核酸の多型評価法
【課題】核酸の多型評価をデジタル化するための解析手法を提供する。
【解決手段】ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡから、ＤＮＡ断片の増幅処理を行い、分子量に基づき該増幅ＤＮＡ断片を視覚化可能に分離したのち、識別可能な個々のＤＮＡ断片に対して予め定義された分子量範囲に基づいて、該分子量範囲内に、所定のシグナル強度の閾値を超える増幅ＤＮＡ断片が存在するかもしくは存在しないかを決定し、各増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在を数値化し、得られた数値データを、該増幅ＤＮＡ断片について、各試料間で比較するか、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較することを含む、生物の核酸多型を評価する方法。
【解決手段】ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡから、ＤＮＡ断片の増幅処理を行い、分子量に基づき該増幅ＤＮＡ断片を視覚化可能に分離したのち、識別可能な個々のＤＮＡ断片に対して予め定義された分子量範囲に基づいて、該分子量範囲内に、所定のシグナル強度の閾値を超える増幅ＤＮＡ断片が存在するかもしくは存在しないかを決定し、各増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在を数値化し、得られた数値データを、該増幅ＤＮＡ断片について、各試料間で比較するか、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較することを含む、生物の核酸多型を評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物の核酸多型を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸の塩基配列の違いを利用して、生物の個体、種、品種、遺伝子型などを識別する方法が多く開発されている（例えば、特許文献１〜４）。これらの方法は、ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの多型に関わる部分を増幅させるプライマーを開発し、該プライマーを使用して対象のＤＮＡ断片を増幅し、ＤＮＡ断片の有無あるいは分子量の相違によって、多型を評価することにより、核酸の相違の判別を行っている。
【０００３】
増幅されたＤＮＡ断片は、ポリアクリルアミドゲルやアガロースゲルなどの支持体を用いたゲル電気泳動あるいはキャピラリー電気泳動により分子量に基づき分離され、可視化された後、多型が評価される。
【０００４】
多型の評価は、増幅したＤＮＡ断片のうち特定の分子種について増幅の有無を判断することおよび検出したＤＮＡ断片が目的のものであるか否かを判断することによりなされる。しかし、増幅量が少ない場合に増幅の有無を判断することおよび試料ごとの電気泳動による移動度のずれを同一分子種とみなすか否かを判断することが難しく、これらの困難さは結果解析の再現性を低下させるとともに自動化に対する障壁となっている。前者については、可視化したＤＮＡ断片のシグナル強度を補正する手段がいくつか報告されている（例えば、特許文献５）。また、後者については、例えば特許文献６では、目的とする特定ＤＮＡ断片の移動度測定において、分子量プラスマイナス５％の範囲としてずれを許容している。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８１８４８６号公報
【特許文献２】特許第３２１８３１８号公報
【特許文献３】特表２００２−５４０７９９号公報
【特許文献４】特許第３２３６２９５号公報
【特許文献５】特開２００３−２５０５４１号公報
【特許文献６】特開２００３−９３０６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、従来技術は同一あるいは相同な特定の目的とするＤＮＡ断片の有無の評価および、ＤＮＡ断片の電気泳動における移動度の測定により多型解析が行われている。しかし、従来技術はＤＮＡ断片の量が多い場合で、かつ近接した移動度の領域に目的とするＤＮＡ断片以外の断片が存在しない場合のみに有効であり、それ以外の場合多型の有無の判断が容易でない。
【０００７】
本発明はこのような従来の問題に鑑み、特に従来技術で難しい複数の核酸断片からなる試料の多型評価方法の提供を目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以下のように発想を転換し多型を評価することにより、上述の如き従来の問題を解決し目的を達成することができる。つまり、従来は特定の分子量をもつ特定のＤＮＡ断片の有無を評価していたが、本発明ではＤＮＡ断片の素性を問わずに判別しやすい分子量範囲を定義し、その範囲内の分子量をもつＤＮＡ断片を１つに限らず、１つ以上存在するか否かのみを記載することにより極めて容易に多型を評価することができる。別の言い方をすれば、本発明の方法の特徴は、増幅したＤＮＡ断片の分子種の相同性を無視し、定義した範囲内の分子量をもつＤＮＡ断片の存在のみを指標に解析を行う核酸の多型評価方法にある。ここで定義した範囲内に検出されるＤＮＡ断片の数は無視される。
【０００９】
したがって、本発明は、以下の特徴を有する。
本発明は、生物由来のＤＮＡまたはＲＮＡから、ＤＮＡ断片の増幅処理を行い、分子量に基づき該増幅ＤＮＡ断片を視覚化可能に分離したのち、識別可能な個々のＤＮＡ断片に対して予め定義された分子量範囲に基づいて、該分子量範囲内に、所定のシグナル強度の閾値を超える増幅ＤＮＡ断片が存在するかもしくは存在しないかを決定し、各増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在を数値化し、得られた数値データを、該増幅ＤＮＡ断片について、各試料間で比較するか、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較することを含む、生物の核酸多型を評価する方法を提供する。
【００１０】
その実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片の数は、互いを識別できる限り、比較する片方の試料では０でも構わない。
【００１１】
別の実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在を数値化するにあたって必要な分子量範囲の数は少なくとも１である。
【００１２】
別の実施形態において、上記分離は電気泳動にて行なわれる。
別の実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片の分子量範囲が、後述の実施例に記載されるようにキク品種間の識別の場合、約５０ｂｐ〜約１０００ｂｐの間に任意に設定される。
【００１３】
別の実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在の数値化が、２進法の数値で表わされる。
【００１４】
別の実施形態において、上記２進法の数値がさらに１０進法に変換される。
別の実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片について表した上記２進法の数値をさらに、各試料の数値データ間で比較するか、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較する。
【００１５】
ここで「既知生物の核酸で予め決定された数値データ」とは、既知の生物の核酸について、公表又は未公表に関わらず、すでに過去に分析されている（言い換えれば、予め決定されている）データをいう。
【００１６】
別の実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片が反復ＤＮＡを含む領域である。
別の実施形態において、上記反復ＤＮＡがマイクロサテライトである。
別の実施形態において、上記生物が真核生物である。
別の実施形態において、上記生物が植物である。
別の実施形態において、上記植物がキク科植物である。
別の実施形態において、上記キク科植物がキク属植物である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法は、増幅したＤＮＡ断片の分子種の相同性や数を無視し、定義した範囲内の分子量をもつＤＮＡ断片の存在のみを指標にするため、増幅ＤＮＡ断片の識別が容易になり、すなわちコンピューターによる識別が可能になり、したがって簡易な手法で、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間の核酸多型を評価することを可能にする。その結果、多型解析が格段に容易になり、また、その自動化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明によれば、生物の核酸多型を評価する方法は、
(1) 生物由来のＤＮＡまたはＲＮＡから、ＤＮＡ断片の増幅処理を行うこと、
(2) 分子量に基づき該増幅ＤＮＡ断片を視覚化可能に分離すること、
(3) 識別可能な個々のＤＮＡ断片に対して予め定義された分子量範囲に基づいて、該分子量範囲内に、所定のシグナル強度の閾値を超える増幅ＤＮＡ断片が存在するかもしくは存在しないかを決定すること、
(4) 各増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在を数値化すること、
(5) (4)で得られた数値データを、増幅ＤＮＡ断片各々について、各試料の数値データ間で比較すること、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較すること、
からなるステップを含む。
【００１９】
上記ステップ(1)で、試料となる核酸は、生物由来の試料から抽出されたＤＮＡおよびＲＮＡである。ＤＮＡは、例えば核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを含む。ｃＤＮＡは、ＲＮＡから逆転写酵素の作用により合成される。一方、ＲＮＡは、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどを含む。本発明の方法では、ＲＮＡは、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、ＤＮＡ断片の増幅のために使用される。
【００２０】
試料となるＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型にし、かつＤＮＡ断片を増幅させるプライマーを使用して、ＤＮＡ断片の増幅を行う。本明細書で使用される「増幅」なる用語は、通常、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」という）を利用した核酸の増幅を意味する。
【００２１】
ＰＣＲは、鋳型としての二本鎖ＤＮＡの増幅領域の５’末端側と３’末端側に相補的な約１５〜約３０塩基長、好ましくは１７〜２５塩基長の塩基配列からなるセンスプライマー（正方向プライマーともいう）とアンチセンスプライマー（逆方向プライマーともいう）、ｄＮＴＰ（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲバッファー（Ｍｇ２＋含有）中で行われる。
【００２２】
本発明でいうＤＮＡの増幅領域は多型が検出される限りどの部分でもよいが、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間等の互いに識別したい対象同士で変化に富んでいる（すなわち、突然変異を起こしやすい）ＤＮＡ領域が好ましく選択される。ＤＮＡの増幅領域は、多型が検出される限りどの部分でもよいが、例えばＳＳＲ(Simple Sequence Repeat)領域等の反復DNAを含む領域以外に、ＩＳＳＲ(Inter-Simple Sequence Repeat)領域、ＳＮＰ(Single Nucleotide Polymorphism)を含む領域、ＲＦＬＰ(Restriction Fragment Length Polymorphism)領域、ＣＡＰＳ(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)領域、ＲＡＰＤ(Random Amplified Polymorphic DNA)領域、ＡＦＬＰ(Amplified Fragment Length Polymorphism)領域等、対象とする生物に独自に存在しているためそれらを指標とすれば互いを識別できる可能性のある領域である。
【００２３】
このうち反復ＤＮＡは、真核生物のゲノム（例えば、核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ）上に存在することが知られている。とりわけ公知の反復ＤＮＡは、サテライトＤＮＡ、ミニサテライトおよびマイクロサテライトである。
【００２４】
サテライトＤＮＡは、セントロメア領域やサブテロメア領域に局在していることが多く、例えば約１００〜３００ｂｐの単位配列が、例えば約１０００〜１００，０００回繰り返したような反復構造を有している。
【００２５】
ミニサテライトは、ゲノム上に存在する反復配列であり、約１０〜６０ｂｐの中間サイズのＤＮＡモチーフから構成されている。
【００２６】
マイクロサテライトは、生物、とりわけ真核生物のゲノム上に散在する反復配列であり、数塩基（約１〜６ｂｐ）程度の短い単位配列の繰り返しからなる。反復単位は、通常２〜４ｂｐであり、数回〜１００回程度またはそれ以上繰り返す場合もある。単位配列は、例えば（Ａ）ｎ、（ＡＴ）ｎ、（ＣＡ）ｎ、（ＧＡ）ｎ（ここで、ｎは２以上の整数、例えば５〜１５０である。）などを含む。
【００２７】
上記のような反復配列は、繰り返しの数が多いほど突然変異を蓄積しやすくなり、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間の多型、疾患（異常）などの原因になるといわれている。特に、マイクロサテライトは、生物の多型評価のために利用されることが多く、本発明においても好適なＤＮＡの増幅領域対象である。他のＩＳＳＲ等に関する説明は、DNA Fingerprinting in Plants, second edition, CRC Press, 2005, ISBN 0-8493-1488-7等に詳細に記載されている。
【００２８】
本明細書で使用される「生物」とは、真核生物および原核生物の両方を指す。真核生物には、動物、植物、酵母等の菌類、藻類などが含まれ、一方、原核生物には細菌類が含まれる。
【００２９】
生物組織や細胞からゲノムＤＮＡを抽出する方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, John Wiley & Sons (1995)）などに記載されている。例えば、動物または植物組織を液体窒素で凍結し破壊したのち、動物組織の場合トリプシンなどの消化酵素を含有するバッファーで、植物組織の場合N-ラウロイルサルコシルを含有する抽出バッファーでそれぞれ処理し、遠心操作ののち、ＤＮＡをフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、クロロホルム/オクタノール、クロロホルム/イソアミルアルコール、塩化セシウム飽和イソプロパノールなどの有機溶媒で抽出し、エタノールで沈殿させ、回収することができる。また、別の例として、細菌ゲノムからＤＮＡを抽出する方法では、ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫを含有するＴＥバッファーで培養細菌を処理したのち、５Ｍ ＮａＣｌを加えてＣＴＡＢ／ＮａＣｌで処理し、クロロホルム/イソアミルアルコール、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、イソプロパノールなどでＤＮＡを抽出し、エタノールで沈殿させる。一方、ＲＮＡの抽出法については、例えば、動物あるいは植物組織または細胞を液体窒素で凍結し破壊する、浸透圧衝撃で破壊するなどの手法で破壊したのち、N-ラウロイルサルコシルおよび塩化セシウムを含有するグアニジウム溶液で処理し、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、クロロホルム/イソアミルアルコールなどの有機溶媒でＲＮＡを抽出し、エタノールで沈殿し、回収する。細菌からのＲＮＡの抽出は、例えばフェノール/クロロホルム、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、クロロホルム/イソアミルアルコールなどの有機溶媒で抽出することを含む方法などで行うことができる。
【００３０】
本明細書で使用する「ゲノムＤＮＡ」とは、動物細胞、植物細胞、菌類細胞、細菌細胞などの生物細胞内の核ＤＮＡ、ミトンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡなどを指す。したがって、上記の方法で抽出・単離されたゲノムＤＮＡまたはその断片は、ＰＣＲの鋳型として使用される。
【００３１】
ＰＣＲに使用されるプライマーは、上述の通り多型が検出される限りいずれでもよいが、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間等の互いに識別したい対象同士で変化に富んでいる（すなわち、突然変異を起こしやすい）ゲノムＤＮＡ領域を増幅するものは多型を示しやすいので利用価値が高い。さらに好ましくは反復ＤＮＡを含む領域、より好ましくはマイクロサテライトを含む領域を増幅するプライマーから選択されることが望ましい。
【００３２】
マイクロサテライトなどの反復ＤＮＡは、生物種別の反復配列データベースを有するｒｅｐｅａｔ ｍａｓｋｅｒ(http://www.repeatmasker.org/)にアクセスすることによって類似性検索をすることができる。このようなデータベースから決定された反復ＤＮＡの塩基配列を挟むようにしてＰＣＲに用いるプライマーを設計することができる。あるいは、不特定の反復ＤＮＡを検出するために、生物由来のＤＮＡ断片をベクター（プラスミド、ファージなど）に組込み、大腸菌に導入してｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、目的の標識化反復配列とハイブリダイズさせて、目的のクローンを選抜し、このクローンからＤＮＡを回収し、配列決定してもよい。このような一連の操作は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 第２版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）などに記載されている。
【００３３】
ＰＣＲは、９４℃で１分〜２分の初期変性ののち、９４℃で２０秒〜３０秒（変性ステップ）、５０℃〜６０℃で３０秒（アニーリングステップ）、および７２℃で３０秒〜５分（伸長ステップ）を１サイクルとして３０〜４０サイクルを実施し、最後に、７２℃で１分〜３分の伸長反応を行うことを含む。
【００３４】
ＰＣＲバッファーは、例えば、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５００ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％ ｇｅｌａｔｉｎからなる溶液を約１０倍希釈して反応に使用される。これに、例えば、２００μＭずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；０．８μＭプライマー；１ユニットの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ；１〜１００ｎｇ鋳型ＤＮＡが含有される。
【００３５】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼは市販されているので、それらを使用することが望ましい。
【００３６】
また、例えばサーマルサイクラー(Thermal Cycler)などのＰＣＲ反応装置が市販されているので、このような装置を利用することが望ましい。
【００３７】
上記第２ステップでは、分子量に基づき増幅ＤＮＡ断片を視覚化可能に分離する。
分離手段は、分子量のサイズの差に基づいてＤＮＡ断片を分離することを可能にする任意の手段を含む。このような手段には、電気泳動、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションなどが含まれる。好ましい手段は、電気泳動、例えばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動、キャピラリー電気泳動などである。
【００３８】
ゲル電気泳動の場合、アガロースまたはアクリルアミドの含量（％）によって、分離可能なＤＮＡ断片のサイズ範囲が決まる。本発明では、増幅されたＤＮＡ断片の分子量は識別対象とする生物のみならずＰＣＲやその後の電気泳動の条件等に左右されるため限定することはできないが、例えば実施例に記載されているキク品種間の識別においては、増幅されたＤＮＡ断片の分子量が５０ｂｐ〜１０００ｂｐの間に入るようにすることが好ましいため、約1〜３％アガロースゲル、約３．５〜１２％アクリルアミドが使用される。
【００３９】
電気泳動バッファーは、通常、ＴＡＥまたはＴＢＥバッファーである。
電気泳動の操作については、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載されている。
【００４０】
分離されたＤＮＡ断片は次いで、可視化される。可視化は、エチジウムブロマイド、蛍光色素（例えばシアン、ビーナスなど）、放射性同位元素（例えば３２Ｐなど）などの染料や標識を利用して行われる。
【００４１】
可視化された結果には、増幅されたＤＮＡ断片の量と分子量の情報が存在する。このうちＤＮＡ断片の量はシグナル（例えば、染料または標識）の強度により表される。また、分子量は電気泳動の移動度により表される。ＤＮＡ断片の量については、濃度既知のＤＮＡ断片を同時に電気泳動すれば濃度を推定することが可能である。また、ＤＮＡ断片の分子量については、分子量既知のＤＮＡ断片を同時に電気泳動すれば分子量を推定することが可能である。
【００４２】
本発明では、シグナル強度について閾値（すなわち、有効な強度の最小値）を設定する。閾値の設定はシグナルの強度自体でもよいし、同時に増幅される他のＤＮＡ断片のシグナル強度を内部標準にし、内部標準に対する相対値でもよい。例えばリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子など生物種を越えて存在する遺伝子のプライマーセットも加えＰＣＲ反応を行うことにより得られるＤＮＡ断片のうちリボソームＲＮＡ遺伝子断片のシグナル強度を内部標準にし、内部標準のシグナルに対するシグナル強度の比を設定することも可能である。内部標準の例は、ｒＲＮＡの他に、ハウスキーピング遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）もしくはそのｃＤＮＡを含む。ハウスキーピング遺伝子は、細胞内で実質的に変動のない発現量を示す遺伝子であり、例えばアクチン遺伝子などが含まれる。設定したシグナル強度あるいはシグナル強度比（閾値）以上のシグナルが検出されるときシグナルが有る、あるいは、設定したシグナル強度もしくはシグナル強度比未満のときシグナルなしと判断する。設定するシグナル強度またはシグナル強度比は任意に設定することが可能である。
【００４３】
第３ステップでは、識別可能な個々のＤＮＡ断片に対して予め定義された分子量範囲に基づいて、該分子量範囲内に、所定のシグナル強度の閾値を超える増幅ＤＮＡ断片が存在するかもしくは非存在かを決定する。
【００４４】
分子量範囲については、分離手段によって分離されたＤＮＡ断片が判別しやすい範囲を定義する。本発明の実施形態によれば、そのような分子量範囲は、非限定的に、例えば約５０ｂｐ〜約１０００ｂｐの間に任意に設定しうる。例えば、電気泳動の場合、ＤＮＡ断片のバンドは、ある定義された分子量範囲、例えば約５０ｂｐ〜約２００ｂｐの幅で設定された範囲（例えば、約１００〜約１５０ｂｐ、約１５０〜約２００ｂｐ、約２００〜約２５０ｂｐ、約２５０〜約３００ｂｐ、約３００〜約３５０ｂｐ、・・・約５５０〜約７００ｂｐ、約８００〜約１０００など）内に存在するか否かを決定する。定義された分子量に基づく範囲内に所定の閾値以上のシグナル強度をもつ１つまたは複数のＤＮＡ断片を１つのマーカーと呼ぶ。
【００４５】
上記第４ステップにおいて、定義された範囲内に所定の閾値以上のシグナルが１つ以上あるとき「１」、定義された範囲内に所定の閾値以上のシグナルがないとき「０」と記載するように、ＤＮＡ断片の存在または非存在を数値によって表す。この数値を、対象となる複数の分子量範囲について順に並べることにより２進法の数値とする。得られた数値を各試料間で比較することにより、あるいは既知生物の数値データと比較することにより、数値が一致すれば互いに同一の多型を有する生物分類階級のいずれかの階級に属するもの（例えば個体、品種、種又は属等）であると判定または推定する。なお、さらに必要に応じて、例えば１０進法の数値に変換しその合計値を各試料間で比較することにより、あるいは既知生物の数値データと比較することにより、識別することが可能である。
【００４６】
このような分子量範囲の数は、１つ以上で、可視化されたＤＮＡ断片数のもっとも多いサンプルのＤＮＡ断片数を最大とした範囲の任意の数でよい。後述の実施例では、キク１６品種の識別を上記方法で行った例を示すが、キク１６品種では、電気泳動の移動度として図１Ａ〜Ｆに示す四角で囲った範囲を定義した。バンドとして識別可能なＤＮＡ断片を有する大体の範囲を目視で設定することは容易である。
【００４７】
上記第５ステップにおいて、このようにして得られた１つ以上のマーカーについての記載を各試料間で比較することにより、あるいは既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較することにより、多型を評価し相違を判別することが可能となる。このように、シグナル強度および領域として定義した移動度という２つのデータを処理することにより容易にＤＮＡ断片の多型評価が可能である。
【００４８】
本発明の上記方法によって、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間等の識別や多型を評価することが可能になる。特に、マイクロサテライトを含む領域をターゲットにする場合には、多型評価だけでなく、疾患の有無も判定することが可能になるだろう。疾患は、ハンチントン病などの遺伝病、癌などの遺伝子変異によって引き起こされるものを含む。
【００４９】
上述したアルゴリズムは自動化が可能である。例えば、電気泳動像をカメラやイメージスキャナーを用いてコンピューターに取り込み、シグナル強度の閾値と調査する範囲を設定し、各試料について上述した「１」、「０」を出力することで自動化が可能である。また、蛍光ラベルした増幅ＤＮＡ断片を試料とした場合には、蛍光ＤＮＡ塩基配列決定装置（例えばアプライドバイオシステムズジャパン社のジェネティックアナライザー）を用いることにより、蛍光強度の閾値と調査する電気泳動移動度の範囲を設定し、各試料について上述した「１」、「０」を出力することで、増幅したＤＮＡ断片から多型解析結果の出力までを自動化することが可能である。このように、カメラやイメージスキャナーをコンピューターと一体化した機器とすれば、自動的に多型解析できるシステムとなる。
【００５０】
シグナル強度は、試料ＤＮＡに共存するＰＣＲ反応の効率を阻害する物質の濃度が各試料間でふれると、再現性が低くなる場合がある。このような心配がある各試料間の比較は内部標準を用いることで解決される。また、移動度の範囲をずれの範囲より広く定義することで、容易に再現性を確保することができる。
【００５１】
本発明による核酸の多型評価方法は、真核生物および原核生物を含む生物に使用可能である。本発明の方法は、動物、植物、菌類、藻類などの真核生物の多型評価に好ましく使用される。以下の実施例では、本発明の方法によって、生物のうち植物、特にキク科植物の中で比較的多品種でかつ実用性の高いキク属植物の品種間を識別する例を示す。
【実施例】
【００５２】
次に、以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００５３】
プライマーセットの設計
１．試料からのＤＮＡ抽出
キク品種「セイプリンス」（販売元：有限会社精興園）の未展開葉１ｇ（１０〜１２個）を液体窒素に浸漬させ凍結し、パウダー状になるまで粉砕した。凍結状態のサンプルに沸騰直前まで温めた１．５×ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）抽出バッファーを５ｍｌ加えてＤＮＡを抽出し、等量のクロロホルム−イソアミルアルコール（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え、遠心機で遠心分離（３０００ｒｐｍ、常温、３０分間）の後に上清を採取することによる除タンパク質処理を２回行った。
【００５４】
その後ＣＴＡＢ沈殿バッファー７．５ｍｌを加え析出したＤＮＡをイノキュレーションループで掬いとり、１０ｎｇ/ｍｌ ＲＮａｓｅを含む１Ｍ ＮａＣｌ２ｍｌに再溶解した。水溶性の夾雑物と塩類を除去するために、エタノール２．５倍量を加え混和した後に、遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで洗浄し、最終沈殿物をＴＥ溶液１００μｌに溶解した。
【００５５】
２．ＤＮＡライブラリーの作製
得られた「セイプリンス」のゲノムＤＮＡ約３．０μｇを超音波破砕した後、０．５ μｌ Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、３７℃で５分放置して末端の平滑化を行った。このＤＮＡをアガロースゲル(１．２％)電気泳動（１．０％、０．５ｘＴＢＥバッファー、１００Ｖ、１５分）により分離した後、１ｋｂから１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片３．５μｌ、ライゲーションバッファー０．５μｌ、プラスミドベクター（ｐＵＣ１８）０．５μｌ、Ｔ４リガーゼ０．５μｌ（１Ｕ/μｌ）を加えた反応液を調製し、一晩反応させてＤＮＡ断片をプラスミドベクターに挿入した。ＤＮＡ断片を挿入したプラスミドベクターは、エレクトロポレーション法にてコンピテントセル（大腸菌株ＤＨ１０Ｂ）へ形質転換させた。形質転換した細胞は、２５ｐｐｍアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（1% Polypepton、0.5% Yeast Extract、1% NaCl、1.5% Bacto Agar）上で、３７℃で一晩培養し、生育するコロニーからなるライブラリーを作製した。得られた形質転換体約６０万クローンをプール化し、アルカリＳＤＳ法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００５６】
３．ＤＮＡライブラリーの濃縮
まず、以下の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチド（ＣＡ−オリゴおよびＴＧ−オリゴ）を合成した。ＣＡ−オリゴは、５'側から３'側に向かって、３０ｍｅｒからなるＡの連鎖と、それに続く（ＣＡ）の２５回の繰り返しからなる(配列番号１)。ＴＧ−オリゴは、５'側から３'側に向かって、３０ｍｅｒからなるＡの連鎖と、それに続く（ＴＧ）の２５回の繰り返しからなる（配列番号２）。
【００５７】
これらのプローブを、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のＭｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを利用してビオチン化した。具体的な操作は次のとおりである。まず、ＣＡ−オリゴ２００ｐｍｏｌ とＴＧ−オリゴ２００ｐｍｏｌ をアニーリング（室温で混合）させた。次いで、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ２０ｐｍｏｌ加え、最後に、ビオチン２１−ｄＵＴＰを１０００ｐｍｏｌ加えた。更に、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を２ユニット加えて、室温で２時間反応させた。作製したビオチン化プローブを５分間煮沸後に氷上で急冷して１本鎖化した。１本鎖化したビオチン化プローブに２．５ｍＭ ＣｏＣｌ２、ＡＴＰ (ＡＴＰとＡＴＰ−ｇｕｍｍａ−Ｓの混合液)、およびＲｅｃＡタンパク８μgを加えて、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、上記２．で作製されたプラスミドライブラリー１０μｇを加えて３７℃で１時間インキュベートして、３重鎖を形成させた。その後、０．１％ＳＤＳ存在下でプロティナーゼＫ処理によってＲｅｃＡを分解し、さらにPhenylmethylsulfonyl Fluoride(ＰＭＳＦ)を加えてプロティナーゼＫを不活化した。ビオチン化プローブとプラスミドベクターを含む液を、緩衝液で平衡化したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ磁気ビーズと混合した。室温で放置後、ストレプトアビジンと結合しなかったＤＮＡを洗浄液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ)で洗浄した。洗浄後にアルカリ液(０．１Ｎ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）によって結合したＤＮＡを溶出した。溶出されたプラスミドベクターはエタノール沈殿法で精製し、エレクトロポレーション法にてコンピテントセル（大腸菌株ＤＨ１０Ｂ）へ形質転換させた。
【００５８】
４．挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列決定
続いて、整列化したクローンに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を解読した。まず、大腸菌クローンを３７℃で一晩、５０ｐｐｍアンピシリンを含むＬＢ（１％ Polypepton、０．５％ Yeast Extract、１％ NaCl）液体培地で培養し、４，８００クローンからアルカリ法（Molecular Cloning Second Edition 1.25-1.28 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）にてプラスミドＤＮＡを抽出し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＮＡとＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ｆ（Millipore社）を用いて精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、Big Dye Terminater Ver. 3.1（アプライドバイオシステムズ社)を用いて反応させ、精製用磁性樹脂（CleanSeq（Beckman Coulter社）で未反応分の余剰色素を除去した。精製後のサンプルを、キャピラリーシーケンサ（ABI3730xl（アプライドバイオシステムズ社））を用いて解読した。
【００５９】
５．プライマーセットの設計
次に、このようにして得られた塩基配列情報を用いて、マイクロサテライトマーカーを検出するためのプライマー情報の作成を行った。プライマー情報の作成には、マイクロサテライトマーカー自動設計システム「Ｒｅａｄ２Ｍａｒｋｅｒ」を使用した。得られた結果のうち２塩基（ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ）の単純反復配列のみを検出対象とするようなプライマーセットを抽出し、４８０プライマーセットを合成した。
【００６０】
プライマーセットの選抜
（１）試料からのＤＮＡ抽出
キク８品種（ウッドペッカー、トゥアーマリン、フィアイビス、フィーリンググリーン、フェリスオーラ、エバーグレース、ユーロおよび神馬（いずれも販売元キリンアグリバイオ株式会社））のさし穂茎頂から、「ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ」（QIAGEN社）を使用し、添付のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは２６０ｎｍの吸光度から濃度を算出し、２ｎｇ/μｌに希釈し、以降の実験に供試した。
【００６１】
（２）多型の確認
設計したプライマーは、上記８品種から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲによる増幅を行い、多型を確認した。ＰＣＲ反応液の組成は、ＤＮＡ（２ｎｇ/μｌ）1μl、Ｇｏ−Ｔａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（プロメガ社）５μl、プライマー(２０μＭ)各０．２μl、滅菌水３．６μlとした。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の後、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃（配列番号３および４のプライマーセット(a)のみ６０℃）で３０秒間（アニーリング）、７２℃で１分間（伸長反応）を３５サイクル、最後に７２℃で５分間行った。増幅産物を０．５ｘＴＢＥバッファーで作製した３％アガロースゲルを用い０．５ｘＴＢＥバッファー中で２００Ｖ、１００分電気泳動した後、エチジウムブロマイドにより染色し、紫外光下で増幅産物を検出した。電気泳動像は、ゲル撮影装置（BIO-Doc-It UVP社）により画像データとするとともに印刷し、多型の有無を評価した。なお、分子量マーカーとしてＯｎｅＳＴＥＰ Ｌａｄｄｅｒ ５０ （０．０５〜２．０ｋｂｐ）（ニッポンジーン社）あるいは５０ｂｐ ＤＮＡ Ｓｔｅｐ Ｌａｄｄｅｒ(プロメガ社）を同時に電気泳動した。このようにして、４８０プライマーセットから、多型性に富み、増幅のよい６プライマーセット（(a)配列番号３と４、(b)配列番号５と６、(c)配列番号７と８、(d)配列番号９と１０、(e)配列番号１１と１２、(f)配列番号１３と１４）を選抜した。
【００６２】
電気泳動像の取得
（１）試料からのＤＮＡ抽出
キク１６品種（ウッドペッカー、キングフィッシャー、ゴールドストックダークリネカー、ジャジー、スケアリー、トゥアーマリン、バロック、フィアイビス、フィーリンググリーン、フィヴァチカン、フィウォッカライム、フィエナジー、フィガーネット、フィキャンドール、フィスワン、フィファルコン：いずれも販売元キリンアグリバイオ株式会社）のさし穂茎頂から、「ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ」（QIAGEN社）を使用し添付のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは２６０ｎｍの吸光度から濃度を算出し、２ｎｇ/μｌに希釈し以降の実験に供試した。
【００６３】
（２）ＰＣＲを用いたＤＮＡ断片の増幅
以下の６つのプライマーセット(a)〜(f)：
(a) atagcccctttttctcctcctcctとaaacaaggaaaattgatccactg（配列番号３、４）
(b) attgctagaggtgtgggagctcagとagatcaagaagatcaatgacgggg（配列番号５、６）
(c) aagatgctaacccaaaattaattagaとccatatgtgtattttgtgacagtt（配列番号７、８）
(d) gaaaaacaaccttcaaagtggcctとgcgggtgtttctttttcaattaacg（配列番号９、１０）
(e) ggcaactcttgaatttggcaactcとccgagaaagtgtatattccggcac（配列番号１１、１２）
(f) gttgcaccgttcgtccttaagtgtとgtcggcggtatacctttgatgaac（配列番号１３、１４）
のそれぞれについて１６品種のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応液の組成は、ＤＮＡ（２ｎｇ/μｌ）1μl、Ｇｏ−Ｔａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（プロメガ社）５μl、プライマー(２０μＭ)各０．２μl、滅菌水３．６μlとした。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の後、９４℃で３０秒間、５５℃（上記(a)のプライマーセットのみ６０℃）で３０秒間および７２℃で１分間を３５サイクル、最後に７２℃で５分間行った。
【００６４】
（３）ＤＮＡ断片の可視化
増幅ＤＮＡ断片を、０．５ｘＴＢＥバッファーで調製した３％アガロースゲルを用い０．５ｘＴＢＥバッファー中で２００Ｖ、１００分電気泳動した後、エチジウムブロマイドにより染色し、紫外光下で増幅DNA断片を検出した。電気泳動像は、ゲル撮影装置（BIO-Doc-It UVP社）により画像データとするとともに印刷し以降の解析に用いた（図１）。なお、分子量マーカーとしてＯｎｅＳＴＥＰ Ｌａｄｄｅｒ ５０（０．０５〜２．０ ｋｂｐ）（ニッポンジーン社）あるいは５０ｂｐ ＤＮＡ Ｓｔｅｐ Ｌａｄｄｅｒ（プロメガ社）を同時に電気泳動した。
【００６５】
電気泳動像の解析
図１に示す６種の電気泳動像を用いて、キク１６品種の多型解析による品種識別を試みた。いずれの図においても分子量マーカー（Ｍ）を除いて左から右に、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）である。
【００６６】
また、第１プライマーセット(a)の結果は図1Ａ、第２プライマーセット(b)の結果は図1Ｂ、第３プライマーセット(c)の結果は図1Ｃ、第４プライマーセット(d)の結果は図1Ｄ、第５プライマーセット(e)の結果は図1Ｅ、第６プライマーセット(f)の結果は図1Ｆである。
【００６７】
図１Ａでは５つの領域（図１A：1〜5）を、図１Ｂでは３領域（図1B：1〜3）、図１Ｃでは２領域（図1C：1〜2）、図１Ｄでは２領域（図1D：1〜2）、図１Ｅでは３領域（図1E：1〜3）、図１Ｆでは２領域（図1F：1〜2）の合計１７領域を定義した。
【００６８】
以下に、同時に電気泳動を行った分子量マーカーから推定されるおよその分子量領域を示す。図１において、Ａ１は２５０ｂｐ近辺、Ａ２は２００ｂｐ近辺、Ａ３は約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、Ａ４は約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、Ａ５は１００ｂｐ近辺、Ｂ１は約２５０ｂｐ〜約３５０ｂｐ、B２は２００ｂｐ近辺、Ｂ３は１００ｂｐ近辺、Ｃ１は約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、C２は約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、Ｄ１は約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、Ｄ２は約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、Ｅ１は約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、Ｅ２は約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、Ｅ３は２００ｂｐ近辺、Ｆ１は約５５０ｂｐ〜約７００ｂｐ、F２は約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐである。
【００６９】
定義された合計１７の領域について、本実施例では各領域のシグナル強度の閾値を目視により設定し、閾値以上のシグナルが１つ以上あれば「１」を、当該領域に閾値以上のシグナルがなければ「０」を記載した。
【００７０】
品種の識別
得られた結果を表１（キク１６品種の６プライマーセットによるＰＣＲ増幅断片に存在する多型の解析例）に示す。なお、表１に記載の品種の配列番号１〜１６は上記の図での付番と一致する。１７個のマーカーの有無により、各品種の結果を１７桁の２進法の数値で記載することができる。これら２進法の数値を１０進法に変換した数値を表１の最下行に記載した。このように用いた１６品種はすべて異なる数値で表され、個別のマーカー型を持つことが示された。一定以上のシグナルだけを抽出し、シグナルを生む分子種の同一性を無視し、領域を定義することにより非相同性およびずれを許容し隣接したシグナルを１つとみなすことにより、解析を容易にすることが可能であった。また、このようにして解析した多型データにより品種を識別することが可能であった。
【００７１】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間等の互いに識別したい対象間の多型を評価することができるので、農業上または医学上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(a)（配列番号３および４）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【図１Ｂ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(b)（配列番号５および６）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【図１Ｃ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(c)（配列番号７および８）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【図１Ｄ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(d)（配列番号９および１０）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【図１Ｅ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(e)（配列番号１１および１２）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【図１Ｆ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(f)（配列番号１３および１４）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
配列番号１、２：プローブ
配列番号３〜１４：プライマー
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物の核酸多型を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、核酸の塩基配列の違いを利用して、生物の個体、種、品種、遺伝子型などを識別する方法が多く開発されている（例えば、特許文献１〜４）。これらの方法は、ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの多型に関わる部分を増幅させるプライマーを開発し、該プライマーを使用して対象のＤＮＡ断片を増幅し、ＤＮＡ断片の有無あるいは分子量の相違によって、多型を評価することにより、核酸の相違の判別を行っている。
【０００３】
増幅されたＤＮＡ断片は、ポリアクリルアミドゲルやアガロースゲルなどの支持体を用いたゲル電気泳動あるいはキャピラリー電気泳動により分子量に基づき分離され、可視化された後、多型が評価される。
【０００４】
多型の評価は、増幅したＤＮＡ断片のうち特定の分子種について増幅の有無を判断することおよび検出したＤＮＡ断片が目的のものであるか否かを判断することによりなされる。しかし、増幅量が少ない場合に増幅の有無を判断することおよび試料ごとの電気泳動による移動度のずれを同一分子種とみなすか否かを判断することが難しく、これらの困難さは結果解析の再現性を低下させるとともに自動化に対する障壁となっている。前者については、可視化したＤＮＡ断片のシグナル強度を補正する手段がいくつか報告されている（例えば、特許文献５）。また、後者については、例えば特許文献６では、目的とする特定ＤＮＡ断片の移動度測定において、分子量プラスマイナス５％の範囲としてずれを許容している。
【０００５】
【特許文献１】特許第２８１８４８６号公報
【特許文献２】特許第３２１８３１８号公報
【特許文献３】特表２００２−５４０７９９号公報
【特許文献４】特許第３２３６２９５号公報
【特許文献５】特開２００３−２５０５４１号公報
【特許文献６】特開２００３−９３０６５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
このように、従来技術は同一あるいは相同な特定の目的とするＤＮＡ断片の有無の評価および、ＤＮＡ断片の電気泳動における移動度の測定により多型解析が行われている。しかし、従来技術はＤＮＡ断片の量が多い場合で、かつ近接した移動度の領域に目的とするＤＮＡ断片以外の断片が存在しない場合のみに有効であり、それ以外の場合多型の有無の判断が容易でない。
【０００７】
本発明はこのような従来の問題に鑑み、特に従来技術で難しい複数の核酸断片からなる試料の多型評価方法の提供を目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
以下のように発想を転換し多型を評価することにより、上述の如き従来の問題を解決し目的を達成することができる。つまり、従来は特定の分子量をもつ特定のＤＮＡ断片の有無を評価していたが、本発明ではＤＮＡ断片の素性を問わずに判別しやすい分子量範囲を定義し、その範囲内の分子量をもつＤＮＡ断片を１つに限らず、１つ以上存在するか否かのみを記載することにより極めて容易に多型を評価することができる。別の言い方をすれば、本発明の方法の特徴は、増幅したＤＮＡ断片の分子種の相同性を無視し、定義した範囲内の分子量をもつＤＮＡ断片の存在のみを指標に解析を行う核酸の多型評価方法にある。ここで定義した範囲内に検出されるＤＮＡ断片の数は無視される。
【０００９】
したがって、本発明は、以下の特徴を有する。
本発明は、生物由来のＤＮＡまたはＲＮＡから、ＤＮＡ断片の増幅処理を行い、分子量に基づき該増幅ＤＮＡ断片を視覚化可能に分離したのち、識別可能な個々のＤＮＡ断片に対して予め定義された分子量範囲に基づいて、該分子量範囲内に、所定のシグナル強度の閾値を超える増幅ＤＮＡ断片が存在するかもしくは存在しないかを決定し、各増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在を数値化し、得られた数値データを、該増幅ＤＮＡ断片について、各試料間で比較するか、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較することを含む、生物の核酸多型を評価する方法を提供する。
【００１０】
その実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片の数は、互いを識別できる限り、比較する片方の試料では０でも構わない。
【００１１】
別の実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在を数値化するにあたって必要な分子量範囲の数は少なくとも１である。
【００１２】
別の実施形態において、上記分離は電気泳動にて行なわれる。
別の実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片の分子量範囲が、後述の実施例に記載されるようにキク品種間の識別の場合、約５０ｂｐ〜約１０００ｂｐの間に任意に設定される。
【００１３】
別の実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在の数値化が、２進法の数値で表わされる。
【００１４】
別の実施形態において、上記２進法の数値がさらに１０進法に変換される。
別の実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片について表した上記２進法の数値をさらに、各試料の数値データ間で比較するか、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較する。
【００１５】
ここで「既知生物の核酸で予め決定された数値データ」とは、既知の生物の核酸について、公表又は未公表に関わらず、すでに過去に分析されている（言い換えれば、予め決定されている）データをいう。
【００１６】
別の実施形態において、上記増幅ＤＮＡ断片が反復ＤＮＡを含む領域である。
別の実施形態において、上記反復ＤＮＡがマイクロサテライトである。
別の実施形態において、上記生物が真核生物である。
別の実施形態において、上記生物が植物である。
別の実施形態において、上記植物がキク科植物である。
別の実施形態において、上記キク科植物がキク属植物である。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の方法は、増幅したＤＮＡ断片の分子種の相同性や数を無視し、定義した範囲内の分子量をもつＤＮＡ断片の存在のみを指標にするため、増幅ＤＮＡ断片の識別が容易になり、すなわちコンピューターによる識別が可能になり、したがって簡易な手法で、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間の核酸多型を評価することを可能にする。その結果、多型解析が格段に容易になり、また、その自動化が可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
本発明によれば、生物の核酸多型を評価する方法は、
(1) 生物由来のＤＮＡまたはＲＮＡから、ＤＮＡ断片の増幅処理を行うこと、
(2) 分子量に基づき該増幅ＤＮＡ断片を視覚化可能に分離すること、
(3) 識別可能な個々のＤＮＡ断片に対して予め定義された分子量範囲に基づいて、該分子量範囲内に、所定のシグナル強度の閾値を超える増幅ＤＮＡ断片が存在するかもしくは存在しないかを決定すること、
(4) 各増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在を数値化すること、
(5) (4)で得られた数値データを、増幅ＤＮＡ断片各々について、各試料の数値データ間で比較すること、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較すること、
からなるステップを含む。
【００１９】
上記ステップ(1)で、試料となる核酸は、生物由来の試料から抽出されたＤＮＡおよびＲＮＡである。ＤＮＡは、例えば核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを含む。ｃＤＮＡは、ＲＮＡから逆転写酵素の作用により合成される。一方、ＲＮＡは、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどを含む。本発明の方法では、ＲＮＡは、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成した後、ＤＮＡ断片の増幅のために使用される。
【００２０】
試料となるＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型にし、かつＤＮＡ断片を増幅させるプライマーを使用して、ＤＮＡ断片の増幅を行う。本明細書で使用される「増幅」なる用語は、通常、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」という）を利用した核酸の増幅を意味する。
【００２１】
ＰＣＲは、鋳型としての二本鎖ＤＮＡの増幅領域の５’末端側と３’末端側に相補的な約１５〜約３０塩基長、好ましくは１７〜２５塩基長の塩基配列からなるセンスプライマー（正方向プライマーともいう）とアンチセンスプライマー（逆方向プライマーともいう）、ｄＮＴＰ（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲバッファー（Ｍｇ２＋含有）中で行われる。
【００２２】
本発明でいうＤＮＡの増幅領域は多型が検出される限りどの部分でもよいが、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間等の互いに識別したい対象同士で変化に富んでいる（すなわち、突然変異を起こしやすい）ＤＮＡ領域が好ましく選択される。ＤＮＡの増幅領域は、多型が検出される限りどの部分でもよいが、例えばＳＳＲ(Simple Sequence Repeat)領域等の反復DNAを含む領域以外に、ＩＳＳＲ(Inter-Simple Sequence Repeat)領域、ＳＮＰ(Single Nucleotide Polymorphism)を含む領域、ＲＦＬＰ(Restriction Fragment Length Polymorphism)領域、ＣＡＰＳ(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)領域、ＲＡＰＤ(Random Amplified Polymorphic DNA)領域、ＡＦＬＰ(Amplified Fragment Length Polymorphism)領域等、対象とする生物に独自に存在しているためそれらを指標とすれば互いを識別できる可能性のある領域である。
【００２３】
このうち反復ＤＮＡは、真核生物のゲノム（例えば、核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ）上に存在することが知られている。とりわけ公知の反復ＤＮＡは、サテライトＤＮＡ、ミニサテライトおよびマイクロサテライトである。
【００２４】
サテライトＤＮＡは、セントロメア領域やサブテロメア領域に局在していることが多く、例えば約１００〜３００ｂｐの単位配列が、例えば約１０００〜１００，０００回繰り返したような反復構造を有している。
【００２５】
ミニサテライトは、ゲノム上に存在する反復配列であり、約１０〜６０ｂｐの中間サイズのＤＮＡモチーフから構成されている。
【００２６】
マイクロサテライトは、生物、とりわけ真核生物のゲノム上に散在する反復配列であり、数塩基（約１〜６ｂｐ）程度の短い単位配列の繰り返しからなる。反復単位は、通常２〜４ｂｐであり、数回〜１００回程度またはそれ以上繰り返す場合もある。単位配列は、例えば（Ａ）ｎ、（ＡＴ）ｎ、（ＣＡ）ｎ、（ＧＡ）ｎ（ここで、ｎは２以上の整数、例えば５〜１５０である。）などを含む。
【００２７】
上記のような反復配列は、繰り返しの数が多いほど突然変異を蓄積しやすくなり、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間の多型、疾患（異常）などの原因になるといわれている。特に、マイクロサテライトは、生物の多型評価のために利用されることが多く、本発明においても好適なＤＮＡの増幅領域対象である。他のＩＳＳＲ等に関する説明は、DNA Fingerprinting in Plants, second edition, CRC Press, 2005, ISBN 0-8493-1488-7等に詳細に記載されている。
【００２８】
本明細書で使用される「生物」とは、真核生物および原核生物の両方を指す。真核生物には、動物、植物、酵母等の菌類、藻類などが含まれ、一方、原核生物には細菌類が含まれる。
【００２９】
生物組織や細胞からゲノムＤＮＡを抽出する方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（Short Protocols in Molecular Biology, 第3版, John Wiley & Sons (1995)）などに記載されている。例えば、動物または植物組織を液体窒素で凍結し破壊したのち、動物組織の場合トリプシンなどの消化酵素を含有するバッファーで、植物組織の場合N-ラウロイルサルコシルを含有する抽出バッファーでそれぞれ処理し、遠心操作ののち、ＤＮＡをフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、クロロホルム/オクタノール、クロロホルム/イソアミルアルコール、塩化セシウム飽和イソプロパノールなどの有機溶媒で抽出し、エタノールで沈殿させ、回収することができる。また、別の例として、細菌ゲノムからＤＮＡを抽出する方法では、ＳＤＳおよびプロテイナーゼＫを含有するＴＥバッファーで培養細菌を処理したのち、５Ｍ ＮａＣｌを加えてＣＴＡＢ／ＮａＣｌで処理し、クロロホルム/イソアミルアルコール、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、イソプロパノールなどでＤＮＡを抽出し、エタノールで沈殿させる。一方、ＲＮＡの抽出法については、例えば、動物あるいは植物組織または細胞を液体窒素で凍結し破壊する、浸透圧衝撃で破壊するなどの手法で破壊したのち、N-ラウロイルサルコシルおよび塩化セシウムを含有するグアニジウム溶液で処理し、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、クロロホルム/イソアミルアルコールなどの有機溶媒でＲＮＡを抽出し、エタノールで沈殿し、回収する。細菌からのＲＮＡの抽出は、例えばフェノール/クロロホルム、フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール、クロロホルム/イソアミルアルコールなどの有機溶媒で抽出することを含む方法などで行うことができる。
【００３０】
本明細書で使用する「ゲノムＤＮＡ」とは、動物細胞、植物細胞、菌類細胞、細菌細胞などの生物細胞内の核ＤＮＡ、ミトンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡなどを指す。したがって、上記の方法で抽出・単離されたゲノムＤＮＡまたはその断片は、ＰＣＲの鋳型として使用される。
【００３１】
ＰＣＲに使用されるプライマーは、上述の通り多型が検出される限りいずれでもよいが、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間等の互いに識別したい対象同士で変化に富んでいる（すなわち、突然変異を起こしやすい）ゲノムＤＮＡ領域を増幅するものは多型を示しやすいので利用価値が高い。さらに好ましくは反復ＤＮＡを含む領域、より好ましくはマイクロサテライトを含む領域を増幅するプライマーから選択されることが望ましい。
【００３２】
マイクロサテライトなどの反復ＤＮＡは、生物種別の反復配列データベースを有するｒｅｐｅａｔ ｍａｓｋｅｒ(http://www.repeatmasker.org/)にアクセスすることによって類似性検索をすることができる。このようなデータベースから決定された反復ＤＮＡの塩基配列を挟むようにしてＰＣＲに用いるプライマーを設計することができる。あるいは、不特定の反復ＤＮＡを検出するために、生物由来のＤＮＡ断片をベクター（プラスミド、ファージなど）に組込み、大腸菌に導入してｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーを作製し、目的の標識化反復配列とハイブリダイズさせて、目的のクローンを選抜し、このクローンからＤＮＡを回収し、配列決定してもよい。このような一連の操作は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 第２版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press）などに記載されている。
【００３３】
ＰＣＲは、９４℃で１分〜２分の初期変性ののち、９４℃で２０秒〜３０秒（変性ステップ）、５０℃〜６０℃で３０秒（アニーリングステップ）、および７２℃で３０秒〜５分（伸長ステップ）を１サイクルとして３０〜４０サイクルを実施し、最後に、７２℃で１分〜３分の伸長反応を行うことを含む。
【００３４】
ＰＣＲバッファーは、例えば、２００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．３，５００ｍＭ ＫＣｌ，２０ｍＭ ＭｇＣｌ２，０．０１％ ｇｅｌａｔｉｎからなる溶液を約１０倍希釈して反応に使用される。これに、例えば、２００μＭずつのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；０．８μＭプライマー；１ユニットの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ；１〜１００ｎｇ鋳型ＤＮＡが含有される。
【００３５】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、例えばＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼは市販されているので、それらを使用することが望ましい。
【００３６】
また、例えばサーマルサイクラー(Thermal Cycler)などのＰＣＲ反応装置が市販されているので、このような装置を利用することが望ましい。
【００３７】
上記第２ステップでは、分子量に基づき増幅ＤＮＡ断片を視覚化可能に分離する。
分離手段は、分子量のサイズの差に基づいてＤＮＡ断片を分離することを可能にする任意の手段を含む。このような手段には、電気泳動、サザンハイブリダイゼーション、ノザンハイブリダイゼーションなどのハイブリダイゼーションなどが含まれる。好ましい手段は、電気泳動、例えばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミド電気泳動、キャピラリー電気泳動などである。
【００３８】
ゲル電気泳動の場合、アガロースまたはアクリルアミドの含量（％）によって、分離可能なＤＮＡ断片のサイズ範囲が決まる。本発明では、増幅されたＤＮＡ断片の分子量は識別対象とする生物のみならずＰＣＲやその後の電気泳動の条件等に左右されるため限定することはできないが、例えば実施例に記載されているキク品種間の識別においては、増幅されたＤＮＡ断片の分子量が５０ｂｐ〜１０００ｂｐの間に入るようにすることが好ましいため、約1〜３％アガロースゲル、約３．５〜１２％アクリルアミドが使用される。
【００３９】
電気泳動バッファーは、通常、ＴＡＥまたはＴＢＥバッファーである。
電気泳動の操作については、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）に記載されている。
【００４０】
分離されたＤＮＡ断片は次いで、可視化される。可視化は、エチジウムブロマイド、蛍光色素（例えばシアン、ビーナスなど）、放射性同位元素（例えば３２Ｐなど）などの染料や標識を利用して行われる。
【００４１】
可視化された結果には、増幅されたＤＮＡ断片の量と分子量の情報が存在する。このうちＤＮＡ断片の量はシグナル（例えば、染料または標識）の強度により表される。また、分子量は電気泳動の移動度により表される。ＤＮＡ断片の量については、濃度既知のＤＮＡ断片を同時に電気泳動すれば濃度を推定することが可能である。また、ＤＮＡ断片の分子量については、分子量既知のＤＮＡ断片を同時に電気泳動すれば分子量を推定することが可能である。
【００４２】
本発明では、シグナル強度について閾値（すなわち、有効な強度の最小値）を設定する。閾値の設定はシグナルの強度自体でもよいし、同時に増幅される他のＤＮＡ断片のシグナル強度を内部標準にし、内部標準に対する相対値でもよい。例えばリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子など生物種を越えて存在する遺伝子のプライマーセットも加えＰＣＲ反応を行うことにより得られるＤＮＡ断片のうちリボソームＲＮＡ遺伝子断片のシグナル強度を内部標準にし、内部標準のシグナルに対するシグナル強度の比を設定することも可能である。内部標準の例は、ｒＲＮＡの他に、ハウスキーピング遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）もしくはそのｃＤＮＡを含む。ハウスキーピング遺伝子は、細胞内で実質的に変動のない発現量を示す遺伝子であり、例えばアクチン遺伝子などが含まれる。設定したシグナル強度あるいはシグナル強度比（閾値）以上のシグナルが検出されるときシグナルが有る、あるいは、設定したシグナル強度もしくはシグナル強度比未満のときシグナルなしと判断する。設定するシグナル強度またはシグナル強度比は任意に設定することが可能である。
【００４３】
第３ステップでは、識別可能な個々のＤＮＡ断片に対して予め定義された分子量範囲に基づいて、該分子量範囲内に、所定のシグナル強度の閾値を超える増幅ＤＮＡ断片が存在するかもしくは非存在かを決定する。
【００４４】
分子量範囲については、分離手段によって分離されたＤＮＡ断片が判別しやすい範囲を定義する。本発明の実施形態によれば、そのような分子量範囲は、非限定的に、例えば約５０ｂｐ〜約１０００ｂｐの間に任意に設定しうる。例えば、電気泳動の場合、ＤＮＡ断片のバンドは、ある定義された分子量範囲、例えば約５０ｂｐ〜約２００ｂｐの幅で設定された範囲（例えば、約１００〜約１５０ｂｐ、約１５０〜約２００ｂｐ、約２００〜約２５０ｂｐ、約２５０〜約３００ｂｐ、約３００〜約３５０ｂｐ、・・・約５５０〜約７００ｂｐ、約８００〜約１０００など）内に存在するか否かを決定する。定義された分子量に基づく範囲内に所定の閾値以上のシグナル強度をもつ１つまたは複数のＤＮＡ断片を１つのマーカーと呼ぶ。
【００４５】
上記第４ステップにおいて、定義された範囲内に所定の閾値以上のシグナルが１つ以上あるとき「１」、定義された範囲内に所定の閾値以上のシグナルがないとき「０」と記載するように、ＤＮＡ断片の存在または非存在を数値によって表す。この数値を、対象となる複数の分子量範囲について順に並べることにより２進法の数値とする。得られた数値を各試料間で比較することにより、あるいは既知生物の数値データと比較することにより、数値が一致すれば互いに同一の多型を有する生物分類階級のいずれかの階級に属するもの（例えば個体、品種、種又は属等）であると判定または推定する。なお、さらに必要に応じて、例えば１０進法の数値に変換しその合計値を各試料間で比較することにより、あるいは既知生物の数値データと比較することにより、識別することが可能である。
【００４６】
このような分子量範囲の数は、１つ以上で、可視化されたＤＮＡ断片数のもっとも多いサンプルのＤＮＡ断片数を最大とした範囲の任意の数でよい。後述の実施例では、キク１６品種の識別を上記方法で行った例を示すが、キク１６品種では、電気泳動の移動度として図１Ａ〜Ｆに示す四角で囲った範囲を定義した。バンドとして識別可能なＤＮＡ断片を有する大体の範囲を目視で設定することは容易である。
【００４７】
上記第５ステップにおいて、このようにして得られた１つ以上のマーカーについての記載を各試料間で比較することにより、あるいは既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較することにより、多型を評価し相違を判別することが可能となる。このように、シグナル強度および領域として定義した移動度という２つのデータを処理することにより容易にＤＮＡ断片の多型評価が可能である。
【００４８】
本発明の上記方法によって、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間等の識別や多型を評価することが可能になる。特に、マイクロサテライトを含む領域をターゲットにする場合には、多型評価だけでなく、疾患の有無も判定することが可能になるだろう。疾患は、ハンチントン病などの遺伝病、癌などの遺伝子変異によって引き起こされるものを含む。
【００４９】
上述したアルゴリズムは自動化が可能である。例えば、電気泳動像をカメラやイメージスキャナーを用いてコンピューターに取り込み、シグナル強度の閾値と調査する範囲を設定し、各試料について上述した「１」、「０」を出力することで自動化が可能である。また、蛍光ラベルした増幅ＤＮＡ断片を試料とした場合には、蛍光ＤＮＡ塩基配列決定装置（例えばアプライドバイオシステムズジャパン社のジェネティックアナライザー）を用いることにより、蛍光強度の閾値と調査する電気泳動移動度の範囲を設定し、各試料について上述した「１」、「０」を出力することで、増幅したＤＮＡ断片から多型解析結果の出力までを自動化することが可能である。このように、カメラやイメージスキャナーをコンピューターと一体化した機器とすれば、自動的に多型解析できるシステムとなる。
【００５０】
シグナル強度は、試料ＤＮＡに共存するＰＣＲ反応の効率を阻害する物質の濃度が各試料間でふれると、再現性が低くなる場合がある。このような心配がある各試料間の比較は内部標準を用いることで解決される。また、移動度の範囲をずれの範囲より広く定義することで、容易に再現性を確保することができる。
【００５１】
本発明による核酸の多型評価方法は、真核生物および原核生物を含む生物に使用可能である。本発明の方法は、動物、植物、菌類、藻類などの真核生物の多型評価に好ましく使用される。以下の実施例では、本発明の方法によって、生物のうち植物、特にキク科植物の中で比較的多品種でかつ実用性の高いキク属植物の品種間を識別する例を示す。
【実施例】
【００５２】
次に、以下の実施例によって本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明の技術的範囲を制限するものではない。
【００５３】
プライマーセットの設計
１．試料からのＤＮＡ抽出
キク品種「セイプリンス」（販売元：有限会社精興園）の未展開葉１ｇ（１０〜１２個）を液体窒素に浸漬させ凍結し、パウダー状になるまで粉砕した。凍結状態のサンプルに沸騰直前まで温めた１．５×ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド）抽出バッファーを５ｍｌ加えてＤＮＡを抽出し、等量のクロロホルム−イソアミルアルコール（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え、遠心機で遠心分離（３０００ｒｐｍ、常温、３０分間）の後に上清を採取することによる除タンパク質処理を２回行った。
【００５４】
その後ＣＴＡＢ沈殿バッファー７．５ｍｌを加え析出したＤＮＡをイノキュレーションループで掬いとり、１０ｎｇ/ｍｌ ＲＮａｓｅを含む１Ｍ ＮａＣｌ２ｍｌに再溶解した。水溶性の夾雑物と塩類を除去するために、エタノール２．５倍量を加え混和した後に、遠心分離して得た沈殿を７０％エタノールで洗浄し、最終沈殿物をＴＥ溶液１００μｌに溶解した。
【００５５】
２．ＤＮＡライブラリーの作製
得られた「セイプリンス」のゲノムＤＮＡ約３．０μｇを超音波破砕した後、０．５ μｌ Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを加え、３７℃で５分放置して末端の平滑化を行った。このＤＮＡをアガロースゲル(１．２％)電気泳動（１．０％、０．５ｘＴＢＥバッファー、１００Ｖ、１５分）により分離した後、１ｋｂから１．５ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片３．５μｌ、ライゲーションバッファー０．５μｌ、プラスミドベクター（ｐＵＣ１８）０．５μｌ、Ｔ４リガーゼ０．５μｌ（１Ｕ/μｌ）を加えた反応液を調製し、一晩反応させてＤＮＡ断片をプラスミドベクターに挿入した。ＤＮＡ断片を挿入したプラスミドベクターは、エレクトロポレーション法にてコンピテントセル（大腸菌株ＤＨ１０Ｂ）へ形質転換させた。形質転換した細胞は、２５ｐｐｍアンピシリンを含むＬＢ寒天培地（1% Polypepton、0.5% Yeast Extract、1% NaCl、1.5% Bacto Agar）上で、３７℃で一晩培養し、生育するコロニーからなるライブラリーを作製した。得られた形質転換体約６０万クローンをプール化し、アルカリＳＤＳ法を用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。
【００５６】
３．ＤＮＡライブラリーの濃縮
まず、以下の塩基配列からなる２種類のオリゴヌクレオチド（ＣＡ−オリゴおよびＴＧ−オリゴ）を合成した。ＣＡ−オリゴは、５'側から３'側に向かって、３０ｍｅｒからなるＡの連鎖と、それに続く（ＣＡ）の２５回の繰り返しからなる(配列番号１)。ＴＧ−オリゴは、５'側から３'側に向かって、３０ｍｅｒからなるＡの連鎖と、それに続く（ＴＧ）の２５回の繰り返しからなる（配列番号２）。
【００５７】
これらのプローブを、Ａｍｅｒｓｈａｍ社のＭｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮＡ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍを利用してビオチン化した。具体的な操作は次のとおりである。まず、ＣＡ−オリゴ２００ｐｍｏｌ とＴＧ−オリゴ２００ｐｍｏｌ をアニーリング（室温で混合）させた。次いで、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰをそれぞれ２０ｐｍｏｌ加え、最後に、ビオチン２１−ｄＵＴＰを１０００ｐｍｏｌ加えた。更に、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を２ユニット加えて、室温で２時間反応させた。作製したビオチン化プローブを５分間煮沸後に氷上で急冷して１本鎖化した。１本鎖化したビオチン化プローブに２．５ｍＭ ＣｏＣｌ２、ＡＴＰ (ＡＴＰとＡＴＰ−ｇｕｍｍａ−Ｓの混合液)、およびＲｅｃＡタンパク８μgを加えて、３７℃で２０分間インキュベートした。次いで、上記２．で作製されたプラスミドライブラリー１０μｇを加えて３７℃で１時間インキュベートして、３重鎖を形成させた。その後、０．１％ＳＤＳ存在下でプロティナーゼＫ処理によってＲｅｃＡを分解し、さらにPhenylmethylsulfonyl Fluoride(ＰＭＳＦ)を加えてプロティナーゼＫを不活化した。ビオチン化プローブとプラスミドベクターを含む液を、緩衝液で平衡化したＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ磁気ビーズと混合した。室温で放置後、ストレプトアビジンと結合しなかったＤＮＡを洗浄液(１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ (ｐＨ７．５)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ)で洗浄した。洗浄後にアルカリ液(０．１Ｎ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）によって結合したＤＮＡを溶出した。溶出されたプラスミドベクターはエタノール沈殿法で精製し、エレクトロポレーション法にてコンピテントセル（大腸菌株ＤＨ１０Ｂ）へ形質転換させた。
【００５８】
４．挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列決定
続いて、整列化したクローンに挿入されているＤＮＡ断片の塩基配列を解読した。まず、大腸菌クローンを３７℃で一晩、５０ｐｐｍアンピシリンを含むＬＢ（１％ Polypepton、０．５％ Yeast Extract、１％ NaCl）液体培地で培養し、４，８００クローンからアルカリ法（Molecular Cloning Second Edition 1.25-1.28 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）にてプラスミドＤＮＡを抽出し、ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ ＮＡとＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ Ｆ（Millipore社）を用いて精製した。得られたプラスミドＤＮＡを、Big Dye Terminater Ver. 3.1（アプライドバイオシステムズ社)を用いて反応させ、精製用磁性樹脂（CleanSeq（Beckman Coulter社）で未反応分の余剰色素を除去した。精製後のサンプルを、キャピラリーシーケンサ（ABI3730xl（アプライドバイオシステムズ社））を用いて解読した。
【００５９】
５．プライマーセットの設計
次に、このようにして得られた塩基配列情報を用いて、マイクロサテライトマーカーを検出するためのプライマー情報の作成を行った。プライマー情報の作成には、マイクロサテライトマーカー自動設計システム「Ｒｅａｄ２Ｍａｒｋｅｒ」を使用した。得られた結果のうち２塩基（ＡＧ、ＡＣ、ＡＴ、ＧＡ、ＧＣ、ＧＴ、ＣＡ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＡ、ＴＧ、ＴＣ）の単純反復配列のみを検出対象とするようなプライマーセットを抽出し、４８０プライマーセットを合成した。
【００６０】
プライマーセットの選抜
（１）試料からのＤＮＡ抽出
キク８品種（ウッドペッカー、トゥアーマリン、フィアイビス、フィーリンググリーン、フェリスオーラ、エバーグレース、ユーロおよび神馬（いずれも販売元キリンアグリバイオ株式会社））のさし穂茎頂から、「ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ」（QIAGEN社）を使用し、添付のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは２６０ｎｍの吸光度から濃度を算出し、２ｎｇ/μｌに希釈し、以降の実験に供試した。
【００６１】
（２）多型の確認
設計したプライマーは、上記８品種から抽出したＤＮＡを用いてＰＣＲによる増幅を行い、多型を確認した。ＰＣＲ反応液の組成は、ＤＮＡ（２ｎｇ/μｌ）1μl、Ｇｏ−Ｔａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（プロメガ社）５μl、プライマー(２０μＭ)各０．２μl、滅菌水３．６μlとした。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の後、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃（配列番号３および４のプライマーセット(a)のみ６０℃）で３０秒間（アニーリング）、７２℃で１分間（伸長反応）を３５サイクル、最後に７２℃で５分間行った。増幅産物を０．５ｘＴＢＥバッファーで作製した３％アガロースゲルを用い０．５ｘＴＢＥバッファー中で２００Ｖ、１００分電気泳動した後、エチジウムブロマイドにより染色し、紫外光下で増幅産物を検出した。電気泳動像は、ゲル撮影装置（BIO-Doc-It UVP社）により画像データとするとともに印刷し、多型の有無を評価した。なお、分子量マーカーとしてＯｎｅＳＴＥＰ Ｌａｄｄｅｒ ５０ （０．０５〜２．０ｋｂｐ）（ニッポンジーン社）あるいは５０ｂｐ ＤＮＡ Ｓｔｅｐ Ｌａｄｄｅｒ(プロメガ社）を同時に電気泳動した。このようにして、４８０プライマーセットから、多型性に富み、増幅のよい６プライマーセット（(a)配列番号３と４、(b)配列番号５と６、(c)配列番号７と８、(d)配列番号９と１０、(e)配列番号１１と１２、(f)配列番号１３と１４）を選抜した。
【００６２】
電気泳動像の取得
（１）試料からのＤＮＡ抽出
キク１６品種（ウッドペッカー、キングフィッシャー、ゴールドストックダークリネカー、ジャジー、スケアリー、トゥアーマリン、バロック、フィアイビス、フィーリンググリーン、フィヴァチカン、フィウォッカライム、フィエナジー、フィガーネット、フィキャンドール、フィスワン、フィファルコン：いずれも販売元キリンアグリバイオ株式会社）のさし穂茎頂から、「ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ」（QIAGEN社）を使用し添付のプロトコールに従いゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは２６０ｎｍの吸光度から濃度を算出し、２ｎｇ/μｌに希釈し以降の実験に供試した。
【００６３】
（２）ＰＣＲを用いたＤＮＡ断片の増幅
以下の６つのプライマーセット(a)〜(f)：
(a) atagcccctttttctcctcctcctとaaacaaggaaaattgatccactg（配列番号３、４）
(b) attgctagaggtgtgggagctcagとagatcaagaagatcaatgacgggg（配列番号５、６）
(c) aagatgctaacccaaaattaattagaとccatatgtgtattttgtgacagtt（配列番号７、８）
(d) gaaaaacaaccttcaaagtggcctとgcgggtgtttctttttcaattaacg（配列番号９、１０）
(e) ggcaactcttgaatttggcaactcとccgagaaagtgtatattccggcac（配列番号１１、１２）
(f) gttgcaccgttcgtccttaagtgtとgtcggcggtatacctttgatgaac（配列番号１３、１４）
のそれぞれについて１６品種のゲノムＤＮＡを鋳型にＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ反応液の組成は、ＤＮＡ（２ｎｇ/μｌ）1μl、Ｇｏ−Ｔａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（プロメガ社）５μl、プライマー(２０μＭ)各０．２μl、滅菌水３．６μlとした。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の後、９４℃で３０秒間、５５℃（上記(a)のプライマーセットのみ６０℃）で３０秒間および７２℃で１分間を３５サイクル、最後に７２℃で５分間行った。
【００６４】
（３）ＤＮＡ断片の可視化
増幅ＤＮＡ断片を、０．５ｘＴＢＥバッファーで調製した３％アガロースゲルを用い０．５ｘＴＢＥバッファー中で２００Ｖ、１００分電気泳動した後、エチジウムブロマイドにより染色し、紫外光下で増幅DNA断片を検出した。電気泳動像は、ゲル撮影装置（BIO-Doc-It UVP社）により画像データとするとともに印刷し以降の解析に用いた（図１）。なお、分子量マーカーとしてＯｎｅＳＴＥＰ Ｌａｄｄｅｒ ５０（０．０５〜２．０ ｋｂｐ）（ニッポンジーン社）あるいは５０ｂｐ ＤＮＡ Ｓｔｅｐ Ｌａｄｄｅｒ（プロメガ社）を同時に電気泳動した。
【００６５】
電気泳動像の解析
図１に示す６種の電気泳動像を用いて、キク１６品種の多型解析による品種識別を試みた。いずれの図においても分子量マーカー（Ｍ）を除いて左から右に、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）である。
【００６６】
また、第１プライマーセット(a)の結果は図1Ａ、第２プライマーセット(b)の結果は図1Ｂ、第３プライマーセット(c)の結果は図1Ｃ、第４プライマーセット(d)の結果は図1Ｄ、第５プライマーセット(e)の結果は図1Ｅ、第６プライマーセット(f)の結果は図1Ｆである。
【００６７】
図１Ａでは５つの領域（図１A：1〜5）を、図１Ｂでは３領域（図1B：1〜3）、図１Ｃでは２領域（図1C：1〜2）、図１Ｄでは２領域（図1D：1〜2）、図１Ｅでは３領域（図1E：1〜3）、図１Ｆでは２領域（図1F：1〜2）の合計１７領域を定義した。
【００６８】
以下に、同時に電気泳動を行った分子量マーカーから推定されるおよその分子量領域を示す。図１において、Ａ１は２５０ｂｐ近辺、Ａ２は２００ｂｐ近辺、Ａ３は約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、Ａ４は約１００ｂｐ〜約１５０ｂｐ、Ａ５は１００ｂｐ近辺、Ｂ１は約２５０ｂｐ〜約３５０ｂｐ、B２は２００ｂｐ近辺、Ｂ３は１００ｂｐ近辺、Ｃ１は約３００ｂｐ〜約３５０ｂｐ、C２は約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、Ｄ１は約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、Ｄ２は約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、Ｅ１は約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐ、Ｅ２は約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐ、Ｅ３は２００ｂｐ近辺、Ｆ１は約５５０ｂｐ〜約７００ｂｐ、F２は約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐである。
【００６９】
定義された合計１７の領域について、本実施例では各領域のシグナル強度の閾値を目視により設定し、閾値以上のシグナルが１つ以上あれば「１」を、当該領域に閾値以上のシグナルがなければ「０」を記載した。
【００７０】
品種の識別
得られた結果を表１（キク１６品種の６プライマーセットによるＰＣＲ増幅断片に存在する多型の解析例）に示す。なお、表１に記載の品種の配列番号１〜１６は上記の図での付番と一致する。１７個のマーカーの有無により、各品種の結果を１７桁の２進法の数値で記載することができる。これら２進法の数値を１０進法に変換した数値を表１の最下行に記載した。このように用いた１６品種はすべて異なる数値で表され、個別のマーカー型を持つことが示された。一定以上のシグナルだけを抽出し、シグナルを生む分子種の同一性を無視し、領域を定義することにより非相同性およびずれを許容し隣接したシグナルを１つとみなすことにより、解析を容易にすることが可能であった。また、このようにして解析した多型データにより品種を識別することが可能であった。
【００７１】
【表１】
【産業上の利用可能性】
【００７２】
本発明は、生物の分類階級間、例えば、界間、門間、綱間、目間、科間、属間、種間、品種間、系統間、または個体間等の互いに識別したい対象間の多型を評価することができるので、農業上または医学上有用である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(a)（配列番号３および４）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【図１Ｂ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(b)（配列番号５および６）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【図１Ｃ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(c)（配列番号７および８）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【図１Ｄ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(d)（配列番号９および１０）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【図１Ｅ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(e)（配列番号１１および１２）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【図１Ｆ】１６品種のキクから抽出したＤＮＡを鋳型に、プライマーセット(f)（配列番号１３および１４）を用いてＰＣＲ増幅した産物の電気泳動像。左のレーンより、分子量マーカー（M）、ウッドペッカー（１）、キングフィッシャー（２）、ゴールドストックダークリネカー（３）、ジャジー（４）、スケアリー（５）、トゥアーマリン（６）、バロック（７）、フィアイビス（８）、フィーリンググリーン（９）、フィヴァチカン（１０）、フィウォッカライム（１１）、フィエナジー（１２）、フィガーネット（１３）、フィキャンドール（１４）、フィスワン（１５）、フィファルコン（１６）、分子量マーカー（M）。それぞれの像において定義した領域を四角で囲んだ。
【配列表フリーテキスト】
【００７４】
配列番号１、２：プローブ
配列番号３〜１４：プライマー
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来のＤＮＡまたはＲＮＡから、ＤＮＡ断片の増幅処理を行い、分子量に基づき該増幅ＤＮＡ断片を視覚化可能に分離したのち、識別可能な個々のＤＮＡ断片に対して予め定義された分子量範囲に基づいて、該分子量範囲内に、所定のシグナル強度の閾値を超える増幅ＤＮＡ断片が存在するかもしくは存在しないかを決定し、各増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在を数値化し、得られた数値データを、該増幅ＤＮＡ断片について、各試料間で比較するか、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較することを含む、生物の核酸多型を評価する方法。
【請求項２】
前記分離を電気泳動にて行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在の数値化を２進法の数値で表すことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅ＤＮＡ断片について表した前記２進法の数値をさらに、各試料の数値データ間で比較するか、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項１】
生物由来のＤＮＡまたはＲＮＡから、ＤＮＡ断片の増幅処理を行い、分子量に基づき該増幅ＤＮＡ断片を視覚化可能に分離したのち、識別可能な個々のＤＮＡ断片に対して予め定義された分子量範囲に基づいて、該分子量範囲内に、所定のシグナル強度の閾値を超える増幅ＤＮＡ断片が存在するかもしくは存在しないかを決定し、各増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在を数値化し、得られた数値データを、該増幅ＤＮＡ断片について、各試料間で比較するか、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較することを含む、生物の核酸多型を評価する方法。
【請求項２】
前記分離を電気泳動にて行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅ＤＮＡ断片の存在もしくは非存在の数値化を２進法の数値で表すことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅ＤＮＡ断片について表した前記２進法の数値をさらに、各試料の数値データ間で比較するか、および／または、既知生物の核酸で予め決定された数値データと比較することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図１Ｅ】
【図１Ｆ】
【公開番号】特開２０１０−３５５０１（Ｐ２０１０−３５５０１Ａ）
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２０３２４０（Ｐ２００８−２０３２４０）
【出願日】平成２０年８月６日（２００８．８．６）
【出願人】（５９３０２７５８７）社団法人農林水産先端技術産業振興センター (7)
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年８月６日（２００８．８．６）
【出願人】（５９３０２７５８７）社団法人農林水産先端技術産業振興センター (7)
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】
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