肉用家禽類の成長を改善するための方法および組成物
本発明は、動物飼料を給与された未成熟および成長中の動物の成長成績（ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）の改善方法、飼料利用効率の改善方法、飼料消化率の増大方法、および死亡率の減少方法を提供する。これらを達成するための粗ケラチナーゼ酵素抽出物および動物飼料サプリメントの製造方法も提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００２年８月９日出願の米国特許仮出願番号第６０／４０２，２２８号（その開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）の利益を主張する。
連邦政府支援の記述
【０００２】
本発明に関する研究は、米国農務省の小規模事業における革新的研究の助成金番号２００２−３３６１０−１１８５０によって一部支援されている。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、動物飼料を給与された未成熟および成長中の動物の成長成績（ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）の改善方法ならびにこれを達成するための動物飼料サプリメントに関する。
【背景技術】
【０００４】
ブロイラー雛の肥育前期用飼料（ｓｔａｒｔｅｒ ｄｉｅｔ）は、相当量の粗タンパク質を含む。ほとんどの粗タンパク質は、ダイズミールなどの伝統的な飼料成分から得られる。ダイズミール（粗タンパク質含有率４８％）中に存在する約９０％の粗タンパク質は、家禽類での消化率が高い（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（１９９４）．Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｏｕｌｔｒｙ．９ｔｈ ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｄ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。伝統的なトウモロコシ−ダイズミールブロイラー肥育前期用飼料は消化率が高いと考えられているが、これらはしばしば幼若期の必要な先天的酵素の欠失により幼若雛によって容易に消化されない種々の複合タンパク質を含む（Ｕｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．７８：２１５−２２２）。ブロイラー飼料中へのプロテアーゼの混入が提案されているが、穀物ベースの飼料へのプロテアーゼ添加を含む多くの初期作業では、鳥類の成績は全く改善されなかった（Ｊｅｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９５７）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．３６：９１９−９２１）。
【０００５】
より最近では、酵素混合物（プロテアーゼおよびアミラーゼが含まれる）での家禽類飼料の酵素補足により、成長成績がいくらか改良されている（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．８１（Ｓｕｐｐｌ．１）：２５；Ｂｕｒｒｏｗｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．８１（Ｓｕｐｐｌ．１）：２９；Ｓｈｏｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．８１（Ｓｕｐｐｌ．１）：１３６）。トウモロコシ−ダイズブロイラー肥育前期飼料へのキシラナーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼの混合物を含む酵素調製物の補足により、１４日齢および４２日齢で体重が改善されたが、飼料要求率に有意な影響を及ぼさなかった（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．（２００２）ｓｕｐｒａ）。トウモロコシ−ダイズベースのアヒル用飼料へのこの酵素混合物の補足の際、酵素補足により、体重増加および飼料要求率が改善された（Ｂｕｒｒｏｗｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）ｓｕｐｒａ）。
【０００６】
家禽類飼料は、いくつかの複合抗栄養および／または不消化化合物をさらに含む。これらの化合物のいくつか（非デンプン多糖類など）は、糜粥内の粘性塊に水分が吸収されて栄養素が容易に吸収されない（Ｏｄｅｔａｌｌａｈ，２０００；Ｏｄｅｔａｌｌａｈ，ｅｔ ａｌ．（２００２）ｓｕｐｒａ）。糜粥粘度が増大するにつれて、消化酵素および栄養素の拡散速度が減少し、それにより、腸細胞による栄養素の吸収が妨害される。糜粥濃度の増加につれて脂肪ミセル形成および吸収も減少し、それにより多くの脂溶性化合物（脂溶性ビタミン、色素、および脂質が含まれる）の吸収が損なわれる（Ｆｅｒｋｅｔ ａｎｄ Ｖｅｌｄｋａｍｐ（１９９９）Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １９９８ Ｗｏｒｌｄ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ｐｇｓ ４３−５２）。したがって、内溶解性（ｅｎｄｏｌｙｔｉｃ）酵素活性によって達成された粘度の減少は、高粘度シリアルを給与した幼若雛で見出された改善で役割を果たすことができ、種々の酵素の相対効果はその粘性減少能力に関連するようである（Ｒｏｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．５０：１９−２７）。
【０００７】
ＰＷＤ−１キナーゼは、バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１の成長培地から最初に精製された酵素である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：１５０９−１５１５；Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：３２７１−３２７５）。ＰＷＤ−１ケラチナーゼは、広範なタンパク質基質（カゼイン、コラーゲン、エラスチン、およびケラチンが含まれる）を加水分解する（Ｓｈｉｈ（２００１）Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ，ｐｇｓ ２４４−２４７）。ＰＷＤ−１ケラチナーゼを使用して、市販の羽毛粉と無細胞ケラチナーゼとの一晩のインキュベーションによって加水分解羽毛粉が製造されている（Ｃａｒｔｅｒ（１９９８）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ：Ａｓｓａｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）。Ｓｈｉｈらに付与された米国特許第４，９０８，２２０号；同第５，１８６，９６１号；および同第５，０６３，１６１号も参照のこと。
【０００８】
前述にもかかわらず、ブロイラー雛の成長成績を増大させるさらなる方法およびこれを達成する動物飼料サプリメントが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、動物飼料を給与された未成熟動物および成長中の動物の成長成績を増大させる方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様は、肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の体重増加の促進に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の成長方法に関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、肉用家禽類に肥育前期用飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の体重増加の促進に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の成長方法に関する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率の改善に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率を改善する方法に関する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類における動物飼料の消化率の増大に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の消化率を増大させる方法に関する。
【００１４】
本発明の別の態様は、肉用家禽類に肥育前期用飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の死亡率の減少に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の死亡率を減少させる方法に関する。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、本質的にケラチナーゼ、タンパク質、および炭水化物からなる動物飼料に関する。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、粗ケラチナーゼ酵素抽出物の製造方法に関する。
【００１７】
本発明は、さらに、孵化栄養状態の改良ならびにそれによる肉用家禽類のより高い成長成績レベルを達成するための未成熟のトリの耐病性および生存性の増大に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上記および本発明の他の態様を、本明細書中に記載の他の実施形態に関してより詳細に記載する。本発明を異なる形態で実施することができ、且つ本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきでないことを認識すべきである。むしろ、本開示が詳細且つ完全であり、且つ当業者に本発明の範囲が完全に伝達されるようにこれらの実施形態を提供する。
【００１９】
本明細書中の発明の説明で使用された専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他で明記しない限り、複数形も含まれることが意図される。
【００２０】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般に理解されている意味と同一である。
【００２１】
本明細書中で引用された全ての刊行物、米国特許出願、米国特許、および他の引例は、その全体が本明細書中で参考として組み込まれる。
【００２２】
本明細書中で使用される、用語「肉用家禽類」は、当業者によって理解される肉の消費のために製造または使用される任意の鳥類をいう。このような鳥類の例には、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、および走鳥類などが含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書中で使用される、用語「未成熟のトリ」は、完全な成長、分化、または発達を欠く鳥類のメンバーをいう。このようなメンバーは、成熟形態または状態を定義する潜在的な能力を有し得る。未成熟のトリは、約１日齢から約５０日齢まで、好ましくは約１日齢から約２１日齢まで、より好ましくは約１日齢から約５日齢までであり得るか、これらの範囲内のトリに匹敵する体重を有し得る。
【００２４】
本明細書中で使用される、用語「成長中のトリ」は、未成熟のトリよりも年長であるか重い鳥類のメンバーをいう。
【００２５】
本明細書中で使用される、用語「成熟したトリ」は、成長中のトリよりも年長であるか重い鳥類のメンバーをいう。
【００２６】
本明細書中で使用される、用語「ブロイラー雛」は、肉の消費のために製造されるか最終的に使用される任意の未成熟のニワトリをいう。
【００２７】
本明細書中で使用される、用語「家禽類飼料」は、トリの成長の促進または維持のための鳥類メンバーに投与することができる飼料をいう。家禽類飼料は、タンパク質源、ビタミン源、ミネラル源、エネルギー源（脂肪、炭水化物など）、さらなるタンパク質、抗生物質、および動物飼料（特に、家禽類飼料）中に含まれることが公知の他の物質または化合物を含み得る。家禽類飼料には、肥育前期用飼料、肥育後期用飼料、および仕上げ用飼料が含まれるが、これらに限定されない。「肥育前期用飼料」は、出生または孵化から所望の年齢および／または体重が得られるまでの動物に投与することができる飼料をいう。「肥育後期用飼料」は、初期成長段階の完了時に動物に投与することができる飼料をいう。「仕上げ用飼料」は、成長期から食肉解体処理までの動物に投与することができる飼料をいう。
【００２８】
本明細書中で使用される、用語「成長」または「成長成績」は、本発明の方法を実施し、そして／または組成物を投与することなく得られるものを超える体重およびサイズ（例えば、高さ、幅、直径、外周など）のいずれかまたは両方の増加をいう。成長は、動物全体または特定の組織（例えば、一般的な筋組織または特定の筋肉）の集団（例えば、重量またはサイズ）の増大を言及することができる。あるいは、成長は、ある組織集団の別の集団に対する相対的増加、特に、筋組織の他の組織（例えば、脂肪組織）に対する増加を示すことができる。成長は、さらに、栄養状態の改善および／または耐病性の増大もまた成長成績の改良を示す、栄養状態および耐病性に関する。
【００２９】
上記を考慮して、本発明の実施形態は、肉用家禽類に動物飼料として家禽類飼料を給与し、前記飼料が、前記肉用家禽類の体重増加の促進に有効な量のケラチナーゼをさらに含み、これを前記家禽類飼料に添加することとを含む、肉用家禽類の成長方法に関する。家禽類飼料は、タンパク質源（例えば、ダイズミール、魚粉、血粉、家禽類副産物（粉末家禽類屑（ｇｒｏｕｎｄ ｐｏｕｌｔｒｙ ｏｆｆａｌ））、肉粉、小麦全粒粉、ナタネ、カノーラ、およびこれらの組み合わせ）を含む動物飼料であり得る。動物飼料は、動物飼料での使用のために粉末に粉砕することができる炭水化物（例えば、トウモロコシ、カラスムギ、オオムギ、モロコシ、またはその組み合わせ）をさらに含む。さらに、動物飼料は、ビタミン、ミネラル、脂肪、抗生物質、および必要または所望の他の物質または化合物を含み得る。動物飼料（家禽類飼料）の非限定的な例には、オオムギ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、ライコムギ、およびライムギなどの穀類を含む穀類ベースの飼料が含まれる。トウモロコシ−ダイズ、コムギ−ダイズ、およびコムギ−トウモロコシ−ダイズ、モロコシ−ダイズ、およびトウモロコシ−モロコシ−ダイズは、本発明の適切な動物飼料の他の非限定的な例を示す。家禽類飼料がトウモロコシ−ダイズミール飼料である場合、トウモロコシ−ダイズミール飼料は、約６０重量％から約７０重量％までのトウモロコシおよび約２０重量％から約３０重量％までのダイズを含む。
【００３０】
家禽類飼料を、肥育前期用飼料、肥育後期用飼料、または仕上げ用飼料にさらに分類することができる。動物飼料（すなわち、家禽類飼料）の正確な組成および物理的特徴は、飼料が意図される種、動物の年齢および／または体重、ならびに給与期間に依存し、当業者はこれらを容易に決定することができる。
【００３１】
本発明の実施形態によれば、肉用家禽類の成長方法には、ケラチナーゼと共に特定のケラチン含有基質を同時に提供するは必要ない。例えば、本発明の実施形態では、Ｃａｒｔｅｒ，１９９８に記載の加水分解羽毛粉の製造と対照的に、飼料添加物として家禽類飼料にケラチナーゼを直接補足することができる。したがって、動物飼料は、本質的にケラチンを含まなくて良い（例えば、１重量％または２重量％以下のケラチン）。
【００３２】
本発明の実施に適切なケラチナーゼは、米国特許第４，９０８，２２０号および同第４，９５９，３１１号（本明細書中で引用した全特許引例の開示が本明細書中で参考として組み込まれる）に記載のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株から得られる。この細菌は、１９８８年３月２３日にブタペスト条約に従ってアメリカ合衆国、メリーランド州、ロックビルのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託し、ＡＴＣＣアクセッション番号５３７５７号が割り当てられた。本発明を実施するために使用することができる他のケラチナーゼは、ストレプトミセス・フラジアエなどの種々の細菌供給源から利用可能である。一般に、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎに付与された米国特許第２，９８８，４８７号を参照のこと；Ｇｏｋｔａｎ，Ｄ．，「Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｒａｔｅｓ ｏｆ Ｋｅｒａｔｉｎｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｕｓｅｄ ｂｙ Ｃｅｒｔａｉｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，」（Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２０７３６９ｂ），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，３３３（１９８４）；Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｇ．，「Ｔｈｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈａｉｒ Ｋｅｒａｔｉｎ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ Ｃａｎｉｓ，」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８，２８９（１９５３）；Ｋｏｈ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，「Ｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ａｎｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，」Ｂａｃｉｌｌｕｓ．Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２７４（１９５９）；Ｍｏｌｙｎｅａｕｘ，Ｇ．Ｓ．，「Ｔｈｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｏｏｌ ｂｙ ａ Ｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，」Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２７４（１９５９）；Ｎｏｖａｌ，Ｊ．ａｎｄ Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｗ．，「Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ Ｋｅｒａｔｉｎ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｆｒａｄｉａｅ，」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７７，２５１（１９５９）；Ｋａｐｉｃａ，Ｌ．ａｎｄ Ｂｌａｎｋ，Ｆ．，「Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ Ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｋｅｒａｔｉｎ ａｓ Ｓｏｌｅ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ，」Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ １１７，４３３（１９５８）；Ｋａｐｉｃａ，Ｌ．ａｎｄ Ｂｌａｎｋ，Ｆ．，「Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ａｌｂｉｃａｎｓ ｏｎ Ｋｅｒａｔｉｎ ａｓ Ｓｏｌｅ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ，」Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ １１５，８１（１９５７）も参照のこと。
【００３３】
本発明の実施のためのケラチナーゼを、コードされたケラチナーゼを発現させる条件下でケラチナーゼをコードする核酸配列を含む宿主細胞を成長させること、培地を濾過して細胞を除去すること、および限外濾過によって残存する上清を回収および濃縮してケラチナーゼを得ることによって得ることができる。受益補因子（ｂｅｎｅｆｉｃｉａｒｙ ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）も得ることができる。
【００３４】
バチルスリケニフォルミス株を本明細書中で例示しているが、ケラチナーゼをコードする核酸配列を含む他の真核微生物および原核微生物も本発明の動物飼料サプリメントの製造に有用であり得ることが意図される。ケラチナーゼをコードする核酸配列を含む真核微生物および原核微生物には、天然に酵素を産生するものならびにケラチナーゼを発現するように遺伝子操作された株が含まれ得る。一般に、タンパク質の組換え産生には、宿主細胞中でのタンパク質発現に適切な形態での組換え発現ベクターへのタンパク質をコードする核酸配列の組み込みが必要であり得る。発現に適切な形態は、核酸がｍＲＮＡに転写されてｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される様式で組換え発現ベクターがケラチナーゼタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された１つまたは複数の調節配列を含むことを提供する。調節配列には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれ得る。このような調節配列は当業者に公知であり、Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｄ．Ｄ．，ｅｄ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ，カリフォルニア州（１９９１）に記載されている。発現ベクターのデザインは、トランスフェクトすべき宿主細胞の選択および／または必要な発現レベルなどの因子に依存し得ると理解すべきである。ケラチナーゼタンパク質をコードする核酸配列またはこれを保有する発現ベクターを、標準的な細胞の形質転換技術によって、真核生物または原核生物起源であり得る宿主細胞に移入することができる。宿主細胞の適切な形質転換方法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００））および他の実験マニュアルに見出すことができる。ケラチナーゼタンパク質をコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞数は、少なくとも一部が使用した組換え発現ベクターの型および使用した形質転換技術の型に依存する。核酸を宿主細胞に一過性に移入することができるか、より典型的には、ケラチナーゼタンパク質の長期発現のために、核酸配列を宿主細胞のゲノムに安定して組み込むか宿主細胞中の安定なエピソームとしてとどめる。一旦産生されると、ケラチナーゼタンパク質を、分泌ポリペプチドとして培養培地から回収することができるが、分泌シグナルを含まず直接発現する場合、宿主細胞溶解物から回収することもできる。
【００３５】
酵母培養物などの真核微生物を、ケラチナーゼをコードする核酸配列を保有するベクターで形質転換することができる。例えば、米国特許第４，７４５，０５７号を参照のこと。サッカロミセス・セレビシエは、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されているが、多数の他の株が一般に利用可能である。酵母ベクターは、２ミクロンの酵母プラスミド由来の複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、ケラチナーゼをコードするＤＮＡ（米国特許第５，７１２，１４７号で提供されているものなど）、ポリアデニル化配列、転写終結配列、および選択遺伝子を含んでもよい。プラスミドの例は、ＹＲｐ７である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｇｅｎｅ ７：１４１；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｇｅｎｅ １０：１５７）。酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３）、または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ，ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４９００）のプロモータが含まれる。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、ＥＰＯ公開番号７３，６５７号にさらに記載されている。さらに、トリコデルマ属などの真菌株（例えば、トリコデルマロンギブラチアタム、トリコデルマリーゼイ、またはトリコデルマビリディ）は、分泌酵素発現で特に有用である。
【００３６】
ケラチナーゼを産生するために使用することができる原核宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性生物（例えば、大腸菌（E.coli）またはバチルス属）が含まれる。宿主細胞の例は、E.coliＷ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５），E.coliＢ，E.coliＸ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７），E.coli２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）である。広範な種々の適切な原核生物および微生物ベクターが利用可能である。Ｅ．コリは、典型的には、ｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。組換え細菌発現ベクターで最も一般的に使用されているプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７５，６１５；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８１，５４４）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，４０５７；ＥＰＯ公開番号３６，７７６号）、およびｔａｃプロモーター（Ｄｅ Ｂｏｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１）が含まれる。プロモーターおよびShine-Delgarno配列（原核生物宿主発現用）は、ケラチナーゼをコードするＤＮＡに作動可能に連結される（すなわち、これらはＤＮＡからのケラチナーゼ伝令ＲＮＡの転写を促進するように位置付けられる）。ケラチナーゼ産生ではバチルス属を使用することが好ましい。バチルス用の組換え発現ベクターは、当業者に周知である。バチルス属は、バチルスアルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス、バチルスサーキュランス、バチルスコアグランス、バチルスフィルムス（Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニフォルミス、バチルスメガテリウム、バチルスプミラス、バチルスステアロサーモフィラス、バチルスズブチリス、およびバチルスチューリンゲンシスであり得る。好ましい実施形態では、バチルスリケニフォルミス株を使用する。いくつかの実施形態では、バチルスリケニフォルミスＴ３９９Ｄ株またはＰＷＤ−１株を使用する。
【００３７】
本明細書中に提供される、ケラチナーゼ酵素を、コードされたケラチナーゼを発現させる条件下での上記宿主細胞の培養および発現したケラチナーゼの回収によって産生することができる。宿主細胞を、細胞が成長する条件下で培養し、その後、コードされたケラチナーゼを発現させる条件下で培養することができるか、細胞を成長させると同時にコードされたケラチナーゼを発現させることができる。このような条件は、当業者に周知であり、宿主細胞および所望の酵素発現レベル量によって変化し得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、形質転換宿主細胞の培養に使用される培地は、ケラチナーゼ産生に適切な任意の培地であり得る。従来技術（遠心分離または濾過による培地からの細胞の分離、限外濾過または蒸発による上清または濾過物中のタンパク質の濃縮、およびその後の凍結乾燥または吹き付け乾燥による乾燥が含まれる）によってケラチナーゼを培地から回収する。
【００３９】
あるいは、培養物上清を、濃縮することなく分離後に吹き付け乾燥または凍結乾燥することができる。
【００４０】
ケラチナーゼは、少なくとも意図する効果を達成するのに十分な量で存在すべきであるが、ケラチナーゼ量の上限を意図する効果の達成に基づいて決定することができる。いくつかの実施形態では、動物飼料は、約０．０１重量％から約２０重量％までのバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼを含む。さらに、本発明の実施で使用されるケラチナーゼは、粗形態または純粋な形態であり得る。粗形態のケラチナーゼを、例えば、その液体成長培地（粗ケラチナーゼを含む液体成長培地）からのケラチナーゼを産生する細菌細胞の分離によって調製することができる。あるいは、細胞を液体培養培地中に（化学的または物理的に）溶解して、粗無細胞抽出物を産生することができる。このような抽出物の他の調製手段は、当業者に自明である。粗キナーゼを、適合可能な任意の形態（水性形態または凍結乾燥形態など）にて飼料中に含めることができる。いくつかの実施形態では、粗ケラチナーゼは、凍結乾燥形態である。
【００４１】
純粋（または実質的に純粋な）ケラチナーゼを、公知の技術による上記の粗ケラチナーゼのその個別の構成要素への分離によって得ることができる。一般に、Ｗ．Ｊａｋｏｂｙ，Ｅｄ．，Ｅｎｚｙｍｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２（１９７１）およびｖｏｌ．１０４，ｐｔ．Ｃ（１９８４），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。カラムクロマトグラフィなどの多数の適切な分離手順が当業者に公知である。各構成タンパク質を、ケラチン様物質を分解する能力についてスクリーニングすることができ、ケラチン様物質を最も良好に分解する構成要素はケラチナーゼを含む。粗ケラチナーゼと同様に、純粋なケラチナーゼを任意の適切な形態（水性形態および凍結乾燥形態が含まれる）で使用することができる。
【００４２】
本発明の実施形態は、さらに、肉用家禽類に動物飼料として家禽類飼料を給与し、前記飼料が、前記飼料が肉用家禽類に提供した動物飼料の飼料利用効率の改善に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率を改善する方法に関する。動物飼料には、上記の動物飼料が含まれる得るが、特定の実施形態では、トウモロコシ−ダイズミールであり得る。ケラチナーゼには、上記ケラチナーゼ（バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれ得る。上記のように、ケラチナーゼは、粗抽出物形態または純粋な形態の酵素であり得る。
【００４３】
「飼料利用効率の改善」は、本発明の方法の実施および／または組成物の投与を実施せずに得られたものと比較した飼料要求率（ＦＣＲ）の減少をいう。ＦＣＲは、消費飼料の量と動物の体重増加との比である。本発明の１つの実施形態では、腸エネルギー消費が同時増加することなく胃腸栄養吸収の増加によって飼料利用効率を改善することができる。本発明の別の実施形態では、動物飼料の消化率の増大によって飼料利用効率を改善することができる。本発明の別の実施形態では、動物飼料の粘度の減少によって飼料利用効率を改善することができる。特定の実施形態では、本発明は、肉用家禽類に動物飼料として家禽類飼料を給与し、前記飼料が、前記肉用家禽類における動物飼料の消化率の増大に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の消化率を増大させる方法に関する。動物飼料には、上記の動物飼料が含まれ得るが、特定の実施形態では、トウモロコシ−ダイズミールであり得る。ケラチナーゼには、上記ケラチナーゼ（バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれ得る。上記のように、ケラチナーゼは、粗抽出物形態または純粋な形態の酵素であり得る。「動物飼料の消化率の増大」は、飼料摂取または栄養素の消化を同時に増大させること無く動物の腸から吸収された栄養素の利用可能性の増大をいう。本発明のいくつかの実施形態では、動物の腸中に存在する物質の粘度または消化物（ｄｉｇｅｓｔａ）の粘度が減少する。他の実施形態では、動物が栄養素として利用不可能にする栄養素の取り込みが減少する。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、肉用家禽類に動物飼料として家禽類飼料を給与し、前記飼料が、前記肉用家禽類（例えば、未成熟のトリ、より詳細にはブロイラー雛）の死亡率の減少に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の死亡率を減少させる方法に関する。動物飼料には、上記の動物飼料が含まれ得るが、特定の実施形態では、トウモロコシ−ダイズミールであり得る。ケラチナーゼには、上記ケラチナーゼ（バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれ得る。上記のように、ケラチナーゼは、粗抽出物形態または純粋な形態の酵素であり得る。「死亡率の減少」は、本発明の方法の実施および／または組成物の投与を実施しないで起こるものと比較した出生または孵化後の動物の生存性の増加または死亡率の減少をいう。死亡率は、任意の原因（特に、ストレス、発育阻害、「飢餓（ｓｔａｒｖｅｏｕｔｓ）」、および疾患）に由来し得る。いくつかの実施形態では、本発明により、未成熟のトリの死亡率が減少する。他の実施形態では、トリは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、または３５日齢、好ましくは約１〜約２１日齢、より好ましくは約１〜５日齢である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、主成分としてタンパク質、炭水化物、およびケラチナーゼを含む動物飼料に関する。ケラチナーゼは、動物飼料を補足する主成分である。動物飼料には、上記の動物飼料が含まれ得るが、特定の実施形態では、トウモロコシ−ダイズミールであり得る。ケラチナーゼには、上記ケラチナーゼ（バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれ得る。上記のように、ケラチナーゼは、粗抽出物形態または純粋な形態の酵素であり得る。
【００４６】
本発明によって提供された動物飼料サプリメントを、動物飼料（オオムギを含むものなど）と直接混合して最終飼料を調製することができる。あるいは、動物飼料サプリメントを、ビタミン動物飼料サプリメント、ミネラル動物飼料サプリメント、およびアミノ酸動物飼料サプリメントなどの１つまたは複数の他の動物飼料サプリメントと混合することができる。いくつかの異なる型の成分を含む得られた適量の動物飼料サプリメントを、動物飼料と混合することができる。
【００４７】
本発明の動物飼料は、少なくとも意図する効果の達成に十分な量のケラチナーゼを含み、ケラチナーゼ量の上限を、意図する効果の達成に基づいて決定することができる。意図する効果には、動物成長成績（体重増加など）の増大、飼料利用効率の改善、飼料消化率の増大、および死亡率の減少が含まれるが、これらに限定されない。動物飼料に添加される動物飼料サプリメントは、１００重量％までのケラチナーゼを含み得る。サプリメントを含む動物飼料は、約５重量％から約２５重量％までのケラチナーゼを含む。いくつかの実施形態では、ケラチナーゼは、バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼである。
【００４８】
任意の動物は、本発明の適切な被験体であり、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、フェレット、および鳥類が含まれるが、本発明は、単胃動物を使用することが好ましい。適切な被験体は、任意の年齢範囲（新生動物、成長中の動物、および成熟動物が含まれる）であり得る。いくつかの実施形態では、適切な被験体は、鳥類、好ましくはニワトリ、より好ましくはブロイラー雛であり得る。他の実施形態では、適切な被験体は、ニワトリであり得る。さらに他の実施形態では、適切な被験体は、未成熟、成長中、または成熟したトリであり得る。他の実施形態では、適切な被験体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、もしくは６５日齢またはこれらの数の任意の範囲内のニワトリであり得る。したがって、本発明は、種々の異なる飼料（ペット用飼料、家禽類飼料、および豚用飼料が含まれる）を提供する。
【００４９】
本発明の動物飼料サプリメントにより、そのエネルギーおよび／またはタンパク質および／またはアミノ酸含有量の減少によって従来の動物飼料を改変すると同時に動物が利用可能なエネルギー、タンパク質、およびアミノ酸の栄養レベルを同一に維持することができる。したがって、動物飼料中に典型的に含まれる高価なエネルギーおよびタンパク質サプリメントの量を、従来の飼料と比較して減少させることができる。
【００５０】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供するが、本発明を制限すると解釈すべきではない。
【実施例１】
【００５１】
組換えバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株からのケラチナーゼの産生
野生型バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株を使用したケラチナーゼ産生のために発酵スケールアップストラテジーをデザインした。
【００５２】
ＬＢ培地でのフラスコ培養。１．０Ｌの蒸留水、１５ｇ ＢＡＣＴＯ（登録商標）寒天、１０ｇＮａＣｌ、１０ｇ ＢＡＣＴＯ（登録商標）トリプトン、および５．０ｇ酵母抽出物を含む製造者の説明書にしたがって調製したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地にてフラスコ培養を行った。バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株をグリセロールストックからＬＢプレートに画線し、５０℃で８〜１２時間成長させた。次いで、バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株の１コロニーを、ＬＢプレートから５００ｍｌ ＬＢ培地を含むフラスコに移し、５０℃で６時間成長させた。
【００５３】
種培養物。バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株の種培養物を、０．７ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｇ／Ｌ脱脂ダイズ粉、および０．１ｇ／Ｌ消泡剤を含む培地に入れた。種培養物の初期ｐＨを、１Ｍ ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．０に調整した。
【００５４】
５００ｍｌのフラスコ培養物を、種培養培地を含む約１０Ｌ〜２０Ｌの第１段階の種発酵槽に移し、２．５％〜５．０％の接種材料サイズに達するまで５０℃で８〜１２時間成長させた。次いで、第１段階の種培養物を、１００Ｌ、２５０Ｌ、または８００Ｌの第２段階の種発酵槽に移し、５０℃で８時間成長させ、その後３７℃にシフトした。
【００５５】
種培養物について、細胞密度は約８時間または１０時間の培養プロセスで少なくとも３×１０8ＣＦＵ／ｍＬに達した。
【００５６】
産生培地。バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株のために使用した産生培養培地は、０．７ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｇ／Ｌ脱脂ダイズ粉、および０．１ｇ／Ｌ消泡剤を含んでいた。産生培養物の初期ｐＨを、１Ｍ ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．０に調整した。
【００５７】
第２段階の種培養物を、培養最終段階のための産生培養培地を含む産生発酵槽に移した。最終段階の培養を５０℃で８時間行い、回収前の総培養時間は約２４時間〜３０時間に達した。
【００５８】
上記培養ステップ中、培養培地の初期ｐＨを７．０に調整したが、培養プロセス中にｐＨを調整しなかった。バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株の至適溶解酸素レベルは約２０％であった。摂取材料サイズは約２．５％〜５％であり、摂取材料の経過時間は、約８〜１２時間であった。
【００５９】
産生培養物について、ピーク細胞密度は、約２０または２４時間の培養プロセスで１．２×１０9ＣＦＵ／ｍＬに達した。アゾカゼインアッセイで測定したピーク酵素活性は、約２４時間〜３０時間の培養プロセスでｍＬあたり３５〜４０Ａ450に達した。産生培養培地のｐＨ値は７．０から８．３に変化したが、酵素活性および産生性は高レベルのままであり、ｐＨ調節が必要ないことを示した。
【００６０】
回収および下流プロセシング。回収前に産生培養物の酵素活性をチェックした。培養物の上清を、遠心分離によって細胞塊から分離し、その後限外濾過または蒸発によって濃縮した。濃縮した液体酵素を吹き付け乾燥させた。
【００６１】
あるいは、培養物の上清を、細胞塊からの分離後濃縮せずに直接吹き付け乾燥させた。
【００６２】
酵素収率および酵素活性。１００Ｌ産生培養物について、回収前にアゾカゼインアッセイによって測定した酵素活性は３，０００〜３，５００Ｕ／ｍｌであり、細胞数は、１．３×１０9ＣＦＵ／ｍＬであった。１００Ｌ産生培養物の総乾燥重量は、９．１２ｇ／Ｌであり、そのうち不溶性乾燥重量が２．１５ｇ／Ｌであり、可溶性乾燥重量が６．８８ｇ／Ｌであった。
【００６３】
粗酵素収率は約１．７５〜２．０ｇ／Ｌであった。５ｋＤａ分子量カットオフを使用したＰｅｌｌｉｃｏｎ濾過による発酵上清の濃縮によって粗酵素を調製し、凍結乾燥させた。粗乾燥酵素の酵素活性は、アゾカゼインアッセイで測定したところ約１，０００，０００〜約１，４００，０００Ｕ／ｇであった。粗乾燥酵素の総タンパク質含有量は約３０〜３６％であり、その約１４〜２０％が純粋なケラチナーゼからなる。
【実施例２】
【００６４】
組換えバチルスリケニフォルミスＴ３９９Ｄ株からのケラチナーゼの産生
組換えバチルスリケニフォルミスＴ３９９Ｄ株（以後「バチルスリケニフォルミスＴ１株」）を使用したケラチナーゼ産生のために発酵スケールアップストラテジーをデザインした。
【００６５】
ＬＢ培地でのフラスコ培養。１．０Ｌの蒸留水、１５ｇ ＢＡＣＴＯ（登録商標）アガー、１０ｇＮａＣｌ、１０ｇ ＢＡＣＴＯ（登録商標）トリプトン、および５．０ｇ酵母抽出物を含む製造者の説明書にしたがって調製したＬＢ培地にてフラスコ培養を行った。バチルスリケニフォルミスＴ１株をグリセロールストックからＬＢプレートに画線し、３７℃で１８時間成長させた。次いで、バチルスリケニフォルミスＴ１株の１コロニーを、ＬＢプレートから５００ｍｌ ＬＢ培地を含むフラスコに移し、３７℃で６時間成長させた。６６０ｎｍでの光学密度の測定によって、細胞成長をモニターした（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ Ｓｅｒｉｅｓ ６６０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，フラートン，カリフォルニア州）。６時間の成長後、１．０を超えるＯＤ660が測定された。
【００６６】
種培養物。バチルスリケニフォルミスＴ１株の種培養物を、０．７ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｇ／Ｌ脱脂ダイズ粉、および０．１ｇ／Ｌ消泡剤を含む培地に入れた。種培養物の初期ｐＨを、１Ｍ ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．０に調整した。
【００６７】
５００ｍｌのフラスコ培養物を、種培養培地を含む約１０Ｌ〜２０Ｌの第１段階の種発酵槽に移し、２．５％〜５．０％の接種材料サイズに達するまで３７℃で８時間成長させた。次いで、第１段階の種培養物を、１００Ｌ、２５０Ｌ、または８００Ｌの第２段階の種発酵槽に移し、３７℃で８時間成長させた。
【００６８】
産生培地。バチルスリケニフォルミスＴ１株のために使用した産生培養培地は、０．７ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１３ｇ／Ｌ脱脂ダイズ粉、４０ｇ／Ｌデンプン、１３ｇ／Ｌ羽毛粉、および０．１ｇ／Ｌ消泡剤を含んでいた。産生培養物の初期ｐＨを、１Ｍ ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．０に調整した。
【００６９】
第２段階の種培養物を、培養最終段階のための産生培養培地を含む産生発酵槽に移した。最終段階の培養を３７℃で４８時間行い、その後回収した。
【００７０】
上記培養ステップ中、培養培地の初期ｐＨを７．０に調整したが、ｐＨを調整しなかった。バチルスリケニフォルミスＴ１株の至適溶解酸素レベルは約３０％であった。摂取材料サイズは約２．５％〜５％であり、摂取材料の経過時間は、約１２時間であった。
【００７１】
回収および下流プロセシング。回収前に産生培養物の酵素活性をチェックした。培養物の上清を、遠心分離によって細胞塊から分離し、その後限外濾過または蒸発によって濃縮した。濃縮した液体酵素を吹き付け乾燥させた。
【００７２】
あるいは、培養物の上清を、細胞塊からの分離後濃縮せずに直接吹き付け乾燥させた。
【００７３】
酵素収率および酵素活性。１００Ｌ産生培養物について、回収前にアゾカゼインアッセイによって測定した酵素活性は３０，０００〜３５，０００Ｕ／ｍｌであり、細胞数は、６．０×１０9ＣＦＵ／ｍＬであった。１００Ｌ産生培養物の総乾燥重量は、４０ｇ／Ｌであり、そのうち不溶性乾燥重量が１５ｇ／Ｌであり、可溶性乾燥重量が２５ｇ／Ｌであった。
【００７４】
直接乾燥培養上清由来の粗酵素収率は約２０ｇ／Ｌであり、１０ｋＤａ分子量カットオフを使用したＰｅｌｌｉｃｏｎ濾過によって得た培養物濃度由来の粗酵素収率は１６ｇ／Ｌであった。粗乾燥酵素の酵素活性は、アゾカゼインアッセイで測定したところ１，０００，０００Ｕ／ｇ超であった。
【実施例３】
【００７５】
家禽類飼料へのケラチナーゼの補足のための材料と方法
トリおよび収容。３つの実験を行った。各実験では、１９２日齢のブロイラー雛の体重を測定し、２つのＡｌｔｅｒｎａｔｅ Ｄｅｓｉｇｎバッテリー（Ｗｉｌｖｅｃｏ，ビルリカ，マサチューセッツ州）に対して完全に無作為なデザインの２４個のケージに無作為に割り当てた。トリの体重を測定し、羽を縛り、５日齢（実験１および２）および１日齢（実験３）で実験処置を施した。檻あたり８羽のトリを使用して４回繰り返したコントロール処理以外は、檻あたり８羽のトリを使用して各処置を５回繰り返した。トリを、温度、換気、および照明（２４時間／日）を制御した部屋に収容した。実験期間中、トリに給餌器で飼料をおよびニップルドリンカーで水を自由に給与した。
【００７６】
ＰＷＤ−１ケラチナーゼ酵素。酵素ＰＷＤ−１ケラチナーゼを、標準的な方法を使用して１５０Ｌの発酵槽で産生した（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｈｉｈ（１９９８）Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：６０８−６１６）。簡単に述べれば、バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）ｓｕｐｒａ）を、発酵槽にて５０℃で４８時間成長させる。無細胞培地を、膜限外濾過によって濃縮し、凍結乾燥機にて乾燥させた。典型的には、粗酵素の収率は２．０ｇ／Ｌであった。粗キナーゼの活性は、アゾケラチンの加水分解（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）ｓｕｐｒａ）によって測定したところ、３００，０００Ｕ／ｇであった。
【００７７】
食餌処理。全飼料を、最小費用線形計画ソフトウェアを使用して計画し、表１に示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
1実験３のみにおいて最初の５日齢のトリに自由に給与する。
2実験１および２において最初の５日齢のトリに自由に給与する。全ての実験では、コントロール処置を施したトリに最初の５日齢以降同一の飼料を給与し続け、他のトリに対応する処置を施した。
3ミネラルプレミックスは、Ｅａｓｔｅｒｎ Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，ＮＣから入手し、以下（飼料１ｋｇあたり）：ＺｎＳＯ4から１２０ｍｇのＺｎ；ＭｎＳＯ4から１２０ｍｇのＭｎ；ＦｅＳＯ4Ｃ５Ｈ2Ｏから８０ｍｇのＦｅ；ＣｕＳＯ4から１０ｍｇのＣｕ；ＣａＩＯ4から２．５ｍｇのＩ；ＣｏＳＯ4から１ｍｇのＣｏが供給される。
4ビタミンプレミックスは、Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪから入手し、以下（飼料１ｋｇあたり）：１３，２００ＩＵのビタミンＡ；４，０００ＩＣＵのビタミンＤ；６６ＩＵのビタミンＥ；３９．６ＦｇのビタミンＢ12；１３．２ｍｇのリボフラビン；１１０ｍｇのナイアシン；２２ｍｇのｄ−パントテン酸；０．４ｍｇのビタミンＫ；２．２ｍｇの葉酸；４．０ｍｇのチアミン；７．９ｍｇのピリドキシン；０．２５３ｍｇのビオチン；１００ｍｇのエトキシキンが供給される。
5セレンプレミックスにより、Ｎａ2ＳｅＯ3として０．２ｍｇＳｅ／ｋｇ飼料が供給される。
6計算分析。
【００８０】
実験を通して、全飼料をマッシュ形態で給与した。トリに、１日齢のトリに基礎飼料を給与し、その後５日齢で対応する実験飼料に切り換えた。実験１では、最初の５日間に給与した基礎飼料は、粗タンパク質についての米国学術研究会議（ＮＲＣ）推奨値（（１９９４）ｓｕｐｒａ）の約９３％であるが、必須アミノ酸、エネルギー、およびカルシウムおよびリン酸含有量は１００％であった。実験２および３では、最初の５日間に給与した基礎飼料は、エネルギーについての米国学術研究会議（ＮＲＣ）推奨値（（１９９４）ｓｕｐｒａ）の約９５％であり、カルシウムおよびリン酸は１００％であるが、粗タンパク質含有量は１０５％であった。その後、１つの檻のブロイラー雛を、各実験の終了（実験１および３では２１日目、実験２では２６日目）まで５つの飼料処置のうちの１つに供した。実験１および２における５つの飼料処理は以下であった。１）非補足コントロール飼料（Ｃ、２１．３９％粗タンパク質）；２）低タンパク質飼料（ＬＰ、１８％粗タンパク質）；３）０．０５％（ｗｔ／ｗｔ）酵素調製物を補足した低タンパク質飼料（ＬＰ＋０．０５Ｅ）；４）０．１０％（ｗｔ／ｗｔ）酵素調製物を補足した低タンパク質飼料（ＬＰ＋０．１０Ｅ）；および５）０．１５％（ｗｔ／ｗｔ）酵素調製物を補足した低タンパク質飼料（ＬＰ＋０．１５Ｅ）。コントロール飼料は、実験１において最初の５日齢のトリに給与した基礎飼料と同一である。これで処置したトリに５日齢後に同一の飼料を給与し続け、残りの処置を５日齢での実験飼料と切り換えた。実験３の飼料処置は以下であった。１）非補足コントロール（Ｃ、２１．３９％粗タンパク質）；２）０．１０％（ｗｔ／ｗｔ）酵素調製物を補足したコントロール飼料（Ｃ＋０１０Ｅ）；３）低タンパク質飼料（ＬＰ、１８％粗タンパク質）；４）０．１０％（ｗｔ／ｗｔ）酵素調製物を補足した低タンパク質飼料（ＬＰ＋０．１０Ｅ）；および５）処置２と同一であるが、５日齢よりもむしろ１日齢でトリに給与を開始した。
【００８１】
飼料給与前に酵素を０．１０Ｎ炭酸ナトリウム溶液に１ｇ酵素／１０ｍｌ溶液の比率で溶解した。その後、スプレーボトルを使用して酵素溶液を１０ｍｌ酵素調製物／ｋｇ飼料の比率で飼料の上部に噴霧し、小ボウルミキサー（Ｔｈｅ Ｈｏｂａｒｔ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，トロイ，オハイオ州）を使用して混合した。
【００８２】
消化物（ｄｉｇｅｓｔａｅ）の粘度。各実験後、檻あたり２羽を除く全てのトリをＣＯ2ガスで安楽死させた。残りの檻あたり２羽のトリを翌日まで保持した。翌日早朝に檻から給餌器を取り出して２時間飼料を与えなかった。２時間後、トリに再度飼料を自由に給与した。１時間後、トリを取り出し（一度に２羽）、その後ＣＯ2ガスを使用して安楽死させた。安楽死直後に剖検を行い、空腸内容物を１ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。トリ１羽あたり２つのサンプルを採取した。チューブを、直ちに１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、直後に市販の粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ＤＶ−ＩＩ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０，Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ストートン，マサチューセッツ州）を使用して粘度を測定するまで氷中に置いた。溶液中でいかなる細菌の成長も回避する条件下で粘度を読み取った。
【００８３】
データ分析。１日齢から開始して各実験の終了まで５日毎に体重および飼料消費を記録した。死亡率および間引き動物について修正した飼料要求率（体重に対する飼料摂取量）を計算した。死亡率を毎日記録した。各実験の体重、飼料消費、飼料要求率、および粘度の読み取りを、ＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９６）ＳＡＳ／ＳＴＡＴ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ｒｅｌｅａｓｅ ６．１１．ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）の一般線形モデル法の一元配置分析を使用して個別に分析した。比率データを、アークサイン平方根変換後にＡＮＯＶＡに供した。最小有意差を使用して平均を分離した。有意性の記述は、Ｐ≦０．０５に基づいた。
【実施例４】
【００８４】
ケラチナーゼでの家禽類飼料の補足：実験１
最終体重、累積飼料消費、および飼料要求率を、表２に示す。
【００８５】
【表２】
【００８６】
a,bＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９６）ｓｕｐｒａ）の最小自乗平均関数にしたがって、異なる上付き文字を有する列内の平均は有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
1値は、檻あたり８羽のブロイラー雛からなる４〜５つの檻の平均を示す。値は、平均±平均の標準誤差を示す。
2Ｅ＝酵素。
【００８７】
酵素処置により、一般に、Ｐ＞０．０５のｐ値で体重が改良された。低タンパク質＋０．１０％酵素処置により、低タンパク質処置よりも体重が重かった（低タンパク質＋０．１０％酵素ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ７００ｇｖｓ６６８ｇ、Ｐ＝０．０８）。酵素処置のうち低タンパク質＋０．１０％酵素処置が最も体重が重くなり、コントロール処置と異ならなかった（低タンパク質＋０．１０％酵素ｖｓコントロールではそれぞれ７００ｇｖｓ７０９ｇ）。
【００８８】
低タンパク質＋０．１５％酵素とコントロール処置との間（低タンパク質＋０．１５％酵素ｖｓコントロールではそれぞれ８２６ｇｖｓ９０１ｇ、Ｐ＜０．０５）以外は飼料消費における処置間の有意差は存在しなかった。酵素処置群間で飼料消費における有意差は存在しなかった。
【００８９】
全実験で１羽のトリのみが死亡した。この死亡したトリおよび間引いたトリの体重を飼料要求率の計算に含め、表２に示す。食餌酵素補足は、飼料要求率に対して有効限界となった。累積に基づいて、低タンパク質＋０．１０％酵素処置は、最も低い飼料要求率を示した（低タンパク質＋０．１０％酵素ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ１．５１ｖｓ１．５７、Ｐ＞０．０５）。
【００９０】
第１の実験結果により、酵素処置に応答する傾向が明らかとなった。より長い期間での酵素の正の効果をさらに分析するために、トリをさらに５日間成長させる第２の実験を行った（２６日齢）。
【実施例５】
【００９１】
ケラチナーゼでの家禽類飼料の補足：実験２
本実験は、トリをさらに５日間成長させること（２６日齢まで）以外は実験１の繰り返しであった。最終体重、累積飼料消費、および飼料要求率を、表３に示す。
【００９２】
【表３】
【００９３】
a,b,cＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９６）ｓｕｐｒａ）の最小自乗平均関数にしたがって、異なる上付き文字を有する列内の平均は有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
1値は、檻あたり８羽のブロイラー雛からなる４〜５つの檻の平均を示す。値は、平均±平均の標準誤差を示す。
2Ｅ＝酵素。
【００９４】
２６日齢で３つ全ての酵素レベルでの低タンパク質飼料の補足により、体重の改善が認められた（Ｐ＜０．０５）。低タンパク質＋０．１０％酵素処置および低タンパク質＋０．１５％酵素処置により、最も良好に体重が改善された（低タンパク質＋０．１５％酵素および低タンパク質＋０．１０％ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ１，０３２ｇおよび１，０２５ｇｖｓ９６４ｇ、Ｐ＜０．０５）。しかし、全ての酵素処置は、コントロール処置よりも体重は軽かった（Ｐ＜０．０５）（低タンパク質＋０．１５％酵素、低タンパク質＋０．１０％酵素、および低タンパク質＋０．０５％酵素ｖｓコントロールではそれぞれ１，０３２ｇ、１，０２５、および１，０１６ｇｖｓ１０８９ｇ）。
【００９５】
低タンパク質飼料を給与した全トリは、コントロール群よりも大量の飼料を消費した（Ｐ＜０．０５）。酵素処置群も低タンパク質飼料よりも大量の飼料を消費した（Ｐ＜０．０５；表２）。酵素処置区間で飼料消費の有意差は認められなかった。０．０５％および０．１５％レベルでの酵素補足により、低タンパク質処置よりも数値上良好な飼料要求率を示し、低タンパク質＋０．１０％酵素処置では低タンパク質処置よりも良好な飼料要求率を有意に示した（Ｐ＜０．０５）（低タンパク質＋０．１０％酵素ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ２．０２ｖｓ２．１４）。この実験では、低タンパク質飼料への酵素の補足により、雛の成績はコントロール飼料に相当するレベルまで改善されなかった。しかし、低タンパク質飼料への０．１０％酵素（ｗｔ／ｗｔ）レベルの補足により、低タンパク質飼料を超えて雛の成績が改善された（Ｐ＜０．０５）。
【００９６】
実験１および２のトリに、最初の５日齢までコントロール飼料を給与し、その後処置飼料を給与した。コントロール飼料により適切なエネルギー、カルシウム、リン、および必須アミノ酸が供給されるにもかかわらず、ＮＲＣ（（１９９４）ｓｕｐｒａ）の粗タンパク質推奨量の９３％しか供給されず、辛うじて適切であり、プロテアーゼ補足に感受性を示した。
【実施例６】
【００９７】
ケラチナーゼでの家禽類飼料の補足：実験３
実験３では、トリを、粗タンパク質に関してＮＲＣ（（１９９４）ｓｕｐｒａ）の推奨量の１０５％を供給し、且つエネルギー（ＮＲＣ推奨量の９５％；表１）以外の他の全ての栄養素が推奨量よりも僅かに多く供給される高タンパク質前肥育前期用飼料を給与した。雛が適切な栄養所要量を給与された後でさえも酵素がその効果を発揮し続けるかどうかを決定するために実験３を行った。
【００９８】
この実験では、たった１つの酵素レベルを使用した（０．１０％ｗｔ／ｗｔ）。しかし、酵素が辛うじて適切なブロイラー肥育前期用飼料への補足に対して効果を発揮する能力を試験するために２つの新規の処理を導入した。２つの新規の処置は、０．１０％酵素（ｗｔ／ｗｔ）を使用した実験１および２で使用した同一のコントロール飼料（２１．３９％粗タンパク質）の補足および５日齢（処置２）または１日齢（処置５）のいずれかでの雛への処置飼料の導入からなる。これにより、１日齢での酵素補足により任意のさらなる成績の改善が得られるかどうかの情報が得られた。
【００９９】
最終体重、累積飼料消費、および飼料要求率を、表４に示す。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
a,b,cＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９６）ｓｕｐｒａ）の最小自乗平均関数にしたがって、異なる上付き文字を有する列内の平均は有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
1値は、檻あたり８羽のブロイラー雛からなる４〜５つの檻の平均を示す。値は、平均±平均の標準誤差を示す。
2Ｅ＝酵素。
3この処置では、１日齢で酵素を添加した。その他の全てには５日齢で添加した。
【０１０２】
表２、表３、および表４のデータは異なる実験でのトリの最終体重数のみを示しているにもかかわらず、各実験で５日毎にトリの体重を測定した。この実験の５日間隔の数値に注目すると、実験３における低タンパク質飼料への酵素での補足により実験１および２よりも体重増加に類似の効果が認められることが明らかであった。低タンパク質飼料への酵素の補足により２１日齢のトリの体重が増加したが、Ｐ＜０．０５で効果を検出することができなかった（低タンパク質＋０．１０％酵素ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ６７９ｇｖｓ６５１ｇ）。しかし、コントロール飼料への酵素の補足（コントロール＋０．１０％酵素調製物、処置２および５）により、コントロール処置より体重が重かった（処置２および５ｖｓコントロールではそれぞれ７６７および７６４ｇ ｖｓ ６９５ｇ、Ｐ＜０．０５）。予想外に、１日齢または５日齢のいずれかで酵素を補足した場合、コントロール飼料への酵素の補足は、低タンパク質飼料に酵素を補足した場合よりも体重において有意に高い改善が認められた（表４）。これは、低タンパク質飼料に対してコントロール飼料のタンパク質および／またはアミノ酸含有量がより高いためであろう。ケラチナーゼは、異なる供給源のタンパク質を攻撃してこれらをより小さなポリペプチド成分に分解する広範なプロテアーゼ酵素である。これらのポリペプチドは、腸管腔内の消化酵素によってより容易に消化される。飼料（この場合、コントロール飼料）の粗タンパク質および／またはアミノ酸含有量がより高いことは、より多数のタンパク質成分の放出および幼若な雛がより利用可能となり、より高い体重増加も反映するように作用する酵素の基質含有量がより高いことを意味する。
【実施例７】
【０１０３】
ケラチナーゼでの家禽類飼料の補足：消化物の粘度
２２日齢（実験１および２）および２７日齢（実験３）のブロイラー雛の空腸内容物の３つ全ての実験からの粘度の読み取り（ｍＰａｓ）を表５に示す。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
a,b,cＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９６）ｓｕｐｒａ）の最小自乗平均関数にしたがって、異なる上付き文字を有する列内の平均は有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
1値は、５つの檻（１６〜２０羽）の平均を示す。値は、平均±平均の標準誤差を示す。
2Ｅ＝酵素。
3この処置では、１日齢で酵素を添加した。その他の全てには５日齢で添加した。
【０１０６】
全実験での低タンパク質飼料およびコントロール飼料へのケラチナーゼの補足により、空腸内容物の粘度が減少した。減少は、酵素補足レベルと正比例した。実験１および２では、低タンパク質飼料への０．１５％酵素の補足（低タンパク質＋０．１５％酵素）により、空腸内容物の粘度が減少した（実験１および２での低タンパク質＋０．１５％酵素ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ２．２７および１．９８ｍＰａｓｖｓ３．５９および２．３６ｍＰａｓ、Ｐ＜０．０５）。低タンパク質＋０．１５％酵素処置もまた、コントロール処置と比較した場合により低い空腸粘度であった（実験１および２での低タンパク質＋０．１５％酵素ｖｓコントロールではそれぞれ２．２７および１．９８ｍＰａｓｖｓ３．６５および２．３１ｍＰａｓ、Ｐ＜０．０５）。
【０１０７】
５日齢でコントロール飼料にケラチナーゼを補足した場合、空腸粘度も減少した（コントロール＋０．１０％酵素（実験３、処置２）ｖｓコントロールではそれぞれ２．１８ｍＰａｓｖｓ２．５５ｍＰａｓ、Ｐ＞０．０５）。しかし、１日齢で飼料に酵素を補足し始めた場合のみ有意に減少した（コントロール＋０．１０％酵素（実験３、処置５）ｖｓコントロールではそれぞれ１．９９ｍＰａｓ ｖｓ ２．５５ｍＰａｓ、Ｐ＜０．０５）。
【実施例８】
【０１０８】
種々の酵素活性を使用した給与試験
本明細書中に記載の方法に従って産生した乾燥粗酵素抽出物は、主に、ケラチナーゼ酵素から構成されているが、５ｋＤａを超える分子量を有するので、限外濾過で保持される他の型の化合物（他の酵素、炭水化物、非酵素ペプチド、ヌクレオチドフラグメントなどが含まれる）も含み得る。
【０１０９】
ブロイラー雛の成長成績とその飼料に添加した粗酵素抽出物のケラチナーゼ活性との間の相関を研究するために、さらなる実験を行った。
【０１１０】
バチルスリケニフォルミスＰ１株、Ｐ２株、およびＴ３９９株の発酵産生から得た粗酵素抽出物をこれらの研究で使用し、結果を表１に示した。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
1６日齢から２１日齢まで給与した酵素サプリメント
2６日齢から２７日齢まで給与した酵素サプリメント
3９０％超の酵素活性が阻害される
4９８％超の酵素活性が阻害される
5１日齢から２１日齢まで給与した酵素サプリメント
【０１１３】
上記実施例は本発明の例示であり、本発明を制限すると解釈されない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって説明され、特許請求の範囲の等価物が本発明に含まれる。
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本願は、２００２年８月９日出願の米国特許仮出願番号第６０／４０２，２２８号（その開示全体が本明細書中で参考として組み込まれる）の利益を主張する。
連邦政府支援の記述
【０００２】
本発明に関する研究は、米国農務省の小規模事業における革新的研究の助成金番号２００２−３３６１０−１１８５０によって一部支援されている。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、動物飼料を給与された未成熟および成長中の動物の成長成績（ｇｒｏｗｔｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）の改善方法ならびにこれを達成するための動物飼料サプリメントに関する。
【背景技術】
【０００４】
ブロイラー雛の肥育前期用飼料（ｓｔａｒｔｅｒ ｄｉｅｔ）は、相当量の粗タンパク質を含む。ほとんどの粗タンパク質は、ダイズミールなどの伝統的な飼料成分から得られる。ダイズミール（粗タンパク質含有率４８％）中に存在する約９０％の粗タンパク質は、家禽類での消化率が高い（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（１９９４）．Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｐｏｕｌｔｒｙ．９ｔｈ ｒｅｖｉｓｅｄ Ｅｄ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。伝統的なトウモロコシ−ダイズミールブロイラー肥育前期用飼料は消化率が高いと考えられているが、これらはしばしば幼若期の必要な先天的酵素の欠失により幼若雛によって容易に消化されない種々の複合タンパク質を含む（Ｕｎｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．７８：２１５−２２２）。ブロイラー飼料中へのプロテアーゼの混入が提案されているが、穀物ベースの飼料へのプロテアーゼ添加を含む多くの初期作業では、鳥類の成績は全く改善されなかった（Ｊｅｎｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９５７）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．３６：９１９−９２１）。
【０００５】
より最近では、酵素混合物（プロテアーゼおよびアミラーゼが含まれる）での家禽類飼料の酵素補足により、成長成績がいくらか改良されている（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．８１（Ｓｕｐｐｌ．１）：２５；Ｂｕｒｒｏｗｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．８１（Ｓｕｐｐｌ．１）：２９；Ｓｈｏｒｔ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉ．８１（Ｓｕｐｐｌ．１）：１３６）。トウモロコシ−ダイズブロイラー肥育前期飼料へのキシラナーゼ、プロテアーゼ、およびアミラーゼの混合物を含む酵素調製物の補足により、１４日齢および４２日齢で体重が改善されたが、飼料要求率に有意な影響を及ぼさなかった（Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，ｅｔ ａｌ．（２００２）ｓｕｐｒａ）。トウモロコシ−ダイズベースのアヒル用飼料へのこの酵素混合物の補足の際、酵素補足により、体重増加および飼料要求率が改善された（Ｂｕｒｒｏｗｓ，ｅｔ ａｌ．（２００２）ｓｕｐｒａ）。
【０００６】
家禽類飼料は、いくつかの複合抗栄養および／または不消化化合物をさらに含む。これらの化合物のいくつか（非デンプン多糖類など）は、糜粥内の粘性塊に水分が吸収されて栄養素が容易に吸収されない（Ｏｄｅｔａｌｌａｈ，２０００；Ｏｄｅｔａｌｌａｈ，ｅｔ ａｌ．（２００２）ｓｕｐｒａ）。糜粥粘度が増大するにつれて、消化酵素および栄養素の拡散速度が減少し、それにより、腸細胞による栄養素の吸収が妨害される。糜粥濃度の増加につれて脂肪ミセル形成および吸収も減少し、それにより多くの脂溶性化合物（脂溶性ビタミン、色素、および脂質が含まれる）の吸収が損なわれる（Ｆｅｒｋｅｔ ａｎｄ Ｖｅｌｄｋａｍｐ（１９９９）Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ １９９８ Ｗｏｒｌｄ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，ｐｇｓ ４３−５２）。したがって、内溶解性（ｅｎｄｏｌｙｔｉｃ）酵素活性によって達成された粘度の減少は、高粘度シリアルを給与した幼若雛で見出された改善で役割を果たすことができ、種々の酵素の相対効果はその粘性減少能力に関連するようである（Ｒｏｔｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ Ａｇｒｉｃ．５０：１９−２７）。
【０００７】
ＰＷＤ−１キナーゼは、バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１の成長培地から最初に精製された酵素である（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５６：１５０９−１５１５；Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５８：３２７１−３２７５）。ＰＷＤ−１ケラチナーゼは、広範なタンパク質基質（カゼイン、コラーゲン、エラスチン、およびケラチンが含まれる）を加水分解する（Ｓｈｉｈ（２００１）Ｉｎ：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ，ｐｇｓ ２４４−２４７）。ＰＷＤ−１ケラチナーゼを使用して、市販の羽毛粉と無細胞ケラチナーゼとの一晩のインキュベーションによって加水分解羽毛粉が製造されている（Ｃａｒｔｅｒ（１９９８）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｋｅｒａｔｉｎａｓｅ：Ａｓｓａｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒａｌｅｉｇｈ，ＮＣ）。Ｓｈｉｈらに付与された米国特許第４，９０８，２２０号；同第５，１８６，９６１号；および同第５，０６３，１６１号も参照のこと。
【０００８】
前述にもかかわらず、ブロイラー雛の成長成績を増大させるさらなる方法およびこれを達成する動物飼料サプリメントが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、動物飼料を給与された未成熟動物および成長中の動物の成長成績を増大させる方法および組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の態様は、肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の体重増加の促進に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の成長方法に関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、肉用家禽類に肥育前期用飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の体重増加の促進に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の成長方法に関する。
【００１２】
本発明のさらなる態様は、肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率の改善に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率を改善する方法に関する。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類における動物飼料の消化率の増大に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の消化率を増大させる方法に関する。
【００１４】
本発明の別の態様は、肉用家禽類に肥育前期用飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の死亡率の減少に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の死亡率を減少させる方法に関する。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、本質的にケラチナーゼ、タンパク質、および炭水化物からなる動物飼料に関する。
【００１６】
本発明のさらなる態様は、粗ケラチナーゼ酵素抽出物の製造方法に関する。
【００１７】
本発明は、さらに、孵化栄養状態の改良ならびにそれによる肉用家禽類のより高い成長成績レベルを達成するための未成熟のトリの耐病性および生存性の増大に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
上記および本発明の他の態様を、本明細書中に記載の他の実施形態に関してより詳細に記載する。本発明を異なる形態で実施することができ、且つ本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきでないことを認識すべきである。むしろ、本開示が詳細且つ完全であり、且つ当業者に本発明の範囲が完全に伝達されるようにこれらの実施形態を提供する。
【００１９】
本明細書中の発明の説明で使用された専門用語は、特定の実施形態の説明のみを目的とし、本発明を制限することを意図しない。本発明の説明および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、他で明記しない限り、複数形も含まれることが意図される。
【００２０】
他で定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者によって一般に理解されている意味と同一である。
【００２１】
本明細書中で引用された全ての刊行物、米国特許出願、米国特許、および他の引例は、その全体が本明細書中で参考として組み込まれる。
【００２２】
本明細書中で使用される、用語「肉用家禽類」は、当業者によって理解される肉の消費のために製造または使用される任意の鳥類をいう。このような鳥類の例には、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、および走鳥類などが含まれるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書中で使用される、用語「未成熟のトリ」は、完全な成長、分化、または発達を欠く鳥類のメンバーをいう。このようなメンバーは、成熟形態または状態を定義する潜在的な能力を有し得る。未成熟のトリは、約１日齢から約５０日齢まで、好ましくは約１日齢から約２１日齢まで、より好ましくは約１日齢から約５日齢までであり得るか、これらの範囲内のトリに匹敵する体重を有し得る。
【００２４】
本明細書中で使用される、用語「成長中のトリ」は、未成熟のトリよりも年長であるか重い鳥類のメンバーをいう。
【００２５】
本明細書中で使用される、用語「成熟したトリ」は、成長中のトリよりも年長であるか重い鳥類のメンバーをいう。
【００２６】
本明細書中で使用される、用語「ブロイラー雛」は、肉の消費のために製造されるか最終的に使用される任意の未成熟のニワトリをいう。
【００２７】
本明細書中で使用される、用語「家禽類飼料」は、トリの成長の促進または維持のための鳥類メンバーに投与することができる飼料をいう。家禽類飼料は、タンパク質源、ビタミン源、ミネラル源、エネルギー源（脂肪、炭水化物など）、さらなるタンパク質、抗生物質、および動物飼料（特に、家禽類飼料）中に含まれることが公知の他の物質または化合物を含み得る。家禽類飼料には、肥育前期用飼料、肥育後期用飼料、および仕上げ用飼料が含まれるが、これらに限定されない。「肥育前期用飼料」は、出生または孵化から所望の年齢および／または体重が得られるまでの動物に投与することができる飼料をいう。「肥育後期用飼料」は、初期成長段階の完了時に動物に投与することができる飼料をいう。「仕上げ用飼料」は、成長期から食肉解体処理までの動物に投与することができる飼料をいう。
【００２８】
本明細書中で使用される、用語「成長」または「成長成績」は、本発明の方法を実施し、そして／または組成物を投与することなく得られるものを超える体重およびサイズ（例えば、高さ、幅、直径、外周など）のいずれかまたは両方の増加をいう。成長は、動物全体または特定の組織（例えば、一般的な筋組織または特定の筋肉）の集団（例えば、重量またはサイズ）の増大を言及することができる。あるいは、成長は、ある組織集団の別の集団に対する相対的増加、特に、筋組織の他の組織（例えば、脂肪組織）に対する増加を示すことができる。成長は、さらに、栄養状態の改善および／または耐病性の増大もまた成長成績の改良を示す、栄養状態および耐病性に関する。
【００２９】
上記を考慮して、本発明の実施形態は、肉用家禽類に動物飼料として家禽類飼料を給与し、前記飼料が、前記肉用家禽類の体重増加の促進に有効な量のケラチナーゼをさらに含み、これを前記家禽類飼料に添加することとを含む、肉用家禽類の成長方法に関する。家禽類飼料は、タンパク質源（例えば、ダイズミール、魚粉、血粉、家禽類副産物（粉末家禽類屑（ｇｒｏｕｎｄ ｐｏｕｌｔｒｙ ｏｆｆａｌ））、肉粉、小麦全粒粉、ナタネ、カノーラ、およびこれらの組み合わせ）を含む動物飼料であり得る。動物飼料は、動物飼料での使用のために粉末に粉砕することができる炭水化物（例えば、トウモロコシ、カラスムギ、オオムギ、モロコシ、またはその組み合わせ）をさらに含む。さらに、動物飼料は、ビタミン、ミネラル、脂肪、抗生物質、および必要または所望の他の物質または化合物を含み得る。動物飼料（家禽類飼料）の非限定的な例には、オオムギ、トウモロコシ、ダイズ、コムギ、ライコムギ、およびライムギなどの穀類を含む穀類ベースの飼料が含まれる。トウモロコシ−ダイズ、コムギ−ダイズ、およびコムギ−トウモロコシ−ダイズ、モロコシ−ダイズ、およびトウモロコシ−モロコシ−ダイズは、本発明の適切な動物飼料の他の非限定的な例を示す。家禽類飼料がトウモロコシ−ダイズミール飼料である場合、トウモロコシ−ダイズミール飼料は、約６０重量％から約７０重量％までのトウモロコシおよび約２０重量％から約３０重量％までのダイズを含む。
【００３０】
家禽類飼料を、肥育前期用飼料、肥育後期用飼料、または仕上げ用飼料にさらに分類することができる。動物飼料（すなわち、家禽類飼料）の正確な組成および物理的特徴は、飼料が意図される種、動物の年齢および／または体重、ならびに給与期間に依存し、当業者はこれらを容易に決定することができる。
【００３１】
本発明の実施形態によれば、肉用家禽類の成長方法には、ケラチナーゼと共に特定のケラチン含有基質を同時に提供するは必要ない。例えば、本発明の実施形態では、Ｃａｒｔｅｒ，１９９８に記載の加水分解羽毛粉の製造と対照的に、飼料添加物として家禽類飼料にケラチナーゼを直接補足することができる。したがって、動物飼料は、本質的にケラチンを含まなくて良い（例えば、１重量％または２重量％以下のケラチン）。
【００３２】
本発明の実施に適切なケラチナーゼは、米国特許第４，９０８，２２０号および同第４，９５９，３１１号（本明細書中で引用した全特許引例の開示が本明細書中で参考として組み込まれる）に記載のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株から得られる。この細菌は、１９８８年３月２３日にブタペスト条約に従ってアメリカ合衆国、メリーランド州、ロックビルのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託し、ＡＴＣＣアクセッション番号５３７５７号が割り当てられた。本発明を実施するために使用することができる他のケラチナーゼは、ストレプトミセス・フラジアエなどの種々の細菌供給源から利用可能である。一般に、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎに付与された米国特許第２，９８８，４８７号を参照のこと；Ｇｏｋｔａｎ，Ｄ．，「Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｒａｔｅｓ ｏｆ Ｋｅｒａｔｉｎｏｕｓ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｕｓｅｄ ｂｙ Ｃｅｒｔａｉｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，」（Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ．２０７３６９ｂ），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０１，３３３（１９８４）；Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｇ．，「Ｔｈｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｈａｉｒ Ｋｅｒａｔｉｎ ｂｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ Ｃａｎｉｓ，」Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８，２８９（１９５３）；Ｋｏｈ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，「Ｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ ａｎｄ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ，」Ｂａｃｉｌｌｕｓ．Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２７４（１９５９）；Ｍｏｌｙｎｅａｕｘ，Ｇ．Ｓ．，「Ｔｈｅ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｏｏｌ ｂｙ ａ Ｋｅｒａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ Ｂａｃｉｌｌｕｓ，」Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．２７４（１９５９）；Ｎｏｖａｌ，Ｊ．ａｎｄ Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｗ．，「Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ Ｋｅｒａｔｉｎ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｆｒａｄｉａｅ，」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７７，２５１（１９５９）；Ｋａｐｉｃａ，Ｌ．ａｎｄ Ｂｌａｎｋ，Ｆ．，「Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ Ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｋｅｒａｔｉｎ ａｓ Ｓｏｌｅ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ，」Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ １１７，４３３（１９５８）；Ｋａｐｉｃａ，Ｌ．ａｎｄ Ｂｌａｎｋ，Ｆ．，「Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ａｌｂｉｃａｎｓ ｏｎ Ｋｅｒａｔｉｎ ａｓ Ｓｏｌｅ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｎｉｔｒｏｇｅｎ，」Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａ １１５，８１（１９５７）も参照のこと。
【００３３】
本発明の実施のためのケラチナーゼを、コードされたケラチナーゼを発現させる条件下でケラチナーゼをコードする核酸配列を含む宿主細胞を成長させること、培地を濾過して細胞を除去すること、および限外濾過によって残存する上清を回収および濃縮してケラチナーゼを得ることによって得ることができる。受益補因子（ｂｅｎｅｆｉｃｉａｒｙ ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）も得ることができる。
【００３４】
バチルスリケニフォルミス株を本明細書中で例示しているが、ケラチナーゼをコードする核酸配列を含む他の真核微生物および原核微生物も本発明の動物飼料サプリメントの製造に有用であり得ることが意図される。ケラチナーゼをコードする核酸配列を含む真核微生物および原核微生物には、天然に酵素を産生するものならびにケラチナーゼを発現するように遺伝子操作された株が含まれ得る。一般に、タンパク質の組換え産生には、宿主細胞中でのタンパク質発現に適切な形態での組換え発現ベクターへのタンパク質をコードする核酸配列の組み込みが必要であり得る。発現に適切な形態は、核酸がｍＲＮＡに転写されてｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される様式で組換え発現ベクターがケラチナーゼタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された１つまたは複数の調節配列を含むことを提供する。調節配列には、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）が含まれ得る。このような調節配列は当業者に公知であり、Ｇｏｅｄｄｅｌ Ｄ．Ｄ．，ｅｄ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ，カリフォルニア州（１９９１）に記載されている。発現ベクターのデザインは、トランスフェクトすべき宿主細胞の選択および／または必要な発現レベルなどの因子に依存し得ると理解すべきである。ケラチナーゼタンパク質をコードする核酸配列またはこれを保有する発現ベクターを、標準的な細胞の形質転換技術によって、真核生物または原核生物起源であり得る宿主細胞に移入することができる。宿主細胞の適切な形質転換方法を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００））および他の実験マニュアルに見出すことができる。ケラチナーゼタンパク質をコードする核酸配列で形質転換した宿主細胞数は、少なくとも一部が使用した組換え発現ベクターの型および使用した形質転換技術の型に依存する。核酸を宿主細胞に一過性に移入することができるか、より典型的には、ケラチナーゼタンパク質の長期発現のために、核酸配列を宿主細胞のゲノムに安定して組み込むか宿主細胞中の安定なエピソームとしてとどめる。一旦産生されると、ケラチナーゼタンパク質を、分泌ポリペプチドとして培養培地から回収することができるが、分泌シグナルを含まず直接発現する場合、宿主細胞溶解物から回収することもできる。
【００３５】
酵母培養物などの真核微生物を、ケラチナーゼをコードする核酸配列を保有するベクターで形質転換することができる。例えば、米国特許第４，７４５，０５７号を参照のこと。サッカロミセス・セレビシエは、下等真核宿主微生物の中で最も一般的に使用されているが、多数の他の株が一般に利用可能である。酵母ベクターは、２ミクロンの酵母プラスミド由来の複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター、ケラチナーゼをコードするＤＮＡ（米国特許第５，７１２，１４７号で提供されているものなど）、ポリアデニル化配列、転写終結配列、および選択遺伝子を含んでもよい。プラスミドの例は、ＹＲｐ７である（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ，ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｇｅｎｅ ７：１４１；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｇｅｎｅ １０：１５７）。酵母ベクターにおける適切なプロモーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３）、または他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ，ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９；Ｈｏｌｌａｎｄ，ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：４９００）のプロモータが含まれる。酵母発現での使用に適切なベクターおよびプロモーターは、ＥＰＯ公開番号７３，６５７号にさらに記載されている。さらに、トリコデルマ属などの真菌株（例えば、トリコデルマロンギブラチアタム、トリコデルマリーゼイ、またはトリコデルマビリディ）は、分泌酵素発現で特に有用である。
【００３６】
ケラチナーゼを産生するために使用することができる原核宿主細胞には、グラム陰性またはグラム陽性生物（例えば、大腸菌（E.coli）またはバチルス属）が含まれる。宿主細胞の例は、E.coliＷ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５），E.coliＢ，E.coliＸ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７），E.coli２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）である。広範な種々の適切な原核生物および微生物ベクターが利用可能である。Ｅ．コリは、典型的には、ｐＢＲ３２２を使用して形質転換される。組換え細菌発現ベクターで最も一般的に使用されているプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ ２７５，６１５；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ ２８１，５４４）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８，４０５７；ＥＰＯ公開番号３６，７７６号）、およびｔａｃプロモーター（Ｄｅ Ｂｏｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：２１）が含まれる。プロモーターおよびShine-Delgarno配列（原核生物宿主発現用）は、ケラチナーゼをコードするＤＮＡに作動可能に連結される（すなわち、これらはＤＮＡからのケラチナーゼ伝令ＲＮＡの転写を促進するように位置付けられる）。ケラチナーゼ産生ではバチルス属を使用することが好ましい。バチルス用の組換え発現ベクターは、当業者に周知である。バチルス属は、バチルスアルカロフィラス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルスアミロリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルスブレビス、バチルスサーキュランス、バチルスコアグランス、バチルスフィルムス（Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ）、バチルスロータス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、バチルスレンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、バチルスリケニフォルミス、バチルスメガテリウム、バチルスプミラス、バチルスステアロサーモフィラス、バチルスズブチリス、およびバチルスチューリンゲンシスであり得る。好ましい実施形態では、バチルスリケニフォルミス株を使用する。いくつかの実施形態では、バチルスリケニフォルミスＴ３９９Ｄ株またはＰＷＤ−１株を使用する。
【００３７】
本明細書中に提供される、ケラチナーゼ酵素を、コードされたケラチナーゼを発現させる条件下での上記宿主細胞の培養および発現したケラチナーゼの回収によって産生することができる。宿主細胞を、細胞が成長する条件下で培養し、その後、コードされたケラチナーゼを発現させる条件下で培養することができるか、細胞を成長させると同時にコードされたケラチナーゼを発現させることができる。このような条件は、当業者に周知であり、宿主細胞および所望の酵素発現レベル量によって変化し得る。
【００３８】
いくつかの実施形態では、形質転換宿主細胞の培養に使用される培地は、ケラチナーゼ産生に適切な任意の培地であり得る。従来技術（遠心分離または濾過による培地からの細胞の分離、限外濾過または蒸発による上清または濾過物中のタンパク質の濃縮、およびその後の凍結乾燥または吹き付け乾燥による乾燥が含まれる）によってケラチナーゼを培地から回収する。
【００３９】
あるいは、培養物上清を、濃縮することなく分離後に吹き付け乾燥または凍結乾燥することができる。
【００４０】
ケラチナーゼは、少なくとも意図する効果を達成するのに十分な量で存在すべきであるが、ケラチナーゼ量の上限を意図する効果の達成に基づいて決定することができる。いくつかの実施形態では、動物飼料は、約０．０１重量％から約２０重量％までのバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼを含む。さらに、本発明の実施で使用されるケラチナーゼは、粗形態または純粋な形態であり得る。粗形態のケラチナーゼを、例えば、その液体成長培地（粗ケラチナーゼを含む液体成長培地）からのケラチナーゼを産生する細菌細胞の分離によって調製することができる。あるいは、細胞を液体培養培地中に（化学的または物理的に）溶解して、粗無細胞抽出物を産生することができる。このような抽出物の他の調製手段は、当業者に自明である。粗キナーゼを、適合可能な任意の形態（水性形態または凍結乾燥形態など）にて飼料中に含めることができる。いくつかの実施形態では、粗ケラチナーゼは、凍結乾燥形態である。
【００４１】
純粋（または実質的に純粋な）ケラチナーゼを、公知の技術による上記の粗ケラチナーゼのその個別の構成要素への分離によって得ることができる。一般に、Ｗ．Ｊａｋｏｂｙ，Ｅｄ．，Ｅｎｚｙｍｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２（１９７１）およびｖｏｌ．１０４，ｐｔ．Ｃ（１９８４），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照のこと。カラムクロマトグラフィなどの多数の適切な分離手順が当業者に公知である。各構成タンパク質を、ケラチン様物質を分解する能力についてスクリーニングすることができ、ケラチン様物質を最も良好に分解する構成要素はケラチナーゼを含む。粗ケラチナーゼと同様に、純粋なケラチナーゼを任意の適切な形態（水性形態および凍結乾燥形態が含まれる）で使用することができる。
【００４２】
本発明の実施形態は、さらに、肉用家禽類に動物飼料として家禽類飼料を給与し、前記飼料が、前記飼料が肉用家禽類に提供した動物飼料の飼料利用効率の改善に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率を改善する方法に関する。動物飼料には、上記の動物飼料が含まれる得るが、特定の実施形態では、トウモロコシ−ダイズミールであり得る。ケラチナーゼには、上記ケラチナーゼ（バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれ得る。上記のように、ケラチナーゼは、粗抽出物形態または純粋な形態の酵素であり得る。
【００４３】
「飼料利用効率の改善」は、本発明の方法の実施および／または組成物の投与を実施せずに得られたものと比較した飼料要求率（ＦＣＲ）の減少をいう。ＦＣＲは、消費飼料の量と動物の体重増加との比である。本発明の１つの実施形態では、腸エネルギー消費が同時増加することなく胃腸栄養吸収の増加によって飼料利用効率を改善することができる。本発明の別の実施形態では、動物飼料の消化率の増大によって飼料利用効率を改善することができる。本発明の別の実施形態では、動物飼料の粘度の減少によって飼料利用効率を改善することができる。特定の実施形態では、本発明は、肉用家禽類に動物飼料として家禽類飼料を給与し、前記飼料が、前記肉用家禽類における動物飼料の消化率の増大に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の消化率を増大させる方法に関する。動物飼料には、上記の動物飼料が含まれ得るが、特定の実施形態では、トウモロコシ−ダイズミールであり得る。ケラチナーゼには、上記ケラチナーゼ（バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれ得る。上記のように、ケラチナーゼは、粗抽出物形態または純粋な形態の酵素であり得る。「動物飼料の消化率の増大」は、飼料摂取または栄養素の消化を同時に増大させること無く動物の腸から吸収された栄養素の利用可能性の増大をいう。本発明のいくつかの実施形態では、動物の腸中に存在する物質の粘度または消化物（ｄｉｇｅｓｔａ）の粘度が減少する。他の実施形態では、動物が栄養素として利用不可能にする栄養素の取り込みが減少する。
【００４４】
他の実施形態では、本発明は、肉用家禽類に動物飼料として家禽類飼料を給与し、前記飼料が、前記肉用家禽類（例えば、未成熟のトリ、より詳細にはブロイラー雛）の死亡率の減少に有効な量のケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の死亡率を減少させる方法に関する。動物飼料には、上記の動物飼料が含まれ得るが、特定の実施形態では、トウモロコシ−ダイズミールであり得る。ケラチナーゼには、上記ケラチナーゼ（バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれ得る。上記のように、ケラチナーゼは、粗抽出物形態または純粋な形態の酵素であり得る。「死亡率の減少」は、本発明の方法の実施および／または組成物の投与を実施しないで起こるものと比較した出生または孵化後の動物の生存性の増加または死亡率の減少をいう。死亡率は、任意の原因（特に、ストレス、発育阻害、「飢餓（ｓｔａｒｖｅｏｕｔｓ）」、および疾患）に由来し得る。いくつかの実施形態では、本発明により、未成熟のトリの死亡率が減少する。他の実施形態では、トリは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３２、３３、３４、または３５日齢、好ましくは約１〜約２１日齢、より好ましくは約１〜５日齢である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明は、主成分としてタンパク質、炭水化物、およびケラチナーゼを含む動物飼料に関する。ケラチナーゼは、動物飼料を補足する主成分である。動物飼料には、上記の動物飼料が含まれ得るが、特定の実施形態では、トウモロコシ−ダイズミールであり得る。ケラチナーゼには、上記ケラチナーゼ（バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれ得る。上記のように、ケラチナーゼは、粗抽出物形態または純粋な形態の酵素であり得る。
【００４６】
本発明によって提供された動物飼料サプリメントを、動物飼料（オオムギを含むものなど）と直接混合して最終飼料を調製することができる。あるいは、動物飼料サプリメントを、ビタミン動物飼料サプリメント、ミネラル動物飼料サプリメント、およびアミノ酸動物飼料サプリメントなどの１つまたは複数の他の動物飼料サプリメントと混合することができる。いくつかの異なる型の成分を含む得られた適量の動物飼料サプリメントを、動物飼料と混合することができる。
【００４７】
本発明の動物飼料は、少なくとも意図する効果の達成に十分な量のケラチナーゼを含み、ケラチナーゼ量の上限を、意図する効果の達成に基づいて決定することができる。意図する効果には、動物成長成績（体重増加など）の増大、飼料利用効率の改善、飼料消化率の増大、および死亡率の減少が含まれるが、これらに限定されない。動物飼料に添加される動物飼料サプリメントは、１００重量％までのケラチナーゼを含み得る。サプリメントを含む動物飼料は、約５重量％から約２５重量％までのケラチナーゼを含む。いくつかの実施形態では、ケラチナーゼは、バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼである。
【００４８】
任意の動物は、本発明の適切な被験体であり、ウシ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、フェレット、および鳥類が含まれるが、本発明は、単胃動物を使用することが好ましい。適切な被験体は、任意の年齢範囲（新生動物、成長中の動物、および成熟動物が含まれる）であり得る。いくつかの実施形態では、適切な被験体は、鳥類、好ましくはニワトリ、より好ましくはブロイラー雛であり得る。他の実施形態では、適切な被験体は、ニワトリであり得る。さらに他の実施形態では、適切な被験体は、未成熟、成長中、または成熟したトリであり得る。他の実施形態では、適切な被験体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、もしくは６５日齢またはこれらの数の任意の範囲内のニワトリであり得る。したがって、本発明は、種々の異なる飼料（ペット用飼料、家禽類飼料、および豚用飼料が含まれる）を提供する。
【００４９】
本発明の動物飼料サプリメントにより、そのエネルギーおよび／またはタンパク質および／またはアミノ酸含有量の減少によって従来の動物飼料を改変すると同時に動物が利用可能なエネルギー、タンパク質、およびアミノ酸の栄養レベルを同一に維持することができる。したがって、動物飼料中に典型的に含まれる高価なエネルギーおよびタンパク質サプリメントの量を、従来の飼料と比較して減少させることができる。
【００５０】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供するが、本発明を制限すると解釈すべきではない。
【実施例１】
【００５１】
組換えバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株からのケラチナーゼの産生
野生型バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株を使用したケラチナーゼ産生のために発酵スケールアップストラテジーをデザインした。
【００５２】
ＬＢ培地でのフラスコ培養。１．０Ｌの蒸留水、１５ｇ ＢＡＣＴＯ（登録商標）寒天、１０ｇＮａＣｌ、１０ｇ ＢＡＣＴＯ（登録商標）トリプトン、および５．０ｇ酵母抽出物を含む製造者の説明書にしたがって調製したＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地にてフラスコ培養を行った。バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株をグリセロールストックからＬＢプレートに画線し、５０℃で８〜１２時間成長させた。次いで、バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株の１コロニーを、ＬＢプレートから５００ｍｌ ＬＢ培地を含むフラスコに移し、５０℃で６時間成長させた。
【００５３】
種培養物。バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株の種培養物を、０．７ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｇ／Ｌ脱脂ダイズ粉、および０．１ｇ／Ｌ消泡剤を含む培地に入れた。種培養物の初期ｐＨを、１Ｍ ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．０に調整した。
【００５４】
５００ｍｌのフラスコ培養物を、種培養培地を含む約１０Ｌ〜２０Ｌの第１段階の種発酵槽に移し、２．５％〜５．０％の接種材料サイズに達するまで５０℃で８〜１２時間成長させた。次いで、第１段階の種培養物を、１００Ｌ、２５０Ｌ、または８００Ｌの第２段階の種発酵槽に移し、５０℃で８時間成長させ、その後３７℃にシフトした。
【００５５】
種培養物について、細胞密度は約８時間または１０時間の培養プロセスで少なくとも３×１０8ＣＦＵ／ｍＬに達した。
【００５６】
産生培地。バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株のために使用した産生培養培地は、０．７ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｇ／Ｌ脱脂ダイズ粉、および０．１ｇ／Ｌ消泡剤を含んでいた。産生培養物の初期ｐＨを、１Ｍ ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．０に調整した。
【００５７】
第２段階の種培養物を、培養最終段階のための産生培養培地を含む産生発酵槽に移した。最終段階の培養を５０℃で８時間行い、回収前の総培養時間は約２４時間〜３０時間に達した。
【００５８】
上記培養ステップ中、培養培地の初期ｐＨを７．０に調整したが、培養プロセス中にｐＨを調整しなかった。バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１株の至適溶解酸素レベルは約２０％であった。摂取材料サイズは約２．５％〜５％であり、摂取材料の経過時間は、約８〜１２時間であった。
【００５９】
産生培養物について、ピーク細胞密度は、約２０または２４時間の培養プロセスで１．２×１０9ＣＦＵ／ｍＬに達した。アゾカゼインアッセイで測定したピーク酵素活性は、約２４時間〜３０時間の培養プロセスでｍＬあたり３５〜４０Ａ450に達した。産生培養培地のｐＨ値は７．０から８．３に変化したが、酵素活性および産生性は高レベルのままであり、ｐＨ調節が必要ないことを示した。
【００６０】
回収および下流プロセシング。回収前に産生培養物の酵素活性をチェックした。培養物の上清を、遠心分離によって細胞塊から分離し、その後限外濾過または蒸発によって濃縮した。濃縮した液体酵素を吹き付け乾燥させた。
【００６１】
あるいは、培養物の上清を、細胞塊からの分離後濃縮せずに直接吹き付け乾燥させた。
【００６２】
酵素収率および酵素活性。１００Ｌ産生培養物について、回収前にアゾカゼインアッセイによって測定した酵素活性は３，０００〜３，５００Ｕ／ｍｌであり、細胞数は、１．３×１０9ＣＦＵ／ｍＬであった。１００Ｌ産生培養物の総乾燥重量は、９．１２ｇ／Ｌであり、そのうち不溶性乾燥重量が２．１５ｇ／Ｌであり、可溶性乾燥重量が６．８８ｇ／Ｌであった。
【００６３】
粗酵素収率は約１．７５〜２．０ｇ／Ｌであった。５ｋＤａ分子量カットオフを使用したＰｅｌｌｉｃｏｎ濾過による発酵上清の濃縮によって粗酵素を調製し、凍結乾燥させた。粗乾燥酵素の酵素活性は、アゾカゼインアッセイで測定したところ約１，０００，０００〜約１，４００，０００Ｕ／ｇであった。粗乾燥酵素の総タンパク質含有量は約３０〜３６％であり、その約１４〜２０％が純粋なケラチナーゼからなる。
【実施例２】
【００６４】
組換えバチルスリケニフォルミスＴ３９９Ｄ株からのケラチナーゼの産生
組換えバチルスリケニフォルミスＴ３９９Ｄ株（以後「バチルスリケニフォルミスＴ１株」）を使用したケラチナーゼ産生のために発酵スケールアップストラテジーをデザインした。
【００６５】
ＬＢ培地でのフラスコ培養。１．０Ｌの蒸留水、１５ｇ ＢＡＣＴＯ（登録商標）アガー、１０ｇＮａＣｌ、１０ｇ ＢＡＣＴＯ（登録商標）トリプトン、および５．０ｇ酵母抽出物を含む製造者の説明書にしたがって調製したＬＢ培地にてフラスコ培養を行った。バチルスリケニフォルミスＴ１株をグリセロールストックからＬＢプレートに画線し、３７℃で１８時間成長させた。次いで、バチルスリケニフォルミスＴ１株の１コロニーを、ＬＢプレートから５００ｍｌ ＬＢ培地を含むフラスコに移し、３７℃で６時間成長させた。６６０ｎｍでの光学密度の測定によって、細胞成長をモニターした（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ Ｓｅｒｉｅｓ ６６０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，フラートン，カリフォルニア州）。６時間の成長後、１．０を超えるＯＤ660が測定された。
【００６６】
種培養物。バチルスリケニフォルミスＴ１株の種培養物を、０．７ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１０ｇ／Ｌ脱脂ダイズ粉、および０．１ｇ／Ｌ消泡剤を含む培地に入れた。種培養物の初期ｐＨを、１Ｍ ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．０に調整した。
【００６７】
５００ｍｌのフラスコ培養物を、種培養培地を含む約１０Ｌ〜２０Ｌの第１段階の種発酵槽に移し、２．５％〜５．０％の接種材料サイズに達するまで３７℃で８時間成長させた。次いで、第１段階の種培養物を、１００Ｌ、２５０Ｌ、または８００Ｌの第２段階の種発酵槽に移し、３７℃で８時間成長させた。
【００６８】
産生培地。バチルスリケニフォルミスＴ１株のために使用した産生培養培地は、０．７ｇ／Ｌ ＫＨ2ＰＯ4、１．４ｇ／Ｌ Ｋ2ＨＰＯ4、０．１ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、１３ｇ／Ｌ脱脂ダイズ粉、４０ｇ／Ｌデンプン、１３ｇ／Ｌ羽毛粉、および０．１ｇ／Ｌ消泡剤を含んでいた。産生培養物の初期ｐＨを、１Ｍ ＨＣｌまたはＮａＯＨの添加によって７．０に調整した。
【００６９】
第２段階の種培養物を、培養最終段階のための産生培養培地を含む産生発酵槽に移した。最終段階の培養を３７℃で４８時間行い、その後回収した。
【００７０】
上記培養ステップ中、培養培地の初期ｐＨを７．０に調整したが、ｐＨを調整しなかった。バチルスリケニフォルミスＴ１株の至適溶解酸素レベルは約３０％であった。摂取材料サイズは約２．５％〜５％であり、摂取材料の経過時間は、約１２時間であった。
【００７１】
回収および下流プロセシング。回収前に産生培養物の酵素活性をチェックした。培養物の上清を、遠心分離によって細胞塊から分離し、その後限外濾過または蒸発によって濃縮した。濃縮した液体酵素を吹き付け乾燥させた。
【００７２】
あるいは、培養物の上清を、細胞塊からの分離後濃縮せずに直接吹き付け乾燥させた。
【００７３】
酵素収率および酵素活性。１００Ｌ産生培養物について、回収前にアゾカゼインアッセイによって測定した酵素活性は３０，０００〜３５，０００Ｕ／ｍｌであり、細胞数は、６．０×１０9ＣＦＵ／ｍＬであった。１００Ｌ産生培養物の総乾燥重量は、４０ｇ／Ｌであり、そのうち不溶性乾燥重量が１５ｇ／Ｌであり、可溶性乾燥重量が２５ｇ／Ｌであった。
【００７４】
直接乾燥培養上清由来の粗酵素収率は約２０ｇ／Ｌであり、１０ｋＤａ分子量カットオフを使用したＰｅｌｌｉｃｏｎ濾過によって得た培養物濃度由来の粗酵素収率は１６ｇ／Ｌであった。粗乾燥酵素の酵素活性は、アゾカゼインアッセイで測定したところ１，０００，０００Ｕ／ｇ超であった。
【実施例３】
【００７５】
家禽類飼料へのケラチナーゼの補足のための材料と方法
トリおよび収容。３つの実験を行った。各実験では、１９２日齢のブロイラー雛の体重を測定し、２つのＡｌｔｅｒｎａｔｅ Ｄｅｓｉｇｎバッテリー（Ｗｉｌｖｅｃｏ，ビルリカ，マサチューセッツ州）に対して完全に無作為なデザインの２４個のケージに無作為に割り当てた。トリの体重を測定し、羽を縛り、５日齢（実験１および２）および１日齢（実験３）で実験処置を施した。檻あたり８羽のトリを使用して４回繰り返したコントロール処理以外は、檻あたり８羽のトリを使用して各処置を５回繰り返した。トリを、温度、換気、および照明（２４時間／日）を制御した部屋に収容した。実験期間中、トリに給餌器で飼料をおよびニップルドリンカーで水を自由に給与した。
【００７６】
ＰＷＤ−１ケラチナーゼ酵素。酵素ＰＷＤ−１ケラチナーゼを、標準的な方法を使用して１５０Ｌの発酵槽で産生した（Ｗａｎｇ ａｎｄ Ｓｈｉｈ（１９９８）Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：６０８−６１６）。簡単に述べれば、バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）ｓｕｐｒａ）を、発酵槽にて５０℃で４８時間成長させる。無細胞培地を、膜限外濾過によって濃縮し、凍結乾燥機にて乾燥させた。典型的には、粗酵素の収率は２．０ｇ／Ｌであった。粗キナーゼの活性は、アゾケラチンの加水分解（Ｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９２）ｓｕｐｒａ）によって測定したところ、３００，０００Ｕ／ｇであった。
【００７７】
食餌処理。全飼料を、最小費用線形計画ソフトウェアを使用して計画し、表１に示す。
【００７８】
【表１】
【００７９】
1実験３のみにおいて最初の５日齢のトリに自由に給与する。
2実験１および２において最初の５日齢のトリに自由に給与する。全ての実験では、コントロール処置を施したトリに最初の５日齢以降同一の飼料を給与し続け、他のトリに対応する処置を施した。
3ミネラルプレミックスは、Ｅａｓｔｅｒｎ Ｍｉｎｅｒａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，ＮＣから入手し、以下（飼料１ｋｇあたり）：ＺｎＳＯ4から１２０ｍｇのＺｎ；ＭｎＳＯ4から１２０ｍｇのＭｎ；ＦｅＳＯ4Ｃ５Ｈ2Ｏから８０ｍｇのＦｅ；ＣｕＳＯ4から１０ｍｇのＣｕ；ＣａＩＯ4から２．５ｍｇのＩ；ＣｏＳＯ4から１ｍｇのＣｏが供給される。
4ビタミンプレミックスは、Ｒｏｃｈｅ，Ｎｕｔｌｅｙ，ＮＪから入手し、以下（飼料１ｋｇあたり）：１３，２００ＩＵのビタミンＡ；４，０００ＩＣＵのビタミンＤ；６６ＩＵのビタミンＥ；３９．６ＦｇのビタミンＢ12；１３．２ｍｇのリボフラビン；１１０ｍｇのナイアシン；２２ｍｇのｄ−パントテン酸；０．４ｍｇのビタミンＫ；２．２ｍｇの葉酸；４．０ｍｇのチアミン；７．９ｍｇのピリドキシン；０．２５３ｍｇのビオチン；１００ｍｇのエトキシキンが供給される。
5セレンプレミックスにより、Ｎａ2ＳｅＯ3として０．２ｍｇＳｅ／ｋｇ飼料が供給される。
6計算分析。
【００８０】
実験を通して、全飼料をマッシュ形態で給与した。トリに、１日齢のトリに基礎飼料を給与し、その後５日齢で対応する実験飼料に切り換えた。実験１では、最初の５日間に給与した基礎飼料は、粗タンパク質についての米国学術研究会議（ＮＲＣ）推奨値（（１９９４）ｓｕｐｒａ）の約９３％であるが、必須アミノ酸、エネルギー、およびカルシウムおよびリン酸含有量は１００％であった。実験２および３では、最初の５日間に給与した基礎飼料は、エネルギーについての米国学術研究会議（ＮＲＣ）推奨値（（１９９４）ｓｕｐｒａ）の約９５％であり、カルシウムおよびリン酸は１００％であるが、粗タンパク質含有量は１０５％であった。その後、１つの檻のブロイラー雛を、各実験の終了（実験１および３では２１日目、実験２では２６日目）まで５つの飼料処置のうちの１つに供した。実験１および２における５つの飼料処理は以下であった。１）非補足コントロール飼料（Ｃ、２１．３９％粗タンパク質）；２）低タンパク質飼料（ＬＰ、１８％粗タンパク質）；３）０．０５％（ｗｔ／ｗｔ）酵素調製物を補足した低タンパク質飼料（ＬＰ＋０．０５Ｅ）；４）０．１０％（ｗｔ／ｗｔ）酵素調製物を補足した低タンパク質飼料（ＬＰ＋０．１０Ｅ）；および５）０．１５％（ｗｔ／ｗｔ）酵素調製物を補足した低タンパク質飼料（ＬＰ＋０．１５Ｅ）。コントロール飼料は、実験１において最初の５日齢のトリに給与した基礎飼料と同一である。これで処置したトリに５日齢後に同一の飼料を給与し続け、残りの処置を５日齢での実験飼料と切り換えた。実験３の飼料処置は以下であった。１）非補足コントロール（Ｃ、２１．３９％粗タンパク質）；２）０．１０％（ｗｔ／ｗｔ）酵素調製物を補足したコントロール飼料（Ｃ＋０１０Ｅ）；３）低タンパク質飼料（ＬＰ、１８％粗タンパク質）；４）０．１０％（ｗｔ／ｗｔ）酵素調製物を補足した低タンパク質飼料（ＬＰ＋０．１０Ｅ）；および５）処置２と同一であるが、５日齢よりもむしろ１日齢でトリに給与を開始した。
【００８１】
飼料給与前に酵素を０．１０Ｎ炭酸ナトリウム溶液に１ｇ酵素／１０ｍｌ溶液の比率で溶解した。その後、スプレーボトルを使用して酵素溶液を１０ｍｌ酵素調製物／ｋｇ飼料の比率で飼料の上部に噴霧し、小ボウルミキサー（Ｔｈｅ Ｈｏｂａｒｔ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，トロイ，オハイオ州）を使用して混合した。
【００８２】
消化物（ｄｉｇｅｓｔａｅ）の粘度。各実験後、檻あたり２羽を除く全てのトリをＣＯ2ガスで安楽死させた。残りの檻あたり２羽のトリを翌日まで保持した。翌日早朝に檻から給餌器を取り出して２時間飼料を与えなかった。２時間後、トリに再度飼料を自由に給与した。１時間後、トリを取り出し（一度に２羽）、その後ＣＯ2ガスを使用して安楽死させた。安楽死直後に剖検を行い、空腸内容物を１ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。トリ１羽あたり２つのサンプルを採取した。チューブを、直ちに１２，０００×ｇで５分間遠心分離し、直後に市販の粘度計（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ，Ｍｏｄｅｌ ＤＶ−ＩＩ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０，Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ストートン，マサチューセッツ州）を使用して粘度を測定するまで氷中に置いた。溶液中でいかなる細菌の成長も回避する条件下で粘度を読み取った。
【００８３】
データ分析。１日齢から開始して各実験の終了まで５日毎に体重および飼料消費を記録した。死亡率および間引き動物について修正した飼料要求率（体重に対する飼料摂取量）を計算した。死亡率を毎日記録した。各実験の体重、飼料消費、飼料要求率、および粘度の読み取りを、ＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９６）ＳＡＳ／ＳＴＡＴ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ｒｅｌｅａｓｅ ６．１１．ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ）の一般線形モデル法の一元配置分析を使用して個別に分析した。比率データを、アークサイン平方根変換後にＡＮＯＶＡに供した。最小有意差を使用して平均を分離した。有意性の記述は、Ｐ≦０．０５に基づいた。
【実施例４】
【００８４】
ケラチナーゼでの家禽類飼料の補足：実験１
最終体重、累積飼料消費、および飼料要求率を、表２に示す。
【００８５】
【表２】
【００８６】
a,bＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９６）ｓｕｐｒａ）の最小自乗平均関数にしたがって、異なる上付き文字を有する列内の平均は有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
1値は、檻あたり８羽のブロイラー雛からなる４〜５つの檻の平均を示す。値は、平均±平均の標準誤差を示す。
2Ｅ＝酵素。
【００８７】
酵素処置により、一般に、Ｐ＞０．０５のｐ値で体重が改良された。低タンパク質＋０．１０％酵素処置により、低タンパク質処置よりも体重が重かった（低タンパク質＋０．１０％酵素ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ７００ｇｖｓ６６８ｇ、Ｐ＝０．０８）。酵素処置のうち低タンパク質＋０．１０％酵素処置が最も体重が重くなり、コントロール処置と異ならなかった（低タンパク質＋０．１０％酵素ｖｓコントロールではそれぞれ７００ｇｖｓ７０９ｇ）。
【００８８】
低タンパク質＋０．１５％酵素とコントロール処置との間（低タンパク質＋０．１５％酵素ｖｓコントロールではそれぞれ８２６ｇｖｓ９０１ｇ、Ｐ＜０．０５）以外は飼料消費における処置間の有意差は存在しなかった。酵素処置群間で飼料消費における有意差は存在しなかった。
【００８９】
全実験で１羽のトリのみが死亡した。この死亡したトリおよび間引いたトリの体重を飼料要求率の計算に含め、表２に示す。食餌酵素補足は、飼料要求率に対して有効限界となった。累積に基づいて、低タンパク質＋０．１０％酵素処置は、最も低い飼料要求率を示した（低タンパク質＋０．１０％酵素ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ１．５１ｖｓ１．５７、Ｐ＞０．０５）。
【００９０】
第１の実験結果により、酵素処置に応答する傾向が明らかとなった。より長い期間での酵素の正の効果をさらに分析するために、トリをさらに５日間成長させる第２の実験を行った（２６日齢）。
【実施例５】
【００９１】
ケラチナーゼでの家禽類飼料の補足：実験２
本実験は、トリをさらに５日間成長させること（２６日齢まで）以外は実験１の繰り返しであった。最終体重、累積飼料消費、および飼料要求率を、表３に示す。
【００９２】
【表３】
【００９３】
a,b,cＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９６）ｓｕｐｒａ）の最小自乗平均関数にしたがって、異なる上付き文字を有する列内の平均は有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
1値は、檻あたり８羽のブロイラー雛からなる４〜５つの檻の平均を示す。値は、平均±平均の標準誤差を示す。
2Ｅ＝酵素。
【００９４】
２６日齢で３つ全ての酵素レベルでの低タンパク質飼料の補足により、体重の改善が認められた（Ｐ＜０．０５）。低タンパク質＋０．１０％酵素処置および低タンパク質＋０．１５％酵素処置により、最も良好に体重が改善された（低タンパク質＋０．１５％酵素および低タンパク質＋０．１０％ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ１，０３２ｇおよび１，０２５ｇｖｓ９６４ｇ、Ｐ＜０．０５）。しかし、全ての酵素処置は、コントロール処置よりも体重は軽かった（Ｐ＜０．０５）（低タンパク質＋０．１５％酵素、低タンパク質＋０．１０％酵素、および低タンパク質＋０．０５％酵素ｖｓコントロールではそれぞれ１，０３２ｇ、１，０２５、および１，０１６ｇｖｓ１０８９ｇ）。
【００９５】
低タンパク質飼料を給与した全トリは、コントロール群よりも大量の飼料を消費した（Ｐ＜０．０５）。酵素処置群も低タンパク質飼料よりも大量の飼料を消費した（Ｐ＜０．０５；表２）。酵素処置区間で飼料消費の有意差は認められなかった。０．０５％および０．１５％レベルでの酵素補足により、低タンパク質処置よりも数値上良好な飼料要求率を示し、低タンパク質＋０．１０％酵素処置では低タンパク質処置よりも良好な飼料要求率を有意に示した（Ｐ＜０．０５）（低タンパク質＋０．１０％酵素ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ２．０２ｖｓ２．１４）。この実験では、低タンパク質飼料への酵素の補足により、雛の成績はコントロール飼料に相当するレベルまで改善されなかった。しかし、低タンパク質飼料への０．１０％酵素（ｗｔ／ｗｔ）レベルの補足により、低タンパク質飼料を超えて雛の成績が改善された（Ｐ＜０．０５）。
【００９６】
実験１および２のトリに、最初の５日齢までコントロール飼料を給与し、その後処置飼料を給与した。コントロール飼料により適切なエネルギー、カルシウム、リン、および必須アミノ酸が供給されるにもかかわらず、ＮＲＣ（（１９９４）ｓｕｐｒａ）の粗タンパク質推奨量の９３％しか供給されず、辛うじて適切であり、プロテアーゼ補足に感受性を示した。
【実施例６】
【００９７】
ケラチナーゼでの家禽類飼料の補足：実験３
実験３では、トリを、粗タンパク質に関してＮＲＣ（（１９９４）ｓｕｐｒａ）の推奨量の１０５％を供給し、且つエネルギー（ＮＲＣ推奨量の９５％；表１）以外の他の全ての栄養素が推奨量よりも僅かに多く供給される高タンパク質前肥育前期用飼料を給与した。雛が適切な栄養所要量を給与された後でさえも酵素がその効果を発揮し続けるかどうかを決定するために実験３を行った。
【００９８】
この実験では、たった１つの酵素レベルを使用した（０．１０％ｗｔ／ｗｔ）。しかし、酵素が辛うじて適切なブロイラー肥育前期用飼料への補足に対して効果を発揮する能力を試験するために２つの新規の処理を導入した。２つの新規の処置は、０．１０％酵素（ｗｔ／ｗｔ）を使用した実験１および２で使用した同一のコントロール飼料（２１．３９％粗タンパク質）の補足および５日齢（処置２）または１日齢（処置５）のいずれかでの雛への処置飼料の導入からなる。これにより、１日齢での酵素補足により任意のさらなる成績の改善が得られるかどうかの情報が得られた。
【００９９】
最終体重、累積飼料消費、および飼料要求率を、表４に示す。
【０１００】
【表４】
【０１０１】
a,b,cＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９６）ｓｕｐｒａ）の最小自乗平均関数にしたがって、異なる上付き文字を有する列内の平均は有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
1値は、檻あたり８羽のブロイラー雛からなる４〜５つの檻の平均を示す。値は、平均±平均の標準誤差を示す。
2Ｅ＝酵素。
3この処置では、１日齢で酵素を添加した。その他の全てには５日齢で添加した。
【０１０２】
表２、表３、および表４のデータは異なる実験でのトリの最終体重数のみを示しているにもかかわらず、各実験で５日毎にトリの体重を測定した。この実験の５日間隔の数値に注目すると、実験３における低タンパク質飼料への酵素での補足により実験１および２よりも体重増加に類似の効果が認められることが明らかであった。低タンパク質飼料への酵素の補足により２１日齢のトリの体重が増加したが、Ｐ＜０．０５で効果を検出することができなかった（低タンパク質＋０．１０％酵素ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ６７９ｇｖｓ６５１ｇ）。しかし、コントロール飼料への酵素の補足（コントロール＋０．１０％酵素調製物、処置２および５）により、コントロール処置より体重が重かった（処置２および５ｖｓコントロールではそれぞれ７６７および７６４ｇ ｖｓ ６９５ｇ、Ｐ＜０．０５）。予想外に、１日齢または５日齢のいずれかで酵素を補足した場合、コントロール飼料への酵素の補足は、低タンパク質飼料に酵素を補足した場合よりも体重において有意に高い改善が認められた（表４）。これは、低タンパク質飼料に対してコントロール飼料のタンパク質および／またはアミノ酸含有量がより高いためであろう。ケラチナーゼは、異なる供給源のタンパク質を攻撃してこれらをより小さなポリペプチド成分に分解する広範なプロテアーゼ酵素である。これらのポリペプチドは、腸管腔内の消化酵素によってより容易に消化される。飼料（この場合、コントロール飼料）の粗タンパク質および／またはアミノ酸含有量がより高いことは、より多数のタンパク質成分の放出および幼若な雛がより利用可能となり、より高い体重増加も反映するように作用する酵素の基質含有量がより高いことを意味する。
【実施例７】
【０１０３】
ケラチナーゼでの家禽類飼料の補足：消化物の粘度
２２日齢（実験１および２）および２７日齢（実験３）のブロイラー雛の空腸内容物の３つ全ての実験からの粘度の読み取り（ｍＰａｓ）を表５に示す。
【０１０４】
【表５】
【０１０５】
a,b,cＳＡＳソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（１９９６）ｓｕｐｒａ）の最小自乗平均関数にしたがって、異なる上付き文字を有する列内の平均は有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。
1値は、５つの檻（１６〜２０羽）の平均を示す。値は、平均±平均の標準誤差を示す。
2Ｅ＝酵素。
3この処置では、１日齢で酵素を添加した。その他の全てには５日齢で添加した。
【０１０６】
全実験での低タンパク質飼料およびコントロール飼料へのケラチナーゼの補足により、空腸内容物の粘度が減少した。減少は、酵素補足レベルと正比例した。実験１および２では、低タンパク質飼料への０．１５％酵素の補足（低タンパク質＋０．１５％酵素）により、空腸内容物の粘度が減少した（実験１および２での低タンパク質＋０．１５％酵素ｖｓ低タンパク質ではそれぞれ２．２７および１．９８ｍＰａｓｖｓ３．５９および２．３６ｍＰａｓ、Ｐ＜０．０５）。低タンパク質＋０．１５％酵素処置もまた、コントロール処置と比較した場合により低い空腸粘度であった（実験１および２での低タンパク質＋０．１５％酵素ｖｓコントロールではそれぞれ２．２７および１．９８ｍＰａｓｖｓ３．６５および２．３１ｍＰａｓ、Ｐ＜０．０５）。
【０１０７】
５日齢でコントロール飼料にケラチナーゼを補足した場合、空腸粘度も減少した（コントロール＋０．１０％酵素（実験３、処置２）ｖｓコントロールではそれぞれ２．１８ｍＰａｓｖｓ２．５５ｍＰａｓ、Ｐ＞０．０５）。しかし、１日齢で飼料に酵素を補足し始めた場合のみ有意に減少した（コントロール＋０．１０％酵素（実験３、処置５）ｖｓコントロールではそれぞれ１．９９ｍＰａｓ ｖｓ ２．５５ｍＰａｓ、Ｐ＜０．０５）。
【実施例８】
【０１０８】
種々の酵素活性を使用した給与試験
本明細書中に記載の方法に従って産生した乾燥粗酵素抽出物は、主に、ケラチナーゼ酵素から構成されているが、５ｋＤａを超える分子量を有するので、限外濾過で保持される他の型の化合物（他の酵素、炭水化物、非酵素ペプチド、ヌクレオチドフラグメントなどが含まれる）も含み得る。
【０１０９】
ブロイラー雛の成長成績とその飼料に添加した粗酵素抽出物のケラチナーゼ活性との間の相関を研究するために、さらなる実験を行った。
【０１１０】
バチルスリケニフォルミスＰ１株、Ｐ２株、およびＴ３９９株の発酵産生から得た粗酵素抽出物をこれらの研究で使用し、結果を表１に示した。
【０１１１】
【表６】
【０１１２】
1６日齢から２１日齢まで給与した酵素サプリメント
2６日齢から２７日齢まで給与した酵素サプリメント
3９０％超の酵素活性が阻害される
4９８％超の酵素活性が阻害される
5１日齢から２１日齢まで給与した酵素サプリメント
【０１１３】
上記実施例は本発明の例示であり、本発明を制限すると解釈されない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって説明され、特許請求の範囲の等価物が本発明に含まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肉用家禽類の成長方法であって、
前記肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の体重増加の促進に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の成長方法。
【請求項２】
前記肉用家禽類が未成熟のトリである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肉用家禽類がニワトリである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ニワトリが約１日齢から６５日齢までである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ニワトリが約１日齢から２１日齢までである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ニワトリが約１日齢から７日齢までである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ニワトリがブロイラー雛である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記家禽類飼料が肥育前期用飼料である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記家禽類飼料が肥育後期用飼料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記家禽類飼料が、仕上げ用飼料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、約６０重量％から約７０重量％のトウモロコシを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、約２０重量％から約３０重量％のダイズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、約０．０１重量％から約０．０２重量％のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼが粗抽出物または純粋な酵素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
肉用家禽類の成長方法であって、
前記肉用家禽類に肥育前期用飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の体重増加の促進に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の成長方法。
【請求項１６】
肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率を改善する方法であって、
前記肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率の改善に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率を改善する方法。
【請求項１７】
肉用家禽類における動物飼料の消化率を増大させる方法であって、
前記肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類における動物飼料の消化率の増大に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の消化率を増大させる方法。
【請求項１８】
肉用家禽類の死亡率を減少させる方法であって、
前記肉用家禽類に肥育前期用飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の死亡率の減少に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の死亡率を減少させる方法。
【請求項１９】
前記肉用家禽類が未成熟のトリである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記肉用家禽類がブロイラー雛である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
本質的にダイズミール、トウモロコシミール、およびケラチナーゼからなる動物飼料。
【請求項２２】
前記動物飼料が、本質的に少なくとも約０．０１重量％のケラチナーゼからなる、請求項２１に記載の動物飼料。
【請求項２３】
前記ケラチナーゼが粗抽出物または純粋な酵素である、請求項２１に記載の動物飼料。
【請求項２４】
前記ケラチナーゼがバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼである、請求項２１に記載の動物飼料。
【請求項２５】
前記動物飼料を肥育前期用飼料に添加する、請求項２４に記載の動物飼料。
【請求項２６】
前記肥育前期用飼料がトウモロコシ−ダイズミール肥育前期用飼料である、請求項２５に記載の動物飼料。
【請求項２７】
前記動物飼料が肥育後期用飼料である、請求項２４に記載の動物飼料。
【請求項２８】
前記動物飼料が仕上げ用飼料である、請求項２４に記載の動物飼料。
【請求項１】
肉用家禽類の成長方法であって、
前記肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の体重増加の促進に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の成長方法。
【請求項２】
前記肉用家禽類が未成熟のトリである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肉用家禽類がニワトリである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ニワトリが約１日齢から６５日齢までである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ニワトリが約１日齢から２１日齢までである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ニワトリが約１日齢から７日齢までである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ニワトリがブロイラー雛である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記家禽類飼料が肥育前期用飼料である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記家禽類飼料が肥育後期用飼料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記家禽類飼料が、仕上げ用飼料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、約６０重量％から約７０重量％のトウモロコシを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、約２０重量％から約３０重量％のダイズを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、約０．０１重量％から約０．０２重量％のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記バチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼが粗抽出物または純粋な酵素である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
肉用家禽類の成長方法であって、
前記肉用家禽類に肥育前期用飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の体重増加の促進に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の成長方法。
【請求項１６】
肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率を改善する方法であって、
前記肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率の改善に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の飼料利用効率を改善する方法。
【請求項１７】
肉用家禽類における動物飼料の消化率を増大させる方法であって、
前記肉用家禽類に家禽類飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類における動物飼料の消化率の増大に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類における動物飼料の消化率を増大させる方法。
【請求項１８】
肉用家禽類の死亡率を減少させる方法であって、
前記肉用家禽類に肥育前期用飼料としてトウモロコシ−ダイズミール飼料を給与し、
前記トウモロコシ−ダイズミール飼料が、前記肉用家禽類の死亡率の減少に有効な量のバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼをさらに含むようにした、肉用家禽類の死亡率を減少させる方法。
【請求項１９】
前記肉用家禽類が未成熟のトリである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記肉用家禽類がブロイラー雛である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
本質的にダイズミール、トウモロコシミール、およびケラチナーゼからなる動物飼料。
【請求項２２】
前記動物飼料が、本質的に少なくとも約０．０１重量％のケラチナーゼからなる、請求項２１に記載の動物飼料。
【請求項２３】
前記ケラチナーゼが粗抽出物または純粋な酵素である、請求項２１に記載の動物飼料。
【請求項２４】
前記ケラチナーゼがバチルスリケニフォルミスＰＷＤ−１ケラチナーゼである、請求項２１に記載の動物飼料。
【請求項２５】
前記動物飼料を肥育前期用飼料に添加する、請求項２４に記載の動物飼料。
【請求項２６】
前記肥育前期用飼料がトウモロコシ−ダイズミール肥育前期用飼料である、請求項２５に記載の動物飼料。
【請求項２７】
前記動物飼料が肥育後期用飼料である、請求項２４に記載の動物飼料。
【請求項２８】
前記動物飼料が仕上げ用飼料である、請求項２４に記載の動物飼料。
【公表番号】特表２００６−５０６９８２（Ｐ２００６−５０６９８２Ａ）
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５４５２３２（Ｐ２００４−５４５２３２）
【出願日】平成１５年８月８日（２００３．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２４７４５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３４７７６
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５９８１３９６０１）ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ (11)
【出願人】（５０５０５０１７５）バイオリソース・インターナショナル，インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年８月８日（２００３．８．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２４７４５
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０３４７７６
【国際公開日】平成１６年４月２９日（２００４．４．２９）
【出願人】（５９８１３９６０１）ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ (11)
【出願人】（５０５０５０１７５）バイオリソース・インターナショナル，インコーポレイテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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