癌疾患修飾抗体
本発明は、新規スクリーニング規範を用いて患者の癌疾患修飾抗体を産生する方法に関する。癌細胞の細胞障害性を用いて抗癌抗体を分離することで、このプロセスは治療および診断目的のための抗癌抗体の産生を可能にする。抗体は、癌の病気分類および診断の補助に用いることができ、また原発腫瘍および腫瘍転移の処置に用いることができる。抗癌抗体を毒素、酵素、放射性化合物、および血液原細胞と結合させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明の癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の単離および生産と、該ＣＤＭＡＢを、必要に応じて１種類以上の化学療法薬と組み合わせて、治療および診断プロセスで使用することに関する。本発明は、さらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌を呈する各々のヒトは一意的であり、そのヒトのアイデンティティと同様に他の癌とは異なる癌を有する。このことにもかかわらず、現行の治療は癌の種類が同じ全ての患者に対して、同じ段階で同じ方法で処置をおこなう。これらの患者の少なくとも３０％は一次治療に失敗して、その上の段階の治療に至り、治療の失敗、転移、および究極的には死亡する確率が高くなる。処置のための優れたアプローチは、特定のヒトに対応した治療にカスタマイズすることであると考えられる。カスタマイゼーションに向く唯一の現行の治療は、手術である。化学療法および放射線療法は患者に合わせて調整することはできず、手術そのものでは治癒を生ずるには不十分である。
【０００３】
モノクローナル抗体の出現で、各々の抗体が単一のエピトープに向けられていることから、カスタマイズされた治療のための方法を開発する可能性はより現実的になった。さらに、特定のヒトの腫瘍を独自に定義する一連のエピトープを対象とする抗体の組み合わせを生産することが可能である。
悪性変換細胞に特異的である抗原を癌細胞が含むということが癌細胞と正常細胞との著しい違いであると認められたことで、科学界では、これらの抗原に対して特異的に結合することによって悪性変換細胞を特異的に標的とするように、モノクローナル抗体を設計することができると長い間考えられていたことから、モノクローナル抗体が癌細胞を除去するための「魔法の弾丸」として働き得るという考えが生じた。
すぐに開示された発明の技術に基づいて単離されたモノクローナル抗体は、患者にとって有益であるかたちで、例えば全身腫瘍組織量を減少させることで、癌疾患を修飾することが示され、本明細書では癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）または「抗癌」抗体として様々に称されている。
【０００４】
現時点では、癌患者は一般に処置の選択肢がほとんどない。癌治療に対する規格化されたアプローチは、全体的な生存率および罹患率の改善をもたらした。しかし、特定の人に対して、これらの改善された統計値は、個人の状況における改善と必ずしも相関しているわけではない。
このように、開業医が同じコホートで他の患者とは独立して各々の腫瘍を処置することを可能とする方法論が出される場合、このことはちょうどその一人に合うように治療を調整する独特なアプローチを可能とするだろう。治療のそのようなコースは、理想的には、硬化速度を増加させ、より良好な結果を生み出し、それによって長く切実な必要性を満たす。
【０００５】
歴史的に、ポリクローナル抗体の使用が、ヒト癌の処置における限られた成功を収めながら使われた。リンパ腫および白血病に対しては、ヒト血漿による処置が施されていたが、長期寛解または反応がほとんどなかった。さらにまた、再現性が乏しく、化学療法と比較して付加的な利点はなかった。乳癌、黒色腫、および腎細胞癌等の固形腫瘍もまた、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿、およびウマ血清による処置を施した。
固形腫瘍に対するモノクローナル抗体の臨床試験が数多くあった。１９８０年代では、少なくとも４種類のヒト乳癌臨床試験があったが、特定の抗原に対する抗体または組織選択性に基づく抗体を用いて、少なくとも４７人の患者からたった一人の応答者が得られたのみである。シスプラチンと組み合わせたヒト化抗ｈｅｒ２抗体による臨床試験の成功は、１９９８年までなかった。本研究では、約４分の１が部分的な緩解率を持ち、もう半分が軽度または安定した疾患の進行を呈した反応について、３７人の患者を利用した。
【０００６】
結直腸癌を調べる臨床試験は、糖タンパク質および糖脂質の両方を標的とする抗体を必要とする。腺癌に対してある程度特異性がある１７−１Ａ等の抗体は、患者一人だけが部分寛解を呈する６０人以上の患者での第２相試験を受けた。他の治験では、１７−１Ａを用いた場合、シクロホスファミドをさらに用いるプロトコルで５２人の患者のうち、完全寛解が１人、軽度の寛解が２人だけであった。類似の結果が１７Ａ−１Ａが関与する他の治験で得られた。最初にイメージングが認められるヒト化マウス・モノクローナル抗体の使用もまた、腫瘍退縮を生じなかった。現在まで、結腸直腸癌に有効である抗体はなかった。同様に、肺癌、脳癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、および胃癌に対しても一様に好ましくない結果であった。黒色腫に対する抗ＧＤ３モノクローナル抗体の使用では、ある程度の成功が得られた。このように、ヒト臨床試験の必要条件である小動物研究での成功にもかからず、試験された抗体のほとんどで効果が得られなかったことが分かる。
【０００７】
（先行特許）
米国特許第５，７５０，１０２号（特許文献１）は、患者の腫瘍から得た細胞が該患者から得た細胞または組織からクローニングされたＭＨＣ遺伝子によってトランスフェクトされるプロセスを開示している。その後、これらのトランスフェクション細胞は、患者への予防接種に用いられる。
米国特許第４，８１６，５８１号（特許文献２）は、哺乳類の腫瘍細胞および正常細胞の細胞内構成要素（細胞外構成要素ではない）に対して特異的であるモノクローナル抗体を得るステップと、そのモノクローナル抗体を標識するステップと、標識抗体と腫瘍細胞を殺す治療を受けた哺乳類の組織とを接触させるステップと、変質している腫瘍細胞の細胞内構成要素に対する上記標識抗体の結合を測定することで治療の効果を決定するステップとを有するプロセスを開示している。ヒト細胞内抗原に対する抗体の調製で、特許権者は悪性細胞がそのような抗原の好都合な供給源であることを認識している。
米国特許第５，１７１，６６５号（特許文献３）は、新規抗体とその生産方法とを提供する。具体的には、その特許はヒト腫瘍（例えば、大腸および肺の腫瘍）に結合したタンパク質抗原に対して強く結合し、その一方で正常細胞に対してはかなり少ない程度に結合する特性を持つモノクローナル抗体の形成を教示している。
米国特許第５，４８４，５９６号（特許文献４）は、外科的にヒト癌患者から腫瘍組織を除くステップと、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処置するステップと、腫瘍細胞に放射線を照射し、生存可能ではあるが非腫瘍形成性にするステップと、該細胞を用いて、原発腫瘍の再発を抑制することが可能であり、その一方で同時に転移を阻害するワクチンを調製するステップとを有する癌治療方法を提供する。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原と反応するモノクローナル抗体の開発を教示する。以下参照する４段目４５行に記載されているように、特許権者はヒト新形成で活発な特異的免疫療法を発現しているモノクローナル抗体の発現で、自所性腫瘍細胞を利用する。
米国特許第５，６９３，７６３号（特許文献５）は、ヒト癌腫に特有であり、起源の上皮組織に依存していない糖タンパク質抗原を教示している。
【０００８】
米国特許第５，７８３，１８６号（特許文献６）は、Ｈｅｒ２発現細胞でアポトーシスを誘発する抗Ｈｅｒ２抗体と、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞系と、そのような抗体を用いた癌の処置方法と、そのような抗体を含む医薬組成物とを開示している。
米国特許第５，８４９，８７６号（特許文献７）は、腫瘍および非腫瘍組織供給源から精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体産生のための新規ハイブリドーマ細胞系を記載している。
米国特許第５，８６９，２６８号（特許文献８）は、所望の抗原に対して特異的な抗体を産生するヒト・リンパ球を生成するための方法と、モノクローナル抗体を産生するための方法と、同様に該方法によって産生されたモノクローナル抗体とを開示している。この特許は、特に癌の診断および治療に有用な抗ＨＤヒト・モノクローナル抗体の産生に関する。
米国特許第５，８６９，０４５号（特許文献９）は、ヒト・抗体、抗体フラグメント、抗体複合体、および単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体機能が２倍となるメカニズムは、分子がヒト・カルシノーマの表面に上に存在する細胞膜抗原に対して反応する点で、さらに、上記抗体がカルシノーマ細胞内に内在化する能力を有し、結合後、特に抗体−薬物結合体および抗体−毒素結合体に対して特に有用であるという点である。それらの修飾形態では、上記抗体は特定の濃度で細胞障害性を表す。
米国特許第５，７８０，０３３号（特許文献１０）は、腫瘍の治療および予防のための自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、老いた哺乳類に由来する抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見つかる、ある種の自然抗体であると言われる。自己抗体が「老いた哺乳類」に由来することから、処置されている患者から実際に由来する自己抗体であることを必要としない。また、この特許は老いた哺乳類から天然およびモノクローナル抗核自己抗体と、モノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞系とを開示する。
【特許文献１】米国特許第５，７５０，１０２号公報
【特許文献２】米国特許第４，８１６，５８１号公報
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号公報
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号公報
【特許文献５】米国特許第５，６９３，７６３号公報
【特許文献６】米国特許第５，７８３，１８６号公報
【特許文献７】米国特許第５，８４９，８７６号公報
【特許文献８】米国特許第５，８６９，２６８号公報
【特許文献９】米国特許第５，８６９，０４５号公報
【特許文献１０】米国特許第５，７８０，０３３号公報
【発明の開示】
【０００９】
本発明者らは、以前に「個々の患者に対して特異的な抗癌抗体」と題された米国特許６，１８０，３５７号の付与を受けており、この特許は癌疾患の処置に有用である個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択するためのプロセスに関する。本明細書の目的にとって、「抗体」および「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は同義的に用いられ、ハイブリドーマ（例えば、マウスまたはヒト）、免疫複合体、ならびに必要に応じて免疫グロブリン・フラグメント、および免疫グロブリン由来の組み換えタンパク質（例えば、キメラおよびヒト化免疫グロブリンＦ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、組み換え免疫グロブリン可変部領域（Ｆｖ）、ならびに融合タンパク質）によって産生されるインタクトな免疫グロブリンに関する。タンパク質の構造または機能に著しい作用を生ずることなくいくつかのアミン酸配列が変化し得ることは、当該技術分野で十分に認識されている。抗体の分子内転位では、主領域の核酸配列またはアミノ酸配列における修飾が一般に許容することができる。これらは、限定されるものではないが、置換（好ましくは保守的置換）、欠失、または付加を含む。さらに、本発明の範囲内である。標準的な化学療法薬様式（例えば、放射性核種）を本発明のＣＤＭＡＢと接合させることで、上記化学療法の使用に焦点が合わせられる。ＣＤＭＡＢは、毒素、細胞障害性部分、または酵素（例えば、ビオチン複合酵素または血液原細胞）に結合させることもできる。
この出願は、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞系を単離するための‘３５７特許に教示されたように患者特異的抗癌抗体を産生するための方法を利用する。これらの抗体を、一つの腫瘍に対して特異的に作ることができるので、癌治療をカスタマイズすることが可能となる。
【００１０】
個別的抗癌性の処置の期待は、患者が管理される方法の変化をもたらす。可能性がある臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて、積み上がっているということである。この試料から、腫瘍の類型が既存の癌疾患修飾抗体のパネルから調べられる。患者は従来通りに病期分類されるが、利用できる抗体はさらに患者を病期分類する際に有用である。患者は既存の抗体を用いて即時治療を受けることができ、腫瘍に特有の抗体のパネルを、本明細書中に概説される方法を用いて、または本明細書中に開示されるスクリーニング法と併用してファージディスプレイ・ライブラリを用いることにより、作ることができる。、他の腫瘍が処置されているものと同じエピトープの一部を有することができる可能性があることから、発生する全ての抗体は抗癌性の抗体のライブラリーに加えられる。この方法によって産生される抗体は、これらの抗体と結合する癌がある数多くの患者において、癌疾患の処置に有用である。
【００１１】
実質的に米国特許第６，１８０，３５７号のプロセスを使用することで、マウス・モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、および１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、患者の乳房腫瘍生検で得た細胞でマウスを免疫化した後に得られた。この出願の背景の範囲内で、細胞殺害（細胞障害性）特性または細胞増殖阻害（細胞分裂停止）特性のいずれかを持つ抗癌抗体を以下、細胞障害性と呼ぶ。これらの抗体を、癌の病期分類および診断の補助に使用することができ、また腫瘍転位の処置に用いることができる。７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、および１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原は、異なる組織起源の幅広い範囲のヒト細胞系の細胞表面上で発現された。試験した細胞系のうち、７Ｂ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６のいずれかの細胞障害性に感受性があったのは、乳癌細胞系ＭＣＦ−７および前立腺癌細胞系ＰＣ−３の二系統のみであった。試験した細胞系のうち、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の細胞障害性効果に対して感受性があったのは、乳癌細胞系ＭＣＦ−７および卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３の二系統のみであった。
抗癌抗体に加えて、患者は、多様な処置療法の一部として現在推奨された治療を受けることを選択することができる。本方法論を介して単離された抗体が相対的に非癌細胞に対して非毒性であるという事実から、高濃度で抗体の組み合わせを、単独または従来の治療と併用して用いることが可能である。高い治療指数は、処置耐性菌の出現の可能性を減少させなければならない短い時間的尺度上で、再治療もできるようにする。
【００１２】
乳癌細胞および卵巣癌細胞に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効果は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での抗腫瘍活性を確立することによって拡張された。ヒト癌の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルは、ＭＣＦ−７乳癌細胞またはＯＶＣＡＲ−３卵巣の癌細胞を重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植することによって確立された。なぜなら、ＳＣＩＤマウスは特定の免疫細胞が欠如しているのでヒト腫瘍細胞を拒絶することができないからである。これらの種類の症状発現前異種移植腫瘍モデルで試験される薬物の作用は、治療効力を予測する上で妥当なものであると考えられる。マウスの癌異種移植片は、自然に起こる癌と同様の方法で、実質壊死、間質壊死、中心壊死、および血管新生を発現する固形腫瘍として成長する。乳癌細胞系ＭＣＦ−７および卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３の評価は、ＳＣＩＤマウスでおこなった。ＭＣＦ−７およびＯＶＣＡＲ−３腫瘍の移植の成功ならびに標準的な化学療法薬に対する腫瘍の感度から、それらの腫瘍を薬物試験のための適当な癌モデルとして特徴づけた。ＭＣＦ−７親細胞系およびその変異体とＯＶＣＡＲ−３細胞系とを、臨床化学療法剤として使用された広範な治療薬を評価するために異種移植腫瘍モデルとして使用することが成功した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ヒト乳癌のヒト乳癌の予防的生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルで、腫瘍増殖および減少した全身腫瘍組織量を予防した。モニタリングは、過去２８０日後処理を続けた。４０パーセントの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２投与群は、移植後７．５ヵ月を超えて生存していた。逆に言えば、イソタイプ対照群は、６．５ヵ月後処理の後で１００パーセントの死亡率であった。５１日目（最後の処置の直後）において，１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群の腫瘍容積はイソタイプ対照群（ｐ＝０．００９８）の２０％であった。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、生存率を高め、ヒト乳癌の安定したモデルで、対照治療群と比較して全身腫瘍組織量を減少させた。
【００１３】
ヒト乳癌モデルでの有益な効果に加えて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置もまた、卵巣癌モデルでＯＶＣＡＲ−３細胞に対して抗腫瘍活性を有した。このモデルでの腫瘍発達の代用基準として体重を用いた。移植後８０日目（処置終了後１６日）、処置群のマウスは対照群の平均体重の８７．６パーセントであった（ｐ＝０．０１５）。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置は、いくつかの異なる癌モデルで、魅力的な抗癌性の治療薬とする。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置は、緩衝液で処置した対照群と比較してヒト卵巣癌の十分に確立されたモデルで腫瘍発達を遅延させたことから、有効であった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗腫瘍活性は、いくつかの異なる癌モデルで、それを魅力的な抗癌性の治療薬とする。
この発明は、治療薬の標的としての１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の使用を教示するもので、投与された場倍、哺乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減らすことができ、治療をうけている哺乳類の生存を延長させることもできる。この発明はまた、ＣＤＭＡＢ（１１ＢＤ−２Ｅ１１−２）およびその誘導体の使用も教示しており、その抗原を標的にすることで、哺乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減らし、またこの抗原を発現している腫瘍を持つ哺乳類の生存を延ばす。
【００１４】
培養液中での乳癌細胞および前立腺癌細胞に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６細胞障害性の結果は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での抗腫瘍活性を確立することで、さらに引き延ばされた。ヒト癌の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルでは、ＭＢ−２３１乳癌細胞またはＰＣ−３前立腺細胞を重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの首筋の皮下に移植した。なぜなら特定の免疫細胞が欠如しているため、ヒト腫瘍細胞を拒絶することができないからである。症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療効力を予測する有効な手段と考えられる。マウスの異種移植片は、自然発生的な癌と同様に間質壊死、中心壊死、および血管新生を発病している固形腫瘍として成長する。乳癌細胞株ＭＢ−２３１および前立腺腫瘍株ＰＣ−３を、免疫不全のマウスでの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）異種移植モデルとして評価した。ＭＢ−２３１およびＰＣ−３腫瘍の成功した移植または「取り込み率（ｔａｋｅ−ｒａｔｅ）」と標準的な化学療法薬に対する腫瘍の感度によって、それらが適当なモデルであることを特徴づけた。ＭＢ−２３１親細胞系および該細胞系の変異体とＰＣ−３アンドロゲン非依存型細胞系とが、臨床化学療法薬として使用された広範囲にわたる治療薬を評価するために、異種移植腫瘍モデルとして成功裏に用いられた。
また、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６は、ヒト乳癌予防生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルでの腫瘍増殖を抑制し、全身腫瘍組織量を減少させた。モニタリングは処置後１５０日以上続いた。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腫瘍を決して生ずることなく、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の８７．５パーセントが移植後６ヶ月を過ぎても生存していた。
また、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６は、ヒト乳癌予防生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルでの腫瘍増殖を抑制し、全身腫瘍組織量を減少させた。モニタリングは処置後１５０日以上続いた。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腫瘍を決して生ずることなく、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の８７．５パーセントが移植後６ヶ月を過ぎても生存していた。逆に言えば、イソタイプ対照群は、７２日目（処理後２３日）までに致死率１００％を達成した。１Ａ２４５．６処置マウスは処置後１５１日までに致死率１００％を達成し、このことはイソタイプ対照処置群よりも６倍長い。したがって、１Ａ２４５．６、さらにたいていの場合７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌細胞モデルでの生存を高め、全身腫瘍組織量を減少させた。
その上、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６によって、確立された生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ヒト乳癌モデルで、腫瘍増殖の抑制および全身腫瘍組織量の減少が有意に達成された。８０日目（後処理２３日）までに、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置マウスではイソタイプ対照群と比較して８２％低い平均腫瘍容積であった（ｐ＝０．００１）。１Ａ２４５．６処理もまた、この日により低い平均腫瘍容積、３５パーセント（ｐ＝０．１３５）を達成した。生存を抗体有効性の基準として用いることで、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群での致死のリスクは、処置後約６０日目でイソタイプ対照群の約１６パーセント（ｐ＝０．０００６）であった。処置後５０日までに１００％のイソタイプ対照群が致死した。相対的に、１Ａ２４５．６処置マウスは処置後１００日まで生存し、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の６０％が処置後１３０日目であっても生存していた。このデータは、対照処置群と比較した場合に、１Ａ２４５．６および７ＢＤ−３３−１Ａ処置によって生存および減少全身腫瘍組織量という利点が与えられたことを示している。体重減少および臨床苦痛等、いかなる毒性の兆候も誘導しなかったことから、７Ｂ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置が安全であることが明らかであった。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置は、なぜならヒト乳癌の十分に確立されたモデルで、対照処置群と比較して、腫瘍増殖を遅らせ、生存を高めたことから、効果的であった。
【００１５】
確立された乳癌の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍モデルに加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置もまた、予防生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）前立腺癌モデルでＰＣ−３細胞に対する抗腫瘍活性を有した。この前立腺異種移植モデルでは、腫瘍細胞の移植１日前に７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＡ２４５を別々にマウスに投与、その後７週間にわたって毎週注射した。７ＢＤ−３３−１Ａおよび１Ａ２４５．６処置は、イソタイプ対照抗体よりも処置期間直後に腫瘍増殖を抑制する点で、有意に（それぞれｐ＝０．００１および０．０１７）、より効果的であった。処置相終了時、７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６を与えられたマウスは、それぞれイソタイプ対照群のたったの３１および５０パーセントまでしか増殖しない腫瘍を有した。
【００１６】
ＰＣ−３ＳＣＩＤ異種移植モデルに対して、疾患進行の代用指標として体重を用いることができる。５２日目では、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置は、イソタイプ対照群と比較して、それぞれ５４および２５パーセントまで体重の減少を有意に（それぞれｐ＝０．００２および０．００４）抑えた。処理後の生存についてマウスをモニターした。処置後１１日目で、イソタイプおよび緩衝対照マウスは致死率が１００パーセントに達した。逆に言えば、処置後３８日目で７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６が致死率１００パーセントに達し、対照群よりも３倍長かった。このように７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置は、十分に確立されたヒト前立腺癌でのイソタイプ対照処置群と比べて、両方とも腫瘍増殖を遅らせ、体重の減少を抑え、さらに生存を延ばすことから、有効であった。
【００１７】
前立腺癌の予防生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍モデルに加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａは確立された生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍モデルでＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を示した。この異種移植モデルでは、抗体処置前に腫瘍が一定の大きさに達するように、ＰＣ−３前立腺癌細胞がＳＣＩＤマウスに対して皮下移植された。７ＢＤ−３３−１１Ａによる処置を再びイソタイプ対照群と比較した。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群では、処置直後にイソタイプ対照群と比較して、平均腫瘍容積が有意に（ｐ＜０．０２４）に小さいことが示された。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、イソタイプ対照群と比較して、３６パーセントまでの腫瘍抑制を媒介した。いくつかの異なる癌モデルでは、７ＢＤ−３３−１１Ａの抗腫瘍活性によって、該モデルが魅力的な抗癌治療薬となった。
【００１８】
正常組織に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の結合を測定した。ＩＨＣ染色によって、腎臓、心臓、および肺等の生体器官を含む大部分の組織は７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現に失敗した。７ＢＤ−３３−１１Ａは、唾液腺、肝臓、脾臓、胃、前立腺、および十二指腸を染色し、さらに扁桃腺を強く染色した。組織染色から得られた結果によれば、７ＢＤ−３３−１１Ａは、種々の細胞型に対する結合が制限される一方で、浸潤マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞に対して結合することが示された。１Ａ２４５．６については、より広範な組織が陽染性であった。大部分のケースでは、染色は上皮または浸潤マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞に制限された。しかし、心筋および肝細胞の両方で陽染性がみられた。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６は、膜染色パターンおよび細胞質染色パターンを示した。
【００１９】
７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗原の限局化ならびに乳がん患者でのその有病率は、免疫療法の有益性を評価する際に重要である。癌患者の乳房腫瘍における抗原発現に対処するために、５０人の乳がん患者から得た腫瘍組織試料を、７ＢＤ−３３−１１ Ａまたは１Ａ２４５．６抗原のいずれかの発現についてスクリーニングした。本研究の結果は、組織試料の３６パーセントが７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原に対して陽染色性であった。染色が悪性細胞に限定されたことから、患者試料内での７ＢＤ−３３−１１Ａの発現が、癌細胞に対して特異的であるように見えた。また、７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌患者から得た正常組織の１０試料中、染色したものはゼロであった。一方、１Ａ２４５．６は、乳癌組織試料の９８パーセントを染色した。１Ａ２４５．６はまた、乳癌患者から得た正常組織の１０試料中、８試料を染色した。しかし、一般に、この染色は乳癌組織試料で観察されたものよりもかなり弱く、また一般に浸潤線維芽細胞に限定された。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６発現を、さらに、乳房腫瘍の発達、処置、および予後において重要な役割を演じるホルモン（エストロゲンおよびプロゲステロン）に対する受容体の乳房腫瘍にもとづいて評価した。ＩＡ２４５．６抗原の発現とエストロゲンもしくはプロゲステロンのいずれかに対する受容体の発現との間に、明瞭な相互関係はなかった。エストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現と７ＢＤ−３３−１１Ａの発現との間にわずかな相互関係があった。すなわち、受容体発現を有する組織は、わずかに高い７ＢＤ−３３−１１Ａ発現を呈した。腫瘍を該腫瘍の病期分類または癌の進行の度合いにもとづいて分析した場合、結果は７Ｂ−Ｄ−３３−１１Ａに対してより高い腫瘍病期によってよりいっそう陽性発現し、１Ａ２４５．６に対してより高い腫瘍病期によってより高強度に染色される傾向を示唆した。しかし、結果は試料の大きさが小さいことによる制限を受けた。
【００２０】
さらに７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の潜在的な治療上の利益をさらに拡げるために、種々のヒト癌組織内での抗原の頻度および限局化を決定した。いくつかの癌種は、乳癌に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を発現した。陽性のヒト癌種として、皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、前立腺（１／１）、子宮（４／４）、および腎臓（３／３）が含まれた。いくつかの癌は抗原を発現しなかった。すなわち、それらは、卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）、およびリンパ節（０／２）を含んだ。１Ａ２４５．６については、正常ヒト組織アレイと同様に、種々のヒト組織種から得た多数の癌が陽染色性であった。より強い染色は、皮膚、肺、肝臓、子宮、腎臓、胃、および膀胱の悪性細胞上で見られた。ヒト乳がん組織と同様に、７ＢＤ−３３−１ｌＡおよび１Ａ２４５．６の限局化は、これらの腫瘍細胞の膜上または細胞質内で生じた。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で癌細胞系に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗体結合に加えて、抗原がヒトで発現され、多数の種類の癌で発現される証拠がある。
【００２１】
全体として、このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗原が癌関連抗原であって、ヒトで発現され、さらに病理学的に関連した癌標的であることを示している。さらに、このデータもまた、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗原がヒト癌組織に結合することを示しており、また診断、治療の予測、または予後診断となり得るアッセイのために、適切に使われる。加えて、上記抗原の細胞膜限局化によって、診断、治療の予測、または予後診断となり得るアッセイで使用される該抗原、その遺伝子もしくは誘導体、そのタンパク質もしくはその変異体の使用が可能となる。
全体で、この発明は治療薬の標的として７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６抗原の使用を教示するもので、それが投与された場合に、哺乳類でその抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減らすことができ、また治療を受けている哺乳類の生存延長をもたらすことができる。この発明はまた、ＣＤＭＡＢ（７ＢＤ−３３−１１Ａ／１Ａ２４５．６）およびその誘導体を用いて、哺乳類で抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減らし、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の生存を延ばすために、その抗原を標的化することも、教示する。さらに、この発明は癌細胞における７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６抗原の検出を用いることも教示するもので、その抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の診断、治療の予測、および予後診断に有用である。
【００２２】
もし患者が治療の初期経過に対して不応性であったり、転移が生じた場合、腫 瘍に対する特異的抗体を生ずるプロセスを、再処置のために繰り返すことができる。さらにまた、抗癌抗体をその患者から得た赤血球に結合させて転移の処置のために再注入することができる。転移癌に対する効果的処置はほとんどなく、転移は一般に死に至る転帰不良の前兆となる。しかし、転移癌は通常、十分に血管化しており、赤血球による抗癌抗体の送達によって、腫瘍部位に抗体を集中させる効果が得られる。転移に先立っても、ほとんどの癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存しており、また赤血球に結合した抗癌抗体は同様に原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）腫瘍でありえる。あるいは、抗体は、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞等の他の血液原細胞に結合することも可能である。
抗体には５つの種類があり、各々がその重鎖によって与えられる機能と関連している。裸の抗体によって癌細胞を殺すことは、抗体依存型細胞障害性または補体依存型細胞障害性のいずれかを通して媒介となると、一般に思われている。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は補体系のＣ−１成分が結合することでヒト補体型を活性化させることができ、それによって腫瘍細胞溶解を導くことができる補体活性化の古典経路が活性化される。ヒト抗体のために、最も効果的に補体活性化させている抗体は、一般にＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３イソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、および特定のリンパ球によって細胞殺害に導くＦｃレセプターを持つ細胞傷害性細胞を補充することで効果的である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３イソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣの媒介となる。
体媒介癌殺害のもう一つの可能な機構が、細胞膜およびその関連糖タンパク質もしくは糖脂質での種々の化学結合の加水分解を触媒するために働く抗体（いわゆる触媒抗体）の使用を介するものであってもよい。
抗体媒介癌細胞殺害により広く認められる２つの機構がさらに存在する。第１は、腫瘍細胞にある推定上の癌抗原に対して免疫反応を産生させるために身体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。第２は、抗体の使用であり、増殖受容体を標的として機能に干渉するめ、あるいは効果的に機能が失われるようにその受容体を下流制御する。
【００２３】
制癌剤の臨床有用性は、患者に対する許容リスク・プロフィールのもとでの薬物の利点に基づく。癌治療において、生存は通常、利点の次に最も求められている。しかし、延命に加えて多数の他のよく認識された利点がある。処置が生存に対して悪影響を及ぼさないこれらの他の利点として、症状寛解、有害事象に対する防御、再発または疾患のない生存の時間延長および進行の時間延長を含む。これらの判定基準は一般に認められており、米国食品医薬品局（Ｆ．Ｄ．Ａ）等の規制団体が、それらの利点を生む薬物を承認する（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ ４２： １３７−１４３ ２００２）。これらの基準に加えて、これらの種類の利点を予測することが可能な他のエンドポイントがあることが十分認識される。一つには、米国Ｆ．Ｄ．Ａ．によって与えられた促進的承認プロセスは、患者の利点を予測する代用物があることを認める。年末（２００３）より、このプロセス中で承認される薬剤が１６種類あり、これらのうちの４種類が完全に承認に移った。すなわち、追跡調査は、代わりの終末点によって予測されたとして直接の患者の利点を示した。固形腫瘍で薬物効果を決定するための１つの重要な終末点は、処置に対する反応の測定による全身腫瘍組織量の評価である（セラッセ（Ｔｈｅｒａｓｓｅ）他。米国国立癌研究所雑誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ） ９２ （３）： ２０５−２１６ ２０００）。そのような評価のための臨床判定基準（ＲＥＣＩＳＴ判定基準）は、固体腫瘍研究グループ（Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）（癌では国際的な一群の専門家）で、反応評価基準によって広められた。全身腫瘍組織量に対する示された効果を持つ薬物は、ＲＥＣＩＳＴ判定基準に従う客観的な反応で示すように、最終的に、適当な対照群と比較して、直接的な患者の利点を産生する傾向にある。前臨床設定では、全身腫瘍組織量は一般に、より直接的に評価および記録される。前臨床試験が上記臨床設定に解釈し得るという点で、前臨床モデルで生存を延ばす薬物は最も予想された臨床的有用性を持つ。臨床処置に対して肯定応答を生ずることに類似して、前臨床設定で全身腫瘍組織量を減少させる薬物もまた疾患に対して有意に直接的な影響を及ぼすことも可能である。生存の延長が制癌剤処置による臨床転帰後に最も求められるものではあるが、臨床有用性を持つ他の利点があり、全身腫瘍組織量もまた、直接的な利点に至ることもでき、また臨床的影響もあることは明らかである （エクハルド（Ｅｃｋｈａｒｄｔ）他。 ｅｔ ａｌ． 発達療法：標的化合物の臨床試験設計の成功および失敗： ＡＳＣＯ啓発本（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ； ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ）、２００３年第３９回年会、２００３、２０９−２１９頁）。
【００２４】
したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞系と、該ハイブリドーマ細胞系がコードされた対応する単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントとを単離するために、癌細胞に関して細胞障害性であり、同時に非癌細胞に対しては相対的に非毒性である特定の個人に由来する細胞から癌疾患修飾抗体を産生する方法を利用することである。
本発明の別の目的は、癌疾患修飾抗体とその抗原結合フラグメントとを教示することである。
本発明のさらなる目的は、細胞障害性が抗体依存型細胞障害性を通して媒介される癌疾患修飾抗体を産生することである。
本発明のさらに別の目的は、細胞障害性が補体依存型細胞障害性を通して媒介される癌疾患修飾抗体を産生することである。
本発明のさらなる目的は、細胞障害性が細胞化学結合の加水分解を触媒する能力の関数である癌疾患修飾抗体を産生することである。
本発明のさらなる目的は、癌の診断、予後、およびモニタリングのための結合アッセイに有用である癌疾患修飾抗体を産生することである。
この明細書の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。ここで、例証および例示を目的として、本発明のいくつかの実施形態を説明する。
【００２５】
（図面の簡単な説明）
この特許または出願では、彩色仕上げされた少なくとも１つの図面が含まれる。カラー図面を有するこの特許または特許出願公開の写しは、申請および必要な料金の支払いに応じて、特許庁から得られる。
図１は、１Ａ２４５．６抗体、両抗体のイソタイプ対照抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体、の典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図２は、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、１Ａ２４５．６のイソタイプ対照抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲのイソタイプ対照抗体の典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図３は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体、両抗体のイソタイプ対照抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体のＦＡＣＳヒストグラムである。
図４は、特定の抗体処置に関する腫瘍容積のグラフ解析である。
図５は、時間経過に伴うＭＢ２３１ヒト乳癌腫瘍容積に対する抗体効果のグラフ解析である。
図６は、 抗体療法に関連した時間経過に伴う生存率を定量化するグラフ解析である。
図７は、 ＭＣＦ−７乳癌モデルでの腫瘍増殖に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の効果を示す図である。図中、破線は抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは平均値±ＳＥＭを表す。
図８は、予防的ＭＣＦ−７異種移植研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後２３０日を超えた生存についてマウスをモニターした。
図９は、予防的ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌モデルの平均体重に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の効果を示す図である。実勢は、抗体が訪うよされた器官を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
図１０は、予防的ＯＶＣＡＲ−３研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−１またはバッファ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後約６０日間、生存に関してマウスをモニターした。
図１１は、予防的ＭＢ−２４１異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後２００日間、生存に関してマウスをモニターした。
図１２は、予防的ＭＢ−２３１乳癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
図１３は、確立したＭＢ−２３１異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４２５．６、またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後１３０日間にわたってマウスの生存をモニターした。
図１４は、予防的前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
図１５は、予防的ＰＣ−３異種移植研究の継続期間に対する異なる処置を受けた群の平均体重を示すヒストグラムである。データ・ポイントは各時点での各群についての平均値±ＳＥＭを表す。
図１６は、予防的ＰＣ−３異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４２５．６、イソタイプまたは緩衝対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す。処置後３８日間にわたって、生存についてマウスをモニターした。
図１７は、確立したＰＣ３前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す。破線は抗体が投与される期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
図１８は、確立したＰＣ−３異種移植研究の持続期間にわたる異なる処置群の平均体重を示すヒストグラムである。データは、各時点での各群の平均値±ＳＥＭとして表されている。
図１９Ａ〜Ｃは、正常ヒト脳であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１、Ｂが１Ａ２４５．６、およびＣが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
図２０Ａ〜Ｃは、正常ヒト心臓であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｂが１Ａ２４５．６（矢印は陽性染色を示す）、およびＣが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
図２１Ａ〜Ｃは、正常ヒト胃洞であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１Ａ（矢印は胃腺上皮の陽性染色を示す）、Ｂが１Ａ２４５．６（矢印は胃腺上皮の陽性染色を示す）、Ｃが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
図２２Ａ〜Ｂは、ヒト乳癌腫瘍（浸潤性導管癌：パネルＡ、黒色矢印：腫瘍細胞シート、黄色矢印：腫瘍間質）およびヒト正常乳房（パネルＢ）に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ結合の典型的な顕微鏡写真を示す。倍率は２００倍である。
図２３Ａ〜Ｂは、ヒト乳癌腫瘍（浸潤性導管癌：パネルＡ、黒色矢印：腫瘍細胞シート、黄色矢印：腫瘍間質）およびヒト正常乳房（パネルＢ、黒色矢印：線維芽細胞）に対する１Ａ２４５．６結合の典型的な顕微鏡写真を示す。倍率は２００倍である。
図２４Ａ〜Ｃは、腎細胞癌であり、Ａは７ＢＤ−３３−１１Ａ（矢印は腫瘍細胞シートでの陽性染色を示す）、Ｂは１Ａ２４５．６（矢印は腫瘍細胞シードでの陽性染色を示す）、およびＣは陰性イソタイプ対照である。倍率は２００倍である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
【実施例１】
【００２７】
ハイブリドーマ生産−ハイブリドーマ細胞系７ＢＤ−３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、および１１ＢＦ−２Ｅ１１−２ハイブリドーマ：
ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６を、ブタベスト条約に従って、それぞれ受託番号ＰＴＡ−４８９０およびＰＴＡ−４８８９として２００３年１月８日、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）（米国２０１１０−２２０９バージニア州マナッサス大学通り１０８０１）に寄託した。３７ＣＦＲ１．８０８にもとづいて、寄託者は、寄託材料の公開に対する有効性にかかるすべての制限が特許の付与によって即座に取り除かれることを確信する。
【００２８】
ハイブリドーマ細胞系１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を、ブタベスト条約に従って、受託番号ＰＴＡ−５６４３として２００３年１１月１１日、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）（米国２０１１０−２２０９バージニア州マナッサス大学通り１０８０１）に寄託した。３７ＣＦＲ１．８０８にもとづいて、寄託者は、寄託材料の公開に対する有効性にかかるすべての制限が特許の付与によって即座に取り除かれることを確信する。
【００２９】
抗癌抗体７ＢＤ−３３−１１Ａを産生するハイブリドーマを作るために、抗原、すなわちヒト乳癌細胞の単一細胞懸濁液を冷ＰＢＳで調製した。週齢８ないし９週のＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、２０万ないし２５０万個の細胞を含む抗原アジュバント１００マイクロリットルをフロイントの完全アジュバントとともに分割量で皮下および腹腔内注射によっておこなった。新たに調製した抗原アジュバントを用いて、初回免疫から３週間後、および最終免疫から２日後に同じ様式で２０万ないし２５０万個の細胞で免疫化マウスの追加免疫に用いた。最終免疫の少なくとも２日後、融合のために脾臓を用いた。単離した脾細胞をＳｐ２／０骨髄腫パートナーと融合してハイブリドーマを調製した。融合から得た上清をハイブリドーマのサブクローニングについて試験した。
【００３０】
抗癌抗体１Ａ２４５．６を産生するハイブリドーマを作るために、抗原、すなわちヒト乳癌細胞の単一細胞懸濁液を冷ＰＢＳで調製した。週齢８ないし９週のＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、２５０万個の細胞を含む抗原アジュバント１００マイクロリットルをフロイントの完全アジュバントとともに分割量で皮下および腹腔内注射によっておこなった。新たに調製した抗原アジュバントを用いて、初回免疫から３週間後、その後２週間、その後５週間、さらに最終免疫化から３週間後に同じ様式で２５０万個の細胞で免疫化マウスの追加免疫に用いた。最終免疫の少なくとも３日後、融合のために脾臓を用いた。単離した脾細胞をＮＳＯ−１骨髄腫パートナーと融合してハイブリドーマを調製した。融合から得た上清をハイブリドーマのサブクローニングについて試験した。
【００３１】
抗癌抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を産生するハイブリドーマを作るために、抗原、すなわちヒト乳癌細胞の単一細胞懸濁液を冷ＰＢＳで調製した。週齢８ないし９週のＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、２０万ないし２５０万個の細胞を含む抗原アジュバント１００マイクロリットルをフロイントの完全アジュバントとともに分割量で皮下および腹腔内注射によっておこなった。新たに調製した抗原アジュバントを用いて、初回免疫から２ないし３週間後、また最終免疫化から２週間後に同じ様式で２０万ないし２５０万個の細胞で免疫化マウスの追加免疫に用いた。最終免疫の少なくとも２日後、融合のために脾臓を用いた。単離した脾細胞をＮＳＯ−１骨髄腫パートナーと融合してハイブリドーマを調製した。融合から得た上清をハイブリドーマのサブクローニングについて試験した。
【００３２】
ハイブリドーマ細胞によって分泌される抗体が免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭイソタイプかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を２．４マイクログラム／ｍＬの濃度で含むコーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．２〜９．６）を４℃、１００マイクロリットル／ウエルで、ＥＬＩＳＡプレートに一晩加えた。このプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのブロッキング緩衝液（５％ミルク含有洗浄緩衝液）を上記プレートに、室温で１時間添加し、次に洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのハイブリドーマ懸濁液を添加し、プレートを１時間、室温でインキュベートした。このプレートを洗浄液で３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ複合体の１／５０００希釈物（１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈）１００マイクロリットル／ウエルを添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＰ溶液を室温で１〜３分間インキュベートした。２ＭのＨ２ＳＯ３を１００マイクロリットル／ウエル添加することで呈色反応を停止させ、プレートを４５０ｎｍでパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置で読み取った。表１に示すように、７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、および１１ＢＤ−２Ｅ１１−２ハイブリドーマは、主にＩｇＧイソタイプの抗体を分泌した。
【００３３】
限界希釈を１〜４回繰り返した後、細胞ＥＬＩＳＡアッセイで標的細胞に結合した抗体についてハイブリドーマ上清を試験した。３種類の乳癌細胞系、すなわちＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１ともいう）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８ともいう）、およびＳＫＢＲ−３、を試験した。平板培養された細胞を、使用前に固定した。室温で、プレートをＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳで希釈した２％パラホルムアルデヒド１００マイクロリットルを各ウエルに室温で１０分間添加し、その後捨てた。プレートを再びＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＰＢＳで再び洗浄した。ブロッキングを、５％ミルク含有洗浄液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を１００マイクロリットル／ウエルを用いて、室温で１時間実施した。プレートを洗浄液で３回洗浄し、ハイブリドーマ上清を１００マイクロリットル／ウエル、室温で１時間添加した。このプレートを洗浄液で３回洗浄し、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼと接合したヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭの１／５０００希釈物（１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈）を１００マイクロリットル／ウエル添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＢ基質を室温で１〜３分インキュベートした。反応を１００マイクロリットル／ウエルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、このプレートを、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置を用いて４５０ｎｍで読み取った。表１に集計したように、結果はＩｇＧイソタイプ対照（３ＢＤ−２７）と比較した際のバックグラウンドを上回る倍数で表した。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６ハイブリドーマ由来の抗体は、バックグラウンドよりも少なくとも６倍大きく、３種類の乳癌細胞系全てに対して強く結合した。両方の抗体が最も強くＭＤＡ−ＭＢ−２３１抗体に結合した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２ハイブリドーマ細胞系由来の抗体もまた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系に最も強く結合したが、バックグラウンドよりも大きい他の２細胞系に対する結合は示されたなかった。これらの結果は、この抗体によって認識されたエピトープがＭＤＡ−ＭＢ−４６８またはＳＫＢＲ−３細胞に存在しないこと、また７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６によって認識されたエピトープとは異なることを示唆している。
【００３４】
抗体結合に関する試験と同時に、ハイブリドーマ上清の細胞毒性について、同じ乳癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＳＫＢＲ−３）を用いて試験した。生／死細胞毒性アッセイをモレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｃｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｅｕ、ＯＲ）から得た。このアッセイを、以下に示す変更を加えて製造元の指示にしたがって実施した。細胞を、予め定められた適当な密度で上記アッセイ前に、平板培養した。２日後、ハイブリドーマ・マイクロタイター・プレートから１００マイクロリットルの上清を細胞プレートに移し、５日間にわたって５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。陽性対照群としてあるウエルを、空になるまで吸引し、１００マイクロリットルのアジ化ナトリウムおよび／またはシクロヘキシミドを添加した。３ＢＤ−２７モノクローナル抗体もまた、イソタイプ対照として添加した。なぜなら、それは試験した３種類の乳癌細胞系に対して結合しないからである。比較のために、抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃ２２５）も上記アッセイで用いた。処置５日後、上記プレートを逆さまにして空にし、拭いて乾燥した。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む室温ＤＰＢＳをマルチチャンネル・スクイーズ・ボトルから各ウエルに分配し、軽く３回叩き、反転して空にし、さらに拭いて乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＤＰＢＳで希釈した蛍光生／死染料５０マイクロリットルを各ウエルに添加し、３７℃、３０分間、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。プレートをパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置で読み取り、そのデータをマイクロソフト・エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）で分析した。結果を表１に集計した。
【００３５】
細胞毒性の違いが３種類の抗体で観察された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は３９〜７３％の致死を示し、ＳＫＢＲ−３細胞で最も高い細胞毒性が観察された。１Ａ２４５．６および７ＢＤ−３３−１１ＡはＭＤＡ−ＭＢ−２３１で類似の細胞毒性を示したが、Ａ２４５．６はＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対して細胞毒性を示すが７Ｂ−３３−１１Ａは示さなかった。
このことは、ハイブリドーマ細胞由来の抗体が癌細胞で細胞毒性を生じ得ることを示した。抗体結合の度合いと、ハイブリドーマによって生ずる細胞毒性とのあいだに一般的な関係もあった。この傾向にはいくつかの例外（例えば結合不足にもかかわらずＭＢ−４６８癌細胞およびＳＫＢＲ−３癌細胞で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって生ずる細胞毒性の量）があった。このことは、この細胞種での細胞ＥＬＩＳＡ結合アッセイによっては検出できない媒介作用を上記抗体が有すること、またはそのアッセイが結合を検出しないこと（細胞固定等のアッセイの制約によるかもしれない）を示唆した。最後に、さらに別の可能性が存在しており、すなわち、このアッセイがこの特定の状況下で細胞毒性を媒介するのに十分である結合を検出するには感度が乏しかった。他の例外は、イソタイプ対照と比較してバックグラウンドよりも結合が６倍増加したにも関わらず、ＭＢ−４６８細胞に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの細胞毒性の相対的な不足であった。このことは、結合がその同族の抗体リゲーションの結果を必ずしも予示するものではないという可能性を示した。既知の非特異的細胞毒性因子であるシクロヘキシミドは予想通りに細胞毒性を生じた。
【００３６】
【表１】
【実施例２】
【００３７】
抗体産生
モノクローナル抗体の産生は、ハイブリドーマ７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、およびＢＤ−２Ｅ１１−２を収集によりＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）で培養し、週に２回再播種し、プロテインＧセファローズ４ファースト・フロー（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ベイ・ド・ウルフェ（Ｂａｉｅ ｄ‘Ｕｒｆｅ）、ＱＣ）による標準的抗体精製手順でおこなった。ヒト化、キメラ化、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、およびＢＤ−２Ｅ１１−２を細胞毒性アッセイで、多数の陽性対照群（抗Ｆａｓ（ＥＯＳ９．１、ＩｇＭ、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ、イー・バイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＣＡ）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧ１、カッパ、１０マイクログラム／ｍｌ、インター・メディコ（Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄｉｃｏ）、マークハム（Ｍａｒｋｈａｍ）、ＯＮ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ１、カッパ、５マイクログラム／ｍｌ、シーダーレーン（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）、ホーンビー（Ｈｒｎｂｙ）、ＯＮ）、シクロヘキシミド（１００マイクロモル、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）、ＮａＮ３（０．１％、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ））および陰性対照群１０７．３（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ１、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ、ＢＤ バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）、Ｇ１５５−１７８（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ、ＢＤ バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）、ＭＰＣ−１１（抗原特異性未知、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン 、ＩｇＧ３、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ）、ＩｇＧ緩衝液（２％））と比較した（表２）。
【００３８】
【表２】
【００３９】
乳癌（ＭＢ−２３１、ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７）、大腸癌（ＨＴ−２９，ＳＷ１１１６、ＳＷ６２０）、肺癌（ＮＣＩ Ｈ４６０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ）、前立腺癌（ＰＣ−３）、および非癌（ＣＣＤ ２７ｓｋ、Ｈｓ８８８ Ｌｕ）細胞系を試験した（全てＡＴＣＣ、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、ＶＡから入手）。生／死細胞毒性は、モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ（ユージン）、ＯＲ）から得た。アッセイは以下に概説する変更を加えて製造元の指示に従っておこなった。細胞を、予め定められた適当な密度で上記アッセイ前に、平板培養した。２日後、１００マイクロリットルの精製抗体を培地に希釈して細胞プレートに移し、５日間にわたって８％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。上記プレートを逆さまにして空にし、拭いて乾燥した。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む室温ＤＰＢＳをマルチチャンネル・スクイーズ・ボトルから各ウエルに分配し、軽く３回叩き、反転して空にし、さらに拭いて乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＤＰＢＳで希釈した蛍光生／死染料を各ウエルに５０マイクロリットル添加し、３７℃、３０分間、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。プレートをパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置で読み取り、そのデータをマイクロソフト・エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）で分析した。結果を表２に集計した。データは、３重に試験した４回の実験の平均を表し、以下の様式で定量的に示した。すなわち、閾値細胞毒性よりも大きい４／４実験（＋＋＋）、閾値細胞毒性よりも大きい３／４実験（＋＋）、閾値細胞毒性よりも大きい２／４実験（＋）。表２中無印の細胞は、不定または閾値細胞毒性よりも低い効果を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗体は選択的に乳房および前立腺の腫瘍株で細胞毒性を示した、その一方で、非形質転換正常細胞に対しては効果を示さなかった。両方とも陽性対照抗Ｆａｓ抗体よりも２５〜５０％大きい致死率を示した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、乳癌細胞および卵巣癌細胞に対して特異的であり、正常細胞に対しては影響を及ぼさなかった。化学的細胞毒性因子は、該因子の期待される細胞毒性を誘発し、その一方で比較のために誘導される数多くの他の抗体もまた予想通りに実行され、生物学的細胞アッセイに限定を加えた。全体で、３種類の抗体が多数の癌細胞型に対して細胞毒性活性を持つことが示された。抗体は、全ての癌細胞型が感受性を示すわけではないので、該抗体の活性という点で選択的である。さらにまた、抗体が非癌細胞型に対しては細胞毒性を生じないということ（治療的な状況では重要な要素である）から、抗体は機能的特性を示した。
【００４０】
まず最初に細胞単層をＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まず）で洗浄して、ＦＡＣＳ用に細胞を調製した。次に、細胞解離緩衝液（インビトロゲン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて、３７℃で細胞培養プレートから細胞を除去した。細胞の遠心および回収後、細胞をＭａｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、および２５％牛胎児血清を含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）リン酸緩衝生理的食塩水（４℃、洗浄媒体）に再懸濁し、計数し、適当な細胞密度に等分し、遠心して細胞をペレットにし、さらに７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、ＢＤ−２Ｅ１１−２、または対照抗体（イソタイプ制御または抗ＥＧＦ−Ｒ）を２０マイクログラム／ｍｌ含む染色媒体（ＭａｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＤＰＢＳ）に。氷上、３０分間、再懸濁した。アレクサ・フルーア（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）結合二次抗体を細胞に添加することに先立って、細胞を洗浄媒体で１回洗浄する。染色媒体に含まれるアレクサ・フルーラ４８８接合抗体を次に２０分間添加した。次に細胞を最終時間に対して洗浄し、１マイクログラム／ｍｌヨウ素化プロピジウムを含む染色媒体に再懸濁した。フローサイトメトリーによる細胞の獲得を、セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウエア（ＢＤ バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いてＦＡＣスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）上に試料を走らせることで、評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）は、ＦＳＣＣおよびＳＳＣ検出器上で電圧および振幅利得を調製することで、設定される。３本の蛍光チャネル（ＦＬ１、ＦＬ２、およびＦＬ３）用の検出器を、細胞が約１−５単位の中央値蛍光強度で均一のピークを持つようにして、アレクサ・フルーア（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８結合二次抗体が続く精製されたイソタイプ制御抗体で染色される細胞を走らせることによって調整した。ＦＳＣおよびヨウ素化プロピジウムに対してゲーティングをおこなうことで、生細胞を取得した。各試料について、約１０，０００個の生細胞を分析のために取得し、その結果を表３に示した。表３は、イソタイプ対照を上回る蛍光強度増加倍率の平均値を示し、定量的に５未満（−）、５ないし５０（＋）、５０ないし１００（＋＋）、１００を超える（＋＋＋）として表し、かつ括弧内は染色された細胞率であった。
【００４１】
【表３】
【００４２】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の典型的なヒストグラムを図１用に編集し、１Ａ２４５．６抗体の典型的なヒストグラムをを図２用に編集し、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の典型的なヒストグラムを図３用に編集し、さらに二峰性のピークを含む結合特性を明示した。いくつかのケースでは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が乳房腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する特異的腫瘍結合を示した。７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＡ２４５．６の両方が乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７）、大腸、肺、卵巣、および前立腺起源の癌系に対する類似した結合を示し、乳癌細胞系の一つ（ＭＤＡＭＢ−４６８）に対しては差次的な結合を示した。非癌化細胞に対する３種類の抗体全ての結合があったが、その結合は細胞毒性を生じなかった。このことは、結合がその同族の抗原の抗体連結反応の結果を必ずしも予示するというわけではないというさらなる証拠であり、また非自明的な知見であった。このことは、異なる細胞での抗体連結反応の状況がまさに抗体結合よりも細胞毒性の決定因子であったことを示唆した。
【実施例３】
【００４３】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験
ここで、図５および図６に示したデータに関連して、週齢４ないし８週のメスＳＣＩＤマウスに対して、５００万個のＮＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットルをマウスの首筋に皮下注射することで、該細胞を移植した。マウスを無作為に、１０匹からなる処置群４つに分けた。移植に先立つ日に、２０ｍｇ／ｋｇの１１ＢＤ２Ｅ−１１−２、７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６試験抗体または３ＢＤ−２７イソタイプ対照抗体（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に結合しないことが知られている）を、２．７ ｍＭ ＫＣＩ、１ ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭＮａＣｌ、および２０ ｍＭＮａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。抗体を次に週に１回、同じ様式で７週間にわたって投与した。
【００４４】
腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、最大１０週間あるいは動物がカナダ動物飼育評議会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ； ＣＣＡＣ）エンド・ポイントに達するまで測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通して見られなかった。週間隔で計量される体重は、健康および発達障害の代用となった。イソタイプ対照３ＢＤ−２７と７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６または１１ＢＤ−２Ｅ１１−２とによって処置された複数の群に関して体重差が最小であった。６０日目（処置停止後１１日）では、１Ａ２４５．６による処置を受けた群の腫瘍体積は、対照群の５．２％（ｐ＝０．０００２）であり、抗体処置による全身腫瘍組織量の減少に効果を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体による処置を受けたそれらの癌保持マウスは疾患を持たず、全身腫瘍組織量がゼロであった。腫瘍容積は、６７日目で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群でより低かった（対照の４５％）（ｐ＝０．０８）。このことはまた、対照抗体と比較して細胞毒性抗体による全身腫瘍組織量の低下を示した。これもまた、７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、および１１ＢＤ−２Ｅ１１−２細胞傷害抗体による処置による対応の生存利点があった（図６）。３ＢＤ−２７抗体によって処置された対照群は、移植後７４日目で１００％の致死率に達した。対照的に、７ＢＤ−３３−１１Ａによって処置された群は疾患無しであり、１Ａ２４５．６処置動物の生存率は１００％であり、さらに１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって処置された群の生存率は２４％であった。
全体で、細胞毒性抗体処置は、ヒト癌疾患のよく認識されたモデルでの対照抗体と比較して、全身腫瘍組織量を減少させるとともに生存率を高めた。このことは、他の哺乳類（ヒトを含む）での治療にとって、これらの抗体（７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、およびＢＤ−２Ｅ１１−２）の薬理学的および製薬学的利点があることを示唆している。
【実施例４】
【００４５】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）定着腫瘍実験
週齢５ないし６週のメスＳＣＩＤマウスに対して、５００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を含む１００マイクロリットルをマウスの首筋に皮下注射することによって、該細胞の移植をおこなった。腫瘍増殖の測定は、カリパスを用いて毎週おこなった。移植後３４日で大部分のコホートが１００ｍｍ３（範囲５０〜２００ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、８〜１０匹のマウスを無作為に３つの処置群の各々に割り当てた。７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６試験抗体または３ＢＤ−３７イソタイプ対照抗体（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に結合しないことが知られている）を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量１５０マイクロリットルで抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）とともに腹腔内投与した。抗体を次に週に３回、合計で１０用量、同じ様式で移植後５６日目まで投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、移植後５９日目まで、または動物がカナダ動物飼育評議会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ； ＣＣＡＣ）エンド・ポイントに達するまで測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【００４６】
毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通して見られなかった。週間隔で計量される体重は、健康および発達障害の代用となった。イソタイプ対照と７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６抗体とによって処置された複数の群に体重差はなかった。図４に示すように、移植後５９日目（処置停止後２日）では、７ＢＤ−３３−１１Ａによる処置を受けた群の腫瘍体積は、対照群の２９．５％（ｐ＝０．０００３）であった。この群では、５９日目の値と５２日目（ｐ＝０．２５）とを比較した場合に、平均腫瘍容積の後退に向かう傾向があった。同様に、１Ａ２４５．６後退による処置もまた、有意に腫瘍増殖を抑制し、全身腫瘍組織量を低下させた。この抗体によって処置された定着腫瘍を持つ動物は、イソタイプ処置対照群の５６．３％である腫瘍容積を有した（ｐ＝０．０１７）。
全体で、ヒト癌疾患のよく認識されたモデルでの対照抗体と比較して、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗体による処置が有意に定着腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させた。このことは、他の哺乳類（ヒトを含む）での治療にとって、これらの抗体の薬理学的および製薬学的利点があることを示唆している。
【実施例５】
【００４７】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＭＢ−２３１予防的生存腫瘍実験
ＳＮ．１０／３４８，２８４に概説されているように、また図１１を参照すると、週齢４ないし８週のメスＳＣＩＤマウスに対する５００万個のＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の移植を該ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによっておこなった。マウスを無作為に、１０匹からなる処置群４つに分けた。移植に先立つ日に、２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６試験抗体またはイソタイプ対照抗体（ＭＢ−２３１もしくはＰＣ−３細胞に結合することが知られている）を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。抗体を次に週に１回、同じ様式で７週間にわたって投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、最大１０週間あるいは動物がカナダ動物飼育評議会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ； ＣＣＡＣ）エンド・ポイントに達するまで測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【００４８】
Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２８４からの継続出願で、７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６のいずれかによる処置に関連した後処置生存利点（図１１）が得られた。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腫瘍を決して生じなかった。また、１匹のマウスのみが２００日目（処理後１５１日）に死亡した。対照的に、イソタイプ対照マウスのすべてが移植後２３日目までに脂肪した。１Ａ２４５．６処置群は、、イソタイプ対照群よりも６倍長い処置後１５１日まで致死率が１００％までには達しなかった。まとめると、１Ａ２４５．６および７ＢＤ−３３−１Ａは、ヒト癌の乳房腫瘍モデルで、生存を高め、また全身腫瘍組織量を減少させた。
【実施例６】
【００４９】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＭＢ−２３１定着腫瘍実験
ＳＮ．１０／３４８，２８４に概説されているように、また図１２および図１３を参照すると、週齢５ないし６週のオスＳＣＩＤマウスに対する５００万個のＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の移植を該ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによっておこなった。腫瘍の増殖をカリバーで毎週測定した。移植後３４日で大部分のコホートが１００ｍｍ３（範囲５０〜２００ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、マウスを無作為に３つの処置群の各々に割り当てた。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６試験抗体またはイソタイプ対照抗体を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量１５０マイクロリットルで抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）とともに腹腔内投与した。つぎに、抗体を週に３回合計で１０用量の投薬を、移植後５６日目までおこなった。腫瘍増殖を、移植後５９日目まで、あるいは個々の動物がＣＣＡＣエンド・ポイントに達するまで、約７日ごとにカリパスを用いて測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【００５０】
Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２８４からの継続出願で、７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６のいずれかによる処置に関連した後処置全身腫瘍組織量減少（図１２）および生存利点（図１３）が得られた。８０日目（処置後２３日）では、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６は、イソタイプ対照処置と比較して平均腫瘍容積が減少した（すなわち、それぞれ８３（ｐ＝０．００１）および３５パーセント（ｐ＝０．１３５））。コックス比例モデルは、異なる群でのハザード（リスク）率を比較するために用いられた。この方法では、群ごとのハザード率をイソタイプ対照群のハザード率と比較する。処置後約６０日で、７ＢＤ−３３−１１Ａ群での致死リスクは、イソタイプ対照処置群と比較して、１６パーセントであった（ｐ＝０．０００６）。７ＢＤ−３３−１１Ａに関連する生存利点は、処理後１００日のマークをかなり過ぎて続くように見えた。処置後１３０日目では、７ＢＤ−３３−１１Ａは生存率６０％を示し、その一方でイソタイプ対照マウスの全てが後処理５０日目で致死した。１Ａ２４５．６は、イソタイプ対照と比較して生存時間が２倍であった（すなわち、後処理５０日に対して１００日）。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６は、ヒト乳癌疾患の十分に認識されたモデルにおいて対照抗体と比較した場合、全身腫瘍組織量を低下および増加させた。このことはこれらの抗体がヒトを含む他のほ乳類での治療にとって薬理学的および製薬学的利点があることを示唆している。
【実施例７】
【００５１】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＰＣ−３予防的腫瘍実験
図１４および図１５を参照すると、週齢４ないし８週のオスＳＣＩＤマウスに対する１００万個のＰＣ−３ヒト乳癌細胞の移植を該ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによっておこなった。マウスを無作為に、それぞれ８匹からなる４つの処置群に割り当てた。移植に先立つ日に、２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６試験抗体またはイソタイプ対照抗体もしくは緩衝対照を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。抗体および緩衝対照を次に週に１回、同じ様式で７週間にわたって投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、最大１０週間あるいは動物がＣＣＡＣエンド・ポイントに達するまで、もしくは５２日目まで、測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【００５２】
異なる群を特定するために最小有意差法（ＬＳＤ）を用いることで、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の両方とも、対照群と比較して処置マウスでの全身腫瘍組織量を有意に減少させることが明らかであった（図１４）。処置後（５２日目）、７ＢＤ−３３−１１Ａはイソタイプ対照と比較して６９パーセント（ｐ＝０．００１）まで腫瘍増殖を防いだ。また、１Ａ２４５．６も、イソタイプ対照と比較して５０パーセント（ｐ＝０．１７）まで腫瘍増殖を防いだ。類似の知見は、緩衝対照と比較をおこなった際に見いだされた。ＰＣ−３前立腺癌異種移植モデルでは、疾患進行の代用指標として体重を用いることができる（図１５）。反復分散分析（Ｒｅｐ． アノバ（ＡＮＯＶＡ））は、イソタイプと緩衝対照群との間に体重の有意差が存在しなかったことを示している。分散分析は、５２日目で、７ＢＤ−３３−１１Ａが対照群および１Ａ２４５．６処置群の両方よりも有意に高い体重を有したと決定した（ｐ＜０．０３）。全体的に、７ＢＤ−３３−１１Ａは、イソタイプ対照群と比較して、５４パーセント（ｐ＝０．００２）まで体重損失を防ぎ、一方１Ａ２４５．６は２５パーセント（ｐ＝０．００４）まで体重損失を防いだ。処置後、生存に関してマウスをモニターした（図１６）。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置マウスの１００パーセントが、処置後３８日目までに致死に達した。このことはイソタイプおよび緩衝対照処置群（処置後１１日）よりも３倍長かった。
まとめると、ヒト前立腺癌の十分に認識されたモデルでイソタイプ対照抗体および緩衝対照と比較して、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗体処置は、全身腫瘍組織量を減少させ、疾患の進行を遅らせ、さらに生存を延ばした。これらの結果は、乳癌を越えた治療としてこれらの抗体（７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６）の潜在的な薬理学的および製薬学的利点を示唆する。
【実施例８】
【００５３】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＰＣ−３定着腫瘍実験
週齢４ないし８週のオスＳＣＩＤマウスに対して、１００万個のＰＣ−３前立腺癌細胞を含む１００マイクロリットルをマウスの首筋に皮下注射することによって、該細胞の移植をおこなった。腫瘍増殖の測定は、カリパスを用いて毎週おこなった。移植後２１日目で大部分のコホートが２７５ｍｍ３（範囲１４４〜４０６ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、９〜１０匹のマウスを無作為に４つの処置群の各々に割り当てた。７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６またはイソタイプ対照抗体を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで２０ｍｇ／ｋｇ／用量で、腹腔内投与した。つぎに、抗体を週に３回合計で１０用量の投薬を、移植後４３日目までおこなった。腫瘍増殖を、研究期間中または個々の動物がＣＣＡＣエンドポイントに達するまで、約７日毎にカリパスを用いて測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
無作為化の際、平均の腫瘍容積と各群の標準偏差とが同程度だった。統計学的に群間の体重差はなかった。このことは、真の無作為化が起こったことを示した。図１７に示すように、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａは、３週間の処置期間の終わりに、イソタイプ対照と比較して、３６パーセント（ｐ＝０．２４）まで腫瘍増殖を有意に抑制することが可能であった。イソタイプまたは投与群と比較した場合、１Ａ２４５．６は有意差を示さなかった。同様に、７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６は、体重（図１８）に関して、イソタイプまたは緩衝対照処置群と比較して、いくらかの有意差を示した。全ての群は、本研究（ｐ＜０．００１）の全体を通じて、体重損失が同程度の有意量を示した。
要約すれば、７ＢＤ−３３−１１Ａは、ＳＣＩＤマウスにおいて前立腺癌の定着腫異種移植モデルでの腫瘍増殖を抑制する点で、イソタイプ対照抗体よりも有意に優れた効果を示す。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａによる処置は、ヒト癌疾患（乳房および前立腺）の２つのよく認識されたモデルで、有意に定着腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させた。このことは、ヒトを含む他の哺乳類での処置に対するこの抗体の薬理学的および製薬学的利点を示唆している。
【実施例９】
【００５４】
正常ヒト組織染色
ＩＨＣ研究を実施して、ヒト体内での７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗原の分布を特徴づけた。ＩＨＣ最適化研究は、さらなる実験のための条件を決定するために、前もって実施した。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６モノクローナル抗体は、すでに述べたようにして、生産および精製した。
組織切片をオーブンで５８℃、１時間乾燥させることで、脱パラフィン化し、コプリン・ジャーでキシレンに５回（各々４分）浸すことで脱ワックス化した。一連の段階的なエタノール洗浄（１００％−７５％）を通しての処置の後で、切片を水中で再水和させた。スライドを１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））に浸し、次に各々５分間で高、中、および低パワー設定でマイクロ波処理し、最終的に冷ＰＢＳに浸した。次にスライドを３％過酸化水素水に６分間浸し、ＰＢＳで３回、各々５分間洗浄し、乾燥し、ユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ブロッキング溶液（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））とともにインキュベート（５分間、室温）した。７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、モノクローナル・マウス抗ビメンチン（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））、またはイソタイプ対照抗体（黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼ（哺乳類組織内には存在せず、また誘導不可の酵素）（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））を抗体希釈緩衝液（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））によって希釈して作用濃度（各抗体について５μｇ／ｍｌ）にし、室温で１時間、一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回（各回５分）洗浄した。一次抗体の免疫反応性の検出／視覚化を、室温で３０分間にわたり供給（ダコ・エンビジョン・システム（Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ）））されるＨＲＰ結合二次抗体によっておこなった。このステップの後に、スライドをＰＢＳで３回（各回５分）洗浄し、室温で１０分間にわたる免疫ペルオキシダーゼ染色のためにＤＡＢ（３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド、ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））クロモゲン基質溶液を添加することで、呈色反応が生じた。このスライドを水道水で洗うことで、クロモゲン反応を停止させた。マイヤー・ヘマトキシリン（Ｍｅｙｅｒ‘ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（シグマ・ダイアグノスティックス（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）による対比染色を行った後、スライドを段階的エタノール（７５〜１００％）で脱水し、キシレンでクリアにした。マウンティング・メディア（ダコ・ファラマウント（Ｄａｋｏ Ｆａｒａｍｏｕｎｔ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ）））を使用することで、スライドにカバースリップを置いた。アキソバート（Ａｘｉｏｖｅｒｔ）２００（ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）、カナダ、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、ＯＮ）を持ちいて、スライドを顕微鏡的に調べ、デジタル画像を獲得し、ノーザン・エクリプス・イメージング・ソフトウエア（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ミシサーガ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）、ＯＮ）を用いて格納した。結果に対して、読み取り、記録、さらに病理学者による解釈がおこなわれた。
【００５５】
５９種類の正常ヒト組織に対する抗体の結合は、ヒト正常器官組織配列（インジェネックス（Ｉｍｇｅｎｅｘ）、サンディエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）、ＣＡ）を使用しておこなった。表４は、多数の正常ヒト組織の配列を７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６染色した結果の概要を示す。表によれば、組織染色に３つのカテゴリーが存在する。組織の一群が完全に陰性であった。これらの組織として、７ＢＤ−３３−１１Ａに対して正常皮膚、脳（図１９Ａ）、卵巣、胸腺、甲状腺、小腸、食道、心臓（図２０Ａ）、胆嚢、およびリンパ節が挙げられた。１Ａ２４５．６について、完全に陰性の組織は、皮膚、皮下組織脂肪、食道、および脳（図１９Ｂ）から構成された。組織の第２の群は、陽性染色を示した組織から構成された。これらは、７ＢＤ−３３−１１Ａに対して、肝臓および脾臓が含まれた。扁桃腺はこの抗体で最も強く染色された。１Ａ２４５．６に関しては、陽染色性が肝臓、心臓（図２０Ｂ）、精巣、甲状腺、副腎、および子宮筋層で生じた。７ＢＤ−３３−１１Ａと同様に、１Ａ２４５．６は最も強く扁桃腺を染色した。組織の第３の群として、組織切片で染色が陽性であった組織が含まれるが、浸潤マクロファージ、リンパ球、線維芽細胞、または上皮、例えば７ＢＤ−３３−１ｌＡおよび１Ａ２４５．６の両方に対しては胃（それぞれ図２１ＡおよびＢ）に限られていた。いくつかの生体器官（例えば腎臓、心臓（図２０Ａ）、および肺）の細胞に、７ＢＤ−３３−１抗原が存在しないことに留意する必要がある。全体的に、７ＢＤ−３３−１１Ａは、陽性である組織での結合を適度にすることが不得意である１Ａ２４５．６と比較して、正常ヒト組織のより小さなサブセットに結合する。より広範囲であるが、１Ａ２４５．６染色は通常、強度を緩和することが不得意であり、大部分の事例では染色された組織上皮に限られている。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１ｌＡに対する抗原が正常組織上で幅広く発現されないこと、また限られた数のヒト組織に対して上記抗体が特異的に結合することを示唆している。加えて、１Ａ２４５．６のための抗原は、心臓および肝臓に存在している他に、上皮と、浸潤リンパ球、マクロファージ、および線維芽細胞とに限られている。
【００５６】
【表４】
【実施例１０】
【００５７】
ヒト腫瘍組織染色
ＩＨＣ研究を実施して、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗原とヒト乳癌との癌関連性を決定し、いずれの抗体もヒト癌を認識する可能性があるかどうかを決定した。比較は、ビメチン（陽性対照）と、黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコース・オキシダーゼ（哺乳類組織では存在せず、また誘導不可能である酵素）（負の対照）とに対しておこなった。５０人の乳癌患者に由来する乳癌組織配列と乳癌患者の非腫瘍性乳房組織に由来する１０種類の試料とを用いたインジェネックス（Ｉｍｇｅｎｅｘ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＣＡ）。各患者に対して以下の情報が提供される。すなわち、年齢、性別、および診断である。実施例９からのＩＨＣに対する手順は以下の通り。全ての抗体を作用濃度５μｇ／ｍｌで使用した。
表５は、乳房癌組織配列の７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の結合概要を提供する。各々の配列は５０人の固体患者から得た腫瘍試料を含んだ。全体として、１Ａ２４５．６に対しての９８パーセント（図２３Ａ）と比較して、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原については試験した５０人の患者のうち３６パーセントが陽性であった（図２２Ａ）。７ＢＤ−３３−１１Ａについては、乳癌患者から得た１０個の正常乳房組織試料のうち、陽性であったものはゼロであった（図２２Ｂ）．逆に言えば、１０個の正常乳房組織試料のうち９個が１Ａ２４５．６に対して陽性であった。しかし、染色は大部分の実例では浸潤線維芽細胞によるものであった（図２３Ｂ）．エストロゲンとプロゲステロン受容体状態とのあいだの相互関係は、１Ａ２４５．６にとって明白なものではなかった（表６）。エストロゲンおよびプロゲステロン受容体を発現するものでもある陽性の７ＢＤ−３３−１Ａ抗原組織の数がわずかに高かった（表７）。７ＢＤ−３３−１Ａ抗原に対しては、より高い腫瘍病期によりいっそう陽性に発現するようにも見え（表７）、１Ａ２４５．６に関しては組織染色の強度がより高い腫瘍病期に相関しているように見える（表６）。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４２５．６による染色は、癌細胞組織特異性があり、染色は膜上および細胞質内の両方で生じた。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４２５．６の両方に由来する染色パターンは、患者試料内で、該抗体が悪性細胞に対してかなり特異的であり、各々の抗原が細胞膜上に存在することから、それによって魅了的な薬物となりうる標的が作られる。
【００５８】
【表５】
【００５９】
【表６】
【００６０】
【表７】
【００６１】
７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４２５．６抗原のいずれが乳癌に加えて他のヒト癌組織上で発現されるかを判断するために、両方の抗体を多重ヒト腫瘍組織配列（インジェネックス（Ｉｍｇｅｎｅｘ）、サンディエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）、ＣＡ）上で、個々に試験した。以下の情報を個々に患者について得た。すなわち、年齢、性、器官、および診断である。用いた染色の手順は、実施例９に概説したものと同様であった。ビンメチンを陽性対照抗体として使用し、同一の陰性対照抗体をヒト乳房腫瘍組織配列について述べられるように用いた。全ての抗体を５μｇ／ｍｌの作用濃度で用いた。
【００６２】
表８で概説されるように、７ＢＤ−３３−１１Ａは乳房の他に多数の種々のヒト癌を染色した。以下の腫瘍型は、７ＢＤ−３３−１１Ａに対して陽性であった。すなわち、皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、前立腺（１／１）、子宮（４／４）、および腎臓（３／３）（図２４Ａ）。いくつかの他の腫瘍型も、しばしば陽染色性を示した。他の腫瘍組織は、７ＢＤ−３３−１１Ａ発現に対しては陰性であった。すなわち、卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）、およびリンパ節（０／２）。逆に言えば、１Ａ２４５．６は試験されるあらゆる腫瘍組織型を染めた。しかし、最も強い染色のいくつかが、皮膚、肺、肝臓、子宮、腎臓（図２４Ｂ）、胃、および膀胱の悪性細胞上で見られた。乳房癌で見られるように、７ＢＤ−３３−１１ＡとｌＡ２４５．６の染色は、癌細胞の膜上および細胞質内で限局化された。
したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５６抗原が単に乳房癌の膜上で見つかるだけではなく、前立腺を含むかなり多様な腫瘍型の膜上でも見いだされるように見える。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５には乳房および前立腺癌に加えて広範囲の腫瘍型における治療薬としての可能性があることを示している。
【００６３】
【表８】
【実施例１１】
【００６４】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＭＣＦ−７予防的生存腫瘍実験
図７および図８を参照すると、週齢４ないし８週のメスＳＣＩＤマウスに対する５００万個のＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の移植を該ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによっておこなった。マウスを無作為に１１〜１３匹のマウスからなる２つの処置群に分けた。移植後の日に、２０ｍｇ／ｋｇの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２試験抗体またはイソタイプ対照抗体（ＭＣＦ−７またはＯＶＣＡＲ−３細胞に結合しないことが知られている）を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。次に、抗体を週に１回、同じ様式で７週間にわたって投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、最大８週間あるいは動物がカナダ動物飼育評議会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ； ＣＣＡＣ）エンド・ポイントに達するまで、測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、対照群と比較して処置マウスの全身腫瘍組織量を有意に減少させた（図７）。処置後（５１日目）、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、イソタイプ対照抗体で処置されたマウスと比較して８０パーセント（ｐ＝０．００９８）まで腫瘍増殖を抑えた。また、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２投与に関連した後処置生存利点（図８）も存在する。イソタイプ対照抗体処置群は、処置後１９７日目によって致死率１００パーセントに達し、一方１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群の４０％が２３３日目でも生存している。まとめると、ヒト乳癌の十分に確立されたモデルで、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は生存を高め、また全身腫瘍組織量を減少させる（ブラッキー（Ｂｌａｋｅｙ）他。臨床癌研究（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ８：１９７４−１９８３ ２００２；クレメント（Ｋｌｅｍｅｎｔ）他。臨床癌研究（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ８： ２２１−２３２ ２００２；ワウンド（Ｗａｕｄ）他。抗癌性の薬剤開発のための腫瘍モデルの関連（Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、フィービグ（Ｆｉｅｂｉｇ）およびバンガー（Ｂｕｎｇｅｒ）編集、５４：３０５−３１５ １９９９；カーパネン（Ｋａｒｐａｎｅｎ）他。癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ６１： １７９０−２００１））。
【実施例１２】
【００６５】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）予防的腫瘍実験
図９および図１０を参照すると、週齢４ないし８週のメスＳＣＩＤマウスに対する５００万個のＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞の移植を、該ヒト卵巣癌細胞を含む１００マイクロリットル生理食塩液を腹腔内注射することによって、おこなった。マウスを無作為に１０匹のマウスからなる２つの処置群に分けた。移植後の日に、２０ｍｇ／ｋｇの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２試験抗体または緩衝対照抗体を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。次に、抗体を週に１回、同じ様式で９週間にわたって投与した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌異種移植では、体重の増加を疾患進行の代用指標として用いることができる。なぜなら、このことは増加した全身腫瘍組織量から腹水の蓄積を反映をするからである（図９）。移植後８０日目（処置終了後１６日）に、緩衝対照群と比較して、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２投与によって１２．４パーセント（ｐ＝０．０１５）まで体重増加を予防した。マウスを、処置後の生存についてモニターした（図１０）。８７日目までに、緩衝対照群は致死率９０パーセントを達成したが、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群ではその時点で８０パーセントが生存していた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群は、１２５日目まで致死率９０パーセントを達成することができなかった。要約すると、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体処置は、ヒト卵巣癌のよく認識されたモデルで緩衝液対処抗体と比較して、全身腫瘍組織量を減少させ、疾患進行を遅延させ、さらに生存を高めた。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２による処置は、ヒト癌疾患の十分に認識された２つのモデル（乳癌および卵巣癌）で、定着腫瘍の全身腫瘍組織量を有意に減少させたことから、ヒトを含む他の哺乳類での治療に対して、薬理学的および製薬学的利点を有することが示唆される （スミス（Ｓｍｉｔｈ）等、前立腺（Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ） ４８： ４７−５３ ２００１； オルソン（Ｏｌｓｏｎ）等、国際癌雑誌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ） ９８： ９２３−９２９ ２００２； ギルバウンド（Ｇｕｉｌｂａｕｄ）他、臨床癌研究（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ７： ２５７３−２５８０ ２００１； ボン・グルニゲン（Ｖｏｎ Ｇｒｕｅｎｉｇｅｎ）他、国際婦人科癌雑誌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｃａｎｃｅｒ） ９： ３６５−３７２ １９９９； ギチャード（Ｇｕｉｃｈａｒｄ）他、臨床癌研究（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ７： ３２２２−３２２８２００１ ； キシアオ（Ｘｉａｏ）他、タンパク質発現および精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ） １９： １２−２１ ２０００）。
【００６６】
この明細書で言及される全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者のレベルで示される。全ての特許および刊行物が、あたかも個々の刊行物が具体的および個々に参照によって取り込まれることが示されるかのように、同じ範囲への言及によって本明細書の一部を構成するものとして援用される。
【００６７】
本発明の特定の形状が例示される一方で、本明細書に開示および表示される特定の形状または構成要素の配置が限定されるものではないことが、理解される。種々の変化が本発明の範囲から逸脱することなくなされることができることは当業者にとって明らかであり、この明細書に表示および記載されたことに限られて本発明が考えられるものではない。
当業者は、本発明が目的を達成し、本質的に内在されるものと同様に、言及される結果および利点を得ることに十分適していることを、容易に認めるだろう。本明細書中に記載されるいかなるオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順、および技術は、現在のところ好ましい実施形態を代表するものであって、例示することを目的としたものであり、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。本発明の精神の範囲内に含まれ、添付された特許請求の範囲の範囲によって定義される変更および他の用途を、当業者は想到することができるだろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されているが、クレームされた本発明はそのような特定の実施形態によって不必要に制限されるものであってはならない。実際、当業者にとって明らかである本発明を実行する上での記載された態様の種々の修飾は、特許請求の範囲が意図するところの範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】１Ａ２４５．６抗体、両抗体のイソタイプ対照抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体、の典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。
【図２】７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、１Ａ２４５．６のイソタイプ対照抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲのイソタイプ対照抗体の典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。
【図３】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体、両抗体のイソタイプ対照抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体のＦＡＣＳヒストグラムである。
【図４】特定の抗体処置に関する腫瘍容積のグラフ解析である。
【図５】時間経過に伴うＭＢ２３１ヒト乳癌腫瘍容積に対する抗体効果のグラフ解析である。
【図６】抗体療法に関連した時間経過に伴う生存率を定量化するグラフ解析である。
【図７】ＭＣＦ−７乳癌モデルでの腫瘍増殖に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の効果を示す図である。図中、破線は抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは平均値±ＳＥＭを表す。
【図８】予防的ＭＣＦ−７異種移植研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後２３０日を超えた生存についてマウスをモニターした。
【図９】予防的ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌モデルの平均体重に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の効果を示す図である。実勢は、抗体が訪うよされた器官を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
【図１０】予防的ＯＶＣＡＲ−３研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−１またはバッファ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後約６０日間、生存に関してマウスをモニターした。
【図１１】予防的ＭＢ−２４１異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後２００日間、生存に関してマウスをモニターした。
【図１２】予防的ＭＢ−２３１乳癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
【図１３】確立したＭＢ−２３１異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４２５．６、またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後１３０日間にわたってマウスの生存をモニターした。
【図１４】予防的前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
【図１５】予防的ＰＣ−３異種移植研究の継続期間に対する異なる処置を受けた群の平均体重を示すヒストグラムである。データ・ポイントは各時点での各群についての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１６】予防的ＰＣ−３異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４２５．６、イソタイプまたは緩衝対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す。処置後３８日間にわたって、生存についてマウスをモニターした。
【図１７】確立したＰＣ３前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す。破線は抗体が投与される期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
【図１８】確立したＰＣ−３異種移植研究の持続期間にわたる異なる処置群の平均体重を示すヒストグラムである。データは、各時点での各群の平均値±ＳＥＭとして表されている。
【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、正常ヒト脳であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１、Ｂが１Ａ２４５．６、およびＣが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
【図２０】図２０Ａ〜Ｃは、正常ヒト心臓であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｂが１Ａ２４５．６（矢印は陽性染色を示す）、およびＣが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、正常ヒト胃洞であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１Ａ（矢印は胃腺上皮の陽性染色を示す）、Ｂが１Ａ２４５．６（矢印は胃腺上皮の陽性染色を示す）、Ｃが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
【図２２】図２２Ａ〜Ｂは、ヒト乳癌腫瘍（浸潤性導管癌：パネルＡ、黒色矢印：腫瘍細胞シート、黄色矢印：腫瘍間質）およびヒト正常乳房（パネルＢ）に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ結合の典型的な顕微鏡写真を示す。倍率は２００倍である。
【図２３】図２３Ａ〜Ｂは、ヒト乳癌腫瘍（浸潤性導管癌：パネルＡ、黒色矢印：腫瘍細胞シート、黄色矢印：腫瘍間質）およびヒト正常乳房（パネルＢ、黒色矢印：線維芽細胞）に対する１Ａ２４５．６結合の典型的な顕微鏡写真を示す。倍率は２００倍である。
【図２４】図２４Ａ〜Ｃは、腎細胞癌であり、Ａは７ＢＤ−３３−１１Ａ（矢印は腫瘍細胞シートでの陽性染色を示す）、Ｂは１Ａ２４５．６（矢印は腫瘍細胞シードでの陽性染色を示す）、およびＣは陰性イソタイプ対照である。倍率は２００倍である。
【技術分野】
【０００１】
この発明の癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の単離および生産と、該ＣＤＭＡＢを、必要に応じて１種類以上の化学療法薬と組み合わせて、治療および診断プロセスで使用することに関する。本発明は、さらに、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌を呈する各々のヒトは一意的であり、そのヒトのアイデンティティと同様に他の癌とは異なる癌を有する。このことにもかかわらず、現行の治療は癌の種類が同じ全ての患者に対して、同じ段階で同じ方法で処置をおこなう。これらの患者の少なくとも３０％は一次治療に失敗して、その上の段階の治療に至り、治療の失敗、転移、および究極的には死亡する確率が高くなる。処置のための優れたアプローチは、特定のヒトに対応した治療にカスタマイズすることであると考えられる。カスタマイゼーションに向く唯一の現行の治療は、手術である。化学療法および放射線療法は患者に合わせて調整することはできず、手術そのものでは治癒を生ずるには不十分である。
【０００３】
モノクローナル抗体の出現で、各々の抗体が単一のエピトープに向けられていることから、カスタマイズされた治療のための方法を開発する可能性はより現実的になった。さらに、特定のヒトの腫瘍を独自に定義する一連のエピトープを対象とする抗体の組み合わせを生産することが可能である。
悪性変換細胞に特異的である抗原を癌細胞が含むということが癌細胞と正常細胞との著しい違いであると認められたことで、科学界では、これらの抗原に対して特異的に結合することによって悪性変換細胞を特異的に標的とするように、モノクローナル抗体を設計することができると長い間考えられていたことから、モノクローナル抗体が癌細胞を除去するための「魔法の弾丸」として働き得るという考えが生じた。
すぐに開示された発明の技術に基づいて単離されたモノクローナル抗体は、患者にとって有益であるかたちで、例えば全身腫瘍組織量を減少させることで、癌疾患を修飾することが示され、本明細書では癌疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）または「抗癌」抗体として様々に称されている。
【０００４】
現時点では、癌患者は一般に処置の選択肢がほとんどない。癌治療に対する規格化されたアプローチは、全体的な生存率および罹患率の改善をもたらした。しかし、特定の人に対して、これらの改善された統計値は、個人の状況における改善と必ずしも相関しているわけではない。
このように、開業医が同じコホートで他の患者とは独立して各々の腫瘍を処置することを可能とする方法論が出される場合、このことはちょうどその一人に合うように治療を調整する独特なアプローチを可能とするだろう。治療のそのようなコースは、理想的には、硬化速度を増加させ、より良好な結果を生み出し、それによって長く切実な必要性を満たす。
【０００５】
歴史的に、ポリクローナル抗体の使用が、ヒト癌の処置における限られた成功を収めながら使われた。リンパ腫および白血病に対しては、ヒト血漿による処置が施されていたが、長期寛解または反応がほとんどなかった。さらにまた、再現性が乏しく、化学療法と比較して付加的な利点はなかった。乳癌、黒色腫、および腎細胞癌等の固形腫瘍もまた、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿、およびウマ血清による処置を施した。
固形腫瘍に対するモノクローナル抗体の臨床試験が数多くあった。１９８０年代では、少なくとも４種類のヒト乳癌臨床試験があったが、特定の抗原に対する抗体または組織選択性に基づく抗体を用いて、少なくとも４７人の患者からたった一人の応答者が得られたのみである。シスプラチンと組み合わせたヒト化抗ｈｅｒ２抗体による臨床試験の成功は、１９９８年までなかった。本研究では、約４分の１が部分的な緩解率を持ち、もう半分が軽度または安定した疾患の進行を呈した反応について、３７人の患者を利用した。
【０００６】
結直腸癌を調べる臨床試験は、糖タンパク質および糖脂質の両方を標的とする抗体を必要とする。腺癌に対してある程度特異性がある１７−１Ａ等の抗体は、患者一人だけが部分寛解を呈する６０人以上の患者での第２相試験を受けた。他の治験では、１７−１Ａを用いた場合、シクロホスファミドをさらに用いるプロトコルで５２人の患者のうち、完全寛解が１人、軽度の寛解が２人だけであった。類似の結果が１７Ａ−１Ａが関与する他の治験で得られた。最初にイメージングが認められるヒト化マウス・モノクローナル抗体の使用もまた、腫瘍退縮を生じなかった。現在まで、結腸直腸癌に有効である抗体はなかった。同様に、肺癌、脳癌、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、および胃癌に対しても一様に好ましくない結果であった。黒色腫に対する抗ＧＤ３モノクローナル抗体の使用では、ある程度の成功が得られた。このように、ヒト臨床試験の必要条件である小動物研究での成功にもかからず、試験された抗体のほとんどで効果が得られなかったことが分かる。
【０００７】
（先行特許）
米国特許第５，７５０，１０２号（特許文献１）は、患者の腫瘍から得た細胞が該患者から得た細胞または組織からクローニングされたＭＨＣ遺伝子によってトランスフェクトされるプロセスを開示している。その後、これらのトランスフェクション細胞は、患者への予防接種に用いられる。
米国特許第４，８１６，５８１号（特許文献２）は、哺乳類の腫瘍細胞および正常細胞の細胞内構成要素（細胞外構成要素ではない）に対して特異的であるモノクローナル抗体を得るステップと、そのモノクローナル抗体を標識するステップと、標識抗体と腫瘍細胞を殺す治療を受けた哺乳類の組織とを接触させるステップと、変質している腫瘍細胞の細胞内構成要素に対する上記標識抗体の結合を測定することで治療の効果を決定するステップとを有するプロセスを開示している。ヒト細胞内抗原に対する抗体の調製で、特許権者は悪性細胞がそのような抗原の好都合な供給源であることを認識している。
米国特許第５，１７１，６６５号（特許文献３）は、新規抗体とその生産方法とを提供する。具体的には、その特許はヒト腫瘍（例えば、大腸および肺の腫瘍）に結合したタンパク質抗原に対して強く結合し、その一方で正常細胞に対してはかなり少ない程度に結合する特性を持つモノクローナル抗体の形成を教示している。
米国特許第５，４８４，５９６号（特許文献４）は、外科的にヒト癌患者から腫瘍組織を除くステップと、腫瘍細胞を得るために腫瘍組織を処置するステップと、腫瘍細胞に放射線を照射し、生存可能ではあるが非腫瘍形成性にするステップと、該細胞を用いて、原発腫瘍の再発を抑制することが可能であり、その一方で同時に転移を阻害するワクチンを調製するステップとを有する癌治療方法を提供する。この特許は、腫瘍細胞の表面抗原と反応するモノクローナル抗体の開発を教示する。以下参照する４段目４５行に記載されているように、特許権者はヒト新形成で活発な特異的免疫療法を発現しているモノクローナル抗体の発現で、自所性腫瘍細胞を利用する。
米国特許第５，６９３，７６３号（特許文献５）は、ヒト癌腫に特有であり、起源の上皮組織に依存していない糖タンパク質抗原を教示している。
【０００８】
米国特許第５，７８３，１８６号（特許文献６）は、Ｈｅｒ２発現細胞でアポトーシスを誘発する抗Ｈｅｒ２抗体と、該抗体を産生するハイブリドーマ細胞系と、そのような抗体を用いた癌の処置方法と、そのような抗体を含む医薬組成物とを開示している。
米国特許第５，８４９，８７６号（特許文献７）は、腫瘍および非腫瘍組織供給源から精製されたムチン抗原に対するモノクローナル抗体産生のための新規ハイブリドーマ細胞系を記載している。
米国特許第５，８６９，２６８号（特許文献８）は、所望の抗原に対して特異的な抗体を産生するヒト・リンパ球を生成するための方法と、モノクローナル抗体を産生するための方法と、同様に該方法によって産生されたモノクローナル抗体とを開示している。この特許は、特に癌の診断および治療に有用な抗ＨＤヒト・モノクローナル抗体の産生に関する。
米国特許第５，８６９，０４５号（特許文献９）は、ヒト・抗体、抗体フラグメント、抗体複合体、および単鎖免疫毒素に関する。これらの抗体機能が２倍となるメカニズムは、分子がヒト・カルシノーマの表面に上に存在する細胞膜抗原に対して反応する点で、さらに、上記抗体がカルシノーマ細胞内に内在化する能力を有し、結合後、特に抗体−薬物結合体および抗体−毒素結合体に対して特に有用であるという点である。それらの修飾形態では、上記抗体は特定の濃度で細胞障害性を表す。
米国特許第５，７８０，０３３号（特許文献１０）は、腫瘍の治療および予防のための自己抗体の使用を開示する。しかし、この抗体は、老いた哺乳類に由来する抗核自己抗体である。この場合、自己抗体は免疫系で見つかる、ある種の自然抗体であると言われる。自己抗体が「老いた哺乳類」に由来することから、処置されている患者から実際に由来する自己抗体であることを必要としない。また、この特許は老いた哺乳類から天然およびモノクローナル抗核自己抗体と、モノクローナル抗核自己抗体を産生するハイブリドーマ細胞系とを開示する。
【特許文献１】米国特許第５，７５０，１０２号公報
【特許文献２】米国特許第４，８１６，５８１号公報
【特許文献３】米国特許第５，１７１，６６５号公報
【特許文献４】米国特許第５，４８４，５９６号公報
【特許文献５】米国特許第５，６９３，７６３号公報
【特許文献６】米国特許第５，７８３，１８６号公報
【特許文献７】米国特許第５，８４９，８７６号公報
【特許文献８】米国特許第５，８６９，２６８号公報
【特許文献９】米国特許第５，８６９，０４５号公報
【特許文献１０】米国特許第５，７８０，０３３号公報
【発明の開示】
【０００９】
本発明者らは、以前に「個々の患者に対して特異的な抗癌抗体」と題された米国特許６，１８０，３５７号の付与を受けており、この特許は癌疾患の処置に有用である個々にカスタマイズされた抗癌抗体を選択するためのプロセスに関する。本明細書の目的にとって、「抗体」および「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は同義的に用いられ、ハイブリドーマ（例えば、マウスまたはヒト）、免疫複合体、ならびに必要に応じて免疫グロブリン・フラグメント、および免疫グロブリン由来の組み換えタンパク質（例えば、キメラおよびヒト化免疫グロブリンＦ（ａｂ’）およびＦ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、組み換え免疫グロブリン可変部領域（Ｆｖ）、ならびに融合タンパク質）によって産生されるインタクトな免疫グロブリンに関する。タンパク質の構造または機能に著しい作用を生ずることなくいくつかのアミン酸配列が変化し得ることは、当該技術分野で十分に認識されている。抗体の分子内転位では、主領域の核酸配列またはアミノ酸配列における修飾が一般に許容することができる。これらは、限定されるものではないが、置換（好ましくは保守的置換）、欠失、または付加を含む。さらに、本発明の範囲内である。標準的な化学療法薬様式（例えば、放射性核種）を本発明のＣＤＭＡＢと接合させることで、上記化学療法の使用に焦点が合わせられる。ＣＤＭＡＢは、毒素、細胞障害性部分、または酵素（例えば、ビオチン複合酵素または血液原細胞）に結合させることもできる。
この出願は、癌疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞系を単離するための‘３５７特許に教示されたように患者特異的抗癌抗体を産生するための方法を利用する。これらの抗体を、一つの腫瘍に対して特異的に作ることができるので、癌治療をカスタマイズすることが可能となる。
【００１０】
個別的抗癌性の処置の期待は、患者が管理される方法の変化をもたらす。可能性がある臨床シナリオは、腫瘍試料が提示時に得られて、積み上がっているということである。この試料から、腫瘍の類型が既存の癌疾患修飾抗体のパネルから調べられる。患者は従来通りに病期分類されるが、利用できる抗体はさらに患者を病期分類する際に有用である。患者は既存の抗体を用いて即時治療を受けることができ、腫瘍に特有の抗体のパネルを、本明細書中に概説される方法を用いて、または本明細書中に開示されるスクリーニング法と併用してファージディスプレイ・ライブラリを用いることにより、作ることができる。、他の腫瘍が処置されているものと同じエピトープの一部を有することができる可能性があることから、発生する全ての抗体は抗癌性の抗体のライブラリーに加えられる。この方法によって産生される抗体は、これらの抗体と結合する癌がある数多くの患者において、癌疾患の処置に有用である。
【００１１】
実質的に米国特許第６，１８０，３５７号のプロセスを使用することで、マウス・モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、および１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、患者の乳房腫瘍生検で得た細胞でマウスを免疫化した後に得られた。この出願の背景の範囲内で、細胞殺害（細胞障害性）特性または細胞増殖阻害（細胞分裂停止）特性のいずれかを持つ抗癌抗体を以下、細胞障害性と呼ぶ。これらの抗体を、癌の病期分類および診断の補助に使用することができ、また腫瘍転位の処置に用いることができる。７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、および１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗原は、異なる組織起源の幅広い範囲のヒト細胞系の細胞表面上で発現された。試験した細胞系のうち、７Ｂ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６のいずれかの細胞障害性に感受性があったのは、乳癌細胞系ＭＣＦ−７および前立腺癌細胞系ＰＣ−３の二系統のみであった。試験した細胞系のうち、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の細胞障害性効果に対して感受性があったのは、乳癌細胞系ＭＣＦ−７および卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３の二系統のみであった。
抗癌抗体に加えて、患者は、多様な処置療法の一部として現在推奨された治療を受けることを選択することができる。本方法論を介して単離された抗体が相対的に非癌細胞に対して非毒性であるという事実から、高濃度で抗体の組み合わせを、単独または従来の治療と併用して用いることが可能である。高い治療指数は、処置耐性菌の出現の可能性を減少させなければならない短い時間的尺度上で、再治療もできるようにする。
【００１２】
乳癌細胞および卵巣癌細胞に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）効果は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での抗腫瘍活性を確立することによって拡張された。ヒト癌の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルは、ＭＣＦ−７乳癌細胞またはＯＶＣＡＲ−３卵巣の癌細胞を重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植することによって確立された。なぜなら、ＳＣＩＤマウスは特定の免疫細胞が欠如しているのでヒト腫瘍細胞を拒絶することができないからである。これらの種類の症状発現前異種移植腫瘍モデルで試験される薬物の作用は、治療効力を予測する上で妥当なものであると考えられる。マウスの癌異種移植片は、自然に起こる癌と同様の方法で、実質壊死、間質壊死、中心壊死、および血管新生を発現する固形腫瘍として成長する。乳癌細胞系ＭＣＦ−７および卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３の評価は、ＳＣＩＤマウスでおこなった。ＭＣＦ−７およびＯＶＣＡＲ−３腫瘍の移植の成功ならびに標準的な化学療法薬に対する腫瘍の感度から、それらの腫瘍を薬物試験のための適当な癌モデルとして特徴づけた。ＭＣＦ−７親細胞系およびその変異体とＯＶＣＡＲ−３細胞系とを、臨床化学療法剤として使用された広範な治療薬を評価するために異種移植腫瘍モデルとして使用することが成功した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、ヒト乳癌のヒト乳癌の予防的生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルで、腫瘍増殖および減少した全身腫瘍組織量を予防した。モニタリングは、過去２８０日後処理を続けた。４０パーセントの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２投与群は、移植後７．５ヵ月を超えて生存していた。逆に言えば、イソタイプ対照群は、６．５ヵ月後処理の後で１００パーセントの死亡率であった。５１日目（最後の処置の直後）において，１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群の腫瘍容積はイソタイプ対照群（ｐ＝０．００９８）の２０％であった。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、生存率を高め、ヒト乳癌の安定したモデルで、対照治療群と比較して全身腫瘍組織量を減少させた。
【００１３】
ヒト乳癌モデルでの有益な効果に加えて、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置もまた、卵巣癌モデルでＯＶＣＡＲ−３細胞に対して抗腫瘍活性を有した。このモデルでの腫瘍発達の代用基準として体重を用いた。移植後８０日目（処置終了後１６日）、処置群のマウスは対照群の平均体重の８７．６パーセントであった（ｐ＝０．０１５）。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置は、いくつかの異なる癌モデルで、魅力的な抗癌性の治療薬とする。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置は、緩衝液で処置した対照群と比較してヒト卵巣癌の十分に確立されたモデルで腫瘍発達を遅延させたことから、有効であった。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の抗腫瘍活性は、いくつかの異なる癌モデルで、それを魅力的な抗癌性の治療薬とする。
この発明は、治療薬の標的としての１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の使用を教示するもので、投与された場倍、哺乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減らすことができ、治療をうけている哺乳類の生存を延長させることもできる。この発明はまた、ＣＤＭＡＢ（１１ＢＤ−２Ｅ１１−２）およびその誘導体の使用も教示しており、その抗原を標的にすることで、哺乳類で抗原を発現している癌の全身腫瘍組織量を減らし、またこの抗原を発現している腫瘍を持つ哺乳類の生存を延ばす。
【００１４】
培養液中での乳癌細胞および前立腺癌細胞に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６細胞障害性の結果は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）での抗腫瘍活性を確立することで、さらに引き延ばされた。ヒト癌の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルでは、ＭＢ−２３１乳癌細胞またはＰＣ−３前立腺細胞を重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの首筋の皮下に移植した。なぜなら特定の免疫細胞が欠如しているため、ヒト腫瘍細胞を拒絶することができないからである。症状発現前異種移植腫瘍モデルは、治療効力を予測する有効な手段と考えられる。マウスの異種移植片は、自然発生的な癌と同様に間質壊死、中心壊死、および血管新生を発病している固形腫瘍として成長する。乳癌細胞株ＭＢ−２３１および前立腺腫瘍株ＰＣ−３を、免疫不全のマウスでの生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）異種移植モデルとして評価した。ＭＢ−２３１およびＰＣ−３腫瘍の成功した移植または「取り込み率（ｔａｋｅ−ｒａｔｅ）」と標準的な化学療法薬に対する腫瘍の感度によって、それらが適当なモデルであることを特徴づけた。ＭＢ−２３１親細胞系および該細胞系の変異体とＰＣ−３アンドロゲン非依存型細胞系とが、臨床化学療法薬として使用された広範囲にわたる治療薬を評価するために、異種移植腫瘍モデルとして成功裏に用いられた。
また、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６は、ヒト乳癌予防生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルでの腫瘍増殖を抑制し、全身腫瘍組織量を減少させた。モニタリングは処置後１５０日以上続いた。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腫瘍を決して生ずることなく、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の８７．５パーセントが移植後６ヶ月を過ぎても生存していた。
また、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６は、ヒト乳癌予防生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）モデルでの腫瘍増殖を抑制し、全身腫瘍組織量を減少させた。モニタリングは処置後１５０日以上続いた。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腫瘍を決して生ずることなく、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の８７．５パーセントが移植後６ヶ月を過ぎても生存していた。逆に言えば、イソタイプ対照群は、７２日目（処理後２３日）までに致死率１００％を達成した。１Ａ２４５．６処置マウスは処置後１５１日までに致死率１００％を達成し、このことはイソタイプ対照処置群よりも６倍長い。したがって、１Ａ２４５．６、さらにたいていの場合７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌細胞モデルでの生存を高め、全身腫瘍組織量を減少させた。
その上、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６によって、確立された生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ヒト乳癌モデルで、腫瘍増殖の抑制および全身腫瘍組織量の減少が有意に達成された。８０日目（後処理２３日）までに、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置マウスではイソタイプ対照群と比較して８２％低い平均腫瘍容積であった（ｐ＝０．００１）。１Ａ２４５．６処理もまた、この日により低い平均腫瘍容積、３５パーセント（ｐ＝０．１３５）を達成した。生存を抗体有効性の基準として用いることで、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群での致死のリスクは、処置後約６０日目でイソタイプ対照群の約１６パーセント（ｐ＝０．０００６）であった。処置後５０日までに１００％のイソタイプ対照群が致死した。相対的に、１Ａ２４５．６処置マウスは処置後１００日まで生存し、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の６０％が処置後１３０日目であっても生存していた。このデータは、対照処置群と比較した場合に、１Ａ２４５．６および７ＢＤ−３３−１Ａ処置によって生存および減少全身腫瘍組織量という利点が与えられたことを示している。体重減少および臨床苦痛等、いかなる毒性の兆候も誘導しなかったことから、７Ｂ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置が安全であることが明らかであった。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置は、なぜならヒト乳癌の十分に確立されたモデルで、対照処置群と比較して、腫瘍増殖を遅らせ、生存を高めたことから、効果的であった。
【００１５】
確立された乳癌の生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍モデルに加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置もまた、予防生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）前立腺癌モデルでＰＣ−３細胞に対する抗腫瘍活性を有した。この前立腺異種移植モデルでは、腫瘍細胞の移植１日前に７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＡ２４５を別々にマウスに投与、その後７週間にわたって毎週注射した。７ＢＤ−３３−１Ａおよび１Ａ２４５．６処置は、イソタイプ対照抗体よりも処置期間直後に腫瘍増殖を抑制する点で、有意に（それぞれｐ＝０．００１および０．０１７）、より効果的であった。処置相終了時、７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６を与えられたマウスは、それぞれイソタイプ対照群のたったの３１および５０パーセントまでしか増殖しない腫瘍を有した。
【００１６】
ＰＣ−３ＳＣＩＤ異種移植モデルに対して、疾患進行の代用指標として体重を用いることができる。５２日目では、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置は、イソタイプ対照群と比較して、それぞれ５４および２５パーセントまで体重の減少を有意に（それぞれｐ＝０．００２および０．００４）抑えた。処理後の生存についてマウスをモニターした。処置後１１日目で、イソタイプおよび緩衝対照マウスは致死率が１００パーセントに達した。逆に言えば、処置後３８日目で７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６が致死率１００パーセントに達し、対照群よりも３倍長かった。このように７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置は、十分に確立されたヒト前立腺癌でのイソタイプ対照処置群と比べて、両方とも腫瘍増殖を遅らせ、体重の減少を抑え、さらに生存を延ばすことから、有効であった。
【００１７】
前立腺癌の予防生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍モデルに加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａは確立された生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）腫瘍モデルでＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を示した。この異種移植モデルでは、抗体処置前に腫瘍が一定の大きさに達するように、ＰＣ−３前立腺癌細胞がＳＣＩＤマウスに対して皮下移植された。７ＢＤ−３３−１１Ａによる処置を再びイソタイプ対照群と比較した。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群では、処置直後にイソタイプ対照群と比較して、平均腫瘍容積が有意に（ｐ＜０．０２４）に小さいことが示された。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、イソタイプ対照群と比較して、３６パーセントまでの腫瘍抑制を媒介した。いくつかの異なる癌モデルでは、７ＢＤ−３３−１１Ａの抗腫瘍活性によって、該モデルが魅力的な抗癌治療薬となった。
【００１８】
正常組織に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の結合を測定した。ＩＨＣ染色によって、腎臓、心臓、および肺等の生体器官を含む大部分の組織は７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現に失敗した。７ＢＤ−３３−１１Ａは、唾液腺、肝臓、脾臓、胃、前立腺、および十二指腸を染色し、さらに扁桃腺を強く染色した。組織染色から得られた結果によれば、７ＢＤ−３３−１１Ａは、種々の細胞型に対する結合が制限される一方で、浸潤マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞に対して結合することが示された。１Ａ２４５．６については、より広範な組織が陽染性であった。大部分のケースでは、染色は上皮または浸潤マクロファージ、リンパ球、および線維芽細胞に制限された。しかし、心筋および肝細胞の両方で陽染性がみられた。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６は、膜染色パターンおよび細胞質染色パターンを示した。
【００１９】
７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗原の限局化ならびに乳がん患者でのその有病率は、免疫療法の有益性を評価する際に重要である。癌患者の乳房腫瘍における抗原発現に対処するために、５０人の乳がん患者から得た腫瘍組織試料を、７ＢＤ−３３−１１ Ａまたは１Ａ２４５．６抗原のいずれかの発現についてスクリーニングした。本研究の結果は、組織試料の３６パーセントが７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原に対して陽染色性であった。染色が悪性細胞に限定されたことから、患者試料内での７ＢＤ−３３−１１Ａの発現が、癌細胞に対して特異的であるように見えた。また、７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌患者から得た正常組織の１０試料中、染色したものはゼロであった。一方、１Ａ２４５．６は、乳癌組織試料の９８パーセントを染色した。１Ａ２４５．６はまた、乳癌患者から得た正常組織の１０試料中、８試料を染色した。しかし、一般に、この染色は乳癌組織試料で観察されたものよりもかなり弱く、また一般に浸潤線維芽細胞に限定された。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６発現を、さらに、乳房腫瘍の発達、処置、および予後において重要な役割を演じるホルモン（エストロゲンおよびプロゲステロン）に対する受容体の乳房腫瘍にもとづいて評価した。ＩＡ２４５．６抗原の発現とエストロゲンもしくはプロゲステロンのいずれかに対する受容体の発現との間に、明瞭な相互関係はなかった。エストロゲンまたはプロゲステロン受容体発現と７ＢＤ−３３−１１Ａの発現との間にわずかな相互関係があった。すなわち、受容体発現を有する組織は、わずかに高い７ＢＤ−３３−１１Ａ発現を呈した。腫瘍を該腫瘍の病期分類または癌の進行の度合いにもとづいて分析した場合、結果は７Ｂ−Ｄ−３３−１１Ａに対してより高い腫瘍病期によってよりいっそう陽性発現し、１Ａ２４５．６に対してより高い腫瘍病期によってより高強度に染色される傾向を示唆した。しかし、結果は試料の大きさが小さいことによる制限を受けた。
【００２０】
さらに７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の潜在的な治療上の利益をさらに拡げるために、種々のヒト癌組織内での抗原の頻度および限局化を決定した。いくつかの癌種は、乳癌に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を発現した。陽性のヒト癌種として、皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、前立腺（１／１）、子宮（４／４）、および腎臓（３／３）が含まれた。いくつかの癌は抗原を発現しなかった。すなわち、それらは、卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）、およびリンパ節（０／２）を含んだ。１Ａ２４５．６については、正常ヒト組織アレイと同様に、種々のヒト組織種から得た多数の癌が陽染色性であった。より強い染色は、皮膚、肺、肝臓、子宮、腎臓、胃、および膀胱の悪性細胞上で見られた。ヒト乳がん組織と同様に、７ＢＤ−３３−１ｌＡおよび１Ａ２４５．６の限局化は、これらの腫瘍細胞の膜上または細胞質内で生じた。生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で癌細胞系に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗体結合に加えて、抗原がヒトで発現され、多数の種類の癌で発現される証拠がある。
【００２１】
全体として、このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗原が癌関連抗原であって、ヒトで発現され、さらに病理学的に関連した癌標的であることを示している。さらに、このデータもまた、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗原がヒト癌組織に結合することを示しており、また診断、治療の予測、または予後診断となり得るアッセイのために、適切に使われる。加えて、上記抗原の細胞膜限局化によって、診断、治療の予測、または予後診断となり得るアッセイで使用される該抗原、その遺伝子もしくは誘導体、そのタンパク質もしくはその変異体の使用が可能となる。
全体で、この発明は治療薬の標的として７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６抗原の使用を教示するもので、それが投与された場合に、哺乳類でその抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減らすことができ、また治療を受けている哺乳類の生存延長をもたらすことができる。この発明はまた、ＣＤＭＡＢ（７ＢＤ−３３−１１Ａ／１Ａ２４５．６）およびその誘導体を用いて、哺乳類で抗原を発現する癌の全身腫瘍組織量を減らし、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の生存を延ばすために、その抗原を標的化することも、教示する。さらに、この発明は癌細胞における７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６抗原の検出を用いることも教示するもので、その抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳類の診断、治療の予測、および予後診断に有用である。
【００２２】
もし患者が治療の初期経過に対して不応性であったり、転移が生じた場合、腫 瘍に対する特異的抗体を生ずるプロセスを、再処置のために繰り返すことができる。さらにまた、抗癌抗体をその患者から得た赤血球に結合させて転移の処置のために再注入することができる。転移癌に対する効果的処置はほとんどなく、転移は一般に死に至る転帰不良の前兆となる。しかし、転移癌は通常、十分に血管化しており、赤血球による抗癌抗体の送達によって、腫瘍部位に抗体を集中させる効果が得られる。転移に先立っても、ほとんどの癌細胞はそれらの生存のために宿主の血液供給に依存しており、また赤血球に結合した抗癌抗体は同様に原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）腫瘍でありえる。あるいは、抗体は、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞等の他の血液原細胞に結合することも可能である。
抗体には５つの種類があり、各々がその重鎖によって与えられる機能と関連している。裸の抗体によって癌細胞を殺すことは、抗体依存型細胞障害性または補体依存型細胞障害性のいずれかを通して媒介となると、一般に思われている。例えば、マウスＩｇＭおよびＩｇＧ２ａ抗体は補体系のＣ−１成分が結合することでヒト補体型を活性化させることができ、それによって腫瘍細胞溶解を導くことができる補体活性化の古典経路が活性化される。ヒト抗体のために、最も効果的に補体活性化させている抗体は、一般にＩｇＭおよびＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ３イソタイプのマウス抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球、および特定のリンパ球によって細胞殺害に導くＦｃレセプターを持つ細胞傷害性細胞を補充することで効果的である。ＩｇＧ１およびＩｇＧ３イソタイプのヒト抗体は、ＡＤＣＣの媒介となる。
体媒介癌殺害のもう一つの可能な機構が、細胞膜およびその関連糖タンパク質もしくは糖脂質での種々の化学結合の加水分解を触媒するために働く抗体（いわゆる触媒抗体）の使用を介するものであってもよい。
抗体媒介癌細胞殺害により広く認められる２つの機構がさらに存在する。第１は、腫瘍細胞にある推定上の癌抗原に対して免疫反応を産生させるために身体を誘導するワクチンとしての抗体の使用である。第２は、抗体の使用であり、増殖受容体を標的として機能に干渉するめ、あるいは効果的に機能が失われるようにその受容体を下流制御する。
【００２３】
制癌剤の臨床有用性は、患者に対する許容リスク・プロフィールのもとでの薬物の利点に基づく。癌治療において、生存は通常、利点の次に最も求められている。しかし、延命に加えて多数の他のよく認識された利点がある。処置が生存に対して悪影響を及ぼさないこれらの他の利点として、症状寛解、有害事象に対する防御、再発または疾患のない生存の時間延長および進行の時間延長を含む。これらの判定基準は一般に認められており、米国食品医薬品局（Ｆ．Ｄ．Ａ）等の規制団体が、それらの利点を生む薬物を承認する（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎＯｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ ４２： １３７−１４３ ２００２）。これらの基準に加えて、これらの種類の利点を予測することが可能な他のエンドポイントがあることが十分認識される。一つには、米国Ｆ．Ｄ．Ａ．によって与えられた促進的承認プロセスは、患者の利点を予測する代用物があることを認める。年末（２００３）より、このプロセス中で承認される薬剤が１６種類あり、これらのうちの４種類が完全に承認に移った。すなわち、追跡調査は、代わりの終末点によって予測されたとして直接の患者の利点を示した。固形腫瘍で薬物効果を決定するための１つの重要な終末点は、処置に対する反応の測定による全身腫瘍組織量の評価である（セラッセ（Ｔｈｅｒａｓｓｅ）他。米国国立癌研究所雑誌（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ） ９２ （３）： ２０５−２１６ ２０００）。そのような評価のための臨床判定基準（ＲＥＣＩＳＴ判定基準）は、固体腫瘍研究グループ（Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）（癌では国際的な一群の専門家）で、反応評価基準によって広められた。全身腫瘍組織量に対する示された効果を持つ薬物は、ＲＥＣＩＳＴ判定基準に従う客観的な反応で示すように、最終的に、適当な対照群と比較して、直接的な患者の利点を産生する傾向にある。前臨床設定では、全身腫瘍組織量は一般に、より直接的に評価および記録される。前臨床試験が上記臨床設定に解釈し得るという点で、前臨床モデルで生存を延ばす薬物は最も予想された臨床的有用性を持つ。臨床処置に対して肯定応答を生ずることに類似して、前臨床設定で全身腫瘍組織量を減少させる薬物もまた疾患に対して有意に直接的な影響を及ぼすことも可能である。生存の延長が制癌剤処置による臨床転帰後に最も求められるものではあるが、臨床有用性を持つ他の利点があり、全身腫瘍組織量もまた、直接的な利点に至ることもでき、また臨床的影響もあることは明らかである （エクハルド（Ｅｃｋｈａｒｄｔ）他。 ｅｔ ａｌ． 発達療法：標的化合物の臨床試験設計の成功および失敗： ＡＳＣＯ啓発本（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ； ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ）、２００３年第３９回年会、２００３、２０９−２１９頁）。
【００２４】
したがって、本発明の目的は、ハイブリドーマ細胞系と、該ハイブリドーマ細胞系がコードされた対応する単離モノクローナル抗体およびその抗原結合フラグメントとを単離するために、癌細胞に関して細胞障害性であり、同時に非癌細胞に対しては相対的に非毒性である特定の個人に由来する細胞から癌疾患修飾抗体を産生する方法を利用することである。
本発明の別の目的は、癌疾患修飾抗体とその抗原結合フラグメントとを教示することである。
本発明のさらなる目的は、細胞障害性が抗体依存型細胞障害性を通して媒介される癌疾患修飾抗体を産生することである。
本発明のさらに別の目的は、細胞障害性が補体依存型細胞障害性を通して媒介される癌疾患修飾抗体を産生することである。
本発明のさらなる目的は、細胞障害性が細胞化学結合の加水分解を触媒する能力の関数である癌疾患修飾抗体を産生することである。
本発明のさらなる目的は、癌の診断、予後、およびモニタリングのための結合アッセイに有用である癌疾患修飾抗体を産生することである。
この明細書の他の目的および利点は、以下の詳細な説明から明らかになる。ここで、例証および例示を目的として、本発明のいくつかの実施形態を説明する。
【００２５】
（図面の簡単な説明）
この特許または出願では、彩色仕上げされた少なくとも１つの図面が含まれる。カラー図面を有するこの特許または特許出願公開の写しは、申請および必要な料金の支払いに応じて、特許庁から得られる。
図１は、１Ａ２４５．６抗体、両抗体のイソタイプ対照抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体、の典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図２は、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、１Ａ２４５．６のイソタイプ対照抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲのイソタイプ対照抗体の典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図３は、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体、両抗体のイソタイプ対照抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体のＦＡＣＳヒストグラムである。
図４は、特定の抗体処置に関する腫瘍容積のグラフ解析である。
図５は、時間経過に伴うＭＢ２３１ヒト乳癌腫瘍容積に対する抗体効果のグラフ解析である。
図６は、 抗体療法に関連した時間経過に伴う生存率を定量化するグラフ解析である。
図７は、 ＭＣＦ−７乳癌モデルでの腫瘍増殖に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の効果を示す図である。図中、破線は抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは平均値±ＳＥＭを表す。
図８は、予防的ＭＣＦ−７異種移植研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後２３０日を超えた生存についてマウスをモニターした。
図９は、予防的ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌モデルの平均体重に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の効果を示す図である。実勢は、抗体が訪うよされた器官を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
図１０は、予防的ＯＶＣＡＲ−３研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−１またはバッファ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後約６０日間、生存に関してマウスをモニターした。
図１１は、予防的ＭＢ−２４１異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後２００日間、生存に関してマウスをモニターした。
図１２は、予防的ＭＢ−２３１乳癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
図１３は、確立したＭＢ−２３１異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４２５．６、またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後１３０日間にわたってマウスの生存をモニターした。
図１４は、予防的前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
図１５は、予防的ＰＣ−３異種移植研究の継続期間に対する異なる処置を受けた群の平均体重を示すヒストグラムである。データ・ポイントは各時点での各群についての平均値±ＳＥＭを表す。
図１６は、予防的ＰＣ−３異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４２５．６、イソタイプまたは緩衝対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す。処置後３８日間にわたって、生存についてマウスをモニターした。
図１７は、確立したＰＣ３前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す。破線は抗体が投与される期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
図１８は、確立したＰＣ−３異種移植研究の持続期間にわたる異なる処置群の平均体重を示すヒストグラムである。データは、各時点での各群の平均値±ＳＥＭとして表されている。
図１９Ａ〜Ｃは、正常ヒト脳であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１、Ｂが１Ａ２４５．６、およびＣが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
図２０Ａ〜Ｃは、正常ヒト心臓であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｂが１Ａ２４５．６（矢印は陽性染色を示す）、およびＣが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
図２１Ａ〜Ｃは、正常ヒト胃洞であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１Ａ（矢印は胃腺上皮の陽性染色を示す）、Ｂが１Ａ２４５．６（矢印は胃腺上皮の陽性染色を示す）、Ｃが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
図２２Ａ〜Ｂは、ヒト乳癌腫瘍（浸潤性導管癌：パネルＡ、黒色矢印：腫瘍細胞シート、黄色矢印：腫瘍間質）およびヒト正常乳房（パネルＢ）に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ結合の典型的な顕微鏡写真を示す。倍率は２００倍である。
図２３Ａ〜Ｂは、ヒト乳癌腫瘍（浸潤性導管癌：パネルＡ、黒色矢印：腫瘍細胞シート、黄色矢印：腫瘍間質）およびヒト正常乳房（パネルＢ、黒色矢印：線維芽細胞）に対する１Ａ２４５．６結合の典型的な顕微鏡写真を示す。倍率は２００倍である。
図２４Ａ〜Ｃは、腎細胞癌であり、Ａは７ＢＤ−３３−１１Ａ（矢印は腫瘍細胞シートでの陽性染色を示す）、Ｂは１Ａ２４５．６（矢印は腫瘍細胞シードでの陽性染色を示す）、およびＣは陰性イソタイプ対照である。倍率は２００倍である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
【実施例１】
【００２７】
ハイブリドーマ生産−ハイブリドーマ細胞系７ＢＤ−３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、および１１ＢＦ−２Ｅ１１−２ハイブリドーマ：
ハイブリドーマ細胞系統７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６を、ブタベスト条約に従って、それぞれ受託番号ＰＴＡ−４８９０およびＰＴＡ−４８８９として２００３年１月８日、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）（米国２０１１０−２２０９バージニア州マナッサス大学通り１０８０１）に寄託した。３７ＣＦＲ１．８０８にもとづいて、寄託者は、寄託材料の公開に対する有効性にかかるすべての制限が特許の付与によって即座に取り除かれることを確信する。
【００２８】
ハイブリドーマ細胞系１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を、ブタベスト条約に従って、受託番号ＰＴＡ−５６４３として２００３年１１月１１日、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）（米国２０１１０−２２０９バージニア州マナッサス大学通り１０８０１）に寄託した。３７ＣＦＲ１．８０８にもとづいて、寄託者は、寄託材料の公開に対する有効性にかかるすべての制限が特許の付与によって即座に取り除かれることを確信する。
【００２９】
抗癌抗体７ＢＤ−３３−１１Ａを産生するハイブリドーマを作るために、抗原、すなわちヒト乳癌細胞の単一細胞懸濁液を冷ＰＢＳで調製した。週齢８ないし９週のＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、２０万ないし２５０万個の細胞を含む抗原アジュバント１００マイクロリットルをフロイントの完全アジュバントとともに分割量で皮下および腹腔内注射によっておこなった。新たに調製した抗原アジュバントを用いて、初回免疫から３週間後、および最終免疫から２日後に同じ様式で２０万ないし２５０万個の細胞で免疫化マウスの追加免疫に用いた。最終免疫の少なくとも２日後、融合のために脾臓を用いた。単離した脾細胞をＳｐ２／０骨髄腫パートナーと融合してハイブリドーマを調製した。融合から得た上清をハイブリドーマのサブクローニングについて試験した。
【００３０】
抗癌抗体１Ａ２４５．６を産生するハイブリドーマを作るために、抗原、すなわちヒト乳癌細胞の単一細胞懸濁液を冷ＰＢＳで調製した。週齢８ないし９週のＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、２５０万個の細胞を含む抗原アジュバント１００マイクロリットルをフロイントの完全アジュバントとともに分割量で皮下および腹腔内注射によっておこなった。新たに調製した抗原アジュバントを用いて、初回免疫から３週間後、その後２週間、その後５週間、さらに最終免疫化から３週間後に同じ様式で２５０万個の細胞で免疫化マウスの追加免疫に用いた。最終免疫の少なくとも３日後、融合のために脾臓を用いた。単離した脾細胞をＮＳＯ−１骨髄腫パートナーと融合してハイブリドーマを調製した。融合から得た上清をハイブリドーマのサブクローニングについて試験した。
【００３１】
抗癌抗体１１ＢＤ−２Ｅ１１−２を産生するハイブリドーマを作るために、抗原、すなわちヒト乳癌細胞の単一細胞懸濁液を冷ＰＢＳで調製した。週齢８ないし９週のＢＡＬＢ／ｃマウスの免疫化は、２０万ないし２５０万個の細胞を含む抗原アジュバント１００マイクロリットルをフロイントの完全アジュバントとともに分割量で皮下および腹腔内注射によっておこなった。新たに調製した抗原アジュバントを用いて、初回免疫から２ないし３週間後、また最終免疫化から２週間後に同じ様式で２０万ないし２５０万個の細胞で免疫化マウスの追加免疫に用いた。最終免疫の少なくとも２日後、融合のために脾臓を用いた。単離した脾細胞をＮＳＯ−１骨髄腫パートナーと融合してハイブリドーマを調製した。融合から得た上清をハイブリドーマのサブクローニングについて試験した。
【００３２】
ハイブリドーマ細胞によって分泌される抗体が免疫グロブリンＧまたは免疫グロブリンＭイソタイプかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを用いた。ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）を２．４マイクログラム／ｍＬの濃度で含むコーティング緩衝液（０．１Ｍ炭酸塩／重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．２〜９．６）を４℃、１００マイクロリットル／ウエルで、ＥＬＩＳＡプレートに一晩加えた。このプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのブロッキング緩衝液（５％ミルク含有洗浄緩衝液）を上記プレートに、室温で１時間添加し、次に洗浄緩衝液で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのハイブリドーマ懸濁液を添加し、プレートを１時間、室温でインキュベートした。このプレートを洗浄液で３回洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭ西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ複合体の１／５０００希釈物（１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈）１００マイクロリットル／ウエルを添加した。このプレートを室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄した。１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＰ溶液を室温で１〜３分間インキュベートした。２ＭのＨ２ＳＯ３を１００マイクロリットル／ウエル添加することで呈色反応を停止させ、プレートを４５０ｎｍでパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置で読み取った。表１に示すように、７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、および１１ＢＤ−２Ｅ１１−２ハイブリドーマは、主にＩｇＧイソタイプの抗体を分泌した。
【００３３】
限界希釈を１〜４回繰り返した後、細胞ＥＬＩＳＡアッセイで標的細胞に結合した抗体についてハイブリドーマ上清を試験した。３種類の乳癌細胞系、すなわちＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１ともいう）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８ともいう）、およびＳＫＢＲ−３、を試験した。平板培養された細胞を、使用前に固定した。室温で、プレートをＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＳで希釈した２％パラホルムアルデヒド１００マイクロリットルを各ウエルに室温で１０分間添加し、その後捨てた。プレートを再びＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＰＢＳで再び洗浄した。ブロッキングを、５％ミルク含有洗浄液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を１００マイクロリットル／ウエルを用いて、室温で１時間実施した。プレートを洗浄液で３回洗浄し、ハイブリドーマ上清を１００マイクロリットル／ウエル、室温で１時間添加した。このプレートを洗浄液で３回洗浄し、西洋ワサビ・ペルオキシダーゼと接合したヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＭの１／５０００希釈物（１％牛血清アルブミン含有ＰＢＳで希釈）を１００マイクロリットル／ウエル添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄液で３回洗浄し、１００マイクロリットル／ウエルのＴＭＢ基質を室温で１〜３分インキュベートした。反応を１００マイクロリットル／ウエルの２Ｍ Ｈ２ＳＯ４で停止させ、このプレートを、パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置を用いて４５０ｎｍで読み取った。表１に集計したように、結果はＩｇＧイソタイプ対照（３ＢＤ−２７）と比較した際のバックグラウンドを上回る倍数で表した。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６ハイブリドーマ由来の抗体は、バックグラウンドよりも少なくとも６倍大きく、３種類の乳癌細胞系全てに対して強く結合した。両方の抗体が最も強くＭＤＡ−ＭＢ−２３１抗体に結合した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２ハイブリドーマ細胞系由来の抗体もまた、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系に最も強く結合したが、バックグラウンドよりも大きい他の２細胞系に対する結合は示されたなかった。これらの結果は、この抗体によって認識されたエピトープがＭＤＡ−ＭＢ−４６８またはＳＫＢＲ−３細胞に存在しないこと、また７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６によって認識されたエピトープとは異なることを示唆している。
【００３４】
抗体結合に関する試験と同時に、ハイブリドーマ上清の細胞毒性について、同じ乳癌細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、およびＳＫＢＲ−３）を用いて試験した。生／死細胞毒性アッセイをモレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｃｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（Ｅｕ、ＯＲ）から得た。このアッセイを、以下に示す変更を加えて製造元の指示にしたがって実施した。細胞を、予め定められた適当な密度で上記アッセイ前に、平板培養した。２日後、ハイブリドーマ・マイクロタイター・プレートから１００マイクロリットルの上清を細胞プレートに移し、５日間にわたって５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。陽性対照群としてあるウエルを、空になるまで吸引し、１００マイクロリットルのアジ化ナトリウムおよび／またはシクロヘキシミドを添加した。３ＢＤ−２７モノクローナル抗体もまた、イソタイプ対照として添加した。なぜなら、それは試験した３種類の乳癌細胞系に対して結合しないからである。比較のために、抗ＥＧＦＲ抗体（Ｃ２２５）も上記アッセイで用いた。処置５日後、上記プレートを逆さまにして空にし、拭いて乾燥した。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む室温ＤＰＢＳをマルチチャンネル・スクイーズ・ボトルから各ウエルに分配し、軽く３回叩き、反転して空にし、さらに拭いて乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＤＰＢＳで希釈した蛍光生／死染料５０マイクロリットルを各ウエルに添加し、３７℃、３０分間、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。プレートをパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置で読み取り、そのデータをマイクロソフト・エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）で分析した。結果を表１に集計した。
【００３５】
細胞毒性の違いが３種類の抗体で観察された。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は３９〜７３％の致死を示し、ＳＫＢＲ−３細胞で最も高い細胞毒性が観察された。１Ａ２４５．６および７ＢＤ−３３−１１ＡはＭＤＡ−ＭＢ−２３１で類似の細胞毒性を示したが、Ａ２４５．６はＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞に対して細胞毒性を示すが７Ｂ−３３−１１Ａは示さなかった。
このことは、ハイブリドーマ細胞由来の抗体が癌細胞で細胞毒性を生じ得ることを示した。抗体結合の度合いと、ハイブリドーマによって生ずる細胞毒性とのあいだに一般的な関係もあった。この傾向にはいくつかの例外（例えば結合不足にもかかわらずＭＢ−４６８癌細胞およびＳＫＢＲ−３癌細胞で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって生ずる細胞毒性の量）があった。このことは、この細胞種での細胞ＥＬＩＳＡ結合アッセイによっては検出できない媒介作用を上記抗体が有すること、またはそのアッセイが結合を検出しないこと（細胞固定等のアッセイの制約によるかもしれない）を示唆した。最後に、さらに別の可能性が存在しており、すなわち、このアッセイがこの特定の状況下で細胞毒性を媒介するのに十分である結合を検出するには感度が乏しかった。他の例外は、イソタイプ対照と比較してバックグラウンドよりも結合が６倍増加したにも関わらず、ＭＢ−４６８細胞に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの細胞毒性の相対的な不足であった。このことは、結合がその同族の抗体リゲーションの結果を必ずしも予示するものではないという可能性を示した。既知の非特異的細胞毒性因子であるシクロヘキシミドは予想通りに細胞毒性を生じた。
【００３６】
【表１】
【実施例２】
【００３７】
抗体産生
モノクローナル抗体の産生は、ハイブリドーマ７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、およびＢＤ−２Ｅ１１−２を収集によりＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）で培養し、週に２回再播種し、プロテインＧセファローズ４ファースト・フロー（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ベイ・ド・ウルフェ（Ｂａｉｅ ｄ‘Ｕｒｆｅ）、ＱＣ）による標準的抗体精製手順でおこなった。ヒト化、キメラ化、またはマウス抗体であるモノクローナル抗体を利用することは、本発明の範囲内である。７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、およびＢＤ−２Ｅ１１−２を細胞毒性アッセイで、多数の陽性対照群（抗Ｆａｓ（ＥＯＳ９．１、ＩｇＭ、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ、イー・バイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＣＡ）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧ１、カッパ、１０マイクログラム／ｍｌ、インター・メディコ（Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄｉｃｏ）、マークハム（Ｍａｒｋｈａｍ）、ＯＮ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ１、カッパ、５マイクログラム／ｍｌ、シーダーレーン（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）、ホーンビー（Ｈｒｎｂｙ）、ＯＮ）、シクロヘキシミド（１００マイクロモル、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）、ＮａＮ３（０．１％、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ））および陰性対照群１０７．３（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ１、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ、ＢＤ バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）、Ｇ１５５−１７８（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ２ａ、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ、ＢＤ バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）、ＭＰＣ−１１（抗原特異性未知、ＩｇＧ２ｂ、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン 、ＩｇＧ３、カッパ、２０マイクログラム／ｍｌ）、ＩｇＧ緩衝液（２％））と比較した（表２）。
【００３８】
【表２】
【００３９】
乳癌（ＭＢ−２３１、ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７）、大腸癌（ＨＴ−２９，ＳＷ１１１６、ＳＷ６２０）、肺癌（ＮＣＩ Ｈ４６０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ）、前立腺癌（ＰＣ−３）、および非癌（ＣＣＤ ２７ｓｋ、Ｈｓ８８８ Ｌｕ）細胞系を試験した（全てＡＴＣＣ、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、ＶＡから入手）。生／死細胞毒性は、モレキュラー・プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ（ユージン）、ＯＲ）から得た。アッセイは以下に概説する変更を加えて製造元の指示に従っておこなった。細胞を、予め定められた適当な密度で上記アッセイ前に、平板培養した。２日後、１００マイクロリットルの精製抗体を培地に希釈して細胞プレートに移し、５日間にわたって８％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。上記プレートを逆さまにして空にし、拭いて乾燥した。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含む室温ＤＰＢＳをマルチチャンネル・スクイーズ・ボトルから各ウエルに分配し、軽く３回叩き、反転して空にし、さらに拭いて乾燥させた。ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＤＰＢＳで希釈した蛍光生／死染料を各ウエルに５０マイクロリットル添加し、３７℃、３０分間、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。プレートをパーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＨＴＳ７０００プレート読み取り装置で読み取り、そのデータをマイクロソフト・エクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）で分析した。結果を表２に集計した。データは、３重に試験した４回の実験の平均を表し、以下の様式で定量的に示した。すなわち、閾値細胞毒性よりも大きい４／４実験（＋＋＋）、閾値細胞毒性よりも大きい３／４実験（＋＋）、閾値細胞毒性よりも大きい２／４実験（＋）。表２中無印の細胞は、不定または閾値細胞毒性よりも低い効果を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗体は選択的に乳房および前立腺の腫瘍株で細胞毒性を示した、その一方で、非形質転換正常細胞に対しては効果を示さなかった。両方とも陽性対照抗Ｆａｓ抗体よりも２５〜５０％大きい致死率を示した。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、乳癌細胞および卵巣癌細胞に対して特異的であり、正常細胞に対しては影響を及ぼさなかった。化学的細胞毒性因子は、該因子の期待される細胞毒性を誘発し、その一方で比較のために誘導される数多くの他の抗体もまた予想通りに実行され、生物学的細胞アッセイに限定を加えた。全体で、３種類の抗体が多数の癌細胞型に対して細胞毒性活性を持つことが示された。抗体は、全ての癌細胞型が感受性を示すわけではないので、該抗体の活性という点で選択的である。さらにまた、抗体が非癌細胞型に対しては細胞毒性を生じないということ（治療的な状況では重要な要素である）から、抗体は機能的特性を示した。
【００４０】
まず最初に細胞単層をＤＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まず）で洗浄して、ＦＡＣＳ用に細胞を調製した。次に、細胞解離緩衝液（インビトロゲン（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）を用いて、３７℃で細胞培養プレートから細胞を除去した。細胞の遠心および回収後、細胞をＭａｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、および２５％牛胎児血清を含むダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）リン酸緩衝生理的食塩水（４℃、洗浄媒体）に再懸濁し、計数し、適当な細胞密度に等分し、遠心して細胞をペレットにし、さらに７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、ＢＤ−２Ｅ１１−２、または対照抗体（イソタイプ制御または抗ＥＧＦ−Ｒ）を２０マイクログラム／ｍｌ含む染色媒体（ＭａｇＣｌ２およびＣａＣｌ２含有ＤＰＢＳ）に。氷上、３０分間、再懸濁した。アレクサ・フルーア（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）結合二次抗体を細胞に添加することに先立って、細胞を洗浄媒体で１回洗浄する。染色媒体に含まれるアレクサ・フルーラ４８８接合抗体を次に２０分間添加した。次に細胞を最終時間に対して洗浄し、１マイクログラム／ｍｌヨウ素化プロピジウムを含む染色媒体に再懸濁した。フローサイトメトリーによる細胞の獲得を、セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）ソフトウエア（ＢＤ バイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を用いてＦＡＣスキャン（ＦＡＣＳｃａｎ）上に試料を走らせることで、評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）は、ＦＳＣＣおよびＳＳＣ検出器上で電圧および振幅利得を調製することで、設定される。３本の蛍光チャネル（ＦＬ１、ＦＬ２、およびＦＬ３）用の検出器を、細胞が約１−５単位の中央値蛍光強度で均一のピークを持つようにして、アレクサ・フルーア（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８結合二次抗体が続く精製されたイソタイプ制御抗体で染色される細胞を走らせることによって調整した。ＦＳＣおよびヨウ素化プロピジウムに対してゲーティングをおこなうことで、生細胞を取得した。各試料について、約１０，０００個の生細胞を分析のために取得し、その結果を表３に示した。表３は、イソタイプ対照を上回る蛍光強度増加倍率の平均値を示し、定量的に５未満（−）、５ないし５０（＋）、５０ないし１００（＋＋）、１００を超える（＋＋＋）として表し、かつ括弧内は染色された細胞率であった。
【００４１】
【表３】
【００４２】
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の典型的なヒストグラムを図１用に編集し、１Ａ２４５．６抗体の典型的なヒストグラムをを図２用に編集し、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の典型的なヒストグラムを図３用に編集し、さらに二峰性のピークを含む結合特性を明示した。いくつかのケースでは、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２が乳房腫瘍細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１に対する特異的腫瘍結合を示した。７ＢＤ−３３−１１ＡおよびＡ２４５．６の両方が乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７）、大腸、肺、卵巣、および前立腺起源の癌系に対する類似した結合を示し、乳癌細胞系の一つ（ＭＤＡＭＢ−４６８）に対しては差次的な結合を示した。非癌化細胞に対する３種類の抗体全ての結合があったが、その結合は細胞毒性を生じなかった。このことは、結合がその同族の抗原の抗体連結反応の結果を必ずしも予示するというわけではないというさらなる証拠であり、また非自明的な知見であった。このことは、異なる細胞での抗体連結反応の状況がまさに抗体結合よりも細胞毒性の決定因子であったことを示唆した。
【実施例３】
【００４３】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）実験
ここで、図５および図６に示したデータに関連して、週齢４ないし８週のメスＳＣＩＤマウスに対して、５００万個のＮＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットルをマウスの首筋に皮下注射することで、該細胞を移植した。マウスを無作為に、１０匹からなる処置群４つに分けた。移植に先立つ日に、２０ｍｇ／ｋｇの１１ＢＤ２Ｅ−１１−２、７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６試験抗体または３ＢＤ−２７イソタイプ対照抗体（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に結合しないことが知られている）を、２．７ ｍＭ ＫＣＩ、１ ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭＮａＣｌ、および２０ ｍＭＮａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。抗体を次に週に１回、同じ様式で７週間にわたって投与した。
【００４４】
腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、最大１０週間あるいは動物がカナダ動物飼育評議会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ； ＣＣＡＣ）エンド・ポイントに達するまで測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通して見られなかった。週間隔で計量される体重は、健康および発達障害の代用となった。イソタイプ対照３ＢＤ−２７と７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６または１１ＢＤ−２Ｅ１１−２とによって処置された複数の群に関して体重差が最小であった。６０日目（処置停止後１１日）では、１Ａ２４５．６による処置を受けた群の腫瘍体積は、対照群の５．２％（ｐ＝０．０００２）であり、抗体処置による全身腫瘍組織量の減少に効果を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体による処置を受けたそれらの癌保持マウスは疾患を持たず、全身腫瘍組織量がゼロであった。腫瘍容積は、６７日目で１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群でより低かった（対照の４５％）（ｐ＝０．０８）。このことはまた、対照抗体と比較して細胞毒性抗体による全身腫瘍組織量の低下を示した。これもまた、７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、および１１ＢＤ−２Ｅ１１−２細胞傷害抗体による処置による対応の生存利点があった（図６）。３ＢＤ−２７抗体によって処置された対照群は、移植後７４日目で１００％の致死率に達した。対照的に、７ＢＤ−３３−１１Ａによって処置された群は疾患無しであり、１Ａ２４５．６処置動物の生存率は１００％であり、さらに１１ＢＤ−２Ｅ１１−２によって処置された群の生存率は２４％であった。
全体で、細胞毒性抗体処置は、ヒト癌疾患のよく認識されたモデルでの対照抗体と比較して、全身腫瘍組織量を減少させるとともに生存率を高めた。このことは、他の哺乳類（ヒトを含む）での治療にとって、これらの抗体（７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、およびＢＤ−２Ｅ１１−２）の薬理学的および製薬学的利点があることを示唆している。
【実施例４】
【００４５】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）定着腫瘍実験
週齢５ないし６週のメスＳＣＩＤマウスに対して、５００万個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞を含む１００マイクロリットルをマウスの首筋に皮下注射することによって、該細胞の移植をおこなった。腫瘍増殖の測定は、カリパスを用いて毎週おこなった。移植後３４日で大部分のコホートが１００ｍｍ３（範囲５０〜２００ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、８〜１０匹のマウスを無作為に３つの処置群の各々に割り当てた。７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６試験抗体または３ＢＤ−３７イソタイプ対照抗体（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に結合しないことが知られている）を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量１５０マイクロリットルで抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）とともに腹腔内投与した。抗体を次に週に３回、合計で１０用量、同じ様式で移植後５６日目まで投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、移植後５９日目まで、または動物がカナダ動物飼育評議会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ； ＣＣＡＣ）エンド・ポイントに達するまで測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【００４６】
毒性の臨床徴候が、本研究の全体を通して見られなかった。週間隔で計量される体重は、健康および発達障害の代用となった。イソタイプ対照と７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６抗体とによって処置された複数の群に体重差はなかった。図４に示すように、移植後５９日目（処置停止後２日）では、７ＢＤ−３３−１１Ａによる処置を受けた群の腫瘍体積は、対照群の２９．５％（ｐ＝０．０００３）であった。この群では、５９日目の値と５２日目（ｐ＝０．２５）とを比較した場合に、平均腫瘍容積の後退に向かう傾向があった。同様に、１Ａ２４５．６後退による処置もまた、有意に腫瘍増殖を抑制し、全身腫瘍組織量を低下させた。この抗体によって処置された定着腫瘍を持つ動物は、イソタイプ処置対照群の５６．３％である腫瘍容積を有した（ｐ＝０．０１７）。
全体で、ヒト癌疾患のよく認識されたモデルでの対照抗体と比較して、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗体による処置が有意に定着腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させた。このことは、他の哺乳類（ヒトを含む）での治療にとって、これらの抗体の薬理学的および製薬学的利点があることを示唆している。
【実施例５】
【００４７】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＭＢ−２３１予防的生存腫瘍実験
ＳＮ．１０／３４８，２８４に概説されているように、また図１１を参照すると、週齢４ないし８週のメスＳＣＩＤマウスに対する５００万個のＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の移植を該ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによっておこなった。マウスを無作為に、１０匹からなる処置群４つに分けた。移植に先立つ日に、２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６試験抗体またはイソタイプ対照抗体（ＭＢ−２３１もしくはＰＣ−３細胞に結合することが知られている）を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。抗体を次に週に１回、同じ様式で７週間にわたって投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、最大１０週間あるいは動物がカナダ動物飼育評議会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ； ＣＣＡＣ）エンド・ポイントに達するまで測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【００４８】
Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２８４からの継続出願で、７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６のいずれかによる処置に関連した後処置生存利点（図１１）が得られた。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腫瘍を決して生じなかった。また、１匹のマウスのみが２００日目（処理後１５１日）に死亡した。対照的に、イソタイプ対照マウスのすべてが移植後２３日目までに脂肪した。１Ａ２４５．６処置群は、、イソタイプ対照群よりも６倍長い処置後１５１日まで致死率が１００％までには達しなかった。まとめると、１Ａ２４５．６および７ＢＤ−３３−１Ａは、ヒト癌の乳房腫瘍モデルで、生存を高め、また全身腫瘍組織量を減少させた。
【実施例６】
【００４９】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＭＢ−２３１定着腫瘍実験
ＳＮ．１０／３４８，２８４に概説されているように、また図１２および図１３を参照すると、週齢５ないし６週のオスＳＣＩＤマウスに対する５００万個のＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の移植を該ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによっておこなった。腫瘍の増殖をカリバーで毎週測定した。移植後３４日で大部分のコホートが１００ｍｍ３（範囲５０〜２００ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、マウスを無作為に３つの処置群の各々に割り当てた。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６試験抗体またはイソタイプ対照抗体を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量１５０マイクロリットルで抗体（１５ｍｇ／ｋｇ）とともに腹腔内投与した。つぎに、抗体を週に３回合計で１０用量の投薬を、移植後５６日目までおこなった。腫瘍増殖を、移植後５９日目まで、あるいは個々の動物がＣＣＡＣエンド・ポイントに達するまで、約７日ごとにカリパスを用いて測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【００５０】
Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２８４からの継続出願で、７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６のいずれかによる処置に関連した後処置全身腫瘍組織量減少（図１２）および生存利点（図１３）が得られた。８０日目（処置後２３日）では、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６は、イソタイプ対照処置と比較して平均腫瘍容積が減少した（すなわち、それぞれ８３（ｐ＝０．００１）および３５パーセント（ｐ＝０．１３５））。コックス比例モデルは、異なる群でのハザード（リスク）率を比較するために用いられた。この方法では、群ごとのハザード率をイソタイプ対照群のハザード率と比較する。処置後約６０日で、７ＢＤ−３３−１１Ａ群での致死リスクは、イソタイプ対照処置群と比較して、１６パーセントであった（ｐ＝０．０００６）。７ＢＤ−３３−１１Ａに関連する生存利点は、処理後１００日のマークをかなり過ぎて続くように見えた。処置後１３０日目では、７ＢＤ−３３−１１Ａは生存率６０％を示し、その一方でイソタイプ対照マウスの全てが後処理５０日目で致死した。１Ａ２４５．６は、イソタイプ対照と比較して生存時間が２倍であった（すなわち、後処理５０日に対して１００日）。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６は、ヒト乳癌疾患の十分に認識されたモデルにおいて対照抗体と比較した場合、全身腫瘍組織量を低下および増加させた。このことはこれらの抗体がヒトを含む他のほ乳類での治療にとって薬理学的および製薬学的利点があることを示唆している。
【実施例７】
【００５１】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＰＣ−３予防的腫瘍実験
図１４および図１５を参照すると、週齢４ないし８週のオスＳＣＩＤマウスに対する１００万個のＰＣ−３ヒト乳癌細胞の移植を該ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによっておこなった。マウスを無作為に、それぞれ８匹からなる４つの処置群に割り当てた。移植に先立つ日に、２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６試験抗体またはイソタイプ対照抗体もしくは緩衝対照を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。抗体および緩衝対照を次に週に１回、同じ様式で７週間にわたって投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、最大１０週間あるいは動物がＣＣＡＣエンド・ポイントに達するまで、もしくは５２日目まで、測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
【００５２】
異なる群を特定するために最小有意差法（ＬＳＤ）を用いることで、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の両方とも、対照群と比較して処置マウスでの全身腫瘍組織量を有意に減少させることが明らかであった（図１４）。処置後（５２日目）、７ＢＤ−３３−１１Ａはイソタイプ対照と比較して６９パーセント（ｐ＝０．００１）まで腫瘍増殖を防いだ。また、１Ａ２４５．６も、イソタイプ対照と比較して５０パーセント（ｐ＝０．１７）まで腫瘍増殖を防いだ。類似の知見は、緩衝対照と比較をおこなった際に見いだされた。ＰＣ−３前立腺癌異種移植モデルでは、疾患進行の代用指標として体重を用いることができる（図１５）。反復分散分析（Ｒｅｐ． アノバ（ＡＮＯＶＡ））は、イソタイプと緩衝対照群との間に体重の有意差が存在しなかったことを示している。分散分析は、５２日目で、７ＢＤ−３３−１１Ａが対照群および１Ａ２４５．６処置群の両方よりも有意に高い体重を有したと決定した（ｐ＜０．０３）。全体的に、７ＢＤ−３３−１１Ａは、イソタイプ対照群と比較して、５４パーセント（ｐ＝０．００２）まで体重損失を防ぎ、一方１Ａ２４５．６は２５パーセント（ｐ＝０．００４）まで体重損失を防いだ。処置後、生存に関してマウスをモニターした（図１６）。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６処置マウスの１００パーセントが、処置後３８日目までに致死に達した。このことはイソタイプおよび緩衝対照処置群（処置後１１日）よりも３倍長かった。
まとめると、ヒト前立腺癌の十分に認識されたモデルでイソタイプ対照抗体および緩衝対照と比較して、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗体処置は、全身腫瘍組織量を減少させ、疾患の進行を遅らせ、さらに生存を延ばした。これらの結果は、乳癌を越えた治療としてこれらの抗体（７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６）の潜在的な薬理学的および製薬学的利点を示唆する。
【実施例８】
【００５３】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＰＣ−３定着腫瘍実験
週齢４ないし８週のオスＳＣＩＤマウスに対して、１００万個のＰＣ−３前立腺癌細胞を含む１００マイクロリットルをマウスの首筋に皮下注射することによって、該細胞の移植をおこなった。腫瘍増殖の測定は、カリパスを用いて毎週おこなった。移植後２１日目で大部分のコホートが２７５ｍｍ３（範囲１４４〜４０６ｍｍ３）の腫瘍容積に達したとき、９〜１０匹のマウスを無作為に４つの処置群の各々に割り当てた。７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６またはイソタイプ対照抗体を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで２０ｍｇ／ｋｇ／用量で、腹腔内投与した。つぎに、抗体を週に３回合計で１０用量の投薬を、移植後４３日目までおこなった。腫瘍増殖を、研究期間中または個々の動物がＣＣＡＣエンドポイントに達するまで、約７日毎にカリパスを用いて測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
無作為化の際、平均の腫瘍容積と各群の標準偏差とが同程度だった。統計学的に群間の体重差はなかった。このことは、真の無作為化が起こったことを示した。図１７に示すように、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａは、３週間の処置期間の終わりに、イソタイプ対照と比較して、３６パーセント（ｐ＝０．２４）まで腫瘍増殖を有意に抑制することが可能であった。イソタイプまたは投与群と比較した場合、１Ａ２４５．６は有意差を示さなかった。同様に、７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４５．６は、体重（図１８）に関して、イソタイプまたは緩衝対照処置群と比較して、いくらかの有意差を示した。全ての群は、本研究（ｐ＜０．００１）の全体を通じて、体重損失が同程度の有意量を示した。
要約すれば、７ＢＤ−３３−１１Ａは、ＳＣＩＤマウスにおいて前立腺癌の定着腫異種移植モデルでの腫瘍増殖を抑制する点で、イソタイプ対照抗体よりも有意に優れた効果を示す。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａによる処置は、ヒト癌疾患（乳房および前立腺）の２つのよく認識されたモデルで、有意に定着腫瘍の全身腫瘍組織量を減少させた。このことは、ヒトを含む他の哺乳類での処置に対するこの抗体の薬理学的および製薬学的利点を示唆している。
【実施例９】
【００５４】
正常ヒト組織染色
ＩＨＣ研究を実施して、ヒト体内での７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗原の分布を特徴づけた。ＩＨＣ最適化研究は、さらなる実験のための条件を決定するために、前もって実施した。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６モノクローナル抗体は、すでに述べたようにして、生産および精製した。
組織切片をオーブンで５８℃、１時間乾燥させることで、脱パラフィン化し、コプリン・ジャーでキシレンに５回（各々４分）浸すことで脱ワックス化した。一連の段階的なエタノール洗浄（１００％−７５％）を通しての処置の後で、切片を水中で再水和させた。スライドを１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））に浸し、次に各々５分間で高、中、および低パワー設定でマイクロ波処理し、最終的に冷ＰＢＳに浸した。次にスライドを３％過酸化水素水に６分間浸し、ＰＢＳで３回、各々５分間洗浄し、乾燥し、ユニバーサル（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ブロッキング溶液（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））とともにインキュベート（５分間、室温）した。７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、モノクローナル・マウス抗ビメンチン（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））、またはイソタイプ対照抗体（黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコースオキシダーゼ（哺乳類組織内には存在せず、また誘導不可の酵素）（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））を抗体希釈緩衝液（ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））によって希釈して作用濃度（各抗体について５μｇ／ｍｌ）にし、室温で１時間、一晩インキュベートした。スライドをＰＢＳで３回（各回５分）洗浄した。一次抗体の免疫反応性の検出／視覚化を、室温で３０分間にわたり供給（ダコ・エンビジョン・システム（Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ）））されるＨＲＰ結合二次抗体によっておこなった。このステップの後に、スライドをＰＢＳで３回（各回５分）洗浄し、室温で１０分間にわたる免疫ペルオキシダーゼ染色のためにＤＡＢ（３，３−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド、ダコ（Ｄａｋｏ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ））クロモゲン基質溶液を添加することで、呈色反応が生じた。このスライドを水道水で洗うことで、クロモゲン反応を停止させた。マイヤー・ヘマトキシリン（Ｍｅｙｅｒ‘ｓ Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）（シグマ・ダイアグノスティックス（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、オークビル（Ｏａｋｖｉｌｌｅ）、ＯＮ）による対比染色を行った後、スライドを段階的エタノール（７５〜１００％）で脱水し、キシレンでクリアにした。マウンティング・メディア（ダコ・ファラマウント（Ｄａｋｏ Ｆａｒａｍｏｕｎｔ）、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、オンタリオ（Ｏｎｔａｒｉｏ）））を使用することで、スライドにカバースリップを置いた。アキソバート（Ａｘｉｏｖｅｒｔ）２００（ツアイス（Ｚｅｉｓｓ）、カナダ、トロント（Ｔｏｒｏｎｔｏ）、ＯＮ）を持ちいて、スライドを顕微鏡的に調べ、デジタル画像を獲得し、ノーザン・エクリプス・イメージング・ソフトウエア（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ミシサーガ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）、ＯＮ）を用いて格納した。結果に対して、読み取り、記録、さらに病理学者による解釈がおこなわれた。
【００５５】
５９種類の正常ヒト組織に対する抗体の結合は、ヒト正常器官組織配列（インジェネックス（Ｉｍｇｅｎｅｘ）、サンディエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）、ＣＡ）を使用しておこなった。表４は、多数の正常ヒト組織の配列を７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６染色した結果の概要を示す。表によれば、組織染色に３つのカテゴリーが存在する。組織の一群が完全に陰性であった。これらの組織として、７ＢＤ−３３−１１Ａに対して正常皮膚、脳（図１９Ａ）、卵巣、胸腺、甲状腺、小腸、食道、心臓（図２０Ａ）、胆嚢、およびリンパ節が挙げられた。１Ａ２４５．６について、完全に陰性の組織は、皮膚、皮下組織脂肪、食道、および脳（図１９Ｂ）から構成された。組織の第２の群は、陽性染色を示した組織から構成された。これらは、７ＢＤ−３３−１１Ａに対して、肝臓および脾臓が含まれた。扁桃腺はこの抗体で最も強く染色された。１Ａ２４５．６に関しては、陽染色性が肝臓、心臓（図２０Ｂ）、精巣、甲状腺、副腎、および子宮筋層で生じた。７ＢＤ−３３−１１Ａと同様に、１Ａ２４５．６は最も強く扁桃腺を染色した。組織の第３の群として、組織切片で染色が陽性であった組織が含まれるが、浸潤マクロファージ、リンパ球、線維芽細胞、または上皮、例えば７ＢＤ−３３−１ｌＡおよび１Ａ２４５．６の両方に対しては胃（それぞれ図２１ＡおよびＢ）に限られていた。いくつかの生体器官（例えば腎臓、心臓（図２０Ａ）、および肺）の細胞に、７ＢＤ−３３−１抗原が存在しないことに留意する必要がある。全体的に、７ＢＤ−３３−１１Ａは、陽性である組織での結合を適度にすることが不得意である１Ａ２４５．６と比較して、正常ヒト組織のより小さなサブセットに結合する。より広範囲であるが、１Ａ２４５．６染色は通常、強度を緩和することが不得意であり、大部分の事例では染色された組織上皮に限られている。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１ｌＡに対する抗原が正常組織上で幅広く発現されないこと、また限られた数のヒト組織に対して上記抗体が特異的に結合することを示唆している。加えて、１Ａ２４５．６のための抗原は、心臓および肝臓に存在している他に、上皮と、浸潤リンパ球、マクロファージ、および線維芽細胞とに限られている。
【００５６】
【表４】
【実施例１０】
【００５７】
ヒト腫瘍組織染色
ＩＨＣ研究を実施して、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６抗原とヒト乳癌との癌関連性を決定し、いずれの抗体もヒト癌を認識する可能性があるかどうかを決定した。比較は、ビメチン（陽性対照）と、黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコース・オキシダーゼ（哺乳類組織では存在せず、また誘導不可能である酵素）（負の対照）とに対しておこなった。５０人の乳癌患者に由来する乳癌組織配列と乳癌患者の非腫瘍性乳房組織に由来する１０種類の試料とを用いたインジェネックス（Ｉｍｇｅｎｅｘ）、サンディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＣＡ）。各患者に対して以下の情報が提供される。すなわち、年齢、性別、および診断である。実施例９からのＩＨＣに対する手順は以下の通り。全ての抗体を作用濃度５μｇ／ｍｌで使用した。
表５は、乳房癌組織配列の７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の結合概要を提供する。各々の配列は５０人の固体患者から得た腫瘍試料を含んだ。全体として、１Ａ２４５．６に対しての９８パーセント（図２３Ａ）と比較して、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原については試験した５０人の患者のうち３６パーセントが陽性であった（図２２Ａ）。７ＢＤ−３３−１１Ａについては、乳癌患者から得た１０個の正常乳房組織試料のうち、陽性であったものはゼロであった（図２２Ｂ）．逆に言えば、１０個の正常乳房組織試料のうち９個が１Ａ２４５．６に対して陽性であった。しかし、染色は大部分の実例では浸潤線維芽細胞によるものであった（図２３Ｂ）．エストロゲンとプロゲステロン受容体状態とのあいだの相互関係は、１Ａ２４５．６にとって明白なものではなかった（表６）。エストロゲンおよびプロゲステロン受容体を発現するものでもある陽性の７ＢＤ−３３−１Ａ抗原組織の数がわずかに高かった（表７）。７ＢＤ−３３−１Ａ抗原に対しては、より高い腫瘍病期によりいっそう陽性に発現するようにも見え（表７）、１Ａ２４５．６に関しては組織染色の強度がより高い腫瘍病期に相関しているように見える（表６）。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４２５．６による染色は、癌細胞組織特異性があり、染色は膜上および細胞質内の両方で生じた。７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４２５．６の両方に由来する染色パターンは、患者試料内で、該抗体が悪性細胞に対してかなり特異的であり、各々の抗原が細胞膜上に存在することから、それによって魅了的な薬物となりうる標的が作られる。
【００５８】
【表５】
【００５９】
【表６】
【００６０】
【表７】
【００６１】
７ＢＤ−３３−１１Ａまたは１Ａ２４２５．６抗原のいずれが乳癌に加えて他のヒト癌組織上で発現されるかを判断するために、両方の抗体を多重ヒト腫瘍組織配列（インジェネックス（Ｉｍｇｅｎｅｘ）、サンディエゴ（ＳａｎＤｉｅｇｏ）、ＣＡ）上で、個々に試験した。以下の情報を個々に患者について得た。すなわち、年齢、性、器官、および診断である。用いた染色の手順は、実施例９に概説したものと同様であった。ビンメチンを陽性対照抗体として使用し、同一の陰性対照抗体をヒト乳房腫瘍組織配列について述べられるように用いた。全ての抗体を５μｇ／ｍｌの作用濃度で用いた。
【００６２】
表８で概説されるように、７ＢＤ−３３−１１Ａは乳房の他に多数の種々のヒト癌を染色した。以下の腫瘍型は、７ＢＤ−３３−１１Ａに対して陽性であった。すなわち、皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、前立腺（１／１）、子宮（４／４）、および腎臓（３／３）（図２４Ａ）。いくつかの他の腫瘍型も、しばしば陽染色性を示した。他の腫瘍組織は、７ＢＤ−３３−１１Ａ発現に対しては陰性であった。すなわち、卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）、およびリンパ節（０／２）。逆に言えば、１Ａ２４５．６は試験されるあらゆる腫瘍組織型を染めた。しかし、最も強い染色のいくつかが、皮膚、肺、肝臓、子宮、腎臓（図２４Ｂ）、胃、および膀胱の悪性細胞上で見られた。乳房癌で見られるように、７ＢＤ−３３−１１ＡとｌＡ２４５．６の染色は、癌細胞の膜上および細胞質内で限局化された。
したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５６抗原が単に乳房癌の膜上で見つかるだけではなく、前立腺を含むかなり多様な腫瘍型の膜上でも見いだされるように見える。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５には乳房および前立腺癌に加えて広範囲の腫瘍型における治療薬としての可能性があることを示している。
【００６３】
【表８】
【実施例１１】
【００６４】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）ＭＣＦ−７予防的生存腫瘍実験
図７および図８を参照すると、週齢４ないし８週のメスＳＣＩＤマウスに対する５００万個のＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞の移植を該ヒト乳癌細胞を含む１００マイクロリットル生理食塩液をマウスの首筋に皮下注射することによっておこなった。マウスを無作為に１１〜１３匹のマウスからなる２つの処置群に分けた。移植後の日に、２０ｍｇ／ｋｇの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２試験抗体またはイソタイプ対照抗体（ＭＣＦ−７またはＯＶＣＡＲ−３細胞に結合しないことが知られている）を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。次に、抗体を週に１回、同じ様式で７週間にわたって投与した。腫瘍増殖の測定は、ほぼ７日目毎にカリパスを用いて、最大８週間あるいは動物がカナダ動物飼育評議会（Ｃａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ； ＣＣＡＣ）エンド・ポイントに達するまで、測定した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、対照群と比較して処置マウスの全身腫瘍組織量を有意に減少させた（図７）。処置後（５１日目）、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は、イソタイプ対照抗体で処置されたマウスと比較して８０パーセント（ｐ＝０．００９８）まで腫瘍増殖を抑えた。また、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２投与に関連した後処置生存利点（図８）も存在する。イソタイプ対照抗体処置群は、処置後１９７日目によって致死率１００パーセントに達し、一方１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群の４０％が２３３日目でも生存している。まとめると、ヒト乳癌の十分に確立されたモデルで、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２は生存を高め、また全身腫瘍組織量を減少させる（ブラッキー（Ｂｌａｋｅｙ）他。臨床癌研究（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ８：１９７４−１９８３ ２００２；クレメント（Ｋｌｅｍｅｎｔ）他。臨床癌研究（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ８： ２２１−２３２ ２００２；ワウンド（Ｗａｕｄ）他。抗癌性の薬剤開発のための腫瘍モデルの関連（Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、フィービグ（Ｆｉｅｂｉｇ）およびバンガー（Ｂｕｎｇｅｒ）編集、５４：３０５−３１５ １９９９；カーパネン（Ｋａｒｐａｎｅｎ）他。癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ６１： １７９０−２００１））。
【実施例１２】
【００６５】
生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）予防的腫瘍実験
図９および図１０を参照すると、週齢４ないし８週のメスＳＣＩＤマウスに対する５００万個のＯＶＣＡＲ−３ヒト卵巣癌細胞の移植を、該ヒト卵巣癌細胞を含む１００マイクロリットル生理食塩液を腹腔内注射することによって、おこなった。マウスを無作為に１０匹のマウスからなる２つの処置群に分けた。移植後の日に、２０ｍｇ／ｋｇの１１ＢＤ−２Ｅ１１−２試験抗体または緩衝対照抗体を、２．７ｍＭ ＫＣＩ、１ｍＭＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、および２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰ０４を含む希釈剤でストック濃度から希釈した後に容量３００マイクロリットルで腹腔内投与した。次に、抗体を週に１回、同じ様式で９週間にわたって投与した。動物の体重を、本研究期間にわたって記録した。本研究終了後、全ての動物を、ＣＣＡＣガイドラインに従って安楽死させた。
ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌異種移植では、体重の増加を疾患進行の代用指標として用いることができる。なぜなら、このことは増加した全身腫瘍組織量から腹水の蓄積を反映をするからである（図９）。移植後８０日目（処置終了後１６日）に、緩衝対照群と比較して、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２投与によって１２．４パーセント（ｐ＝０．０１５）まで体重増加を予防した。マウスを、処置後の生存についてモニターした（図１０）。８７日目までに、緩衝対照群は致死率９０パーセントを達成したが、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群ではその時点で８０パーセントが生存していた。１１ＢＤ−２Ｅ１１−２処置群は、１２５日目まで致死率９０パーセントを達成することができなかった。要約すると、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体処置は、ヒト卵巣癌のよく認識されたモデルで緩衝液対処抗体と比較して、全身腫瘍組織量を減少させ、疾患進行を遅延させ、さらに生存を高めた。したがって、１１ＢＤ−２Ｅ１１−２による処置は、ヒト癌疾患の十分に認識された２つのモデル（乳癌および卵巣癌）で、定着腫瘍の全身腫瘍組織量を有意に減少させたことから、ヒトを含む他の哺乳類での治療に対して、薬理学的および製薬学的利点を有することが示唆される （スミス（Ｓｍｉｔｈ）等、前立腺（Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ） ４８： ４７−５３ ２００１； オルソン（Ｏｌｓｏｎ）等、国際癌雑誌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ） ９８： ９２３−９２９ ２００２； ギルバウンド（Ｇｕｉｌｂａｕｄ）他、臨床癌研究（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ７： ２５７３−２５８０ ２００１； ボン・グルニゲン（Ｖｏｎ Ｇｒｕｅｎｉｇｅｎ）他、国際婦人科癌雑誌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｃａｎｃｅｒ） ９： ３６５−３７２ １９９９； ギチャード（Ｇｕｉｃｈａｒｄ）他、臨床癌研究（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ） ７： ３２２２−３２２８２００１ ； キシアオ（Ｘｉａｏ）他、タンパク質発現および精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ） １９： １２−２１ ２０００）。
【００６６】
この明細書で言及される全ての特許および刊行物は、本発明が関係する当業者のレベルで示される。全ての特許および刊行物が、あたかも個々の刊行物が具体的および個々に参照によって取り込まれることが示されるかのように、同じ範囲への言及によって本明細書の一部を構成するものとして援用される。
【００６７】
本発明の特定の形状が例示される一方で、本明細書に開示および表示される特定の形状または構成要素の配置が限定されるものではないことが、理解される。種々の変化が本発明の範囲から逸脱することなくなされることができることは当業者にとって明らかであり、この明細書に表示および記載されたことに限られて本発明が考えられるものではない。
当業者は、本発明が目的を達成し、本質的に内在されるものと同様に、言及される結果および利点を得ることに十分適していることを、容易に認めるだろう。本明細書中に記載されるいかなるオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連した化合物、方法、手順、および技術は、現在のところ好ましい実施形態を代表するものであって、例示することを目的としたものであり、本発明の範囲を制限することを意図したものではない。本発明の精神の範囲内に含まれ、添付された特許請求の範囲の範囲によって定義される変更および他の用途を、当業者は想到することができるだろう。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して説明されているが、クレームされた本発明はそのような特定の実施形態によって不必要に制限されるものであってはならない。実際、当業者にとって明らかである本発明を実行する上での記載された態様の種々の修飾は、特許請求の範囲が意図するところの範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】１Ａ２４５．６抗体、両抗体のイソタイプ対照抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体、の典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。
【図２】７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体、１Ａ２４５．６のイソタイプ対照抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲのイソタイプ対照抗体の典型的なＦＡＣＳヒストグラムである。
【図３】１１ＢＤ−２Ｅ１１−２抗体、両抗体のイソタイプ対照抗体、いくつかの癌細胞系および非癌細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体のＦＡＣＳヒストグラムである。
【図４】特定の抗体処置に関する腫瘍容積のグラフ解析である。
【図５】時間経過に伴うＭＢ２３１ヒト乳癌腫瘍容積に対する抗体効果のグラフ解析である。
【図６】抗体療法に関連した時間経過に伴う生存率を定量化するグラフ解析である。
【図７】ＭＣＦ−７乳癌モデルでの腫瘍増殖に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の効果を示す図である。図中、破線は抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは平均値±ＳＥＭを表す。
【図８】予防的ＭＣＦ−７異種移植研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−２またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後２３０日を超えた生存についてマウスをモニターした。
【図９】予防的ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌モデルの平均体重に対する１１ＢＤ−２Ｅ１１−２の効果を示す図である。実勢は、抗体が訪うよされた器官を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
【図１０】予防的ＯＶＣＡＲ−３研究での１１ＢＤ−２Ｅ１１−１またはバッファ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後約６０日間、生存に関してマウスをモニターした。
【図１１】予防的ＭＢ−２４１異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後２００日間、生存に関してマウスをモニターした。
【図１２】予防的ＭＢ−２３１乳癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す図である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
【図１３】確立したＭＢ−２３１異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４２５．６、またはイソタイプ対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す図である。処置後１３０日間にわたってマウスの生存をモニターした。
【図１４】予防的前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す。破線は、抗体が投与された期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
【図１５】予防的ＰＣ−３異種移植研究の継続期間に対する異なる処置を受けた群の平均体重を示すヒストグラムである。データ・ポイントは各時点での各群についての平均値±ＳＥＭを表す。
【図１６】予防的ＰＣ−３異種移植研究での７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４２５．６、イソタイプまたは緩衝対照抗体による処置後の腫瘍保持マウスの生存を示す。処置後３８日間にわたって、生存についてマウスをモニターした。
【図１７】確立したＰＣ３前立腺癌モデルでの腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａおよび１Ａ２４５．６の効果を示す。破線は抗体が投与される期間を示す。データ・ポイントは、平均値±ＳＥＭを表す。
【図１８】確立したＰＣ−３異種移植研究の持続期間にわたる異なる処置群の平均体重を示すヒストグラムである。データは、各時点での各群の平均値±ＳＥＭとして表されている。
【図１９】図１９Ａ〜Ｃは、正常ヒト脳であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１、Ｂが１Ａ２４５．６、およびＣが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
【図２０】図２０Ａ〜Ｃは、正常ヒト心臓であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｂが１Ａ２４５．６（矢印は陽性染色を示す）、およびＣが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
【図２１】図２１Ａ〜Ｃは、正常ヒト胃洞であり、Ａが７ＢＤ−３３−１１Ａ（矢印は胃腺上皮の陽性染色を示す）、Ｂが１Ａ２４５．６（矢印は胃腺上皮の陽性染色を示す）、Ｃが陰性イソタイプ対照を示す。倍率は２００倍である。
【図２２】図２２Ａ〜Ｂは、ヒト乳癌腫瘍（浸潤性導管癌：パネルＡ、黒色矢印：腫瘍細胞シート、黄色矢印：腫瘍間質）およびヒト正常乳房（パネルＢ）に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ結合の典型的な顕微鏡写真を示す。倍率は２００倍である。
【図２３】図２３Ａ〜Ｂは、ヒト乳癌腫瘍（浸潤性導管癌：パネルＡ、黒色矢印：腫瘍細胞シート、黄色矢印：腫瘍間質）およびヒト正常乳房（パネルＢ、黒色矢印：線維芽細胞）に対する１Ａ２４５．６結合の典型的な顕微鏡写真を示す。倍率は２００倍である。
【図２４】図２４Ａ〜Ｃは、腎細胞癌であり、Ａは７ＢＤ−３３−１１Ａ（矢印は腫瘍細胞シートでの陽性染色を示す）、Ｂは１Ａ２４５．６（矢印は腫瘍細胞シードでの陽性染色を示す）、およびＣは陰性イソタイプ対照である。倍率は２００倍である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
受託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の同定されている特徴を持つ該モノクローナル抗体のフラグメントに対して特異的に結合する抗原を発現するヒト腫瘍を哺乳類において処置することによって、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法であって、前記哺乳類に対して前記モノクローナル抗体を、前記哺乳類の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量で投与するステップを含み、それによって疾患進行の遅延および／または生存の延長がおこなわれる、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法。
【請求項２】
前記抗体が細胞障害性部分と接合している、請求項１の方法。
【請求項３】
前記細胞障害性部分が放射同位元素である、請求項２の方法。
【請求項４】
前記抗体が補体を活性化させる、請求項１の方法。
【請求項５】
前記抗体が抗体依存型細胞障害性を媒介する、請求項１の方法。
【請求項６】
前記抗体がマウス抗体である、請求項１の方法。
【請求項７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１の方法。
【請求項８】
前記抗体がキメラ化抗体である、請求項１の方法。
【請求項９】
受託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる、単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記単離モノクローン抗体またはその結合フラグメントがヒト化されている、請求項９の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
細胞障害性部分、酵素、放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択されるメンバーと接合する、請求項９の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記単離抗体または抗原結合フラグメントがキメラ化抗体である、請求項９の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウス抗体である、請求項９の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
受託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託された、単離クローン。
【請求項１５】
ヒト腫瘍から選択された組織試料での癌細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、それによって前記組織試料内の前記癌細胞の存在を示す、結合アッセイ。
【請求項１６】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項１５の結合アッセイ。
【請求項１７】
ヒト腫瘍から選択されたヒト組織内の癌細胞を単離またはスクリーニングする方法であって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、前記結合によって前記癌細胞が単離され、前記組織試料内での前記癌細胞の存在が確認される、単離またはスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項１７の方法。
【請求項１９】
受託番号ＰＴＡ−４８８９としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の同定されている特徴を持つ該モノクローナル抗体のフラグメントに対して特異的に結合する抗原を発現するヒト腫瘍を哺乳類において処置することによって、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法であって、前記哺乳類に対して前記モノクローナル抗体を、前記哺乳類の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量で投与するステップを含み、それによって疾患進行の遅延および／または生存の延長がおこなわれる、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法。
【請求項２０】
前記抗体が細胞障害性部分と接合している、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記細胞障害性部分が放射同位元素である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記抗体が補体を活性化させる、請求項１９の方法。
【請求項２３】
前記抗体が抗体依存型細胞障害性を媒介する、請求項１９の方法。
【請求項２４】
前記抗体がマウス抗体である、請求項１９の方法。
【請求項２５】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１９の方法。
【請求項２６】
前記抗体がキメラ化抗体である、請求項１９の方法。
【請求項２７】
受託番号ＰＴＡ−４８８９としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる、単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
前記単離モノクローン抗体またはその結合フラグメントがヒト化されている、請求項２７の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
細胞障害性部分、酵素、放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択されるメンバーと接合する、請求項２７の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
前記単離抗体または抗原結合フラグメントがキメラ化抗体である、請求項２７の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウス抗体である、請求項２７の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
受託番号ＰＴＡ−４８８９としてＡＴＣＣに寄託された、単離クローン。
【請求項３３】
ヒト腫瘍から選択された組織試料での癌細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−４８８９としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、それによって前記組織試料内の前記癌細胞の存在を示す、結合アッセイ。
【請求項３４】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項３３の結合アッセイ。
【請求項３５】
ヒト腫瘍から選択されたヒト組織内の癌細胞を単離またはスクリーニングする方法であって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−４８８９としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、前記結合によって前記癌細胞が単離され、前記組織試料内での前記癌細胞の存在が確認される、単離またはスクリーニング方法。
【請求項３６】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項３５の方法。
【請求項３７】
受託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の同定されている特徴を持つ該モノクローナル抗体のフラグメントに対して特異的に結合する抗原を発現するヒト腫瘍を哺乳類において処置することによって、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法であって、前記哺乳類に対して前記モノクローナル抗体を、前記哺乳類の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量で投与するステップを含み、それによって疾患進行の遅延および／または生存の延長がおこなわれる、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法。
【請求項３８】
前記抗体が細胞障害性部分と接合している、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記細胞障害性部分が放射同位元素である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記抗体が補体を活性化させる、請求項３７の方法。
【請求項４１】
前記抗体が抗体依存型細胞障害性を媒介する、請求項３７の方法。
【請求項４２】
前記抗体がマウス抗体である、請求項３７の方法。
【請求項４３】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項３７の方法。
【請求項４４】
前記抗体がキメラ化抗体である、請求項３７の方法。
【請求項４５】
受託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる、単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４６】
前記単離モノクローン抗体またはその結合フラグメントがヒト化されている、請求項４５の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４７】
細胞障害性部分、酵素、放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択されるメンバーと接合する、請求項４５の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４８】
前記単離抗体または抗原結合フラグメントがキメラ化抗体である、請求項４５の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４９】
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウス抗体である、請求項４５の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５０】
受託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託された、単離クローン。
【請求項５１】
ヒト腫瘍から選択された組織試料での癌細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、それによって前記組織試料内の前記癌細胞の存在を示す、結合アッセイ。
【請求項５２】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項５１の結合アッセイ。
【請求項５３】
ヒト腫瘍から選択されたヒト組織内の癌細胞を単離またはスクリーニングする方法であって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、前記結合によって前記癌細胞が単離され、前記組織試料内での前記癌細胞の存在が確認される、単離またはスクリーニング方法。
【請求項５４】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項５３の方法。
【請求項１】
受託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の同定されている特徴を持つ該モノクローナル抗体のフラグメントに対して特異的に結合する抗原を発現するヒト腫瘍を哺乳類において処置することによって、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法であって、前記哺乳類に対して前記モノクローナル抗体を、前記哺乳類の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量で投与するステップを含み、それによって疾患進行の遅延および／または生存の延長がおこなわれる、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法。
【請求項２】
前記抗体が細胞障害性部分と接合している、請求項１の方法。
【請求項３】
前記細胞障害性部分が放射同位元素である、請求項２の方法。
【請求項４】
前記抗体が補体を活性化させる、請求項１の方法。
【請求項５】
前記抗体が抗体依存型細胞障害性を媒介する、請求項１の方法。
【請求項６】
前記抗体がマウス抗体である、請求項１の方法。
【請求項７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１の方法。
【請求項８】
前記抗体がキメラ化抗体である、請求項１の方法。
【請求項９】
受託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる、単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記単離モノクローン抗体またはその結合フラグメントがヒト化されている、請求項９の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
細胞障害性部分、酵素、放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択されるメンバーと接合する、請求項９の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記単離抗体または抗原結合フラグメントがキメラ化抗体である、請求項９の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウス抗体である、請求項９の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
受託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託された、単離クローン。
【請求項１５】
ヒト腫瘍から選択された組織試料での癌細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、それによって前記組織試料内の前記癌細胞の存在を示す、結合アッセイ。
【請求項１６】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項１５の結合アッセイ。
【請求項１７】
ヒト腫瘍から選択されたヒト組織内の癌細胞を単離またはスクリーニングする方法であって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−４８９０としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、前記結合によって前記癌細胞が単離され、前記組織試料内での前記癌細胞の存在が確認される、単離またはスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項１７の方法。
【請求項１９】
受託番号ＰＴＡ−４８８９としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の同定されている特徴を持つ該モノクローナル抗体のフラグメントに対して特異的に結合する抗原を発現するヒト腫瘍を哺乳類において処置することによって、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法であって、前記哺乳類に対して前記モノクローナル抗体を、前記哺乳類の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量で投与するステップを含み、それによって疾患進行の遅延および／または生存の延長がおこなわれる、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法。
【請求項２０】
前記抗体が細胞障害性部分と接合している、請求項１９の方法。
【請求項２１】
前記細胞障害性部分が放射同位元素である、請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記抗体が補体を活性化させる、請求項１９の方法。
【請求項２３】
前記抗体が抗体依存型細胞障害性を媒介する、請求項１９の方法。
【請求項２４】
前記抗体がマウス抗体である、請求項１９の方法。
【請求項２５】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１９の方法。
【請求項２６】
前記抗体がキメラ化抗体である、請求項１９の方法。
【請求項２７】
受託番号ＰＴＡ−４８８９としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる、単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
前記単離モノクローン抗体またはその結合フラグメントがヒト化されている、請求項２７の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
細胞障害性部分、酵素、放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択されるメンバーと接合する、請求項２７の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
前記単離抗体または抗原結合フラグメントがキメラ化抗体である、請求項２７の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウス抗体である、請求項２７の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
受託番号ＰＴＡ−４８８９としてＡＴＣＣに寄託された、単離クローン。
【請求項３３】
ヒト腫瘍から選択された組織試料での癌細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−４８８９としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、それによって前記組織試料内の前記癌細胞の存在を示す、結合アッセイ。
【請求項３４】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項３３の結合アッセイ。
【請求項３５】
ヒト腫瘍から選択されたヒト組織内の癌細胞を単離またはスクリーニングする方法であって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−４８８９としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、前記結合によって前記癌細胞が単離され、前記組織試料内での前記癌細胞の存在が確認される、単離またはスクリーニング方法。
【請求項３６】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項３５の方法。
【請求項３７】
受託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされるモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の同定されている特徴を持つ該モノクローナル抗体のフラグメントに対して特異的に結合する抗原を発現するヒト腫瘍を哺乳類において処置することによって、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法であって、前記哺乳類に対して前記モノクローナル抗体を、前記哺乳類の全身腫瘍組織量を減少させるのに有効な量で投与するステップを含み、それによって疾患進行の遅延および／または生存の延長がおこなわれる、生存の延長および／または疾患進行の遅延をおこなう方法。
【請求項３８】
前記抗体が細胞障害性部分と接合している、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記細胞障害性部分が放射同位元素である、請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記抗体が補体を活性化させる、請求項３７の方法。
【請求項４１】
前記抗体が抗体依存型細胞障害性を媒介する、請求項３７の方法。
【請求項４２】
前記抗体がマウス抗体である、請求項３７の方法。
【請求項４３】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項３７の方法。
【請求項４４】
前記抗体がキメラ化抗体である、請求項３７の方法。
【請求項４５】
受託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる、単離モノクローン抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４６】
前記単離モノクローン抗体またはその結合フラグメントがヒト化されている、請求項４５の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４７】
細胞障害性部分、酵素、放射性化合物、および造血性細胞からなる群から選択されるメンバーと接合する、請求項４５の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４８】
前記単離抗体または抗原結合フラグメントがキメラ化抗体である、請求項４５の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項４９】
前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがマウス抗体である、請求項４５の単離抗体または抗原結合フラグメント。
【請求項５０】
受託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託された、単離クローン。
【請求項５１】
ヒト腫瘍から選択された組織試料での癌細胞の存在を決定するための結合アッセイであって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、それによって前記組織試料内の前記癌細胞の存在を示す、結合アッセイ。
【請求項５２】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項５１の結合アッセイ。
【請求項５３】
ヒト腫瘍から選択されたヒト組織内の癌細胞を単離またはスクリーニングする方法であって、前記ヒト腫瘍から組織試料を提供するステップと、受託番号ＰＴＡ−５６４３としてＡＴＣＣに寄託されたクローンによってコードされる単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供するステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを前記組織試料と接触させるステップと、前記単離モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと前記組織試料との結合を測定するステップと、を含み、前記結合によって前記癌細胞が単離され、前記組織試料内での前記癌細胞の存在が確認される、単離またはスクリーニング方法。
【請求項５４】
前記ヒト腫瘍組織試料を、大腸、卵巣、肺、および乳房組織から選択される組織由来の腫瘍から得る、請求項５３の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【公表番号】特表２００７−５２３８３４（Ｐ２００７−５２３８３４Ａ）
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５００４３４（Ｐ２００６−５００４３４）
【出願日】平成１６年１月２１日（２００４．１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／００００５９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６５４２２
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【出願人】（５０４２３６５９２）アリアス リサーチ、インコーポレイテッド (28)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月２１日（２００４．１．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００４／００００５９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６５４２２
【国際公開日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【出願人】（５０４２３６５９２）アリアス リサーチ、インコーポレイテッド (28)
【Ｆターム（参考）】
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