遺伝子欠損酵母の製造方法
【課題】遺伝子欠損させると生育阻害が生じ、特殊装置や多くの時間を要する方法でしか取得することができなかった遺伝子欠損酵母を簡便に取得することができる遺伝子欠損酵母の製造方法を提供する。
【解決手段】宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第１の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第２の工程と、前記補償経路を脱落させる第３の工程を含む遺伝子欠損酵母の製造方法。
【解決手段】宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第１の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第２の工程と、前記補償経路を脱落させる第３の工程を含む遺伝子欠損酵母の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノール以外の有用化学物質を効率的に生産することのできる酵母の製造方法に関する。さらに詳しく言えば、エタノール生産能を低減させるため遺伝子欠損させると生育阻害が生じ、従来特殊装置や多くの時間を要する方法でしか取得することができなかった遺伝子欠損酵母を簡便に取得することができる遺伝子欠損酵母の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は高濃度のグルコース存在下で高い効率でエタノールを生産するため、従来清酒やビール等の生産菌として使用されてきた。近年は、その高い増殖性、グルコース資化性、酸耐性等からバイオマスを原料とした物質生産菌としても有望視されている。
【０００３】
酵母を用いてエタノール以外の物質生産を行う場合、大量に生産されるエタノールの生産能を低減させるため、エタノール生産経路にあるピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣと略記する。）遺伝子やアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨと略記する。）遺伝子などの遺伝子破壊を行うことが望ましい。ところが、これらの遺伝子を欠損させる対象の遺伝子とした場合、特に複数の遺伝子を同時に欠損させると宿主の生育や醗酵阻害が起こることが知られており（特許文献１：特表２００３−５０００６２号公報、非特許文献１：Ｈｏｈｍａｎｎ, Ｓ. ｅｔ ａｌ. (１９９０) ＥＵＲ. Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., １８８, ｐ６１５−６２１）、酵母の代謝系遺伝子の改変により、求める物質の生産が可能な菌株を取得する際の障害となっていた。
【０００４】
一般的に、酵母の遺伝子欠損方法としては、簡便かつ高効率な相同組換えによる遺伝子置換法が用いられる（非特許文献２：Ｂａｕｄｉｎ, Ａ. ｅｔ ａｌ. (１９９３) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ., ２１, ｐ３３２９−３３３０、非特許文献３：Ｂｒａｃｈｍａｎｎ, Ｃ. Ｂ. ｅｔ ａｌ. （１９９８） Ｙｅａｓｔ, １４, ｐ１１５−１３２）。しかしながら、遺伝子欠損した菌株が生育阻害を生じる場合、相同組換えを用いた単純な遺伝子置換では、プレート上のセレクションによる変異株の取得が難しいという問題があった。従来法では胞子を形成させ、分離することにより（特許文献２：特表２００１−５１６５８４号公報、特許文献３：特開２００６−６２７１号公報）、あるいは組成を変えた培地で連続培養することにより進化工学的に（特許文献４：特表２００６−５２５０２５号公報）変異株を取得していたが、マニピュレーター等の特殊な装置が必要である上に、目的の菌株が得られるまで非常に長い時間を要するという難点もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００３−５０００６２号公報
【特許文献２】特表２００１−５１６５８４号公報
【特許文献３】特開２００６−６２７１号公報
【特許文献４】特表２００６−５２５０２５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｏｈｍａｎｎ, Ｓ. ｅｔ ａｌ. (１９９０) Ｅｕｒ. Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., １８８, ｐ６１５−６２１
【非特許文献２】Ｂａｕｄｉｎ, Ａ. ｅｔ ａｌ. (１９９３) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ., ２１, ｐ３３２９−３３３０
【非特許文献３】Ｂｒａｃｈｍａｎｎ, Ｃ. Ｂ. ｅｔ ａｌ. （１９９８） Ｙｅａｓｔ, １４, ｐ１１５−１３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、エタノール生産能を低減させるため遺伝子欠損させると生育阻害が生じ、特殊装置や多くの時間を要する方法でしか取得することができなかった遺伝子欠損酵母を簡便に取得することができる遺伝子欠損酵母の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第１の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第２の工程と、前記補償経路を脱落させる第３の工程を含む処理を行うことにより、生育阻害が生じる遺伝子を欠損させた酵母株を取得できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［１６］を含む。
［１］宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第１の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第２の工程と、前記補償経路を脱落させる第３の工程を含むことを特徴とする遺伝子欠損酵母の製造方法。
［２］前記代替代謝物が、リンゴ酸及び／またはコハク酸である［１］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［３］前記代替代謝物生産経路の構築工程が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子及び／またはリンゴ酸トランスポーター（ＭＡＥ）遺伝子を導入及び／または増幅する工程である［１］または［２］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［４］前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）が、ＭＤＨ１遺伝子、ＭＤＨ２遺伝子及びＭＤＨ３遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである［３］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［５］前記リンゴ酸トランスポーター（ＭＡＥ）が、ｍａｅ１遺伝子によりコードされるものである［３］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［６］前記補償経路の構築工程が、前記第２の工程で欠損させる遺伝子と同一の遺伝子を導入する工程である［１］〜［５］のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［７］前記補償経路の構築工程において、第３の工程において脱落させて機能欠損が可能となるような選択マーカーを有しているプラスミドを使用する［１］〜［６］のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［８］前記遺伝子欠損の対象となる遺伝子が、エタノール生合成経路の遺伝子である［１］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［９］前記エタノール生合成経路の遺伝子が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）及び／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）をコードする遺伝子である［８］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１０］前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）が、ＰＤＣ１遺伝子、ＰＤＣ５遺伝子及びＰＤＣ６遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである［９］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１１］前記アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）が、ＡＤＨ１遺伝子、ＡＤＨ２遺伝子、ＡＤＨ３遺伝子、ＡＤＨ４遺伝子及びＡＤＨ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである［９］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１２］前記第２の工程を、ＰＣＲ産物を用いたジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法を用いて行う［１］〜［１１］のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１３］前記宿主酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する［１］〜［１２］のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１４］前記宿主酵母がサッカロマイセス・セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)である［１３］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１５］前記第１〜第３の工程の少なくとも１工程における菌株の取得を、選択マーカーを含むプレート上でのセレクションにより行う［１］〜［１４］のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１６］前記選択マーカーが薬剤耐性マーカーまたは栄養要求性マーカーである［１５］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、補償経路の働きで宿主酵母の遺伝子欠損による急激な生育阻害を防ぎ、目的遺伝子の欠損株を特殊装置や長時間を要さず簡便に取得することができる。本発明の方法によれば、相同組換え及びプレートを用いた簡便なセレクションで、宿主酵母の生育阻害が生じる一つあるいは複数の遺伝子の欠損株を取得可能であり、特殊な装置を用いて胞子形成・分離を行う従来の方法に比べて、時間的・金銭的なメリットが大きい。また、本発明により得られる組換え酵母は、有機酸等の有用化学物質等を生産するための生産菌として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ジーンターゲッティングによるＡＤＨ１遺伝子の欠損とその確認の工程を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の遺伝子欠損酵母の製造方法は、宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第１の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第２の工程と、前記補償経路を脱落させる第３の工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
本明細書において「遺伝子欠損」とは、遺伝子が本来持つ機能が失われた状態を言い、遺伝子の塩基配列の一部もしくは全部が欠落すること、遺伝子の塩基配列が他の塩基配列に置換されること等により生じる。このような状態は自然に生じることもあるが、本発明では、任意の遺伝子を目的に応じて人為的に欠損させることを意味する。
【００１４】
本明細書において「生育阻害」とは、野生株に比べて遺伝子改変した酵母の増殖速度が著しく低下する状態、あるいは全く増殖できなくなった状態のこと言う。生育阻害が生じる遺伝子とは、一つあるいは複数の遺伝子を欠損させると宿主の生育阻害が起こるような代謝の主要経路の遺伝子のことを言い、例えば、グリコーゲンシンターゼ、グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルコサミンリン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ヘキソースジホスファターゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ビスホスホグリセロムターゼ、ビスホスホグリセリン酸ホスファターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセロムターゼ、エノラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸シンターゼ、イソシトラーゼ、フマル酸ヒドラターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルCoAシンテターゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ等の酵素をコードする遺伝子が挙げられる。
【００１５】
中でも、エタノールの生合成経路の遺伝子群は欠損による生育阻害が顕著であることから、本発明の欠損対象として好ましく、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣと略記する。）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨと略記する。）をコードする遺伝子が欠損対象として好ましい。特に好ましいのは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４及びＡＤＨ５遺伝子（Ｓａｃｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｎａｍｅ：ＹＬＲ０４４Ｃ，ＹＬＲ１３４Ｗ，ＹＧＲ０８７Ｃ，ＹＯＬ０８６Ｃ，ＹＭＲ３０３Ｃ，ＹＭＲ０８３Ｗ，ＹＧＬ２５６Ｗ，ＹＢＲ１４５Ｗ）である。
【００１６】
本発明において遺伝子欠損させる酵母は、遺伝子欠損可能な酵母であれば特に制限されるものではなく、例えば、サッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、クリベロマイセス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)属、シゾサッカロマイセス(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、チゴサッカロマイセス(Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、ヤロウイア(Ｙａｒｒｏｗｉａ)属、ハンゼヌラ(Ｈａｎｓｅｎｕｌａ)属、ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)属、キャンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)属等の酵母が挙げられ、中でもサッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属のものが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が特に好ましい。また、形質転換により遺伝子を導入した際に形質転換体を選抜することが容易になることから、栄養要求性を持つ菌株が好ましい。
【００１７】
本明細書において「代替代謝物」とは、欠損対象となるターゲット遺伝子を欠損させた時にターゲット遺伝子の代謝物の代わりに菌体内の酸化還元バランスを取ることができる代謝物のことを言う。例えば、エタノールの代替代謝物としては、乳酸、アクリル酸、酢酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、グリオキシル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸、レブリン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸等の有機酸類や、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール等のアルコール類が挙げられる。中でも、乳酸、リンゴ酸、コハク酸が代替代謝物として好ましく、リンゴ酸、コハク酸がより好ましい。
【００１８】
本明細書において「代替経路の構築」とは、本発明の第１の工程において代替代謝物へとつながる代謝経路の遺伝子を宿主酵母にあらかじめ導入し、これら代謝物の生産機能を付与することである。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、リンゴ酸シンターゼ、イソシトラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、フマル酸リダクターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸トランスポーター等をコードする遺伝子を使用することができる。中でも、代替代謝物となるリンゴ酸やコハク酸の生産量が増大する代替経路が構築されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸トランスポーター等の遺伝子を導入及び／または増幅することが好ましく、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＭＤＨ３遺伝子（Ｓａｃｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｎａｍｅ：ＹＫＬ０８５Ｗ，ＹＯＬ１２６Ｃ，ＹＤＬ０７８Ｃ）及びｍａｅ１遺伝子（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００１０２０２０５）のうち1種あるいは複数種を導入及び／または増幅することが特に好ましい。
【００１９】
上記導入する遺伝子の単離は、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等の公知の方法によって行うことができる。あるいは、常法により調製された全ｍＲＮＡ、全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡ、あるいは市販のｃＤＮＡライブラリー等の核酸を鋳型とし、本発明に用いられる遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるプライマーを用いたＰＣＲ法によって取得することができる。また、染色体ＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション等の公知の方法によって行うこともできる。
【００２０】
代替経路の構築に使用されるベクターは、遺伝子が導入される酵母で複製され、安定に保持されるものであればいずれのものも用いることができ、染色体組み込み型プラスミド、シングルコピー型プラスミド、マルチコピー型プラスミドなどを用いることができる。例えば、ｐＲＳシリーズのＹＩ、ＹＣ、ＹＥタイプや、ｐ４ＸＸシリーズ（Ｄｏｍｉｎｉｋ ｅｔ ａｌ., (１９９５)Ｇｅｎｅ. １５６: ｐ.１１９−１２２）等が挙げられる。ベクター中に任意の遺伝子を組み込むには、例えば、その遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素切断部位またはマルチクローニングサイトにインフレームで挿入し連結すればよい。本発明で使用する発現ベクターには、ベクターが細胞内に保持されていることを示す選択マーカーが含まれていることが好ましい。
【００２１】
上記導入する遺伝子の機能発現に用いられるプロモーターは、その発現ベクターを導入する酵母中でその制御下の遺伝子の発現を誘導できるものであれば任意のものでよい。酵母中で発現させるためには、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＣＹＣ１プロモーター等の公知のプロモーターが使用できる。このうち、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターが最も好ましい。また、ターミネーターとしては、ＥＮＯ１ターミネーター、ＧＡＬ１０ターミネーター、ＧＡＰＤＨターミネーター、ＡＤＨターミネーター、ＣＹＣ１ターミネーター等の公知のターミネーターが使用できる。
【００２２】
本明細書において「補償経路の構築」とは、本発明の第２の工程における欠損させたいターゲット遺伝子と同等の機能を発現する遺伝子を導入する工程に対応する。すなわち、遺伝子欠損の対象となるターゲット遺伝子と同一か、もしくは同等の機能発現を可能とする遺伝子を発現させてターゲット遺伝子の機能を補う状態にすることを言い、具体的には遺伝子欠損の対象となるターゲット遺伝子と同一か、もしくは同等の機能発現を可能とする遺伝子を酵母に導入し、発現させることを言う。例えば、酵母ゲノム上のＡＤＨ１遺伝子を欠損させたい場合はＰＣＲ等により単離したＡＤＨ１遺伝子を発現用プラスミドに連結し、形質転換により酵母に導入することで補償経路を構築することができる。導入する遺伝子は欠損させる遺伝子と同一のものが好ましいが、同じ機能を有するものであれば異なる遺伝子でもよいし、別の生物由来のものでもよい。また、導入する遺伝子は一種でもよいし、複数種でもよい。
【００２３】
補償経路の構築に使用されるベクターはプラスミドであることが好ましい。酵母中でプラスミドの状態で自律複製されるものであればいずれのものも用いることができる。例えば、ｐＲＳシリーズのＹＣ、ＹＥタイプや、ｐ４ＸＸシリーズ（Ｄｏｍｉｎｉｋ ｅｔ ａｌ., (１９９５)Ｇｅｎｅ. １５６: ｐ.１１９−１２２）等のベクターが挙げられる。ベクター中に任意の遺伝子を組み込むには、例えば、その遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素切断部位またはマルチクローニングサイトにインフレームで挿入し連結すればよい。補償経路構築用のプラスミドは、後に脱落させて機能欠損が可能となるような選択マーカーを有していることが好ましい。
【００２４】
本発明で用いられる遺伝子またはそれを含む組換えベクターを用いて宿主酵母を形質転換するには、一般的に行われている遺伝子導入法、例えば、コンピテントセル法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、塩化リチウム法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。形質転換体の選択は、常法に従って行うことができるが、通常は使用した組換えベクターに組み込まれた選択マーカーを利用して行うことができる。
【００２５】
本発明の第１の工程における代替代謝物生産経路の構築及び補償経路を構築する際の両者の実施順序は特に限定されない。すなわち、代替代謝物生産経路の構築後補償経路の構築を行なうこともできるし、補償経路の構築後代替代謝物生産経路の構築を行なうこともできる。また、補償経路の構築と代替代謝物生産経路の構築を同時に行なうこともできる。
【００２６】
上記遺伝子が酵母に導入されたことの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロット法等を利用して行うことができる。例えば、形質転換された酵母からプラスミドを抽出し、遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行えばよい。その増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、サイバーセーフ（ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ）等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、目的とする遺伝子が導入されたことを確認することができる。
【００２７】
本発明の第１の工程における代替経路の構築及び補償経路の構築は、染色体上のターゲット遺伝子の機能を欠損することによって生じる酵母の生育阻害を回避することを目的としている。すなわち、続く第２の工程において染色体上のターゲット遺伝子を欠損させてその機能を失っても、補償経路として導入したプラスミド上の遺伝子がその機能を補うことにより、ターゲット遺伝子が欠損されても生育可能な状態を維持できる。さらに続く第３の工程において補償経路として導入したプラスミドを脱落させても、第１の工程において代替経路を構築しておいたことにより菌体内の酸化還元バランスを取ることができる代謝物が生産され、ターゲット遺伝子が欠損されても生育可能な酵母が得られるということである。第１の工程を行わない場合、あるいは第１の工程における代替経路の構築及び補償経路の構築のいずれか一方しか行わない場合、いずれの場合も第２あるいは第３の工程において生育阻害が生じ、目的とする酵母を得ることができない。
【００２８】
本発明における前述の第１工程、第２工程及び後述の第３工程においては、一般的な薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子をマーカー遺伝子として利用することができる。例えば、Ｇ４１８耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などの公知の薬剤耐性マーカー遺伝子を使用することができる。あるいは、ウラシル要求性、リシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性、トリプトファン要求性、メチオニン要求性、ビオチン要求性、アデニン要求性などの栄養要求性を相補する公知の栄養要求性マーカー遺伝子を用いることができる。
【００２９】
本発明の第２の工程における遺伝子欠損は、一般的な相同組換えによる遺伝子置換を用いて行うことができる。例えば、ＰＣＲ産物を用いたジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法（ワンステップ遺伝子破壊）や、ＰＣＲ産物もしくはプラスミドを導入後、マーカー遺伝子を回収する遺伝子破壊法（ツーステップ遺伝子破壊）などが挙げられる。いずれの場合も、相同組換えによってターゲット遺伝子をマーカー遺伝子に置換することにより遺伝子欠損が可能となる。
【００３０】
マーカー遺伝子は、その５’末端側と３’末端側に宿主酵母の染色体ＤＮＡと相同配列を有するベクターの形態で宿主酵母内に導入され、相同配列と宿主染色体ＤＮＡとが相同組換えを起こすことにより、宿主酵母の染色体に挿入または置換によって導入され、これによってターゲット遺伝子が欠損される。塩基配列が明らかな宿主酵母の染色体ＤＮＡに基づいて相同配列を設計することにより、マーカー遺伝子を染色体の任意の位置に導入し、任意のターゲット遺伝子を欠損することができる。
【００３１】
マーカー遺伝子を宿主酵母に導入するためのベクターは、線状のＤＮＡ断片であってもよく、またプラスミドのような環状であってもよい。ベクターの導入は、公知の遺伝子導入技術を用いて行うことができる。例えば、コンピテントセル法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、塩化リチウム法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。
【００３２】
本発明において、ターゲット遺伝子が欠損されたことは、公知の方法によって確認することができる。例えば、ターゲット遺伝子の表現型による確認や、ターゲット遺伝子を挟んだ染色体上の領域に対してＰＣＲを行い、増幅された断片の大きさに基づいて確認することもできる。また、ターゲット遺伝子に特異的なプローブを用いて検出してもよい。
【００３３】
本発明における第３の工程である第１の工程にて構築した補償経路の脱落、すなわち前記プラスミドの脱落は、補償経路の構築に用いたプラスミド中の選択マーカーによる選択圧をかけずに菌株の培養を行い、酵母が分裂する際に自然にプラスミドが脱落することを利用する方法で行うことができる。プラスミドが脱落した菌株のスクリーニングには、脱落した菌株のみが生存できるポジティブスクリーニングを行うことができることから、前述の栄養要求性相補遺伝子としてＵｒａ３やＬｙｓ２のマーカーを有するプラスミド及び５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）やα−アミノアジピン酸（αＡＡ）等が含有されたプレートを用いることが好ましい。
【００３４】
酵母の培養に用いる培地は、炭素源としてグルコース、及び本発明で得られる組換え酵母が資化し得る窒素源、無機塩類、ビタミン類等を含有し、組換え酵母の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。静置培養、振とう培養、深部通気撹拌培養のいずれで行ってもよいが、振とう培養が好ましく用いられる。培養温度は通常、１５〜４０℃である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例、参考例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
工程１）代替経路及び補償経路の構築
実施例１−１、参考例１〜２：代替経路の構築
（１）ＭＤＨ３遺伝子の単離及びＭＤＨ３遺伝子を有するプラスミドの調製
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４２株の染色体ＤＮＡを、ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）を用い、添付説明書の記載に従って調製した。以下、ゲノムＤＮＡの調製は全て説明書の記載に従った。得られた染色体を鋳型とし、配列番号１及び２で示される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、約１．０ｋｂｐのＭＤＨ３遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲ反応はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、添付説明書の記載に従って行った。以下、ＰＣＲ法は全て説明書の記載に従った。ＤＮＡ断片の鎖長は、ＰＣＲ反応生成物を０．９％アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、添付された説明書の記載に従ってクローニングした。得られたプラスミドとｐ４１３ＧＰＤベクターをそれぞれＳｐｅＩ及びＳｍａＩで制限酵素処理し、ＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標） ＧＴＧ（登録商標）ａｇａｒｏｓｅ（ＣＡＭＢＲＥＸ社製）を用いて作製した１．０％アガロースゲルで電気泳動することによりＳｐｅＩ−ＳｍａＩ断片を単離、精製した。その後、Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、ＭＤＨ３遺伝子がｐ４１３ＧＰＤに連結された目的のプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００３７】
（２）ｍａｅ１遺伝子の単離及びｍａｅ１遺伝子を有するプラスミドの調製
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）のｃＤＮＡライブラリー（バイオアカデミア社）を鋳型とし、配列番号４及び５で示される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、ｍａｅ１遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ＤＮＡ断片の鎖長は、反応生成物を０．９％アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、添付説明書の記載に従ってクローニングした。得られたプラスミドとｐ４１５ＧＰＤベクターをそれぞれＳｐｅＩ及びＰｓｔＩで制限酵素処理し、ＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標） ＧＴＧ（登録商標） ａｇａｒｏｓｅ（ＣＡＭＢＲＥＸ社製）を用いて作製した１．０％アガロースゲルで電気泳動することによりＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ断片を単離、精製した。その後、Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、ｍａｅ１遺伝子がｐ４１５ＧＰＤに連結された目的のプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号６で示される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００３８】
（３）ＰＤＣ１遺伝子欠損酵母へのＭＤＨ３及びｍａｅ１遺伝子の導入
形質転換の宿主として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４２のＰＤＣ１遺伝子が欠損された市販の遺伝子欠損株（オープンバイオシステムズ社から購入、以下ΔＰＤＣ１株とする。）を用いた。
上記（１）及び（２）で調製したプラスミドを用いて、Ｃｈｅｎ Ｄ, Ｙａｎｇ Ｂ, Ｋｕｏ Ｔ. （１９９２）.Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ ２１: ８３−８４.に記載の形質転換法により、ΔＰＤＣ１株を形質転換し、実施例１−１の形質転換体１を得た。
形質転換体選択培地には、以下に示す組成のＳＤ寒天培地に必要に応じてアミノ酸を添加した寒天培地を用いた。すなわち、形質転換体１は、ＳＤ（Ｕｒａ、Ｌｙｓ）寒天培地（ＳＤ寒天培地にウラシル２０ｍｇ／Ｌ、リシン塩酸塩３０ｍｇ／Ｌを添加したもの）を用いて３０℃で３日間培養することにより生育するコロニーを選抜することにより取得した。
ＳＤ寒天培地組成：
イースト・ナイトロジェン・ベース（Yeast Nitrogen Base：Difco社製） 6.7g/L
グルコース 20g/L
寒天 20g/L
【００３９】
（４）形質転換体の培養結果
得られた形質転換体１を、以下に示す組成のＳＣ液体培地作製時に、選択マーカーに対応するアミノ酸を除いて作製した液体培地を用いて試験管培養試験を行った。すなわち、実施例１−１の形質転換体１にはヒスチジン及びロイシンを添加せずに作製したＳＣ（−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ）液体培地を用いた。参考として、形質転換していないΔＰＤＣ１株（参考例１）及びＢＹ４７４２（参考例２）を並べて培養した。参考例１及び２には通常のＳＣ液体培地を用いた。実施例１−１及び参考例１〜２に使用したプラスミド、寒天培地及び液体培地を表１に示す。
各培地５ｍＬに、各プレートから１白金耳植菌し、３０℃で一晩培養し、これを前培養溶液とした。得られた前培養溶液を、新たな試験管中のＳＣ液体培地５ｍＬに初発の濁度（ＯＤ６６０）が０．０５になるように植菌し、３０℃で培養した。ＯＤ６６０は濁度計（ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ５１８Ｒ，ＴＡＩＴＥＣ社製）で測定した。また培養上清中のエタノール、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸の含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィー（島津製作所社製）を用いて定量した。結果を表２に示す。
【００４０】
ＳＣ液体培地組成：
イースト・ナイトロジェン・ベース（Yeast Nitrogen Base：Difco社製） 6.7g/L
グルコース 20g/L
硫酸アデニン 20mg/L
ウラシル 20mg/L
トリプトファン 20mg/L
ヒスチジン塩酸塩 20mg/L
アルギニン塩酸塩 20mg/L
メチオニン 20mg/L
チロシン 30mg/L
ロイシン 60mg/L
イソロイシン 30mg/L
リシン塩酸塩 30mg/L
フェニルアラニン 40mg/L
グルタミン酸 100mg/L
アスパラギン酸 100mg/L
バリン 150mg/L
トレオニン 200mg/L
セリン 400mg/L
液体クロマトグラフィー分析条件：
サンプル：培養上清、
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ１０１１（３００ × ８．０ ｍｍ、昭和電工（株）製）、
移動相：２０ ｍＭ 硫酸、
流速 ：０．６ ｍｌ／分、
カラム温度：６０℃、
検出 ：ＲＩ検出器。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２に示す通り、実施例１のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、参考例１、２よりも多くの有機酸を生産しており、代替経路の構築が確認された。
【００４４】
実施例１−２：補償経路の構築
（５）ＡＤＨ１遺伝子の単離及びＡＤＨ１遺伝子を有するプラスミドの調製
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４２株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８で示される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＨ１遺伝子を含む約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ＤＮＡ断片の鎖長は、反応生成物を０．９％アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、添付された説明書の記載に従ってクローニングした。得られたプラスミドとｐ４２６ＧＰＤベクターをＣｌａＩ及びＳａｌＩで制限酵素処理し、ＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標） ＧＴＧ（登録商標） ａｇａｒｏｓｅ（ＣＡＭＢＲＥＸ社製）を用いて作製した１．０％アガロースゲルで電気泳動することによりＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片を単離、精製した。その後、Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、ＡＤＨ１遺伝子がｐ４２６ＧＰＤに連結された目的のプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号９で示される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００４５】
（６）形質転換体１へのＡＤＨ１遺伝子の導入
上記（５）で調製したプラスミドを、Ｃｈｅｎ Ｄ, Ｙａｎｇ Ｂ, Ｋｕｏ Ｔ. （１９９２）.Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ ２１: ８３−８４.に記載の形質転換法により実施例１−１の形質転換体１へと導入した。培地には、ＳＤ寒天培地にリシン塩酸塩３０ｍｇ／Ｌを添加したＳＤ（Ｌｙｓ）寒天培地を用い、３０℃で３日間培養し、表３に示す実施例１−２の形質転換体２を取得した。
【００４６】
【表３】
【００４７】
実施例１−２の形質転換体２からプラスミドを抽出し、ＰＣＲ法によってＡＤＨ１の遺伝子が導入されていることを確認した。すなわち、実施例１−２における補償経路の構築が確認できた。
【００４８】
工程２）生育阻害が生じる遺伝子の欠損
（７）ＡＤＨ１遺伝子欠損用ＤＮＡ断片の作製
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４２株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、５’末端側の相同組換え配列としてＡＤＨ１ ＵＰ（−２２９〜−１）、３’末端側の相同組換え配列としてＡＤＨ１ ＤＮ（１０４８〜１３３６）の各ＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ用プライマーにはそれぞれ、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３のプライマーを使用した。また、同様にｐＲＳ３１７ベクターを鋳型にして、配列番号１４と１５のプライマーを用いてＬＹＳ２マーカーの遺伝子断片を増幅した。
これらの断片を精製後、各断片を混合して、配列番号１０及び１３のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことにより約５．４ｋｂｐの断片を得た。最終的に得られたＤＮＡ断片を「ＡＤＨ１遺伝子欠損用ＤＮＡ断片」と称する。
【００４９】
実施例１−３、比較例１〜３：
（８）ＡＤＨ１遺伝子欠損酵母の作製
上記（７）で調製したＡＤＨ１遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を使用し、ジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法を用いて、上記（３）、（６）で得られた実施例１−１の形質転換体１、実施例１−２の形質転換体２、ΔＰＤＣ１、及びＢＹ４７４２を形質転換した。形質転換体選択培地には、表４に記載した寒天培地を用いて、３０℃で３日間培養し、４種類の形質転換体、すなわち形質転換体２から実施例１−３の形質転換体３、形質転換体１から形質転換体４（比較例１）、ΔＰＤＣ１から形質転換体５(比較例２)、ＢＹ４７４２から形質転換体６(比較例３)を取得した。
【００５０】
【表４】
【００５１】
（９）遺伝子欠損の確認
上記（８）で得た４種類の形質転換体よりゲノムＤＮＡを調製した。続いて、ＰＣＲ法によって、ＡＤＨ１遺伝子欠損用ＤＮＡ断片がゲノムに組み込まれているかどうかを確認した。このＰＣＲでは、３組のプライマーを用いて、目的の配列が予想通りの長さに伸長されるかの確認を行った。すなわち、ＡＤＨ１遺伝子の相同組換え部分の全長を伸張するプライマーとして配列番号１０と１３のプライマーを使用し、ＬＹＳ２マーカーの中程からＡＤＨ１遺伝子３’末端側の相同組換え配列までを伸張するプライマーとして配列番号１３と１６のプライマーを使用し、ＡＤＨ１遺伝子の中程からＡＤＨ１遺伝子３’末端側の相同組換え配列までを伸張するプライマーとして配列番号１３と１７のプライマーを使用した（図１参照）。
確認ＰＣＲ及びＡＤＨ１遺伝子欠損の結果を表５に示す。
【００５２】
【表５】
【００５３】
表５に示す通り、ＡＤＨ１遺伝子の単独欠損では生育阻害が起こらないため、比較例３におけるＢＹ４７４２のＡＤＨ１遺伝子欠損は可能であるが、比較例２においてΔＰＤＣ１を宿主とした場合のＡＤＨ１遺伝子欠損、すなわちＰＤＣ１遺伝子とＡＤＨ１遺伝子の二重欠損は生育阻害が起こるため、代替経路及び補償経路が構築されていない比較例２では二重欠損株を得ることができず、技術的に難しいことがわかる。比較例１では代替経路は構築されているが、補償経路が構築されていないため、比較例２と同様に二重欠損株を得ることができない。
一方、実施例１−３のようにあらかじめ代替経路（ＭＤＨ３遺伝子及びｍａｅ１遺伝子の導入）と補償経路（ＡＤＨ１遺伝子をｐ４２６ＧＰＤベクターに連結したプラスミドの導入）を構築しておいた形質転換体を使用することにより、ＡＤＨ１遺伝子欠損が可能となることが示された。
【００５４】
工程３）補償経路の遺伝子の脱落
（１０）プラスミドの脱落
上記（８）で得られた実施例１−３の形質転換体３を、ヒスチジン、ロイシン及びリシンを添加せずに作製したＳＣ（−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）液体培地を用いで３日間培養した。その後、５−ＦＯＡ １ｍｇ／Ｌを含むＳＣ（−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）寒天培地に塗布すると、約１．３×１０-5の頻度でコロニーが出現した。得られたコロニーを、ウラシルを含むＳＣ（＋Ｕｒａ,−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）寒天培地及びウラシルを含まないＳＣ（−Ｕｒａ,−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）寒天培地の両方に移し、３０℃で一晩プレート培養した。移したコロニーのうち、ＳＣ（＋Ｕｒａ,−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）寒天培地でのみ生育し、ＳＣ（−Ｕｒａ,−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）寒天培地では生育しなかった菌株を、プラスミド（ＡＤＨ１遺伝子を連結したｐ４２６ＧＰＤベクター）の脱落した実施例１の株として選抜した。実施例１の株は、ウラシル要求性が復活しており、ＰＤＣ１遺伝子及びＡＤＨ１遺伝子が両方とも欠損されている。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により得られる組換え酵母は、有機酸等の有用化学物質等を生産するための生産菌として有用であり、糖類を原料とした有機酸等の製造技術分野において有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノール以外の有用化学物質を効率的に生産することのできる酵母の製造方法に関する。さらに詳しく言えば、エタノール生産能を低減させるため遺伝子欠損させると生育阻害が生じ、従来特殊装置や多くの時間を要する方法でしか取得することができなかった遺伝子欠損酵母を簡便に取得することができる遺伝子欠損酵母の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酵母は高濃度のグルコース存在下で高い効率でエタノールを生産するため、従来清酒やビール等の生産菌として使用されてきた。近年は、その高い増殖性、グルコース資化性、酸耐性等からバイオマスを原料とした物質生産菌としても有望視されている。
【０００３】
酵母を用いてエタノール以外の物質生産を行う場合、大量に生産されるエタノールの生産能を低減させるため、エタノール生産経路にあるピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣと略記する。）遺伝子やアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨと略記する。）遺伝子などの遺伝子破壊を行うことが望ましい。ところが、これらの遺伝子を欠損させる対象の遺伝子とした場合、特に複数の遺伝子を同時に欠損させると宿主の生育や醗酵阻害が起こることが知られており（特許文献１：特表２００３−５０００６２号公報、非特許文献１：Ｈｏｈｍａｎｎ, Ｓ. ｅｔ ａｌ. (１９９０) ＥＵＲ. Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., １８８, ｐ６１５−６２１）、酵母の代謝系遺伝子の改変により、求める物質の生産が可能な菌株を取得する際の障害となっていた。
【０００４】
一般的に、酵母の遺伝子欠損方法としては、簡便かつ高効率な相同組換えによる遺伝子置換法が用いられる（非特許文献２：Ｂａｕｄｉｎ, Ａ. ｅｔ ａｌ. (１９９３) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ., ２１, ｐ３３２９−３３３０、非特許文献３：Ｂｒａｃｈｍａｎｎ, Ｃ. Ｂ. ｅｔ ａｌ. （１９９８） Ｙｅａｓｔ, １４, ｐ１１５−１３２）。しかしながら、遺伝子欠損した菌株が生育阻害を生じる場合、相同組換えを用いた単純な遺伝子置換では、プレート上のセレクションによる変異株の取得が難しいという問題があった。従来法では胞子を形成させ、分離することにより（特許文献２：特表２００１−５１６５８４号公報、特許文献３：特開２００６−６２７１号公報）、あるいは組成を変えた培地で連続培養することにより進化工学的に（特許文献４：特表２００６−５２５０２５号公報）変異株を取得していたが、マニピュレーター等の特殊な装置が必要である上に、目的の菌株が得られるまで非常に長い時間を要するという難点もあった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００３−５０００６２号公報
【特許文献２】特表２００１−５１６５８４号公報
【特許文献３】特開２００６−６２７１号公報
【特許文献４】特表２００６−５２５０２５号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｈｏｈｍａｎｎ, Ｓ. ｅｔ ａｌ. (１９９０) Ｅｕｒ. Ｊ. Ｂｉｏｃｈｅｍ., １８８, ｐ６１５−６２１
【非特許文献２】Ｂａｕｄｉｎ, Ａ. ｅｔ ａｌ. (１９９３) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ., ２１, ｐ３３２９−３３３０
【非特許文献３】Ｂｒａｃｈｍａｎｎ, Ｃ. Ｂ. ｅｔ ａｌ. （１９９８） Ｙｅａｓｔ, １４, ｐ１１５−１３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、エタノール生産能を低減させるため遺伝子欠損させると生育阻害が生じ、特殊装置や多くの時間を要する方法でしか取得することができなかった遺伝子欠損酵母を簡便に取得することができる遺伝子欠損酵母の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第１の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第２の工程と、前記補償経路を脱落させる第３の工程を含む処理を行うことにより、生育阻害が生じる遺伝子を欠損させた酵母株を取得できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち本発明は、以下の［１］〜［１６］を含む。
［１］宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第１の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第２の工程と、前記補償経路を脱落させる第３の工程を含むことを特徴とする遺伝子欠損酵母の製造方法。
［２］前記代替代謝物が、リンゴ酸及び／またはコハク酸である［１］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［３］前記代替代謝物生産経路の構築工程が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子及び／またはリンゴ酸トランスポーター（ＭＡＥ）遺伝子を導入及び／または増幅する工程である［１］または［２］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［４］前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）が、ＭＤＨ１遺伝子、ＭＤＨ２遺伝子及びＭＤＨ３遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである［３］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［５］前記リンゴ酸トランスポーター（ＭＡＥ）が、ｍａｅ１遺伝子によりコードされるものである［３］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［６］前記補償経路の構築工程が、前記第２の工程で欠損させる遺伝子と同一の遺伝子を導入する工程である［１］〜［５］のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［７］前記補償経路の構築工程において、第３の工程において脱落させて機能欠損が可能となるような選択マーカーを有しているプラスミドを使用する［１］〜［６］のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［８］前記遺伝子欠損の対象となる遺伝子が、エタノール生合成経路の遺伝子である［１］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［９］前記エタノール生合成経路の遺伝子が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）及び／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）をコードする遺伝子である［８］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１０］前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）が、ＰＤＣ１遺伝子、ＰＤＣ５遺伝子及びＰＤＣ６遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである［９］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１１］前記アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）が、ＡＤＨ１遺伝子、ＡＤＨ２遺伝子、ＡＤＨ３遺伝子、ＡＤＨ４遺伝子及びＡＤＨ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである［９］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１２］前記第２の工程を、ＰＣＲ産物を用いたジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法を用いて行う［１］〜［１１］のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１３］前記宿主酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する［１］〜［１２］のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１４］前記宿主酵母がサッカロマイセス・セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)である［１３］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１５］前記第１〜第３の工程の少なくとも１工程における菌株の取得を、選択マーカーを含むプレート上でのセレクションにより行う［１］〜［１４］のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
［１６］前記選択マーカーが薬剤耐性マーカーまたは栄養要求性マーカーである［１５］に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の方法により、補償経路の働きで宿主酵母の遺伝子欠損による急激な生育阻害を防ぎ、目的遺伝子の欠損株を特殊装置や長時間を要さず簡便に取得することができる。本発明の方法によれば、相同組換え及びプレートを用いた簡便なセレクションで、宿主酵母の生育阻害が生じる一つあるいは複数の遺伝子の欠損株を取得可能であり、特殊な装置を用いて胞子形成・分離を行う従来の方法に比べて、時間的・金銭的なメリットが大きい。また、本発明により得られる組換え酵母は、有機酸等の有用化学物質等を生産するための生産菌として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ジーンターゲッティングによるＡＤＨ１遺伝子の欠損とその確認の工程を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の遺伝子欠損酵母の製造方法は、宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第１の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第２の工程と、前記補償経路を脱落させる第３の工程を含むことを特徴とする。
【００１３】
本明細書において「遺伝子欠損」とは、遺伝子が本来持つ機能が失われた状態を言い、遺伝子の塩基配列の一部もしくは全部が欠落すること、遺伝子の塩基配列が他の塩基配列に置換されること等により生じる。このような状態は自然に生じることもあるが、本発明では、任意の遺伝子を目的に応じて人為的に欠損させることを意味する。
【００１４】
本明細書において「生育阻害」とは、野生株に比べて遺伝子改変した酵母の増殖速度が著しく低下する状態、あるいは全く増殖できなくなった状態のこと言う。生育阻害が生じる遺伝子とは、一つあるいは複数の遺伝子を欠損させると宿主の生育阻害が起こるような代謝の主要経路の遺伝子のことを言い、例えば、グリコーゲンシンターゼ、グルコース−１−リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、ホスホグルコムターゼ、グルコキナーゼ、ヘキソキナーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ、グルコサミンリン酸イソメラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、ヘキソースジホスファターゼ、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ビスホスホグリセロムターゼ、ビスホスホグリセリン酸ホスファターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ホスホグリセロムターゼ、エノラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸シンターゼ、イソシトラーゼ、フマル酸ヒドラターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、スクシニルCoAシンテターゼ、オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ等の酵素をコードする遺伝子が挙げられる。
【００１５】
中でも、エタノールの生合成経路の遺伝子群は欠損による生育阻害が顕著であることから、本発明の欠損対象として好ましく、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣと略記する。）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨと略記する。）をコードする遺伝子が欠損対象として好ましい。特に好ましいのは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＡＤＨ３、ＡＤＨ４及びＡＤＨ５遺伝子（Ｓａｃｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｎａｍｅ：ＹＬＲ０４４Ｃ，ＹＬＲ１３４Ｗ，ＹＧＲ０８７Ｃ，ＹＯＬ０８６Ｃ，ＹＭＲ３０３Ｃ，ＹＭＲ０８３Ｗ，ＹＧＬ２５６Ｗ，ＹＢＲ１４５Ｗ）である。
【００１６】
本発明において遺伝子欠損させる酵母は、遺伝子欠損可能な酵母であれば特に制限されるものではなく、例えば、サッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、クリベロマイセス(Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ)属、シゾサッカロマイセス(Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、チゴサッカロマイセス(Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属、ヤロウイア(Ｙａｒｒｏｗｉａ)属、ハンゼヌラ(Ｈａｎｓｅｎｕｌａ)属、ピキア(Ｐｉｃｈｉａ)属、キャンディダ(Ｃａｎｄｉｄａ)属等の酵母が挙げられ、中でもサッカロマイセス(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ)属のものが好ましく、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が特に好ましい。また、形質転換により遺伝子を導入した際に形質転換体を選抜することが容易になることから、栄養要求性を持つ菌株が好ましい。
【００１７】
本明細書において「代替代謝物」とは、欠損対象となるターゲット遺伝子を欠損させた時にターゲット遺伝子の代謝物の代わりに菌体内の酸化還元バランスを取ることができる代謝物のことを言う。例えば、エタノールの代替代謝物としては、乳酸、アクリル酸、酢酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、リンゴ酸、グリオキシル酸、３−ヒドロキシプロピオン酸、フマル酸、コハク酸、イタコン酸、レブリン酸、アジピン酸、アスコルビン酸、クエン酸等の有機酸類や、１−プロパノール、２−プロパノール、１−ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール等のアルコール類が挙げられる。中でも、乳酸、リンゴ酸、コハク酸が代替代謝物として好ましく、リンゴ酸、コハク酸がより好ましい。
【００１８】
本明細書において「代替経路の構築」とは、本発明の第１の工程において代替代謝物へとつながる代謝経路の遺伝子を宿主酵母にあらかじめ導入し、これら代謝物の生産機能を付与することである。例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ、クエン酸シンターゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、リンゴ酸シンターゼ、イソシトラーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、フマラーゼ、フマル酸リダクターゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸トランスポーター等をコードする遺伝子を使用することができる。中でも、代替代謝物となるリンゴ酸やコハク酸の生産量が増大する代替経路が構築されるリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸トランスポーター等の遺伝子を導入及び／または増幅することが好ましく、ＭＤＨ１、ＭＤＨ２、ＭＤＨ３遺伝子（Ｓａｃｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｎａｍｅ：ＹＫＬ０８５Ｗ，ＹＯＬ１２６Ｃ，ＹＤＬ０７８Ｃ）及びｍａｅ１遺伝子（ＮＣＢＩ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＭ＿００１０２０２０５）のうち1種あるいは複数種を導入及び／または増幅することが特に好ましい。
【００１９】
上記導入する遺伝子の単離は、染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等の公知の方法によって行うことができる。あるいは、常法により調製された全ｍＲＮＡ、全ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲにより得られたｃＤＮＡ、あるいは市販のｃＤＮＡライブラリー等の核酸を鋳型とし、本発明に用いられる遺伝子の塩基配列に基づいて設計されるプライマーを用いたＰＣＲ法によって取得することができる。また、染色体ＤＮＡライブラリーから、ハイブリダイゼーション等の公知の方法によって行うこともできる。
【００２０】
代替経路の構築に使用されるベクターは、遺伝子が導入される酵母で複製され、安定に保持されるものであればいずれのものも用いることができ、染色体組み込み型プラスミド、シングルコピー型プラスミド、マルチコピー型プラスミドなどを用いることができる。例えば、ｐＲＳシリーズのＹＩ、ＹＣ、ＹＥタイプや、ｐ４ＸＸシリーズ（Ｄｏｍｉｎｉｋ ｅｔ ａｌ., (１９９５)Ｇｅｎｅ. １５６: ｐ.１１９−１２２）等が挙げられる。ベクター中に任意の遺伝子を組み込むには、例えば、その遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素切断部位またはマルチクローニングサイトにインフレームで挿入し連結すればよい。本発明で使用する発現ベクターには、ベクターが細胞内に保持されていることを示す選択マーカーが含まれていることが好ましい。
【００２１】
上記導入する遺伝子の機能発現に用いられるプロモーターは、その発現ベクターを導入する酵母中でその制御下の遺伝子の発現を誘導できるものであれば任意のものでよい。酵母中で発現させるためには、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＴＥＦプロモーター、ＣＹＣ１プロモーター等の公知のプロモーターが使用できる。このうち、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターが最も好ましい。また、ターミネーターとしては、ＥＮＯ１ターミネーター、ＧＡＬ１０ターミネーター、ＧＡＰＤＨターミネーター、ＡＤＨターミネーター、ＣＹＣ１ターミネーター等の公知のターミネーターが使用できる。
【００２２】
本明細書において「補償経路の構築」とは、本発明の第２の工程における欠損させたいターゲット遺伝子と同等の機能を発現する遺伝子を導入する工程に対応する。すなわち、遺伝子欠損の対象となるターゲット遺伝子と同一か、もしくは同等の機能発現を可能とする遺伝子を発現させてターゲット遺伝子の機能を補う状態にすることを言い、具体的には遺伝子欠損の対象となるターゲット遺伝子と同一か、もしくは同等の機能発現を可能とする遺伝子を酵母に導入し、発現させることを言う。例えば、酵母ゲノム上のＡＤＨ１遺伝子を欠損させたい場合はＰＣＲ等により単離したＡＤＨ１遺伝子を発現用プラスミドに連結し、形質転換により酵母に導入することで補償経路を構築することができる。導入する遺伝子は欠損させる遺伝子と同一のものが好ましいが、同じ機能を有するものであれば異なる遺伝子でもよいし、別の生物由来のものでもよい。また、導入する遺伝子は一種でもよいし、複数種でもよい。
【００２３】
補償経路の構築に使用されるベクターはプラスミドであることが好ましい。酵母中でプラスミドの状態で自律複製されるものであればいずれのものも用いることができる。例えば、ｐＲＳシリーズのＹＣ、ＹＥタイプや、ｐ４ＸＸシリーズ（Ｄｏｍｉｎｉｋ ｅｔ ａｌ., (１９９５)Ｇｅｎｅ. １５６: ｐ.１１９−１２２）等のベクターが挙げられる。ベクター中に任意の遺伝子を組み込むには、例えば、その遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素切断部位またはマルチクローニングサイトにインフレームで挿入し連結すればよい。補償経路構築用のプラスミドは、後に脱落させて機能欠損が可能となるような選択マーカーを有していることが好ましい。
【００２４】
本発明で用いられる遺伝子またはそれを含む組換えベクターを用いて宿主酵母を形質転換するには、一般的に行われている遺伝子導入法、例えば、コンピテントセル法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、塩化リチウム法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。形質転換体の選択は、常法に従って行うことができるが、通常は使用した組換えベクターに組み込まれた選択マーカーを利用して行うことができる。
【００２５】
本発明の第１の工程における代替代謝物生産経路の構築及び補償経路を構築する際の両者の実施順序は特に限定されない。すなわち、代替代謝物生産経路の構築後補償経路の構築を行なうこともできるし、補償経路の構築後代替代謝物生産経路の構築を行なうこともできる。また、補償経路の構築と代替代謝物生産経路の構築を同時に行なうこともできる。
【００２６】
上記遺伝子が酵母に導入されたことの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法、ウェスタンブロット法等を利用して行うことができる。例えば、形質転換された酵母からプラスミドを抽出し、遺伝子に特異的なプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行えばよい。その増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、サイバーセーフ（ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ）等により染色し、増幅産物を１本のバンドとして検出することにより、目的とする遺伝子が導入されたことを確認することができる。
【００２７】
本発明の第１の工程における代替経路の構築及び補償経路の構築は、染色体上のターゲット遺伝子の機能を欠損することによって生じる酵母の生育阻害を回避することを目的としている。すなわち、続く第２の工程において染色体上のターゲット遺伝子を欠損させてその機能を失っても、補償経路として導入したプラスミド上の遺伝子がその機能を補うことにより、ターゲット遺伝子が欠損されても生育可能な状態を維持できる。さらに続く第３の工程において補償経路として導入したプラスミドを脱落させても、第１の工程において代替経路を構築しておいたことにより菌体内の酸化還元バランスを取ることができる代謝物が生産され、ターゲット遺伝子が欠損されても生育可能な酵母が得られるということである。第１の工程を行わない場合、あるいは第１の工程における代替経路の構築及び補償経路の構築のいずれか一方しか行わない場合、いずれの場合も第２あるいは第３の工程において生育阻害が生じ、目的とする酵母を得ることができない。
【００２８】
本発明における前述の第１工程、第２工程及び後述の第３工程においては、一般的な薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子をマーカー遺伝子として利用することができる。例えば、Ｇ４１８耐性遺伝子、オーレオバシジン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、フレオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子などの公知の薬剤耐性マーカー遺伝子を使用することができる。あるいは、ウラシル要求性、リシン要求性、ロイシン要求性、ヒスチジン要求性、トリプトファン要求性、メチオニン要求性、ビオチン要求性、アデニン要求性などの栄養要求性を相補する公知の栄養要求性マーカー遺伝子を用いることができる。
【００２９】
本発明の第２の工程における遺伝子欠損は、一般的な相同組換えによる遺伝子置換を用いて行うことができる。例えば、ＰＣＲ産物を用いたジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法（ワンステップ遺伝子破壊）や、ＰＣＲ産物もしくはプラスミドを導入後、マーカー遺伝子を回収する遺伝子破壊法（ツーステップ遺伝子破壊）などが挙げられる。いずれの場合も、相同組換えによってターゲット遺伝子をマーカー遺伝子に置換することにより遺伝子欠損が可能となる。
【００３０】
マーカー遺伝子は、その５’末端側と３’末端側に宿主酵母の染色体ＤＮＡと相同配列を有するベクターの形態で宿主酵母内に導入され、相同配列と宿主染色体ＤＮＡとが相同組換えを起こすことにより、宿主酵母の染色体に挿入または置換によって導入され、これによってターゲット遺伝子が欠損される。塩基配列が明らかな宿主酵母の染色体ＤＮＡに基づいて相同配列を設計することにより、マーカー遺伝子を染色体の任意の位置に導入し、任意のターゲット遺伝子を欠損することができる。
【００３１】
マーカー遺伝子を宿主酵母に導入するためのベクターは、線状のＤＮＡ断片であってもよく、またプラスミドのような環状であってもよい。ベクターの導入は、公知の遺伝子導入技術を用いて行うことができる。例えば、コンピテントセル法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、塩化リチウム法、アグロバクテリウム法、プロトプラスト融合法等を用いればよい。
【００３２】
本発明において、ターゲット遺伝子が欠損されたことは、公知の方法によって確認することができる。例えば、ターゲット遺伝子の表現型による確認や、ターゲット遺伝子を挟んだ染色体上の領域に対してＰＣＲを行い、増幅された断片の大きさに基づいて確認することもできる。また、ターゲット遺伝子に特異的なプローブを用いて検出してもよい。
【００３３】
本発明における第３の工程である第１の工程にて構築した補償経路の脱落、すなわち前記プラスミドの脱落は、補償経路の構築に用いたプラスミド中の選択マーカーによる選択圧をかけずに菌株の培養を行い、酵母が分裂する際に自然にプラスミドが脱落することを利用する方法で行うことができる。プラスミドが脱落した菌株のスクリーニングには、脱落した菌株のみが生存できるポジティブスクリーニングを行うことができることから、前述の栄養要求性相補遺伝子としてＵｒａ３やＬｙｓ２のマーカーを有するプラスミド及び５−フルオロオロト酸（ＦＯＡ）やα−アミノアジピン酸（αＡＡ）等が含有されたプレートを用いることが好ましい。
【００３４】
酵母の培養に用いる培地は、炭素源としてグルコース、及び本発明で得られる組換え酵母が資化し得る窒素源、無機塩類、ビタミン類等を含有し、組換え酵母の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれでもよい。静置培養、振とう培養、深部通気撹拌培養のいずれで行ってもよいが、振とう培養が好ましく用いられる。培養温度は通常、１５〜４０℃である。
【実施例】
【００３５】
以下、実施例、参考例及び比較例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
工程１）代替経路及び補償経路の構築
実施例１−１、参考例１〜２：代替経路の構築
（１）ＭＤＨ３遺伝子の単離及びＭＤＨ３遺伝子を有するプラスミドの調製
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４２株の染色体ＤＮＡを、ＱＩＡ ａｍｐ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製）を用い、添付説明書の記載に従って調製した。以下、ゲノムＤＮＡの調製は全て説明書の記載に従った。得られた染色体を鋳型とし、配列番号１及び２で示される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、約１．０ｋｂｐのＭＤＨ３遺伝子を含むＤＮＡ断片を取得した。ＰＣＲ反応はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社製）を用い、添付説明書の記載に従って行った。以下、ＰＣＲ法は全て説明書の記載に従った。ＤＮＡ断片の鎖長は、ＰＣＲ反応生成物を０．９％アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、添付された説明書の記載に従ってクローニングした。得られたプラスミドとｐ４１３ＧＰＤベクターをそれぞれＳｐｅＩ及びＳｍａＩで制限酵素処理し、ＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標） ＧＴＧ（登録商標）ａｇａｒｏｓｅ（ＣＡＭＢＲＥＸ社製）を用いて作製した１．０％アガロースゲルで電気泳動することによりＳｐｅＩ−ＳｍａＩ断片を単離、精製した。その後、Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、ＭＤＨ３遺伝子がｐ４１３ＧＰＤに連結された目的のプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００３７】
（２）ｍａｅ１遺伝子の単離及びｍａｅ１遺伝子を有するプラスミドの調製
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）のｃＤＮＡライブラリー（バイオアカデミア社）を鋳型とし、配列番号４及び５で示される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、ｍａｅ１遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ＤＮＡ断片の鎖長は、反応生成物を０．９％アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、添付説明書の記載に従ってクローニングした。得られたプラスミドとｐ４１５ＧＰＤベクターをそれぞれＳｐｅＩ及びＰｓｔＩで制限酵素処理し、ＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標） ＧＴＧ（登録商標） ａｇａｒｏｓｅ（ＣＡＭＢＲＥＸ社製）を用いて作製した１．０％アガロースゲルで電気泳動することによりＳｐｅＩ−ＰｓｔＩ断片を単離、精製した。その後、Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、ｍａｅ１遺伝子がｐ４１５ＧＰＤに連結された目的のプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号６で示される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００３８】
（３）ＰＤＣ１遺伝子欠損酵母へのＭＤＨ３及びｍａｅ１遺伝子の導入
形質転換の宿主として、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４２のＰＤＣ１遺伝子が欠損された市販の遺伝子欠損株（オープンバイオシステムズ社から購入、以下ΔＰＤＣ１株とする。）を用いた。
上記（１）及び（２）で調製したプラスミドを用いて、Ｃｈｅｎ Ｄ, Ｙａｎｇ Ｂ, Ｋｕｏ Ｔ. （１９９２）.Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ ２１: ８３−８４.に記載の形質転換法により、ΔＰＤＣ１株を形質転換し、実施例１−１の形質転換体１を得た。
形質転換体選択培地には、以下に示す組成のＳＤ寒天培地に必要に応じてアミノ酸を添加した寒天培地を用いた。すなわち、形質転換体１は、ＳＤ（Ｕｒａ、Ｌｙｓ）寒天培地（ＳＤ寒天培地にウラシル２０ｍｇ／Ｌ、リシン塩酸塩３０ｍｇ／Ｌを添加したもの）を用いて３０℃で３日間培養することにより生育するコロニーを選抜することにより取得した。
ＳＤ寒天培地組成：
イースト・ナイトロジェン・ベース（Yeast Nitrogen Base：Difco社製） 6.7g/L
グルコース 20g/L
寒天 20g/L
【００３９】
（４）形質転換体の培養結果
得られた形質転換体１を、以下に示す組成のＳＣ液体培地作製時に、選択マーカーに対応するアミノ酸を除いて作製した液体培地を用いて試験管培養試験を行った。すなわち、実施例１−１の形質転換体１にはヒスチジン及びロイシンを添加せずに作製したＳＣ（−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ）液体培地を用いた。参考として、形質転換していないΔＰＤＣ１株（参考例１）及びＢＹ４７４２（参考例２）を並べて培養した。参考例１及び２には通常のＳＣ液体培地を用いた。実施例１−１及び参考例１〜２に使用したプラスミド、寒天培地及び液体培地を表１に示す。
各培地５ｍＬに、各プレートから１白金耳植菌し、３０℃で一晩培養し、これを前培養溶液とした。得られた前培養溶液を、新たな試験管中のＳＣ液体培地５ｍＬに初発の濁度（ＯＤ６６０）が０．０５になるように植菌し、３０℃で培養した。ＯＤ６６０は濁度計（ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ５１８Ｒ，ＴＡＩＴＥＣ社製）で測定した。また培養上清中のエタノール、ピルビン酸、リンゴ酸、コハク酸の含有量を以下の条件で、液体クロマトグラフィー（島津製作所社製）を用いて定量した。結果を表２に示す。
【００４０】
ＳＣ液体培地組成：
イースト・ナイトロジェン・ベース（Yeast Nitrogen Base：Difco社製） 6.7g/L
グルコース 20g/L
硫酸アデニン 20mg/L
ウラシル 20mg/L
トリプトファン 20mg/L
ヒスチジン塩酸塩 20mg/L
アルギニン塩酸塩 20mg/L
メチオニン 20mg/L
チロシン 30mg/L
ロイシン 60mg/L
イソロイシン 30mg/L
リシン塩酸塩 30mg/L
フェニルアラニン 40mg/L
グルタミン酸 100mg/L
アスパラギン酸 100mg/L
バリン 150mg/L
トレオニン 200mg/L
セリン 400mg/L
液体クロマトグラフィー分析条件：
サンプル：培養上清、
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ１０１１（３００ × ８．０ ｍｍ、昭和電工（株）製）、
移動相：２０ ｍＭ 硫酸、
流速 ：０．６ ｍｌ／分、
カラム温度：６０℃、
検出 ：ＲＩ検出器。
【００４１】
【表１】
【００４２】
【表２】
【００４３】
表２に示す通り、実施例１のサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、参考例１、２よりも多くの有機酸を生産しており、代替経路の構築が確認された。
【００４４】
実施例１−２：補償経路の構築
（５）ＡＤＨ１遺伝子の単離及びＡＤＨ１遺伝子を有するプラスミドの調製
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４２株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び８で示される塩基配列を有するＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＨ１遺伝子を含む約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を取得した。ＤＮＡ断片の鎖長は、反応生成物を０．９％アガロースゲルで電気泳動することにより確認した。得られたＤＮＡ断片とＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ（登録商標） ＴＯＰＯ（登録商標） Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用い、添付された説明書の記載に従ってクローニングした。得られたプラスミドとｐ４２６ＧＰＤベクターをＣｌａＩ及びＳａｌＩで制限酵素処理し、ＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標） ＧＴＧ（登録商標） ａｇａｒｏｓｅ（ＣＡＭＢＲＥＸ社製）を用いて作製した１．０％アガロースゲルで電気泳動することによりＣｌａＩ−ＳａｌＩ断片を単離、精製した。その後、Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｍｉｘ（タカラバイオ社製）を用いて連結し、ＡＤＨ１遺伝子がｐ４２６ＧＰＤに連結された目的のプラスミドを得た。挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより調べたところ、配列番号９で示される塩基配列を有するＤＮＡを有していた。
【００４５】
（６）形質転換体１へのＡＤＨ１遺伝子の導入
上記（５）で調製したプラスミドを、Ｃｈｅｎ Ｄ, Ｙａｎｇ Ｂ, Ｋｕｏ Ｔ. （１９９２）.Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ ２１: ８３−８４.に記載の形質転換法により実施例１−１の形質転換体１へと導入した。培地には、ＳＤ寒天培地にリシン塩酸塩３０ｍｇ／Ｌを添加したＳＤ（Ｌｙｓ）寒天培地を用い、３０℃で３日間培養し、表３に示す実施例１−２の形質転換体２を取得した。
【００４６】
【表３】
【００４７】
実施例１−２の形質転換体２からプラスミドを抽出し、ＰＣＲ法によってＡＤＨ１の遺伝子が導入されていることを確認した。すなわち、実施例１−２における補償経路の構築が確認できた。
【００４８】
工程２）生育阻害が生じる遺伝子の欠損
（７）ＡＤＨ１遺伝子欠損用ＤＮＡ断片の作製
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＹ４７４２株の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応を行い、５’末端側の相同組換え配列としてＡＤＨ１ ＵＰ（−２２９〜−１）、３’末端側の相同組換え配列としてＡＤＨ１ ＤＮ（１０４８〜１３３６）の各ＤＮＡ断片を増幅した。ＰＣＲ用プライマーにはそれぞれ、配列番号１０と１１、配列番号１２と１３のプライマーを使用した。また、同様にｐＲＳ３１７ベクターを鋳型にして、配列番号１４と１５のプライマーを用いてＬＹＳ２マーカーの遺伝子断片を増幅した。
これらの断片を精製後、各断片を混合して、配列番号１０及び１３のプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行うことにより約５．４ｋｂｐの断片を得た。最終的に得られたＤＮＡ断片を「ＡＤＨ１遺伝子欠損用ＤＮＡ断片」と称する。
【００４９】
実施例１−３、比較例１〜３：
（８）ＡＤＨ１遺伝子欠損酵母の作製
上記（７）で調製したＡＤＨ１遺伝子欠損用ＤＮＡ断片を使用し、ジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法を用いて、上記（３）、（６）で得られた実施例１−１の形質転換体１、実施例１−２の形質転換体２、ΔＰＤＣ１、及びＢＹ４７４２を形質転換した。形質転換体選択培地には、表４に記載した寒天培地を用いて、３０℃で３日間培養し、４種類の形質転換体、すなわち形質転換体２から実施例１−３の形質転換体３、形質転換体１から形質転換体４（比較例１）、ΔＰＤＣ１から形質転換体５(比較例２)、ＢＹ４７４２から形質転換体６(比較例３)を取得した。
【００５０】
【表４】
【００５１】
（９）遺伝子欠損の確認
上記（８）で得た４種類の形質転換体よりゲノムＤＮＡを調製した。続いて、ＰＣＲ法によって、ＡＤＨ１遺伝子欠損用ＤＮＡ断片がゲノムに組み込まれているかどうかを確認した。このＰＣＲでは、３組のプライマーを用いて、目的の配列が予想通りの長さに伸長されるかの確認を行った。すなわち、ＡＤＨ１遺伝子の相同組換え部分の全長を伸張するプライマーとして配列番号１０と１３のプライマーを使用し、ＬＹＳ２マーカーの中程からＡＤＨ１遺伝子３’末端側の相同組換え配列までを伸張するプライマーとして配列番号１３と１６のプライマーを使用し、ＡＤＨ１遺伝子の中程からＡＤＨ１遺伝子３’末端側の相同組換え配列までを伸張するプライマーとして配列番号１３と１７のプライマーを使用した（図１参照）。
確認ＰＣＲ及びＡＤＨ１遺伝子欠損の結果を表５に示す。
【００５２】
【表５】
【００５３】
表５に示す通り、ＡＤＨ１遺伝子の単独欠損では生育阻害が起こらないため、比較例３におけるＢＹ４７４２のＡＤＨ１遺伝子欠損は可能であるが、比較例２においてΔＰＤＣ１を宿主とした場合のＡＤＨ１遺伝子欠損、すなわちＰＤＣ１遺伝子とＡＤＨ１遺伝子の二重欠損は生育阻害が起こるため、代替経路及び補償経路が構築されていない比較例２では二重欠損株を得ることができず、技術的に難しいことがわかる。比較例１では代替経路は構築されているが、補償経路が構築されていないため、比較例２と同様に二重欠損株を得ることができない。
一方、実施例１−３のようにあらかじめ代替経路（ＭＤＨ３遺伝子及びｍａｅ１遺伝子の導入）と補償経路（ＡＤＨ１遺伝子をｐ４２６ＧＰＤベクターに連結したプラスミドの導入）を構築しておいた形質転換体を使用することにより、ＡＤＨ１遺伝子欠損が可能となることが示された。
【００５４】
工程３）補償経路の遺伝子の脱落
（１０）プラスミドの脱落
上記（８）で得られた実施例１−３の形質転換体３を、ヒスチジン、ロイシン及びリシンを添加せずに作製したＳＣ（−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）液体培地を用いで３日間培養した。その後、５−ＦＯＡ １ｍｇ／Ｌを含むＳＣ（−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）寒天培地に塗布すると、約１．３×１０-5の頻度でコロニーが出現した。得られたコロニーを、ウラシルを含むＳＣ（＋Ｕｒａ,−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）寒天培地及びウラシルを含まないＳＣ（−Ｕｒａ,−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）寒天培地の両方に移し、３０℃で一晩プレート培養した。移したコロニーのうち、ＳＣ（＋Ｕｒａ,−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）寒天培地でのみ生育し、ＳＣ（−Ｕｒａ,−Ｈｉｓ,−Ｌｅｕ,−Ｌｙｓ）寒天培地では生育しなかった菌株を、プラスミド（ＡＤＨ１遺伝子を連結したｐ４２６ＧＰＤベクター）の脱落した実施例１の株として選抜した。実施例１の株は、ウラシル要求性が復活しており、ＰＤＣ１遺伝子及びＡＤＨ１遺伝子が両方とも欠損されている。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明により得られる組換え酵母は、有機酸等の有用化学物質等を生産するための生産菌として有用であり、糖類を原料とした有機酸等の製造技術分野において有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第１の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第２の工程と、前記補償経路を脱落させる第３の工程を含むことを特徴とする遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項２】
前記代替代謝物が、リンゴ酸及び／またはコハク酸である請求項１に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項３】
前記代替代謝物生産経路の構築工程が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子及び／またはリンゴ酸トランスポーター（ＭＡＥ）遺伝子を導入及び／または増幅する工程である請求項１または２に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項４】
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）が、ＭＤＨ１遺伝子、ＭＤＨ２遺伝子及びＭＤＨ３遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである請求項３に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項５】
前記リンゴ酸トランスポーター（ＭＡＥ）が、ｍａｅ１遺伝子によりコードされるものである請求項３に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項６】
前記補償経路の構築工程が、前記第２の工程で欠損させる遺伝子と同一の遺伝子を導入する工程である請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項７】
前記補償経路の構築工程において、第３の工程において脱落させて機能欠損が可能となるような選択マーカーを有しているプラスミドを使用する請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項８】
前記遺伝子欠損の対象となる遺伝子が、エタノール生合成経路の遺伝子である請求項１に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項９】
前記エタノール生合成経路の遺伝子が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）及び／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）をコードする遺伝子である請求項８に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１０】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）が、ＰＤＣ１遺伝子、ＰＤＣ５遺伝子及びＰＤＣ６遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである請求項９に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１１】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）が、ＡＤＨ１遺伝子、ＡＤＨ２遺伝子、ＡＤＨ３遺伝子、ＡＤＨ４遺伝子及びＡＤＨ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである請求項９に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１２】
前記第２の工程を、ＰＣＲ産物を用いたジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法を用いて行う請求項１〜１１のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１３】
前記宿主酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する請求項１〜１２のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１４】
前記宿主酵母がサッカロマイセス・セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)である請求項１３に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１５】
前記第１〜第３の工程の少なくとも１工程における菌株の取得を、選択マーカーを含むプレート上でのセレクションにより行う請求項１〜１４のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１６】
前記選択マーカーが薬剤耐性マーカーまたは栄養要求性マーカーである請求項１５に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１】
宿主酵母に対して代替代謝物生産経路及び補償経路を構築する第１の工程と、前記宿主酵母の生育阻害が生じる遺伝子の欠損を行う第２の工程と、前記補償経路を脱落させる第３の工程を含むことを特徴とする遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項２】
前記代替代謝物が、リンゴ酸及び／またはコハク酸である請求項１に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項３】
前記代替代謝物生産経路の構築工程が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子及び／またはリンゴ酸トランスポーター（ＭＡＥ）遺伝子を導入及び／または増幅する工程である請求項１または２に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項４】
前記リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）が、ＭＤＨ１遺伝子、ＭＤＨ２遺伝子及びＭＤＨ３遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである請求項３に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項５】
前記リンゴ酸トランスポーター（ＭＡＥ）が、ｍａｅ１遺伝子によりコードされるものである請求項３に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項６】
前記補償経路の構築工程が、前記第２の工程で欠損させる遺伝子と同一の遺伝子を導入する工程である請求項１〜５のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項７】
前記補償経路の構築工程において、第３の工程において脱落させて機能欠損が可能となるような選択マーカーを有しているプラスミドを使用する請求項１〜６のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項８】
前記遺伝子欠損の対象となる遺伝子が、エタノール生合成経路の遺伝子である請求項１に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項９】
前記エタノール生合成経路の遺伝子が、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）及び／またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）をコードする遺伝子である請求項８に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１０】
前記ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）が、ＰＤＣ１遺伝子、ＰＤＣ５遺伝子及びＰＤＣ６遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである請求項９に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１１】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）が、ＡＤＨ１遺伝子、ＡＤＨ２遺伝子、ＡＤＨ３遺伝子、ＡＤＨ４遺伝子及びＡＤＨ５遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１つの遺伝子によりコードされるものである請求項９に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１２】
前記第２の工程を、ＰＣＲ産物を用いたジーンターゲッティングによる遺伝子破壊法を用いて行う請求項１〜１１のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１３】
前記宿主酵母がサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属する請求項１〜１２のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１４】
前記宿主酵母がサッカロマイセス・セレビシエ(Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ)である請求項１３に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１５】
前記第１〜第３の工程の少なくとも１工程における菌株の取得を、選択マーカーを含むプレート上でのセレクションにより行う請求項１〜１４のいずれかに記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【請求項１６】
前記選択マーカーが薬剤耐性マーカーまたは栄養要求性マーカーである請求項１５に記載の遺伝子欠損酵母の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１３−２１９４０（Ｐ２０１３−２１９４０Ａ）
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１５７５８６（Ｐ２０１１−１５７５８６）
【出願日】平成２３年７月１９日（２０１１．７．１９）
【出願人】（０００００２００４）昭和電工株式会社 (3,251)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年２月４日（２０１３．２．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年７月１９日（２０１１．７．１９）
【出願人】（０００００２００４）昭和電工株式会社 (3,251)
【Ｆターム（参考）】
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