細胞表面抗原に対する抗体取得とその抗原同定
【課題】細胞表面抗原に結合する抗体のスクリーニング方法の提供。
【解決手段】次の工程を含む、細胞表面抗原に結合する抗体の取得方法、(1)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画と抗体ライブラリーとを２５℃での比誘電率が８０以上の水性媒体中で接触させる工程、(2)(1)の水性媒体と界面を介して接触する２５℃での比誘電率が２０以下１以上で油性の低極性溶媒とからなる２相系を調製する工程、(3)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を低極性溶媒に移動させる工程、および(4)低極性溶媒に移動した細胞、またはその分画に結合している抗体を、細胞表面抗原に結合する抗体として回収する工程。
【解決手段】次の工程を含む、細胞表面抗原に結合する抗体の取得方法、(1)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画と抗体ライブラリーとを２５℃での比誘電率が８０以上の水性媒体中で接触させる工程、(2)(1)の水性媒体と界面を介して接触する２５℃での比誘電率が２０以下１以上で油性の低極性溶媒とからなる２相系を調製する工程、(3)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を低極性溶媒に移動させる工程、および(4)低極性溶媒に移動した細胞、またはその分画に結合している抗体を、細胞表面抗原に結合する抗体として回収する工程。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、細胞表面抗原に結合する抗体の取得方法、
(1)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画と抗体ライブラリーとを２５℃での比誘電率が８０以上の水性媒体中で接触させる工程、
(2)(1)の水性媒体と界面を介して接触する２５℃での比誘電率が２０以下１以上で油性の低極性溶媒とからなる２相系を調製する工程、
(3)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を低極性溶媒に移動させる工程、および
(4)低極性溶媒に移動した細胞、またはその分画に結合している抗体を、細胞表面抗原に結合する抗体として回収する工程。
【請求項２】
工程(3)と(4)の間に、付加的に次の工程(3-a)から(3-c)を含む、請求項１に記載の方法、
(3-a)(3)において、低極性溶媒に移動された細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を、水性媒体に移動させる工程、
(3-b)(3-a)の水性媒体と界面を介して接触する低極性溶媒とからなる２相系を調製する工程、および
(3-c)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を低極性溶媒に移動させる工程。
【請求項３】
工程(3-a)における水性媒体が、(1)の水性媒体とは異なる水性媒体に接触させる工程である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程(3-b)における低極性溶媒が、(2)の低極性溶媒と共通である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
工程(3-b)における低極性溶媒が、(2)の低極性溶媒と置き換えられた異なる低極性溶媒である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
(3-c)において低極性溶媒に移動された細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を、(3)において低極性溶媒に移動された細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画として、前記工程(3-a)から(3-c)を繰り返すことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記工程(3-a)から(3-c)を、１〜５回繰り返す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程(3-a)から(3-c)を、２〜３回繰り返す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗体ライブラリーが抗体の可変領域を提示したファージライブラリーである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程(4)において回収された抗体を新たな抗体ライブラリーとして工程(1)-(3)を繰り返す工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞の分画が、細胞表面抗原の可溶性分画である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞表面抗原の可溶性分画を次の工程によって得ることを特徴とする請求項１１に記載の方法、
(1) 抗体を取得すべき抗原を発現している細胞を破砕する工程、
(2) 工程(1)の破砕物から細胞膜分画を回収する工程、
(3) 細胞膜分画を界面活性剤混合液によって可溶化する工程、および
(4) 工程(3)の上清を細胞表面抗原の可溶性分画として回収する工程。
【請求項１３】
界面活性剤混合液を構成する界面活性剤が、非イオン性界面活性剤と両性界面活性剤のいずれか、または両方である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非イオン系界面活性剤が、NP-40、Triton X100、n-Dodecyl β-D-maltoside、n-Octyl β-D-glucoside、 n-Octyl β-D-maltopyranoside、およびn-Decyl β-D-maltosideからなる群から選択される少なくとも１つの化合物である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
両性界面活性剤が、Deoxycholic acidである請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞表面抗原の可溶性分画が固相に結合されている請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
固相が磁性粒子である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞が、固相に固定化された細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
固相がガラスビーズである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ガラスビーズがコラーゲン処理されたガラスビーズである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
固相に固定化された細胞が、前記細胞をコラーゲン処理されたガラスビーズとともに培養することによって得られた細胞である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
水性媒体が、不活性蛋白質を添加した細胞培養液または緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
不活性蛋白質がウシ血清アルブミンである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞培養液が、MEM（Minimum EssentialMedium）、 Basal Medium, Eagle（BME）、 Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）、 Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DME）、RPMI-1640 Medium（RPMI1640） 、およびES Medium（ES）からなる群から選択されるいずれかの細胞培養液である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
低極性溶媒が、シクロヘキサンおよびジフェニルエーテルを含む混合溶媒である請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
シクロヘキサンとジフェニルエーテルの１：９の混合溶媒である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
低極性溶媒が、次のａおよびｂに記載の溶媒を含む混合溶媒であり、かつ溶媒密度（d）1.0-1.09を有することを特徴とする請求項１に記載の方法、
ａ：ヘキサン、シクロヘキサン、イソオクタン、およびジイソプロピルエーテルからなる
群から選択される少なくとも１つの溶媒、
ｂ：フタル酸ジブチル、1,1,1-トリクロロエタン、およびジフェニルエーテルからなる群
から選択される少なくとも１つの溶媒。
【請求項２８】
水性媒体として、不活性蛋白質を添加した細胞培養液または緩衝液を組み合わせることを特徴とする請求項２５または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
以下の工程を含む、抗体の可変領域を提示したファージライブラリーから目的とする細胞の表面抗原に結合する活性を有するファージクローンをスクリーニングするための方法において、ファージライブラリーと前記抗原とを２５℃での比誘電率が８０以上の水性媒体中で接触させた後に、２５℃での比誘電率が２０以下１以上で油性の低極性溶媒相に移動させることによって抗原抗体複合体の水素結合を安定化させる工程を含む方法、
(1)抗原抗体反応が可能な条件下でファージライブラリーおよび、目的とする抗原とを接触させる工程、および
(2)前記抗原に結合したファージクローンを回収する工程。
【請求項３０】
前記細胞表面抗原が、細胞、または細胞表面抗原の可溶性分画を固定した固相である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
水性媒体が血清アルブミンを含むミニマムエッセンシャルメディウムである請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
低極性溶媒が以下のa-dからなる群から選択されたいずれかの溶媒である請求項２９に記載の方法、
a.ジフェニルエーテルと1,1,1-トリクロロエタンとヘキサンの混合溶媒、
b.イソプロピルエーテルと1,1,1-トリクロロエタンとヘキサンの混合溶媒、および
c.フタル酸ジブチルとシクロヘキサンの混合溶媒、
d.ジフェニルエーテルとシクロヘキサンの混合溶媒。
【請求項３３】
極性媒体として血清アルブミンを含むミニマムエッセンシャルメディウムを組み合わせることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を保持した固相と抗体ライブラリーを接触させ、細胞表面抗原に結合する抗体を回収する工程を含む、細胞表面抗原に結合する抗体の取得方法において、以下のa)〜c)のいずれかの工程を含む方法であって、抗原マスキング剤と抗体マスキング剤がそれぞれ以下に定義される成分を含み、
抗原マスキング剤：取得を望まない抗体を含む、
抗体マスキング剤：取得を望まない抗体が認識する遊離の抗原を含む、
a) 細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を保持した固相と抗体ライブラリーとが、抗原マスキング剤または抗体マスキング剤のいずれかの共存下で接触させられる、
b)抗体ライブラリーを抗体マスキング剤との接触後に細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を保持した固相と接触させる、または
c)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を保持した固相を抗原マスキ
ング剤と接触後に抗体ライブラリーと接触させる、
更に次の工程を含む、抗体の取得方法、
(1)前記細胞、またはその分画を保持した固相と抗体ライブラリーを含む２５℃での比誘電率が８０以上の水性媒体と、この水性媒体と接触した２５℃での比誘電率が２０以下１以上で油性の低極性溶媒で構成される２相系を調製する工程、
(2)標的抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を保持した固相を低極性溶媒相に移動させる工程、および
(3)低極性溶媒相に移動した細胞、またはその分画を保持した固相に結合している抗体を、細胞表面抗原に結合する抗体として回収する工程。
【請求項３５】
取得を目的とする抗体が認識する抗原が癌細胞の表面抗原であり、取得を望まない抗体が認識する抗原が正常細胞の表面抗原である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
正常細胞と前記癌細胞が由来する組織が共通である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
取得を目的とする抗体が認識する抗原が、特定のステージの癌細胞の表面抗原であり、取得を望まない抗体が認識する抗原が前記ステージとは異なるステージの同種の癌細胞の表面抗原である請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記特定のステージと、特定のステージとは異なるステージのいずれかが、進行癌であり、他方が初期癌である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
取得を望まない抗体が、前記細胞表面抗原に結合する抗体であり、目的とする抗体が、取得を望まない抗体が認識する抗原または抗原決定基とは異なる抗原または抗原決定基に結合する抗体である請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
取得を望まない抗体が、前記細胞表面抗原に結合する結合活性によって予め単離された抗体である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１、または請求項３４のいずれかの方法によって得ることができる抗体またはその可変領域を含む断片。
【請求項４２】
請求項１、または請求項３４のいずれかの方法によって得ることができる抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４３】
次の工程を含む、特定の細胞の表面抗原に結合し、同じ条件で類似の細胞に接触させたときに類似の細胞には結合しない抗体のスクリーニング方法、
(1)請求項１または請求項３４に記載の方法によって選択された抗体を、前記特定の細胞またはその分画を保持した固相、および前記類似の細胞またはその分画を保持した固相に共通の条件下で接触させる工程、および
(2)前記特定の細胞またはその分画を保持した固相に結合し、前記類似の細胞またはその分画を保持した固相に結合しなかった抗体を選択する工程。
【請求項４４】
特定の細胞が癌細胞であり、類似する細胞が当該癌細胞と同じ組織の正常細胞である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
特定の細胞があるステージの癌細胞であり、類似する細胞が別のステージの同種の癌細胞である請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
工程(1)が、前記特定の細胞および前記類似する細胞の細胞固定試料に前記抗体を接触させる工程を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
工程(1)が、前記特定の細胞の抗原分画を保持した固相、および前記類似する細胞の抗原分画を保持した固相に前記抗体を接触させる工程を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞、または細胞の抗原分画を保持した固相に結合した抗体を、その抗体を認識する標識抗体で検出する工程を含む、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体ライブラリーが少なくとも１０9種類の抗体を含む抗体ライブラリーである請求項１または請求項３４に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体ライブラリーが、少なくとも１０10種類の抗体を含む抗体ライブラリーである請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体ライブラリーが、少なくとも１０11種類の抗体を含む抗体ライブラリーである請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
次の工程を含む請求項４１に記載の抗体が結合する抗原の同定方法、
(1)請求項４１に記載の抗体と当該抗体の単離に用いた細胞表面抗原とを接触させる工程、
(2)前記抗体に結合した抗原を回収する工程、および
(3)回収された抗原を同定する工程。
【請求項５３】
付加的に、工程(3)で同定された抗原のアミノ酸配列を決定する工程を含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
抗原を消化し、消化生成物を構成するアミノ酸を同定する工程を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
蛋白質分解酵素によって、抗原を消化する工程を含む請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
蛋白質分解酵素がセリンプロテアーゼである請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
セリンプロテアーゼがトリプシンである請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
消化生成物を構成するアミノ酸を、質量分析によって同定する工程を含む請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
請求項５２に記載の方法によって同定された抗原。
【請求項１】
次の工程を含む、細胞表面抗原に結合する抗体の取得方法、
(1)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画と抗体ライブラリーとを２５℃での比誘電率が８０以上の水性媒体中で接触させる工程、
(2)(1)の水性媒体と界面を介して接触する２５℃での比誘電率が２０以下１以上で油性の低極性溶媒とからなる２相系を調製する工程、
(3)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を低極性溶媒に移動させる工程、および
(4)低極性溶媒に移動した細胞、またはその分画に結合している抗体を、細胞表面抗原に結合する抗体として回収する工程。
【請求項２】
工程(3)と(4)の間に、付加的に次の工程(3-a)から(3-c)を含む、請求項１に記載の方法、
(3-a)(3)において、低極性溶媒に移動された細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を、水性媒体に移動させる工程、
(3-b)(3-a)の水性媒体と界面を介して接触する低極性溶媒とからなる２相系を調製する工程、および
(3-c)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を低極性溶媒に移動させる工程。
【請求項３】
工程(3-a)における水性媒体が、(1)の水性媒体とは異なる水性媒体に接触させる工程である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程(3-b)における低極性溶媒が、(2)の低極性溶媒と共通である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
工程(3-b)における低極性溶媒が、(2)の低極性溶媒と置き換えられた異なる低極性溶媒である請求項２に記載の方法。
【請求項６】
(3-c)において低極性溶媒に移動された細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を、(3)において低極性溶媒に移動された細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画として、前記工程(3-a)から(3-c)を繰り返すことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記工程(3-a)から(3-c)を、１〜５回繰り返す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程(3-a)から(3-c)を、２〜３回繰り返す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗体ライブラリーが抗体の可変領域を提示したファージライブラリーである請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
工程(4)において回収された抗体を新たな抗体ライブラリーとして工程(1)-(3)を繰り返す工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞の分画が、細胞表面抗原の可溶性分画である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
細胞表面抗原の可溶性分画を次の工程によって得ることを特徴とする請求項１１に記載の方法、
(1) 抗体を取得すべき抗原を発現している細胞を破砕する工程、
(2) 工程(1)の破砕物から細胞膜分画を回収する工程、
(3) 細胞膜分画を界面活性剤混合液によって可溶化する工程、および
(4) 工程(3)の上清を細胞表面抗原の可溶性分画として回収する工程。
【請求項１３】
界面活性剤混合液を構成する界面活性剤が、非イオン性界面活性剤と両性界面活性剤のいずれか、または両方である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
非イオン系界面活性剤が、NP-40、Triton X100、n-Dodecyl β-D-maltoside、n-Octyl β-D-glucoside、 n-Octyl β-D-maltopyranoside、およびn-Decyl β-D-maltosideからなる群から選択される少なくとも１つの化合物である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
両性界面活性剤が、Deoxycholic acidである請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
細胞表面抗原の可溶性分画が固相に結合されている請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
固相が磁性粒子である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞が、固相に固定化された細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
固相がガラスビーズである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ガラスビーズがコラーゲン処理されたガラスビーズである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
固相に固定化された細胞が、前記細胞をコラーゲン処理されたガラスビーズとともに培養することによって得られた細胞である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
水性媒体が、不活性蛋白質を添加した細胞培養液または緩衝液である請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
不活性蛋白質がウシ血清アルブミンである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
細胞培養液が、MEM（Minimum EssentialMedium）、 Basal Medium, Eagle（BME）、 Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）、 Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DME）、RPMI-1640 Medium（RPMI1640） 、およびES Medium（ES）からなる群から選択されるいずれかの細胞培養液である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
低極性溶媒が、シクロヘキサンおよびジフェニルエーテルを含む混合溶媒である請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
シクロヘキサンとジフェニルエーテルの１：９の混合溶媒である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
低極性溶媒が、次のａおよびｂに記載の溶媒を含む混合溶媒であり、かつ溶媒密度（d）1.0-1.09を有することを特徴とする請求項１に記載の方法、
ａ：ヘキサン、シクロヘキサン、イソオクタン、およびジイソプロピルエーテルからなる
群から選択される少なくとも１つの溶媒、
ｂ：フタル酸ジブチル、1,1,1-トリクロロエタン、およびジフェニルエーテルからなる群
から選択される少なくとも１つの溶媒。
【請求項２８】
水性媒体として、不活性蛋白質を添加した細胞培養液または緩衝液を組み合わせることを特徴とする請求項２５または請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
以下の工程を含む、抗体の可変領域を提示したファージライブラリーから目的とする細胞の表面抗原に結合する活性を有するファージクローンをスクリーニングするための方法において、ファージライブラリーと前記抗原とを２５℃での比誘電率が８０以上の水性媒体中で接触させた後に、２５℃での比誘電率が２０以下１以上で油性の低極性溶媒相に移動させることによって抗原抗体複合体の水素結合を安定化させる工程を含む方法、
(1)抗原抗体反応が可能な条件下でファージライブラリーおよび、目的とする抗原とを接触させる工程、および
(2)前記抗原に結合したファージクローンを回収する工程。
【請求項３０】
前記細胞表面抗原が、細胞、または細胞表面抗原の可溶性分画を固定した固相である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
水性媒体が血清アルブミンを含むミニマムエッセンシャルメディウムである請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
低極性溶媒が以下のa-dからなる群から選択されたいずれかの溶媒である請求項２９に記載の方法、
a.ジフェニルエーテルと1,1,1-トリクロロエタンとヘキサンの混合溶媒、
b.イソプロピルエーテルと1,1,1-トリクロロエタンとヘキサンの混合溶媒、および
c.フタル酸ジブチルとシクロヘキサンの混合溶媒、
d.ジフェニルエーテルとシクロヘキサンの混合溶媒。
【請求項３３】
極性媒体として血清アルブミンを含むミニマムエッセンシャルメディウムを組み合わせることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を保持した固相と抗体ライブラリーを接触させ、細胞表面抗原に結合する抗体を回収する工程を含む、細胞表面抗原に結合する抗体の取得方法において、以下のa)〜c)のいずれかの工程を含む方法であって、抗原マスキング剤と抗体マスキング剤がそれぞれ以下に定義される成分を含み、
抗原マスキング剤：取得を望まない抗体を含む、
抗体マスキング剤：取得を望まない抗体が認識する遊離の抗原を含む、
a) 細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を保持した固相と抗体ライブラリーとが、抗原マスキング剤または抗体マスキング剤のいずれかの共存下で接触させられる、
b)抗体ライブラリーを抗体マスキング剤との接触後に細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を保持した固相と接触させる、または
c)細胞表面抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を保持した固相を抗原マスキ
ング剤と接触後に抗体ライブラリーと接触させる、
更に次の工程を含む、抗体の取得方法、
(1)前記細胞、またはその分画を保持した固相と抗体ライブラリーを含む２５℃での比誘電率が８０以上の水性媒体と、この水性媒体と接触した２５℃での比誘電率が２０以下１以上で油性の低極性溶媒で構成される２相系を調製する工程、
(2)標的抗原を細胞膜上に発現した細胞、またはその分画を保持した固相を低極性溶媒相に移動させる工程、および
(3)低極性溶媒相に移動した細胞、またはその分画を保持した固相に結合している抗体を、細胞表面抗原に結合する抗体として回収する工程。
【請求項３５】
取得を目的とする抗体が認識する抗原が癌細胞の表面抗原であり、取得を望まない抗体が認識する抗原が正常細胞の表面抗原である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
正常細胞と前記癌細胞が由来する組織が共通である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
取得を目的とする抗体が認識する抗原が、特定のステージの癌細胞の表面抗原であり、取得を望まない抗体が認識する抗原が前記ステージとは異なるステージの同種の癌細胞の表面抗原である請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記特定のステージと、特定のステージとは異なるステージのいずれかが、進行癌であり、他方が初期癌である請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
取得を望まない抗体が、前記細胞表面抗原に結合する抗体であり、目的とする抗体が、取得を望まない抗体が認識する抗原または抗原決定基とは異なる抗原または抗原決定基に結合する抗体である請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
取得を望まない抗体が、前記細胞表面抗原に結合する結合活性によって予め単離された抗体である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１、または請求項３４のいずれかの方法によって得ることができる抗体またはその可変領域を含む断片。
【請求項４２】
請求項１、または請求項３４のいずれかの方法によって得ることができる抗体の可変領域をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４３】
次の工程を含む、特定の細胞の表面抗原に結合し、同じ条件で類似の細胞に接触させたときに類似の細胞には結合しない抗体のスクリーニング方法、
(1)請求項１または請求項３４に記載の方法によって選択された抗体を、前記特定の細胞またはその分画を保持した固相、および前記類似の細胞またはその分画を保持した固相に共通の条件下で接触させる工程、および
(2)前記特定の細胞またはその分画を保持した固相に結合し、前記類似の細胞またはその分画を保持した固相に結合しなかった抗体を選択する工程。
【請求項４４】
特定の細胞が癌細胞であり、類似する細胞が当該癌細胞と同じ組織の正常細胞である請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
特定の細胞があるステージの癌細胞であり、類似する細胞が別のステージの同種の癌細胞である請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
工程(1)が、前記特定の細胞および前記類似する細胞の細胞固定試料に前記抗体を接触させる工程を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
工程(1)が、前記特定の細胞の抗原分画を保持した固相、および前記類似する細胞の抗原分画を保持した固相に前記抗体を接触させる工程を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞、または細胞の抗原分画を保持した固相に結合した抗体を、その抗体を認識する標識抗体で検出する工程を含む、請求項３７または請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体ライブラリーが少なくとも１０9種類の抗体を含む抗体ライブラリーである請求項１または請求項３４に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体ライブラリーが、少なくとも１０10種類の抗体を含む抗体ライブラリーである請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体ライブラリーが、少なくとも１０11種類の抗体を含む抗体ライブラリーである請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
次の工程を含む請求項４１に記載の抗体が結合する抗原の同定方法、
(1)請求項４１に記載の抗体と当該抗体の単離に用いた細胞表面抗原とを接触させる工程、
(2)前記抗体に結合した抗原を回収する工程、および
(3)回収された抗原を同定する工程。
【請求項５３】
付加的に、工程(3)で同定された抗原のアミノ酸配列を決定する工程を含む請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
抗原を消化し、消化生成物を構成するアミノ酸を同定する工程を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
蛋白質分解酵素によって、抗原を消化する工程を含む請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
蛋白質分解酵素がセリンプロテアーゼである請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
セリンプロテアーゼがトリプシンである請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
消化生成物を構成するアミノ酸を、質量分析によって同定する工程を含む請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
請求項５２に記載の方法によって同定された抗原。
【図１】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２】
【図３−１】
【図３−２】
【図４−１】
【図４−２】
【図５−１】
【図５−２】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８−１】
【図８−２】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公開番号】特開２０１１−２３９７８４（Ｐ２０１１−２３９７８４Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５７４３３（Ｐ２０１１−１５７４３３）
【出願日】平成２３年７月１９日（２０１１．７．１９）
【分割の表示】特願２００４−３４９７８３（Ｐ２００４−３４９７８３）の分割
【原出願日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５０３１９６７７６）株式会社ペルセウスプロテオミクス (25)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１９日（２０１１．７．１９）
【分割の表示】特願２００４−３４９７８３（Ｐ２００４−３４９７８３）の分割
【原出願日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５０３１９６７７６）株式会社ペルセウスプロテオミクス (25)
【Ｆターム（参考）】
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