【課題】ヒトの治療および診断に使用できるモノクローナル抗体を産生することを目的とする。
【解決手段】複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、複数のヒトＤ遺伝子セグメント、および複数のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再配列されていないヒト重鎖免疫グロブリン可変領域を含むトランスジェニックマウスを用いて、前記課題を解決する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【数１Ａ】

【背景技術】
【０００２】
【数１Ｂ】

【０００３】
【数２】

【０００４】
【数３】

【０００５】
【数４】

【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明によって以下が提供される。
【０００７】
【数５】

【０００８】
【数６】

【０００９】
【数７】

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【数５０】

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【数５１】

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【数５３】

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【数５５】

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【数６０】

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【数６１】

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【数６２】

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【数６３】

【００６７】
【数６４】

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【数６６】

【００７０】
【数６７】

【００７１】
【数６８】

【００７２】
【数６９】

【００７３】
【数７０】

【００７４】
【数７１】

【００７５】
【数７２】

【００７６】
【数７３】

【００７７】
【数７４Ａ】

【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、再配列されていないゲノムＤＮＡ中および再配列された免疫グロブリン重鎖遺伝子から発現されるｍＲＮＡ中の相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４を表す。
【図２】図２はヒトλ鎖遺伝子座を表す。
【図３】図３はヒトκ鎖遺伝子座を表す。
【図４】図４はヒト重鎖遺伝子座を表す。
【図５】図５は、ヒトγ３およびγ１定常領域を含有する２５ｋｂ断片に次いでラット鎖３’エンハンサー配列を含む７００ｂｐ断片に連結された再配列されたＩｇＭ遺伝子を含有するトランスジェン構成物を表す。
【図６】図６は、生体内相同組換えによって軽鎖トランスジェンを形成させるために使うことができる断片を表す、ヒトκ鎖遺伝子座の制限地図である。
【図７】図７はｐＧＰ１の作製を示す。
【図８】図８はｐＧＰ１中に含まれるポリリンカーの構成を示す。
【図９】図９は、本発明のヒト重鎖トランスジェンを作製するのに使う断片を示す。
【図１０】図１０はｐＨＩＧｌおよびｐＣＯＮ１の作製を示す。
【図１１】図１１は、ｐＲＥＧ２を形成させるためにｐＲＥ３（ラットエンハンサー３’）中に挿入されるヒトＣγ１断片を示す。
【図１２】図１２は、ｐＨＩＧ３’およびｐＣＯＮの作製を示す。
【図１３】図１３は、本発明のトランスジュンの作製に使われるヒトＤ領域セグメントを含む断片を示す。
【図１４】図１４は、ｐＨＩＧ２（Ｄセグメント含有プラスミド）の作製を示す。
【図１５】図１５は、本発明のトランスジェンの作製に使われるヒトＪκおよびヒトＣκ遺伝子セグメントを包含する断片を示す。
【図１６】図１６はｐＥμの構造を示す。
【図１７】図１７はｐＫａｐＨの作製を示す。
【図１８】図１８は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。
【図１９】図１９は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２０】図２０は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２１】図２１は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２２】図２２は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２３】図２３は、マウスの内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブ−ネガティブ選別ベクターの作製を示す。
【図２４】図２４は、マウスの内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を機能的に破壊するためのポジティブーネガティブ選択ベクターの作製を示す。
【図２５】図２５はκ鎖標的用ベクターの構造を示す。
【図２６】図２６はマウス重鎖標的用ベクターの構造を示す。
【図２７】図２７はマウス重鎖標的用ベクターの構造を示す。
【図２８】図２８はベクターｐＧＰｅの地図を示す。
【図２９】図２９はベクターｐＪＭ２の構造を示す。
【図３０】図３０はベクターｐＣＯＲｌの構造を示す。
【図３１】図３１はｐＩＧＭｌ，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２のトランスジェン構成物を示す。
【図３２】図３２はｐγｅ２の構造を示す。
【図３３】図３３はｐＶＧＥｌの構造を示す。
【図３４】図３４はｐＨＣｌトランスジェニックマウス中でのヒトＩｇ発現のアッセイ結果を示す。
【図３５】図３５はｐＪＣＫｌの構造を示す。
【図３６】図３６は合成重鎖可変領域の作製を示す。
【図３７】図３７は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＣＭ１，ｐＨＣ１およびｐＨＣ２の略図である。
【図３８】図３８は、重鎖小遺伝子座構成物ｐＩＧＧ１並びにκ軽鎖小遺伝子座構成物ｐＫＣ１，ｐＫＶｅ１およびｐＫＣ２の略図である。
【図３９】図３９は、機能的に再配列された軽鎖遺伝子を再構成するための方策を表す。
【図４０】図４０は血清ＥＬＩＳＡ結果を表す。
【図４１】図４１は、８匹のトランスジェニックマウスからの血清のＥＬＩＳＡアッセイの結果を表す。
【図４２】図４２はプラスミドｐＢＣＥｌの略図である。
【図４３】図４３は、ＫＬＨ−ＤＮＰ（３７Ａ），ＫＬＨ（３７Ｂ）およびＢＳＡ−ＤＮＰ（３７Ｃ）に特異的なＩｇＧおよびＩｇＭレベルを測定することによる、ＫＬＨ−ＤＮＰに対する本発明のトランスジェニックマウスの免疫応答を表す。
【図４４】図４４は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトμ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免役処萱後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。
【図４５】図４５は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合しそしてヒトγ鎖を含んで成る抗体の存在を証明するＥＬＩＳＡデータを示す；各パネルは、免疫処置後の指示日においてマウスから得られたプールした血清試料からの逆数系列希釈を示す。
【図４６】図４６は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に麦示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４７】図４７は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４８】図４８は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組識から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図４９】図４９は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣｌトランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５０】図５０は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行にわいて、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５１】図５１は、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）によって免疫処置されたＨＣ１トランスジェニックマウスのリンパ系組織から得られたｍＲＮＡより生成された２３個の無作為選択ｃＤＮＡの整列された可変領域配列を、生殖細胞トランスジェン配列（最上行）に比較して示す。各行において、生殖細胞配列に対するヌクレオチド変化は推定アミノ酸配列中の変化の上に表示される（もしあれば）。重鎖ＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３に相当する領域が示されている。生殖細胞によってコードされないヌクレオチドは大文字で示されている。推定アミノ酸配列は、慣例的な一文字表記法を使ってヌクレオチド配列の下に与えられている。
【図５２】図５２は、ヒストグラム形式での図４０のデータを示す；推定アミノ酸残基位置が縦座標として示され（左がアミノ末端方向であり、右がカルボキシ末端方向である）そして配列変異の頻度が横座標として示される。
【図５３】図５３は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５４】図５４は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．８と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５５】図５５は、Ｖκ遺伝子セグメントを含有するｖｋ６５．１５と命名されたヒトＤＮＡ断片のヌクレオチド配列を示す；Ｖκコード領域推定アミノ酸配列も示される；スプライシング配列と組換えシグナル配列（ヘプタマー／ノナマー）は枠内に示される。
【図５６】図５６は、同時に注入された２つの弔複断片の問での相１司組換えによる軽鎖小遺伝子座の形成を示す。
【図５７】抗原結合の特異１生を示すＣＥＡ及び非ＣＥＡ抗原と反応性あるモノクローナル抗体についてのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図５８】ヒトＶＤＪ及びマウス恒常領域配列を有する写しを増幅するべくＰＣＲにより増幅された１０個のＣＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。
【図５９】ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーン及びヒトκミニ遺伝子座トランスジーンの両方を支持するマウスから得た血清のさまざまな希釈度に対するＥＬＩＳＡの結果を示している；マウスはヒトＣＤ４で免疫化されたものであり、示されているデータは、ヒトＣＤ４と反応性をもちそれぞれヒトκ、ヒトμ、又はヒトγエピトープを有する抗体を表わしている。
【図６０】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトμ又はマウスμについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６１】３つのマワス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、ヒトκ又はマウスκについてのリンパ球染色の杣対的分布を示す。
【図６２】３つのマウス遺伝子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλについてのリンパ球染色の相対的分布を示している。
【図６３】４つのマウス遺Ｅ子型についてＦＡＣＳにより決定される、マウスλ又はヒトκについてのリンパ球染色の相対的分布を示す。
【図６４】免疫化されていない血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す。
【図６５】さまざまな遺伝子型の免疫化されていない００１１マウスの血清中のヒトμ、ヒトγ、ヒトκ、マウスμ、マウスγ、マウスκ、及びマウスλ鎖の量を示す散乱プロットを示している。
【図６６】００１１マウスにおける抗ヒトＣＤ４タイターを示す。
【図６７】ヒトＣＤ４での００１１マウスの免疫化に続く免疫化後３週間目又は７週間目に採取した血清中の抗一ＣＤ４抗体内のヒトμ、ヒトγ、又はヒトκ鎖を含む抗体力価を示す。
【図６８】ヒト重鎖ミニ遺伝子座トランスジーンＰＨＣ１及びＰＨＣ２、及び軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンｐＫＣｌ，ｐＫＣｌｅ及び指示された部位でＰＫＣ２とＣｏ４の問の相同組換えにより作り出された軽鎖ミニ遺伝子座トランスジーンの概略図である。
【図６９】Ｓｔｏｒｂｅｔａ１．（１９８９）前掲書中、からとられた、ネズミラムダ軽鎖遺伝子座の連鎖地図を示す。点刻囲みは偽遺伝子を表わす。
【図７０】相同遺伝子ターゲティングによるマウスλ遺伝子座の失活を概略的に表わしている。
【図７１】「免疫グロブリン遺伝子」、Ｈｏｎｊｏ，Ｔ，ＡＩｔ，ＦＷ，及びＲａｂｂｉｔｓＴＨ（ｅｄｓ）ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８９）ｐ１２９から取られたＢＡＬＢ／ｃマウス重鎖遺伝子座の地図を示す。構造遺伝子は上部ラインに閉じた囲みで示されている。第２及び第３のラインは表示された記号を伴って制限部位を示している。
【図７２】マウス重鎖遺伝子座α恒常領域遺伝子のヌクレオチド配列を示す。
【図７３】マウス重鎖遺伝子座Ｊ_４遺伝子内に２つのｂｐフレームシフトを導入するためのフレームシフトベクター（プラスミドＢ）の構成を示す。
【図７４】高度免疫中のトランスジェニック動物のアイソタイプ特異応答を示す。反応性のヒトμ及びγ１の相対的レベルは、比色ＥＬＩＳＡ検定法（ｙ一軸）によって示されている。我々は、フロイントアジュバント中のＣＥＡの腹腔内注入により、同型接合のＪＨＤバックグラウンド内で３匹の生後７〜１０週目の雄のＨＣ１系統５７のトランスジェニック動物（＃１９９１，＃２３５６，＃２３５７）を免疫化した。図は、ＣＥＡでコーティングされたマイクロタイターウエルに対するプールした血清（各注入に先立って収集したもの）の２５０倍希釈液の結合を描いている。
【図７５】クラススイッテ組換えにより媒介されたトランスジーンでコードされたγ１アイソタイプの発現を示す。２つの異なるヒトγ１発現ハイブリドーマ内の組込まれたトランスジーンのゲノミック構造は、μ及びγ１スイッチ領域の問の組換えと一貫性をもつ。図７５は、３つのトランスジーン発現ハイブリドーマから分離したＰａｃＩ／ＳｆｉＩ消化されたＤＮＡのサザンプロットを示す。左から右へ：クローン９２−０９Ａ一５Ｈｌ−５、ヒトγ１／μ；クローン９２−９０Ａ−４Ｇ２−２、ヒトγ１／μ；クローン９２−０９Ａ−４Ｆ７−Ａ５−２、ヒトγ１，μ。３つのハイブリドーマは全て、ＨＣ１−５７の組込みについて半接合でＪＨＤ分断について同型接合の生後７カ月のマウス（マウス＃１９９１）から誘導される。プロットは、ヒトγ１スイッチ領域の３’半部分にまたがる２．３ｋｂのＢｇｌＩＩ／ＳｆｉＩＤＮＡフラグメントから誘導されたプローブでハイブリッド形成される。μ発現ハイブリドーマの中にはいかなるスイッチ産物も見い出せないが、２つのγ１発現ハイブリドーマ９２−０９Ａ−５Ｈ１−５及び９２−０９Ａ−４Ｇ２−２は、それぞれ、５．１ｋｂ及び５．３ｋｂのＰａｃＩ／ＳｒｉＩフラグメントを結果としてもたらすスイッチ産物を含む。
【図７６】図７６は、μからγ１へのクラススイッチを産生させることのできる考えられる２つの欠失メカニズムの図である。ヒトμ遺伝子には、μを欠失するべく組換えできる４００ｂｐの直接的反復（σμ及びΣμ）がフランキングしている。このメカニズムによるクラススイッチングはつねに６．４ｋｂのＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成するが、一方μ及びγ１スイッチ領域の問の組換えによるクラススイッチは、個々のスイッチ事象の間でサイズの変動を示しながら、４ｋｂと７ｋｂの問のＰａｃＩ／ＳｆｉＩフラグメントを生成する。図７５で検討されている２つのγ１発現ハイブリドーマは、μ及びγ１スイッチ領域の間で組換えを受けていると思われる。
【図７７】トランススイッチにより生成されたキメラヒト／マウス免疫グロブリン重鎖を示す。トランススイッチ産物のｃＤＮＡクローンは、高度免疫されたＨＣｌトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７；動物及び免疫計画の説明については図７４に対する凡例を参照のこと）から分離した脾臓とリンパ節のＲＮＡの混合物の逆転写及びＰＣＲ増幅により生成された。１０個の無作為にとり出したクローンの部分的ヌクレオチド配列が示されている。小文字は、コードされた生殖細胞系を表わし、大文字は、既知の生殖細胞系配列に割当てることのできないヌクレオチドを示す。これらは体細胞突然変異、Ｎヌクレオチド又は切形Ｄセグメントであることが考えられる。両面タイプはマウスγ配列を表わす。
【図７８】再配置されたＶＨ２５１トランスジーンが高度免疫されたものの中での体細胞突然変異を受けることを示している。
【図７９】図７８では抗原に対する一次反応を図７９では二次反応を示すＣＨ１系統２６のマウスからのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。生殖細胞系配列が上部に示され；生殖細胞系からのヌクレオチド変更は、各クローンについて表わされている。１つの周期は、生殖細胞系配列との同一性を示し、大文字はいかなる生殖細胞系源も１司定されないことを示している。配列は、Ｊセグメントの用途に応ってまとめられている。Ｊセグメントの各々の生殖細胞系配列が示されている。ＣＤＲ３配列内の小文字はＨＣ１トランスジーン内に含まれている既知のＤセグメントに対する同一性を表わす。割当てられたＤセグメントは、各配列の最後に表Ｄされている。割当てされていない配列は、Ｎ領域の付加又は体細胞突然変異から誘導されうる。又は、場合によって、これらは単にあまりにも短かすぎて既知のＤセグメントから無作為のＮ個のヌクレオチドを区別できないこともある。図７８の一次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１一γｌｃＤＮＡクローン。生後４週間の雌のＨＣｌ系統２６−ＪＨＤマウス（＃２５９９）にＫＬＨ及び完全フロイントアジュバントを一回だけ注入した。５日後に脾臓細胞ＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は０．０６％（２／３，１９８ｂｐ）である。図７９の二次応答：１３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−γｌｃＤＮＡクローン。生後２カ月の雌ＨＣｌ系統２６−ＪＨＤマウス（＃３２０４）に対しで１カ月にわたり３回ＨＥＬ及びフロイントアジュバントを注入した（一次注入は完全アジュバントで、又追加免疫は１週間目と３週間目に不完全アジュバントで）；４カ月後に脾臓とリンパ節のＲＮＡを分離した。Ｖセグメント内での体液性突然変異の全体的頻度は１．６％（５２／３，１９８ｂｐ）。
【図８０】広範な体細胞突然変異がγ１配列に制限されていることを示している：体細胞突然変異及びクラススイッチはＢ細胞の同じ集団内で発生する。ＣＥＡに対し高度免疫された（免疫化計画については図６８参照）ＨＣ１系統５７のトランスジェニック−ＪＨＤマウス（＃２３５７）の脾臓及びリンパ節細胞から分離したＶＨ２５１ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。図８０：ＩｇＭ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１−μｃＤＮＡクローン。ＣＤＲｓ１及び２の周囲残基を含む１５６ｂｐのセグメントのヌクレオチド配列。体細胞突然変異の全体的レベルは０．１％（５／３，７４４ｂｐ）である。
【図８１】図８１：ＩｇＧ：２３の無作為にとり上げたＶＨ２５１一γ１ｃＤＮＡクローン。ＣＤＲｓ１〜３及び周囲残基を含むセグメントのヌクレオチド配列。Ｖセグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は１．１％（６５／５，６５８ｂｐ）である。図８０中のμ配列との比較のため；最初の１５６個のヌクレオチドに対する突然変異頻度は１．１％（４１／３，５８８ｂｐである）。記号の説明については、図８０及び８１の凡例を参照のこと。
【図８２】ＶＨ５１Ｐ１及びＶＨ５６Ｐ１が、免疫化を受けていないマウス内の広範な体細胞突然変異を示す。生後９週目の免疫化を受けていない雌のＨＣ２系統２５５０のトランスジェニックーＪＨＤマウス（＃５２５０）からのＩｇＧ重鎖可変領域ｃＤＮＡクローンの部分的ヌクレオチド配列。１９ＶＨ５６ｐｌセグメントでの体細胞突然変異の全体的頻度は、２．２％（１０１／４，６７４ｂｐ）である。単一一のＶＨ５１ｐ１セグメント内の体細胞突然変異の全体的頻度は２．０％（５／２４６ｂｐ）である。記号の説明については図７８及び７９に対する凡例を参照。
【図８３】分析された内因性Ｉｇ遺伝子座をもつ２重トランスジェニックマウスは、ヒトＩｇＭκ陽性Ｂ細胞を含んでいる。異なる遺伝子型をもつ４匹のマウスの脾臓から分離された細胞のＦＡＣＳ。左欄：対照マウス（＃９９４４、生後６週目の雌、ＪＨ＋／−，ＪＣκ＋／−；異型接合野生型マウス重鎖及びκ一軽鎖遺伝子座、非トランスジェニック）。第２欄：ヒト重鎖トランスジェニック（＃９８７７、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０±；分断されたマウスの重鎖及びκ一軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２トランスジーンについて半接合）。第３欄：ヒトκ一軽鎖トランスジェニック（＃９８７８、生後６週目の雌ＪＨ−／−，ＪＣκ−／−，ＫＣｏ４系統４４３７＋；分断されたマウスの重鎖及びκ一軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。右欄：２重トランスジェニック（＃９８７９、生後６週目の雌、ＪＨ−／−ｍＪＣκ−／−，ＨＣ２系統２５５０＋，ＫＣｏ４系統４４３７＋；分断されたマウスの重鎖及びκｋ一軽鎖遺伝子座について同型接合で、ＨＣ２及びＫＣｏ４トランスジーンについて半接合）。上段：マウスλ軽鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。第２段：ヒトμ重鎖（ｘ軸）及びヒトκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞、第３段：マウスのμ重鎖（ｘ軸）及びマウスのκ軽鎖（ｙ軸）の発現について染色された脾細胞。下段：マウスＢ２２０抗原の発現について染色された脾細胞のヒストグラム（対数螢光：ｘ軸：細胞数：ｙ軸）。２つの色図版の各々について、表示された象眼の各々の中の細胞の相対数は、ヨウ化プロピジウム染色及び光散乱に基つくｅ一パラメータゲートの百分率として与えられている。下段に表示されている試料の各々におけるＢ２２０＋細胞の分１由１は、リンパ球光散乱ゲートの白分率として与えられている。
【図８４】２重トランスジェニックマウスの血清中の分泌された免疫グロブリンレベル。内因性重鎖及びκ一軽鎖遺伝子座分断について同型接合の１８の個々のＨＣ２／ＫＣｏ４２重トランスジェニックマウスからのマウスＴ及びλ及びヒトμ，γ及びκ。マウス：（＋）ＨＣ２系統２５５０（組込み１回につき最高５つのＨＣ２コピー）、ＫＣｏ４系統４４３６（組込み１回につき１〜２つのＫＣｏ４コピー）；（○）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４４３７（組込み一回につき最高１０個のＫＣｏ４コピー）；（×）ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４５８３（組込み一一回につき最高５つのＫＣｏ４コピー）；（□）ＨＣ２系統２５７２（組込み１回につき３０〜５０のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７；（△）ＨＣ２系統５４６７（組込み１回につき２０〜３０個のＨＣ２コピー、ＫＣｏ４系統４４３７。
【図８５】ヒト抗原に対するヒト抗体応答を示す。図８５：組換え型ヒト可溶性ＣＤ４に対する一次応答。ヒトＩｇＭ及びヒトκ軽鎖のレベルが、４つの２重トランスジェニックマウスからの出血前（○）及び免疫化後（●）の血清について報告されている。
【図８６】図８６：インビボでヒトＩｇＧに対するスイッチが起こる。非特異的交叉反応性を阻害するべく１．５μ／ｍ１の余分なＩｇＥ，κ及び１％の正常なマウス血清の存在下で使川されたペルオキソダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトＩｇＧを用いて、ヒトＩｇＧ（円）を検山した。ヒトκ軽鎖（正方形）は、１％の正常なマウスの血清の存在下でペルオキシダーゼ接合されたポリクローナル抗ヒトκ試薬を用いて、検出した。１匹のマウス（＃９３４４；ＨＣ２系統２５５０，ＫＣｏ４系統４４３６）からの代表的結果が示されている。各々の点は、重複ウエルの平均からバックグラウンド吸収を引いたものを表わしている。
【図８７】ヒトＣＤ８十リンパ球からヒトＣＤ４＋リンパ球を弁別するハイブリドーマ上清を用いたヒトＰＢＬのＦＡＣＳ分析を示す。
【図８８】トランスジェニックマウスの血清内のヒトα−ＣＤ４１ｇＭａｎｆＩｇＧを示す。
【図８９】トランスジェニックマウスのα−ヒトＣＤ４ハイブリドーマモノクローナル、２Ｃｌｌ−８をＲＰＡ−ＴＡ及びＬｅｕ−３Ａモノクローナルと比較する競合結合実験を示す。
【図９０】培養された２Ｃｌｌ−８ハイブリドーマのＩｇ発現についての産生データを示す。
【図９１】重鎖恒常領域遺伝子といった遺伝子を欠失させるための相同組換えターゲッティングトランスジーンの構造を概略的に示す。本発明のトランスジェニックマウスを、下記の表Ｂ及びＣから選択されたヒト抗原により免疫する。トランスジェニックマウスは前記ヒト抗原に結合するヒト抗体を生産する。免疫されたトランスジェニックマウスからのＢ細胞を用いて、前記選択されたヒト抗原に対するモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製する。
【実施例】
【００７９】
【数７４Ｂ】

【００８０】
【数７５】

【００８１】
【数７６】

【００８２】
【数７７】

【００８３】
【数７８】

【００８４】
【数７９】

【００８５】
【数８０】

【００８６】
【数８１】

【００８７】
【数８２】

【００８８】
【数８３】

【００８９】
【数８４】

【００９０】
【数８５】

【００９１】
【数８６】

【００９２】
【数８７】

【００９３】
【数８８】

【００９４】
【数８９】

【００９５】
【数９０】

【００９６】
【数９１】

【００９７】
【数９２】

【００９８】
【数９３】

【００９９】
【数９４】

【０１００】
【数９５】

【０１０１】
【数９６】

【０１０２】
【数９７】

【０１０３】
【数９８】

【０１０４】
【数９９】

【０１０５】
【数１００】

【０１０６】
【数１０１】

【０１０７】
【数１０２】

【０１０８】
【数１０３】

【０１０９】
【数１０４】

【０１１０】
【数１０５】

【０１１１】
【数１０６】

【０１１２】
【数１０７】

【０１１３】
【数１０８】

【０１１４】
【数１０９】

【０１１５】
【数１１０】

【０１１６】
【数１１１】

【０１１７】
【数１１２】

【０１１８】
【数１１３】

【０１１９】
【数１１４】

【０１２０】
【数１１５】

【０１２１】
【数１１６】

【０１２２】
【数１１７】

【０１２３】
【数１１８】

【０１２４】
【数１１９】

【０１２５】
【数１２０】

【０１２６】
【数１２１】

【０１２７】
【数１２２】

【０１２８】
【数１２３】

【０１２９】
【数１２４】

【０１３０】
【数１２５】

【０１３１】
【数１２６】

【０１３２】
【数１２７】

【０１３３】
【数１２８】

【０１３４】
【数１２９】

【０１３５】
【数１３０】

【０１３６】
【数１３１】

【０１３７】
【数１３２】

【０１３８】
【数１３３】

【０１３９】
【数１３４】

【０１４０】
【数１３５】

【０１４１】
【数１３６】

【０１４２】
【数１３７】

【０１４３】
【数１３８】

【０１４４】
【数１３９】

【０１４５】
【数１４０】

【０１４６】
【数１４１】

【０１４７】
【数１４２】

【０１４８】
【数１４３】

【０１４９】
【数１４４】

【０１５０】
【数１４５】

【０１５１】
【数１４６】

【０１５２】
【数１４７】

【０１５３】
【数１４８】

【０１５４】
【数１４９】

【０１５５】
【数１５０】

【０１５６】
【数１５１】

【０１５７】
【数１５２】

【０１５８】
【数１５３】

【０１５９】
【数１５４】

【０１６０】
【数１５５】

【０１６１】
【数１５６】

【０１６２】
【数１５７】

【０１６３】
【数１５８】

【０１６４】
【数１５９】

【０１６５】
【数１６０】

【０１６６】
【数１６１】

【０１６７】
【数１６２】

【０１６８】
【数１６３】

【０１６９】
【数１６４】

【０１７０】
【数１６５】

【０１７１】
【数１６６】

【０１７２】
【数１６７】

【０１７３】
【数１６８】

【０１７４】
【数１６９】

【０１７５】
【数１７０】

【０１７６】
【数１７１】

【０１７７】
【数１７２】

【０１７８】
【数１７３】

【０１７９】
【数１７４】

【０１８０】
【数１７５】

【０１８１】
【数１７６】

【０１８２】
【数１７７】

【０１８３】
【数１７８】

【０１８４】
【数１７９】

【０１８５】
【数１８０】

【０１８６】
【数１８１】

【０１８７】
【数１８２】

【０１８８】
【数１８３】

【０１８９】
【数１８４】

【０１９０】
【数１８５】

【０１９１】
【数１８６】

【０１９２】
【数１８７】

【０１９３】
【数１８８】

【０１９４】
【数１８９】

【０１９５】
【数１９０】

【０１９６】
【数１９１】

【０１９７】
【数１９２】

【０１９８】
【数１９３】

【０１９９】
【数１９４】

【０２００】
【数１９５】

【０２０１】
【数１９６】

【０２０２】
【数１９７】

【０２０３】
【数１９８】

【０２０４】
【数１９９】

【０２０５】
【数２００】

【０２０６】
【数２０１】

【０２０７】
【数２０２】

【０２０８】
【数２０３】

【０２０９】
【数２０４】

【０２１０】
【数２０５】

【０２１１】
【数２０６】

【０２１２】
【数２０７】

【０２１３】
【数２０８】

【特許請求の範囲】
【請求項１】
所定の抗原に結合する、ヒト可変領域およびマウス定常領域からなるキメラ重鎖を有するキメラ抗体を得るための方法であって、
（ａ）複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、複数のヒトＤ遺伝子セグメント、および複数のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、再配列されていないヒト重鎖免疫グロブリン可変領域を含むトランスジェニックマウスを、所定の抗原で免疫する工程；および
（ｂ）該所定の抗原に結合するキメラ抗体を該マウスから得る工程
を包含する、方法。
【請求項２】
再配列されていないヒト軽鎖免疫グロブリン可変領域およびヒト軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記軽鎖可変領域が、複数のＶ_Ｌ遺伝子セグメントおよび複数のＪ_Ｌ遺伝子セグメントを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記キメラ抗体が、ヒト軽鎖を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒト軽鎖がκ定常領域を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒト軽鎖がλ定常領域を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法であって、前記重鎖免疫グロブリン可変領域が、２〜約１０のＶ_Ｈ遺伝子セグメント、少なくとも１０のＤ遺伝子セグメント、および少なくとも６のＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含む、方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法であって、前記マウス免疫グロブリン重鎖定常領域が、γ定常領域を含む、方法。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法であって、前記ヒト重鎖免疫グロブリン可変領域が、少なくとも１つのプロモーターを含むシス作用性転写調節領域をさらに含む、方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記キメラ抗体のヒト重鎖可変領域をコードする核酸分子を単離する工程、および該核酸分子を、作動可能に、ヒト定常領域をコードする核酸分子に連結する工程
を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記キメラ抗体のヒト軽鎖可変領域をコードする核酸分子を単離する工程、および該核酸分子を、作動可能に、ヒト定常領域をコードする核酸分子に連結する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記キメラ抗体のヒト重鎖可変領域をコードする核酸分子を単離する工程、および該核酸分子を、作動可能に、ヒト定常領域をコードする核酸分子に連結する工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記キメラ抗体のヒト軽鎖可変領域をコードする核酸分子を単離する工程、および該核酸分子を、作動可能に、ヒト定常領域をコードする核酸分子に連結する工程
を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記キメラ抗体の、ヒト重鎖可変領域およびヒト軽鎖可変領域をコードする核酸分子を単離する工程、および該核酸分子を、作動可能に、ヒト定常領域をコードする核酸分子に連結する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法であって、ヒト定常領域をコードする核酸に作動可能に連結した核酸分子を宿主細胞内で発現することによってヒト抗体を産生する工程を更に包含する、方法。
【請求項１６】
前記発現したヒト抗体を単離する工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
所定の抗原に結合する体細胞変異を経た抗体を得る方法であって、
（ａ）トランスジェニックマウスを所定の抗原で免疫する工程；
（ここで、前記トランスジェニックマウスは、不活性化された内因性マウス重鎖可変遺伝子領域を含み、更に、μ定常領域遺伝子セグメントに作用可能に連結された再配列されていないヒト重鎖免疫グロブリン可変領域を含むゲノムを有し、
前記再配列されていないヒト重鎖可変領域が、複数のヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメント、複数のヒトＤ遺伝子セグメント、および複数のヒトＪ_Ｈ遺伝子セグメントを含み、
前記μ定常領域が、
（ｉ）ヒトＳμ配列およびヒトまたはマウスμコード配列；ならびに
（ｉｉ）マウスＳμ配列およびヒトまたはマウスμコード配列
からなる群から選択される）
（ｂ）前記トランスジェニックマウスからＢリンパ球を取り出す工程；
（ｃ）前記Ｂリンパ球が発現する、前記所定の抗原に結合するマウスＩｇＧイソタイプの免疫グロブリン分子を同定する工程；ならびに
（ｄ）前記所定の抗原に結合するＩｇＧイソタイプの免疫グロブリン分子を単離し、それにより、前記所定の抗原に結合する体細胞変異を経た抗体を、工程（Ｃ）のＢリンパ球から得る工程
を含む方法。
【請求項１８】
どの免疫グロブリンイソタイプが発現しているかを決定するためにＢリンパ球に由来する細胞をスクリーニングすることによって、前記マウスＩｇＧイソタイプの免疫グロブリン分子が同定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｂリンパ球からＩｇＧ免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を単離し、重鎖定常領域の配列を決定することによって、前記ＩｇＧイソタイプの免疫グロブリン分子が同定される、請求項１７に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２】

【図５３】

【図５４】

【図５５】

【図５６】

【図５７】

【図５８】

【図５９】

【図６０】

【図６１】

【図６２】

【図６３】

【図６４】

【図６５】

【図６６】

【図６７】

【図６８】

【図６９】

【図７０】

【図７１】

【図７２】

【図７３】

【図７４】

【図７５】

【図７６】

【図７７】

【図７８】

【図７９】

【図８０】

【図８１】

【図８２】

【図８３】

【図８４】

【図８５】

【図８６】

【図８７】

【図８８】

【図８９】

【図９０】

【図９１】

【公開番号】特開２０１２−１４３２５２（Ｐ２０１２−１４３２５２Ａ）
【公開日】平成２４年８月２日（２０１２．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１０７０２２（Ｐ２０１２−１０７０２２）
【出願日】平成２４年５月８日（２０１２．５．８）
【分割の表示】特願２００６−２９３３６７（Ｐ２００６−２９３３６７）の分割
【原出願日】平成６年４月２５日（１９９４．４．２５）
【出願人】（５９４１９２７１８）ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド (2)
【Ｆターム（参考）】