細胞分離装置およびコラゲナーゼ除去方法
【課題】生体由来細胞へ与える損傷を抑えながらコラゲナーゼを確実に除去し、健全な生体由来細胞の回収率を向上させる装置と方法の提供。
【解決手段】生体由来細胞Ｂを含有する生体組織ＡをコラゲナーゼＤを含む酵素溶液で分解して得られた分解溶液を内部に収容する収容体５と、該収容体５内に固定されコラゲナーゼＤを吸着する吸着体４とを備える細胞分離装置１。分解溶液を収容体５内に収容するだけでコラゲナーゼＤが除去され、撹拌および遠心分離による洗浄処理を省くことができる。
【解決手段】生体由来細胞Ｂを含有する生体組織ＡをコラゲナーゼＤを含む酵素溶液で分解して得られた分解溶液を内部に収容する収容体５と、該収容体５内に固定されコラゲナーゼＤを吸着する吸着体４とを備える細胞分離装置１。分解溶液を収容体５内に収容するだけでコラゲナーゼＤが除去され、撹拌および遠心分離による洗浄処理を省くことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置およびコラゲナーゼ除去方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体組織から幹細胞や未分化細胞などの生体由来細胞を分離する装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。分離して得られた生体由来細胞は、例えば、生体内に注入され、再生医療に用いられている。昨今、このような幹細胞が豊富に含まれる生体組織として脂肪組織が注目され、脂肪組織から脂肪由来細胞を抽出する技術の開発が進められている。
【０００３】
脂肪組織内では、繊維状のコラーゲンが網のように結合して脂肪由来細胞を覆うことにより構造が保持されている。したがって、脂肪組織から脂肪由来細胞を分離するためにはコラーゲンの網を分解する必要があり、コラーゲンの分解酵素であるコラゲナーゼの溶液中で脂肪組織の分解処理を行う。その後、洗浄液の注入、撹拌、遠心分離および上清の排出を繰り返して段階的にコラゲナーゼを除去する。この際に、最終生成物内に残留したコラゲナーゼが脂肪由来細胞やこれを用いた治療の効果に影響を及ぼす可能性があるため、コラゲナーゼの残留量が一定の水準以下になるまで脂肪由来細胞を徹底的に洗浄する必要がある。
【０００４】
一方、コラーゲンは一般的に、３本のα鎖と呼ばれるペプチド鎖が螺旋状に巻きつき、各α鎖間で水素結合を形成した３重螺旋構造を有している。α鎖は、「‐（グリシン）‐（アミノ酸Ｘ）‐（アミノ酸Ｙ）‐」のアミノ酸配列が繰り返す一次構造を有している。また、コラーゲンは動物の皮の真皮を構成しており、動物から採取した皮を革製品に加工するときは、皮をなめしてコラーゲン同士を化学的に架橋し、構造を強固にしてから使用される（例えば、特許文献２参照。）。また、皮をなめすため、蛋白質と強く結合する性質を有するタンニンが古くから使用されている。
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５２４３９６号公報
【特許文献２】特開２００５−２３９７０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、洗浄液内での懸濁と遠心分離とを繰り返すことにより脂肪由来細胞が損傷を受け、増殖能が低下したり死滅したりする。その結果、最終的に得られる健全な脂肪由来細胞の数が減少して脂肪由来細胞の回収効率が向上せず、一度の処理で十分な数の脂肪由来細胞を得るのが難しいという問題がある。また、体内から採取できる脂肪組織の量は限られているため、可能な限り回収率を向上させたいという要求がある。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体由来細胞へ与える損傷を抑えながらコラゲナーゼを確実に除去し、健全な生体由来細胞の回収率を向上させることができる細胞分離装置およびコラゲナーゼ除去方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体由来細胞を含有する生体組織をコラゲナーゼを含む酵素溶液で分解して得られた分解溶液を内部に収容する収容体と、該収容体内に固定され前記コラゲナーゼを吸着する吸着体とを備える細胞分離装置を提供する。
【０００９】
本発明によれば、分解溶液が収容体内に収容されると、分解溶液内に含まれるコラゲナーゼが吸着体によって吸着される。すなわち、分解溶液を収容体内に収容させるだけで分解溶液内からコラゲナーゼが除去されるので、収容体内に収容された分解溶液を回収することにより、コラゲナーゼを除去するために従来行われている懸濁および遠心分離による洗浄処理を省くことが可能となる。
【００１０】
これにより、生体由来細胞への損傷を低減しながらコラゲナーゼを除去し、健全な生体由来細胞の回収率を向上させることができる。
また、収容体として、従来の細胞分離装置で用いられている容器や送液管路などを用いることにより、新たにコラゲナーゼ除去用の容器等の追加が不要となる。
【００１１】
上記発明にいては、前記吸着体が、前記コラゲナーゼの基質であるペプチドまたはタンパク質が互いに架橋されて形成されている改変ペプチドまたは改変タンパク質からなることとしてもよい。
このようにすることで、コラゲナーゼは、改変ペプチドまたは改変タンパク質を基質として認識して結合し、これらと複合体を形成する。しかし、改変ペプチドまたは改変タンパク質は、互いに架橋されているためコラゲナーゼによって分解されず、その結果、コラゲナーゼは改変ペプチドまたは改変タンパク質と解離せずに複合体を形成したまま吸着体に捕捉される。
【００１２】
このように、コラゲナーゼの基質を用いることにより、吸着体を分解溶液内のコラゲナーゼのみに特異的に作用させ、生体由来細胞への影響を抑えながらコラゲナーゼのみを除去することが可能になる。
【００１３】
上記発明においては、前記ペプチドが、３重螺旋構造のコラーゲンを構成しているα鎖であることとしてもよい。
このようにすることで、コラゲナーゼがコラーゲンに結合するが、コラーゲンは分子内でα鎖同士が架橋されているため分解されず、コラゲナーゼはコラーゲンによって捕捉される。これにより、分解溶液内のコラゲナーゼのみを特異的に除去することができる。また、コラーゲンは、細胞の増殖能やその他の機能を維持させるため従来細胞培養等に用いられており、生体への安全性も確認されている。したがって、処理過程による生体由来細胞への損傷や機能の低下などをさらに抑える効果が期待でき、また、生体由来細胞の安全性も確保できる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記タンパク質または前記ペプチドが、植物から抽出された植物タンニンによって架橋されていることとしてもよい。
植物タンニンは、植物の組織中に存在しているポリフェノールの一種であり、生体への安全性が高い。また、植物タンニンは従来皮のなめし剤として用いられ、ペプチドおよびタンパク質を互いに架橋して強固な構造を形成することが知られている。したがって、天然の植物タンニンを用いることにより、生体由来細胞のより高い安全性を確保しながら、コラゲナーゼによって分解されない改変ペプチドまたは改変タンパク質を形成させることができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記改変ペプチドまたは前記改変タンパク質が、前記収容体の内壁を、固相を形成して覆っていることとしてもよい。
このようにすることで、改変ペプチドまたは改変タンパク質を簡易に収容体に設けることができ、また、分解溶液と改変ペプチドまたは改変タンパク質との接触面積を広く確保され、効率良くコラゲナーゼを除去することができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記生体組織が、生体から採取された脂肪組織であり、前記生体由来細胞が、前記脂肪組織に内包されている脂肪由来細胞であることとしてもよい。
このようにすることで、コラゲナーゼにより脂肪組織から分離された脂肪由来細胞の洗浄工程を省くことが可能となり、健全な脂肪由来細胞の回収率を向上させることができる。
【００１７】
また、本発明は、生体由来細胞を含有する生体組織をコラゲナーゼにより分解して得られた分解溶液を、前記コラゲナーゼを吸着する吸着分子に接触させる接触ステップを備えるコラゲナーゼ除去方法を提供する。
【００１８】
本発明によれば、接触ステップを行うことにより、分解溶液内のコラゲナーゼが吸着分子に吸着され、コラゲナーゼが除去された分解溶液を得ることができる。これにより、懸濁および遠心分離による洗浄が不要になり、あるいは、その回数を減らすことが可能となり、生体由来細胞が受ける損傷を低減して、健全な生体由来細胞の回収率を向上させることができる。
【００１９】
上記発明においては、前記吸着分子が、前記コラゲナーゼの基質であるペプチドまたはタンパク質が互いに架橋されて形成されている改変ペプチドまたは改変タンパク質であることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記ペプチドが、３重螺旋構造のコラーゲンを構成しているα鎖であることとしてもよい。
【００２０】
また、上記発明においては、前記ペプチドまたは前記タンパク質が、植物から抽出された植物タンニンにより架橋されていることとしもよい。
また、上記発明においては、前記生体組織が、生体から採取された脂肪組織であり、前記生体由来細胞が、前記脂肪組織に内包されている脂肪由来細胞であることとしてもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、生体由来細胞へ与える損傷を抑えながらコラゲナーゼを確実に除去し、健全な生体由来細胞の回収率を向上させることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の一実施形態に係る細胞分離装置１について、図１〜図２を参照して以下に説明する。なお、本実施形態においては、脂肪組織Ａから脂肪由来細胞Ｂを分離する工程を例に挙げて説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、図１に示されるように、脂肪組織Ａを分解処理する分解処理部２と、細胞懸濁懸を遠心分離して濃縮する濃縮部３と、分解処理部２および濃縮部３に接続され、内壁が改変コラーゲン（改変ペプチド、改変タンパク質）Ｃの層（吸着体）４で覆われたチューブ（収容体）５と、該チューブ５内の液体に送りをかけるチューブポンプ６とを備えている。
【００２３】
分解処理部２は、生体から吸引などの方法により採取された脂肪組織Ａと、該脂肪組織Ａを分解するコラゲナーゼＤが含まれた酵素溶液とを収容する処理容器２ａを備えている。処理容器２ａ内で脂肪組織Ａと酵素溶液が撹拌されると、脂肪組織Ａに含まれるコラーゲンが分解されて脂肪組織Ａに内包されていた脂肪由来細胞Ｂが開放され、コラゲナーゼＤ、分解組織および脂肪由来細胞Ｂを含む分解溶液となる。分解溶液は静置されて、脂肪組織Ａが分解されて生じた脂肪分を含む上層と、脂肪由来細胞Ｂを含む下層とに層分離された後、下層の分解溶液のみ、つまり脂肪由来細胞Ｂの細胞懸濁液が処理容器２ａの底面に設けられた排出口２ｂからチューブ５内へ排出される。
【００２４】
濃縮部３は、遠心分離機３ａと、該遠心分離機３ａに装着された遠心分離容器３ｂとを備えている。処理容器２ａ内から送られてきた細胞懸濁液は、遠心分離容器３ｂ内に収容されて遠心分離機３ａで遠心分離され、脂肪由来細胞Ｂの細胞塊と上清とに分離される。
【００２５】
チューブ５の内壁５ａは、合成により得られた合成α鎖（ペプチド）を植物タンニンにより架橋した改変コラーゲンＣの層４によって覆われている。
合成α鎖は、例えば、「‐（グリシン）‐（プロリン）‐（リジン）‐」の３つのアミノ酸配列を２０〜５０回繰り返して合成する。そして、合成α鎖の溶液中に植物タンニンを添加して、合成α鎖同士が植物タンニンで架橋された改変コラーゲンＣを合成する。
【００２６】
改変コラーゲンＣは、物理的吸着、または、架橋剤によりチューブ５の内壁５ａに固相化される。物理的吸着の場合、改変コラーゲンＣの溶液をチューブ５内に満たして静置した後、洗浄液によりチューブ５内を洗浄して改変コラーゲンＣを固相化する。架橋剤を用いる場合、例えば、シリコーン製やプラスチック製のチューブ５の内壁５ａをアミノシラン処理してアミノ基を生成し、チューブ５内に植物タンニンを添加した改変コラーゲンＣ溶液を満たす。改変コラーゲンＣは、植物タンニンを介して内壁５ａ表面のアミノ基と架橋され、また、改変コラーゲンＣ同士がタンニンにより架橋されてチューブ内壁５ａに固相化される。
【００２７】
細胞懸濁液がチューブ５内を通過すると、図２に示されるように、コラゲナーゼＤが改変コラーゲンＣを基質として認識して結合し、改変コラーゲンＣとの複合体を形成する。改変コラーゲンＣは各合成α鎖が架橋されていてコラゲナーゼＤによって分解されないため、コラゲナーゼＤは改変コラーゲンＣから解離せずに複合体の状態でチューブ５の内壁５ａの改変コラーゲンＣの層４において捕捉されるようになっている。
【００２８】
このように構成された細胞分離装置１を用いて脂肪組織Ａから脂肪由来細胞Ｂ分離するには、図３に示されるように、処理容器２ａ内で脂肪組織Ａを攪拌して分解処理する（ステップＳ１）。続いて、チューブポンプ６が作動すると処理容器２ａ内の細胞懸濁液がチューブ５内に排出され、チューブ５内の改変コラーゲンＣの層４に接触させられながら遠心分離容器３ｂ内へ送液される（接触ステップ、ステップＳ２）。そして、コラゲナーゼＤが除去された細胞懸濁液を遠心分離すると（ステップＳ３）、脂肪組織Ａから分離されたコラゲナーゼＤを含まない脂肪由来細胞Ｂの細胞塊が得られる。
なお、本発明に係るコラゲナーゼ除去方法は、上記のステップＳ２である。
【００２９】
このように、本実施形態によれば、細胞分離装置１の細胞懸濁液と接触する位置に固相化された改変コラーゲンＣを設けておくだけで、細胞懸濁液内のコラゲナーゼＤが除去され、遠心分離容器３ｂ内には、コラゲナーゼＤを含まない細胞懸濁液が送液される。すなわち、撹拌と遠心分離による洗浄処理を省く、または、その回数を大幅に減らすことができる。
【００３０】
これにより、脂肪由来細胞Ｂへ与える損傷を大幅に低減して健全な脂肪由来細胞Ｂの回収率を向上させ、容易に所望の量の脂肪由来細胞Ｂを得ることができるという利点がある。また、チューブ５内に、コラゲナーゼＤを吸着させる吸着体として改変コラーゲンＣの層４を設けることにより、従来の細胞分離装置に新たな構成の追加が不要となるという利点がある。
【００３１】
さらに、チューブ５をコイル状に巻いて流路を延長してコラゲナーゼＤと改変コラーゲンＣとの接触面積を増大し、図示しないヒータなどの加温手段によりチューブ５内を約３７度に加温することにより、コラゲナーゼＤの改変コラーゲンＣとの結合を促進してより確実にコラゲナーゼＤを除去することができる。
また、従来ディスポーザブルで使用されているチューブ５内に吸着体を設けることにより、チューブ５のみを改変コラーゲンＣの保管に適した環境で保存することが可能である。また、コラゲナーゼＤの吸着効率が低下しても容易に新しいものへ交換でき、コラゲナーゼＤの除去効率のばらつき等を防ぐことができる。
【００３２】
また、吸着体として、従来細胞培養等で用いられている固相化されたコラーゲンを採用し、さらに、改変コラーゲンＣの合成と固相化において、生体親和性の高い植物由来の植物タンニンを架橋剤として用いることにより、脂肪由来細胞Ｂのより高い安全を確保することができる。
【００３３】
また、改変コラーゲンＣは、コラゲナーゼＤが基質として認識する認識部位の構造が保持されていればよく、その生体機能の維持は不要である。また、改変コラーゲンＣを互いに架橋することにより構造が強固になり、温度変化や水流などの外的な影響を受けにくくなる。これにより、コラゲナーゼＤを吸着させる分子として抗体などの生体活性の維持が必要なものを用いる場合と比較して、使用や管理が大幅に容易なるという利点がある。また、構造が明らかで様々な用途で広く用いられているコラーゲンを用いることにより、簡易にかつ安価に吸着体を設けることができる。
【００３４】
なお、上記実施形態においては、吸着体として固相化された改変コラーゲンＣの層４をチューブ５の内壁５ａに設けることとしたが、吸着体はコラゲナーゼＤを含む分解溶液または細胞懸濁液が接触する位置に固定されていればよい。例えば、処理容器２ａまたは遠心分離容器３ｂの内壁が改変コラーゲンＣでコートされていてもよい。
【００３５】
また、吸着体として、改変コラーゲンＣが表面に結合された担体や、シート状に形成された改変コラーゲンＣ等を用い、これらが充填されたカラムや内部に配置された流路などをチューブ５の途中位置に配置することとしてもよい。さらに、改変コラーゲンＣは、各α鎖が架橋されていればよく、例えば、なめし処理を施した革を用いても同様の効果を得ることができる。
【００３６】
また、上記実施形態においては、コラゲナーゼＤを捕捉させるために改変コラーゲンＣを用いることとしたが、コラゲナーゼＤの基質として一般に知られているゼラチンやフィブロネクチンを架橋した改変ゼラチンや改変フィブロネクチンなどでも、改変コラーゲンＣと同様の効果が期待できる。
【００３７】
また、上記のような改変タンパク質や改変ペプチドの他に、コラゲナーゼＤに対する抗体を用いてもよい。また、生体分子を特異的に標識するために従来用いられている方法を用いてもよく、例えば、プロテインＡやビオチンなどが固相化された吸着体と、抗体と結合したコラゲナーゼまたはアビジンで標識されたコラゲナーゼとを使用しても、コラゲナーゼＤを特異的かつ高効率で吸着して除去することができる。
【００３８】
また、上記実施形態においては、植物タンニンによって合成α鎖同士を架橋することとしたが、これに代えて、化学架橋剤で架橋することとしてもよい。
また、上記実施形態においては、植物タンニンによってチューブ内壁に改変コラーゲンを固相化することとしたが、これに代えて、化学架橋剤で固相化してもよい。
例えば、本実施形態の場合、リジン残基同士を架橋するために一般的に用いられる化学架橋剤、具体的には、ＤＳＳ（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）リンカー等が用いられる。
【００３９】
また、上記実施形態においては、合成α鎖を構成する繰り返しアミノ酸配列として、「‐（グリシン）‐（プロリン）‐（リジン）」を用いたが、コラゲナーゼが基質として認識可能なアミノ酸配列であればよい。例えば、合成α鎖が、一般的にコラーゲンを構成するアミノ酸であるヒドロキシプロリンやアラニン等を含んでいてもよい。
【００４０】
また、上記実施形態において、脂肪由来細胞Ｂには、血管内皮細胞、繊維芽細胞、造血幹細胞、血球系の細胞、脂肪由来の幹細胞などが含まれる。ここで、幹細胞は、細胞治療などの目的で脂肪組織から採取される細胞であり、多分化能、自己再生能を有する細胞を指す。また、脂肪組織Ａとして、ヒト由来の皮下脂肪組織、内臓脂肪組織、白色脂肪組織、褐色脂肪組織等でよく、ヒト等の脂肪部位をハサミ等の鋭利な器具で採取されたものなどであってもよい。
【００４１】
また、上記実施形態においては、脂肪組織から脂肪由来細胞を分離する処理過程を一例に挙げて説明したが、脂肪組織以外の他の生体組織、例えば、上皮組織や軟骨組織、臓器から採取した組織などでもよく、生体組織の分解にコラゲナーゼが用いられる場合であれば適用可能である。
【００４２】
本発明のコラゲナーゼ除去方法の実施例について、以下に説明する。
[実施例１]
「‐（グリシン）‐（プロリン）‐（リジン）‐」の繰り返しアミノ酸配列が２０〜５０回繰り返す人工α鎖を化学合成した。該人工α鎖の溶液中に植物タンニンを添加して人工α鎖同士を架橋し、本実施例に係る改変コラーゲンを合成した。
【００４３】
アミノシラン処理し内壁表面にアミノ基を有するプラスチック容器を作製した。該プラスチック容器内に改変コラーゲン溶液を収容して植物タンニンを添加し、改変コラーゲンの未反応のリジン残基とアミノ基とを植物タンニンにより架橋して、プラスチック容器の内壁に固相化された改変コラーゲンの層を形成した。
このようにして作製されたプラスチック容器、および、比較例として未処理のプラスチック容器の内部にそれぞれコラゲナーゼ溶液を貯留して３０分間室温で静置した。
【００４４】
静置後、各容器内の反応溶液を限外濾過フィルタ（ミリポア社製、５０ｋＤａ）に移して遠心分離により濃縮し、各反応溶液内に含まれる成分をＳＤＳ ＰＡＧＥにより調べた。比較例の反応溶液からはコラゲナーゼのバンドが検出されたのに対し、本実施例の反応溶液からはコラゲナーゼのバンドが検出されなかった。
以上の結果から、溶液中のコラゲナーゼが改変コラーゲンによって吸着され、溶液中から除去されることが確認された。
【００４５】
[実施例２]
約３ｃｍ×３ｃｍの大きさのなめし処理された革の表面を紙やすりでこすって毛羽立たせ、革の表面積を増大させた。このように処理された革を、容器内に収容された１０ｍｌの０．１μｇ／ｍｌコラゲナーゼ／ＰＢＳ溶液に浸漬させて１０分間静置した。本実施例の比較例として、革を入れない０．１μｇ／ｍｌコラゲナーゼ／ＰＢＳ溶液を用意した。
【００４６】
静置後、本実施例と比較例の各容器内の溶液に含まれる成分をＳＤＳ ＰＡＧＥで調べた。比較例の溶液からはコラゲナーゼのバンドが検出されたのに対し、革と反応させた溶液からはコラゲナーゼのバンドが検出されなかった。
以上の結果から、溶液中のコラゲナーゼが革によって吸着され、溶液内から除去されることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置の全体構成を示す図である。
【図２】図１の細胞分離装置のチューブ内において、改変コラーゲンの層によってコラゲナーゼが除去される作用を説明する図である。
【図３】図１の細胞分離装置を用いた細胞分離方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００４８】
１ 細胞分離装置
２ 分解処理部
２ａ 処理容器
２ｂ 排出口
３ 濃縮部
３ａ 遠心分離機
３ｂ 遠心分離容器
４ 改変コラーゲンの層（吸着体）
５ チューブ（収容体）
６ チューブポンプ
Ａ 脂肪組織（生体組織）
Ｂ 脂肪由来細胞（生体由来細胞）
Ｃ 改変コラーゲン（改変ペプチド、改変タンパク質）
Ｄ コラゲナーゼ
Ｓ２ 接触ステップ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞分離装置およびコラゲナーゼ除去方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、生体組織から幹細胞や未分化細胞などの生体由来細胞を分離する装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。分離して得られた生体由来細胞は、例えば、生体内に注入され、再生医療に用いられている。昨今、このような幹細胞が豊富に含まれる生体組織として脂肪組織が注目され、脂肪組織から脂肪由来細胞を抽出する技術の開発が進められている。
【０００３】
脂肪組織内では、繊維状のコラーゲンが網のように結合して脂肪由来細胞を覆うことにより構造が保持されている。したがって、脂肪組織から脂肪由来細胞を分離するためにはコラーゲンの網を分解する必要があり、コラーゲンの分解酵素であるコラゲナーゼの溶液中で脂肪組織の分解処理を行う。その後、洗浄液の注入、撹拌、遠心分離および上清の排出を繰り返して段階的にコラゲナーゼを除去する。この際に、最終生成物内に残留したコラゲナーゼが脂肪由来細胞やこれを用いた治療の効果に影響を及ぼす可能性があるため、コラゲナーゼの残留量が一定の水準以下になるまで脂肪由来細胞を徹底的に洗浄する必要がある。
【０００４】
一方、コラーゲンは一般的に、３本のα鎖と呼ばれるペプチド鎖が螺旋状に巻きつき、各α鎖間で水素結合を形成した３重螺旋構造を有している。α鎖は、「‐（グリシン）‐（アミノ酸Ｘ）‐（アミノ酸Ｙ）‐」のアミノ酸配列が繰り返す一次構造を有している。また、コラーゲンは動物の皮の真皮を構成しており、動物から採取した皮を革製品に加工するときは、皮をなめしてコラーゲン同士を化学的に架橋し、構造を強固にしてから使用される（例えば、特許文献２参照。）。また、皮をなめすため、蛋白質と強く結合する性質を有するタンニンが古くから使用されている。
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５２４３９６号公報
【特許文献２】特開２００５−２３９７０６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、洗浄液内での懸濁と遠心分離とを繰り返すことにより脂肪由来細胞が損傷を受け、増殖能が低下したり死滅したりする。その結果、最終的に得られる健全な脂肪由来細胞の数が減少して脂肪由来細胞の回収効率が向上せず、一度の処理で十分な数の脂肪由来細胞を得るのが難しいという問題がある。また、体内から採取できる脂肪組織の量は限られているため、可能な限り回収率を向上させたいという要求がある。
【０００７】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、生体由来細胞へ与える損傷を抑えながらコラゲナーゼを確実に除去し、健全な生体由来細胞の回収率を向上させることができる細胞分離装置およびコラゲナーゼ除去方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生体由来細胞を含有する生体組織をコラゲナーゼを含む酵素溶液で分解して得られた分解溶液を内部に収容する収容体と、該収容体内に固定され前記コラゲナーゼを吸着する吸着体とを備える細胞分離装置を提供する。
【０００９】
本発明によれば、分解溶液が収容体内に収容されると、分解溶液内に含まれるコラゲナーゼが吸着体によって吸着される。すなわち、分解溶液を収容体内に収容させるだけで分解溶液内からコラゲナーゼが除去されるので、収容体内に収容された分解溶液を回収することにより、コラゲナーゼを除去するために従来行われている懸濁および遠心分離による洗浄処理を省くことが可能となる。
【００１０】
これにより、生体由来細胞への損傷を低減しながらコラゲナーゼを除去し、健全な生体由来細胞の回収率を向上させることができる。
また、収容体として、従来の細胞分離装置で用いられている容器や送液管路などを用いることにより、新たにコラゲナーゼ除去用の容器等の追加が不要となる。
【００１１】
上記発明にいては、前記吸着体が、前記コラゲナーゼの基質であるペプチドまたはタンパク質が互いに架橋されて形成されている改変ペプチドまたは改変タンパク質からなることとしてもよい。
このようにすることで、コラゲナーゼは、改変ペプチドまたは改変タンパク質を基質として認識して結合し、これらと複合体を形成する。しかし、改変ペプチドまたは改変タンパク質は、互いに架橋されているためコラゲナーゼによって分解されず、その結果、コラゲナーゼは改変ペプチドまたは改変タンパク質と解離せずに複合体を形成したまま吸着体に捕捉される。
【００１２】
このように、コラゲナーゼの基質を用いることにより、吸着体を分解溶液内のコラゲナーゼのみに特異的に作用させ、生体由来細胞への影響を抑えながらコラゲナーゼのみを除去することが可能になる。
【００１３】
上記発明においては、前記ペプチドが、３重螺旋構造のコラーゲンを構成しているα鎖であることとしてもよい。
このようにすることで、コラゲナーゼがコラーゲンに結合するが、コラーゲンは分子内でα鎖同士が架橋されているため分解されず、コラゲナーゼはコラーゲンによって捕捉される。これにより、分解溶液内のコラゲナーゼのみを特異的に除去することができる。また、コラーゲンは、細胞の増殖能やその他の機能を維持させるため従来細胞培養等に用いられており、生体への安全性も確認されている。したがって、処理過程による生体由来細胞への損傷や機能の低下などをさらに抑える効果が期待でき、また、生体由来細胞の安全性も確保できる。
【００１４】
また、上記発明においては、前記タンパク質または前記ペプチドが、植物から抽出された植物タンニンによって架橋されていることとしてもよい。
植物タンニンは、植物の組織中に存在しているポリフェノールの一種であり、生体への安全性が高い。また、植物タンニンは従来皮のなめし剤として用いられ、ペプチドおよびタンパク質を互いに架橋して強固な構造を形成することが知られている。したがって、天然の植物タンニンを用いることにより、生体由来細胞のより高い安全性を確保しながら、コラゲナーゼによって分解されない改変ペプチドまたは改変タンパク質を形成させることができる。
【００１５】
また、上記発明においては、前記改変ペプチドまたは前記改変タンパク質が、前記収容体の内壁を、固相を形成して覆っていることとしてもよい。
このようにすることで、改変ペプチドまたは改変タンパク質を簡易に収容体に設けることができ、また、分解溶液と改変ペプチドまたは改変タンパク質との接触面積を広く確保され、効率良くコラゲナーゼを除去することができる。
【００１６】
また、上記発明においては、前記生体組織が、生体から採取された脂肪組織であり、前記生体由来細胞が、前記脂肪組織に内包されている脂肪由来細胞であることとしてもよい。
このようにすることで、コラゲナーゼにより脂肪組織から分離された脂肪由来細胞の洗浄工程を省くことが可能となり、健全な脂肪由来細胞の回収率を向上させることができる。
【００１７】
また、本発明は、生体由来細胞を含有する生体組織をコラゲナーゼにより分解して得られた分解溶液を、前記コラゲナーゼを吸着する吸着分子に接触させる接触ステップを備えるコラゲナーゼ除去方法を提供する。
【００１８】
本発明によれば、接触ステップを行うことにより、分解溶液内のコラゲナーゼが吸着分子に吸着され、コラゲナーゼが除去された分解溶液を得ることができる。これにより、懸濁および遠心分離による洗浄が不要になり、あるいは、その回数を減らすことが可能となり、生体由来細胞が受ける損傷を低減して、健全な生体由来細胞の回収率を向上させることができる。
【００１９】
上記発明においては、前記吸着分子が、前記コラゲナーゼの基質であるペプチドまたはタンパク質が互いに架橋されて形成されている改変ペプチドまたは改変タンパク質であることとしてもよい。
また、上記発明においては、前記ペプチドが、３重螺旋構造のコラーゲンを構成しているα鎖であることとしてもよい。
【００２０】
また、上記発明においては、前記ペプチドまたは前記タンパク質が、植物から抽出された植物タンニンにより架橋されていることとしもよい。
また、上記発明においては、前記生体組織が、生体から採取された脂肪組織であり、前記生体由来細胞が、前記脂肪組織に内包されている脂肪由来細胞であることとしてもよい。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、生体由来細胞へ与える損傷を抑えながらコラゲナーゼを確実に除去し、健全な生体由来細胞の回収率を向上させることができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明の一実施形態に係る細胞分離装置１について、図１〜図２を参照して以下に説明する。なお、本実施形態においては、脂肪組織Ａから脂肪由来細胞Ｂを分離する工程を例に挙げて説明する。
本実施形態に係る細胞分離装置１は、図１に示されるように、脂肪組織Ａを分解処理する分解処理部２と、細胞懸濁懸を遠心分離して濃縮する濃縮部３と、分解処理部２および濃縮部３に接続され、内壁が改変コラーゲン（改変ペプチド、改変タンパク質）Ｃの層（吸着体）４で覆われたチューブ（収容体）５と、該チューブ５内の液体に送りをかけるチューブポンプ６とを備えている。
【００２３】
分解処理部２は、生体から吸引などの方法により採取された脂肪組織Ａと、該脂肪組織Ａを分解するコラゲナーゼＤが含まれた酵素溶液とを収容する処理容器２ａを備えている。処理容器２ａ内で脂肪組織Ａと酵素溶液が撹拌されると、脂肪組織Ａに含まれるコラーゲンが分解されて脂肪組織Ａに内包されていた脂肪由来細胞Ｂが開放され、コラゲナーゼＤ、分解組織および脂肪由来細胞Ｂを含む分解溶液となる。分解溶液は静置されて、脂肪組織Ａが分解されて生じた脂肪分を含む上層と、脂肪由来細胞Ｂを含む下層とに層分離された後、下層の分解溶液のみ、つまり脂肪由来細胞Ｂの細胞懸濁液が処理容器２ａの底面に設けられた排出口２ｂからチューブ５内へ排出される。
【００２４】
濃縮部３は、遠心分離機３ａと、該遠心分離機３ａに装着された遠心分離容器３ｂとを備えている。処理容器２ａ内から送られてきた細胞懸濁液は、遠心分離容器３ｂ内に収容されて遠心分離機３ａで遠心分離され、脂肪由来細胞Ｂの細胞塊と上清とに分離される。
【００２５】
チューブ５の内壁５ａは、合成により得られた合成α鎖（ペプチド）を植物タンニンにより架橋した改変コラーゲンＣの層４によって覆われている。
合成α鎖は、例えば、「‐（グリシン）‐（プロリン）‐（リジン）‐」の３つのアミノ酸配列を２０〜５０回繰り返して合成する。そして、合成α鎖の溶液中に植物タンニンを添加して、合成α鎖同士が植物タンニンで架橋された改変コラーゲンＣを合成する。
【００２６】
改変コラーゲンＣは、物理的吸着、または、架橋剤によりチューブ５の内壁５ａに固相化される。物理的吸着の場合、改変コラーゲンＣの溶液をチューブ５内に満たして静置した後、洗浄液によりチューブ５内を洗浄して改変コラーゲンＣを固相化する。架橋剤を用いる場合、例えば、シリコーン製やプラスチック製のチューブ５の内壁５ａをアミノシラン処理してアミノ基を生成し、チューブ５内に植物タンニンを添加した改変コラーゲンＣ溶液を満たす。改変コラーゲンＣは、植物タンニンを介して内壁５ａ表面のアミノ基と架橋され、また、改変コラーゲンＣ同士がタンニンにより架橋されてチューブ内壁５ａに固相化される。
【００２７】
細胞懸濁液がチューブ５内を通過すると、図２に示されるように、コラゲナーゼＤが改変コラーゲンＣを基質として認識して結合し、改変コラーゲンＣとの複合体を形成する。改変コラーゲンＣは各合成α鎖が架橋されていてコラゲナーゼＤによって分解されないため、コラゲナーゼＤは改変コラーゲンＣから解離せずに複合体の状態でチューブ５の内壁５ａの改変コラーゲンＣの層４において捕捉されるようになっている。
【００２８】
このように構成された細胞分離装置１を用いて脂肪組織Ａから脂肪由来細胞Ｂ分離するには、図３に示されるように、処理容器２ａ内で脂肪組織Ａを攪拌して分解処理する（ステップＳ１）。続いて、チューブポンプ６が作動すると処理容器２ａ内の細胞懸濁液がチューブ５内に排出され、チューブ５内の改変コラーゲンＣの層４に接触させられながら遠心分離容器３ｂ内へ送液される（接触ステップ、ステップＳ２）。そして、コラゲナーゼＤが除去された細胞懸濁液を遠心分離すると（ステップＳ３）、脂肪組織Ａから分離されたコラゲナーゼＤを含まない脂肪由来細胞Ｂの細胞塊が得られる。
なお、本発明に係るコラゲナーゼ除去方法は、上記のステップＳ２である。
【００２９】
このように、本実施形態によれば、細胞分離装置１の細胞懸濁液と接触する位置に固相化された改変コラーゲンＣを設けておくだけで、細胞懸濁液内のコラゲナーゼＤが除去され、遠心分離容器３ｂ内には、コラゲナーゼＤを含まない細胞懸濁液が送液される。すなわち、撹拌と遠心分離による洗浄処理を省く、または、その回数を大幅に減らすことができる。
【００３０】
これにより、脂肪由来細胞Ｂへ与える損傷を大幅に低減して健全な脂肪由来細胞Ｂの回収率を向上させ、容易に所望の量の脂肪由来細胞Ｂを得ることができるという利点がある。また、チューブ５内に、コラゲナーゼＤを吸着させる吸着体として改変コラーゲンＣの層４を設けることにより、従来の細胞分離装置に新たな構成の追加が不要となるという利点がある。
【００３１】
さらに、チューブ５をコイル状に巻いて流路を延長してコラゲナーゼＤと改変コラーゲンＣとの接触面積を増大し、図示しないヒータなどの加温手段によりチューブ５内を約３７度に加温することにより、コラゲナーゼＤの改変コラーゲンＣとの結合を促進してより確実にコラゲナーゼＤを除去することができる。
また、従来ディスポーザブルで使用されているチューブ５内に吸着体を設けることにより、チューブ５のみを改変コラーゲンＣの保管に適した環境で保存することが可能である。また、コラゲナーゼＤの吸着効率が低下しても容易に新しいものへ交換でき、コラゲナーゼＤの除去効率のばらつき等を防ぐことができる。
【００３２】
また、吸着体として、従来細胞培養等で用いられている固相化されたコラーゲンを採用し、さらに、改変コラーゲンＣの合成と固相化において、生体親和性の高い植物由来の植物タンニンを架橋剤として用いることにより、脂肪由来細胞Ｂのより高い安全を確保することができる。
【００３３】
また、改変コラーゲンＣは、コラゲナーゼＤが基質として認識する認識部位の構造が保持されていればよく、その生体機能の維持は不要である。また、改変コラーゲンＣを互いに架橋することにより構造が強固になり、温度変化や水流などの外的な影響を受けにくくなる。これにより、コラゲナーゼＤを吸着させる分子として抗体などの生体活性の維持が必要なものを用いる場合と比較して、使用や管理が大幅に容易なるという利点がある。また、構造が明らかで様々な用途で広く用いられているコラーゲンを用いることにより、簡易にかつ安価に吸着体を設けることができる。
【００３４】
なお、上記実施形態においては、吸着体として固相化された改変コラーゲンＣの層４をチューブ５の内壁５ａに設けることとしたが、吸着体はコラゲナーゼＤを含む分解溶液または細胞懸濁液が接触する位置に固定されていればよい。例えば、処理容器２ａまたは遠心分離容器３ｂの内壁が改変コラーゲンＣでコートされていてもよい。
【００３５】
また、吸着体として、改変コラーゲンＣが表面に結合された担体や、シート状に形成された改変コラーゲンＣ等を用い、これらが充填されたカラムや内部に配置された流路などをチューブ５の途中位置に配置することとしてもよい。さらに、改変コラーゲンＣは、各α鎖が架橋されていればよく、例えば、なめし処理を施した革を用いても同様の効果を得ることができる。
【００３６】
また、上記実施形態においては、コラゲナーゼＤを捕捉させるために改変コラーゲンＣを用いることとしたが、コラゲナーゼＤの基質として一般に知られているゼラチンやフィブロネクチンを架橋した改変ゼラチンや改変フィブロネクチンなどでも、改変コラーゲンＣと同様の効果が期待できる。
【００３７】
また、上記のような改変タンパク質や改変ペプチドの他に、コラゲナーゼＤに対する抗体を用いてもよい。また、生体分子を特異的に標識するために従来用いられている方法を用いてもよく、例えば、プロテインＡやビオチンなどが固相化された吸着体と、抗体と結合したコラゲナーゼまたはアビジンで標識されたコラゲナーゼとを使用しても、コラゲナーゼＤを特異的かつ高効率で吸着して除去することができる。
【００３８】
また、上記実施形態においては、植物タンニンによって合成α鎖同士を架橋することとしたが、これに代えて、化学架橋剤で架橋することとしてもよい。
また、上記実施形態においては、植物タンニンによってチューブ内壁に改変コラーゲンを固相化することとしたが、これに代えて、化学架橋剤で固相化してもよい。
例えば、本実施形態の場合、リジン残基同士を架橋するために一般的に用いられる化学架橋剤、具体的には、ＤＳＳ（Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）リンカー等が用いられる。
【００３９】
また、上記実施形態においては、合成α鎖を構成する繰り返しアミノ酸配列として、「‐（グリシン）‐（プロリン）‐（リジン）」を用いたが、コラゲナーゼが基質として認識可能なアミノ酸配列であればよい。例えば、合成α鎖が、一般的にコラーゲンを構成するアミノ酸であるヒドロキシプロリンやアラニン等を含んでいてもよい。
【００４０】
また、上記実施形態において、脂肪由来細胞Ｂには、血管内皮細胞、繊維芽細胞、造血幹細胞、血球系の細胞、脂肪由来の幹細胞などが含まれる。ここで、幹細胞は、細胞治療などの目的で脂肪組織から採取される細胞であり、多分化能、自己再生能を有する細胞を指す。また、脂肪組織Ａとして、ヒト由来の皮下脂肪組織、内臓脂肪組織、白色脂肪組織、褐色脂肪組織等でよく、ヒト等の脂肪部位をハサミ等の鋭利な器具で採取されたものなどであってもよい。
【００４１】
また、上記実施形態においては、脂肪組織から脂肪由来細胞を分離する処理過程を一例に挙げて説明したが、脂肪組織以外の他の生体組織、例えば、上皮組織や軟骨組織、臓器から採取した組織などでもよく、生体組織の分解にコラゲナーゼが用いられる場合であれば適用可能である。
【００４２】
本発明のコラゲナーゼ除去方法の実施例について、以下に説明する。
[実施例１]
「‐（グリシン）‐（プロリン）‐（リジン）‐」の繰り返しアミノ酸配列が２０〜５０回繰り返す人工α鎖を化学合成した。該人工α鎖の溶液中に植物タンニンを添加して人工α鎖同士を架橋し、本実施例に係る改変コラーゲンを合成した。
【００４３】
アミノシラン処理し内壁表面にアミノ基を有するプラスチック容器を作製した。該プラスチック容器内に改変コラーゲン溶液を収容して植物タンニンを添加し、改変コラーゲンの未反応のリジン残基とアミノ基とを植物タンニンにより架橋して、プラスチック容器の内壁に固相化された改変コラーゲンの層を形成した。
このようにして作製されたプラスチック容器、および、比較例として未処理のプラスチック容器の内部にそれぞれコラゲナーゼ溶液を貯留して３０分間室温で静置した。
【００４４】
静置後、各容器内の反応溶液を限外濾過フィルタ（ミリポア社製、５０ｋＤａ）に移して遠心分離により濃縮し、各反応溶液内に含まれる成分をＳＤＳ ＰＡＧＥにより調べた。比較例の反応溶液からはコラゲナーゼのバンドが検出されたのに対し、本実施例の反応溶液からはコラゲナーゼのバンドが検出されなかった。
以上の結果から、溶液中のコラゲナーゼが改変コラーゲンによって吸着され、溶液中から除去されることが確認された。
【００４５】
[実施例２]
約３ｃｍ×３ｃｍの大きさのなめし処理された革の表面を紙やすりでこすって毛羽立たせ、革の表面積を増大させた。このように処理された革を、容器内に収容された１０ｍｌの０．１μｇ／ｍｌコラゲナーゼ／ＰＢＳ溶液に浸漬させて１０分間静置した。本実施例の比較例として、革を入れない０．１μｇ／ｍｌコラゲナーゼ／ＰＢＳ溶液を用意した。
【００４６】
静置後、本実施例と比較例の各容器内の溶液に含まれる成分をＳＤＳ ＰＡＧＥで調べた。比較例の溶液からはコラゲナーゼのバンドが検出されたのに対し、革と反応させた溶液からはコラゲナーゼのバンドが検出されなかった。
以上の結果から、溶液中のコラゲナーゼが革によって吸着され、溶液内から除去されることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞分離装置の全体構成を示す図である。
【図２】図１の細胞分離装置のチューブ内において、改変コラーゲンの層によってコラゲナーゼが除去される作用を説明する図である。
【図３】図１の細胞分離装置を用いた細胞分離方法を示すフローチャートである。
【符号の説明】
【００４８】
１ 細胞分離装置
２ 分解処理部
２ａ 処理容器
２ｂ 排出口
３ 濃縮部
３ａ 遠心分離機
３ｂ 遠心分離容器
４ 改変コラーゲンの層（吸着体）
５ チューブ（収容体）
６ チューブポンプ
Ａ 脂肪組織（生体組織）
Ｂ 脂肪由来細胞（生体由来細胞）
Ｃ 改変コラーゲン（改変ペプチド、改変タンパク質）
Ｄ コラゲナーゼ
Ｓ２ 接触ステップ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体由来細胞を含有する生体組織をコラゲナーゼを含む酵素溶液で分解して得られた分解溶液を内部に収容する収容体と、
該収容体内に固定され前記コラゲナーゼを吸着する吸着体とを備える細胞分離装置。
【請求項２】
前記吸着体が、前記コラゲナーゼの基質であるペプチドまたはタンパク質が互いに架橋されて形成されている改変ペプチドまたは改変タンパク質からなる請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記ペプチドが、３重螺旋構造のコラーゲンを構成しているα鎖である請求項２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記タンパク質または前記ペプチドが、植物から抽出された植物タンニンによって架橋されている請求項２または請求項３に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
前記改変ペプチドまたは前記改変タンパク質が、前記収容体の内壁を、固相を形成して覆っている請求項２から請求項４のいずれかに記載の細胞分離装置。
【請求項６】
前記生体組織が、生体から採取された脂肪組織であり、
前記生体由来細胞が、前記脂肪組織に内包されている脂肪由来細胞である請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞分離装置。
【請求項７】
生体由来細胞を含有する生体組織をコラゲナーゼにより分解して得られた分解溶液を、前記コラゲナーゼを吸着する吸着分子に接触させる接触ステップを備えるコラゲナーゼ除去方法。
【請求項８】
前記吸着分子が、前記コラゲナーゼの基質であるペプチドまたはタンパク質が互いに架橋されて形成されている改変ペプチドまたは改変タンパク質である請求項７に記載のコラゲナーゼ除去方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、３重螺旋構造のコラーゲンを構成しているα鎖である請求項８に記載のコラゲナーゼ除去方法。
【請求項１０】
前記ペプチドまたは前記タンパク質が、植物から抽出された植物タンニンにより架橋されている請求項８または請求項９に記載のコラゲナーゼ除去方法。
【請求項１１】
前記生体組織が、生体から採取された脂肪組織であり、
前記生体由来細胞が、前記脂肪組織に内包されている脂肪由来細胞である請求項７から請求項１０のいずれかに記載のコラゲナーゼ除去方法。
【請求項１】
生体由来細胞を含有する生体組織をコラゲナーゼを含む酵素溶液で分解して得られた分解溶液を内部に収容する収容体と、
該収容体内に固定され前記コラゲナーゼを吸着する吸着体とを備える細胞分離装置。
【請求項２】
前記吸着体が、前記コラゲナーゼの基質であるペプチドまたはタンパク質が互いに架橋されて形成されている改変ペプチドまたは改変タンパク質からなる請求項１に記載の細胞分離装置。
【請求項３】
前記ペプチドが、３重螺旋構造のコラーゲンを構成しているα鎖である請求項２に記載の細胞分離装置。
【請求項４】
前記タンパク質または前記ペプチドが、植物から抽出された植物タンニンによって架橋されている請求項２または請求項３に記載の細胞分離装置。
【請求項５】
前記改変ペプチドまたは前記改変タンパク質が、前記収容体の内壁を、固相を形成して覆っている請求項２から請求項４のいずれかに記載の細胞分離装置。
【請求項６】
前記生体組織が、生体から採取された脂肪組織であり、
前記生体由来細胞が、前記脂肪組織に内包されている脂肪由来細胞である請求項１から請求項５のいずれかに記載の細胞分離装置。
【請求項７】
生体由来細胞を含有する生体組織をコラゲナーゼにより分解して得られた分解溶液を、前記コラゲナーゼを吸着する吸着分子に接触させる接触ステップを備えるコラゲナーゼ除去方法。
【請求項８】
前記吸着分子が、前記コラゲナーゼの基質であるペプチドまたはタンパク質が互いに架橋されて形成されている改変ペプチドまたは改変タンパク質である請求項７に記載のコラゲナーゼ除去方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、３重螺旋構造のコラーゲンを構成しているα鎖である請求項８に記載のコラゲナーゼ除去方法。
【請求項１０】
前記ペプチドまたは前記タンパク質が、植物から抽出された植物タンニンにより架橋されている請求項８または請求項９に記載のコラゲナーゼ除去方法。
【請求項１１】
前記生体組織が、生体から採取された脂肪組織であり、
前記生体由来細胞が、前記脂肪組織に内包されている脂肪由来細胞である請求項７から請求項１０のいずれかに記載のコラゲナーゼ除去方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１２４８１４（Ｐ２０１０−１２４８１４Ａ）
【公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３０６５４７（Ｐ２００８−３０６５４７）
【出願日】平成２０年１２月１日（２００８．１２．１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１日（２００８．１２．１）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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