新規抗体並びに治療及び診断方法におけるその使用
ＫＴＰＡＦ５０タンパク質を特異的に認識するポリクローナル及びモノクローナル抗体並びにそれを含む組成物が提供される。癌、自己免疫疾患、移植片拒絶、神経変性疾患及び糖尿病等の状態の診断及び治療におけるＫＴＰＡＦ５０特異抗体の使用も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規抗体並びに治療及び診断方法におけるその使用に関し、特に、自己免疫障害及び癌に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願を通じて言及されているあらゆる刊行物は、そこに引用されているあらゆる参考文献を含み、参照として本明細書に完全に組み込まれる。
【０００３】
組織特異的タンパク質及びその発現レベルは、生物の健康状態の優れた指標及び疾患の場合は治療の標的候補となり得る。
【０００４】
ヒトが罹患する疾患は、その原因の機序に従って分類することができる。例えば、免疫学的な成分又は病因を有する疾患として、感染症、急性及び慢性炎症性疾患、癌、移植並びに自己免疫疾患が挙げられる。
【０００５】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）という用語は、恐らく身体のそれ自身の腸組織に対する免疫反応の結果腸が炎症を起こし（発赤及び肥大化）、したがって自己免疫障害であると考えられる障害群を包含する。
【０００６】
ＩＢＤの主要な２つの型、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）が説明されてきた。その病名が示唆するように、潰瘍性大腸炎は結腸（大腸）に限定される。クローン病は口から肛門に及ぶ消化管のいずれの部分にも関与し得るが、これは小腸及び／又は結腸において最も多く発症する。
【０００７】
重度の炎症がある場合、疾患は活性期にあると考えられ、患者の状態は再燃を起こす。炎症の程度がより低い（又はない）場合、患者は通常無症状であり、疾患は寛解期にあると考えられる。
【０００８】
炎症性腸疾患の原因は完全には明らかになっていない。未知の因子／病原体（又は因子の組合せ）が、無制御に続く炎症反応を腸管において生じるよう身体の免疫系を誘発する。炎症反応の結果腸壁が傷害され、血性下痢及び腹痛をもたらす。
【０００９】
遺伝的、感染性、免疫性及び心理的要因は全て、ＩＢＤ発症への影響と関連付けられてきた。ＩＢＤ発症に対する遺伝的素因（或いは感受性）が存在する。しかし依然として、身体の免疫系活性化の誘発因子は同定するべき課題である。身体の免疫系をオンにすることのできる因子として、感染病原体（未だ同定されていない）、抗原（例えば、牛乳由来のタンパク質）に対する免疫応答、或いは自己免疫過程が挙げられる。腸は免疫反応をもたらし得る物体に常に曝露されているため、より最近の仮説として、生物が正常な免疫応答をオフにする不全の存在が挙げられる。
【００１０】
ＩＢＤは慢性疾患であり、罹患した対象は、疾患が再燃し症状が発生する期間を経て、続いて症状がなくなる、或いは低減して良好な健康状態を回復する寛解期となる。
【００１１】
症状は軽度から重度の範囲に及び、通常、関与する腸管の部分に依存し得る。症状として、次のものが挙げられる。腹部疝痛及び腹痛、血性下痢、非常に切迫した便通、発熱、食欲不振、体重減少、貧血（失血による）。
【００１２】
炎症性腸疾患の腸合併症として、次のものが挙げられる。潰瘍からの大量出血、腸の穿孔（破裂）、狭窄及び閉塞（クローン病患者において、狭窄は多くの場合炎症性であり、薬物治療で頻繁に軽快する）、固定又は線維症（瘢痕性）狭窄は、閉塞の軽減に内視鏡による処置又は外科的処置を必要とし得る。潰瘍性大腸炎において、結腸狭窄は悪性（癌性）であると推測される。瘻孔（異常な通り道）及び肛門周囲の疾患は、クローン病患者においてより一般的である。中毒性巨大結腸症（結腸の急性非閉塞性拡張）は潰瘍性大腸炎の生命に関わる合併症であり、緊急の外科的処置を必要とする。潰瘍性大腸炎における結腸癌のリスクは、診断約８〜１０年後に一般集団のリスクを超えて有意に増加し始める。結腸全体が関与する場合、クローン病における癌のリスクは潰瘍性大腸炎のリスクと等しくなるであろう。クローン病において小腸悪性腫瘍のリスクが増加する。
【００１３】
ＩＢＤの腸外併発は、腸以外の器官に関与する合併症を意味する。これらは、ＩＢＤ患者のごく一部にしか影響を与えない。ＩＢＤ患者は、関節炎、皮膚疾患、目の炎症、肝及び腎障害並びに骨量減少に罹っている可能性がある。
【００１４】
ＩＢＤの診断は現在、主に検便、便潜血検査、全血球数、電解質パネル、ＬＦＴ（アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、アルブミン、総タンパク質及びビリルビンレベルの測定）を含む試験及び検査の組合せによって行われる。
【００１５】
放射線医学（例えば、腹部Ｘ線又はバリウム注腸）及び内視鏡による手順（例えば、結腸内視鏡検査及びＳ字結腸鏡検査）もまた、ＩＢＤの診断に用いられる。
【００１６】
明らかに、ＩＢＤの明確な診断方法は依然として存在せず、ＩＢＤの鑑別及び特異的診断に有用となり得る分子マーカーの必要がある。
【００１７】
癌の種類の非限定的な例として、副腎皮質癌、悪性黒色腫、非黒色腫皮膚癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、カポジ肉腫、膀胱癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、神経外胚葉性及び松果体癌、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児髄芽腫、小児視覚路神経膠腫、髄膜腫、混合膠腫、乏突起神経膠腫、星状細胞腫、脳室上衣腫、下垂体腺腫、転移性腺癌、聴神経腫瘍、脊椎傍悪性奇形腫、乳癌、腺管癌、乳腺腫瘍症、卵巣癌、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、腟癌、外陰癌、妊娠性トロホブラスト癌、卵管癌、子宮肉腫、白血病、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟部肉腫、ウィルムス腫瘍、ファンコニー貧血、ランゲルハンス細胞組織球症、腎臓の悪性ラブドイド腫瘍、肝癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、絨毛癌、内分泌性癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、胃癌、胃腸癌、尿生殖器癌、神経膠腫、婦人科系の癌、頭頸部癌、肝細胞癌、下咽頭癌、膵島細胞癌、腎癌、喉頭癌、肺癌、リンパ腫、男性乳癌、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、非黒色腫皮膚癌、食道癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、下垂体癌、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行細胞癌、絨毛性癌、子宮癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢胞性癌、肛門癌、骨癌、腸癌、腺管癌、脂肪肉腫、神経芽細胞腫、腎芽腫並びに骨肉腫が挙げられる。
【００１８】
炎症性疾患は、敗血症、内毒血症、膵炎、ぶどう膜炎、肝炎、腹膜炎、角膜炎、ＳＩＲＳ及び損傷によって誘発された炎症を含む。
【００１９】
妊孕性に関連する疾患は、男性不妊症及び女性不妊症を含む。男性不妊症は様々な問題に起因し得る。より一般的な障害の一部を下に列挙する。
− 精子産生欠損：男性不妊症の９０パーセントが、十分な精子を産生できないことに起因する。無精子症（Ａｚｚｏｓｐｅｒｍｉａ）は精子が全く産生されないときに発生し、一方、精子が殆ど産生されない場合は精子減少症と診断される。
− 精索静脈瘤；
− 他の障害：男性不妊症の原因となり得る他の障害として、精巣の異常発達又は傷害（内分泌障害又は炎症に起因する）、付属腺の障害、性交障害、雄性生殖管に嚢胞を生じる１９５０年代及び１９６０年代に用いられた合成エストロゲン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）への曝露、停留精巣及び稀な事例では染色体異常等の遺伝的障害が挙げられる。
【００２０】
女性不妊症もまた、様々な問題に起因し得る。より一般的な障害の一部として、多嚢胞性卵巣疾患、骨盤内炎症性疾患、排卵性機能障害、子宮筋腫、子宮内膜症及び免疫学的不妊症が挙げられる。
【００２１】
炭水化物代謝障害は様々な形で生じる。最もよく見られる障害は後天性である。糖尿病性ケトアシドーシス、高浸透圧性昏睡及び低血糖等、炭水化物代謝における後天性又は続発性の撹乱はいずれも、中枢神経系に作用する。糖尿病において、末梢神経疾患の多くの形態及び変種も観察される。炭水化物代謝のその他の障害は、稀に起こる先天性代謝異常（即ち、遺伝的欠陥）である。
【００２２】
炭水化物代謝の後天性障害は、米国内及び世界中の両方で非常によく見られる。低血糖は、アルコール依存症及びインスリン治療されている糖尿病患者の両方における、神経疾患、特に急性精神機能低下、記憶喪失、失見当識、鈍麻及び昏睡の一般的な原因である。他の原因による高インスリン血症は稀であるが、膵腫瘍が原因の可能性もある。その様々な神経合併症を伴う糖尿病は、成人患者で治療される最もよく見られる障害の１つである。
【００２３】
炭水化物代謝の遺伝性障害は稀である。重度のピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）複合体欠損及びペントース尿症と呼ばれる良性化学的異常は、非常に少数（２〜６名）の患者でしか報告されていない。
【００２４】
低血糖、糖尿病性ケトアシドーシス及び高浸透圧性昏睡はいずれも致死の可能性があるが、治療の可能性がある状態である。
【００２５】
国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットにおいて、本発明者らは、ＫＴＰＡＦ５０と命名したタンパク質について記述し、このタンパク質は胎盤、腎臓（成体及び胎児）、膵臓及び精巣における特異的な発現を示したが、造血組織では休止及び活性型ＣＤ８＋細胞、休止及び活性型単核細胞並びに休止及び活性型ＣＤ１９＋細胞において検出された。
【００２６】
ＫＴＰＡＦ５０特異抗体を開発したところ、驚いたことに、本発明者らは、本発明においてＫＴＰＡＦ５０の発現が特に癌及び自己免疫障害における特定の病状と相関し得ることを示す。
【００２７】
さらに予期せぬことに、本発明者らは、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体が細胞増殖及びサイトカイン発現の強力な制御因子であることを示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
そこで、本発明の目的は、ＫＴＰＡＦ５０を特異的に認識する抗体並びに癌、自己免疫障害、移植片拒絶、神経変性疾患及び糖尿病の診断及び治療におけるその使用を提供することである。
【００２９】
本明細書及び続く実施例に示されている通り、本発明の診断方法は、特定の種類の癌及び自己免疫障害の検出及びモニタリングに特に適している。
【００３０】
本発明の上述及び他の用途及び目的は、説明が進むにつれて明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
第一の態様において、本発明は、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はその任意の断片若しくは誘導体を特異的に認識する抗体と共に、それを含む組成物に関する。前記ＫＴＰＡＦ５０タンパク質は、配列番号１又は配列番号２で表される。
【００３２】
本発明はまた、配列番号３、配列番号５、配列番号６及び配列番号７のいずれか一配列で表されるＫＴＰＡＦ５０由来ペプチドを特異的に認識する抗体並びにそれを含む組成物に関する。
【００３３】
本明細書に記載されている抗体又はそれを含む組成物は、診断及び／又は治療方法に用いるためのものである。
【００３４】
特に、前記抗体又はそれを含む組成物は、癌及び自己免疫障害のいずれか一方の診断又は予後と共に、癌治療に用いるためのものである。
【００３５】
別の一態様において、本発明は、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はそれに由来するペプチドを特異的に認識する抗体を産生する抗体産生細胞系又はハイブリドーマ細胞系を提供する。これらの細胞系によって産生される抗体もまた、本発明により提供される。
【００３６】
さらに別の一態様において、本発明は、診断又は治療組成物の調製における、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はそれに由来するペプチドを特異的に認識する抗体の使用を提供する。
【００３７】
一実施形態において、本明細書において提供される診断組成物は、癌及び自己免疫疾患のいずれか一方の診断のためのものである。
【００３８】
本発明に提供される治療組成物は、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患、糖尿病及び移植片拒絶からなる群から選択された状態の治療のためのものである。
【００３９】
さらに別の一態様において、本発明は、対象における癌又は自己免疫疾患のいずれか一方の診断のための方法であって、
ａ）対象から試料を得る工程と、
ｂ）前記試料をＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はそれに由来するペプチドを特異的に認識する少なくとも１種類の抗体又はそれを含む組成物と接触させる工程と、
ｃ）前記少なくとも１種類の抗体とその特異抗原との複合体の形成を検出手段により検出する工程と、
を含み、それにより、複合体の検出が、前記対象が癌又は自己免疫障害に罹患していることを示す方法を提供する。
【００４０】
前記方法の一実施形態において、前記試料は血液試料である。
【００４１】
前記方法の別の特定の一実施形態において、前記癌は、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択される。
【００４２】
さらに別の一実施形態において、本発明は、必要とする対象に治療上有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を投与する工程を含む、癌の治療のための方法を提供する。
【００４３】
本発明は、有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を細胞と接触させる工程を含む、細胞増殖を抑制する或いはサイトカイン発現を抑制する方法をさらに提供する。特定の一実施形態において、前記細胞はサイトカインを発現する細胞である。
【００４４】
本発明の抗体によってその発現が抑制される特定のサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０である。
【００４５】
さらに別の一態様において、本発明は、癌又は自己免疫疾患の診断、治療有効性のモニタリング又は予後評価の内いずれか１つのためのキットであって、次の構成要素、
ａ）本発明に係る少なくとも１種類の抗体又はそれを含む組成物と、
ｂ）本発明の前記抗体によって特異的に認識される抗原の、試料における存在の検出を行うための取扱説明書と、
を含む、キットを提供する。
【００４６】
前記キットは、次の構成要素、
ａ）検査する試料を採取するための少なくとも１つの手段と、
ｂ）前記抗体による前記抗原の前記認識の検出に必要な少なくとも１種類の試薬と、
ｃ）少なくとも１種類の対照試料と、
の内少なくとも１つをさらに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】抗ＫＴＰＡＦ５０のＫＴＰＡＦ５０抗原に対する特異性を示す検量線の図である。
【図２】健常者（Ｈ）と比較した、肺癌（ＬＣ）患者から得られたヒト血液血清中のＫＴＰＡＦ５０濃度を示すヒストグラムである。
【図３Ａ】雌Ｂａｌｂ／Ｃ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、レサズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）と４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。略語：抗ＰＲＴ３ １＝抗体３Ｅ３Ｇ７；抗ＰＲＴ３ ２＝抗体５Ｅ１１Ｈ３；Ｔｒｅａｔ．＝処理；ｒｅｌ．ｃｏｎｔ．＝対照との相対値。
【図３Ｂ】雌Ｂａｌｂ／Ｃ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図３Ｃ】雌Ｂａｌｂ／Ｃ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図４Ａ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来の細胞における、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。略語：抗ＰＲＴ３ １＝抗体５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝抗体３Ｅ３Ｇ７；Ｔｒｅａｔ．＝処理；ｒｅｌ．ｃｏｎｔ．＝対照との相対値。
【図４Ｂ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雌Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来細胞における、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図４Ｃ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来の細胞における、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図４Ｄ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雌Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来細胞における、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図４Ｅ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来の細胞における、レサズリンと４．５時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による７２時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図４Ｆ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雌Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来細胞における、レサズリンと４．５時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による７２時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図５】Ｃ５７／ｂｌａｃｋ処理脾細胞由来の培地中のＫＴＰＡＦ５０濃度を示す図である。略語：ｆ．＝雌；ｍ．＝雄
【図６Ａ】２４時間の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体処理に続く、ヒト単球の生存率を示す図であり、レサズリンと２時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。略語：抗ＰＲＴ３ １＝抗体５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝抗体３Ｅ３Ｇ７；ｒｅｌ．＝相対；ｃｏｎｔ．＝対照；ｔｒｅａｔ．＝処理。
【図６Ｂ】２４時間の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体処理に続く、ヒト単球の生存率を示す図であり、レサズリンと４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図６Ｃ】２４時間の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体処理に続く、ヒト単球の生存率を示す図であり、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図７Ａ】４８時間の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体処理に続く、ヒト単球の生存率を示す図であり、レサズリンと２時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。略語：抗ＰＲＴ３ １＝抗体５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝抗体３Ｅ３Ｇ７；ｒｅｌ．＝相対；ｃｏｎｔ．＝対照；ｔｒｅａｔ．＝処理。
【図７Ｂ】４８時間の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体処理に続く、ヒト単球の生存率を示す図であり、レサズリンと４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図８Ａ】ヒト単球におけるＴＮＦ−α発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＴＮＦ−αキャリブレーションを示す図である。略語：抗ＰＲＴ３ １＝５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝３Ｅ３Ｇ７；ｃｏｎｔ．＝対照。
【図８Ｂ】ヒト単球におけるＴＮＦ−α発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＴＮＦ−α発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図８Ｃ】ヒト単球におけるＴＮＦ−α発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＴＮＦ−α発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図８Ｄ】ヒト単球におけるＴＮＦ−α発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＴＮＦ−α発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１２０時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図８Ｅ】ヒト単球におけるＴＮＦ−α発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＴＮＦ−α発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１４４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図９Ａ】ヒト単球におけるＩＮＦ−γ発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＮＦ−γキャリブレーションを示す図である。略語：抗ＰＲＴ３ １＝５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝３Ｅ３Ｇ７；ｃｏｎｃ．＝濃度。
【図９Ｂ】ヒト単球におけるＩＮＦ−γ発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＮＦ−γ発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図９Ｃ】ヒト単球におけるＩＮＦ−γ発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＮＦ−γ発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図９Ｄ】ヒト単球におけるＩＮＦ−γ発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＮＦ−γ発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１２０時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図９Ｅ】ヒト単球におけるＩＮＦ−γ発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＮＦ−γ発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１４４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図１０Ａ】ヒト単球におけるＩＬ−１０発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＬ−１０キャリブレーションを示す図である。略語：抗ＰＲＴ３ １＝５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝３Ｅ３Ｇ７；ｃｏｎｃ．＝濃度。
【図１０Ｂ】ヒト単球におけるＩＬ−１０発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＬ−１０発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図１０Ｃ】ヒト単球におけるＩＬ−１０発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＬ−１０発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図１０Ｄ】ヒト単球におけるＩＬ−１０発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＬ−１０発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１２０時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図１０Ｅ】ヒト単球におけるＩＬ−１０発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＬ−１０発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１４４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図１１】２４時間及び１４４時間インキュベーション後の、ヒト単球の培地におけるＫＴＰＡＦ５０タンパク質の存在を示す図である。略語：ｃｏｎｔ．＝対照
【図１２Ａ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、対照を示す図である。
【図１２Ｂ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、１００μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０抗体（α−ＰＲＴ３ １）で処理した細胞を示す図である。
【図１２Ｃ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、１００μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０抗体（α−ＰＲＴ３ ２）で処理した細胞を示す図である。
【図１２Ｄ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、１００ｎｇ／ｍｌのＫＴＰＡＦ５０タンパク質で処理した細胞を示す図である。
【図１２Ｅ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、５００ｎｇ／ｍｌのＫＴＰＡＦ５０タンパク質で処理した細胞を示す図である。
【図１２Ｆ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、１０００ｎｇ／ｍｌのＫＴＰＡＦ５０タンパク質で処理した細胞を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以前の報告において、本発明者らは、ＫＴＰＡＦ５０と命名されたタンパク質（本明細書においてＰＲＴ３とも称する）について、その発現パターン及び生物活性を示しつつ記述した［国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレット］。本発明のため、国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットの内容は参照として本明細書に完全に組み込まれる。
【００４９】
とりわけ、国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットはＫＴＰＡＦ５０発現パターンについて記述する。さらに、国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットは、本明細書において配列番号１として示されるシグナルペプチドを含まないＫＴＰＡＦ５０全長タンパク質の配列と、本明細書において配列番号２として示されるシグナルペプチドを含むＫＴＰＡＦ５０全長タンパク質の配列を提供する。加えて、国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットにおいて、本明細書において配列番号４として表されている３６アミノ酸長のＮ末端ペプチドも記載されている。
【００５０】
本発明において、本発明者らは、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質及び／又はＫＴＰＡＦ５０由来ペプチドを認識し結合する抗体の開発について記載する。
【００５１】
驚いたことに、後述する例１に記載されている通り、前記抗体は、国際公開第２００９／０８３９６８号明細書に記載されている通りＫＴＰＡＦ５０の組織発現と直接的な相関のない特定の種類の癌、特に肺癌における前記タンパク質の同定において特異的であることが示された。
【００５２】
本発明者らは、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体が細胞生存の強力な制御因子であり、したがって細胞増殖の制御における重要なツールとして用いることができることも証明する。
【００５３】
予期せぬことに、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体は、本明細書において炎症性サイトカイン発現の効果的な制御因子として示されている。これらの結果は、免疫系の恒常性バランスにおけるＫＴＰＡＦ５０の中心的役割を示唆し、その抗体を潜在的な免疫制御因子として提供する。
【００５４】
したがって、本発明はその第一の態様において、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はその任意の断片若しくは誘導体を特異的に認識する抗体を提供する。特に、前記ＫＴＰＡＦ５０タンパク質は、配列番号１又は配列番号２で表される。配列番号１は５０ａａ長であり、シグナルペプチドを含まないＫＴＰＡＦ５０タンパク質に関連する。配列番号２は７４ａａ長であり、国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットに以前に記載した通り、シグナルペプチドを含む全長ＫＴＰＡＦ５０タンパク質に関連する。
【００５５】
本明細書において定義されているように、本発明の抗体は通常、天然に由来又は天然に産生されたものである。したがって、抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。或いは、本発明の抗体は、合成的に産生、例えば化学合成又は各抗体産生細胞若しくは細胞系から特異的ｍＲＮＡを単離することにより組換えにより産生されてもよい。それに続き、組換えにより産生された抗体を作製するため、前記特異的ｍＲＮＡは標準的な分子生物学的操作（ｃＤＮＡを得て、前記ｃＤＮＡを発現ベクターに導入する等）に付される。前記技法は当業者に良く知られている。
【００５６】
タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製は当業者に良く知られた技法であり、とりわけＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．の第２章に記載されている。
【００５７】
モノクローナル抗体は、免疫動物、特にラット又はマウスの脾臓又はリンパ節から採取されたＢ細胞から、雑種細胞の増殖に有利な条件下で不死化Ｂ細胞と融合することにより調製することができる。モノクローナル抗体を作製する技法は、上述のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第２章等、多くの論文及び教科書に記載されている。その第２章に記載された通りのモノクローナル抗体の作製のため、これらの動物の脾臓又はリンパ節細胞は、タンパク質免疫動物の脾臓又はリンパ節細胞と同じ方法で用いることができる。モノクローナル抗体の作製に用いられる技法は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ［Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ ２５６；４９５〜４９７］並びに米国特許第４，３７６，１１０号明細書によりさらに記載されている。
【００５８】
後述の例２は、本発明者らによって作製された３０種のＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体について記載する。表２は各抗体の抗原特異性を表し、表３はその抗原親和性を示す。
【００５９】
用語「抗体」はまた、例えば、抗原と結合できるｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、二重特異性抗体、直鎖抗体、抗体のＦ（ａｂ’）２抗原結合断片等、インタクトな分子とその断片の両方を含むように企図されている［Ｗａｈｌら（１９８３年）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４、３１６〜３２５］。
【００６０】
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２並びに他の抗体断片は、インタクトな抗体分子のため及び本明細書に開示されている抗体の他の用途のための、本明細書に開示されている方法に従った、本発明の抗体の作製のための抗原として用いたタンパク質の生物試料における検出に有用である。このような断片は、例えばパパイン（Ｆａｂ断片作製のため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片作製のため）等の酵素を用いたタンパク質切断により産生することができる。このように、本発明において有用なＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２並びに他の抗体断片は、使用目的に応じて様々なタグを付けることができる。これらのタグは、検出を促進するための検出可能なタグであっても、腫瘍細胞を殺傷する毒性タグであっても、或いは他の細胞又は物質が腫瘍細胞を殺傷するよう誘導できる「誘導」タグであってもよい。
【００６１】
抗体は、分子（抗原）と特異的に反応し、その結果抗体が前記分子と結合できる場合、分子と「結合可能である」又は「認識する」と言われている。用語「エピトープ」は、該抗体又は該抗体を産生する細胞によって認識され得る、抗体が結合することのできる任意の分子の一部を意味するよう企図されている。エピトープ又は「抗原決定基」は、通常、アミノ酸又は糖側鎖等、分子の化学的活性表面分類からなり、特異的三次元構造特性及び特異的電荷特性を有する。
【００６２】
「抗原」は、抗体によって認識及び結合され得る分子又は分子の一部である。抗原は、１個又は２個以上のエピトープを有する可能性がある。上述の特異的反応は、抗原がその対応する抗体と高度に選択的且つ特異的な仕方で反応するが、他の抗原によって生じ得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すよう企図されている。
【００６３】
本発明によって提供される抗体は、特にポリクローナル抗体の任意のアイソタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤのものとなることができる。
【００６４】
モノクローナル抗体は、任意のアイソタイプのものであってもよい。
【００６５】
本明細書において提供され表２に示されているモノクローナル抗体は通常、ＩｇＧアイソタイプであった。
【００６６】
本発明において、本発明のＫＴＡＰＦ５０特異抗体を作製するために用いた抗原は、全長タンパク質又はＫＴＡＰＦ５０タンパク質に由来するペプチドに対応する。
【００６７】
用語「ペプチド」は、本明細書において、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を表すよう用いられている。ペプチドは、合成により、遺伝子工学的方法により、宿主細胞における発現、或いは他の適切な手段により得ることができる。他に断りのない限り、ペプチドは一般に、自然発生のＬ−アミノ酸で構成されている。
【００６８】
ペプチド分子に関し、用語「生物学的特性」は、全長ＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０ペプチドにより達成され得るｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ効果の内少なくとも一方を行うペプチドの能力を意味し、これは本明細書に記載されている生物活性を含むが、これに限定されるものではない。例えば、生物学的特性は、癌、免疫系関連疾患、ウイルス性疾患及び炎症ベースの疾患を治療する能力を含む。
【００６９】
抗体に関しては、「生物学的特性」又は「生物活性」は一般に、エピトープを特異的に認識し、その結果それと結合する抗体の能力を意味する。エピトープは、全長タンパク質の一部であってもよいし、或いはタンパク質断片又はペプチドに埋め込まれてもよい。実施例において証明され、図面において例証されている通り、図１は、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体のＫＴＰＡＦ５０タンパク質に対する特異性を示した。同様に、図３において、抗Ｔ１０１抗体のＴ１０１タンパク質に関する特異性が示される。
【００７０】
用語「改変された分子の生物学的特性が未改変分子と比べて有意に影響することなく」とは、改変された分子が、未改変分子の生物活性と質的に類似の生物活性を保持することを表すことを意味する。
【００７１】
本発明との関連において、改変されたペプチドに関し、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７のタンパク質の生物学的特性の内１又は複数を保持することを意味する。ペプチドが未改変の分子の生物活性と質的に類似の生物活性を保持するか決定するため、例えば、改変されたペプチドが、並行してアッセイされる対応する未改変ペプチド（即ち、全長ＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０ペプチドの）と比較されるｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又は臨床実験、或いは別個に行った実験から分かる通り、改変されたペプチドがアッセイされて未改変ペプチドの生物学的効果と同様の生物学的効果を有するか試験する実験等、１又は複数のアッセイを行うことができる。このような実験は、例えば、国際公開第２００９／０８３９６８号明細書に記載されている仕方で行うことができる。
【００７２】
改変されたペプチドは、ＫＴＰＡＦ５０ペプチドに含まれる少なくとも８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０又は少なくとも４５アミノ酸残基の対応する配列に対してある程度の同一性を有する、少なくとも８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０又は少なくとも４５アミノ酸残基の連続した配列を含むペプチドとなることができ、該ある程度の同一性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、具体的には少なくとも９５％である。
【００７３】
本発明により、ＫＴＰＡＦ５０に由来する改変されたペプチド、例えば、保存的置換により１又は複数のアミノ酸が別のアミノ酸と交換された改変されたペプチドを認識することのできる抗体もまた提供される。本明細書において、「保存的置換」は、あるクラスにおけるアミノ酸の、同じクラスのアミノ酸による置換を意味し、このようなクラスは、天然に存在する相同タンパク質におけるアミノ酸側鎖の共通の物理化学的性質及び高い置換頻度によって定義される。アミノ酸側鎖の一般的な６クラスが分類されており、これはクラスＩ（Ｃｙｓ）、クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）、クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）、クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）及びクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含む。例えば、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｕ等、クラスＩＩＩの別の残基への置換は、保存的置換である。
【００７４】
一実施形態において、アミノ酸配列において１個の置換のみが行われる。
【００７５】
別の一実施形態において、２個の置換が行われる。さらに別の一実施形態において、３個の置換が行われる。置換の最大数は、未置換配列におけるアミノ酸の少なくとも７０％、望ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を元のままに残すだけのアミノ酸数を超えてはならない。特定の一実施形態により、他の残基に置換された最大３、場合により最大６個のアミノ酸残基を含む置換は保存的置換である。
【００７６】
さらに別の一実施形態において、１又は複数のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸、好ましくは対応するＤ−アミノ酸に交換され得る。特定の一実施形態において、全アミノ酸がＤ−アミノ酸である。
【００７７】
よって、本発明は、実質的に等しい又はより高い活性を有する、本明細書に開示されている配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７）と構造的に類似の配列を含むタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを認識できる抗体に関することを理解するべきである。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの構造変化は、１又は複数の欠失、付加又は置換を含む。配列内の任意の点で生じ得る欠失又は付加の数は一般に、全アミノ酸数の２５％未満、好ましくは１０％未満となるであろう。
【００７８】
好ましい置換は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの二次構造の変質が予想されない変化、即ち保存的変化である。次のリストは、元のアミノ酸（左側）に対し交換され得るアミノ酸（右側）を示す。
【表１】
【００７９】
アミノ酸は、電荷、側鎖サイズ等、その本質的な特色に応じて分類することもできる。次のリストは、類似のアミノ酸グループを示す。好ましい置換は、次の通り、あるグループに属すアミノ酸を同一グループのアミノ酸と交換する。
１．小分子脂肪族・非極性：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
２．極性・負電荷残基及びそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．極性・正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．大分子脂肪族・非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
５．大分子芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
【００８０】
アミノ酸置換及びタンパク質構造に関するさらなる所見は、Ｓｃｈｕｌｚら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９７９年及びＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、カリフォルニア州サンフランシスコ、１９８３年に記載されている。
【００８１】
上に詳述されている通りの好ましい保存的アミノ酸置換は、本明細書において下に詳述されている通り、本発明の抗体によって認識されるタンパク質の機能又は活性を実質的に維持する又は増強させることが予想される。当然ながら、その結果生じるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドが、本発明の抗体により認識される抗原、即ち、本発明の抗体により認識されるタンパク質と機能の点で実質的に等しい又はより優れている抗原であれば、いずれのアミノ酸置換、付加又は欠失も本発明の範囲内であると考えられる。
【００８２】
本発明の抗体により認識されるタンパク質は、固相合成（例えば、ＦＭＯＣ及びＢＯＣ技法を用いた）並びに液相合成等、従来の化学的方法により産生することができる。これらのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、後述のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１６章に詳述されている通り、細菌若しくは昆虫細胞又は他の真核生物転写ｉｎ ｖｉｖｏ系において産生してもよい。産生に続き、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、それらが産生された細胞から精製される。ペプチド精製方法は、当業者にとって公知のものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１６章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００６年及びＣｏｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第５章及び第６章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００６年に詳述されている。有利には、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）等の第二のタンパク質又はヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）配列等の配列タグとの融合体として産生することができる。融合体又はタグ付きタンパク質の使用は、上述のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１６章並びにＨｉｓ−タグタンパク質発現及び精製キットの取扱説明書［例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ドイツから入手可能］に詳述されているように、精製手順を簡略化する。
【００８３】
本発明の抗体によって認識されるタンパク質は、例えば、細胞抽出物又はリボソームを用いた無細胞系において合成することもできる。
【００８４】
本発明の抗原は、その機能、親和性又は安定性を改善するようさらに改変することができる。例えば、より優れた安定性及び／又は全体的な性能改善をペプチドに付与するよう、環化が用いられてよい。側鎖環化及び骨格環化等、多くの異なる環化方法が開発されてきた。これらの方法は、先行技術において十分に実証されている［例えば、Ｙｕら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７、１６１〜７５、１９９９年、Ｐａｔｅｌら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５３、６８〜７４、１９９９年、Ｖａｌｅｒｏら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５３、５６〜６７、１９９９年、Ｒｏｍａｎｏｖｓｋｉｓら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５２、３５６〜７４、１９９８年、Ｃｒｏｚｅｔら、Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３、２６１〜７６、１９９８年、Ｒｉｖｉｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１、５０１２〜９、１９９８年、Ｐａｎｚｏｎｅら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（東京）、５１、８７２〜９、１９９８年、Ｇｉｂｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、１２８１４〜８、１９９８年、Ｌｉｍａｌら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５２：１２１〜９、１９９８年及び米国特許第５，４４４，１５０号明細書］。
【００８５】
特定の環化方法は、ベンゼン環のパラ置換されたアミノ酸誘導体を用いることによる、両親媒性αへリックスの安定化に関与する［Ｙｕら、（１９９９年）、ｉ同上］。別の特定の環化方法は、Ｒｅｉｓｓｍａｎｎら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １：５１〜６、１９９４〜９５年及びそこに参照されている文献に開示されているように骨格環化である。骨格−側鎖結合に関与する別の環化方法が用いられてもよい［Ｒｅｉｓｓｍａｎｎら（１９９４〜９５年）、同上］。
【００８６】
上述の通りではあるが、本発明において、本発明の抗体によって認識されるタンパク質は、自然発生的又は合成アミノ酸ではない様々な同一又は異なる有機成分によりそのＮ末端及び／又はＣ末端が延長されてよい。このような延長の一例として、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドはＮ−アセチル基によりそのＮ末端及び／又はＣ末端が延長されてよい。
【００８７】
ペプチド構造を改善するため、本発明の抗体によって認識されるタンパク質は、そのＮ末端を通してラウリル−システイン（ＬＣ）残基と結合及び／又はそのＣ末端を通してシステイン（Ｃ）残基と結合、或いはペプチドと免疫化のためのアジュバント（単数又は複数）との結合に適した他の残基（単数又は複数）と結合することができる。
【００８８】
さらに別の一態様において、本発明は、本発明に記載されている少なくとも１種類の抗体を有効成分として含む組成物を提供する。したがって、本発明の組成物の活性物質として含まれている前記抗体は、ＫＴＰＡＦ５０又はその任意の断片、アナログ若しくは誘導体を認識し結合する抗体又はその断片である。
【００８９】
前記組成物は、異なるハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体の組合せを含むことができる。例えば、前記組成物は、表２に記載のハイブリドーマに対応した２種類、３種類、４種類、５種類又はそれ以上のハイブリドーマ細胞系に由来する抗体を含むことができる。
【００９０】
一実施形態において、前記組成物は診断方法に用いるためのものである。
【００９１】
前記抗体又はそれを含む前記組成物は、癌及び自己免疫障害の診断に有用である。
【００９２】
具体的には、前記抗体又はそれを含む前記組成物は、肺癌又はＩＢＤの診断に用いることができる。
【００９３】
別の一実施形態において、本発明に記載されている抗体の内少なくとも１つを含む前記組成物は、癌の治療に用いることができる。
【００９４】
さらに別の一実施形態において、本発明に記載されている抗体の内少なくとも１つを含む組成物は、癌の予後に用いることができる。治療有効性の指標を持つことが重要な癌治療を受けている患者は、特に予後の必要がある。したがって、本発明に記載されている少なくとも１種類の抗体を含む組成物は、治療成績であるＫＴＰＡＦ５０レベルの検出又は決定によって決定することができるべきである。
【００９５】
組成物の調製は本技術分野においてよく知られており、多くの論文や教科書に説明されている。例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルベニア州イーストン、１９９０年の特に１５２１〜１７１２頁を参照のこと。
【００９６】
本発明の組成物は、薬学的に許容されるアジュバント、担体、希釈剤又は賦形剤の内少なくとも１つをさらに含むことができる。
【００９７】
用語「薬学的に許容される担体」は、有効成分と反応しない不活性の非毒性材料のいずれか１種類を意味する。担体は、所望の製剤形態に基づき、場合により選択される。担体は、クリアランス速度を遅らせるため、持続放出特性を付与するため、望ましくない副作用を低減させるため等、薬剤の安定性を改善するための有効成分の標的組織への送達又は浸透の改善効果を場合により有することができる。担体は、製剤に食用香味料等を提供するための、製剤を安定化する物質（例えば、保存剤）であってよい。担体は、従来用いられてきた担体の内いずれかであってよく、溶解度及び本発明の抗体との反応性欠如等の物理化学的考察並びに投与経路によってのみ限定される。担体は、添加物、着色料、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、香味料及び薬理学的適合性担体を含むことができる。加えて、担体は、定義によると予測可能な方法で有効成分の作用に影響を及ぼす物質であるところのアジュバントとなることができる。担体の典型例として、（ａ）有効量の活性物質が、水、生理食塩水、天然果汁、アルコール、シロップ等、希釈剤中に溶解した溶液、（ｂ）それぞれが固体又は顆粒として所定量の活性物質を含む、カプセル（例えば界面活性剤、潤滑剤及び不活性充填剤を含む、例えば通常の硬い又は柔らかい殻のゼラチン型の）、錠剤、薬用キャンディー（活性物質がショ糖及びアカシア又はトラガント等、香料中にある、或いは活性物質がゼラチン及びグリセリン等、不活性塩基中にある）並びにトローチ剤、（ｃ）散剤、（ｄ）適切な液体中の懸濁剤、（ｅ）適切なエマルジョン、（ｆ）リポソーム製剤その他が挙げられる。
【００９８】
別の一実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、ホルモン等、追加的な活性物質を必要に応じてさらに含むこともできるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
本発明において、本発明に係る抗体を産生する抗体産生細胞系もまた提供される。よって、本発明は、ＫＴＰＡＦ５０に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。
【０１００】
一実施形態において、同様に本発明の目的である抗体産生細胞系を作出するため、抗体産生細胞はクローンとして単離され、不死化される。細胞の不死化は、当業者にとって公知の方法により達成することができ、これは例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、２００７年［Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ、Ｃｏｒｔｉ Ｄ、Ｓａｌｌｕｓｔｏ Ｆ．（２００７年）Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１８（６）：５２３〜８］によって記載されている。
【０１０１】
後述の例２並びに表２及び３は、本発明者らによって作製された全ハイブリドーマ、その作製に用いた特定の抗原及びＥＬＩＳＡによって測定したその抗原親和性を示す。
【０１０２】
したがって、本発明は、抗体産生細胞系又はハイブリドーマ細胞系も提供する。
【０１０３】
特に、本発明は、次のハイブリドーマ細胞系３Ｅ３Ｇ７、５Ｅ１１Ｈ３、２Ｂ６Ａ３、２Ｂ６Ａ１２、２Ｂ６Ｇ２、２Ｂ６Ｈ１、５Ｅ１１Ｂ５、５Ｅ１１Ｂ８、５Ｅ１１Ｈ５、３Ｅ１Ｆ９、３Ｅ１Ｆ１１、３Ｅ１Ｇ４、３Ｅ１Ｇ６、２Ａ８Ｂ８、２Ａ８Ｂ１２、２Ａ８Ｈ７、６Ｅ２Ｂ６、６Ｅ２Ｃ５、６Ｅ２Ｃ９、６Ｅ２Ｄ４、７Ｄ４Ｄ６、７Ｄ４Ｅ１２、７Ｄ４Ｆ９、７Ｄ４Ｈ１０、６Ｆ５Ａ１、６Ｆ５Ｃ９、６Ｆ５Ｃ１２、３Ｅ３Ｂ３及び３Ｅ３Ｃ８を提供する。
【０１０４】
ブダペスト条約の規定に従い、次の通り、２種類のハイブリドーマ細胞系（３Ｅ３Ｇ７及び５Ｅ１１Ｈ３）を、寄託機関であるＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（２５、Ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４、Ｐａｒｉｓ、Ｃｅｄｅｘ １５、フランス）に寄託した。
【表２】
【０１０５】
対象出願に対応する出願又はその後継の出願がなされている国の外国特許法の定めるところにより寄託物を利用することができる。しかし、寄託物の利用は、行政措置により承認された特許権を逸脱した対象発明の実施の許諾には当たらないことを理解するべきである。
【０１０６】
さらに、対象ハイブリドーマ寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の条項に従って保存及び一般公開されている、即ち、その生存維持及び汚染防止に必要なあらゆる注意を払って、寄託試料供給の最後の要求があってから少なくとも５年間の期間、そしていずれの場合においても寄託日から少なくとも３０年間の期間、或いは培養物の開示をなし得る任意の特許の法的強制力のある期間保存された。寄託機関が寄託物の状態のために請求があっても試料を供給できなければ、寄託者は、寄託物（単数又は複数）を交換する義務に同意する。対象培養寄託物の一般公開におけるあらゆる制限は、それを開示する特許の付与によって取消不能に取り除かれるであろう。
【０１０７】
したがって、本発明は、前記細胞系によって産生される抗体も提供する。
【０１０８】
さらにまた別の一態様において、本発明は、本発明に記載されているＫＴＰＡＦ５０を認識する抗体の診断組成物の調製における使用を提供する。特に、前記組成物は、癌及び自己免疫疾患のいずれか一方の診断のためのものである。
【０１０９】
よって、本発明は、癌診断のための診断組成物の調製における抗ＫＴＰＡＦ５０抗体の使用を提供する。
【０１１０】
本明細書において癌について言及する場合、慢性骨髄性白血病や成熟に伴う急性骨髄性白血病等の骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、好塩基球増加を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病、バーキット病や非ホジキン病等の悪性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病や慢性リンパ球性白血病等のリンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、良性髄膜腫等の固体腫瘍、唾液腺の混合腫瘍、口唇及び口腔における腫瘍、咽頭、喉頭、副鼻腔、結腸腺腫、小細胞肺癌等の腺癌、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸肉腫、脂肪肉腫、粘液性滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液性軟骨肉腫、ユーイング腫瘍、精巣及び卵巣未分化胚細胞腫を含む他の腫瘍、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、中皮腫、乳癌、皮膚癌、前立腺癌及び卵巣癌、眼瞼の癌腫、結膜の癌腫、結膜の悪性黒色腫、ぶどう膜の悪性黒色腫、網膜芽細胞腫、涙腺の癌腫、眼窩、脳、脊髄、脈管系の肉腫、血管肉腫並びにカポジ肉腫を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
本明細書において後続の例１及び図２で証明されているように、ＫＴＰＡＦ５０血清レベルを肺癌において評価したところ、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体は、肺癌の診断における有用性を示した。
【０１１２】
本発明の抗体又はそれを含む組成物もまた、乳癌及び卵巣癌の診断で用いるためのものである。
【０１１３】
加えて、本発明は、自己免疫疾患の診断のための診断組成物の調製における抗ＫＴＰＡＦ５０抗体の使用を提供する。
【０１１４】
本明細書の記述において、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性ぶどう膜炎、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、膵島炎、シェーグレン症候群、自然流産、実験的自己免疫性心筋炎、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、ループス（ＳＬＥ）、乾癬及び糖尿病、特にＩ型を含む。自己免疫疾患の追加的な例として、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、円形脱毛症、アミロイド症、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、軸索及び神経細胞性神経障害、Ｂａｌ病、Ｂｅｈｎｅｔ病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアックスプルー（非熱帯性）、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、皮膚筋炎、デビック病、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、好中球減少症、眼球瘢痕性類天疱瘡、骨関節炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（末梢ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型多腺性自己免疫性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋痛、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球ろう、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、精子及び精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎及び壊死性脊髄症、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、血管炎、小水疱性皮膚症、白斑並びにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１１５】
別の一態様において、本発明は、本発明に記載されているＫＴＰＡＦ５０特異的な抗体の、癌、自己免疫疾患、移植片拒絶、神経変性疾患及び糖尿病を治療するための治療組成物の調製における使用を提供する。
【０１１６】
特に、前記組成物は、癌を治療するためのものである。
【０１１７】
例３に示す通り、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体による治療は細胞生存率の低下をもたらし、これらの抗体を細胞死の誘導又はアポトーシスの誘導に用いてよいことを示唆する。癌性細胞における細胞死の誘導は、その除去のための効果的な手段となることができる。
【０１１８】
したがって、本発明は、必要とする対象に治療上有効量の少なくとも１種類の本発明の抗体又はその組合せを投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。
【０１１９】
さらに、本発明において提供される抗体又はその断片は、本発明の抗体作製のための抗原として用いたタンパク質の試料における量的又は質的な検出に用いることができる。これは、蛍光（免疫蛍光）、酵素反応の発色産物、沈殿の生成、化学発光又は生物発光の内いずれか１種類となり得る、視覚的に検出可能なシグナルを与える技法によって達成することができる。後述の通り、蛍光又は発色性標識抗体の利用は、光学顕微鏡、フローサイトメトリー又は蛍光定量的検出と組み合わせる。抗体の検出に用いることのできる他の技法及び標識は、コロイド金、放射性タグ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）その他、アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン、磁性ビーズ及び物理的システム、例えば実際の結合に対して高感度のナノテクノロジーによるシステムを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
本発明において提供される抗体又はその断片は、例えば免疫組織化学、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡等において、またタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ検出のため組織学的染色に用いることができる。ｉｎ ｓｉｔｕ検出は、対象から組織学的検体を取り出し、本発明の標識抗体をこのような検体と接触させることによって達成することができる。標識抗体（又は断片）を生物試料（前記検体）に塗布又は覆うことにより、抗体（又は断片）の接触を行う。このような手順の使用により、試験した組織における抗原の存在だけでなく、その分布を決定することも可能となる。このようなｉｎ ｓｉｔｕ検出を達成するため、当業者であれば、本発明を用いて染色手順等、多種多様な組織学的方法を改変できることを容易に認知できるであろう。
【０１２１】
本発明に係る抗体を標識して直接検出できる方法の１つは、同を酵素に結合し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に用いることによるものである。同様に、この酵素は、後に適切な基質に曝露されるときに、例えば分光光度的、蛍光定量的又は視覚的手段によって検出され得る化学成分を生成するような仕方で基質と反応するであろう。抗体の検出可能な標識に用いることのできる酵素は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されるものではない。検出は、酵素のための発色性基質を用いる比色法によって達成することができる。検出は、同様に調製された標準と基質との酵素反応の程度を視覚的に比較することによって達成することもできる（この手順は、可溶性発色産物及び不溶性発色産物、例えばニトロセルロース又はプラスチック支持体の両方に適している）。
【０１２２】
本発明において、抗原と抗体との反応の検出は、適切な事例においては、異なるエピトープと特異的、或いは非特異的な二次抗体又はリガンド若しくは反応抗体と反応性の他のリガンドの使用によってさらに支援することができる。
【０１２３】
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、測光アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びイムノブロッティング等、酵素免疫測定法は、特異抗体の検出を達成するために容易に適用することができる。
【０１２４】
同様に用いることのできる他の検出システムは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃｏｗａｎ株Ｉ由来のプロテインＡ、グループＣストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種（２６ＲＰ６６株）由来のプロテインＧの使用に基づくシステム又はビオチン−アビジン結合反応を用いるシステムを含む。
【０１２５】
本発明の抗体を用いることのできる免疫酵素的検出の他の方法は、ウエスタンブロット及びドットブロットである。試料は、電気泳動により分離され、ニトロセルロースメンブレン又は他の適切な支持体に転写される。次に、検査される試料（例えば、培養物上清）がメンブレンと接触され、形成された免疫複合体の存在が既述の方法により検出される。この方法の変法において、精製抗体がメンブレン上に線状又は点状に塗布され、結合される。その後、メンブレンは、検査される培養前後の試料と接触され、形成された免疫複合体を本明細書に記載されている技法を用いて検出する。
【０１２６】
抗体−抗原複合体の存在は凝集によって検出することもできる。本発明に係る抗体は、例えば均一な懸濁液を生成するラテックス粒子のコーティングに用いることもできる。試料、例えば抗体によって認識される特異抗原を含む血清と混合すると、ラテックス粒子は凝集を生じ、大きな凝集物の存在は視覚的に検出することができる。
【０１２７】
免疫測定技法による抗体の測定に適用できる免疫学的手順及び免疫測定法手順の総説として、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ［Ｄ．Ｓｔｉｔｅｓら編（１９９４年）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版］を参照されたい。
【０１２８】
抗原と抗体との反応の検出は、本技術分野で公知の方法により検出可能な成分で標識された抗体又はリガンドの使用によって容易とすることができる。このような検出可能な成分は、沈殿若しくは変色の視覚的検出、顕微鏡による視覚的検出又は分光測定若しくは放射測定による自動検出等を可能にする。検出可能な成分の例として、フルオレセイン及びローダミン（蛍光顕微鏡用）、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ（光学顕微鏡用又は電子顕微鏡用のいずれか及び生化学的検出並びに変色による生化学的検出用）並びにビオチン−ストレプトアビジン（光学又は電子顕微鏡用）が挙げられる。用いられる検出方法及び成分は、例えば、上のリスト又はこのような選択に適用される標準的な判断基準による他の適切な例から選択することができる［Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ］。
【０１２９】
検出は、他の様々な免疫測定法のいずれかを用いて達成することができる。例えば、抗体又は抗体断片を放射性標識することにより、放射免疫測定法（ＲＩＡ）の使用による抗原の検出が可能となる。ＲＩＡの優れた記述は、参照として本明細書に組み込まれるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｏｒｋ、Ｔ．Ｓ．ら著、Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ（１９７８年）に記載されており、特に表題「Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」の章、Ｃｈａｒｄ，Ｔ．著を参照のこと。放射性同位元素は、ガンマ／ベータカウンター若しくはシンチレーションカウンターの使用又はオートラジオグラフィーによる手段によって検出することができる。
【０１３０】
本発明に係る抗体の蛍光化合物による標識も可能である。蛍光標識抗体が適切な波長の光に露光されると、次にその存在は蛍光により検出することができる。最も一般に利用されている蛍光標識用化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレサミンである。
【０１３１】
抗体は、１５２Ｅ又はその他ランタニド系列等、蛍光放射性金属を用いて検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＥＴＰＡ）等の金属キレート基を用いて抗体に結合することができる。
【０１３２】
抗体は、それと化学発光化合物とを結合することによって検出可能に標識することができる。続いて、化学発光タグ付き抗体の存在は、化学的反応過程の際に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識用化合物の例として、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
【０１３３】
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗体を標識するために用いることができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める、生物系に存在する化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
【０１３４】
本発明の抗体分子は、「２部位（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）」又は「サンドイッチ」アッセイとしても知られている免疫測定法における利用に適応することができる。一般的な免疫測定法において、大量の非標識抗体（又は抗体断片）が固体の支持体又は担体に結合し、大量の検出可能に標識された可溶性抗体が添加されて、固相抗体、抗原及び標識抗体の間に形成された三元複合体の検出及び／又は定量化を可能にする。
【０１３５】
本発明の抗体は、多くの異なる癌のイメージングに用いるために放射標識してもよい。Ｉｎ１１１及びＴｃ９９等、放射性同位元素は、抗体標識及びイメージング技法による可視化に用いられる。放射免疫シンチグラフィ（ＲＩＳ）は、腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏイメージングを可能にする機能試験である。これは、放射標識抗体及び標準的なガンマシンチレーションカメラを用いて達成される。
【０１３６】
このように、本発明は、対象における腫瘍又は癌の存在の検出又は徴候のスクリーニングアッセイとして有用である。抗体又はその断片は、本明細書に記載されている検出可能なマーカーと直接コンジュゲートした場合、抗原（又はその断片）のｉｎ ｖｉｖｏにおける検出に用いて癌性細胞の存在を示し、診断される対象に注射してイメージングにより検出することによってイメージング技法を活用した可視化を行うことができる。
【０１３７】
さらに、本発明によって提供される抗体は、癌の治療においてそれ自体を、或いは組成物の一部として用いるために、細胞毒性薬物とコンジュゲートすることができる。
【０１３８】
したがって、上述の通り、本発明によって提供される抗体は、癌性又は前癌性細胞を殺傷するための毒性薬物の送達系として適している。
【０１３９】
細胞毒性薬物の一例は、抗体と直接的に、或いはリンカーを介して共有結合できる抗増殖性薬物分子であるが、前記抗体は、癌細胞に豊富な、或いは癌細胞によって分泌されるプロテアーゼにより必要に応じて特異的に切断され、その結果プロテアーゼの作用により癌細胞の内部、近隣又は癌細胞に抗増殖性薬物を優先的に放出することができる。
【０１４０】
抗増殖性薬物の例として、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、チオテパ、イホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキサート、５−フルオロウラシルシトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン（ｉｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、エピポドフィロトキシンビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｌｅｓｔｉｎ）、エトポシド、テニポシド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、アドレノコルチコイド、エストロゲン、抗エストロゲン、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、アンドロゲン、抗アンドロゲン、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ミトタン、プロカルバジド、シスプラスチン（ｃｉｓｐｌａｓｔｉｎ）、カルボプラチン、メルファラン、メトトレキサート及びクロラムブシルが挙げられる。
【０１４１】
或いは、抗体は、金属イオン（鉄又は亜鉛その他）等の特定の物質を腫瘍へと運ぶことができ、したがって毒性物質（前述の通り、放射性又は細胞毒性化学物質、即ち、リシン等の毒素、細胞毒性アルキル化剤又は細胞毒性プロドラッグ）を腫瘍へと送達するための手段又は担体として機能する。抗体と毒素又は放射性同位元素との結合は、化学的となることができる。直接結合した毒素の例として、ドキソルビシン、クロラムブシル、リシン、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素等が挙げられる。ハイブリッド毒素は、抗原及び毒素に対して二重特異性を備えるよう作成することができる。このような二価分子は、腫瘍と結合して細胞毒性薬物を腫瘍へと送達するよう、或いはＴ３〜Ｔｉ受容体複合体との結合等、細胞毒性リンパ球と結合しこれを活性化するよう機能することができる。
【０１４２】
例３、４及び６並びにそれらの各図に示す通り、本発明の抗体は、細胞増殖を抑制することができる。
【０１４３】
したがって、別の一態様において、本発明は、有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を細胞と接触させる工程を含む、細胞増殖を抑制する方法を提供する。前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法であってもｅｘ ｖｉｖｏ法であってもよい。
【０１４４】
例６にも示す通り、本発明の抗体は、サイトカイン、特にＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０の発現を抑制することができる。
【０１４５】
よって、さらにまた別の一態様において、本発明は、有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を、前記サイトカインを発現する細胞と接触させる工程を含む、サイトカイン発現を抑制するための方法を提供する。前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法であってもｅｘ ｖｉｖｏ法であってもよい。
【０１４６】
特に、本発明は、炎症性サイトカインを抑制するための方法を提供する。
【０１４７】
炎症性サイトカインは、炎症を誘導することによって作用する。これらのサイトカインは、内因性発熱物質（ＩＬ１、ＩＬ６、ＴＮＦ−アルファ）として作用するか、マクロファージと間葉系細胞（線維芽細胞、上皮及び内皮細胞等）の両方により二次メディエーター及び炎症性サイトカインの合成を上方制御するか、急性期タンパク質の産生を刺激するか、或いは炎症性細胞を誘引する。
【０１４８】
炎症性サイトカインとして、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＩＮＦ−γ（インターフェロンγ）、ＴＮＦ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３が挙げられる。これらのサイトカインは、Ｔｈ１及びＴｈ２リンパ球の制御に関与する。
【０１４９】
ＴＮＦ−αの下方制御は特に、リウマチ様関節炎、ＩＢＤ及び乾癬等、自己免疫疾患の治療に重要であることが示されてきた。
【０１５０】
したがって、本発明の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体又はそれを含む組成物は、これらのヒト自己免疫疾患を治療するための非常に強力なツールである。
【０１５１】
これに関連し、本発明の抗体は、移植片拒絶並びに自己免疫疾患、神経変性疾患及び糖尿病の治療に用いることもできる。
【０１５２】
したがって、本発明は、治療上有効量のＫＴＰＡＦ５０特異抗体又はそれを含む組成物を、必要とする対象に投与する工程を含む、癌、自己免疫障害、移植片拒絶、神経変性障害及び糖尿病からなる群から選択された状態の治療方法を提供する。
【０１５３】
前記抗体で治療することのできる特定の自己免疫疾患は、ＩＢＤ、リウマチ様関節炎及び乾癬である。
【０１５４】
神経変性障害は、運動系、感覚系又は認知系における選択的且つ対称的な神経細胞消失によって特徴付けられる慢性且つ進行性の障害である。神経変性障害の限定的なリストとして、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、家族性アミロイド多発ニューロパチー及びタウオパチーが挙げられる。
【０１５５】
糖尿病は、生物が十分なインスリンを産生しないことによる、或いは細胞が産生されたインスリンに応答しないことによる高血糖によって特徴付けられる。この高血糖は、多尿症（頻尿症）、多飲症（口渇増大）及び過食症（空腹感増大）の古典的な症状を呈す。３種の主要な糖尿病の型は、身体がインスリンを産生できないことによる、インスリン投与によって治療できる１型糖尿病、インスリン抵抗性による２型糖尿病及びそれ以前には糖尿病に罹ったことのない妊婦が妊娠中に高血中グルコースレベルを有する妊娠糖尿病である。真性糖尿病の他の形態に、インスリン分泌の遺伝的欠陥による先天性糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病、高用量の糖質コルチコイドによって誘導されるステロイド糖尿病及び数種類の形態の一遺伝子性糖尿病がある。
【０１５６】
本発明は、既に診断された癌の予後評価に用いることのできる方法も提供する。特に、治療の前、最中及び後の経過観察に重要である。或いは、特に検査される試料が、患者から得ることのできる最も「患者に優しい」タイプの試料の１つである血液試料である場合、前記方法は、癌のスクリーニングにも適切である。
【０１５７】
したがって、さらにまた別の一態様において、本発明は、
ａ．対象から試料を得る工程と、
ｂ．前記試料を本発明に係る少なくとも１種類の抗体、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体又はそれを含む組成物と接触させる工程と、
ｃ．前記少なくとも１種類の抗体とその特異抗原との複合体の形成を検出手段により検出する工程と、
を含む、対象における癌の診断のための方法であって、複合体の検出が、前記対象が癌に罹患していることを示す方法を提供する。
【０１５８】
本明細書において対象について言及する場合、前記対象は、哺乳類、ヒト又は非ヒトとなることができる。非ヒト哺乳類は、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット等を含むが、これらに限定されるものではない。通常、対象は、ヒト、特に患者又は健常者である。
【０１５９】
本発明の診断方法の一実施形態において、前記試料は血液試料である。
【０１６０】
抗ＫＴＰＡＦ５０抗体又はそれを含む組成物を利用する、本発明の前記診断方法のさらに別の一実施形態において、前記癌は、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択される。
【０１６１】
したがって、本発明は、癌治療の有効性のモニタリング方法も提供する。治療の有効性のモニタリングは、癌治療の予後評価に必要である。したがって、本明細書に示されている診断方法は、癌治療の前、最中及び後の対象において有効となることができ、各時点で得られた結果の解析（少なくとも２種の抗原−抗体複合体の間の関係性のパターン）は正常集団における同一複合体のパターンと比較される。対象のパターンが正常集団のパターンと最も近似であることは、治療の成功を示す。
【０１６２】
本明細書に言及されている癌治療は、放射線療法、化学療法等を含む、疾患を根絶するためのあらゆる治療に関する。
【０１６３】
本発明の抗体は、本発明の抗体を互いに組み合わせて又は他の抗体と組み合わせて用いることのできる、ヒト及びマウス免疫系において免疫応答を誘導する化合物のハイスループットスクリーニング並びに特に消化器系において、或いは同様に他の系において炎症及び癌を誘導する化合物のスクリーニングのための多重免疫測定法に用いることもできる。多重免疫測定法は、当業者に知られており、とりわけＡｎｄｅｒｓｏｎ及びＤａｖｉｓｏｎ［Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＤａｖｉｓｏｎ（１９９９年）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：１０１７〜１０２２］によって記載されている。
【０１６４】
本発明を説明するための本明細書において、「腫瘍」、「癌」、「悪性増殖性障害」及び「悪性腫瘍」は、全て等しく組織又は器官の肥厚化に関する。組織がリンパ性又は免疫系悪性細胞の一部である場合、循環細胞の非固体腫瘍を含み得る。他の組織又は器官の悪性腫瘍は、固体腫瘍を生じ得る。一般に、非固体及び固体腫瘍は、例えば、癌腫、黒色腫、白血病及びリンパ腫である。
【０１６５】
癌及び腫瘍は、慢性骨髄性白血病や成熟に伴う急性骨髄性白血病等の骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、好塩基球増加を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病、バーキット病や非ホジキン病等の悪性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病や慢性リンパ球性白血病等のリンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、良性髄膜腫等の固体腫瘍、唾液腺の混合腫瘍、口唇及び口腔における腫瘍、咽頭、喉頭、副鼻腔、結腸腺腫、小細胞肺癌等の腺癌、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸肉腫、脂肪肉腫、粘液性滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液性軟骨肉腫、ユーイング腫瘍、精巣及び卵巣未分化胚細胞腫を含む他の腫瘍、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、中皮腫、乳癌、皮膚癌、前立腺癌及び卵巣癌、眼瞼の癌腫、結膜の癌腫、結膜の悪性黒色腫、ぶどう膜の悪性黒色腫、網膜芽細胞腫、涙腺の癌腫、眼窩、脳、脊髄、脈管系の肉腫、血管肉腫並びにカポジ肉腫を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１６６】
癌の検出、診断、予後評価、スクリーニング及び治療のための本明細書に記載されている方法は、癌におけるいずれのステージにも適している。
【０１６７】
別の一実施形態において、本方法は、癌の任意のステージで実施され、他の現在利用されている特に癌診断のための技法と比べて最も有利である。例えば、技術的に患者に不快感をもたらし、その上比較的高度な偽陽性結果を生じる（これは、言い換えると、さらに生検にかけられる多くの患者が必要のない不安にかられる）マンモグラフィーと比較した場合、本発明に記載されている診断方法は血液検査に基づき、より低い偽陽性結果の発生率の可能性がある。あらゆる現在のマクロレベルの診断ツール、マンモグラム、デジタル直腸試験（ＤＲＥ）及び超音波（それぞれ乳癌、前立腺癌及び卵巣癌のため）は、疑わしい腫瘍体積が既に視覚的に検出可能なサイズに発達した後にようやく癌を診断する能力を有し、これは患者の生存率の低下及び生活の質の低下をもたらす。例えば、米国単独では、乳癌のために年間約３千万件のマンモグラフィー手順が行われ、疑わしい乳房の病変を有する女性に百万件を超える外科的乳房生検が行われる。
【０１６８】
この点について、癌のステージ分類体系に精通していることが重要である。ステージ分類は、癌がどのように発生するかについての知見に基づく。癌細胞は、無秩序に、或いは腫瘍を形成するよう分裂、増殖する。腫瘍が増殖するにつれ、近傍器官及び組織に浸潤できるようになる。癌細胞は腫瘍から離脱し、血流又はリンパ系に進入することもできる。血流又はリンパ系を通って移動することにより、癌は原発部位から広がって、他の器官において新しい腫瘍を形成することができ、これは転移と呼ばれている。
【０１６９】
大部分の種類の癌は、ＴＮＭ（腫瘍サイズ、リンパ節の関与、転移）表示を有するが、一部の癌にはない。例えば、脳及び脊髄の癌は、その細胞型及びグレードに応じて分類される。異なるステージ分類体系がリンパ腫等、多くの血液又は骨髄の癌に用いられる。アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）ステージ分類は、リンパ腫のステージ分類に一般に用いられ、ＡＪＣＣ（対癌米国合同委員会）及びＵＩＣＣ（国際対癌連合）の両方によって採用された。しかし、大部分の種類の白血病等、他の血液又は骨髄の癌は、明快なステージ分類体系を持たない。世界産婦人科連合によって開発された別のステージ分類体系は、子宮頸部、子宮、卵巣、膣及び外陰の癌のステージ分類に用いられる。この体系は、ＴＮＭ式を用いる。その上、小児癌は、ＴＮＭ体系か、或いは小児治験を行うグループである小児腫瘍学グループ（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）のステージ分類基準のいずれかを用いてステージ分類される。
【０１７０】
ＴＮＭステージ分類体系は、次の通りである。Ｔは腫瘍サイズ及び近傍組織で浸潤したかを表し、Ｎは関与する任意のリンパ節を表し、Ｍは転移の存在を表す。
原発腫瘍（Ｔ）
ＴＸ 原発腫瘍を評価できない
Ｔ０ 原発腫瘍の証拠なし
Ｔｉｓ 原位置の癌腫（近隣の組織へと広がっていない早期癌）
Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４ 原発腫瘍のサイズ及び／又は程度
局所リンパ節（Ｎ）
ＮＸ 局所リンパ節を評価できない
Ｎ０ リンパ節の関与なし（リンパ節において癌は発見されない）
Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３ 局所リンパ節の関与（拡散の数及び／又は程度）
遠隔転移（Ｍ）
ＭＸ 遠隔転移を評価できない
Ｍ０ 遠隔転移なし（癌は身体の他の部分へと広がっていない）
Ｍ１ 遠隔転移（癌は身体の他の部分へと広がっている）
【０１７１】
ＴＮＭ体系に従った一例は、例えば乳癌Ｔ３Ｎ２Ｍ０であり、これは乳房外部の近傍リンパ節に広がったが、身体の他の部分には広がっていない大きな腫瘍を意味する。前立腺癌Ｔ２Ｎ０Ｍ０は、腫瘍が前立腺内のみに局在し、リンパ節又は身体の他のいかなる部分にも広がっていないことを意味する。
【０１７２】
ＮＣＩの監視疫学遠隔成績プログラム（ＳＥＥＲ）等、多くの癌登録は、概要ステージ分類を利用する。この体系は、あらゆる種類の癌に用いられる。これは、癌症例を５つの主要カテゴリーに分類する。
− 原位置型は、癌が最初に生じた細胞層にのみ存在する早期癌である。
− 局在型は、癌が最初に生じた器官に限定された拡散の証拠のない癌である。
− 局所型は、元々の（原発）部位を越えて近傍リンパ節又は器官及び組織へと広がった癌である。
− 遠隔型は、原発部位から遠隔器官又は遠隔リンパ節へと広がった癌である。
− 不明は、ステージを示すのに十分な情報がない症例の説明に用いられる。
【０１７３】
別の一般に用いられるステージ分類体系は、ローマ数字を用いる。
ステージ０：原位置の癌腫（癌が最初に生じた細胞層にのみ存在する早期癌）。
ステージＩ、ＩＩ及びＩＩＩ：数字が大きくなる程、より広範の疾患、より大型の腫瘍サイズ及び／又は癌の原発腫瘍に隣接する近傍リンパ節及び／又は器官への拡散を示す。
ステージＩＶ：癌が別の器官へと広がった。
【０１７４】
よって、本発明によって提供される癌の診断及び検出方法、例えば本明細書に記載されている標識抗体を用いた方法も、腫瘍のステージ分類に非常に有用である［腫瘍は増殖につれて変化するため］。例えば、これは、特に癌の初期に他の現在利用できる技法によって検出できない増殖の検出及び／又は位置の特定を可能にする。
【０１７５】
よって、さらにまた別の一態様において、本発明は、対象における自己免疫疾患の診断のための方法であって、
ａ．対象から試料を得る工程と、
ｂ．前記試料を本発明に係る少なくとも１種類の抗体、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体又はそれを含む組成物と接触させる工程と、
ｃ．前記少なくとも１種類の抗体とその特異抗原との複合体の形成を検出手段により検出する工程と、
を含み、それにより、複合体の検出が、前記対象が自己免疫疾患に罹患していることを示す方法を提供する。
【０１７６】
上述の方法は、複合体の検出及び治療中の異なる時点（治療前、治療中及び治療後）におけるそのレベルの比較が自己免疫疾患に罹患している又は罹患する可能性のある対象における治療効率及び結果の評価を提供する、自己免疫疾患の予後に適用することもできる。
【０１７７】
本発明の前記診断方法の一実施形態において、前記試料は血液試料である。
【０１７８】
本明細書において定義されている通り、「試料」は、対象、一般には哺乳類の対象から得られる任意の試料を意味する。生物試料の例として、体液及び組織検体が挙げられる。試料ソースは、血液、血清、血漿、母乳、膿汁、脳脊髄液、スワブ、擦り取った組織、洗液、尿、糞便、体腔の洗浄によって得られたリンス液、痰、身体の各領域（咽頭、膣、耳、眼、皮膚、リンパ節その他等の痛みのある組織）から採取したスワブ等の生理的媒体に由来し得る。組織検体は、脾臓、リンパ節及び任意のリンパ球含有組織の生検を含む。
【０１７９】
本明細書及び特許請求の範囲における用語「試料」は、本明細書において広義で用いられている。
【０１８０】
一般に、スワブ及び先験的に液体ではない試料は液体媒体と接触され、次にこれが検出剤と接触させられる。
【０１８１】
本発明の特定の一実施形態において、本発明の方法において用いられる前記試料は、体液又は培養由来試料の内いずれか１種類である。
【０１８２】
培養由来試料は、細胞抽出物、培地試料又は体液由来の培養物、例えば血液試料培養物となることができる。
【０１８３】
「全血」とは、動物又はヒトから採取された血液を意味する。全血は、ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸又は凝血及び凝固を抑制するその他の物質を用いて採取してよい。
【０１８４】
生物試料は、ニトロセルロース等の固相支持体若しくは担体又は細胞、細胞粒子若しくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固体支持体若しくは担体で処理することができる。上述の通り、次に支持体又は担体は、適切なバッファーで洗浄され、続いて本発明に係る検出可能に標識された抗体で処理される。次に、固相支持体又は担体は、バッファーで２回目の洗浄を行い、非結合抗体を除去する。次に、結合した抗原又は前記固体支持体若しくは担体上の標識の量は、従来の手段によって検出することができる。
【０１８５】
「固相支持体」、「固相担体」、「固体支持体」、「固体担体」、「支持体」又は「担体」により、抗原又は抗体と結合できるあらゆる支持体又は担体が企図されている。良く知られた支持体又は担体として、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド並びにマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、ある程度可溶性であっても、或いは本発明の目的のため不溶性であってもよい。支持体材料は、そこに結合した分子が抗原又は抗体と結合できる限り、実質的にどの可能な構造形態であってもよい。したがって、支持体又は担体の形態は、ビーズ等の球状、試験管の内部表面等の円柱状又は棒状体の外表面であってよい。同一チューブ内の異なる抗原に対して、異なる担体が用いられ得る。或いは、表面はシート、試験紙等のように平坦であってもよい。特定の支持体又は担体は、ポリスチレンビーズを含む。当業者であれば、抗体又は抗原を結合するための他の多くの適切な担体を知っている、或いはルーチン実験の使用により同を確認できるであろう。
【０１８６】
洗浄、撹拌、振盪、濾過等、他の工程が、通例として、或いは特定の局面に必要なものとしてアッセイに加えられてよい。
【０１８７】
本明細書に定義されている「培養液」は、本発明を実施するための試料の維持に用いることのできる任意の培地を意味し、好ましくは適切な抗生物質及びグルタミン、並びに必要に応じて抗真菌剤、非必須アミノ酸、ＤＴＴ、ピルビン酸ナトリウム等の他の添加物を添加した、ウシ（ｃａｌｆ／ｂｏｖｉｎｅ）胎仔血清を含む或いは含まないＲＰＭＩ１６４０を含むが、これに限定されるものではない。本発明の実施に用いることのできる他の培養液は、イーグル、ダルベッコ、ＭｃＣｏｙ、Ｍｅｄｉａ１９９、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地及び添加物あり又はなしの無血清培地を含むが、これらに限定されるものではない。別の一実施形態において、培地に刺激物質は含まれていない。
【０１８８】
本発明は、必要とする対象に治療上効果的な投与量の本発明の抗体を投与する工程を含む、癌治療の方法も提供する。特に、前記抗体は、治療に用いる場合、細胞毒性薬物とコンジュゲートされる、或いは毒性物質を標的細胞へ送達するための担体として機能する。これに関連して、標的細胞は本発明の抗体によって認識される細胞であり、これは腫瘍関連抗原を発現する細胞を意味し、したがって異常増殖に関連する。
【０１８９】
さらにまた別の一態様において、本発明は、次の構成要素、
ａ．本発明の本明細書に記載されている少なくとも１種類の抗体又はそれを含む組成物と、
ｂ．前記抗体によって特異的に認識される抗原の、試料における存在の検出を行うための取扱説明書と、
を含む、癌の診断、治療有効性のモニタリング又は予後評価の内いずれか１つのためのキットを提供する。
【０１９０】
前記キットは、次の構成要素、
ａ．検査する試料を採取するための少なくとも１つの手段と、
ｂ．前記抗体による前記抗原の前記認識の検出に必要な少なくとも１種類の試薬と、
ｃ．少なくとも１種類の対照試料と、
の内少なくとも１つをさらに含むことができる。
【０１９１】
本発明は、癌の診断及び／又は予後評価のためのキットも提供する。
【０１９２】
キットは、基本的に対象における腫瘍抗原特異抗体を検出するためのものである。対象は、哺乳類、ヒト又は非ヒトであってよい。通常、対象はヒト患者、癌患者又は健常者である。
【０１９３】
別の一態様において、本発明は、次の構成要素、
ａ．本発明の本明細書に記載されている少なくとも１種類の抗体又はそれを含む組成物と、
ｂ．前記抗体によって特異的に認識される抗原の、試料における存在の検出を行うための取扱説明書と、
を含む、自己免疫疾患の診断、治療有効性のモニタリング及び予後の内少なくとも１つのためのキットも提供する。
【０１９４】
同様に、前記キットは、次の構成要素、
ａ．検査する試料を採取するための少なくとも１つの手段と、
ｂ．前記抗体による前記抗原の前記認識の検出に必要な少なくとも１種類の試薬と、
ｃ．少なくとも１種類の対照試料と、
の内少なくとも１つをさらに含むことができる。
【０１９５】
一実施形態において、このようなキットは、例えば、ＥＬＩＳＡキット等、適切であれば固体支持体、本発明に定義されている少なくとも１種類の抗体及び必要に応じて二次抗体を含む抗体（又は認識用薬剤）捕捉アッセイキットである。キットは、上述の通り、検出可能な成分、酵素基質及び発色試薬等、その他必要な試薬をさらに必要に応じて含むことができる。或いは、抗体捕捉診断キットは、本明細書に記載されている構成要素及び試薬を一般に含むイムノブロットキットである。本発明の診断キットに含まれている特定の試薬及び他の構成要素は、キットで実施される特異的診断方法に従った、本技術分野で利用できる試薬及び他の構成要素から選択することができる。このようなキットは、組織又は体液、特に全血、ＰＢＭＣ或いは対象から採取された培養前及び／又は後の白血球等、生物試料における抗体の検出に用いることができる。
【０１９６】
本発明の方法において「適切な手段」と記載されている場合、前記適切な手段は、とりわけ免疫親和性手順、酵素アッセイ又は構造的特色を検出するための手段となることができる。
【０１９７】
前記適切な手段が免疫親和性手順である場合、前記手順は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降法、ＦＡＣＳ又は本発明に記載されている抗体を利用するその他免疫親和性手順の内いずれか１種類である。
【０１９８】
特定の一実施形態において、検出は捕捉ＥＬＩＳＡによって達成される。
【０１９９】
捕捉ＥＬＩＳＡ（「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡとしても知られている）は、ピコグラムからマイクログラム量の物質（ホルモン、細胞シグナル伝達化学物質、感染症抗原及びサイトカイン等）を定量化するための高感度アッセイである。この種のＥＬＩＳＡは、解析される物質がポリスチレンマイクロタイタープレートと結合するには希釈され過ぎた（細胞培養上清中のタンパク質等）場合、或いはプラスチックと十分に結合しない（有機小分子等）場合に特によく用いられる。抗体、試料、対照及び検出用抗体の捕捉に最適な希釈並びにインキュベーション時間は経験的に決定され、広範な用量設定を必要とし得る。理想的には、酵素標識された検出用抗体が用いられる。しかし、検出用抗体が非標識である場合、二次抗体は、コーティング用抗体又は試料のいずれかと交差反応してはならない。適切な陰性及び陽性対照も含まれるべきである。
【０２００】
用いられる捕捉又はコーティング用抗体は、炭酸−重炭酸バッファー又はＰＢＳで希釈するべきである。捕捉用抗体は通常、０．２〜１０μｇ／ｍｌで蒔かれる。アフィニティー精製された抗体を用いる、或いはＩｇＧ画分を最小限用いることが好ましい。一般に、試料は、１０ｎｇ〜１０μｇ／ウエル範囲（アッセイの感度が高くなる程、より少量の試料が必要とされる）になるようＰＢＳで希釈される。
【０２０１】
本明細書において、用語「検出可能な成分」は、任意の原子、分子又はそれらの一部を意味し、その存在、不在又はレベルは、直接又は間接的にモニターすることができる。一例として、放射性同位元素が挙げられる。他の例として、（ｉ）変色又は光放射（発光）反応を触媒できる酵素及び（ｉｉ）フルオロフォアが挙げられる。例えば、フルオロフォアの場合等、検出可能な成分それ自体が検出可能であれば、検出可能な成分の検出は直接的となることができる。或いは、検出可能な成分の検出は間接的であってもよい。後者の場合、それ自身が直接的に検出可能である、検出可能な成分と反応する第二の成分が好ましくは用いられる。検出可能な成分は、抗体固有のものとなることができる。例えば、抗体定常部は、直接的に検出可能な成分を備える二次抗体が特異的に結合することのできる、間接的に検出可能な成分として機能することができる。
【０２０２】
このように、二次抗体は、本発明の方法における抗体の検出に特に適した手段である。この二次抗体は、それ自体が検出可能な成分とコンジュゲートすることができる。本発明に係る抗体が検出可能に標識され得る一方法は、同を酵素と結合することによるものである。同様に、この酵素は、その後適切な基質に曝露されるのであれば、例えば、分光光度的、蛍光定量的又は視覚的手段により検出され得る化学的成分を生成するような仕方で基質と反応するであろう。抗体の検出可能な標識に用いることのできる酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２０３】
検出は、酵素に対する発色性基質を用いる比色法によって達成することができる。検出は、同様に調製した標準と比較した、基質の酵素反応の程度の視覚的比較によって達成することもできる。
【０２０４】
第一の抗体が結合する固体支持体は、任意の水に不溶性で水に懸濁不能の固体支持体となることができる。適切な固体支持体の例として、例えばポリスチレン製の大型のビーズ、濾紙、試験管及びマイクロタイタープレートが挙げられる。第一の抗体は、共有結合又は吸着によって固体支持体と結合することができる。固体支持体を用いることの利点は、固相と液相の分離のための遠心分離工程の必要がないことである。
【０２０５】
上述の固体支持体は、ポリスチレン、アガロース、セファロース、セルロース、ガラスビーズ及び磁化可能なセルロース粒子その他のポリマー等、ポリマーを含むこともできる。固体支持体は、大型又は小型のビーズ又は粒子、チューブ、プレートその他の形状となることができる。
【０２０６】
固体支持体として、好ましくはその内壁が第一の抗体、例えば本発明のために本発明者らによって調製された特異的な抗体又はその任意の断片若しくは誘導体でコーティングされたマイクロタイタープレートの試験管からなるものが用いられる。
【０２０７】
本発明の方法において用いられている「決定」の言及は、評価、定量化、計算又は特定の試料中に存在するバイオマーカー量に由来するその他を含む。これは、例えば、検出可能な産物の出現、例えば基質レベルの任意の検出可能な変化、又は産物出現若しくは基質消失率の任意の変化となることのできる終点指示を測定することにより、或いは本発明に記載のバイオマーカーと結合した抗体量を測定することにより達成することができる。
【０２０８】
前記検査キットの全てにおいて、検査される試料を採取するための前記手段は、スワブ、ピペット又は類似の採取手段となることができ、前記インキュベーション手段は、プレート、試験管、ガラス若しくはプラスチック表面、ウエル又は吸取り紙片上に置かれた液体又は半流動性培養液、或いは同様の手段となることができる。
【０２０９】
いかなる型式のキットも、検査が走査装置上で行われ、結果がコンピュータにリアルタイムで送り込まれるようにも設計されていることを理解するべきである。これは、全情報が関係者全員に直接メールされ、後に参照できるよう無編集で保存されることを確実にするであろう。
【０２１０】
キットの別の一実施形態において、前記試料は、体液及び培養由来試料のいずれか１種類である。
【０２１１】
本発明の抗体と接触させられる試料は、アレイに配置することができる。
【０２１２】
本発明の方法及びキットに用いられている用語「アレイ」は、認識用薬剤、即ち本発明の抗体の内少なくとも１つの「アドレス指定された」空間配置を意味する。アレイの各「アドレス」は、認識用薬剤を含有する所定の特定の空間領域である。例えば、アレイは、そのそれぞれが異なる抗体を含有する複数の容器（試験管）、プレート、マイクロプレートのマイクロウエルとなることができる。アレイは、別個の領域（点、線、カラム）において異なる且つ公知の認識用薬剤、例えば抗体を保持する任意の固体支持体となることもできる。アレイは、好ましくは、作り付けの適切な対照、例えば試料なし領域、抗体なし領域、どちらもない領域、即ち溶媒及び試薬のみ領域並びに抗体によって認識される合成又は単離されたタンパク質又はペプチド（陽性対照）を含む領域を含む。本発明のアレイに用いられる固体支持体は、本発明によって提供されるキットに関連して、本明細書において後により詳細に説明される。
【０２１３】
本発明のキットにおける使用に適した固体支持体は、一般に、実質的に液相に不溶性である。本発明の固体支持体は、特定の種類の支持体に限定されない。むしろ、多数の支持体が利用でき、当業者に知られている。よって、有用な固体支持体は、エーロゲル及びハイドロゲル等の固体及び半流動性マトリックス、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜コーティングされたバイオチップ等）、マイクロ流体チップ、シリコンチップ、マルチウエルプレート（マイクロタイタープレート又はマイクロプレートとも言う）、メンブレン、フィルター、導電性及び非導電性金属、ガラス（顕微鏡用スライド等）並びに磁性支持体を含む。有用な固体支持体のさらなる具体例として、シリカゲル、ポリマーメンブレン、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、セファロース等の多糖類、ナイロン、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプン等が挙げられる。
【０２１４】
本発明の方法及びキットのいずれかに含まれている試薬のいずれかが、上述の固体支持体材料のいずれかに包埋、連結、接続、結合、配置又は融合された試薬として提供され得ることに、さらに留意するべきである。
【０２１５】
本発明の方法及びキットによって用いられる任意の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、例えば本発明の抗体に由来するキメラ若しくは単鎖抗体（ＳｃＦｖ）であってよいことに留意するべきである。
【０２１６】
本発明は、その内容が本明細書の開示内に含まれているものとして読解される、特許請求の範囲によって規定される。
【０２１７】
開示され、記載されている通り、本発明は、本明細書において開示されている特定の実施例、工程段階及び材料に限定されないことを理解するべきであり、これはこのような工程段階及び材料はある程度変化する可能性があるためである。本明細書における用語使用は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されるため、これは限定を企図しないことも理解するべきである。
【０２１８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、その内容が明らかにそれ以外を示さない限り、単数形は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【０２１９】
本明細書及び続く特許請求の範囲を通じて、文脈がそれ以外を必要としない限り、語句「含む」並びに「含んだ」及び「含んでいる」等の変化形は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程群の包含を暗示するが、その他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程群の除外を暗示しないことが理解される。
【０２２０】
次の実施例は、本発明者らによって本発明の態様の実施に用いられる技法の代表例である。これらの技法は本発明の実施のための好ましい実施形態の例示であるが、当業者であれば、本開示を考慮し、企図された本発明の範囲から逸脱することなく多くの修正を行ってよいことを認識すると理解するべきである。
【０２２１】
他に規定されていない限り、本明細書に用いられているあらゆる技術及び科学用語は、本発明に関与する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
【実施例】
【０２２２】
方法
例えばＥＬＩＳＡ等の多くの免疫学的技法は当業者によく知られており、例えばＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに詳細に記載されているため、本明細書における各事例において詳細には記載されない。
【０２２３】
一般的な分子生物学的方法
多くの分子生物学的技術の方法は当業者によく知られているため、本明細書において詳述されない。このような方法は、ＰＣＲ、ｃＤＮＡの発現、ヒト細胞のトランスフェクション等を含む。このような方法について説明する教科書は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ：０８７９６９３０９６；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８８年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．である。さらに、例えばウエスタンブロット等、多くの免疫学的技法は当業者によく知られているため、本明細書における各事例において詳細には記載されない。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。
【０２２４】
ＥＬＩＳＡ一般プロトコル
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、容易にアッセイされる酵素と結合した抗体又は抗原を用いることによって、抗体の特異性と簡便な酵素アッセイの感度とを組み合わせる。ＥＬＩＳＡは、抗原又は抗体濃度の有用な測定値を提供することができる。ＥＬＩＳＡは、５段階からなる手順である。１）マイクロタイタープレートウエルをＰＢＳで希釈した抗原でコーティングし、一晩４℃でインキュベートし、洗浄する。２）非結合部位をＰＢＳに溶解したＢＳＡ／ＦＣＳでブロッキングして偽陽性結果を抑制し、１時間インキュベートし、洗浄する。３）抗体をウエルに添加し、１時間インキュベートし、洗浄する。４）酵素とコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧを添加し、１時間インキュベートし、洗浄する。５）基質と酵素との反応が、発色産物を生成し、最終的に陽性反応を示す。
【０２２５】
ＦＡＣＳプロトコル
１．細胞を収集、洗浄し、氷冷ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、１％アジ化ナトリウム中に１〜５×１０６細胞／ｍｌ濃度になるよう懸濁液において調整した。
２．０．１〜１０μｇ／ｍｌの標識一次抗体を添加した。必要であれば、抗体を３％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈した。
３．細胞＋抗体を少なくとも３０分間室温又は４℃でインキュベートした。
４．４００ｇで５分間遠心分離し、５００μｌ〜１ｍｌの氷冷ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、１％アジ化ナトリウムに再懸濁することにより、細胞を３回洗浄した。
５．これにより、細胞はフローサイトメーターによる解析の準備が整った。
【０２２６】
ＫＴＰＡＦ５０検出のためのＥＬＩＳＡ手順
１．検量線：ＰＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０２−０２３−５Ａ）中に２０００ｐｇ／ｍｌ〜３１ｐｇ／ｍｌとなるようＰＲＴ３の段階希釈液を調製した。
２．３７℃の水槽において試料を急速に解凍した。
３．７０μｌの２回複製した各血液試料（希釈されず）及び７０μｌの３回複製した標準試料をＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウエルプレート（ＮＵＮＣ、Ｆ９６Ｍａｘｉｓｏｒｐ、カタログ番号４４２４０４）にロードし、４℃で一晩振盪しつつインキュベートした。
４．洗浄：３００μｌの０．０５％ＴＷ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号０７７７−１Ｌ）／ＰＢＳでプレートを４回洗浄した。
５．ブロッキング：３００μｌのブロッキングバッファー、５％ＢＳＡ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号１６００６９）／ＰＢＳを各ウエルにロードし、室温で１時間、振盪しつつインキュベートした。
６．洗浄：工程＃４に同じ。
７．検出：ＫＴＰＡＦ５０特異抗体（アフィニティー精製した）を希釈液（ＰＢＳ中に０．０５％ＴＷ−２０、０．１％ＢＳＡを溶解）で１：２５０に希釈した。１００μｌの検出用抗体を各ウエルにロードし、室温で２時間、振盪しつつインキュベートした。
８．洗浄：上の工程＃４に同じ。
９．ＨＲＰコンジュゲート：ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７０７４）を希釈液で１：２００に希釈した。１００μｌのＨＲＰコンジュゲートを各ウエルにロードし、３０分間、室温で振盪しつつインキュベートした。
１０．洗浄：４回ではなく５回洗浄する以外は上の工程＃４に同じ。
１１．発色：１００μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ基質、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＥＳ００１−５００ＭＬ）を各ウエルに添加した。青色を呈色したら、５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、カタログ番号５５５２５４０）を添加した。
１２．プレート読取り：マイクロプレートリーダーにおいて、４５０ｎｍの吸光度を検査した。
【０２２７】
ポリクローナル抗体の調製
ポリクローナル抗体調製のための標準的なプロトコルを用いて、ポリクローナル抗体をウサギにおいて産生した。
【０２２８】
ＫＴＰＡＦ５０特異的ポリクローナル抗体の調製に用いた抗原は、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質Ｃ末端における最後の１４アミノ酸（ＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫ）に対応するペプチドであり、これは配列番号３で表される配列に相当する。
【０２２９】
図１は、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体のその抗原に対する特異性の曲線を示す。
【０２３０】
ＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体の調製及びキャリブレーション
当業者に知られた抗体の標準的なプロトコルに従ってＧｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（米国テキサス州サン・アントニオ）により、ＫＴＰＡＦ５０に対するモノクローナル抗体をオーダーメイドした。次の通り、抗体親和性のキャリブレーションをＥＬＩＳＡにより行った。
１．ＫＴＰＡＦ５０ペプチドを１０００、５００、１００及び０ｎｇ／ｍｌになるようＰＢＳに希釈し、検量線を作製した。２枚のＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）ＥＬＩＳＡ Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ＃４４２４０４）においてこれらの濃度の液を２回複製して３０回分ロードした。プレートを一晩４℃で穏やかに振盪しつつインキュベートした。
２．インキュベーション後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（３００μｌ／ウエル）を用いてプレートを４回洗浄した。
３．３００μｌ／ウエルの１％ＢＳＡ／ＰＢＳをロードし、その後４℃で穏やかに振盪しつつ一晩インキュベーションすることによってウエルをブロッキングした。
４．インキュベーション後、工程２に記載の通りプレートを洗浄した。各ＫＴＰＡＦ５０希釈曲線において、各１００μｌの３０種のモノクローナルＫＴＰＡＦ５０抗体を２回複製してロードした。対照として、ポリクローナルＫＴＰＡＦ５０抗体（１：２５０希釈された）も各プレートにロードし、プレートを１時間３７℃でインキュベートした。
５．インキュベーション後、工程２に記載の通りプレートを洗浄した。０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳに１：２００希釈した５０μｌのペルオキシダーゼ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１１５−０３５−２０６）を各ウエルにロードした。プレートを１時間３７℃でインキュベートした。
６．インキュベーション後、工程２に記載の通りプレートを洗浄した。１００μｌのＴＭＢ／Ｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＥＳ００１−５００ＭＬ）を各ウエルにロードし、１５分間３７℃でインキュベートした。
７．５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を各ウエルにロードした。
８．マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでプレートの読取りを行った。
【０２３１】
ＴＤＳプロトコル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）による）
１．１００μｌ／ウエルの捕捉用抗体／コーティングバッファー（試薬セットに同封されている分析証明書に記されている通り希釈）でＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ９０１８ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。プレートを密封し、一晩４℃でインキュベートした。
２．ウエルを吸引し、＞２５０μｌ／ウエルの洗浄バッファーで５回洗浄した。各洗浄工程の際に浸漬時間（約１分間）を設け、洗浄効果を高めた。吸取り紙で残渣バッファーをプレートから除去した。
３．１倍量の５×濃縮アッセイ希釈液を４倍量のＤＩ水で希釈した。ウエルを２００μｌ／ウエルの１×アッセイ希釈液でブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。
４．洗浄を５回繰り返した。
５．検量線のため、１００μｌ／ウエルの希釈標準を適切なウエルに添加し、最高濃度の標準から段階２倍希釈液を調製して検量線を作製した。１００μｌ／ウエルの試料を適切なウエルに添加した。プレートを被覆又は密封し、室温で２時間（或いは感度を最大にするため一晩４℃）インキュベートした。
６．洗浄を５回繰り返した。
７．１×アッセイ希釈液＊に希釈した検出用抗体を１００μｌ／ウエル添加した。プレートを密封し、室温で１時間インキュベートした。
８．洗浄を５回繰り返した。
９．１×アッセイ希釈液に希釈されたアビジン−ＨＲＰ＊を１００μｌ／ウエル添加した。プレートを密封し、室温で３０分間インキュベートした。
１０．最後の洗浄において、吸引前にウエルを洗浄バッファーに１〜２分間浸漬し、この洗浄を合計７回繰り返した。
１１．５０μｌの停止液１００μｌ／ウエルの基質溶液を各ウエルに添加した。プレートを室温で１５分間インキュベートし、反応を５０μｌの停止液で停止させた。
１２．プレートを４５０ｎｍで読み取った。波長の差し引きが可能であれば、４５０ｎｍの値から５７０ｎｍの値を差し引いてデータ解析を行う。
【０２３２】
Ｐｏｉｅｔｉｃｓ（登録商標）細胞の解凍手順
ＤＮａｓｅ Ｉは、培養細胞及び単核細胞の凝集を抑制するよう機能するため、培地に添加した。
１．凍結細胞のバイアルを３７℃ウォーターバスにおいて急速に解凍した。
２．最大２ｍｌの細胞懸濁液を５０ｍｌのコニカルチューブに無菌的に移した。
３．バイアルを１０％ＦＢＳ又は１％ＢＳＡ及び２０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉを含む１ｍｌの予め温めた培地でリンスした。
４．数滴の培地をそれぞれに添加した後穏やかに旋回させつつ、合計容量は５ｍｌとなった（＝３分間）。
５．培地をそれぞれに添加した後穏やかに旋回させつつ、１ｍｌ〜２ｍｌ容量の培地を滴下することによって増量を完了した（＝５〜１０分間）。
６．細胞懸濁液を２００×ｇにて室温で１５分間遠心分離した。
７．細胞ペレットを残りの培地に穏やかに再懸濁した。
８．洗浄培地により容量を徐々に増し、培地をそれぞれに添加した後に穏やかに旋回しつつ、１ｍｌ〜２ｍｌ容量の培地を添加することによりチューブを充填した。
９．細胞懸濁液を２００×ｇにて室温で１５分間遠心分離した。
１０．２ｍｌの洗浄液を慎重に取り除き、細胞ペレットを残りの２ｍｌの培地で穏やかに再懸濁した。細胞を計数した。細胞数が予想より少ない場合、必要であれば工程７で取り分けておいた上清でさらに洗浄を行って細胞を合わせてよい。
１１．細胞を１時間３７℃及び５％ＣＯ２にて静置し、２度目の計数を行い、次に培養に付した。
＊ＤＮａｓｅ添加のため、１０％ＦＢＳ及び２０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ Ｄ４５１３）を含む２０ｍｌの培地を調製するとよい。ＤＮａｓｅ含有培地を細胞の希釈に用いた。
【０２３３】
動物
Ｈａｒｌａｎ ＩｓｒａｅｌからＢａｌｂ／Ｃマウスを購入した。
【表３】
【０２３４】
（例１）
ヒト血液試料におけるＫＴＰＡＦ５０の検出
Ａｓｔｅｒａｎｄ（登録商標）から年齢５０〜６５歳の男女に由来する１９種のヒト血液血清試料を得た。９試料は肺癌患者で１０試料は健常者である。使用まで−８０℃より低温で全試料を維持した。
【０２３５】
ポリクローナル抗ＫＴＰＡＦ５０抗体を用いて、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質の存在に関して血液試料を検査した。図２から理解できるように、ＫＴＰＡＦ５０の発現は、肺癌試料において有意に高かった。
【０２３６】
したがって、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体は、肺癌検出のための診断ツールとして用いることができる。
【０２３７】
（例２）
抗ＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体の作製
ＫＴＰＡＦ５０ペプチド（抗原１、２又は３、下表参照）又は全長ＫＴＰＡＦ５０タンパク質を抗原として用いてＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体を作製した。抗原を下の表１に記す。抗原２は、ポリクローナル抗体の調製と基本的に同様に用いられるが、そのＮ末端にプロリン、そのＣ末端にシステインを有する。抗体は、Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（米国テキサス州サン・アントニオ）に委託した。
【表４】
【０２３８】
Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（米国テキサス州サン・アントニオ）により３０種の異なるモノクローナル抗体が生産され、それらのＫＴＰＡＦ５０に対する親和性を検証した。
【０２３９】
表２は、各ハイブリドーマの抗原特異性をまとめる。
【表５】
【０２４０】
各モノクローナル抗体に対する親和性検量線の結果を表３にまとめる。
【表６−１】
【表６−２】
【０２４１】
（例３）
雌Ｂａｌｂ／Ｃ脾細胞の生存率におけるモノクローナルＫＴＰＡＦ５０抗体の効果
３０種のＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体を、脾細胞生存率におけるその効果に関して検査した。レサズリンアッセイを用いて生存率を検査した。
【０２４２】
手順：
１．１匹の雌Ｂａｌｂ／Ｃ（２０週齢）の脾臓を収集し、１×ＲＢＣ溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃００−４３３３）を用いて赤血球を溶解した。
２．細胞を２枚のＦ９６ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ＃１６７００８）に分配した。各プレートにおいて、２００μｌの核型分析培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ０１−２０１−１Ｂ）中に懸濁した５０，０００細胞を５×５ウエルにロードした。細胞を２４時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
３．インキュベーション後、各ウエルに次の処理を５回複製して行った。
ａ．対照（抗ｐ５３抗体［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＣＳ−６５３３４］−１０μｌ）
ｂ．１００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｃ．１０００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｄ．１５μｌのα−ＫＴＰＡＦ５０ １（ハイブリドーマ３Ｅ３Ｇ７）
ｅ．１５μｌのα−ＫＴＰＡＦ５０ ２（ハイブリドーマ５Ｅ１１Ｈ３）
４．３７℃、５％ＣＯ２にて第一のプレートを２４時間インキュベートし、第二のプレートを４８時間インキュベートした。
【０２４３】
インキュベーション時間の後、２０μｌのレサズリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＡＲ００２）を各ウエルに添加し、プレートリーダーを用いて４及び２４時間目にウエルの蛍光（５３０／５９０ｎｍ）を検査した。
【０２４４】
結果を図３Ａ〜３Ｃに示す。基本的に、処理及びレサズリンによる４時間インキュベーションの２４時間後、細胞生存率は３Ｅ３Ｇ７及び５Ｅ１１Ｈ３で処理した培養においてそれぞれ５４％及び５８％に低下した（図６Ａ）。細胞生存率低下は、レサズリンによる２４時間インキュベーション後により一層顕著であり、３Ｅ３Ｇ７及び５Ｅ１１Ｈ３で処理した培養においてそれぞれ２９％及び３５％であった（図６Ｂ）。
【０２４５】
ＫＴＰＡＦ５０特異抗体による４８時間処理は、細胞生存率を２４時間処理と同様の程度まで低下させた（図６Ｃ）。
【０２４６】
結果は、ＫＴＰＡＦ５０に対するモノクローナル抗体がＢａｌｂ／Ｃ脾細胞の生存率を大幅に低下できることを明らかに示し、これはＫＴＰＡＦ５０がマウス脾細胞の生存率維持に中心的役割を果たすことを示唆する。特異的モノクローナル抗体によるＫＴＰＡＦ５０活性の中和は、マウスにおいて誘導された自己免疫疾患を治療するための非常に強力なツールとして機能する。同様に、ＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体は、ヒト治験において用いられるであろう。
【０２４７】
（例４）
Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞の生存率におけるモノクローナルＫＴＰＡＦ５０抗体の効果
３０種のＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体を、脾細胞生存率におけるその効果に関して検査した。レサズリンアッセイを用いて生存率を検査した。
【０２４８】
手順：
１．１匹の雌及び１匹の雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ（８週齢）の脾臓を収集し、１×ＲＢＣ溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃００−４３３３）を用いて赤血球を溶解した。
２．細胞を２枚のＦ９６ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ＃１６７００８）に分配した。各プレートにおいて、２００μｌの核型分析培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−２０１−１Ｂ）中に懸濁した５０，０００細胞を５×５ウエルにロードした。細胞を２４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
３．インキュベーション後、各ウエルに次の処理を５回複製して行った。
ａ．対照（抗ｐ５３抗体［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＣＳ−６５３３４］−１０μｌ）
ｂ．１５μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ １（抗体５Ｅ１１Ｈ３）
ｃ．１５μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ ２（抗体３Ｅ３Ｇ７）
ｄ．１００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｅ．５００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
４．３７℃、５％ＣＯ２にて第一のプレートを２４時間インキュベートし、第二のプレートを４８時間インキュベートし、第三のプレートを７２時間インキュベートした。
５．インキュベーション時間の後、２０μｌのレサズリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＡＲ００２）を各ウエルに添加し、４及び２４時間目にプレートリーダーを用いて蛍光（５３０／５９０ｎｍ）を測定した。
【０２４９】
結果を図７Ａ〜７Ｆに示す。基本的に、処理及びレサズリンによる２４時間インキュベーションの２４時間後、雄由来の細胞における細胞生存率は、５Ｅ１１Ｈ３及び３Ｅ３Ｇ７で処理した培養において３６％に低下し（図４Ａ）、雌由来の細胞における細胞生存率は５Ｅ１１Ｈ３及び３Ｅ３Ｇ７で処理した培養においてそれぞれ５２％及び５８％に低下した（図４Ｂ）。ＫＴＰＡＦ５０特異抗体による４８時間処理は、雄と雌両方の細胞の細胞生存率を雌における２４時間処理と同様の程度まで低下させた（図４Ｃ及び４Ｄ）。
【０２５０】
抗体による処理を延長（７２時間処理）しても、さらなる細胞生存率低下は示されなかった（図４Ｅ及び４Ｆ）。
【０２５１】
結果は、ＫＴＰＡＦ５０に対するモノクローナル抗体がＣ５７Ｂｌ／６脾細胞の生存率を大幅に低下できることを明らかに示し、これはＫＴＰＡＦ５０がマウス脾細胞の生存率維持に中心的役割を果たすことを示唆する。特異的モノクローナル抗体によるＫＴＰＡＦ５０活性の中和は、マウスにおいて誘導された自己免疫疾患を治療するための非常に強力なツールとして機能する。同様に、ＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体は、ヒト治験において用いられるであろう。
【０２５２】
（例５）
ＫＴＰＡＦ５０抗体による処理に加えて、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて上清中のＫＴＰＡＦ５０の存在に関して細胞を評価した。
【０２５３】
手順：
１．セクションＡ（手順の工程４）から得られた２４時間対照試料をＭａｘｉｓｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ＃４４２４０４）上にロードした。各ウエルにつき１００μｌを３回複製した。ゼロ基準として、核型分析培地も３回複製してロードした。定量化のため、ＰＲＴ３の段階希釈液もロードした（２０００〜６３ｐｇ／ｍｌ）。プレートを４℃で一晩インキュベートした。
２．インキュベーションの後、マルチピペットを用いてプレートを３００μｌの０．０５％ＴＷ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ ＃０７７７−１Ｌ）／ＰＢＳで４回洗浄した。
３．５％ＢＳＡ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ＃１６００６９）／ＰＢＳを用いてプレートをブロッキングした。３００μｌを各ウエルにロードした。Ｒ．Ｔ．で１時間、振盪しつつインキュベーションした。
４．工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
５．ＰＲＴ３ポリクローナル抗体（アフィニティー精製された）を希釈液（０．０５％ＴＷ−２０、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で１：２５０希釈した。１００μｌの抗体を各ウエルにロードした。プレートをＲ．Ｔ．で２時間、振盪しつつインキュベートした。
６．工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
７．ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、７０７４）を希釈液で１：２００希釈した。１００μｌのＨＲＰコンジュゲートを各ウエルにロードした。プレートを３０分間、Ｒ．Ｔで振盪しつつインキュベートした。
８．４回ではなく５回洗浄する以外は工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
９．１００μｌのＴＭＢ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）、ＥＳ００１−５００ＭＬ）を各ウエルにロードし、発色後に５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、５５５２５４０）をロードして反応を停止させた。
１０．マイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０２５４】
結果を図５に示すが、これは上清中のｍＫＴＰＡＦ５０の存在を確認する。
【０２５５】
（例６）
ヒト単球におけるモノクローナルＫＴＰＡＦ５０抗体の効果
ヒト単球におけるＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を、細胞生存率、サイトカイン発現、上清中のＫＴＰＡＦ５０タンパク質の存在及び細胞形態に関して解析した。
【０２５６】
Ａ．レサズリンアッセイを用いて細胞生存率を検査した
手順：
１．ヒト末梢血単核細胞（ＨＰＢＭＣ）（Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ−２７０２）を公式プロトコル（別添Ｂを参照）に従って解凍し、末梢血核型分析培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ＃０１−２０１−１Ｂ）において培養した。
２．細胞を２枚のＦ９６ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ＃１６７００８）に分配した。各プレートにおいて、２００μｌの核型分析培地中に懸濁した５０，０００細胞を４×５ウエルにロードした。細胞を２４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
３．インキュベーション後、次の処理を各ウエルに４回複製して行った。
ａ．対照（抗ｐ５３抗体［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＣＳ−６５３３４］−１０μｌ）
ｂ．１０μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ １（５Ｅ１１Ｈ３）
ｃ．２５μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ １（５Ｅ１１Ｈ３）
ｄ．１０μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ ２（，３Ｅ３Ｇ７）
ｅ．２５μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ ２（３Ｅ３Ｇ７）
４．３７℃、５％ＣＯ２にて第一のプレートを２４時間インキュベートし、第二のプレートを４８時間インキュベートした。
【０２５７】
インキュベーション時間の後、２０μｌのレサズリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＡＲ００２）を各ウエルに添加し、プレートリーダーを用いて２、４及び２４時間目（２４時間インキュベーションの後に）又は２及び４時間目（４８時間インキュベーションの後に）に蛍光（５３０／５９０ｎｍ）を測定した。結果をそれぞれ図６Ａ〜６Ｃ及び７Ａ〜７Ｂに示す。
【０２５８】
Ｂ．ＥＬＩＳＡアッセイを用いた、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による処理後の培地（上清）中のサイトカイン発現の変化の解析
手順：
１．ヒト末梢血単核細胞（ＨＰＢＭＣ）（Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ−２７０２）を解凍プロトコル（上述を参照）に従って解凍し、末梢血核型分析培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−２０１−１Ｂ）において培養した。
２．細胞を４枚の６ウエルマルチディッシュプレート（Ｎｕｎｃ＃１４０６７５）に分配した。各ウエルにつき、１Ｍの細胞を２ｍＬ核型分析培地にロードした。細胞を２４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
３．インキュベーション後、次の処理を各ウエルに行った。
ａ． 対照
ｂ． １００μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ １（５Ｅ１１Ｈ３）
ｃ． １０μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ ２（３Ｅ３Ｇ７）
ｄ． １００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｅ． ５００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｆ． １０００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
４．プレートを２４、４８、１２０及び１４４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
５．インキュベーション後、プレートを氷上に置き、試料を採取し、３００Ｇで１０分間遠心分離した。培地（上清）をＥＬＩＳＡアッセイ用に取り分けた。
６．ＥＬＩＳＡアッセイのため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ＃４４２４０４）上に試料をロードした。メーカーの取扱説明書（ＴＤＳプロトコル、上述を参照）に従い、次のＥＬＩＳＡキットを各サイトカインの検査に用いた。
ａ．ヒトＴＮＦ−アルファ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）＃８８−７３４６）。１：１０希釈試料。
ｂ．ヒトＩＦＮ−ガンマ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）＃８８−７３１６）。１：１０希釈試料。
ｃ．ヒトＩＬ−１０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）＃８８−７１０６）。１：６希釈試料。
ｄ．ＰＲＴ−３。希釈していない試料。
【０２５９】
ＴＮＦ−α発現は、抗ＫＴＰＡＦ５０処理の２４又は４８時間処理では変化しなかったが（図８Ｂ〜８Ｃ）、１２０時間処理では有意に低下し（図８Ｄ）、１４４時間処理では抗体５Ｅ１１Ｈ３により低下が起きた（図８Ｅ）。
【０２６０】
ＩＦＮ−γ発現は抗ＫＴＰＡＦ５０処理後に低下し、この低下は時間と共に増幅した（図９Ｂ〜９Ｅ）。
【０２６１】
抗ＫＴＰＡＦ５０処理によりＩＬ−１０発現が抑制された（図１０Ａ〜１０Ｄ）。
【０２６２】
これらの結果は、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体がＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ等、ヒト末梢白血球から分泌されるヒト炎症性サイトカインを下方制御できることを強力に証明する。したがって、本明細書において提供されるモノクローナル抗体は、ヒト自己免疫疾患、移植片拒絶及び同様の他の状態を治療するための潜在的な薬物候補である。
【０２６３】
Ｃ．ＥＬＩＳＡアッセイを用いた、培地中に存在するＫＴＰＡＦ５０の解析
手順
１．セクションＢ（手順の工程６）の２種の対照試料をＭａｘｉｓｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ＃４４２４０４）上にロードした。各ウエルにつき１００μｌを３回複製した。ゼロ基準として、核型分析培地も３回複製してロードした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。
２．インキュベーション後、マルチピペットを用いて３００μｌの０．０５％ＴＷ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ＃０７７７−１Ｌ）／ＰＢＳでプレートを４回洗浄した。
３．５％ＢＳＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ＃１６００６９）／ＰＢＳを用いてプレートをブロッキングした。３００μｌを各ウエルにロードした。Ｒ．Ｔ．にて１時間、振盪しつつインキュベーションした。
４．工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
５．ＫＴＰＡＦ５０ポリクローナル抗体（アフィニティー精製した）を希釈液（０．０５％ＴＷ−２０、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で１：２５０希釈した。１００μｌの抗体を各ウエルにロードした。プレートを室温で２時間、振盪しつつインキュベートした。
６．工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
７．ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃７０７４）を希釈液で１：２００希釈した。１００μｌのＨＲＰコンジュゲートを各ウエルにロードした。プレートを３０分間、室温で振盪しつつインキュベートした。
８．４回ではなく５回洗浄する以外は工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
９．１００μｌのＴＭＢ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ＃ＥＳ００１−５００ＭＬ）を各ウエルにロードした。発色後、５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ｆｒｕｔａｒｏｍ＃５５５２５４０）をロードして反応を停止させた。
１０．マイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０２６４】
結果を図１１に示すが、これは上清におけるＫＴＡＰＡＦ５０の存在を確認する。
【０２６５】
Ｄ．抗ＫＴＰＡＦ５０処理後のヒト単球細胞における形態変化、光学顕微鏡による解析
手順：
１．ヒト末梢血単核細胞（ＨＰＢＭＣ）（Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ−２７０２）を解凍プロトコル（上述を参照）に従って解凍し、末梢血核型分析培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ０１−２０１−１Ｂ）において培養した。
２．細胞を４枚の６ウエルマルチディッシュプレート（Ｎｕｎｃ＃１４０６７５）に分配した。各ウエルにおいて、１Ｍの細胞を２ｍＬ核型分析培地にロードした。細胞を２４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
３．インキュベーション後、次の処理を各ウエルに行った。
ａ．対照
ｂ．１００μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ １（５Ｅ１１Ｈ３）
ｃ．１０μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ ２（３Ｅ３Ｇ７）
ｄ．１００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｅ．５００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｆ．１０００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
４．プレートを１２０時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートし、光学顕微鏡（倍率×１００）及びＣＣＤカメラを用いて可視化した（図１５Ａ〜１５Ｆ）。
【０２６６】
ＰＨＡで処理したヒト末梢血細胞は、増殖して大きな細胞凝集塊を生じる。本結果は、ＰＨＡ処理に続いて抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体処理が行われる場合、これらの細胞の完全な増殖抑制が観察されたことを疑いの余地なく示す。このことは、本明細書に提供される抗体を、増殖制御のための強力なツールとし、癌、炎症過程に関与する疾患等の望ましくない細胞増殖に関与する任意の状態の治療法とする。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規抗体並びに治療及び診断方法におけるその使用に関し、特に、自己免疫障害及び癌に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願を通じて言及されているあらゆる刊行物は、そこに引用されているあらゆる参考文献を含み、参照として本明細書に完全に組み込まれる。
【０００３】
組織特異的タンパク質及びその発現レベルは、生物の健康状態の優れた指標及び疾患の場合は治療の標的候補となり得る。
【０００４】
ヒトが罹患する疾患は、その原因の機序に従って分類することができる。例えば、免疫学的な成分又は病因を有する疾患として、感染症、急性及び慢性炎症性疾患、癌、移植並びに自己免疫疾患が挙げられる。
【０００５】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）という用語は、恐らく身体のそれ自身の腸組織に対する免疫反応の結果腸が炎症を起こし（発赤及び肥大化）、したがって自己免疫障害であると考えられる障害群を包含する。
【０００６】
ＩＢＤの主要な２つの型、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）及びクローン病（ＣＤ）が説明されてきた。その病名が示唆するように、潰瘍性大腸炎は結腸（大腸）に限定される。クローン病は口から肛門に及ぶ消化管のいずれの部分にも関与し得るが、これは小腸及び／又は結腸において最も多く発症する。
【０００７】
重度の炎症がある場合、疾患は活性期にあると考えられ、患者の状態は再燃を起こす。炎症の程度がより低い（又はない）場合、患者は通常無症状であり、疾患は寛解期にあると考えられる。
【０００８】
炎症性腸疾患の原因は完全には明らかになっていない。未知の因子／病原体（又は因子の組合せ）が、無制御に続く炎症反応を腸管において生じるよう身体の免疫系を誘発する。炎症反応の結果腸壁が傷害され、血性下痢及び腹痛をもたらす。
【０００９】
遺伝的、感染性、免疫性及び心理的要因は全て、ＩＢＤ発症への影響と関連付けられてきた。ＩＢＤ発症に対する遺伝的素因（或いは感受性）が存在する。しかし依然として、身体の免疫系活性化の誘発因子は同定するべき課題である。身体の免疫系をオンにすることのできる因子として、感染病原体（未だ同定されていない）、抗原（例えば、牛乳由来のタンパク質）に対する免疫応答、或いは自己免疫過程が挙げられる。腸は免疫反応をもたらし得る物体に常に曝露されているため、より最近の仮説として、生物が正常な免疫応答をオフにする不全の存在が挙げられる。
【００１０】
ＩＢＤは慢性疾患であり、罹患した対象は、疾患が再燃し症状が発生する期間を経て、続いて症状がなくなる、或いは低減して良好な健康状態を回復する寛解期となる。
【００１１】
症状は軽度から重度の範囲に及び、通常、関与する腸管の部分に依存し得る。症状として、次のものが挙げられる。腹部疝痛及び腹痛、血性下痢、非常に切迫した便通、発熱、食欲不振、体重減少、貧血（失血による）。
【００１２】
炎症性腸疾患の腸合併症として、次のものが挙げられる。潰瘍からの大量出血、腸の穿孔（破裂）、狭窄及び閉塞（クローン病患者において、狭窄は多くの場合炎症性であり、薬物治療で頻繁に軽快する）、固定又は線維症（瘢痕性）狭窄は、閉塞の軽減に内視鏡による処置又は外科的処置を必要とし得る。潰瘍性大腸炎において、結腸狭窄は悪性（癌性）であると推測される。瘻孔（異常な通り道）及び肛門周囲の疾患は、クローン病患者においてより一般的である。中毒性巨大結腸症（結腸の急性非閉塞性拡張）は潰瘍性大腸炎の生命に関わる合併症であり、緊急の外科的処置を必要とする。潰瘍性大腸炎における結腸癌のリスクは、診断約８〜１０年後に一般集団のリスクを超えて有意に増加し始める。結腸全体が関与する場合、クローン病における癌のリスクは潰瘍性大腸炎のリスクと等しくなるであろう。クローン病において小腸悪性腫瘍のリスクが増加する。
【００１３】
ＩＢＤの腸外併発は、腸以外の器官に関与する合併症を意味する。これらは、ＩＢＤ患者のごく一部にしか影響を与えない。ＩＢＤ患者は、関節炎、皮膚疾患、目の炎症、肝及び腎障害並びに骨量減少に罹っている可能性がある。
【００１４】
ＩＢＤの診断は現在、主に検便、便潜血検査、全血球数、電解質パネル、ＬＦＴ（アラニントランスアミナーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、アルブミン、総タンパク質及びビリルビンレベルの測定）を含む試験及び検査の組合せによって行われる。
【００１５】
放射線医学（例えば、腹部Ｘ線又はバリウム注腸）及び内視鏡による手順（例えば、結腸内視鏡検査及びＳ字結腸鏡検査）もまた、ＩＢＤの診断に用いられる。
【００１６】
明らかに、ＩＢＤの明確な診断方法は依然として存在せず、ＩＢＤの鑑別及び特異的診断に有用となり得る分子マーカーの必要がある。
【００１７】
癌の種類の非限定的な例として、副腎皮質癌、悪性黒色腫、非黒色腫皮膚癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、カポジ肉腫、膀胱癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、神経外胚葉性及び松果体癌、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状細胞腫、小児大脳星状細胞腫、小児髄芽腫、小児視覚路神経膠腫、髄膜腫、混合膠腫、乏突起神経膠腫、星状細胞腫、脳室上衣腫、下垂体腺腫、転移性腺癌、聴神経腫瘍、脊椎傍悪性奇形腫、乳癌、腺管癌、乳腺腫瘍症、卵巣癌、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、腟癌、外陰癌、妊娠性トロホブラスト癌、卵管癌、子宮肉腫、白血病、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、軟部肉腫、ウィルムス腫瘍、ファンコニー貧血、ランゲルハンス細胞組織球症、腎臓の悪性ラブドイド腫瘍、肝癌、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、絨毛癌、内分泌性癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、胃癌、胃腸癌、尿生殖器癌、神経膠腫、婦人科系の癌、頭頸部癌、肝細胞癌、下咽頭癌、膵島細胞癌、腎癌、喉頭癌、肺癌、リンパ腫、男性乳癌、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌、非黒色腫皮膚癌、食道癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、下垂体癌、前立腺癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、移行細胞癌、絨毛性癌、子宮癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺嚢胞性癌、肛門癌、骨癌、腸癌、腺管癌、脂肪肉腫、神経芽細胞腫、腎芽腫並びに骨肉腫が挙げられる。
【００１８】
炎症性疾患は、敗血症、内毒血症、膵炎、ぶどう膜炎、肝炎、腹膜炎、角膜炎、ＳＩＲＳ及び損傷によって誘発された炎症を含む。
【００１９】
妊孕性に関連する疾患は、男性不妊症及び女性不妊症を含む。男性不妊症は様々な問題に起因し得る。より一般的な障害の一部を下に列挙する。
− 精子産生欠損：男性不妊症の９０パーセントが、十分な精子を産生できないことに起因する。無精子症（Ａｚｚｏｓｐｅｒｍｉａ）は精子が全く産生されないときに発生し、一方、精子が殆ど産生されない場合は精子減少症と診断される。
− 精索静脈瘤；
− 他の障害：男性不妊症の原因となり得る他の障害として、精巣の異常発達又は傷害（内分泌障害又は炎症に起因する）、付属腺の障害、性交障害、雄性生殖管に嚢胞を生じる１９５０年代及び１９６０年代に用いられた合成エストロゲン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）への曝露、停留精巣及び稀な事例では染色体異常等の遺伝的障害が挙げられる。
【００２０】
女性不妊症もまた、様々な問題に起因し得る。より一般的な障害の一部として、多嚢胞性卵巣疾患、骨盤内炎症性疾患、排卵性機能障害、子宮筋腫、子宮内膜症及び免疫学的不妊症が挙げられる。
【００２１】
炭水化物代謝障害は様々な形で生じる。最もよく見られる障害は後天性である。糖尿病性ケトアシドーシス、高浸透圧性昏睡及び低血糖等、炭水化物代謝における後天性又は続発性の撹乱はいずれも、中枢神経系に作用する。糖尿病において、末梢神経疾患の多くの形態及び変種も観察される。炭水化物代謝のその他の障害は、稀に起こる先天性代謝異常（即ち、遺伝的欠陥）である。
【００２２】
炭水化物代謝の後天性障害は、米国内及び世界中の両方で非常によく見られる。低血糖は、アルコール依存症及びインスリン治療されている糖尿病患者の両方における、神経疾患、特に急性精神機能低下、記憶喪失、失見当識、鈍麻及び昏睡の一般的な原因である。他の原因による高インスリン血症は稀であるが、膵腫瘍が原因の可能性もある。その様々な神経合併症を伴う糖尿病は、成人患者で治療される最もよく見られる障害の１つである。
【００２３】
炭水化物代謝の遺伝性障害は稀である。重度のピルビン酸脱水素酵素（ＰＤＨ）複合体欠損及びペントース尿症と呼ばれる良性化学的異常は、非常に少数（２〜６名）の患者でしか報告されていない。
【００２４】
低血糖、糖尿病性ケトアシドーシス及び高浸透圧性昏睡はいずれも致死の可能性があるが、治療の可能性がある状態である。
【００２５】
国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットにおいて、本発明者らは、ＫＴＰＡＦ５０と命名したタンパク質について記述し、このタンパク質は胎盤、腎臓（成体及び胎児）、膵臓及び精巣における特異的な発現を示したが、造血組織では休止及び活性型ＣＤ８＋細胞、休止及び活性型単核細胞並びに休止及び活性型ＣＤ１９＋細胞において検出された。
【００２６】
ＫＴＰＡＦ５０特異抗体を開発したところ、驚いたことに、本発明者らは、本発明においてＫＴＰＡＦ５０の発現が特に癌及び自己免疫障害における特定の病状と相関し得ることを示す。
【００２７】
さらに予期せぬことに、本発明者らは、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体が細胞増殖及びサイトカイン発現の強力な制御因子であることを示す。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
そこで、本発明の目的は、ＫＴＰＡＦ５０を特異的に認識する抗体並びに癌、自己免疫障害、移植片拒絶、神経変性疾患及び糖尿病の診断及び治療におけるその使用を提供することである。
【００２９】
本明細書及び続く実施例に示されている通り、本発明の診断方法は、特定の種類の癌及び自己免疫障害の検出及びモニタリングに特に適している。
【００３０】
本発明の上述及び他の用途及び目的は、説明が進むにつれて明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
第一の態様において、本発明は、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はその任意の断片若しくは誘導体を特異的に認識する抗体と共に、それを含む組成物に関する。前記ＫＴＰＡＦ５０タンパク質は、配列番号１又は配列番号２で表される。
【００３２】
本発明はまた、配列番号３、配列番号５、配列番号６及び配列番号７のいずれか一配列で表されるＫＴＰＡＦ５０由来ペプチドを特異的に認識する抗体並びにそれを含む組成物に関する。
【００３３】
本明細書に記載されている抗体又はそれを含む組成物は、診断及び／又は治療方法に用いるためのものである。
【００３４】
特に、前記抗体又はそれを含む組成物は、癌及び自己免疫障害のいずれか一方の診断又は予後と共に、癌治療に用いるためのものである。
【００３５】
別の一態様において、本発明は、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はそれに由来するペプチドを特異的に認識する抗体を産生する抗体産生細胞系又はハイブリドーマ細胞系を提供する。これらの細胞系によって産生される抗体もまた、本発明により提供される。
【００３６】
さらに別の一態様において、本発明は、診断又は治療組成物の調製における、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はそれに由来するペプチドを特異的に認識する抗体の使用を提供する。
【００３７】
一実施形態において、本明細書において提供される診断組成物は、癌及び自己免疫疾患のいずれか一方の診断のためのものである。
【００３８】
本発明に提供される治療組成物は、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患、糖尿病及び移植片拒絶からなる群から選択された状態の治療のためのものである。
【００３９】
さらに別の一態様において、本発明は、対象における癌又は自己免疫疾患のいずれか一方の診断のための方法であって、
ａ）対象から試料を得る工程と、
ｂ）前記試料をＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はそれに由来するペプチドを特異的に認識する少なくとも１種類の抗体又はそれを含む組成物と接触させる工程と、
ｃ）前記少なくとも１種類の抗体とその特異抗原との複合体の形成を検出手段により検出する工程と、
を含み、それにより、複合体の検出が、前記対象が癌又は自己免疫障害に罹患していることを示す方法を提供する。
【００４０】
前記方法の一実施形態において、前記試料は血液試料である。
【００４１】
前記方法の別の特定の一実施形態において、前記癌は、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択される。
【００４２】
さらに別の一実施形態において、本発明は、必要とする対象に治療上有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を投与する工程を含む、癌の治療のための方法を提供する。
【００４３】
本発明は、有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を細胞と接触させる工程を含む、細胞増殖を抑制する或いはサイトカイン発現を抑制する方法をさらに提供する。特定の一実施形態において、前記細胞はサイトカインを発現する細胞である。
【００４４】
本発明の抗体によってその発現が抑制される特定のサイトカインは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０である。
【００４５】
さらに別の一態様において、本発明は、癌又は自己免疫疾患の診断、治療有効性のモニタリング又は予後評価の内いずれか１つのためのキットであって、次の構成要素、
ａ）本発明に係る少なくとも１種類の抗体又はそれを含む組成物と、
ｂ）本発明の前記抗体によって特異的に認識される抗原の、試料における存在の検出を行うための取扱説明書と、
を含む、キットを提供する。
【００４６】
前記キットは、次の構成要素、
ａ）検査する試料を採取するための少なくとも１つの手段と、
ｂ）前記抗体による前記抗原の前記認識の検出に必要な少なくとも１種類の試薬と、
ｃ）少なくとも１種類の対照試料と、
の内少なくとも１つをさらに含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】抗ＫＴＰＡＦ５０のＫＴＰＡＦ５０抗原に対する特異性を示す検量線の図である。
【図２】健常者（Ｈ）と比較した、肺癌（ＬＣ）患者から得られたヒト血液血清中のＫＴＰＡＦ５０濃度を示すヒストグラムである。
【図３Ａ】雌Ｂａｌｂ／Ｃ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、レサズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）と４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。略語：抗ＰＲＴ３ １＝抗体３Ｅ３Ｇ７；抗ＰＲＴ３ ２＝抗体５Ｅ１１Ｈ３；Ｔｒｅａｔ．＝処理；ｒｅｌ．ｃｏｎｔ．＝対照との相対値。
【図３Ｂ】雌Ｂａｌｂ／Ｃ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図３Ｃ】雌Ｂａｌｂ／Ｃ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図４Ａ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来の細胞における、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。略語：抗ＰＲＴ３ １＝抗体５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝抗体３Ｅ３Ｇ７；Ｔｒｅａｔ．＝処理；ｒｅｌ．ｃｏｎｔ．＝対照との相対値。
【図４Ｂ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雌Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来細胞における、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図４Ｃ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来の細胞における、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図４Ｄ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雌Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来細胞における、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図４Ｅ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来の細胞における、レサズリンと４．５時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による７２時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図４Ｆ】雌又は雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞生存率における抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体の効果を示す図であり、雌Ｃ５７／ｂｌａｃｋマウス由来細胞における、レサズリンと４．５時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による７２時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図５】Ｃ５７／ｂｌａｃｋ処理脾細胞由来の培地中のＫＴＰＡＦ５０濃度を示す図である。略語：ｆ．＝雌；ｍ．＝雄
【図６Ａ】２４時間の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体処理に続く、ヒト単球の生存率を示す図であり、レサズリンと２時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。略語：抗ＰＲＴ３ １＝抗体５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝抗体３Ｅ３Ｇ７；ｒｅｌ．＝相対；ｃｏｎｔ．＝対照；ｔｒｅａｔ．＝処理。
【図６Ｂ】２４時間の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体処理に続く、ヒト単球の生存率を示す図であり、レサズリンと４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図６Ｃ】２４時間の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体処理に続く、ヒト単球の生存率を示す図であり、レサズリンと２４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図７Ａ】４８時間の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体処理に続く、ヒト単球の生存率を示す図であり、レサズリンと２時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。略語：抗ＰＲＴ３ １＝抗体５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝抗体３Ｅ３Ｇ７；ｒｅｌ．＝相対；ｃｏｎｔ．＝対照；ｔｒｅａｔ．＝処理。
【図７Ｂ】４８時間の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体処理に続く、ヒト単球の生存率を示す図であり、レサズリンと４時間インキュベーションした後に測定した、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図８Ａ】ヒト単球におけるＴＮＦ−α発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＴＮＦ−αキャリブレーションを示す図である。略語：抗ＰＲＴ３ １＝５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝３Ｅ３Ｇ７；ｃｏｎｔ．＝対照。
【図８Ｂ】ヒト単球におけるＴＮＦ−α発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＴＮＦ−α発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図８Ｃ】ヒト単球におけるＴＮＦ−α発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＴＮＦ−α発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図８Ｄ】ヒト単球におけるＴＮＦ−α発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＴＮＦ−α発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１２０時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図８Ｅ】ヒト単球におけるＴＮＦ−α発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＴＮＦ−α発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１４４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図９Ａ】ヒト単球におけるＩＮＦ−γ発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＮＦ−γキャリブレーションを示す図である。略語：抗ＰＲＴ３ １＝５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝３Ｅ３Ｇ７；ｃｏｎｃ．＝濃度。
【図９Ｂ】ヒト単球におけるＩＮＦ−γ発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＮＦ−γ発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図９Ｃ】ヒト単球におけるＩＮＦ−γ発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＮＦ−γ発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図９Ｄ】ヒト単球におけるＩＮＦ−γ発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＮＦ−γ発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１２０時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図９Ｅ】ヒト単球におけるＩＮＦ−γ発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＮＦ−γ発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１４４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図１０Ａ】ヒト単球におけるＩＬ−１０発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＬ−１０キャリブレーションを示す図である。略語：抗ＰＲＴ３ １＝５Ｅ１１Ｈ３；抗ＰＲＴ３ ２＝３Ｅ３Ｇ７；ｃｏｎｃ．＝濃度。
【図１０Ｂ】ヒト単球におけるＩＬ−１０発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＬ−１０発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による２４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図１０Ｃ】ヒト単球におけるＩＬ−１０発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＬ−１０発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による４８時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図１０Ｄ】ヒト単球におけるＩＬ−１０発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＬ−１０発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１２０時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図１０Ｅ】ヒト単球におけるＩＬ−１０発現に対するＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を示す図であり、ＩＬ−１０発現におけるＫＴＰＡＦ５０抗体による１４４時間処理の効果を示すヒストグラムである。
【図１１】２４時間及び１４４時間インキュベーション後の、ヒト単球の培地におけるＫＴＰＡＦ５０タンパク質の存在を示す図である。略語：ｃｏｎｔ．＝対照
【図１２Ａ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、対照を示す図である。
【図１２Ｂ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、１００μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０抗体（α−ＰＲＴ３ １）で処理した細胞を示す図である。
【図１２Ｃ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、１００μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０抗体（α−ＰＲＴ３ ２）で処理した細胞を示す図である。
【図１２Ｄ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、１００ｎｇ／ｍｌのＫＴＰＡＦ５０タンパク質で処理した細胞を示す図である。
【図１２Ｅ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、５００ｎｇ／ｍｌのＫＴＰＡＦ５０タンパク質で処理した細胞を示す図である。
【図１２Ｆ】光学顕微鏡により可視化した抗ＫＴＰＡＦ５０処理後の細胞形態変化を示す図であり、１０００ｎｇ／ｍｌのＫＴＰＡＦ５０タンパク質で処理した細胞を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
以前の報告において、本発明者らは、ＫＴＰＡＦ５０と命名されたタンパク質（本明細書においてＰＲＴ３とも称する）について、その発現パターン及び生物活性を示しつつ記述した［国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレット］。本発明のため、国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットの内容は参照として本明細書に完全に組み込まれる。
【００４９】
とりわけ、国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットはＫＴＰＡＦ５０発現パターンについて記述する。さらに、国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットは、本明細書において配列番号１として示されるシグナルペプチドを含まないＫＴＰＡＦ５０全長タンパク質の配列と、本明細書において配列番号２として示されるシグナルペプチドを含むＫＴＰＡＦ５０全長タンパク質の配列を提供する。加えて、国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットにおいて、本明細書において配列番号４として表されている３６アミノ酸長のＮ末端ペプチドも記載されている。
【００５０】
本発明において、本発明者らは、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質及び／又はＫＴＰＡＦ５０由来ペプチドを認識し結合する抗体の開発について記載する。
【００５１】
驚いたことに、後述する例１に記載されている通り、前記抗体は、国際公開第２００９／０８３９６８号明細書に記載されている通りＫＴＰＡＦ５０の組織発現と直接的な相関のない特定の種類の癌、特に肺癌における前記タンパク質の同定において特異的であることが示された。
【００５２】
本発明者らは、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体が細胞生存の強力な制御因子であり、したがって細胞増殖の制御における重要なツールとして用いることができることも証明する。
【００５３】
予期せぬことに、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体は、本明細書において炎症性サイトカイン発現の効果的な制御因子として示されている。これらの結果は、免疫系の恒常性バランスにおけるＫＴＰＡＦ５０の中心的役割を示唆し、その抗体を潜在的な免疫制御因子として提供する。
【００５４】
したがって、本発明はその第一の態様において、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はその任意の断片若しくは誘導体を特異的に認識する抗体を提供する。特に、前記ＫＴＰＡＦ５０タンパク質は、配列番号１又は配列番号２で表される。配列番号１は５０ａａ長であり、シグナルペプチドを含まないＫＴＰＡＦ５０タンパク質に関連する。配列番号２は７４ａａ長であり、国際公開第２００９／０８３９６８号パンフレットに以前に記載した通り、シグナルペプチドを含む全長ＫＴＰＡＦ５０タンパク質に関連する。
【００５５】
本明細書において定義されているように、本発明の抗体は通常、天然に由来又は天然に産生されたものである。したがって、抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である。或いは、本発明の抗体は、合成的に産生、例えば化学合成又は各抗体産生細胞若しくは細胞系から特異的ｍＲＮＡを単離することにより組換えにより産生されてもよい。それに続き、組換えにより産生された抗体を作製するため、前記特異的ｍＲＮＡは標準的な分子生物学的操作（ｃＤＮＡを得て、前記ｃＤＮＡを発現ベクターに導入する等）に付される。前記技法は当業者に良く知られている。
【００５６】
タンパク質に対するポリクローナル抗体の作製は当業者に良く知られた技法であり、とりわけＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．の第２章に記載されている。
【００５７】
モノクローナル抗体は、免疫動物、特にラット又はマウスの脾臓又はリンパ節から採取されたＢ細胞から、雑種細胞の増殖に有利な条件下で不死化Ｂ細胞と融合することにより調製することができる。モノクローナル抗体を作製する技法は、上述のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第２章等、多くの論文及び教科書に記載されている。その第２章に記載された通りのモノクローナル抗体の作製のため、これらの動物の脾臓又はリンパ節細胞は、タンパク質免疫動物の脾臓又はリンパ節細胞と同じ方法で用いることができる。モノクローナル抗体の作製に用いられる技法は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ［Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ ２５６；４９５〜４９７］並びに米国特許第４，３７６，１１０号明細書によりさらに記載されている。
【００５８】
後述の例２は、本発明者らによって作製された３０種のＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体について記載する。表２は各抗体の抗原特異性を表し、表３はその抗原親和性を示す。
【００５９】
用語「抗体」はまた、例えば、抗原と結合できるｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、二重特異性抗体、直鎖抗体、抗体のＦ（ａｂ’）２抗原結合断片等、インタクトな分子とその断片の両方を含むように企図されている［Ｗａｈｌら（１９８３年）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４、３１６〜３２５］。
【００６０】
Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２並びに他の抗体断片は、インタクトな抗体分子のため及び本明細書に開示されている抗体の他の用途のための、本明細書に開示されている方法に従った、本発明の抗体の作製のための抗原として用いたタンパク質の生物試料における検出に有用である。このような断片は、例えばパパイン（Ｆａｂ断片作製のため）又はペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片作製のため）等の酵素を用いたタンパク質切断により産生することができる。このように、本発明において有用なＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２並びに他の抗体断片は、使用目的に応じて様々なタグを付けることができる。これらのタグは、検出を促進するための検出可能なタグであっても、腫瘍細胞を殺傷する毒性タグであっても、或いは他の細胞又は物質が腫瘍細胞を殺傷するよう誘導できる「誘導」タグであってもよい。
【００６１】
抗体は、分子（抗原）と特異的に反応し、その結果抗体が前記分子と結合できる場合、分子と「結合可能である」又は「認識する」と言われている。用語「エピトープ」は、該抗体又は該抗体を産生する細胞によって認識され得る、抗体が結合することのできる任意の分子の一部を意味するよう企図されている。エピトープ又は「抗原決定基」は、通常、アミノ酸又は糖側鎖等、分子の化学的活性表面分類からなり、特異的三次元構造特性及び特異的電荷特性を有する。
【００６２】
「抗原」は、抗体によって認識及び結合され得る分子又は分子の一部である。抗原は、１個又は２個以上のエピトープを有する可能性がある。上述の特異的反応は、抗原がその対応する抗体と高度に選択的且つ特異的な仕方で反応するが、他の抗原によって生じ得る多数の他の抗体とは反応しないことを示すよう企図されている。
【００６３】
本発明によって提供される抗体は、特にポリクローナル抗体の任意のアイソタイプ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ又はＩｇＤのものとなることができる。
【００６４】
モノクローナル抗体は、任意のアイソタイプのものであってもよい。
【００６５】
本明細書において提供され表２に示されているモノクローナル抗体は通常、ＩｇＧアイソタイプであった。
【００６６】
本発明において、本発明のＫＴＡＰＦ５０特異抗体を作製するために用いた抗原は、全長タンパク質又はＫＴＡＰＦ５０タンパク質に由来するペプチドに対応する。
【００６７】
用語「ペプチド」は、本明細書において、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を表すよう用いられている。ペプチドは、合成により、遺伝子工学的方法により、宿主細胞における発現、或いは他の適切な手段により得ることができる。他に断りのない限り、ペプチドは一般に、自然発生のＬ−アミノ酸で構成されている。
【００６８】
ペプチド分子に関し、用語「生物学的特性」は、全長ＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０ペプチドにより達成され得るｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏ効果の内少なくとも一方を行うペプチドの能力を意味し、これは本明細書に記載されている生物活性を含むが、これに限定されるものではない。例えば、生物学的特性は、癌、免疫系関連疾患、ウイルス性疾患及び炎症ベースの疾患を治療する能力を含む。
【００６９】
抗体に関しては、「生物学的特性」又は「生物活性」は一般に、エピトープを特異的に認識し、その結果それと結合する抗体の能力を意味する。エピトープは、全長タンパク質の一部であってもよいし、或いはタンパク質断片又はペプチドに埋め込まれてもよい。実施例において証明され、図面において例証されている通り、図１は、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体のＫＴＰＡＦ５０タンパク質に対する特異性を示した。同様に、図３において、抗Ｔ１０１抗体のＴ１０１タンパク質に関する特異性が示される。
【００７０】
用語「改変された分子の生物学的特性が未改変分子と比べて有意に影響することなく」とは、改変された分子が、未改変分子の生物活性と質的に類似の生物活性を保持することを表すことを意味する。
【００７１】
本発明との関連において、改変されたペプチドに関し、これは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７のタンパク質の生物学的特性の内１又は複数を保持することを意味する。ペプチドが未改変の分子の生物活性と質的に類似の生物活性を保持するか決定するため、例えば、改変されたペプチドが、並行してアッセイされる対応する未改変ペプチド（即ち、全長ＫＴＰＡＦ５０ペプチド又はＫＴＰＡＦ５０ペプチドの）と比較されるｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又は臨床実験、或いは別個に行った実験から分かる通り、改変されたペプチドがアッセイされて未改変ペプチドの生物学的効果と同様の生物学的効果を有するか試験する実験等、１又は複数のアッセイを行うことができる。このような実験は、例えば、国際公開第２００９／０８３９６８号明細書に記載されている仕方で行うことができる。
【００７２】
改変されたペプチドは、ＫＴＰＡＦ５０ペプチドに含まれる少なくとも８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０又は少なくとも４５アミノ酸残基の対応する配列に対してある程度の同一性を有する、少なくとも８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０又は少なくとも４５アミノ酸残基の連続した配列を含むペプチドとなることができ、該ある程度の同一性は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、具体的には少なくとも９５％である。
【００７３】
本発明により、ＫＴＰＡＦ５０に由来する改変されたペプチド、例えば、保存的置換により１又は複数のアミノ酸が別のアミノ酸と交換された改変されたペプチドを認識することのできる抗体もまた提供される。本明細書において、「保存的置換」は、あるクラスにおけるアミノ酸の、同じクラスのアミノ酸による置換を意味し、このようなクラスは、天然に存在する相同タンパク質におけるアミノ酸側鎖の共通の物理化学的性質及び高い置換頻度によって定義される。アミノ酸側鎖の一般的な６クラスが分類されており、これはクラスＩ（Ｃｙｓ）、クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）、クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）、クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）及びクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含む。例えば、ＡｓｐのＡｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｕ等、クラスＩＩＩの別の残基への置換は、保存的置換である。
【００７４】
一実施形態において、アミノ酸配列において１個の置換のみが行われる。
【００７５】
別の一実施形態において、２個の置換が行われる。さらに別の一実施形態において、３個の置換が行われる。置換の最大数は、未置換配列におけるアミノ酸の少なくとも７０％、望ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％を元のままに残すだけのアミノ酸数を超えてはならない。特定の一実施形態により、他の残基に置換された最大３、場合により最大６個のアミノ酸残基を含む置換は保存的置換である。
【００７６】
さらに別の一実施形態において、１又は複数のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸、好ましくは対応するＤ−アミノ酸に交換され得る。特定の一実施形態において、全アミノ酸がＤ−アミノ酸である。
【００７７】
よって、本発明は、実質的に等しい又はより高い活性を有する、本明細書に開示されている配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号７）と構造的に類似の配列を含むタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを認識できる抗体に関することを理解するべきである。タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの構造変化は、１又は複数の欠失、付加又は置換を含む。配列内の任意の点で生じ得る欠失又は付加の数は一般に、全アミノ酸数の２５％未満、好ましくは１０％未満となるであろう。
【００７８】
好ましい置換は、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドの二次構造の変質が予想されない変化、即ち保存的変化である。次のリストは、元のアミノ酸（左側）に対し交換され得るアミノ酸（右側）を示す。
【表１】
【００７９】
アミノ酸は、電荷、側鎖サイズ等、その本質的な特色に応じて分類することもできる。次のリストは、類似のアミノ酸グループを示す。好ましい置換は、次の通り、あるグループに属すアミノ酸を同一グループのアミノ酸と交換する。
１．小分子脂肪族・非極性：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
２．極性・負電荷残基及びそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．極性・正電荷残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．大分子脂肪族・非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
５．大分子芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ
【００８０】
アミノ酸置換及びタンパク質構造に関するさらなる所見は、Ｓｃｈｕｌｚら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州ニューヨーク、１９７９年及びＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、カリフォルニア州サンフランシスコ、１９８３年に記載されている。
【００８１】
上に詳述されている通りの好ましい保存的アミノ酸置換は、本明細書において下に詳述されている通り、本発明の抗体によって認識されるタンパク質の機能又は活性を実質的に維持する又は増強させることが予想される。当然ながら、その結果生じるタンパク質、ポリペプチド又はペプチドが、本発明の抗体により認識される抗原、即ち、本発明の抗体により認識されるタンパク質と機能の点で実質的に等しい又はより優れている抗原であれば、いずれのアミノ酸置換、付加又は欠失も本発明の範囲内であると考えられる。
【００８２】
本発明の抗体により認識されるタンパク質は、固相合成（例えば、ＦＭＯＣ及びＢＯＣ技法を用いた）並びに液相合成等、従来の化学的方法により産生することができる。これらのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、後述のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１６章に詳述されている通り、細菌若しくは昆虫細胞又は他の真核生物転写ｉｎ ｖｉｖｏ系において産生してもよい。産生に続き、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、それらが産生された細胞から精製される。ペプチド精製方法は、当業者にとって公知のものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１６章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００６年及びＣｏｌｉｇａｎら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第５章及び第６章、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、２００６年に詳述されている。有利には、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドは、グルタチオンＳ−転移酵素（ＧＳＴ）等の第二のタンパク質又はヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）配列等の配列タグとの融合体として産生することができる。融合体又はタグ付きタンパク質の使用は、上述のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１６章並びにＨｉｓ−タグタンパク質発現及び精製キットの取扱説明書［例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ、ドイツから入手可能］に詳述されているように、精製手順を簡略化する。
【００８３】
本発明の抗体によって認識されるタンパク質は、例えば、細胞抽出物又はリボソームを用いた無細胞系において合成することもできる。
【００８４】
本発明の抗原は、その機能、親和性又は安定性を改善するようさらに改変することができる。例えば、より優れた安定性及び／又は全体的な性能改善をペプチドに付与するよう、環化が用いられてよい。側鎖環化及び骨格環化等、多くの異なる環化方法が開発されてきた。これらの方法は、先行技術において十分に実証されている［例えば、Ｙｕら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７、１６１〜７５、１９９９年、Ｐａｔｅｌら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５３、６８〜７４、１９９９年、Ｖａｌｅｒｏら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５３、５６〜６７、１９９９年、Ｒｏｍａｎｏｖｓｋｉｓら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５２、３５６〜７４、１９９８年、Ｃｒｏｚｅｔら、Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３、２６１〜７６、１９９８年、Ｒｉｖｉｅｒら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４１、５０１２〜９、１９９８年、Ｐａｎｚｏｎｅら、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（東京）、５１、８７２〜９、１９９８年、Ｇｉｂｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、１２８１４〜８、１９９８年、Ｌｉｍａｌら、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．５２：１２１〜９、１９９８年及び米国特許第５，４４４，１５０号明細書］。
【００８５】
特定の環化方法は、ベンゼン環のパラ置換されたアミノ酸誘導体を用いることによる、両親媒性αへリックスの安定化に関与する［Ｙｕら、（１９９９年）、ｉ同上］。別の特定の環化方法は、Ｒｅｉｓｓｍａｎｎら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ １：５１〜６、１９９４〜９５年及びそこに参照されている文献に開示されているように骨格環化である。骨格−側鎖結合に関与する別の環化方法が用いられてもよい［Ｒｅｉｓｓｍａｎｎら（１９９４〜９５年）、同上］。
【００８６】
上述の通りではあるが、本発明において、本発明の抗体によって認識されるタンパク質は、自然発生的又は合成アミノ酸ではない様々な同一又は異なる有機成分によりそのＮ末端及び／又はＣ末端が延長されてよい。このような延長の一例として、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドはＮ−アセチル基によりそのＮ末端及び／又はＣ末端が延長されてよい。
【００８７】
ペプチド構造を改善するため、本発明の抗体によって認識されるタンパク質は、そのＮ末端を通してラウリル−システイン（ＬＣ）残基と結合及び／又はそのＣ末端を通してシステイン（Ｃ）残基と結合、或いはペプチドと免疫化のためのアジュバント（単数又は複数）との結合に適した他の残基（単数又は複数）と結合することができる。
【００８８】
さらに別の一態様において、本発明は、本発明に記載されている少なくとも１種類の抗体を有効成分として含む組成物を提供する。したがって、本発明の組成物の活性物質として含まれている前記抗体は、ＫＴＰＡＦ５０又はその任意の断片、アナログ若しくは誘導体を認識し結合する抗体又はその断片である。
【００８９】
前記組成物は、異なるハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体の組合せを含むことができる。例えば、前記組成物は、表２に記載のハイブリドーマに対応した２種類、３種類、４種類、５種類又はそれ以上のハイブリドーマ細胞系に由来する抗体を含むことができる。
【００９０】
一実施形態において、前記組成物は診断方法に用いるためのものである。
【００９１】
前記抗体又はそれを含む前記組成物は、癌及び自己免疫障害の診断に有用である。
【００９２】
具体的には、前記抗体又はそれを含む前記組成物は、肺癌又はＩＢＤの診断に用いることができる。
【００９３】
別の一実施形態において、本発明に記載されている抗体の内少なくとも１つを含む前記組成物は、癌の治療に用いることができる。
【００９４】
さらに別の一実施形態において、本発明に記載されている抗体の内少なくとも１つを含む組成物は、癌の予後に用いることができる。治療有効性の指標を持つことが重要な癌治療を受けている患者は、特に予後の必要がある。したがって、本発明に記載されている少なくとも１種類の抗体を含む組成物は、治療成績であるＫＴＰＡＦ５０レベルの検出又は決定によって決定することができるべきである。
【００９５】
組成物の調製は本技術分野においてよく知られており、多くの論文や教科書に説明されている。例えば、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルベニア州イーストン、１９９０年の特に１５２１〜１７１２頁を参照のこと。
【００９６】
本発明の組成物は、薬学的に許容されるアジュバント、担体、希釈剤又は賦形剤の内少なくとも１つをさらに含むことができる。
【００９７】
用語「薬学的に許容される担体」は、有効成分と反応しない不活性の非毒性材料のいずれか１種類を意味する。担体は、所望の製剤形態に基づき、場合により選択される。担体は、クリアランス速度を遅らせるため、持続放出特性を付与するため、望ましくない副作用を低減させるため等、薬剤の安定性を改善するための有効成分の標的組織への送達又は浸透の改善効果を場合により有することができる。担体は、製剤に食用香味料等を提供するための、製剤を安定化する物質（例えば、保存剤）であってよい。担体は、従来用いられてきた担体の内いずれかであってよく、溶解度及び本発明の抗体との反応性欠如等の物理化学的考察並びに投与経路によってのみ限定される。担体は、添加物、着色料、希釈剤、緩衝剤、崩壊剤、湿潤剤、保存剤、香味料及び薬理学的適合性担体を含むことができる。加えて、担体は、定義によると予測可能な方法で有効成分の作用に影響を及ぼす物質であるところのアジュバントとなることができる。担体の典型例として、（ａ）有効量の活性物質が、水、生理食塩水、天然果汁、アルコール、シロップ等、希釈剤中に溶解した溶液、（ｂ）それぞれが固体又は顆粒として所定量の活性物質を含む、カプセル（例えば界面活性剤、潤滑剤及び不活性充填剤を含む、例えば通常の硬い又は柔らかい殻のゼラチン型の）、錠剤、薬用キャンディー（活性物質がショ糖及びアカシア又はトラガント等、香料中にある、或いは活性物質がゼラチン及びグリセリン等、不活性塩基中にある）並びにトローチ剤、（ｃ）散剤、（ｄ）適切な液体中の懸濁剤、（ｅ）適切なエマルジョン、（ｆ）リポソーム製剤その他が挙げられる。
【００９８】
別の一実施形態において、本発明の組成物は、抗生物質、サイトカイン、リンホカイン、増殖因子、ホルモン等、追加的な活性物質を必要に応じてさらに含むこともできるが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
本発明において、本発明に係る抗体を産生する抗体産生細胞系もまた提供される。よって、本発明は、ＫＴＰＡＦ５０に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を提供する。
【０１００】
一実施形態において、同様に本発明の目的である抗体産生細胞系を作出するため、抗体産生細胞はクローンとして単離され、不死化される。細胞の不死化は、当業者にとって公知の方法により達成することができ、これは例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａら、２００７年［Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ、Ｃｏｒｔｉ Ｄ、Ｓａｌｌｕｓｔｏ Ｆ．（２００７年）Ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｉｍｍｏｒｔａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌｓ Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；１８（６）：５２３〜８］によって記載されている。
【０１０１】
後述の例２並びに表２及び３は、本発明者らによって作製された全ハイブリドーマ、その作製に用いた特定の抗原及びＥＬＩＳＡによって測定したその抗原親和性を示す。
【０１０２】
したがって、本発明は、抗体産生細胞系又はハイブリドーマ細胞系も提供する。
【０１０３】
特に、本発明は、次のハイブリドーマ細胞系３Ｅ３Ｇ７、５Ｅ１１Ｈ３、２Ｂ６Ａ３、２Ｂ６Ａ１２、２Ｂ６Ｇ２、２Ｂ６Ｈ１、５Ｅ１１Ｂ５、５Ｅ１１Ｂ８、５Ｅ１１Ｈ５、３Ｅ１Ｆ９、３Ｅ１Ｆ１１、３Ｅ１Ｇ４、３Ｅ１Ｇ６、２Ａ８Ｂ８、２Ａ８Ｂ１２、２Ａ８Ｈ７、６Ｅ２Ｂ６、６Ｅ２Ｃ５、６Ｅ２Ｃ９、６Ｅ２Ｄ４、７Ｄ４Ｄ６、７Ｄ４Ｅ１２、７Ｄ４Ｆ９、７Ｄ４Ｈ１０、６Ｆ５Ａ１、６Ｆ５Ｃ９、６Ｆ５Ｃ１２、３Ｅ３Ｂ３及び３Ｅ３Ｃ８を提供する。
【０１０４】
ブダペスト条約の規定に従い、次の通り、２種類のハイブリドーマ細胞系（３Ｅ３Ｇ７及び５Ｅ１１Ｈ３）を、寄託機関であるＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ（２５、Ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ、Ｆ−７５７２４、Ｐａｒｉｓ、Ｃｅｄｅｘ １５、フランス）に寄託した。
【表２】
【０１０５】
対象出願に対応する出願又はその後継の出願がなされている国の外国特許法の定めるところにより寄託物を利用することができる。しかし、寄託物の利用は、行政措置により承認された特許権を逸脱した対象発明の実施の許諾には当たらないことを理解するべきである。
【０１０６】
さらに、対象ハイブリドーマ寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約の条項に従って保存及び一般公開されている、即ち、その生存維持及び汚染防止に必要なあらゆる注意を払って、寄託試料供給の最後の要求があってから少なくとも５年間の期間、そしていずれの場合においても寄託日から少なくとも３０年間の期間、或いは培養物の開示をなし得る任意の特許の法的強制力のある期間保存された。寄託機関が寄託物の状態のために請求があっても試料を供給できなければ、寄託者は、寄託物（単数又は複数）を交換する義務に同意する。対象培養寄託物の一般公開におけるあらゆる制限は、それを開示する特許の付与によって取消不能に取り除かれるであろう。
【０１０７】
したがって、本発明は、前記細胞系によって産生される抗体も提供する。
【０１０８】
さらにまた別の一態様において、本発明は、本発明に記載されているＫＴＰＡＦ５０を認識する抗体の診断組成物の調製における使用を提供する。特に、前記組成物は、癌及び自己免疫疾患のいずれか一方の診断のためのものである。
【０１０９】
よって、本発明は、癌診断のための診断組成物の調製における抗ＫＴＰＡＦ５０抗体の使用を提供する。
【０１１０】
本明細書において癌について言及する場合、慢性骨髄性白血病や成熟に伴う急性骨髄性白血病等の骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、好塩基球増加を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病、バーキット病や非ホジキン病等の悪性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病や慢性リンパ球性白血病等のリンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、良性髄膜腫等の固体腫瘍、唾液腺の混合腫瘍、口唇及び口腔における腫瘍、咽頭、喉頭、副鼻腔、結腸腺腫、小細胞肺癌等の腺癌、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸肉腫、脂肪肉腫、粘液性滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液性軟骨肉腫、ユーイング腫瘍、精巣及び卵巣未分化胚細胞腫を含む他の腫瘍、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、中皮腫、乳癌、皮膚癌、前立腺癌及び卵巣癌、眼瞼の癌腫、結膜の癌腫、結膜の悪性黒色腫、ぶどう膜の悪性黒色腫、網膜芽細胞腫、涙腺の癌腫、眼窩、脳、脊髄、脈管系の肉腫、血管肉腫並びにカポジ肉腫を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
本明細書において後続の例１及び図２で証明されているように、ＫＴＰＡＦ５０血清レベルを肺癌において評価したところ、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体は、肺癌の診断における有用性を示した。
【０１１２】
本発明の抗体又はそれを含む組成物もまた、乳癌及び卵巣癌の診断で用いるためのものである。
【０１１３】
加えて、本発明は、自己免疫疾患の診断のための診断組成物の調製における抗ＫＴＰＡＦ５０抗体の使用を提供する。
【０１１４】
本明細書の記述において、自己免疫疾患は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、多発性硬化症（ＭＳ）、自己免疫性ぶどう膜炎、自己免疫性網膜ぶどう膜炎、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、膵島炎、シェーグレン症候群、自然流産、実験的自己免疫性心筋炎、リウマチ様関節炎（ＲＡ）、ループス（ＳＬＥ）、乾癬及び糖尿病、特にＩ型を含む。自己免疫疾患の追加的な例として、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、円形脱毛症、アミロイド症、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、軸索及び神経細胞性神経障害、Ｂａｌ病、Ｂｅｈｎｅｔ病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアックスプルー（非熱帯性）、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性神経障害、皮膚筋炎、デビック病、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エヴァンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、好中球減少症、眼球瘢痕性類天疱瘡、骨関節炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（末梢ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ型多腺性自己免疫性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋痛、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球ろう、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、精子及び精巣自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎及び壊死性脊髄症、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織病（ＵＣＴＤ）、血管炎、小水疱性皮膚症、白斑並びにウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。
【０１１５】
別の一態様において、本発明は、本発明に記載されているＫＴＰＡＦ５０特異的な抗体の、癌、自己免疫疾患、移植片拒絶、神経変性疾患及び糖尿病を治療するための治療組成物の調製における使用を提供する。
【０１１６】
特に、前記組成物は、癌を治療するためのものである。
【０１１７】
例３に示す通り、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体による治療は細胞生存率の低下をもたらし、これらの抗体を細胞死の誘導又はアポトーシスの誘導に用いてよいことを示唆する。癌性細胞における細胞死の誘導は、その除去のための効果的な手段となることができる。
【０１１８】
したがって、本発明は、必要とする対象に治療上有効量の少なくとも１種類の本発明の抗体又はその組合せを投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。
【０１１９】
さらに、本発明において提供される抗体又はその断片は、本発明の抗体作製のための抗原として用いたタンパク質の試料における量的又は質的な検出に用いることができる。これは、蛍光（免疫蛍光）、酵素反応の発色産物、沈殿の生成、化学発光又は生物発光の内いずれか１種類となり得る、視覚的に検出可能なシグナルを与える技法によって達成することができる。後述の通り、蛍光又は発色性標識抗体の利用は、光学顕微鏡、フローサイトメトリー又は蛍光定量的検出と組み合わせる。抗体の検出に用いることのできる他の技法及び標識は、コロイド金、放射性タグ、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）その他、アビジン／ストレプトアビジン−ビオチン、磁性ビーズ及び物理的システム、例えば実際の結合に対して高感度のナノテクノロジーによるシステムを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
本発明において提供される抗体又はその断片は、例えば免疫組織化学、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡等において、またタンパク質のｉｎ ｓｉｔｕ検出のため組織学的染色に用いることができる。ｉｎ ｓｉｔｕ検出は、対象から組織学的検体を取り出し、本発明の標識抗体をこのような検体と接触させることによって達成することができる。標識抗体（又は断片）を生物試料（前記検体）に塗布又は覆うことにより、抗体（又は断片）の接触を行う。このような手順の使用により、試験した組織における抗原の存在だけでなく、その分布を決定することも可能となる。このようなｉｎ ｓｉｔｕ検出を達成するため、当業者であれば、本発明を用いて染色手順等、多種多様な組織学的方法を改変できることを容易に認知できるであろう。
【０１２１】
本発明に係る抗体を標識して直接検出できる方法の１つは、同を酵素に結合し、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）に用いることによるものである。同様に、この酵素は、後に適切な基質に曝露されるときに、例えば分光光度的、蛍光定量的又は視覚的手段によって検出され得る化学成分を生成するような仕方で基質と反応するであろう。抗体の検出可能な標識に用いることのできる酵素は、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されるものではない。検出は、酵素のための発色性基質を用いる比色法によって達成することができる。検出は、同様に調製された標準と基質との酵素反応の程度を視覚的に比較することによって達成することもできる（この手順は、可溶性発色産物及び不溶性発色産物、例えばニトロセルロース又はプラスチック支持体の両方に適している）。
【０１２２】
本発明において、抗原と抗体との反応の検出は、適切な事例においては、異なるエピトープと特異的、或いは非特異的な二次抗体又はリガンド若しくは反応抗体と反応性の他のリガンドの使用によってさらに支援することができる。
【０１２３】
免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、測光アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ及びイムノブロッティング等、酵素免疫測定法は、特異抗体の検出を達成するために容易に適用することができる。
【０１２４】
同様に用いることのできる他の検出システムは、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃｏｗａｎ株Ｉ由来のプロテインＡ、グループＣストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の菌種（２６ＲＰ６６株）由来のプロテインＧの使用に基づくシステム又はビオチン−アビジン結合反応を用いるシステムを含む。
【０１２５】
本発明の抗体を用いることのできる免疫酵素的検出の他の方法は、ウエスタンブロット及びドットブロットである。試料は、電気泳動により分離され、ニトロセルロースメンブレン又は他の適切な支持体に転写される。次に、検査される試料（例えば、培養物上清）がメンブレンと接触され、形成された免疫複合体の存在が既述の方法により検出される。この方法の変法において、精製抗体がメンブレン上に線状又は点状に塗布され、結合される。その後、メンブレンは、検査される培養前後の試料と接触され、形成された免疫複合体を本明細書に記載されている技法を用いて検出する。
【０１２６】
抗体−抗原複合体の存在は凝集によって検出することもできる。本発明に係る抗体は、例えば均一な懸濁液を生成するラテックス粒子のコーティングに用いることもできる。試料、例えば抗体によって認識される特異抗原を含む血清と混合すると、ラテックス粒子は凝集を生じ、大きな凝集物の存在は視覚的に検出することができる。
【０１２７】
免疫測定技法による抗体の測定に適用できる免疫学的手順及び免疫測定法手順の総説として、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ［Ｄ．Ｓｔｉｔｅｓら編（１９９４年）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版］を参照されたい。
【０１２８】
抗原と抗体との反応の検出は、本技術分野で公知の方法により検出可能な成分で標識された抗体又はリガンドの使用によって容易とすることができる。このような検出可能な成分は、沈殿若しくは変色の視覚的検出、顕微鏡による視覚的検出又は分光測定若しくは放射測定による自動検出等を可能にする。検出可能な成分の例として、フルオレセイン及びローダミン（蛍光顕微鏡用）、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリホスファターゼ（光学顕微鏡用又は電子顕微鏡用のいずれか及び生化学的検出並びに変色による生化学的検出用）並びにビオチン−ストレプトアビジン（光学又は電子顕微鏡用）が挙げられる。用いられる検出方法及び成分は、例えば、上のリスト又はこのような選択に適用される標準的な判断基準による他の適切な例から選択することができる［Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ］。
【０１２９】
検出は、他の様々な免疫測定法のいずれかを用いて達成することができる。例えば、抗体又は抗体断片を放射性標識することにより、放射免疫測定法（ＲＩＡ）の使用による抗原の検出が可能となる。ＲＩＡの優れた記述は、参照として本明細書に組み込まれるＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｏｒｋ、Ｔ．Ｓ．ら著、Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＹ（１９７８年）に記載されており、特に表題「Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」の章、Ｃｈａｒｄ，Ｔ．著を参照のこと。放射性同位元素は、ガンマ／ベータカウンター若しくはシンチレーションカウンターの使用又はオートラジオグラフィーによる手段によって検出することができる。
【０１３０】
本発明に係る抗体の蛍光化合物による標識も可能である。蛍光標識抗体が適切な波長の光に露光されると、次にその存在は蛍光により検出することができる。最も一般に利用されている蛍光標識用化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレサミンである。
【０１３１】
抗体は、１５２Ｅ又はその他ランタニド系列等、蛍光放射性金属を用いて検出可能に標識することができる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＥＴＰＡ）等の金属キレート基を用いて抗体に結合することができる。
【０１３２】
抗体は、それと化学発光化合物とを結合することによって検出可能に標識することができる。続いて、化学発光タグ付き抗体の存在は、化学的反応過程の際に生じる発光の存在を検出することによって決定される。特に有用な化学発光標識用化合物の例として、ルミノール、イソルミノール、セロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルが挙げられる。
【０１３３】
同様に、生物発光化合物は、本発明の抗体を標識するために用いることができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を高める、生物系に存在する化学発光の一種である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することによって決定される。標識に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンである。
【０１３４】
本発明の抗体分子は、「２部位（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）」又は「サンドイッチ」アッセイとしても知られている免疫測定法における利用に適応することができる。一般的な免疫測定法において、大量の非標識抗体（又は抗体断片）が固体の支持体又は担体に結合し、大量の検出可能に標識された可溶性抗体が添加されて、固相抗体、抗原及び標識抗体の間に形成された三元複合体の検出及び／又は定量化を可能にする。
【０１３５】
本発明の抗体は、多くの異なる癌のイメージングに用いるために放射標識してもよい。Ｉｎ１１１及びＴｃ９９等、放射性同位元素は、抗体標識及びイメージング技法による可視化に用いられる。放射免疫シンチグラフィ（ＲＩＳ）は、腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏイメージングを可能にする機能試験である。これは、放射標識抗体及び標準的なガンマシンチレーションカメラを用いて達成される。
【０１３６】
このように、本発明は、対象における腫瘍又は癌の存在の検出又は徴候のスクリーニングアッセイとして有用である。抗体又はその断片は、本明細書に記載されている検出可能なマーカーと直接コンジュゲートした場合、抗原（又はその断片）のｉｎ ｖｉｖｏにおける検出に用いて癌性細胞の存在を示し、診断される対象に注射してイメージングにより検出することによってイメージング技法を活用した可視化を行うことができる。
【０１３７】
さらに、本発明によって提供される抗体は、癌の治療においてそれ自体を、或いは組成物の一部として用いるために、細胞毒性薬物とコンジュゲートすることができる。
【０１３８】
したがって、上述の通り、本発明によって提供される抗体は、癌性又は前癌性細胞を殺傷するための毒性薬物の送達系として適している。
【０１３９】
細胞毒性薬物の一例は、抗体と直接的に、或いはリンカーを介して共有結合できる抗増殖性薬物分子であるが、前記抗体は、癌細胞に豊富な、或いは癌細胞によって分泌されるプロテアーゼにより必要に応じて特異的に切断され、その結果プロテアーゼの作用により癌細胞の内部、近隣又は癌細胞に抗増殖性薬物を優先的に放出することができる。
【０１４０】
抗増殖性薬物の例として、シクロホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、チオテパ、イホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メトトレキサート、５−フルオロウラシルシトシンアラビノシド、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン（ｉｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、プリカマイシン、エピポドフィロトキシンビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｌｅｓｔｉｎ）、エトポシド、テニポシド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、アドレノコルチコイド、エストロゲン、抗エストロゲン、プロゲスチン、アロマターゼ阻害剤、アンドロゲン、抗アンドロゲン、ダカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、ミトタン、プロカルバジド、シスプラスチン（ｃｉｓｐｌａｓｔｉｎ）、カルボプラチン、メルファラン、メトトレキサート及びクロラムブシルが挙げられる。
【０１４１】
或いは、抗体は、金属イオン（鉄又は亜鉛その他）等の特定の物質を腫瘍へと運ぶことができ、したがって毒性物質（前述の通り、放射性又は細胞毒性化学物質、即ち、リシン等の毒素、細胞毒性アルキル化剤又は細胞毒性プロドラッグ）を腫瘍へと送達するための手段又は担体として機能する。抗体と毒素又は放射性同位元素との結合は、化学的となることができる。直接結合した毒素の例として、ドキソルビシン、クロラムブシル、リシン、シュードモナス（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素等が挙げられる。ハイブリッド毒素は、抗原及び毒素に対して二重特異性を備えるよう作成することができる。このような二価分子は、腫瘍と結合して細胞毒性薬物を腫瘍へと送達するよう、或いはＴ３〜Ｔｉ受容体複合体との結合等、細胞毒性リンパ球と結合しこれを活性化するよう機能することができる。
【０１４２】
例３、４及び６並びにそれらの各図に示す通り、本発明の抗体は、細胞増殖を抑制することができる。
【０１４３】
したがって、別の一態様において、本発明は、有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を細胞と接触させる工程を含む、細胞増殖を抑制する方法を提供する。前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法であってもｅｘ ｖｉｖｏ法であってもよい。
【０１４４】
例６にも示す通り、本発明の抗体は、サイトカイン、特にＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０の発現を抑制することができる。
【０１４５】
よって、さらにまた別の一態様において、本発明は、有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を、前記サイトカインを発現する細胞と接触させる工程を含む、サイトカイン発現を抑制するための方法を提供する。前記方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法であってもｅｘ ｖｉｖｏ法であってもよい。
【０１４６】
特に、本発明は、炎症性サイトカインを抑制するための方法を提供する。
【０１４７】
炎症性サイトカインは、炎症を誘導することによって作用する。これらのサイトカインは、内因性発熱物質（ＩＬ１、ＩＬ６、ＴＮＦ−アルファ）として作用するか、マクロファージと間葉系細胞（線維芽細胞、上皮及び内皮細胞等）の両方により二次メディエーター及び炎症性サイトカインの合成を上方制御するか、急性期タンパク質の産生を刺激するか、或いは炎症性細胞を誘引する。
【０１４８】
炎症性サイトカインとして、ＩＬ−１、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子α）、ＩＮＦ−γ（インターフェロンγ）、ＴＮＦ−β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３が挙げられる。これらのサイトカインは、Ｔｈ１及びＴｈ２リンパ球の制御に関与する。
【０１４９】
ＴＮＦ−αの下方制御は特に、リウマチ様関節炎、ＩＢＤ及び乾癬等、自己免疫疾患の治療に重要であることが示されてきた。
【０１５０】
したがって、本発明の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体又はそれを含む組成物は、これらのヒト自己免疫疾患を治療するための非常に強力なツールである。
【０１５１】
これに関連し、本発明の抗体は、移植片拒絶並びに自己免疫疾患、神経変性疾患及び糖尿病の治療に用いることもできる。
【０１５２】
したがって、本発明は、治療上有効量のＫＴＰＡＦ５０特異抗体又はそれを含む組成物を、必要とする対象に投与する工程を含む、癌、自己免疫障害、移植片拒絶、神経変性障害及び糖尿病からなる群から選択された状態の治療方法を提供する。
【０１５３】
前記抗体で治療することのできる特定の自己免疫疾患は、ＩＢＤ、リウマチ様関節炎及び乾癬である。
【０１５４】
神経変性障害は、運動系、感覚系又は認知系における選択的且つ対称的な神経細胞消失によって特徴付けられる慢性且つ進行性の障害である。神経変性障害の限定的なリストとして、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、家族性アミロイド多発ニューロパチー及びタウオパチーが挙げられる。
【０１５５】
糖尿病は、生物が十分なインスリンを産生しないことによる、或いは細胞が産生されたインスリンに応答しないことによる高血糖によって特徴付けられる。この高血糖は、多尿症（頻尿症）、多飲症（口渇増大）及び過食症（空腹感増大）の古典的な症状を呈す。３種の主要な糖尿病の型は、身体がインスリンを産生できないことによる、インスリン投与によって治療できる１型糖尿病、インスリン抵抗性による２型糖尿病及びそれ以前には糖尿病に罹ったことのない妊婦が妊娠中に高血中グルコースレベルを有する妊娠糖尿病である。真性糖尿病の他の形態に、インスリン分泌の遺伝的欠陥による先天性糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病、高用量の糖質コルチコイドによって誘導されるステロイド糖尿病及び数種類の形態の一遺伝子性糖尿病がある。
【０１５６】
本発明は、既に診断された癌の予後評価に用いることのできる方法も提供する。特に、治療の前、最中及び後の経過観察に重要である。或いは、特に検査される試料が、患者から得ることのできる最も「患者に優しい」タイプの試料の１つである血液試料である場合、前記方法は、癌のスクリーニングにも適切である。
【０１５７】
したがって、さらにまた別の一態様において、本発明は、
ａ．対象から試料を得る工程と、
ｂ．前記試料を本発明に係る少なくとも１種類の抗体、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体又はそれを含む組成物と接触させる工程と、
ｃ．前記少なくとも１種類の抗体とその特異抗原との複合体の形成を検出手段により検出する工程と、
を含む、対象における癌の診断のための方法であって、複合体の検出が、前記対象が癌に罹患していることを示す方法を提供する。
【０１５８】
本明細書において対象について言及する場合、前記対象は、哺乳類、ヒト又は非ヒトとなることができる。非ヒト哺乳類は、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット等を含むが、これらに限定されるものではない。通常、対象は、ヒト、特に患者又は健常者である。
【０１５９】
本発明の診断方法の一実施形態において、前記試料は血液試料である。
【０１６０】
抗ＫＴＰＡＦ５０抗体又はそれを含む組成物を利用する、本発明の前記診断方法のさらに別の一実施形態において、前記癌は、肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択される。
【０１６１】
したがって、本発明は、癌治療の有効性のモニタリング方法も提供する。治療の有効性のモニタリングは、癌治療の予後評価に必要である。したがって、本明細書に示されている診断方法は、癌治療の前、最中及び後の対象において有効となることができ、各時点で得られた結果の解析（少なくとも２種の抗原−抗体複合体の間の関係性のパターン）は正常集団における同一複合体のパターンと比較される。対象のパターンが正常集団のパターンと最も近似であることは、治療の成功を示す。
【０１６２】
本明細書に言及されている癌治療は、放射線療法、化学療法等を含む、疾患を根絶するためのあらゆる治療に関する。
【０１６３】
本発明の抗体は、本発明の抗体を互いに組み合わせて又は他の抗体と組み合わせて用いることのできる、ヒト及びマウス免疫系において免疫応答を誘導する化合物のハイスループットスクリーニング並びに特に消化器系において、或いは同様に他の系において炎症及び癌を誘導する化合物のスクリーニングのための多重免疫測定法に用いることもできる。多重免疫測定法は、当業者に知られており、とりわけＡｎｄｅｒｓｏｎ及びＤａｖｉｓｏｎ［Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＤａｖｉｓｏｎ（１９９９年）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：１０１７〜１０２２］によって記載されている。
【０１６４】
本発明を説明するための本明細書において、「腫瘍」、「癌」、「悪性増殖性障害」及び「悪性腫瘍」は、全て等しく組織又は器官の肥厚化に関する。組織がリンパ性又は免疫系悪性細胞の一部である場合、循環細胞の非固体腫瘍を含み得る。他の組織又は器官の悪性腫瘍は、固体腫瘍を生じ得る。一般に、非固体及び固体腫瘍は、例えば、癌腫、黒色腫、白血病及びリンパ腫である。
【０１６５】
癌及び腫瘍は、慢性骨髄性白血病や成熟に伴う急性骨髄性白血病等の骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、好塩基球増加を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病、バーキット病や非ホジキン病等の悪性リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病や慢性リンパ球性白血病等のリンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、良性髄膜腫等の固体腫瘍、唾液腺の混合腫瘍、口唇及び口腔における腫瘍、咽頭、喉頭、副鼻腔、結腸腺腫、小細胞肺癌等の腺癌、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸肉腫、脂肪肉腫、粘液性滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液性軟骨肉腫、ユーイング腫瘍、精巣及び卵巣未分化胚細胞腫を含む他の腫瘍、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性黒色腫、中皮腫、乳癌、皮膚癌、前立腺癌及び卵巣癌、眼瞼の癌腫、結膜の癌腫、結膜の悪性黒色腫、ぶどう膜の悪性黒色腫、網膜芽細胞腫、涙腺の癌腫、眼窩、脳、脊髄、脈管系の肉腫、血管肉腫並びにカポジ肉腫を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１６６】
癌の検出、診断、予後評価、スクリーニング及び治療のための本明細書に記載されている方法は、癌におけるいずれのステージにも適している。
【０１６７】
別の一実施形態において、本方法は、癌の任意のステージで実施され、他の現在利用されている特に癌診断のための技法と比べて最も有利である。例えば、技術的に患者に不快感をもたらし、その上比較的高度な偽陽性結果を生じる（これは、言い換えると、さらに生検にかけられる多くの患者が必要のない不安にかられる）マンモグラフィーと比較した場合、本発明に記載されている診断方法は血液検査に基づき、より低い偽陽性結果の発生率の可能性がある。あらゆる現在のマクロレベルの診断ツール、マンモグラム、デジタル直腸試験（ＤＲＥ）及び超音波（それぞれ乳癌、前立腺癌及び卵巣癌のため）は、疑わしい腫瘍体積が既に視覚的に検出可能なサイズに発達した後にようやく癌を診断する能力を有し、これは患者の生存率の低下及び生活の質の低下をもたらす。例えば、米国単独では、乳癌のために年間約３千万件のマンモグラフィー手順が行われ、疑わしい乳房の病変を有する女性に百万件を超える外科的乳房生検が行われる。
【０１６８】
この点について、癌のステージ分類体系に精通していることが重要である。ステージ分類は、癌がどのように発生するかについての知見に基づく。癌細胞は、無秩序に、或いは腫瘍を形成するよう分裂、増殖する。腫瘍が増殖するにつれ、近傍器官及び組織に浸潤できるようになる。癌細胞は腫瘍から離脱し、血流又はリンパ系に進入することもできる。血流又はリンパ系を通って移動することにより、癌は原発部位から広がって、他の器官において新しい腫瘍を形成することができ、これは転移と呼ばれている。
【０１６９】
大部分の種類の癌は、ＴＮＭ（腫瘍サイズ、リンパ節の関与、転移）表示を有するが、一部の癌にはない。例えば、脳及び脊髄の癌は、その細胞型及びグレードに応じて分類される。異なるステージ分類体系がリンパ腫等、多くの血液又は骨髄の癌に用いられる。アナーバー（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）ステージ分類は、リンパ腫のステージ分類に一般に用いられ、ＡＪＣＣ（対癌米国合同委員会）及びＵＩＣＣ（国際対癌連合）の両方によって採用された。しかし、大部分の種類の白血病等、他の血液又は骨髄の癌は、明快なステージ分類体系を持たない。世界産婦人科連合によって開発された別のステージ分類体系は、子宮頸部、子宮、卵巣、膣及び外陰の癌のステージ分類に用いられる。この体系は、ＴＮＭ式を用いる。その上、小児癌は、ＴＮＭ体系か、或いは小児治験を行うグループである小児腫瘍学グループ（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）のステージ分類基準のいずれかを用いてステージ分類される。
【０１７０】
ＴＮＭステージ分類体系は、次の通りである。Ｔは腫瘍サイズ及び近傍組織で浸潤したかを表し、Ｎは関与する任意のリンパ節を表し、Ｍは転移の存在を表す。
原発腫瘍（Ｔ）
ＴＸ 原発腫瘍を評価できない
Ｔ０ 原発腫瘍の証拠なし
Ｔｉｓ 原位置の癌腫（近隣の組織へと広がっていない早期癌）
Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４ 原発腫瘍のサイズ及び／又は程度
局所リンパ節（Ｎ）
ＮＸ 局所リンパ節を評価できない
Ｎ０ リンパ節の関与なし（リンパ節において癌は発見されない）
Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３ 局所リンパ節の関与（拡散の数及び／又は程度）
遠隔転移（Ｍ）
ＭＸ 遠隔転移を評価できない
Ｍ０ 遠隔転移なし（癌は身体の他の部分へと広がっていない）
Ｍ１ 遠隔転移（癌は身体の他の部分へと広がっている）
【０１７１】
ＴＮＭ体系に従った一例は、例えば乳癌Ｔ３Ｎ２Ｍ０であり、これは乳房外部の近傍リンパ節に広がったが、身体の他の部分には広がっていない大きな腫瘍を意味する。前立腺癌Ｔ２Ｎ０Ｍ０は、腫瘍が前立腺内のみに局在し、リンパ節又は身体の他のいかなる部分にも広がっていないことを意味する。
【０１７２】
ＮＣＩの監視疫学遠隔成績プログラム（ＳＥＥＲ）等、多くの癌登録は、概要ステージ分類を利用する。この体系は、あらゆる種類の癌に用いられる。これは、癌症例を５つの主要カテゴリーに分類する。
− 原位置型は、癌が最初に生じた細胞層にのみ存在する早期癌である。
− 局在型は、癌が最初に生じた器官に限定された拡散の証拠のない癌である。
− 局所型は、元々の（原発）部位を越えて近傍リンパ節又は器官及び組織へと広がった癌である。
− 遠隔型は、原発部位から遠隔器官又は遠隔リンパ節へと広がった癌である。
− 不明は、ステージを示すのに十分な情報がない症例の説明に用いられる。
【０１７３】
別の一般に用いられるステージ分類体系は、ローマ数字を用いる。
ステージ０：原位置の癌腫（癌が最初に生じた細胞層にのみ存在する早期癌）。
ステージＩ、ＩＩ及びＩＩＩ：数字が大きくなる程、より広範の疾患、より大型の腫瘍サイズ及び／又は癌の原発腫瘍に隣接する近傍リンパ節及び／又は器官への拡散を示す。
ステージＩＶ：癌が別の器官へと広がった。
【０１７４】
よって、本発明によって提供される癌の診断及び検出方法、例えば本明細書に記載されている標識抗体を用いた方法も、腫瘍のステージ分類に非常に有用である［腫瘍は増殖につれて変化するため］。例えば、これは、特に癌の初期に他の現在利用できる技法によって検出できない増殖の検出及び／又は位置の特定を可能にする。
【０１７５】
よって、さらにまた別の一態様において、本発明は、対象における自己免疫疾患の診断のための方法であって、
ａ．対象から試料を得る工程と、
ｂ．前記試料を本発明に係る少なくとも１種類の抗体、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体又はそれを含む組成物と接触させる工程と、
ｃ．前記少なくとも１種類の抗体とその特異抗原との複合体の形成を検出手段により検出する工程と、
を含み、それにより、複合体の検出が、前記対象が自己免疫疾患に罹患していることを示す方法を提供する。
【０１７６】
上述の方法は、複合体の検出及び治療中の異なる時点（治療前、治療中及び治療後）におけるそのレベルの比較が自己免疫疾患に罹患している又は罹患する可能性のある対象における治療効率及び結果の評価を提供する、自己免疫疾患の予後に適用することもできる。
【０１７７】
本発明の前記診断方法の一実施形態において、前記試料は血液試料である。
【０１７８】
本明細書において定義されている通り、「試料」は、対象、一般には哺乳類の対象から得られる任意の試料を意味する。生物試料の例として、体液及び組織検体が挙げられる。試料ソースは、血液、血清、血漿、母乳、膿汁、脳脊髄液、スワブ、擦り取った組織、洗液、尿、糞便、体腔の洗浄によって得られたリンス液、痰、身体の各領域（咽頭、膣、耳、眼、皮膚、リンパ節その他等の痛みのある組織）から採取したスワブ等の生理的媒体に由来し得る。組織検体は、脾臓、リンパ節及び任意のリンパ球含有組織の生検を含む。
【０１７９】
本明細書及び特許請求の範囲における用語「試料」は、本明細書において広義で用いられている。
【０１８０】
一般に、スワブ及び先験的に液体ではない試料は液体媒体と接触され、次にこれが検出剤と接触させられる。
【０１８１】
本発明の特定の一実施形態において、本発明の方法において用いられる前記試料は、体液又は培養由来試料の内いずれか１種類である。
【０１８２】
培養由来試料は、細胞抽出物、培地試料又は体液由来の培養物、例えば血液試料培養物となることができる。
【０１８３】
「全血」とは、動物又はヒトから採取された血液を意味する。全血は、ヘパリン、ＥＤＴＡ、クエン酸又は凝血及び凝固を抑制するその他の物質を用いて採取してよい。
【０１８４】
生物試料は、ニトロセルロース等の固相支持体若しくは担体又は細胞、細胞粒子若しくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固体支持体若しくは担体で処理することができる。上述の通り、次に支持体又は担体は、適切なバッファーで洗浄され、続いて本発明に係る検出可能に標識された抗体で処理される。次に、固相支持体又は担体は、バッファーで２回目の洗浄を行い、非結合抗体を除去する。次に、結合した抗原又は前記固体支持体若しくは担体上の標識の量は、従来の手段によって検出することができる。
【０１８５】
「固相支持体」、「固相担体」、「固体支持体」、「固体担体」、「支持体」又は「担体」により、抗原又は抗体と結合できるあらゆる支持体又は担体が企図されている。良く知られた支持体又は担体として、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロンアミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド並びにマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、ある程度可溶性であっても、或いは本発明の目的のため不溶性であってもよい。支持体材料は、そこに結合した分子が抗原又は抗体と結合できる限り、実質的にどの可能な構造形態であってもよい。したがって、支持体又は担体の形態は、ビーズ等の球状、試験管の内部表面等の円柱状又は棒状体の外表面であってよい。同一チューブ内の異なる抗原に対して、異なる担体が用いられ得る。或いは、表面はシート、試験紙等のように平坦であってもよい。特定の支持体又は担体は、ポリスチレンビーズを含む。当業者であれば、抗体又は抗原を結合するための他の多くの適切な担体を知っている、或いはルーチン実験の使用により同を確認できるであろう。
【０１８６】
洗浄、撹拌、振盪、濾過等、他の工程が、通例として、或いは特定の局面に必要なものとしてアッセイに加えられてよい。
【０１８７】
本明細書に定義されている「培養液」は、本発明を実施するための試料の維持に用いることのできる任意の培地を意味し、好ましくは適切な抗生物質及びグルタミン、並びに必要に応じて抗真菌剤、非必須アミノ酸、ＤＴＴ、ピルビン酸ナトリウム等の他の添加物を添加した、ウシ（ｃａｌｆ／ｂｏｖｉｎｅ）胎仔血清を含む或いは含まないＲＰＭＩ１６４０を含むが、これに限定されるものではない。本発明の実施に用いることのできる他の培養液は、イーグル、ダルベッコ、ＭｃＣｏｙ、Ｍｅｄｉａ１９９、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地及び添加物あり又はなしの無血清培地を含むが、これらに限定されるものではない。別の一実施形態において、培地に刺激物質は含まれていない。
【０１８８】
本発明は、必要とする対象に治療上効果的な投与量の本発明の抗体を投与する工程を含む、癌治療の方法も提供する。特に、前記抗体は、治療に用いる場合、細胞毒性薬物とコンジュゲートされる、或いは毒性物質を標的細胞へ送達するための担体として機能する。これに関連して、標的細胞は本発明の抗体によって認識される細胞であり、これは腫瘍関連抗原を発現する細胞を意味し、したがって異常増殖に関連する。
【０１８９】
さらにまた別の一態様において、本発明は、次の構成要素、
ａ．本発明の本明細書に記載されている少なくとも１種類の抗体又はそれを含む組成物と、
ｂ．前記抗体によって特異的に認識される抗原の、試料における存在の検出を行うための取扱説明書と、
を含む、癌の診断、治療有効性のモニタリング又は予後評価の内いずれか１つのためのキットを提供する。
【０１９０】
前記キットは、次の構成要素、
ａ．検査する試料を採取するための少なくとも１つの手段と、
ｂ．前記抗体による前記抗原の前記認識の検出に必要な少なくとも１種類の試薬と、
ｃ．少なくとも１種類の対照試料と、
の内少なくとも１つをさらに含むことができる。
【０１９１】
本発明は、癌の診断及び／又は予後評価のためのキットも提供する。
【０１９２】
キットは、基本的に対象における腫瘍抗原特異抗体を検出するためのものである。対象は、哺乳類、ヒト又は非ヒトであってよい。通常、対象はヒト患者、癌患者又は健常者である。
【０１９３】
別の一態様において、本発明は、次の構成要素、
ａ．本発明の本明細書に記載されている少なくとも１種類の抗体又はそれを含む組成物と、
ｂ．前記抗体によって特異的に認識される抗原の、試料における存在の検出を行うための取扱説明書と、
を含む、自己免疫疾患の診断、治療有効性のモニタリング及び予後の内少なくとも１つのためのキットも提供する。
【０１９４】
同様に、前記キットは、次の構成要素、
ａ．検査する試料を採取するための少なくとも１つの手段と、
ｂ．前記抗体による前記抗原の前記認識の検出に必要な少なくとも１種類の試薬と、
ｃ．少なくとも１種類の対照試料と、
の内少なくとも１つをさらに含むことができる。
【０１９５】
一実施形態において、このようなキットは、例えば、ＥＬＩＳＡキット等、適切であれば固体支持体、本発明に定義されている少なくとも１種類の抗体及び必要に応じて二次抗体を含む抗体（又は認識用薬剤）捕捉アッセイキットである。キットは、上述の通り、検出可能な成分、酵素基質及び発色試薬等、その他必要な試薬をさらに必要に応じて含むことができる。或いは、抗体捕捉診断キットは、本明細書に記載されている構成要素及び試薬を一般に含むイムノブロットキットである。本発明の診断キットに含まれている特定の試薬及び他の構成要素は、キットで実施される特異的診断方法に従った、本技術分野で利用できる試薬及び他の構成要素から選択することができる。このようなキットは、組織又は体液、特に全血、ＰＢＭＣ或いは対象から採取された培養前及び／又は後の白血球等、生物試料における抗体の検出に用いることができる。
【０１９６】
本発明の方法において「適切な手段」と記載されている場合、前記適切な手段は、とりわけ免疫親和性手順、酵素アッセイ又は構造的特色を検出するための手段となることができる。
【０１９７】
前記適切な手段が免疫親和性手順である場合、前記手順は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降法、ＦＡＣＳ又は本発明に記載されている抗体を利用するその他免疫親和性手順の内いずれか１種類である。
【０１９８】
特定の一実施形態において、検出は捕捉ＥＬＩＳＡによって達成される。
【０１９９】
捕捉ＥＬＩＳＡ（「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡとしても知られている）は、ピコグラムからマイクログラム量の物質（ホルモン、細胞シグナル伝達化学物質、感染症抗原及びサイトカイン等）を定量化するための高感度アッセイである。この種のＥＬＩＳＡは、解析される物質がポリスチレンマイクロタイタープレートと結合するには希釈され過ぎた（細胞培養上清中のタンパク質等）場合、或いはプラスチックと十分に結合しない（有機小分子等）場合に特によく用いられる。抗体、試料、対照及び検出用抗体の捕捉に最適な希釈並びにインキュベーション時間は経験的に決定され、広範な用量設定を必要とし得る。理想的には、酵素標識された検出用抗体が用いられる。しかし、検出用抗体が非標識である場合、二次抗体は、コーティング用抗体又は試料のいずれかと交差反応してはならない。適切な陰性及び陽性対照も含まれるべきである。
【０２００】
用いられる捕捉又はコーティング用抗体は、炭酸−重炭酸バッファー又はＰＢＳで希釈するべきである。捕捉用抗体は通常、０．２〜１０μｇ／ｍｌで蒔かれる。アフィニティー精製された抗体を用いる、或いはＩｇＧ画分を最小限用いることが好ましい。一般に、試料は、１０ｎｇ〜１０μｇ／ウエル範囲（アッセイの感度が高くなる程、より少量の試料が必要とされる）になるようＰＢＳで希釈される。
【０２０１】
本明細書において、用語「検出可能な成分」は、任意の原子、分子又はそれらの一部を意味し、その存在、不在又はレベルは、直接又は間接的にモニターすることができる。一例として、放射性同位元素が挙げられる。他の例として、（ｉ）変色又は光放射（発光）反応を触媒できる酵素及び（ｉｉ）フルオロフォアが挙げられる。例えば、フルオロフォアの場合等、検出可能な成分それ自体が検出可能であれば、検出可能な成分の検出は直接的となることができる。或いは、検出可能な成分の検出は間接的であってもよい。後者の場合、それ自身が直接的に検出可能である、検出可能な成分と反応する第二の成分が好ましくは用いられる。検出可能な成分は、抗体固有のものとなることができる。例えば、抗体定常部は、直接的に検出可能な成分を備える二次抗体が特異的に結合することのできる、間接的に検出可能な成分として機能することができる。
【０２０２】
このように、二次抗体は、本発明の方法における抗体の検出に特に適した手段である。この二次抗体は、それ自体が検出可能な成分とコンジュゲートすることができる。本発明に係る抗体が検出可能に標識され得る一方法は、同を酵素と結合することによるものである。同様に、この酵素は、その後適切な基質に曝露されるのであれば、例えば、分光光度的、蛍光定量的又は視覚的手段により検出され得る化学的成分を生成するような仕方で基質と反応するであろう。抗体の検出可能な標識に用いることのできる酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、アルファ−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定されるものではない。
【０２０３】
検出は、酵素に対する発色性基質を用いる比色法によって達成することができる。検出は、同様に調製した標準と比較した、基質の酵素反応の程度の視覚的比較によって達成することもできる。
【０２０４】
第一の抗体が結合する固体支持体は、任意の水に不溶性で水に懸濁不能の固体支持体となることができる。適切な固体支持体の例として、例えばポリスチレン製の大型のビーズ、濾紙、試験管及びマイクロタイタープレートが挙げられる。第一の抗体は、共有結合又は吸着によって固体支持体と結合することができる。固体支持体を用いることの利点は、固相と液相の分離のための遠心分離工程の必要がないことである。
【０２０５】
上述の固体支持体は、ポリスチレン、アガロース、セファロース、セルロース、ガラスビーズ及び磁化可能なセルロース粒子その他のポリマー等、ポリマーを含むこともできる。固体支持体は、大型又は小型のビーズ又は粒子、チューブ、プレートその他の形状となることができる。
【０２０６】
固体支持体として、好ましくはその内壁が第一の抗体、例えば本発明のために本発明者らによって調製された特異的な抗体又はその任意の断片若しくは誘導体でコーティングされたマイクロタイタープレートの試験管からなるものが用いられる。
【０２０７】
本発明の方法において用いられている「決定」の言及は、評価、定量化、計算又は特定の試料中に存在するバイオマーカー量に由来するその他を含む。これは、例えば、検出可能な産物の出現、例えば基質レベルの任意の検出可能な変化、又は産物出現若しくは基質消失率の任意の変化となることのできる終点指示を測定することにより、或いは本発明に記載のバイオマーカーと結合した抗体量を測定することにより達成することができる。
【０２０８】
前記検査キットの全てにおいて、検査される試料を採取するための前記手段は、スワブ、ピペット又は類似の採取手段となることができ、前記インキュベーション手段は、プレート、試験管、ガラス若しくはプラスチック表面、ウエル又は吸取り紙片上に置かれた液体又は半流動性培養液、或いは同様の手段となることができる。
【０２０９】
いかなる型式のキットも、検査が走査装置上で行われ、結果がコンピュータにリアルタイムで送り込まれるようにも設計されていることを理解するべきである。これは、全情報が関係者全員に直接メールされ、後に参照できるよう無編集で保存されることを確実にするであろう。
【０２１０】
キットの別の一実施形態において、前記試料は、体液及び培養由来試料のいずれか１種類である。
【０２１１】
本発明の抗体と接触させられる試料は、アレイに配置することができる。
【０２１２】
本発明の方法及びキットに用いられている用語「アレイ」は、認識用薬剤、即ち本発明の抗体の内少なくとも１つの「アドレス指定された」空間配置を意味する。アレイの各「アドレス」は、認識用薬剤を含有する所定の特定の空間領域である。例えば、アレイは、そのそれぞれが異なる抗体を含有する複数の容器（試験管）、プレート、マイクロプレートのマイクロウエルとなることができる。アレイは、別個の領域（点、線、カラム）において異なる且つ公知の認識用薬剤、例えば抗体を保持する任意の固体支持体となることもできる。アレイは、好ましくは、作り付けの適切な対照、例えば試料なし領域、抗体なし領域、どちらもない領域、即ち溶媒及び試薬のみ領域並びに抗体によって認識される合成又は単離されたタンパク質又はペプチド（陽性対照）を含む領域を含む。本発明のアレイに用いられる固体支持体は、本発明によって提供されるキットに関連して、本明細書において後により詳細に説明される。
【０２１３】
本発明のキットにおける使用に適した固体支持体は、一般に、実質的に液相に不溶性である。本発明の固体支持体は、特定の種類の支持体に限定されない。むしろ、多数の支持体が利用でき、当業者に知られている。よって、有用な固体支持体は、エーロゲル及びハイドロゲル等の固体及び半流動性マトリックス、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜コーティングされたバイオチップ等）、マイクロ流体チップ、シリコンチップ、マルチウエルプレート（マイクロタイタープレート又はマイクロプレートとも言う）、メンブレン、フィルター、導電性及び非導電性金属、ガラス（顕微鏡用スライド等）並びに磁性支持体を含む。有用な固体支持体のさらなる具体例として、シリカゲル、ポリマーメンブレン、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、セファロース等の多糖類、ナイロン、ラテックスビーズ、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプン等が挙げられる。
【０２１４】
本発明の方法及びキットのいずれかに含まれている試薬のいずれかが、上述の固体支持体材料のいずれかに包埋、連結、接続、結合、配置又は融合された試薬として提供され得ることに、さらに留意するべきである。
【０２１５】
本発明の方法及びキットによって用いられる任意の抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、組換え、例えば本発明の抗体に由来するキメラ若しくは単鎖抗体（ＳｃＦｖ）であってよいことに留意するべきである。
【０２１６】
本発明は、その内容が本明細書の開示内に含まれているものとして読解される、特許請求の範囲によって規定される。
【０２１７】
開示され、記載されている通り、本発明は、本明細書において開示されている特定の実施例、工程段階及び材料に限定されないことを理解するべきであり、これはこのような工程段階及び材料はある程度変化する可能性があるためである。本明細書における用語使用は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲及びその均等物によってのみ限定されるため、これは限定を企図しないことも理解するべきである。
【０２１８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において、その内容が明らかにそれ以外を示さない限り、単数形は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。
【０２１９】
本明細書及び続く特許請求の範囲を通じて、文脈がそれ以外を必要としない限り、語句「含む」並びに「含んだ」及び「含んでいる」等の変化形は、記載された整数若しくは工程又は整数若しくは工程群の包含を暗示するが、その他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程群の除外を暗示しないことが理解される。
【０２２０】
次の実施例は、本発明者らによって本発明の態様の実施に用いられる技法の代表例である。これらの技法は本発明の実施のための好ましい実施形態の例示であるが、当業者であれば、本開示を考慮し、企図された本発明の範囲から逸脱することなく多くの修正を行ってよいことを認識すると理解するべきである。
【０２２１】
他に規定されていない限り、本明細書に用いられているあらゆる技術及び科学用語は、本発明に関与する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。
【実施例】
【０２２２】
方法
例えばＥＬＩＳＡ等の多くの免疫学的技法は当業者によく知られており、例えばＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに詳細に記載されているため、本明細書における各事例において詳細には記載されない。
【０２２３】
一般的な分子生物学的方法
多くの分子生物学的技術の方法は当業者によく知られているため、本明細書において詳述されない。このような方法は、ＰＣＲ、ｃＤＮＡの発現、ヒト細胞のトランスフェクション等を含む。このような方法について説明する教科書は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ：０８７９６９３０９６；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８８年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．である。さらに、例えばウエスタンブロット等、多くの免疫学的技法は当業者によく知られているため、本明細書における各事例において詳細には記載されない。例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと。
【０２２４】
ＥＬＩＳＡ一般プロトコル
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、容易にアッセイされる酵素と結合した抗体又は抗原を用いることによって、抗体の特異性と簡便な酵素アッセイの感度とを組み合わせる。ＥＬＩＳＡは、抗原又は抗体濃度の有用な測定値を提供することができる。ＥＬＩＳＡは、５段階からなる手順である。１）マイクロタイタープレートウエルをＰＢＳで希釈した抗原でコーティングし、一晩４℃でインキュベートし、洗浄する。２）非結合部位をＰＢＳに溶解したＢＳＡ／ＦＣＳでブロッキングして偽陽性結果を抑制し、１時間インキュベートし、洗浄する。３）抗体をウエルに添加し、１時間インキュベートし、洗浄する。４）酵素とコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧを添加し、１時間インキュベートし、洗浄する。５）基質と酵素との反応が、発色産物を生成し、最終的に陽性反応を示す。
【０２２５】
ＦＡＣＳプロトコル
１．細胞を収集、洗浄し、氷冷ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、１％アジ化ナトリウム中に１〜５×１０６細胞／ｍｌ濃度になるよう懸濁液において調整した。
２．０．１〜１０μｇ／ｍｌの標識一次抗体を添加した。必要であれば、抗体を３％ＢＳＡ／ＰＢＳに希釈した。
３．細胞＋抗体を少なくとも３０分間室温又は４℃でインキュベートした。
４．４００ｇで５分間遠心分離し、５００μｌ〜１ｍｌの氷冷ＰＢＳ、１０％ＦＣＳ、１％アジ化ナトリウムに再懸濁することにより、細胞を３回洗浄した。
５．これにより、細胞はフローサイトメーターによる解析の準備が整った。
【０２２６】
ＫＴＰＡＦ５０検出のためのＥＬＩＳＡ手順
１．検量線：ＰＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号０２−０２３−５Ａ）中に２０００ｐｇ／ｍｌ〜３１ｐｇ／ｍｌとなるようＰＲＴ３の段階希釈液を調製した。
２．３７℃の水槽において試料を急速に解凍した。
３．７０μｌの２回複製した各血液試料（希釈されず）及び７０μｌの３回複製した標準試料をＭａｘｉｓｏｒｐ９６ウエルプレート（ＮＵＮＣ、Ｆ９６Ｍａｘｉｓｏｒｐ、カタログ番号４４２４０４）にロードし、４℃で一晩振盪しつつインキュベートした。
４．洗浄：３００μｌの０．０５％ＴＷ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ、カタログ番号０７７７−１Ｌ）／ＰＢＳでプレートを４回洗浄した。
５．ブロッキング：３００μｌのブロッキングバッファー、５％ＢＳＡ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号１６００６９）／ＰＢＳを各ウエルにロードし、室温で１時間、振盪しつつインキュベートした。
６．洗浄：工程＃４に同じ。
７．検出：ＫＴＰＡＦ５０特異抗体（アフィニティー精製した）を希釈液（ＰＢＳ中に０．０５％ＴＷ−２０、０．１％ＢＳＡを溶解）で１：２５０に希釈した。１００μｌの検出用抗体を各ウエルにロードし、室温で２時間、振盪しつつインキュベートした。
８．洗浄：上の工程＃４に同じ。
９．ＨＲＰコンジュゲート：ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、カタログ番号７０７４）を希釈液で１：２００に希釈した。１００μｌのＨＲＰコンジュゲートを各ウエルにロードし、３０分間、室温で振盪しつつインキュベートした。
１０．洗浄：４回ではなく５回洗浄する以外は上の工程＃４に同じ。
１１．発色：１００μｌのＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、西洋ワサビペルオキシダーゼ基質、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＥＳ００１−５００ＭＬ）を各ウエルに添加した。青色を呈色したら、５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、カタログ番号５５５２５４０）を添加した。
１２．プレート読取り：マイクロプレートリーダーにおいて、４５０ｎｍの吸光度を検査した。
【０２２７】
ポリクローナル抗体の調製
ポリクローナル抗体調製のための標準的なプロトコルを用いて、ポリクローナル抗体をウサギにおいて産生した。
【０２２８】
ＫＴＰＡＦ５０特異的ポリクローナル抗体の調製に用いた抗原は、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質Ｃ末端における最後の１４アミノ酸（ＥＫＧＡＡＦＳＰＩＹＰＲＲＫ）に対応するペプチドであり、これは配列番号３で表される配列に相当する。
【０２２９】
図１は、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体のその抗原に対する特異性の曲線を示す。
【０２３０】
ＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体の調製及びキャリブレーション
当業者に知られた抗体の標準的なプロトコルに従ってＧｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（米国テキサス州サン・アントニオ）により、ＫＴＰＡＦ５０に対するモノクローナル抗体をオーダーメイドした。次の通り、抗体親和性のキャリブレーションをＥＬＩＳＡにより行った。
１．ＫＴＰＡＦ５０ペプチドを１０００、５００、１００及び０ｎｇ／ｍｌになるようＰＢＳに希釈し、検量線を作製した。２枚のＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）ＥＬＩＳＡ Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｎｏ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ＃４４２４０４）においてこれらの濃度の液を２回複製して３０回分ロードした。プレートを一晩４℃で穏やかに振盪しつつインキュベートした。
２．インキュベーション後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（３００μｌ／ウエル）を用いてプレートを４回洗浄した。
３．３００μｌ／ウエルの１％ＢＳＡ／ＰＢＳをロードし、その後４℃で穏やかに振盪しつつ一晩インキュベーションすることによってウエルをブロッキングした。
４．インキュベーション後、工程２に記載の通りプレートを洗浄した。各ＫＴＰＡＦ５０希釈曲線において、各１００μｌの３０種のモノクローナルＫＴＰＡＦ５０抗体を２回複製してロードした。対照として、ポリクローナルＫＴＰＡＦ５０抗体（１：２５０希釈された）も各プレートにロードし、プレートを１時間３７℃でインキュベートした。
５．インキュベーション後、工程２に記載の通りプレートを洗浄した。０．１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳに１：２００希釈した５０μｌのペルオキシダーゼ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ＃１１５−０３５−２０６）を各ウエルにロードした。プレートを１時間３７℃でインキュベートした。
６．インキュベーション後、工程２に記載の通りプレートを洗浄した。１００μｌのＴＭＢ／Ｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＥＳ００１−５００ＭＬ）を各ウエルにロードし、１５分間３７℃でインキュベートした。
７．５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を各ウエルにロードした。
８．マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍでプレートの読取りを行った。
【０２３１】
ＴＤＳプロトコル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）による）
１．１００μｌ／ウエルの捕捉用抗体／コーティングバッファー（試薬セットに同封されている分析証明書に記されている通り希釈）でＣｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ９０１８ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした。プレートを密封し、一晩４℃でインキュベートした。
２．ウエルを吸引し、＞２５０μｌ／ウエルの洗浄バッファーで５回洗浄した。各洗浄工程の際に浸漬時間（約１分間）を設け、洗浄効果を高めた。吸取り紙で残渣バッファーをプレートから除去した。
３．１倍量の５×濃縮アッセイ希釈液を４倍量のＤＩ水で希釈した。ウエルを２００μｌ／ウエルの１×アッセイ希釈液でブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。
４．洗浄を５回繰り返した。
５．検量線のため、１００μｌ／ウエルの希釈標準を適切なウエルに添加し、最高濃度の標準から段階２倍希釈液を調製して検量線を作製した。１００μｌ／ウエルの試料を適切なウエルに添加した。プレートを被覆又は密封し、室温で２時間（或いは感度を最大にするため一晩４℃）インキュベートした。
６．洗浄を５回繰り返した。
７．１×アッセイ希釈液＊に希釈した検出用抗体を１００μｌ／ウエル添加した。プレートを密封し、室温で１時間インキュベートした。
８．洗浄を５回繰り返した。
９．１×アッセイ希釈液に希釈されたアビジン−ＨＲＰ＊を１００μｌ／ウエル添加した。プレートを密封し、室温で３０分間インキュベートした。
１０．最後の洗浄において、吸引前にウエルを洗浄バッファーに１〜２分間浸漬し、この洗浄を合計７回繰り返した。
１１．５０μｌの停止液１００μｌ／ウエルの基質溶液を各ウエルに添加した。プレートを室温で１５分間インキュベートし、反応を５０μｌの停止液で停止させた。
１２．プレートを４５０ｎｍで読み取った。波長の差し引きが可能であれば、４５０ｎｍの値から５７０ｎｍの値を差し引いてデータ解析を行う。
【０２３２】
Ｐｏｉｅｔｉｃｓ（登録商標）細胞の解凍手順
ＤＮａｓｅ Ｉは、培養細胞及び単核細胞の凝集を抑制するよう機能するため、培地に添加した。
１．凍結細胞のバイアルを３７℃ウォーターバスにおいて急速に解凍した。
２．最大２ｍｌの細胞懸濁液を５０ｍｌのコニカルチューブに無菌的に移した。
３．バイアルを１０％ＦＢＳ又は１％ＢＳＡ及び２０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉを含む１ｍｌの予め温めた培地でリンスした。
４．数滴の培地をそれぞれに添加した後穏やかに旋回させつつ、合計容量は５ｍｌとなった（＝３分間）。
５．培地をそれぞれに添加した後穏やかに旋回させつつ、１ｍｌ〜２ｍｌ容量の培地を滴下することによって増量を完了した（＝５〜１０分間）。
６．細胞懸濁液を２００×ｇにて室温で１５分間遠心分離した。
７．細胞ペレットを残りの培地に穏やかに再懸濁した。
８．洗浄培地により容量を徐々に増し、培地をそれぞれに添加した後に穏やかに旋回しつつ、１ｍｌ〜２ｍｌ容量の培地を添加することによりチューブを充填した。
９．細胞懸濁液を２００×ｇにて室温で１５分間遠心分離した。
１０．２ｍｌの洗浄液を慎重に取り除き、細胞ペレットを残りの２ｍｌの培地で穏やかに再懸濁した。細胞を計数した。細胞数が予想より少ない場合、必要であれば工程７で取り分けておいた上清でさらに洗浄を行って細胞を合わせてよい。
１１．細胞を１時間３７℃及び５％ＣＯ２にて静置し、２度目の計数を行い、次に培養に付した。
＊ＤＮａｓｅ添加のため、１０％ＦＢＳ及び２０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ Ｄ４５１３）を含む２０ｍｌの培地を調製するとよい。ＤＮａｓｅ含有培地を細胞の希釈に用いた。
【０２３３】
動物
Ｈａｒｌａｎ ＩｓｒａｅｌからＢａｌｂ／Ｃマウスを購入した。
【表３】
【０２３４】
（例１）
ヒト血液試料におけるＫＴＰＡＦ５０の検出
Ａｓｔｅｒａｎｄ（登録商標）から年齢５０〜６５歳の男女に由来する１９種のヒト血液血清試料を得た。９試料は肺癌患者で１０試料は健常者である。使用まで−８０℃より低温で全試料を維持した。
【０２３５】
ポリクローナル抗ＫＴＰＡＦ５０抗体を用いて、ＫＴＰＡＦ５０タンパク質の存在に関して血液試料を検査した。図２から理解できるように、ＫＴＰＡＦ５０の発現は、肺癌試料において有意に高かった。
【０２３６】
したがって、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体は、肺癌検出のための診断ツールとして用いることができる。
【０２３７】
（例２）
抗ＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体の作製
ＫＴＰＡＦ５０ペプチド（抗原１、２又は３、下表参照）又は全長ＫＴＰＡＦ５０タンパク質を抗原として用いてＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体を作製した。抗原を下の表１に記す。抗原２は、ポリクローナル抗体の調製と基本的に同様に用いられるが、そのＮ末端にプロリン、そのＣ末端にシステインを有する。抗体は、Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（米国テキサス州サン・アントニオ）に委託した。
【表４】
【０２３８】
Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（米国テキサス州サン・アントニオ）により３０種の異なるモノクローナル抗体が生産され、それらのＫＴＰＡＦ５０に対する親和性を検証した。
【０２３９】
表２は、各ハイブリドーマの抗原特異性をまとめる。
【表５】
【０２４０】
各モノクローナル抗体に対する親和性検量線の結果を表３にまとめる。
【表６−１】
【表６−２】
【０２４１】
（例３）
雌Ｂａｌｂ／Ｃ脾細胞の生存率におけるモノクローナルＫＴＰＡＦ５０抗体の効果
３０種のＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体を、脾細胞生存率におけるその効果に関して検査した。レサズリンアッセイを用いて生存率を検査した。
【０２４２】
手順：
１．１匹の雌Ｂａｌｂ／Ｃ（２０週齢）の脾臓を収集し、１×ＲＢＣ溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃００−４３３３）を用いて赤血球を溶解した。
２．細胞を２枚のＦ９６ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ＃１６７００８）に分配した。各プレートにおいて、２００μｌの核型分析培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ０１−２０１−１Ｂ）中に懸濁した５０，０００細胞を５×５ウエルにロードした。細胞を２４時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。
３．インキュベーション後、各ウエルに次の処理を５回複製して行った。
ａ．対照（抗ｐ５３抗体［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＣＳ−６５３３４］−１０μｌ）
ｂ．１００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｃ．１０００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｄ．１５μｌのα−ＫＴＰＡＦ５０ １（ハイブリドーマ３Ｅ３Ｇ７）
ｅ．１５μｌのα−ＫＴＰＡＦ５０ ２（ハイブリドーマ５Ｅ１１Ｈ３）
４．３７℃、５％ＣＯ２にて第一のプレートを２４時間インキュベートし、第二のプレートを４８時間インキュベートした。
【０２４３】
インキュベーション時間の後、２０μｌのレサズリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＡＲ００２）を各ウエルに添加し、プレートリーダーを用いて４及び２４時間目にウエルの蛍光（５３０／５９０ｎｍ）を検査した。
【０２４４】
結果を図３Ａ〜３Ｃに示す。基本的に、処理及びレサズリンによる４時間インキュベーションの２４時間後、細胞生存率は３Ｅ３Ｇ７及び５Ｅ１１Ｈ３で処理した培養においてそれぞれ５４％及び５８％に低下した（図６Ａ）。細胞生存率低下は、レサズリンによる２４時間インキュベーション後により一層顕著であり、３Ｅ３Ｇ７及び５Ｅ１１Ｈ３で処理した培養においてそれぞれ２９％及び３５％であった（図６Ｂ）。
【０２４５】
ＫＴＰＡＦ５０特異抗体による４８時間処理は、細胞生存率を２４時間処理と同様の程度まで低下させた（図６Ｃ）。
【０２４６】
結果は、ＫＴＰＡＦ５０に対するモノクローナル抗体がＢａｌｂ／Ｃ脾細胞の生存率を大幅に低下できることを明らかに示し、これはＫＴＰＡＦ５０がマウス脾細胞の生存率維持に中心的役割を果たすことを示唆する。特異的モノクローナル抗体によるＫＴＰＡＦ５０活性の中和は、マウスにおいて誘導された自己免疫疾患を治療するための非常に強力なツールとして機能する。同様に、ＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体は、ヒト治験において用いられるであろう。
【０２４７】
（例４）
Ｃ５７／ｂｌａｃｋ脾細胞の生存率におけるモノクローナルＫＴＰＡＦ５０抗体の効果
３０種のＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体を、脾細胞生存率におけるその効果に関して検査した。レサズリンアッセイを用いて生存率を検査した。
【０２４８】
手順：
１．１匹の雌及び１匹の雄Ｃ５７／ｂｌａｃｋ（８週齢）の脾臓を収集し、１×ＲＢＣ溶解バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃００−４３３３）を用いて赤血球を溶解した。
２．細胞を２枚のＦ９６ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ＃１６７００８）に分配した。各プレートにおいて、２００μｌの核型分析培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−２０１−１Ｂ）中に懸濁した５０，０００細胞を５×５ウエルにロードした。細胞を２４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
３．インキュベーション後、各ウエルに次の処理を５回複製して行った。
ａ．対照（抗ｐ５３抗体［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＣＳ−６５３３４］−１０μｌ）
ｂ．１５μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ １（抗体５Ｅ１１Ｈ３）
ｃ．１５μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ ２（抗体３Ｅ３Ｇ７）
ｄ．１００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｅ．５００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
４．３７℃、５％ＣＯ２にて第一のプレートを２４時間インキュベートし、第二のプレートを４８時間インキュベートし、第三のプレートを７２時間インキュベートした。
５．インキュベーション時間の後、２０μｌのレサズリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＡＲ００２）を各ウエルに添加し、４及び２４時間目にプレートリーダーを用いて蛍光（５３０／５９０ｎｍ）を測定した。
【０２４９】
結果を図７Ａ〜７Ｆに示す。基本的に、処理及びレサズリンによる２４時間インキュベーションの２４時間後、雄由来の細胞における細胞生存率は、５Ｅ１１Ｈ３及び３Ｅ３Ｇ７で処理した培養において３６％に低下し（図４Ａ）、雌由来の細胞における細胞生存率は５Ｅ１１Ｈ３及び３Ｅ３Ｇ７で処理した培養においてそれぞれ５２％及び５８％に低下した（図４Ｂ）。ＫＴＰＡＦ５０特異抗体による４８時間処理は、雄と雌両方の細胞の細胞生存率を雌における２４時間処理と同様の程度まで低下させた（図４Ｃ及び４Ｄ）。
【０２５０】
抗体による処理を延長（７２時間処理）しても、さらなる細胞生存率低下は示されなかった（図４Ｅ及び４Ｆ）。
【０２５１】
結果は、ＫＴＰＡＦ５０に対するモノクローナル抗体がＣ５７Ｂｌ／６脾細胞の生存率を大幅に低下できることを明らかに示し、これはＫＴＰＡＦ５０がマウス脾細胞の生存率維持に中心的役割を果たすことを示唆する。特異的モノクローナル抗体によるＫＴＰＡＦ５０活性の中和は、マウスにおいて誘導された自己免疫疾患を治療するための非常に強力なツールとして機能する。同様に、ＫＴＰＡＦ５０特異的モノクローナル抗体は、ヒト治験において用いられるであろう。
【０２５２】
（例５）
ＫＴＰＡＦ５０抗体による処理に加えて、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて上清中のＫＴＰＡＦ５０の存在に関して細胞を評価した。
【０２５３】
手順：
１．セクションＡ（手順の工程４）から得られた２４時間対照試料をＭａｘｉｓｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ＃４４２４０４）上にロードした。各ウエルにつき１００μｌを３回複製した。ゼロ基準として、核型分析培地も３回複製してロードした。定量化のため、ＰＲＴ３の段階希釈液もロードした（２０００〜６３ｐｇ／ｍｌ）。プレートを４℃で一晩インキュベートした。
２．インキュベーションの後、マルチピペットを用いてプレートを３００μｌの０．０５％ＴＷ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ ＃０７７７−１Ｌ）／ＰＢＳで４回洗浄した。
３．５％ＢＳＡ（ＭＰ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ＃１６００６９）／ＰＢＳを用いてプレートをブロッキングした。３００μｌを各ウエルにロードした。Ｒ．Ｔ．で１時間、振盪しつつインキュベーションした。
４．工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
５．ＰＲＴ３ポリクローナル抗体（アフィニティー精製された）を希釈液（０．０５％ＴＷ−２０、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で１：２５０希釈した。１００μｌの抗体を各ウエルにロードした。プレートをＲ．Ｔ．で２時間、振盪しつつインキュベートした。
６．工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
７．ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、７０７４）を希釈液で１：２００希釈した。１００μｌのＨＲＰコンジュゲートを各ウエルにロードした。プレートを３０分間、Ｒ．Ｔで振盪しつつインキュベートした。
８．４回ではなく５回洗浄する以外は工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
９．１００μｌのＴＭＢ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）、ＥＳ００１−５００ＭＬ）を各ウエルにロードし、発色後に５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、５５５２５４０）をロードして反応を停止させた。
１０．マイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０２５４】
結果を図５に示すが、これは上清中のｍＫＴＰＡＦ５０の存在を確認する。
【０２５５】
（例６）
ヒト単球におけるモノクローナルＫＴＰＡＦ５０抗体の効果
ヒト単球におけるＫＴＰＡＦ５０抗体の効果を、細胞生存率、サイトカイン発現、上清中のＫＴＰＡＦ５０タンパク質の存在及び細胞形態に関して解析した。
【０２５６】
Ａ．レサズリンアッセイを用いて細胞生存率を検査した
手順：
１．ヒト末梢血単核細胞（ＨＰＢＭＣ）（Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ−２７０２）を公式プロトコル（別添Ｂを参照）に従って解凍し、末梢血核型分析培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ＃０１−２０１−１Ｂ）において培養した。
２．細胞を２枚のＦ９６ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ（商標）プレート（Ｎｕｎｃ＃１６７００８）に分配した。各プレートにおいて、２００μｌの核型分析培地中に懸濁した５０，０００細胞を４×５ウエルにロードした。細胞を２４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
３．インキュベーション後、次の処理を各ウエルに４回複製して行った。
ａ．対照（抗ｐ５３抗体［Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ＣＳ−６５３３４］−１０μｌ）
ｂ．１０μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ １（５Ｅ１１Ｈ３）
ｃ．２５μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ １（５Ｅ１１Ｈ３）
ｄ．１０μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ ２（，３Ｅ３Ｇ７）
ｅ．２５μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ ２（３Ｅ３Ｇ７）
４．３７℃、５％ＣＯ２にて第一のプレートを２４時間インキュベートし、第二のプレートを４８時間インキュベートした。
【０２５７】
インキュベーション時間の後、２０μｌのレサズリン（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ＃ＡＲ００２）を各ウエルに添加し、プレートリーダーを用いて２、４及び２４時間目（２４時間インキュベーションの後に）又は２及び４時間目（４８時間インキュベーションの後に）に蛍光（５３０／５９０ｎｍ）を測定した。結果をそれぞれ図６Ａ〜６Ｃ及び７Ａ〜７Ｂに示す。
【０２５８】
Ｂ．ＥＬＩＳＡアッセイを用いた、抗ＫＴＰＡＦ５０抗体による処理後の培地（上清）中のサイトカイン発現の変化の解析
手順：
１．ヒト末梢血単核細胞（ＨＰＢＭＣ）（Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ−２７０２）を解凍プロトコル（上述を参照）に従って解凍し、末梢血核型分析培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ ０１−２０１−１Ｂ）において培養した。
２．細胞を４枚の６ウエルマルチディッシュプレート（Ｎｕｎｃ＃１４０６７５）に分配した。各ウエルにつき、１Ｍの細胞を２ｍＬ核型分析培地にロードした。細胞を２４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
３．インキュベーション後、次の処理を各ウエルに行った。
ａ． 対照
ｂ． １００μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ １（５Ｅ１１Ｈ３）
ｃ． １０μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ ２（３Ｅ３Ｇ７）
ｄ． １００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｅ． ５００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｆ． １０００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
４．プレートを２４、４８、１２０及び１４４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
５．インキュベーション後、プレートを氷上に置き、試料を採取し、３００Ｇで１０分間遠心分離した。培地（上清）をＥＬＩＳＡアッセイ用に取り分けた。
６．ＥＬＩＳＡアッセイのため、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ＃４４２４０４）上に試料をロードした。メーカーの取扱説明書（ＴＤＳプロトコル、上述を参照）に従い、次のＥＬＩＳＡキットを各サイトカインの検査に用いた。
ａ．ヒトＴＮＦ−アルファ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）＃８８−７３４６）。１：１０希釈試料。
ｂ．ヒトＩＦＮ−ガンマ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）＃８８−７３１６）。１：１０希釈試料。
ｃ．ヒトＩＬ−１０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）＃８８−７１０６）。１：６希釈試料。
ｄ．ＰＲＴ−３。希釈していない試料。
【０２５９】
ＴＮＦ−α発現は、抗ＫＴＰＡＦ５０処理の２４又は４８時間処理では変化しなかったが（図８Ｂ〜８Ｃ）、１２０時間処理では有意に低下し（図８Ｄ）、１４４時間処理では抗体５Ｅ１１Ｈ３により低下が起きた（図８Ｅ）。
【０２６０】
ＩＦＮ−γ発現は抗ＫＴＰＡＦ５０処理後に低下し、この低下は時間と共に増幅した（図９Ｂ〜９Ｅ）。
【０２６１】
抗ＫＴＰＡＦ５０処理によりＩＬ−１０発現が抑制された（図１０Ａ〜１０Ｄ）。
【０２６２】
これらの結果は、ＫＴＰＡＦ５０特異抗体がＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γ等、ヒト末梢白血球から分泌されるヒト炎症性サイトカインを下方制御できることを強力に証明する。したがって、本明細書において提供されるモノクローナル抗体は、ヒト自己免疫疾患、移植片拒絶及び同様の他の状態を治療するための潜在的な薬物候補である。
【０２６３】
Ｃ．ＥＬＩＳＡアッセイを用いた、培地中に存在するＫＴＰＡＦ５０の解析
手順
１．セクションＢ（手順の工程６）の２種の対照試料をＭａｘｉｓｏｒｐ ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ＃４４２４０４）上にロードした。各ウエルにつき１００μｌを３回複製した。ゼロ基準として、核型分析培地も３回複製してロードした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。
２．インキュベーション後、マルチピペットを用いて３００μｌの０．０５％ＴＷ−２０（Ａｍｒｅｓｃｏ＃０７７７−１Ｌ）／ＰＢＳでプレートを４回洗浄した。
３．５％ＢＳＡ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ＃１６００６９）／ＰＢＳを用いてプレートをブロッキングした。３００μｌを各ウエルにロードした。Ｒ．Ｔ．にて１時間、振盪しつつインキュベーションした。
４．工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
５．ＫＴＰＡＦ５０ポリクローナル抗体（アフィニティー精製した）を希釈液（０．０５％ＴＷ−２０、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）で１：２５０希釈した。１００μｌの抗体を各ウエルにロードした。プレートを室温で２時間、振盪しつつインキュベートした。
６．工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
７．ヤギ抗ウサギＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ＃７０７４）を希釈液で１：２００希釈した。１００μｌのＨＲＰコンジュゲートを各ウエルにロードした。プレートを３０分間、室温で振盪しつつインキュベートした。
８．４回ではなく５回洗浄する以外は工程２に記載されている通り、プレートを洗浄した。
９．１００μｌのＴＭＢ（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ＃ＥＳ００１−５００ＭＬ）を各ウエルにロードした。発色後、５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４（Ｆｒｕｔａｒｏｍ＃５５５２５４０）をロードして反応を停止させた。
１０．マイクロプレートリーダーにおいて４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０２６４】
結果を図１１に示すが、これは上清におけるＫＴＡＰＡＦ５０の存在を確認する。
【０２６５】
Ｄ．抗ＫＴＰＡＦ５０処理後のヒト単球細胞における形態変化、光学顕微鏡による解析
手順：
１．ヒト末梢血単核細胞（ＨＰＢＭＣ）（Ｌｏｎｚａ＃ＣＣ−２７０２）を解凍プロトコル（上述を参照）に従って解凍し、末梢血核型分析培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ０１−２０１−１Ｂ）において培養した。
２．細胞を４枚の６ウエルマルチディッシュプレート（Ｎｕｎｃ＃１４０６７５）に分配した。各ウエルにおいて、１Ｍの細胞を２ｍＬ核型分析培地にロードした。細胞を２４時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。
３．インキュベーション後、次の処理を各ウエルに行った。
ａ．対照
ｂ．１００μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ １（５Ｅ１１Ｈ３）
ｃ．１０μｌの抗ＫＴＰＡＦ５０ ２（３Ｅ３Ｇ７）
ｄ．１００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｅ．５００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
ｆ．１０００ｎｇ／ｍｌ ＫＴＰＡＦ５０
４．プレートを１２０時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートし、光学顕微鏡（倍率×１００）及びＣＣＤカメラを用いて可視化した（図１５Ａ〜１５Ｆ）。
【０２６６】
ＰＨＡで処理したヒト末梢血細胞は、増殖して大きな細胞凝集塊を生じる。本結果は、ＰＨＡ処理に続いて抗ＫＴＰＡＦ５０モノクローナル抗体処理が行われる場合、これらの細胞の完全な増殖抑制が観察されたことを疑いの余地なく示す。このことは、本明細書に提供される抗体を、増殖制御のための強力なツールとし、癌、炎症過程に関与する疾患等の望ましくない細胞増殖に関与する任意の状態の治療法とする。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はその任意の断片若しくは誘導体を特異的に認識する抗体。
【請求項２】
前記ＫＴＰＡＦ５０タンパク質が配列番号１又は配列番号２で表される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＫＴＰＡＦ５０由来ペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項４】
前記ＫＴＰＡＦ５０由来ペプチドが、配列番号３、配列番号５、配列番号６及び配列番号７のいずれか一配列で表される、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はその任意の断片若しくは誘導体を特異的に認識する抗体を有効成分として含む組成物。
【請求項６】
薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
診断方法における使用のための、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
自己免疫障害及び癌の内一方の診断における使用のための、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
癌治療における使用のための、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項１０】
癌又は自己免疫疾患のいずれか一方の予後における使用のための、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記癌が肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択された、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記自己免疫障害が炎症性腸疾患である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の抗体を産生する、抗体産生細胞系。
【請求項１４】
３Ｅ３Ｇ７又は５Ｅ１１Ｈ３のいずれか一方である、ハイブリドーマ細胞系。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の細胞系に由来する抗体。
【請求項１６】
診断組成物の調製における、請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１７】
前記組成物が、癌及び自己免疫疾患のいずれか一方の診断のためのものである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記癌が肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記自己免疫障害が炎症性腸疾患である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
治療組成物の調製における、請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２１】
前記組成物が、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患、糖尿病及び移植片拒絶からなる群から選択される状態の治療のためのものである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
対象における癌の診断のための方法であって、
ａ．対象から試料を得る工程と、
ｂ．前記試料を請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の抗体又は請求項５から８までのいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程と、
ｃ．前記少なくとも１種類の抗体とその特異抗原との複合体の形成を検出手段により検出する工程と、
を含み、それにより、複合体の検出が、前記対象が癌に罹患していることを示す上記方法。
【請求項２３】
前記試料が血液試料である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が請求項４及び１５に記載の抗体であり、前記癌が肺癌である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象における自己免疫障害の診断のための方法であって、
ａ．対象から試料を得る工程と、
ｂ．前記試料を請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の抗体又は請求項５から８までのいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程と、
ｃ．前記少なくとも１種類の抗体とその特異抗原との複合体の形成を検出手段により検出する工程と、
を含み、それにより、複合体の検出が、前記対象が自己免疫障害に罹患していることを示す上記方法。
【請求項２６】
前記試料が血液試料である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記自己免疫障害がＩＢＤである、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
癌の治療方法であって、必要とする対象に治療上有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項２９】
細胞増殖を抑制する方法であって、有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を細胞と接触させる工程を含む、上記方法。
【請求項３０】
サイトカイン発現を抑制する方法であって、有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を、前記サイトカインを発現する細胞と接触させる工程を含む、上記方法。
【請求項３１】
前記サイトカインが炎症性サイトカインである、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０からなる群から選択された、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
癌の診断、治療有効性のモニタリング又は予後評価の内いずれか１つのためのキットであって、次の構成要素、
ａ．請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の抗体又は請求項５から８までのいずれか一項に記載の組成物と、
ｂ．前記抗体によって特異的に認識される抗原の、試料における存在の検出を行うための取扱説明書と、
を含む、上記キット。
【請求項３４】
次の構成要素、
ａ．検査する試料を採取するための少なくとも１つの手段と、
ｂ．前記抗体による前記抗原の前記認識の検出に必要な少なくとも１種類の試薬と、
ｃ．少なくとも１種類の対照試料と、
の内少なくとも１つをさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
自己免疫疾患の診断及び治療有効性のモニタリング又は予後評価の内少なくとも１種のためのキットであって、次の構成要素、
ａ．請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の抗体又は請求項５から８までのいずれか一項に記載の組成物と、
ｂ．前記抗体によって特異的に認識される抗原の、試料における存在の検出を行うための取扱説明書と、
を含む、上記キット。
【請求項３６】
次の構成要素、
ａ．検査する試料を採取するための少なくとも１つの手段と、
ｂ．前記抗体による前記抗原の前記認識の検出に必要な少なくとも１種類の試薬と、
ｃ．少なくとも１種類の対照試料と、
の内少なくとも１つをさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項１】
ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はその任意の断片若しくは誘導体を特異的に認識する抗体。
【請求項２】
前記ＫＴＰＡＦ５０タンパク質が配列番号１又は配列番号２で表される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ＫＴＰＡＦ５０由来ペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項４】
前記ＫＴＰＡＦ５０由来ペプチドが、配列番号３、配列番号５、配列番号６及び配列番号７のいずれか一配列で表される、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
ＫＴＰＡＦ５０タンパク質又はその任意の断片若しくは誘導体を特異的に認識する抗体を有効成分として含む組成物。
【請求項６】
薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
診断方法における使用のための、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項８】
自己免疫障害及び癌の内一方の診断における使用のための、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
癌治療における使用のための、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項１０】
癌又は自己免疫疾患のいずれか一方の予後における使用のための、請求項５又は６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記癌が肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択された、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
前記自己免疫障害が炎症性腸疾患である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の抗体を産生する、抗体産生細胞系。
【請求項１４】
３Ｅ３Ｇ７又は５Ｅ１１Ｈ３のいずれか一方である、ハイブリドーマ細胞系。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載の細胞系に由来する抗体。
【請求項１６】
診断組成物の調製における、請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項１７】
前記組成物が、癌及び自己免疫疾患のいずれか一方の診断のためのものである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記癌が肺癌、乳癌及び卵巣癌からなる群から選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記自己免疫障害が炎症性腸疾患である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
治療組成物の調製における、請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２１】
前記組成物が、癌、自己免疫疾患、神経変性疾患、糖尿病及び移植片拒絶からなる群から選択される状態の治療のためのものである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
対象における癌の診断のための方法であって、
ａ．対象から試料を得る工程と、
ｂ．前記試料を請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の抗体又は請求項５から８までのいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程と、
ｃ．前記少なくとも１種類の抗体とその特異抗原との複合体の形成を検出手段により検出する工程と、
を含み、それにより、複合体の検出が、前記対象が癌に罹患していることを示す上記方法。
【請求項２３】
前記試料が血液試料である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が請求項４及び１５に記載の抗体であり、前記癌が肺癌である、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
対象における自己免疫障害の診断のための方法であって、
ａ．対象から試料を得る工程と、
ｂ．前記試料を請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の抗体又は請求項５から８までのいずれか一項に記載の組成物と接触させる工程と、
ｃ．前記少なくとも１種類の抗体とその特異抗原との複合体の形成を検出手段により検出する工程と、
を含み、それにより、複合体の検出が、前記対象が自己免疫障害に罹患していることを示す上記方法。
【請求項２６】
前記試料が血液試料である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記自己免疫障害がＩＢＤである、請求項２５又は２６に記載の方法。
【請求項２８】
癌の治療方法であって、必要とする対象に治療上有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を投与する工程を含む、上記方法。
【請求項２９】
細胞増殖を抑制する方法であって、有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を細胞と接触させる工程を含む、上記方法。
【請求項３０】
サイトカイン発現を抑制する方法であって、有効量の少なくとも１種類の抗ＫＴＰＡＦ５０抗体若しくはその組合せ又はそれを含む組成物を、前記サイトカインを発現する細胞と接触させる工程を含む、上記方法。
【請求項３１】
前記サイトカインが炎症性サイトカインである、請求項３０の方法。
【請求項３２】
前記サイトカインが、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ又はＩＬ−１０からなる群から選択された、請求項３０又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
癌の診断、治療有効性のモニタリング又は予後評価の内いずれか１つのためのキットであって、次の構成要素、
ａ．請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の抗体又は請求項５から８までのいずれか一項に記載の組成物と、
ｂ．前記抗体によって特異的に認識される抗原の、試料における存在の検出を行うための取扱説明書と、
を含む、上記キット。
【請求項３４】
次の構成要素、
ａ．検査する試料を採取するための少なくとも１つの手段と、
ｂ．前記抗体による前記抗原の前記認識の検出に必要な少なくとも１種類の試薬と、
ｃ．少なくとも１種類の対照試料と、
の内少なくとも１つをさらに含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
自己免疫疾患の診断及び治療有効性のモニタリング又は予後評価の内少なくとも１種のためのキットであって、次の構成要素、
ａ．請求項１から４まで及び請求項１５のいずれか一項に記載の少なくとも１種類の抗体又は請求項５から８までのいずれか一項に記載の組成物と、
ｂ．前記抗体によって特異的に認識される抗原の、試料における存在の検出を行うための取扱説明書と、
を含む、上記キット。
【請求項３６】
次の構成要素、
ａ．検査する試料を採取するための少なくとも１つの手段と、
ｂ．前記抗体による前記抗原の前記認識の検出に必要な少なくとも１種類の試薬と、
ｃ．少なくとも１種類の対照試料と、
の内少なくとも１つをさらに含む、請求項３５に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【図２】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図４Ｅ】
【図４Ｆ】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図８Ｃ】
【図８Ｄ】
【図８Ｅ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】
【図９Ｅ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１０Ｄ】
【図１１】
【図１２Ａ】
【図１２Ｂ】
【図１２Ｃ】
【図１２Ｄ】
【図１２Ｅ】
【図１２Ｆ】
【公表番号】特表２０１２−５３２１２２（Ｐ２０１２−５３２１２２Ａ）
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１８１４６（Ｐ２０１２−５１８１４６）
【出願日】平成２２年６月２９日（２０１０．６．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００５２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００１４３２
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１２００２１７２）ツー トゥー バイオテック リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月１３日（２０１２．１２．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月２９日（２０１０．６．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２０１０／０００５２４
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／００１４３２
【国際公開日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【出願人】（５１２００２１７２）ツー トゥー バイオテック リミテッド (2)
【Ｆターム（参考）】
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