でもＦ３ドメインがインテグリンβサブユニットに結合し、インテグリンの細胞内から細胞外へのシグナル伝達を増強させ、細胞接着や細胞遊走を亢進することが知られている。
【０００９】
本件発明者は、関節リウマチ患者より採取したリンパ球におけるタリン発現について検討した。その結果、（ｉ）関節リウマチ患者においては、通常の４７ｋＤａのポリペプチドのフラグメントである２種類のポリペプチドが検出されること、（ｉｉ）一方はＦ１ドメインを少なくとも含む約３２ｋＤａのポリペプチドであり、他方はＦ３ドメインを少なくとも含む約１５ｋＤａのポリペプチドであること、（ｉｉｉ）この２種類のポリペプチドをマーカーとして用いることで関節リウマチを高精度に診断できること、を見出した。
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものであり、具体的には以下のとおりである。
【００１０】
［１］ タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有する新規ポリペプチド。
【００１１】
［２］ タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有する新規ポリペプチド。
【００１２】
［３］ 関節リウマチに罹患している被検動物より採取した生体試料中から検出可能である上記［１］又は［２］記載の新規ポリペプチド。
【００１３】
［４］ 被検動物より採取した生体試料中から下記（ａ）及び（ｂ）の少なくとも一方のポリペプチドを検出する工程を含む関節リウマチの診断方法。
（ａ）タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
（ｂ）タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
【００１４】
［５］ 前記被検動物がヒトである上記［４］記載の関節リウマチの診断方法。
【００１５】
［６］ 上記［４］又は［５］記載の関節リウマチの診断方法に使用するための診断用キット。
【００１６】
［７］ タリンのＮ末端からカルパイン切断部位までの範囲に特異的に結合する抗体を含有してなる上記［６］記載の診断用キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、関節リウマチを高精度に診断するための新規ポリペプチド、そのようなポリペプチドを検出する工程を含む関節リウマチの診断方法、及びそのような診断方法に使用される診断用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明における約３２ｋＤａのポリペプチド及び約１５ｋＤａのポリペプチドを説明するための模式図である。
【図２】末梢血単核球（ＰＢＭＣ）ライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、Ｈ−１８抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図３】ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、Ｈ−１８抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図４】ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、Ｈ−１８抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図５】ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、ＴＡ２０５抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図６】ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、ＴＡ２０５抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図７】ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、ＴＡ２０５抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図８】健常者のＰＢＭＣライセートとＲＡ患者のＰＢＭＣライセートとを混和した後、ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、Ｈ−１８抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図９】ＧＳＴとタリンのＦ３ドメインを含むフラグメントとが融合したＧＳＴ融合タンパク質を示す模式図である。
【図１０】ＧＳＴ融合タンパク質と健常者又はＲＡ患者のＰＢＭＣライセートとを混和した後、ＳＤＳ電気泳動を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［新規ポリペプチド及び関節リウマチの診断方法］
本発明に係る関節リウマチの診断方法は、被検動物より採取した生体試料中から下記（ａ）及び（ｂ）の少なくとも一方のポリペプチドを検出する工程を含むものである。
（ａ）タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
（ｂ）タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
【００２０】
また、本発明に係る新規ポリペプチドは、上記（ａ）及び（ｂ）の２種類のポリペプチドに対応するものである。
【００２１】
前述したとおり、タリンは、ＦＥＲＭ領域を含む分子量４７ｋＤａのＮ末端領域と、一束のαヘリックスからなる分子量１９０ｋＤａのＣ末端領域とから構成されるタンパク質である。ＦＥＲＭ領域はさらに、Ｎ末端側からＦ１ドメイン、Ｆ２ドメイン、Ｆ３ドメインの３つのサブ領域に分けられている。そして、生体内では、カルパインによって４７ｋＤａのＮ末端領域と１９０ｋＤａのＣ末端領域とに切断される。
【００２２】
ヒトの場合、タリン１、タリン２の２種類のアイソフォームが存在する。タリン１のｍＲＮＡ配列、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１，２に示す。また、タリン２のｍＲＮＡ配列、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号３，４に示す。
タリン１に関しては、カルパインによる切断部位は４３１番目のアミノ酸と４３６番目のアミノ酸との間、Ｆ１ドメインは１１７番目から２０６番目までのアミノ酸配列、Ｆ２ドメインは２０７番目から３０８番目までのアミノ酸配列、Ｆ３ドメインは３０９番目から４０５番目までのアミノ酸配列にそれぞれ対応する。
一方、タリン２に関しては、カルパインによる切断部位は４３４番目のアミノ酸と４３９番目のアミノ酸との間、Ｆ１ドメインは１１９番目から２０８番目までのアミノ酸配列、Ｆ２ドメインは２０９番目から３１１番目までのアミノ酸配列、Ｆ３ドメインは３１２番目から４０８番目までのアミノ酸配列にそれぞれ対応する。
【００２３】
上記（ａ）及び（ｂ）の２種類のポリペプチドはいずれも、タリンがカルパインで切断された後の４７ｋＤａのポリペプチドのフラグメントに相当するものである。
図１に示すように、２４０ｋＤａのタリンはカルパインによって４７ｋＤａのＮ末端領域と１９０ｋＤａのＣ末端領域とに切断される。しかし、本件発明者の研究により、関節リウマチ（ＲＡ）に罹患している被検動物においては、この４７ｋＤａのポリペプチドが何らかの機序によってＦ２ドメイン内で切断され、約３２ｋＤａのポリペプチドと約１５ｋＤａのポリペプチドとが優位に出現していることが分かった。また、この切断部位は、Ｆ２ドメインのＣ末端に存在するＨ４領域内に存在することが推測された。なお、Ｈ４領域は、タリン１に関しては２９１番目のＧｌｕから３０８番目のＴｙｒまで、タリン２に関しては２９４番目のＧｌｕから３１１番目のＴｙｒまでのアミノ酸配列にそれぞれ対応する。
【００２４】
したがって、上記（ａ）及び（ｂ）の２種類のポリペプチドを関節リウマチのマーカーとすることが可能である。換言すれば、被検動物より採取した生体試料中から上記（ａ）及び（ｂ）の２種類のポリペプチドの少なくとも一方を検出することで、関節リウマチを診断することが可能である。
【００２５】
被検動物としては、関節リウマチに罹患し得る動物であれば特に制限はなく、目的に応じて選択することができる。例えば、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ネコ、ウサギ、モルモット等が挙げられるが、その中でもヒトが好ましい。
また、生体試料としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができる。例えば、末梢血、関節滑膜、関節液等が挙げられる。その中でも、採取が簡便である点で末梢血が好ましい。
【００２６】
上記（ａ）及び（ｂ）の２種類のポリペプチドの少なくとも一方を検出する方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法が挙げられるが、その中でもウエスタンブロット法が好ましい。
【００２７】
検出に用いる一次抗体としては、タリンのＮ末端からカルパイン切断部位までの範囲、すなわち上記の４７ｋＤａのポリペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限はない。例えば、上記（ａ）のポリペプチドを検出可能な一次抗体としては、Ｈ−１８抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）、Ｈ−３００抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）等が挙げられる。また、上記（ｂ）のポリペプチドを検出可能な一次抗体としては、ＴＡ２０５抗体（アブカム社）、Ｈ−３００抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）等が挙げられる。
【００２８】
［診断用キット］
本発明に係る診断用キットは、本発明に係る関節リウマチの診断方法に使用するためのものである。この診断用キットには、例えば、タリンのＮ末端からカルパイン切断部位までの範囲、すなわち上記の４７ｋＤａのポリペプチドに特異的に結合する抗体が含まれる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。なお、以下の実施例では、関節リウマチ患者（ＲＡ患者）２１例、全身性エリテマトーデス患者（ＳＬＥ患者）９例、及び健常者８例を被検者とした。
【００３０】
＜実施例１：ウエスタンブロット法によるタリンのフラグメントの検出＞
実施例１では、カルパイン処理後の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）ライセートに含まれるタリンのフラグメントをウエスタンブロット法により検出した。
【００３１】
まず、Ｆｉｃｏｌｌ法を用いて各被検者からＰＢＭＣを採取後、１×１０７個のＰＢＭＣあたり１ｍＬの溶解バッファ（１０ｍＭ トリエタノールアミン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、１０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０μｇ／ｍＬ リューペプチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬ アプロチニン）を加えて１５分間振盪混和した。さらに、１分間超音波破砕し、遠心分離を行った後、上清を回収してＰＢＭＣライセートとした。
次いで、このＰＢＭＣライセートにＣａＣｌ２とカルパイン１（シグマアルドリッチ社）とを加えて２５℃で１時間振盪混和させ、ＳＤＳサンプルバッファを加えて５分間煮沸させた後、リアルゲルプレート（バイオクラフト社）を用いてＳＤＳ電気泳動を行った。その後、ジェルコードブルー染色試薬（サーモサイエンティフィック社）を用いてゲル染色を行い、目的のタンパク質のバンドを確認した。
【００３２】
ＰＢＭＣライセートの電気泳動後、泳動したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＶＤＦ膜をＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（ＤＳファーマバイオメディカル社）中、室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体溶液と室温で１時間振盪混和して洗浄し、さらに二次抗体溶液と室温で１時間振盪混和して洗浄した。一次抗体としては、Ｈ−１８抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）又はＴＡ２０５抗体（アブカム社）を用いた。また、Ｈ−１８抗体に対する二次抗体としてはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体を用い、ＴＡ２０５抗体に対する二次抗体としてはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。その後、ＰＶＤＦ膜を洗浄し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア社）を用いてバンドを検出した。一次抗体としてＨ−１８抗体を用いた結果を図２〜４に示し、一次抗体としてＴＡ２０５抗体を用いた結果を図５〜７に示す。
【００３３】
図２〜７から分かるように、健常者の場合、Ｈ−１８抗体及びＴＡ２０５抗体のいずれによっても、通常の４７ｋＤａのバンド（星印）が確認されたが、ＲＡ患者の場合、Ｈ−１８抗体では約３２ｋＤａのバンド（矢印）が優位に確認され、ＴＡ２０５抗体では約１５ｋＤａのバンド（矢印）が優位に確認された。
Ｈ−１８抗体はタリンのＮ末端を認識することから、この約３２ｋＤａのバンドは、タリンがカルパイン１で切断された後の４７ｋＤａのポリペプチドのうち、Ｎ末端側の約３２ｋＤａのポリペプチドに対応すると考えられる。また、ＴＡ２０５抗体はタリンの１３９番目から４３３番目のアミノ酸を認識することから、この約１５ｋＤａのバンドは、同じく４７ｋＤａのポリペプチドのうち、Ｃ末端側の約１５ｋＤａのポリペプチドに対応すると考えられる。
【００３４】
この約３２ｋＤａ及び約１５ｋＤａのポリペプチドは、ＲＡ患者の血中で４７ｋＤａのポリペプチドが何らかの機序により切断されて生じた可能性がある。そこで、このことを確認するため、同一例の健常者のＰＢＭＣライセートと、数例のＲＡ患者のＰＢＭＣライセートとをそれぞれ振盪混和し、上記と同様にＨ−１８抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。結果を図８に示す。
【００３５】
図８から分かるように、ＲＡ患者のＰＢＭＣライセートと混和させた場合には、健常者のＰＢＭＣライセート中に存在していた４７ｋＤａのポリペプチドのバンドが減弱又は消失し、代わりに約３２ｋＤａのポリペプチドのバンドが出現した。
この結果から、４７ｋＤａのポリペプチドは、ＲＡ患者の血中で何らかの機序により切断されると考えられる。
【００３６】
＜実施例２：ＧＳＴ融合タンパク質を用いたタリンの切断実験＞
実施例２では、４７ｋＤａのポリペプチドの切断部位をさらに確認するため、ＧＳＴ融合タンパク質を用いたタリンの切断実験を行った。具体的には、図９に模式的に示すように、ＧＳＴとタリンのＦ３ドメインを含むフラグメントとが融合したＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂに結合させた状態で作製し、切断実験に用いた。
【００３７】
まず、ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社）を用いて、健常者のＰＢＭＣから全ｍＲＮＡを抽出した。続いて、逆転写酵素を用いて全ｍＲＮＡ１．０μｇを一本鎖ｃＤＮＡに変換した後、ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換した。この二本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、５’−ＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴ−３’（配列番号５）をセンスプライマー、５’−ＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＣＣＡＣＴＴＴ−３’（配列番号６）をアンチセンスプライマーとして、ＰＣＲ法により５５７ｂｐのタリンｃＤＮＡを合成した。
【００３８】
このｃＤＮＡをｐＣＲＩＩベクター（インビトロジェン社）に組み込んだ後、ＥｃｏＲＩで切り出し、ｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクター（ＧＥヘルスケア社）に組み込んだ。このｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターでＴＯＰ１０Ｆ’細胞（インビトロジェン社）を形質転換した後、細胞を超音波で破砕し、さらにグルタチオンセファロース４Ｂと４℃で１時間振盪混和した。その後、ＧＳＴ融合タンパク質が結合したグルタチオンセファロース４Ｂを回収し、ＰＢＳで洗浄した。
【００３９】
次いで、ＧＳＴ融合タンパク質が結合したグルタチオンセファロース４ＢとＰＢＭＣライセートとを２５℃で１時間振盪混和した後、洗浄した。その後、還元型グルタチオンを含む溶出バッファを加えて遠心分離を行い、回収した上清のＳＤＳ電気泳動を行った後、ゲル染色をいった。なお、対照としては、ＰＢＭＣライセートの代わりにＰＢＳを混和したもの、及び０．００１Ｕ／ｍＬのトロンビンを含むＰＢＳを混和したものを用いた。結果を図１０に示す。
【００４０】
図１０から分かるように、健常者のＰＢＭＣライセートと混和させた場合には４７ｋＤａのＧＳＴ融合タンパク質のバンドが優位に確認されたが、ＲＡ患者のＰＢＭＣライセートと混和させた場合には３２ｋＤａにもバンドが確認された。
この結果から、カルパイン処理後の４７ｋＤａのポリペプチドは、ＲＡ患者のＰＢＭＣライセートにより、Ｎ末端側から約３２ｋＤａの位置で切断されることが分かる。
【００４１】
＜実施例３：関節リウマチ診断の感度・特異度の確認＞
実施例３では、ＲＡ患者２１例、ＳＬＥ患者９例、及び健常者８例を被検者として、約３２ｋＤａのポリペプチド又は約１５ｋＤａのポリペプチドをマーカーとした関節リウマチ診断の感度・特異度について確認した。
各被検者における約３２ｋＤａのポリペプチドの有無を下記表１に示し、各被検者における約１５ｋＤａのポリペプチドの有無を下記表２に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
約３２ｋＤａのポリペプチドの有無を検討すると、ＲＡ患者では健常者と比較して、感度は１８／２１×１００＝８５．７％、特異度は８／８×１００＝１００％であった。また、ＳＬＥ患者と比較しても、感度は１８／２１×１００＝８５．７％、特異度は５／９×１００＝５５．６％であった。このことから、約３２ｋＤａのポリペプチドはＲＡ患者血中に有意に存在することが分かる。
また、約１５ｋＤａのポリペプチドの有無を検討すると、ＲＡ患者では健常者と比較して、感度は１７／２１×１００＝８１．０％、特異度は８／８×１００＝１００％であった。また、ＳＬＥ患者と比較しても、感度は１７／２１×１００＝８１．０％、特異度は５／９×１００＝５５．６％であった。このことから、約１５ｋＤａのポリペプチドはＲＡ患者血中に有意に存在することが分かる。
【００４５】
一般に日常診療上、関節リウマチ診断のマーカーとしてリウマトイド因子や抗ＣＣＰ抗体が用いられている。これまでの報告では、リウマトイド因子の感度は７５〜８０％、特異度は５０〜７０％、抗ＣＣＰ抗体の感度は５０〜７５％、特異度は８５〜９５％である。また、ＳＬＥ患者の血中における抗ＣＣＰ抗体の陽性率は５〜４０％と報告されている（Ｑｉｎｇ ＹＦ． ｅｔ ａｌ．， Ｌｕｐｕｓ １８： ７１３−７１７， ２００９を参照）。
したがって、本発明の診断方法は、感度に関して既存の方法よりも優れ、特異度に関しても既存の方法に劣らないものであることが分かる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ポリペプチド、そのようなポリペプチドを検出する工程を含む関節リウマチの診断方法、及びそのような診断方法に使用される診断用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ＲＡ）は、関節の滑膜組織を病変の主座とする慢性炎症性疾患であり、有病率が人口の約１％を占める疾患である。関節リウマチは、その初期には滑膜炎を来し、次第に軟骨や骨が侵され、進行すると関節が破壊され変形する。また、症状の経過は、関節炎の寛解・再燃を繰り返し、完治する例や急速に進行する例など多彩である。
【０００３】
関節リウマチの診断は主に症状によってなされるが、近年、患者の血清中に含まれる自己抗体をマーカーとした診断方法が注目されている。そのような自己抗体としては、リウマトイド因子（変性ＩｇＧに対する自己抗体）、抗環状シトルリン化ペプチド抗体（抗ＣＣＰ抗体）等が知られている（非特許文献１参照）。
【０００４】
しかしながら、これまでの報告では、リウマトイド因子の感度は７５〜８０％、特異度は５０〜７０％、抗ＣＣＰ抗体の感度は５０〜７５％、特異度は８５〜９５％であり、必ずしも満足のいくものではなかった（非特許文献２，３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ａ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓ． Ｔｈｅｒ．， ４： ８７−９３， ２００２
【非特許文献２】Ａｖｏｕａｃ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｈｅｕｍ． Ｄｉｓ． ６５： ８４５−８５１， ２００６
【非特許文献３】ｖａｎ Ｖｅｎｒｏｏｉｊ ＷＪ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １１４３： ２６８−２８５， ２００８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、これまでに知られていない新規マーカーの探索を行い、見出された新規マーカーをもとに関節リウマチの診断方法及び診断用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
関節リウマチ患者では、血中のリンパ球が活性化されて血管内皮細胞との細胞接着が亢進するのと同時にリンパ球遊走も亢進する結果、血管外にリンパ球が浸潤し、この浸潤リンパ球が様々な炎症を引き起こすことが知られている。そこで本件発明者は、新規マーカーの探索を行うにあたり、細胞と基質とが接着する領域、特にリンパ球内では細胞接着領域に主に集中して発現される高分子細胞骨格タンパク質であるタリン（Ｔａｌｉｎ）に着目した。
【０００８】
タリンは、ＦＥＲＭ領域を含む分子量４７ｋＤａのＮ末端領域と、一束のαヘリックスからなる分子量１９０ｋＤａのＣ末端領域とから構成されるタンパク質である。ＦＥＲＭ領域はさらに、Ｎ末端側からＦ１ドメイン、Ｆ２ドメイン、Ｆ３ドメインの３つのサブ領域に分けられている。生体内では、カルパイン（Ｃａｌｐａｉｎ）によって切断されたＮ末端領域のポリペプチド、その中でもＦ３ドメインがインテグリンβサブユニットに結合し、インテグリンの細胞内から細胞外へのシグナル伝達を増強させ、細胞接着や細胞遊走を亢進することが知られている。
【０００９】
本件発明者は、関節リウマチ患者より採取したリンパ球におけるタリン発現について検討した。その結果、（ｉ）関節リウマチ患者においては、通常の４７ｋＤａのポリペプチドのフラグメントである２種類のポリペプチドが検出されること、（ｉｉ）一方はＦ１ドメインを少なくとも含む約３２ｋＤａのポリペプチドであり、他方はＦ３ドメインを少なくとも含む約１５ｋＤａのポリペプチドであること、（ｉｉｉ）この２種類のポリペプチドをマーカーとして用いることで関節リウマチを高精度に診断できること、を見出した。
本発明は、このような知見に基づいて完成されたものであり、具体的には以下のとおりである。
【００１０】
［１］ タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有する新規ポリペプチド。
【００１１】
［２］ タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有する新規ポリペプチド。
【００１２】
［３］ 関節リウマチに罹患している被検動物より採取した生体試料中から検出可能である上記［１］又は［２］記載の新規ポリペプチド。
【００１３】
［４］ 被検動物より採取した生体試料中から下記（ａ）及び（ｂ）の少なくとも一方のポリペプチドを検出する工程を含む関節リウマチの診断方法。
（ａ）タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
（ｂ）タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
【００１４】
［５］ 前記被検動物がヒトである上記［４］記載の関節リウマチの診断方法。
【００１５】
［６］ 上記［４］又は［５］記載の関節リウマチの診断方法に使用するための診断用キット。
【００１６】
［７］ タリンのＮ末端からカルパイン切断部位までの範囲に特異的に結合する抗体を含有してなる上記［６］記載の診断用キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、関節リウマチを高精度に診断するための新規ポリペプチド、そのようなポリペプチドを検出する工程を含む関節リウマチの診断方法、及びそのような診断方法に使用される診断用キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明における約３２ｋＤａのポリペプチド及び約１５ｋＤａのポリペプチドを説明するための模式図である。
【図２】末梢血単核球（ＰＢＭＣ）ライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、Ｈ−１８抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図３】ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、Ｈ−１８抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図４】ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、Ｈ−１８抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図５】ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、ＴＡ２０５抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図６】ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、ＴＡ２０５抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図７】ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、ＴＡ２０５抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図８】健常者のＰＢＭＣライセートとＲＡ患者のＰＢＭＣライセートとを混和した後、ＰＢＭＣライセート中に含まれるタリンのフラグメントを、Ｈ−１８抗体を用いて検出したウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図９】ＧＳＴとタリンのＦ３ドメインを含むフラグメントとが融合したＧＳＴ融合タンパク質を示す模式図である。
【図１０】ＧＳＴ融合タンパク質と健常者又はＲＡ患者のＰＢＭＣライセートとを混和した後、ＳＤＳ電気泳動を行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
［新規ポリペプチド及び関節リウマチの診断方法］
本発明に係る関節リウマチの診断方法は、被検動物より採取した生体試料中から下記（ａ）及び（ｂ）の少なくとも一方のポリペプチドを検出する工程を含むものである。
（ａ）タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
（ｂ）タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
【００２０】
また、本発明に係る新規ポリペプチドは、上記（ａ）及び（ｂ）の２種類のポリペプチドに対応するものである。
【００２１】
前述したとおり、タリンは、ＦＥＲＭ領域を含む分子量４７ｋＤａのＮ末端領域と、一束のαヘリックスからなる分子量１９０ｋＤａのＣ末端領域とから構成されるタンパク質である。ＦＥＲＭ領域はさらに、Ｎ末端側からＦ１ドメイン、Ｆ２ドメイン、Ｆ３ドメインの３つのサブ領域に分けられている。そして、生体内では、カルパインによって４７ｋＤａのＮ末端領域と１９０ｋＤａのＣ末端領域とに切断される。
【００２２】
ヒトの場合、タリン１、タリン２の２種類のアイソフォームが存在する。タリン１のｍＲＮＡ配列、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号１，２に示す。また、タリン２のｍＲＮＡ配列、アミノ酸配列をそれぞれ配列番号３，４に示す。
タリン１に関しては、カルパインによる切断部位は４３１番目のアミノ酸と４３６番目のアミノ酸との間、Ｆ１ドメインは１１７番目から２０６番目までのアミノ酸配列、Ｆ２ドメインは２０７番目から３０８番目までのアミノ酸配列、Ｆ３ドメインは３０９番目から４０５番目までのアミノ酸配列にそれぞれ対応する。
一方、タリン２に関しては、カルパインによる切断部位は４３４番目のアミノ酸と４３９番目のアミノ酸との間、Ｆ１ドメインは１１９番目から２０８番目までのアミノ酸配列、Ｆ２ドメインは２０９番目から３１１番目までのアミノ酸配列、Ｆ３ドメインは３１２番目から４０８番目までのアミノ酸配列にそれぞれ対応する。
【００２３】
上記（ａ）及び（ｂ）の２種類のポリペプチドはいずれも、タリンがカルパインで切断された後の４７ｋＤａのポリペプチドのフラグメントに相当するものである。
図１に示すように、２４０ｋＤａのタリンはカルパインによって４７ｋＤａのＮ末端領域と１９０ｋＤａのＣ末端領域とに切断される。しかし、本件発明者の研究により、関節リウマチ（ＲＡ）に罹患している被検動物においては、この４７ｋＤａのポリペプチドが何らかの機序によってＦ２ドメイン内で切断され、約３２ｋＤａのポリペプチドと約１５ｋＤａのポリペプチドとが優位に出現していることが分かった。また、この切断部位は、Ｆ２ドメインのＣ末端に存在するＨ４領域内に存在することが推測された。なお、Ｈ４領域は、タリン１に関しては２９１番目のＧｌｕから３０８番目のＴｙｒまで、タリン２に関しては２９４番目のＧｌｕから３１１番目のＴｙｒまでのアミノ酸配列にそれぞれ対応する。
【００２４】
したがって、上記（ａ）及び（ｂ）の２種類のポリペプチドを関節リウマチのマーカーとすることが可能である。換言すれば、被検動物より採取した生体試料中から上記（ａ）及び（ｂ）の２種類のポリペプチドの少なくとも一方を検出することで、関節リウマチを診断することが可能である。
【００２５】
被検動物としては、関節リウマチに罹患し得る動物であれば特に制限はなく、目的に応じて選択することができる。例えば、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ネコ、ウサギ、モルモット等が挙げられるが、その中でもヒトが好ましい。
また、生体試料としては、特に制限はなく、目的に応じて選択することができる。例えば、末梢血、関節滑膜、関節液等が挙げられる。その中でも、採取が簡便である点で末梢血が好ましい。
【００２６】
上記（ａ）及び（ｂ）の２種類のポリペプチドの少なくとも一方を検出する方法としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、ウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法が挙げられるが、その中でもウエスタンブロット法が好ましい。
【００２７】
検出に用いる一次抗体としては、タリンのＮ末端からカルパイン切断部位までの範囲、すなわち上記の４７ｋＤａのポリペプチドに特異的に結合するものであれば特に制限はない。例えば、上記（ａ）のポリペプチドを検出可能な一次抗体としては、Ｈ−１８抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）、Ｈ−３００抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）等が挙げられる。また、上記（ｂ）のポリペプチドを検出可能な一次抗体としては、ＴＡ２０５抗体（アブカム社）、Ｈ−３００抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）等が挙げられる。
【００２８】
［診断用キット］
本発明に係る診断用キットは、本発明に係る関節リウマチの診断方法に使用するためのものである。この診断用キットには、例えば、タリンのＮ末端からカルパイン切断部位までの範囲、すなわち上記の４７ｋＤａのポリペプチドに特異的に結合する抗体が含まれる。
【実施例】
【００２９】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載によって何ら限定して解釈されるものではない。なお、以下の実施例では、関節リウマチ患者（ＲＡ患者）２１例、全身性エリテマトーデス患者（ＳＬＥ患者）９例、及び健常者８例を被検者とした。
【００３０】
＜実施例１：ウエスタンブロット法によるタリンのフラグメントの検出＞
実施例１では、カルパイン処理後の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）ライセートに含まれるタリンのフラグメントをウエスタンブロット法により検出した。
【００３１】
まず、Ｆｉｃｏｌｌ法を用いて各被検者からＰＢＭＣを採取後、１×１０７個のＰＢＭＣあたり１ｍＬの溶解バッファ（１０ｍＭ トリエタノールアミン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、１０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１０μｇ／ｍＬ リューペプチン、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬ アプロチニン）を加えて１５分間振盪混和した。さらに、１分間超音波破砕し、遠心分離を行った後、上清を回収してＰＢＭＣライセートとした。
次いで、このＰＢＭＣライセートにＣａＣｌ２とカルパイン１（シグマアルドリッチ社）とを加えて２５℃で１時間振盪混和させ、ＳＤＳサンプルバッファを加えて５分間煮沸させた後、リアルゲルプレート（バイオクラフト社）を用いてＳＤＳ電気泳動を行った。その後、ジェルコードブルー染色試薬（サーモサイエンティフィック社）を用いてゲル染色を行い、目的のタンパク質のバンドを確認した。
【００３２】
ＰＢＭＣライセートの電気泳動後、泳動したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＰＶＤＦ膜をＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（ＤＳファーマバイオメディカル社）中、室温で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、一次抗体溶液と室温で１時間振盪混和して洗浄し、さらに二次抗体溶液と室温で１時間振盪混和して洗浄した。一次抗体としては、Ｈ−１８抗体（サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）又はＴＡ２０５抗体（アブカム社）を用いた。また、Ｈ−１８抗体に対する二次抗体としてはＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ抗体を用い、ＴＡ２０５抗体に対する二次抗体としてはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いた。その後、ＰＶＤＦ膜を洗浄し、ＥＣＬ Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（ＧＥヘルスケア社）を用いてバンドを検出した。一次抗体としてＨ−１８抗体を用いた結果を図２〜４に示し、一次抗体としてＴＡ２０５抗体を用いた結果を図５〜７に示す。
【００３３】
図２〜７から分かるように、健常者の場合、Ｈ−１８抗体及びＴＡ２０５抗体のいずれによっても、通常の４７ｋＤａのバンド（星印）が確認されたが、ＲＡ患者の場合、Ｈ−１８抗体では約３２ｋＤａのバンド（矢印）が優位に確認され、ＴＡ２０５抗体では約１５ｋＤａのバンド（矢印）が優位に確認された。
Ｈ−１８抗体はタリンのＮ末端を認識することから、この約３２ｋＤａのバンドは、タリンがカルパイン１で切断された後の４７ｋＤａのポリペプチドのうち、Ｎ末端側の約３２ｋＤａのポリペプチドに対応すると考えられる。また、ＴＡ２０５抗体はタリンの１３９番目から４３３番目のアミノ酸を認識することから、この約１５ｋＤａのバンドは、同じく４７ｋＤａのポリペプチドのうち、Ｃ末端側の約１５ｋＤａのポリペプチドに対応すると考えられる。
【００３４】
この約３２ｋＤａ及び約１５ｋＤａのポリペプチドは、ＲＡ患者の血中で４７ｋＤａのポリペプチドが何らかの機序により切断されて生じた可能性がある。そこで、このことを確認するため、同一例の健常者のＰＢＭＣライセートと、数例のＲＡ患者のＰＢＭＣライセートとをそれぞれ振盪混和し、上記と同様にＨ−１８抗体を用いてウエスタンブロット解析を行った。結果を図８に示す。
【００３５】
図８から分かるように、ＲＡ患者のＰＢＭＣライセートと混和させた場合には、健常者のＰＢＭＣライセート中に存在していた４７ｋＤａのポリペプチドのバンドが減弱又は消失し、代わりに約３２ｋＤａのポリペプチドのバンドが出現した。
この結果から、４７ｋＤａのポリペプチドは、ＲＡ患者の血中で何らかの機序により切断されると考えられる。
【００３６】
＜実施例２：ＧＳＴ融合タンパク質を用いたタリンの切断実験＞
実施例２では、４７ｋＤａのポリペプチドの切断部位をさらに確認するため、ＧＳＴ融合タンパク質を用いたタリンの切断実験を行った。具体的には、図９に模式的に示すように、ＧＳＴとタリンのＦ３ドメインを含むフラグメントとが融合したＧＳＴ融合タンパク質を、グルタチオンセファロース４Ｂに結合させた状態で作製し、切断実験に用いた。
【００３７】
まず、ｍＲＮＡ精製キット（ファルマシア社）を用いて、健常者のＰＢＭＣから全ｍＲＮＡを抽出した。続いて、逆転写酵素を用いて全ｍＲＮＡ１．０μｇを一本鎖ｃＤＮＡに変換した後、ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換した。この二本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、５’−ＧＡＡＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴ−３’（配列番号５）をセンスプライマー、５’−ＣＣＡＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＣＴＣＣＡＣＴＴＴ−３’（配列番号６）をアンチセンスプライマーとして、ＰＣＲ法により５５７ｂｐのタリンｃＤＮＡを合成した。
【００３８】
このｃＤＮＡをｐＣＲＩＩベクター（インビトロジェン社）に組み込んだ後、ＥｃｏＲＩで切り出し、ｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクター（ＧＥヘルスケア社）に組み込んだ。このｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターでＴＯＰ１０Ｆ’細胞（インビトロジェン社）を形質転換した後、細胞を超音波で破砕し、さらにグルタチオンセファロース４Ｂと４℃で１時間振盪混和した。その後、ＧＳＴ融合タンパク質が結合したグルタチオンセファロース４Ｂを回収し、ＰＢＳで洗浄した。
【００３９】
次いで、ＧＳＴ融合タンパク質が結合したグルタチオンセファロース４ＢとＰＢＭＣライセートとを２５℃で１時間振盪混和した後、洗浄した。その後、還元型グルタチオンを含む溶出バッファを加えて遠心分離を行い、回収した上清のＳＤＳ電気泳動を行った後、ゲル染色をいった。なお、対照としては、ＰＢＭＣライセートの代わりにＰＢＳを混和したもの、及び０．００１Ｕ／ｍＬのトロンビンを含むＰＢＳを混和したものを用いた。結果を図１０に示す。
【００４０】
図１０から分かるように、健常者のＰＢＭＣライセートと混和させた場合には４７ｋＤａのＧＳＴ融合タンパク質のバンドが優位に確認されたが、ＲＡ患者のＰＢＭＣライセートと混和させた場合には３２ｋＤａにもバンドが確認された。
この結果から、カルパイン処理後の４７ｋＤａのポリペプチドは、ＲＡ患者のＰＢＭＣライセートにより、Ｎ末端側から約３２ｋＤａの位置で切断されることが分かる。
【００４１】
＜実施例３：関節リウマチ診断の感度・特異度の確認＞
実施例３では、ＲＡ患者２１例、ＳＬＥ患者９例、及び健常者８例を被検者として、約３２ｋＤａのポリペプチド又は約１５ｋＤａのポリペプチドをマーカーとした関節リウマチ診断の感度・特異度について確認した。
各被検者における約３２ｋＤａのポリペプチドの有無を下記表１に示し、各被検者における約１５ｋＤａのポリペプチドの有無を下記表２に示す。
【００４２】
【表１】
【００４３】
【表２】
【００４４】
約３２ｋＤａのポリペプチドの有無を検討すると、ＲＡ患者では健常者と比較して、感度は１８／２１×１００＝８５．７％、特異度は８／８×１００＝１００％であった。また、ＳＬＥ患者と比較しても、感度は１８／２１×１００＝８５．７％、特異度は５／９×１００＝５５．６％であった。このことから、約３２ｋＤａのポリペプチドはＲＡ患者血中に有意に存在することが分かる。
また、約１５ｋＤａのポリペプチドの有無を検討すると、ＲＡ患者では健常者と比較して、感度は１７／２１×１００＝８１．０％、特異度は８／８×１００＝１００％であった。また、ＳＬＥ患者と比較しても、感度は１７／２１×１００＝８１．０％、特異度は５／９×１００＝５５．６％であった。このことから、約１５ｋＤａのポリペプチドはＲＡ患者血中に有意に存在することが分かる。
【００４５】
一般に日常診療上、関節リウマチ診断のマーカーとしてリウマトイド因子や抗ＣＣＰ抗体が用いられている。これまでの報告では、リウマトイド因子の感度は７５〜８０％、特異度は５０〜７０％、抗ＣＣＰ抗体の感度は５０〜７５％、特異度は８５〜９５％である。また、ＳＬＥ患者の血中における抗ＣＣＰ抗体の陽性率は５〜４０％と報告されている（Ｑｉｎｇ ＹＦ． ｅｔ ａｌ．， Ｌｕｐｕｓ １８： ７１３−７１７， ２００９を参照）。
したがって、本発明の診断方法は、感度に関して既存の方法よりも優れ、特異度に関しても既存の方法に劣らないものであることが分かる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有する新規ポリペプチド。
【請求項２】
タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有する新規ポリペプチド。
【請求項３】
関節リウマチに罹患している被検動物より採取した生体試料中から検出可能である請求項１又は２記載の新規ポリペプチド。
【請求項４】
被検動物より採取した生体試料中から下記（ａ）及び（ｂ）の少なくとも一方のポリペプチドを検出する工程を含む関節リウマチの診断方法。
（ａ）タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
（ｂ）タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
【請求項５】
前記被検動物がヒトである請求項４記載の関節リウマチの診断方法。
【請求項６】
請求項４又は５記載の関節リウマチの診断方法に使用するための診断用キット。
【請求項７】
タリンのＮ末端からカルパイン切断部位までの範囲に特異的に結合する抗体を含有してなる請求項６記載の診断用キット。
【請求項１】
タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有する新規ポリペプチド。
【請求項２】
タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有する新規ポリペプチド。
【請求項３】
関節リウマチに罹患している被検動物より採取した生体試料中から検出可能である請求項１又は２記載の新規ポリペプチド。
【請求項４】
被検動物より採取した生体試料中から下記（ａ）及び（ｂ）の少なくとも一方のポリペプチドを検出する工程を含む関節リウマチの診断方法。
（ａ）タリンのＦ１ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約３２ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
（ｂ）タリンのＦ３ドメインに対応するアミノ酸配列を少なくとも含み、かつ、約１５ｋＤａの分子量を有するポリペプチド。
【請求項５】
前記被検動物がヒトである請求項４記載の関節リウマチの診断方法。
【請求項６】
請求項４又は５記載の関節リウマチの診断方法に使用するための診断用キット。
【請求項７】
タリンのＮ末端からカルパイン切断部位までの範囲に特異的に結合する抗体を含有してなる請求項６記載の診断用キット。
【図１】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−１５７３０１（Ｐ２０１１−１５７３０１Ａ）
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０４９２（Ｐ２０１０−２０４９２）
【出願日】平成２２年２月１日（２０１０．２．１）
【出願人】（５１０１８０９４６）株式会社ケイティーバイオ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年８月１８日（２０１１．８．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月１日（２０１０．２．１）
【出願人】（５１０１８０９４６）株式会社ケイティーバイオ (2)
【Ｆターム（参考）】
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