非消化性アミロース粒子、その製造方法、ならびにそれを含有する飲食品、医薬品および医薬部外品
【課題】実質的にα−アミラーゼによる分解を受けないアミロース粒子を提供すること、およびその製造方法を提供すること。
【解決手段】重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースから実質的になるアミロース粒子であって、かつ、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない、アミロース粒子。重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下の酵素合成アミロースからなるアミロース粒子の製造方法もまた提供される。
【解決手段】重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースから実質的になるアミロース粒子であって、かつ、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない、アミロース粒子。重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下の酵素合成アミロースからなるアミロース粒子の製造方法もまた提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非消化性アミロース粒子、その製造方法、ならびにそれを含有する飲食品、医薬品および医薬部外品に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、澱粉は消化されやすい糖質と考えられているが、実際には消化酵素により分解されない成分を有している。この難消化性成分は、食物繊維としての機能を発揮していると考えられている。食物繊維機能の例としては、整腸作用、便通作用などの腸内環境改善効果、血糖値上昇抑制作用、コレステロール低下作用などが挙げられる。
【０００３】
このような背景のもと、難消化性成分の含量を高めた難消化性澱粉の開発が進められている。その結果、湿熱処理澱粉（特許文献１（特開平７−２５２３０１号公報）、特許文献２（特開平１０−１９５１０５号公報））、ハイアミロース澱粉（特許文献３（特開平１１−２５５８０２号公報））、アミロスクラーゼにより合成されたアミロース（特許文献４（特表２００２−５２０４２５号公報）、特許文献５（国際公開第００／０２９２６号パンフレット）、特許文献６（特表２００２−５３３１０７号公報）および特許文献７（国際公開第００／３８５３７号パンフレット））などが開発されている。
【０００４】
しかしながら、これまでに開発されたこれらの難消化性澱粉はいずれも難消化性成分が１００％ではなく、消化性成分を含んでいる。混入している消化性成分は、体内で容易に分解吸収され、血糖値の上昇をもたらす。そのため、食物繊維としての機能を相殺してしまうだけでなく、特に重度の糖尿病患者向けの飲食品などの場合には、使用が困難であるという問題がある。各特許文献に記載される発明の欠点について以下に詳細に説明する。
【０００５】
特許文献１（特開平７−２５２３０１号公報）に記載の発明は、アミロース含量が３０重量％以上の澱粉を原料として減圧した後蒸気加圧処理することにより難消化性成分を高めようとしたものである。しかしながら、この方法により得られた難消化性澱粉含有デキストリンの難消化性成分の含量が６０％程度であり、さらに、消化性成分である単糖および重合度（ＤＰ）２〜９のオリゴ糖を６．９％含有する。そのため、この難消化性澱粉を経口摂取すると、これらの消化性成分が体内で容易に分解吸収され、血糖値の上昇をもたらす。従って、この難消化性澱粉は、低カロリー飲食品としての効果が低い。また、この方法により得られた難消化性澱粉の平均分子量は２０００である。特許文献１は、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースについて、何の示唆も開示もしていない。
【０００６】
特許文献２（特開平１０−１９５１０５号公報）に記載の発明は、酸処理した天然の澱粉を１３０℃〜１４０℃で湿熱処理することにより難消化性成分を高めようとしたものである。具体的には、アミロース含量の高い（７０重量％以上）ハイアミロースコーンスターチを原料にし、湿熱処理を加えることで約６６％の食物繊維含量が得られている。特許文献２は、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースについて、何の示唆も開示もしていない。
【０００７】
特許文献３（特開平１１−２５５８０２号公報）に記載の発明は、アミロース含量が３０重量％以上の高アミロース澱粉を原料として、ＣＧＴａｓｅを作用させ、澱粉粒を保持した状態で澱粉成分の易溶出部分をシクロデキストリンに変換することにより難消化性成分を高めようとしたものである。難消化性成分は最高７７％得られている。しかし、本難消化性澱粉は、世界食品添加物専門会議で許容摂取量が制限（５mg／ｋｇ／日まで）されている食品添加物であるβ−ＣＤを含有している。そのため、この難消化性澱粉を食物繊維として多量に摂取するのは望ましくない。特許文献３は、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下の酵素合成アミロースについて、何の示唆も開示もしていない。
【０００８】
特許文献４（特表２００２−５２０４２５号公報）および特許文献５（国際公開第００／０２９２６号パンフレット）には、水不溶性の線状α−１，４−Ｄ−グルカンから得られるレジスタントスターチ（ＲＳ）が開示されている。特許文献４および５の請求項は非常に広範囲であるが、具体的に開示されているのは、１種類のレジスタントスターチのみである。このレジスタントスターチは、スクロースにアミロスクラーゼという酵素を作用させる方法により製造された、数平均分子量（Ｍｎ）２３２６、重量平均分子量（Ｍｗ）３３６７、分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）約１．４５の線状α−１，４−Ｄ−グルカンを出発原料とし、この線状α−１，４−Ｄ−グルカンの１０％水分散液を加熱しゲル化させた後冷却する処理（戻し凝集処理）を行うことにより製造されている。この方法により得られる生成物においては、ＲＳ含有量が７０〜８７％まで上昇している。特許文献４および５はさらに、線状α−１，４−Ｄ−グルカンの濃度を３０％に上昇させて同様の戻し凝集処理を行うことによる、ＲＳ含有量９３〜９４％の生成物の製造を記載している。
【０００９】
このように特許文献４および５は、アミロスクラーゼで製造される比較的低分子量のα−１，４−Ｄ−グルカンを、戻し凝集という特殊な処理を行い、ＲＳ含有量を最大９４％まで高めた生成物を開示している。しかしながら、ここではＲＳ含有量が１００％でないため、当然消化される成分が含まれている。従って、特許文献４および５はα−アミラーゼによる分解を実質的に受けないアミロース粒子を示唆も開示していない。特許文献４および５は、α−アミラーゼによる分解性がα−１，４−Ｄ−グルカンの分子量および分子量分散度に大きな影響を受けることを示唆も開示もしていない。特許文献４および５は、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けないアミロース粒子が、戻し凝集という処理を経なくても製造可能であることについて示唆も開示もしていない。
【００１０】
特許文献４および５は、その発明に使用可能なα−１，４−Ｄ−グルカンを、請求項では分子量が７５〜１０，０００，０００と非常に広く規定している。しかしながらこの記載は理解不可能である。下限の７５は、グルコースの分子量（１８０）より小さく、α−１，４−Ｄ−グルカンの分子量としてそもそも適切でない。さらにグルコース（分子量１８０）およびマルトオリゴ糖（分子量３６０〜１８００）は最も消化吸収に優れた糖質であり、これらが難消化性澱粉とは理解できない。さらに特許文献４および５の発明者らが、実施例で使用しているのは、アミロスクラーゼを利用して製造されるα−１，４−Ｄ−グルカンのみである。この方法についての説明は００３２〜００３４段落にあるが、この方法で製造されるα−１，４−Ｄ−グルカンの分子量は、実施例で開示のとおり、平均分子量で数千（数平均分子量２３２６、重量平均分子量３３６７）程度でしかない。さらにアミロスクラーゼを利用するα−１，４−Ｄ−グルカンの製造法では、原理的に分子量１万を超えるようなα−１，４−Ｄ−グルカンを合成することはできない。高分子量α−１，４−Ｄ−グルカンを作るためには、００３４段落に記載されているアクセプター分子のモル数が、スクロースのモル数に対して低い条件で反応させる必要がある。しかし００３４段落に記載されているとおり、アミロスクラーゼはスクロースを原料として自身の働きによってアクセプター分子を作り出すことが出来るため、そもそもアクセプター分子の濃度を低くコントロールすることはできない。また、この方法では分子量分散度を制御する手段もない。従って、特許文献４および５は、重量平均分子量が１２，０００以上のアミロースを実質的に記載していない。
【００１１】
特許文献６（特表２００２−５３３１０７号公報）および特許文献７（国際公開第００／３８５３７号パンフレット）は、水不溶性の線状α−１，４−Ｄ−グルカンおよび／またはそれから得られるレジスタントスターチ、および少なくとも一つの食品添加物または飼料添加物を含む組成物、および該組成物を使用して得られる食品と薬品について開示している。特許文献６および７は、最も好適に利用される線状α−１，４−Ｄ−グルカンは、重量平均分子量（Ｍｗ）２０００〜８０００（００３１段落）、分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）１．５〜１５（００３３段落）であると開示している。また、特許文献６および７は、重合度１０から３５の含有量が高い線状α−１，４−Ｄ−グルカンが好ましい（００３２段落）と開示している。また、当該水不溶性の線状α−１，４−Ｄ−グルカン具体的な製造法として、スクロースにアミロスクラーゼという酵素を作用させる方法を開示している（００４０〜００４２段落）。さらにこの線状α−１，４−Ｄ−グルカンに特許文献４（特表２００２−５２０４２５号公報）の方法を利用して製造されたレジスタントスターチが好適に利用できると開示している。また、水不溶性の線状α−１，４−Ｄ−グルカンおよび／またはそれから得られるレジスタントスターチは特に好ましくは平均直径が１μｍから５μｍの微粒子であることが好適であるとしている（００６３段落）。
【００１２】
特許文献６および７の請求項は非常に広範囲であるが、具体的に実施例で開示されているのは、数平均分子量（Ｍｎ）２３２６、重量平均分子量（Ｍｗ）３３６７、分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）約１．４５の線状α−１，４−Ｄ−グルカンを利用した場合である。そしてこの線状α−１，４−Ｄ−グルカンを特許文献４（特表２００２−５２０４２５号公報）に記載の方法（α−１，４−Ｄ−グルカンの水分散液を加熱しゲル化させた後冷却する、戻し凝集処理）に従い製造した生成物（ＲＳ含有量７０〜８７％）をさらに実施例で使用している。この生成物を含有するヨーグルトを人に摂取させる試験が行われた。特許文献６および７の表２の結果を以下の表１に抜粋する。
【００１３】
【表１】
レジスタントスターチ含有ヨーグルト摂取群（ＲＳビフィド後）は、レジスタントスターチなしヨーグルト摂取群（ＬＣ１後）と比較し、糞便中のビフィド菌の相対的含有量が増加（１０．３％→１３．９％）していることが開示されている。
【００１４】
他方、糞便量に関しては、ＲＳビフィド後においてプラスマイナス３５ｇという誤差を考慮すると、レジスタントスターチなしヨーグルトの摂取による糞便量の増加（１３７ｇ−１２５ｇ＝１２ｇ）とレジスタントスターチ含有ヨーグルト摂取による糞便量の増加（１４８ｇ−１２７ｇ＝２１ｇ）とは実質的に差がなく、このことは、レジスタントスターチの有無が糞便量に実質的に影響を与えないことを示している。この結果は、特許文献６および７のレジスタントスターチが大腸内で糞便量を増加させるほどの作用は発揮できていないことを示している。
【００１５】
このように、特許文献６および７は、大腸のビフィド菌を活性化するが、大腸内での食物繊維の役割である便通改善剤として作用しないレジスタントスターチを開示している。特許文献６および７は、消化される成分を含まない、つまり実質的にα−アミラーゼによる分解を受けないアミロース粒子の摂取についてもその効果についても示唆も開示もしていない。
【００１６】
逆に、上記特許文献６および７の表２から理解されるとおり、アミロースは大腸内で糞便量を増加させる食物繊維としての作用がないということが技術常識であった。
【００１７】
特許文献８（国際公開第２００２／０９７１０７号パンフレット）には、ＳＰ−ＧＰ法を利用したグルカンの製造法が記載されている。特許文献８には、不溶性アミロースには食物繊維と同様の働きが予測され、健康食品への利用も期待できることが記載されている。特許文献８は、種々の条件でグルカンを合成することを記載している。しかし、特許文献８は、グルカンの分子量が代表的には約８×１０３以上であり、好ましくは約１×１０４以上であると記載しているが、具体的な重量平均分子量については表１５に７１２ＫＤａまたは７１５ＫＤａと記載するだけであり、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００という低分子量のグルカンの有する特徴については記載していない。このような高分子量のグルカンは水溶性であり、非常に濃度を高くするかまたはエタノールなどの有機溶媒を用いなければ沈澱を形成しない。特許文献８では、限外濾過を行って精製しているが、これは、グルカンが溶解していることを示す。特許文献８はまた、アミロースを冷却することによりアミロース粒子が形成されることを記載していない。
【００１８】
特許文献９（特開２００４−３１５４８１号公報）は、重量平均分子量約１万のアミロースおよび３万のアミロースを開示する。特許文献９は、種々の分子量のα−１，４グルカンを合成し、その中で重量平均分子量約１万または３万の低分子のα−１，４グルカンは沈殿を形成し、水不溶性であることを記載している。しかし、特許文献９は、１２，０００〜５５，０００という低分子量のグルカンの有する特性については記載していない。特許文献９では、１０６ｍＭのスクロースを用いてアミロースを合成している。特許文献９の条件で合成されるアミロース濃度は約１．６重量％程度である。特許文献９には、「１６時間保温し、反応終了後、生成したα−１，４−グルカンの収率（％）、重量平均分子量（Ｍｗ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を決定した」と記載されている。すなわち、特許文献９では、冷却を行っていないし、反応終了後、すぐに測定を行っている。アミロース粒子の大きさに影響を与えるのは、アミロース濃度、冷却温度、冷却時間、冷却時の攪拌の有無などである。特許文献９に記載されるアミロース濃度で、冷却を行わずに、短時間で形成されるアミロース粒子の平均粒子径は、非常に小さい。本願明細書の評価例５に記載するように、同じ分子量のアミロースから形成されるアミロース粒子であっても、平均粒子径が小さいと消化性が高い。このように、特許文献９に記載される沈澱は、消化性の高いものである。特許文献９はまた、アミロースを冷却することにより食物繊維として作用するアミロース粒子が形成されることを記載していない。
【００１９】
特許文献１０（国際公開第２００５／０１００９３号パンフレット）は、重量平均分子量約３万のα−１，４−グルカンを開示する。特許文献１０は、生成したα−１，４−グルカンが低分子量である場合は生成物が反応液中で沈澱すること、および沈澱／可溶化の境界が一般に分子量約１００ｋＤａ（すなわち、約１０万Ｄａ）程度であることを記載している。しかし、特許文献１０は、１２，０００〜５５，０００という低分子量のグルカンの有する特性については記載していない。特許文献１０では、１０６ｍＭのスクロースを用いてアミロースを合成している。特許文献１０の条件で合成されるアミロース濃度は約１．６重量％程度である。特許文献１０には、「１６時間保温し、反応終了後、生成したα−１，４−グルカンの収率（％）、重量平均分子量（Ｍｗ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を決定した」と記載されている。すなわち、特許文献１０では、冷却を行っていないし、反応終了後、すぐに測定を行っている。特許文献１０に記載されるアミロース濃度で、冷却を行わずに、短時間で形成されるアミロース粒子の平均粒子径は、非常に小さい。そのため、特許文献１０に記載される沈澱は、消化性の高いものである。特許文献１０はまた、アミロースを冷却することにより食物繊維として作用するアミロース粒子が形成されることを記載していない。
【００２０】
特許文献１１（国際公開第２００５／０５０１８６７８号パンフレット）は、重量平均分子量約１万、３万のα−１，４−グルカンを開示する。特許文献１１は、種々の分子量のα−１，４グルカンを合成し、その中で重量平均分子量約１万および３万の低分子のα−１，４グルカンは沈殿を形成し、水不溶性であることを記載している。特許文献１１は、生成したα−１，４−グルカンが低分子量である場合は生成物が反応液中で沈澱すること、および分子量約２００ｋＤａ（すなわち、約２０万Ｄａ）未満では沈澱し、その結晶形が老化型および非晶質であることを記載している。しかし、特許文献１１は、１２，０００〜５５，０００という低分子量のグルカンの有する特性については記載していない。特許文献１１では、１０６ｍＭのスクロースを用いてアミロースを合成している。特許文献１１の条件で合成されるアミロース濃度は約１．６重量％程度である。特許文献１１には、「１６時間保温し、反応終了後、生成したα−１，４−グルカンの収率（％）、重量平均分子量（Ｍｗ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を決定した」と記載されている。すなわち、特許文献１１では、冷却を行っていないし、反応終了後、すぐに測定を行っている。特許文献１１に記載されるアミロース濃度で、冷却を行わずに、短時間で形成されるアミロース粒子の平均粒子径は、非常に小さい。そのため、特許文献１１に記載される沈澱は、消化性の高いものである。特許文献１１はまた、アミロースを冷却することにより食物繊維として作用するアミロース粒子が形成されることを記載していない。
【特許文献１】特開平７−２５２３０１号公報
【特許文献２】特開平１０−１９５１０５号公報
【特許文献３】特開平１１−２５５８０２号公報
【特許文献４】特表２００２−５２０４２５号公報
【特許文献５】国際公開第００／０２９２６号パンフレット
【特許文献６】特表２００２−５３３１０７号公報
【特許文献７】国際公開第００／３８５３７号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００２／０９７１０７号パンフレット
【特許文献９】特開２００４−３１５４８１号公報
【特許文献１０】国際公開第２００５／０１００９３号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第２００５／０５０１８６７８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、実質的にα−アミラーゼによる分解を受けないアミロース粒子を提供すること、およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、アミロースの消化性には非常に大きな重合度依存性があることを見出し、さらに詳細に研究を行ったところ、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースから実質的になるアミロース粒子は、インビトロのα−アミラーゼ消化試験では、実質的に分解を受けず、かつ経口投与しても血糖上昇をもたらさない性質を有していることを見出し、本発明を完成させた。さらに本発明のアミロース粒子を経口摂取した場合、糞便量の顕著な上昇が見られ、食物繊維としての機能が強く発現していることを確認した。
【００２３】
このように本発明は、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない特徴を有するアミロース粒子という新規飲食品原料、医薬品素材および医薬部外品素材を初めて提供するものであり、さらにはその機能を生かした飲食品および医薬品および医薬部外品の開発を可能とするものである。
【００２４】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）
重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースからなるアミロース粒子であって、かつ、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない、アミロース粒子。
【００２５】
（項目２）
前記アミロースの重量平均分子量が１５，０００〜４５，０００である、項目１に記載のアミロース粒子。
【００２６】
（項目３）
前記アミロースの重量平均分子量が１８，０００〜４０，０００である、項目１に記載のアミロース粒子。
【００２７】
（項目４）
平均粒子径が１０マイクロメートル以上１０００マイクロメートル以下である、項目１に記載のアミロース粒子。
【００２８】
（項目５）
血糖値上昇抑制用の飲食品素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【００２９】
（項目６）
糞便量を増大させるための飲食品素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【００３０】
（項目７）
脂質の吸収を抑制させるための飲食品素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【００３１】
（項目８）
血糖値上昇抑制用の医薬品または医薬部外品の素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【００３２】
（項目９）
糞便量を増大させるための医薬品または医薬部外品の素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【００３３】
（項目１０）
脂質の吸収を抑制させるための医薬品または医薬部外品の素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【００３４】
（項目１１）
重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下の酵素合成アミロースから実質的になるアミロース粒子の製造方法であって、該方法は、
グルカンホスホリラーゼの酵素反応により、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；
該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；
該アミロース粒子を回収する工程；
を包含する、方法。
【００３５】
（項目１２）
前記プライマーが、マルトオリゴ糖である、項目１１に記載の方法。
【００３６】
（項目１３）
前記アミロース粒子が、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない、項目１１に記載の方法。
【００３７】
（項目１４）
前記冷却が、前記アミロース粒子の平均粒子径が１０マイクロメートル以上１０００マイクロメートル以下となる冷却条件で行われる、項目１１に記載の方法。
【００３８】
（項目１５）
前記アミロース粒子を水で洗浄する工程をさらに包含する、項目１１に記載の方法。
【００３９】
（項目１６）
項目１に記載のアミロース粒子を含有する飲食品。
【００４０】
（項目１７）
項目１に記載のアミロース粒子を含有する医薬品または医薬部外品。
【発明の効果】
【００４１】
本発明のアミロース粒子は、これまで公開されてきた難消化性澱粉およびアミロースとは、その成分が異なり、またその製造方法が異なっており、従来技術に対し新規性を有している。
【００４２】
さらに本発明のアミロース粒子は、実質的に非消化性成分のみからなり、消化される成分を実質的に有していない。ここに従来技術からの進歩性が認められる。さらに今回のアミロース粒子は消化される成分を実質的に有していないため、経口摂取しても、血糖値を実質的に上昇させないという優位性を有している。さらに今回のアミロース粒子は消化される成分を実質的に有していないため、他の難消化性澱粉よりも優れた糞便増加機能を有しており、ここにも進歩性が認められる。
【００４３】
特に実質的に非消化性成分のみからなり、消化される成分を実質的に有していないアミロース粒子を提供することの価値は以下にあると思われる。
【００４４】
食物繊維は、ヒトの消化酵素で分解されず、整腸作用、便通作用など腸内環境改善効果、血糖値上昇抑制作用、コレステロール低下作用がある。特にセルロースはヒトの消化酵素でまったく分解されない。一方、従来公知の難消化性澱粉はわずかであるがヒトの消化酵素により分解され代謝される。そのため血中のグルコース濃度の上昇をもたらす。難消化性澱粉を便通改善など腸内環境改善効果を期待した飲食品に利用する場合、その効果を発揮するために難消化性澱粉の多量の添加が必要となり、代謝される糖質含量も増える。その結果、血中のグルコース濃度の上昇につながる。例えば、食物繊維を糖尿病患者向けの低カロリー飲食品に利用する場合、エネルギー摂取量および血中に取り込まれるグルコース量の影響は大きく、特に重度の糖尿病患者にとって食物繊維中の微量の消化成分は無視できない。本発明の消化される部分を有していないアミロース粒子の効果は飲食品産業にとって、医薬品産業にとって、また、医薬部外品産業にとって、非常に重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４６】
（１．アミロース粒子）
本発明のアミロース粒子は、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない。本明細書中で用語「α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない」とは、アミロース粒子１０ｍｇを水１０ｍｌに懸濁した試料にブタ膵臓α−アミラーゼ（３．２５Ｕ）を３７℃にて２時間作用させた場合のアミロース粒子の残存率が９５％以上であることをいう。この場合のアミロース粒子の残存率は好ましくは約９５．５％以上であり、より好ましくは約９６％以上であり、さらに好ましくは約９７％以上であり、一層好ましくは約９８％以上であり、特に好ましくは約９９％以上であり、最も好ましくは１００％である。上限は特にないが、例えば、１００％以下のものを使用可能である。本発明のアミロース粒子は、アミロース粒子１０ｍｇを水１０ｍｌに懸濁した試料にブタ膵臓α−アミラーゼ（３．２５Ｕ）を３７℃にて約２時間以上作用させた場合のアミロース粒子の残存率が９５％以上であることが好ましい。本発明のアミロース粒子は、作用時間が好ましくは約３時間以上、より好ましくは約４時間以上、さらに好ましくは約５時間以上である場合に９５％以上の残存率を示すことが好ましい。なお、本明細書中では、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けないことを、「アミラーゼ抵抗性がある」または「アミラーゼ抵抗性がほぼ１００％である」ともいう。
【００４７】
本発明のアミロース粒子は、実質的にアミロースからなる。本明細書中では用語「実質的にアミロースからなる」とは、アミロースが約９５重量％以上を占めることをいう。アミロース粒子中のアミロースの含有量は、好ましくは約９５．５重量％以上であり、より好ましくは約９６重量％以上であり、さらに好ましくは約９７重量％以上であり、一層好ましくは約９８重量％以上であり、特に好ましくは約９９重量％以上であり、最も好ましくは約１００％である。
【００４８】
本明細書中で用語「アミロース」とは、α−１，４−グルコシド結合によって連結された２以上のＤ−グルコース単位から構成される直鎖状の糖をいう。
【００４９】
本発明のアミロース粒子に含まれるアミロースの重量平均分子量は、約１２，０００以上であり、より好ましくは約１３，０００以上であり、さらに好ましくは約１５，０００以上であり、一層好ましくは約１７，０００以上であり、特に好ましくは約１８，０００以上であり、最も好ましくは約１９，０００以上である。本発明のアミロース粒子に含まれるアミロースの重量平均分子量は、約５５，０００以下であり、より好ましくは約５４，０００以下であり、さらに好ましくは約５３，０００以下であり、さらにより好ましくは約５２，０００以下であり、一層好ましくは約５０，０００以下であり、さらに一層好ましくは約４５，０００以下であり、特に好ましくは約４０，０００以下であり、最も好ましくは約３７，０００以下である。
【００５０】
本発明のアミロース粒子に含まれるアミロースの分子量分散度は、１．２５以下である。本明細書中では、分子量分散度とは、重量平均分子量（Ｍｗ）／数平均分子量（Ｍｎ）をいう。本明細書中では、分子量分散度を「分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）」と記載する場合もある。分子量分散度は、好ましくは１．２４以下であり、より好ましくは１．２３以下であり、さらに好ましくは１．２以下であり、いっそう好ましくは１．１５以下であり、特に好ましくは１．１以下である。
【００５１】
アミロースのような高分子は、一般に均一な分子ではなく、種々の大きさの分子の混合物であるため、その分子量は数平均分子量（Ｍｎ）もしくは重量平均分子量（Ｍｗ）で評価する。Ｍｎは、その系の全質量を、その系に含まれる分子の個数で割ったものである。すなわち数分率による平均である。一方、Ｍｗは重量分率による平均である。完全に均一な物質であれば、Ｍｗ＝Ｍｎとなるが、高分子は一般に分子量分布を有するためＭｗ＞Ｍｎとなる。したがって、Ｍｗ／Ｍｎが１に近いほど、分子量の均一度が大きい（分子量分布が狭い）ということになる。一般的に高分子物質は、分子量により性質が異なるため、分子量分布の大きな高分子はさまざまな性質をもったものの混合物となる。このため、特定の機能を発揮させたいときには、分子量分布の狭いものが好適に利用される。
【００５２】
Ｍｎは、分子の個数を評価することにより、決定できる。すなわち、アミロースなどにおいては、還元性末端数を測定することにより決定できる。還元性末端数の測定は、例えばＴａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９６．１７８：ｐ．１６００−１６０６に記載されるＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ法により決定できる。また、Ｍｎは、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載される示差屈折計と多角度光散乱検出器とを併用したゲルろ過クロマトグラフィー（ＭＡＬＬＳ法）によっても、決定できる。Ｍｗは、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載されるＭＡＬＬＳ法によって決定できる。
【００５３】
本発明のアミロース粒子の平均粒子径は、好ましくは約１０マイクロメートル以上であり、より好ましくは約２０マイクロメートル以上であり、さらに好ましくは約３０マイクロメートル以上であり、特に好ましくは約４０マイクロメートル以上であり、最も好ましくは約５０マイクロメートル以上である。本発明のアミロース粒子の平均粒子径は、好ましくは約１０００マイクロメートル以下であり、より好ましくは約５００マイクロメートル以下であり、さらに好ましくは約４００マイクロメートル以下であり、さらにより好ましくは約３００マイクロメートル以下であり、特に好ましくは約２００マイクロメートル以下であり、最も好ましくは約１００マイクロメートル以下である。本明細書中の「平均粒子径」とは、数平均粒子径であり、数平均粒子径は、島津レーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−２２００、（株）島津製作所製）によって測定され得る。
【００５４】
（２．アミロース粒子の製造方法）
本発明のアミロース粒子は、グルカンホスホリラーゼの酵素反応により、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；および該アミロース粒子を回収する工程により製造される。より具体的には、グルカンホスホリラーゼの酵素反応の方法としては、グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）とスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）とを併用してスクロースに作用させる方法（ＳＰ-ＧＰ法という）、グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）を単独でグルコース−１−リン酸に作用させる方法（ＧＰ法）、グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）とβ−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ＣＰ）とを併用してβ−１，４−グルカンに作用させる方法（ＣＰ-ＧＰ法）の三種類の方法が可能である。このような、グルカンホスホリラーゼを利用して製造されるアミロースは、酵素合成アミロースとも呼ばれる。
【００５５】
ＳＰ−ＧＰ法による本発明のアミロース粒子は、スクロース、無機リン酸もしくはグルコース−１−リン酸、プライマー、スクロースホスホリラーゼ、グルカンホスホリラーゼおよび水を含有する反応液をインキュベートして、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；および該アミロース粒子を回収する工程を包含する。
【００５６】
ＧＰ法による本発明のアミロース粒子は、グルコース−１−リン酸、プライマー、グルカンホスホリラーゼおよび水を含有する反応液をインキュベートして、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；および該アミロース粒子を回収する工程により製造される。
【００５７】
ＣＰ−ＧＰ法による本発明のアミロース粒子は、β−１，４−グルカン、無機リン酸もしくはグルコース−１−リン酸、プライマー、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、グルカンホスホリラーゼおよび水を含有する反応液をインキュベートして、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；および該アミロース粒子を回収する工程により製造される。
【００５８】
本発明の製造方法を用いた場合、戻り凝集などの複雑な工程を行う必要がない。
【００５９】
（２．１ 材料）
本発明の製造方法では、例えば、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカン、スクロースホスホリラーゼ、グルカンホスホリラーゼ、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびそれを溶かしている溶媒である水を主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加して添加してもよい。
【００６０】
（２．１．１ スクロース）
スクロースは、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１で示される、分子量約３４２の二糖である。スクロースは、光合成能を有するあらゆる植物中に存在する。スクロースは、植物から単離されてもよいし、化学的に合成されてもよい。コストの面からみて、スクロースを植物から単離することが好ましい。スクロースを多量に含む植物の例としては、サトウキビ、サトウダイコンなどが挙げられる。サトウキビは、汁液中に約２０％のスクロースを含む。サトウダイコンは、汁液中に約１０〜１５％のスクロースを含む。スクロースは、スクロースを含む植物の汁液から精製糖に至るいずれの精製段階のものとして提供されてもよい。
【００６１】
本発明の方法で使用されるスクロースは、純粋なものであることが好ましい。しかし、本発明のスクロースの効果を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んでいてもよい。
【００６２】
溶液中に含まれるスクロースの濃度は、代表的には約５〜１００％、好ましくは約８〜８０％、より好ましくは約８〜５０％である。なお、本明細書中でスクロースの濃度は、Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅで、すなわち、
（スクロースの重量）×１００／（溶液の容量）
で計算する。スクロースの重量が多すぎると、反応中に未反応のスクロースが析出する場合がある。スクロースの使用量が少なすぎると、高温での反応において収率が低下する場合がある。
【００６３】
（２．１．２ 無機リン酸もしくはグルコース−１−リン酸）
本明細書中において、無機リン酸とは、スクロースホスホリラーゼの反応においてリン酸基質を供与し得る物質をいう。ここでリン酸基質とは、グルコース−１−リン酸のリン酸部分（ｍｏｉｅｔｙ）の原料となる物質をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒されるスクロース加リン酸分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用していると考えられる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、この基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という。無機リン酸は、反応開始時の反応溶液中に１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されてもよい。
【００６４】
無機リン酸は、例えば、ポリリン酸（例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸）のようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。
【００６５】
本明細書において、グルコース−１−リン酸とは、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩をいう。グルコース−１−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。グルコース−１−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−１−リン酸二ナトリウム、グルコース−１−リン酸二カリウム、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を書いていないグルコース−１−リン酸は、広義のグルコース−１−リン酸、すなわち狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩を示す。
【００６６】
グルコース−１−リン酸は反応開始時の反応溶液中に、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されていてもよい。
【００６７】
反応溶液中に含まれる無機リン酸のモル濃度とグルコース−１−リン酸のモル濃度との合計は、代表的には約１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭ〜約２５０ｍＭである。無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の量が多すぎると、アミロースの収率が低下する場合がある。使用量が少なすぎると、アミロースの合成に時間がかかる場合がある。
【００６８】
反応溶液中の無機リン酸の含有量は、国際公開第０２／０９７１０７号パンフレットの１．４に記載の方法によって定量され得る。反応溶液中のグルコース−１−リン酸の含有量は、国際公開第０２／０９７１０７号パンフレットの１．３に記載の方法によって定量され得る。反応に関与しないリン含有物質を使わない場合、そのような場合は原子吸光法によって無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の合計含有量を測定してもよい。
【００６９】
（２．１．３ プライマー）
本発明の方法で用いられるプライマーは、本発明で使用されるアミロースの合成において出発物質として作用する分子をいう。プライマーは、α−１，４−グルコシド結合で糖単位が結合できる遊離部分を１個以上有すれば、他の部分は糖以外の部分によって形成されていてもよい。本発明の方法では、プライマーに対して糖単位がα−１，４−グルコシド結合で順次結合されて、アミロースが合成される。プライマーとしては、グルカンホスホリラーゼによって糖単位が付加され得る任意の糖が挙げられる。本発明で用いられるプライマーは、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンであることが好ましい。
【００７０】
プライマーの例としては、低分子量アミロースが挙げられる。
【００７１】
本明細書中でプライマーに用いられる、用語「低分子量アミロース」とは、重合度が５０以下のアミロースをいう。本発明で用いられる低分子量アミロースの重合度は、好ましくは約２以上であり、より好ましくは約３以上であり、さらに好ましくは約４以上である。本発明で用いられる低分子量アミロースの重合度は、好ましくは約５０以下であり、より好ましくは約４０以下であり、さらに好ましくは約３０以下であり、一層好ましくは約３０以下であり、特に好ましくは約２０以下であり、最も好ましくは約１０以下である。低分子量アミロースのうち、重合度が２以上１０以下のものは特に、マルトオリゴ糖ともいう。
【００７２】
本明細書中では、用語「マルトオリゴ糖」とは、２〜１０個のグルコースが脱水縮合して生じた物質であって、α−１，４結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖の重合度は、好ましくは約４以上であり、より好ましくは約５以上であり、さらに好ましくは約７以上である。マルトオリゴ糖の重合度は、好ましくは約１０以下であり、より好ましくは約９以下であり、さらに好ましくは約８以下である。
【００７３】
マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マルトデカオースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。マルトオリゴ糖は、好ましくはマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースである。
【００７４】
プライマーは１種類の化合物であっても、複数の化合物の混合物であってもよい。コストが低いため、マルトオリゴ糖の混合物をプライマーとして使用することが好ましい。
【００７５】
合成されるアミロースの重合度は、使用されるプライマーの重合度、およびプライマーのモル濃度と基質のモル濃度との比率によって決定される。ここでいう基質とは、ＳＰ-ＧＰ法ではスクロース、ＧＰ法ではグルコース−１−リン酸、ＣＰ-ＧＰ法ではβ−１，４−グルカンのことである。使用されるプライマーの重合度が同じであれば、基質のモル濃度に対するプライマーのモル濃度が多くなるほど、得られるアミロースの重合度は小さくなる。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明の方法においては、重合度２〜１０のマルトオリゴ糖をプライマーとして使用する場合、基質のモル濃度を１００としたときのプライマーのモル濃度は、好ましくは約０．４５以上であり、より好ましくは約０．５以上であり、さらに好ましくは約０．５５以上であり、さらにより好ましくは約０．６以上であり、特に好ましくは約０．６５以上であり、最も好ましくは約０．７以上である。本発明の方法においては、重合度２〜１０のマルトオリゴ糖をプライマーとして使用する場合、基質のモル濃度を１００としたときのプライマーのモル濃度は、好ましくは約４．５以下であり、より好ましくは約４以下であり、さらに好ましくは約３．５以下であり、さらに好ましくは約３以下であり、さらにより好ましくは約２．５以下であり、特に好ましくは約２．２以下であり、最も好ましくは約２．０以下である。
【００７７】
（２．１．４ β−１，４−グルカン）
本明細書中では「β−１，４−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、β−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。β−１，４−グルカンは、直鎖状の分子であり得る。直鎖状β−グルカンとβ−１，４−グルカンとセルロースとは同義語である。直鎖状β−グルカンでは、β−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。１分子のβ−１，４−グルカンに含まれる糖単位の数を、このβ−１，４−グルカンの重合度という。β−１，４−グルカンの重合度は、好ましくは、約２〜約１０であり、より好ましくは約２〜約８であり、より好ましくは約２〜約５である。重合度が約２〜約１０のβ−１，４−グルカンを、セロオリゴ糖ともいう。重合度が２のβ−１，４−グルカンを特に、セロビオースという。重合度が３のβ−１，４−グルカンをセロトリオースという。重合度が４のβ−１，４−グルカンをセロテトラオースという。β−１，４−グルカンの重合度が低いほど溶解度が高く、取り扱いが容易であるので、重合度の低いβ−１，４−グルカンがより好ましい。β−１，４−グルカンは、あらゆる植物中に存在する。β−１，４−グルカンは、植物から単離されたまま未改変のものであってもよく、植物から単離したものを化学的または酵素的に処理することによって得られたものであってもよい。β−１，４−グルカンはまた、古紙、建材、古布などの廃棄物から再生されるセルロースまたはそれから調製されたものであってもよい。例えば、植物から単離した高分子量のセルロースに対してセルラーゼを作用させることによって、より低分子量のセロオリゴ糖が得られる。植物からセロオリゴ糖を大量に生産する方法は当該分野で公知である。このような文献の例としては、特開２００１−９５５９４号公報が挙げられる。β−１，４−グルカンは、β−１，４−グルカンを含む植物破砕液から精製β−１，４−グルカンに至るいずれの生成段階のものとして提供されてもよい。本発明の方法で使用されるβ−１，４−グルカンは、純粋なものであることが好ましい。しかし、本発明で用いる酵素の作用を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んでいてもよい。
【００７８】
溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンの濃度は、代表的には約０．１％〜約４０％であり、好ましくは約０．５％〜約３０％であり、より好ましくは約１％〜約２０％であり、特に好ましくは約２％〜約１５％であり、最も好ましくは約３％〜約１２％である。なお、本明細書中でβ−１，４−グルカンの濃度は、Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅで、すなわち、
（β−１，４−グルカンの重量）×１００／（溶液の容量）
で計算する。β−１，４−グルカンの重量が多すぎると、溶液中に未反応のβ−１，４−アミロースが析出する場合がある。β−１，４−グルカンの使用量が少なすぎると、高温での反応において、反応自体は起こるものの、収率が低下する場合がある。
【００７９】
（２．１．５ スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ．２．４．１．７））
本明細書中では、「スクロースホスホリラーゼ」とは、スクロースのα−グリコシル基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【００８０】
【化１】
スクロースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。スクロースホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｍｏｎｉｌｉａ ｓｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｅａ ｅｓｃｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
スクロースホスホリラーゼは、スクロースホスホリラーゼを産生する任意の生物由来であり得る。スクロースホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、単独で存在する場合の耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、スクロースホスホリラーゼを４％のスクロース存在下で５５℃にて３０分間加熱した場合に加熱前のスクロースホスホリラーゼの活性の５０％以上の活性を保持するものであることが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌由来であり、さらに好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ由来である。
【００８２】
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
【００８３】
本発明で用いられるスクロースホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、スクロースホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。本発明で用いられるスクロースホスホリラーゼは、上記の生物から単離したスクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【００８４】
このようなスクロースホスホリラーゼは、当該分野で公知の方法によって調製され得る。例えば、国際公開第０２／０９７１０７号パンフレットに記載される方法によって調製され得る。
【００８５】
スクロースホスホリラーゼは、未精製のものであっても精製されたものであってもよいが、好ましくはある程度精製されたものである。
【００８６】
本発明の方法において反応開始時の溶液中に含まれるスクロースホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約０．０５Ｕ／ｇスクロース以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｇスクロース以上であり、さらに好ましくは約０．５Ｕ／ｇスクロース以上であり、特に好ましくは約１Ｕ／ｇスクロース以上であり、最も好ましくは約１０Ｕ／ｇスクロース以上である。本発明の方法において反応開始時の溶液中に含まれるスクロースホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約１０００Ｕ／ｇスクロース以下であり、より好ましくは約５００Ｕ／ｇスクロース以下であり、さらに好ましくは約３００Ｕ／ｇスクロース以下であり、特に好ましくは約１００Ｕ／ｇスクロース以下であり、最も好ましくは約５０Ｕ／ｇスクロース以下である。スクロースホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、アミロースの収率が低下する場合がある。
【００８７】
スクロースホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。スクロースホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。スクロースホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。
【００８８】
（２．１．６ グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ．２．４．１．１））
グルカンホスホリラーゼとは、α−１，４−グルカンの加リン酸分解を触媒する酵素の総称であり、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるα−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。本発明の方法では、無機リン酸は、スクロースの加リン酸分解に使われ、反応溶液中に含まれる無機リン酸の量が少ないので、α−１，４−グルカンの合成の方向に反応が進む。
【００８９】
グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。
【００９０】
グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ（馬鈴薯ともいう）、サツマイモ（甘藷ともいう）、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。
【００９１】
グルカンホスホリラーゼを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類などが挙げられる。
【００９２】
グルカンホスホリラーゼを産生する微生物の例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｓｕｌｕｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓなどが挙げられる。グルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【００９３】
本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来することが好ましく、ジャガイモに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルカンホスホリラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【００９４】
本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、グルカンホスホリラーゼを産生する動物、植物、および微生物から直接単離され得る。
【００９５】
本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、これらの動物、植物または微生物から単離したグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【００９６】
グルカンホスホリラーゼは、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【００９７】
このようなグルカンホスホリラーゼは、当該分野で公知の方法によって調製され得る。例えば、国際公開第０２／０９７１０７号パンフレットに記載される方法によって調製され得る。
【００９８】
グルカンホスホリラーゼは、未精製のものであっても精製されたものであってもよいが、好ましくはある程度精製されたものである。
【００９９】
本発明の方法において反応開始時の溶液中に含まれるグルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約０．０５Ｕ／ｇスクロース以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｇスクロース以上であり、さらに好ましくは約０．５Ｕ／ｇスクロース以上であり、特に好ましくは約１Ｕ／ｇスクロース以上であり、最も好ましくは約１０Ｕ／ｇスクロース以上である。本発明の方法において反応開始時の溶液中に含まれるグルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約１０００Ｕ／ｇスクロース以下であり、より好ましくは約５００Ｕ／ｇスクロース以下であり、さらに好ましくは約３００Ｕ／ｇスクロース以下であり、特に好ましくは約１００Ｕ／ｇスクロース以下であり、最も好ましくは約５０Ｕ／ｇスクロース以下である。グルカンホスホリラーゼの使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、アミロースの収率が低下する場合がある。
【０１００】
グルカンホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。グルカンホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。グルカンホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。グルカンホスホリラーゼはまた、スクロースホスホリラーゼと同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１０１】
（２．１．７ β−１，４−グルカンホスホリラーゼ）
本明細書中では、「β−１，４−グルカンホスホリラーゼ」とは、β−１，４−グルカンの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるβ−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存するが、この反応は、β−１，４−グルカン合成反応の方向に進みやすい傾向がある。β−１，４−グルカンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【０１０２】
【化２】
なお、この式において、出発時のβ−１，４−グルカンの重合度が２の場合、β−１，４−グルカンの代わりにグルコースが得られる。
【０１０３】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼは好ましくは、セロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．２０）またはセロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．４９）である。
【０１０４】
セロビオースホスホリラーゼは、セロビオースの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロビオースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【０１０５】
【化３】
セロデキストリンホスホリラーゼは、重合度３以上のセロオリゴ糖の非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロオリゴ糖は、セロデキストリンとも呼ばれる。セロデキストリンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【０１０６】
【化４】
本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロビオースである場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においてはまた、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。この場合、セロデキストリンホスホリラーゼの作用によってセロオリゴ糖が分解されることによって生じたグルコース−１−リン酸がα−グルカン合成に使用され、かつ最終的に生じたセロビオースをセロビオースホスホリラーゼによって分解し得るので、セロオリゴ糖からα−グルカンの合成速度がより速くなる。
【０１０７】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）を産生する任意の生物由来であり得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを１．４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で５５℃にて２０分間加熱した場合に加熱前のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの活性の５０％以上の活性を保持するものであることが好ましく、６０％以上の活性を保持するものであることがより好ましく、７０％以上の活性を保持するものであることがさらに好ましく、８０％以上の活性を保持するものであることが特に好ましく、８５％以上の活性を保持するものであることが最も好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来である。
【０１０８】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。
【０１０９】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。
【０１１０】
本発明で用いられるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。本発明で用いられるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記の生物から単離したβ−１，４−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１１１】
（２．１．８ 水）
水は、軟水、中間水および硬水のいずれであってもよい。硬水とは、硬度２０°以上の水をいい、中間水とは、硬度１０°以上２０°未満の水をいい、軟水とは、硬度１０°未満の水をいう。水は、好ましくは軟水または中間水であり、より好ましくは軟水である。
【０１１２】
（２．１．９ 他の材料）
スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカン、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼなどの材料を含む溶液中には、スクロースホスホリラーゼとスクロースとの間の相互作用、グルカンホスホリラーゼとプライマーとの間の相互作用およびβ−１，４−グルカンホスホリラーゼとβ−１，４−グルカンとの間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、スクロースホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。
【０１１３】
（２．２．１ ＳＰ−ＧＰ法によるアミロースの合成）
本発明で用いられるアミロースは、当該分野で公知の任意のアミロース合成方法によって合成され得る。例えば、スクロースとプライマーにスクロースホスホリラーゼとグルカンホスホリラーゼとを同時に作用させる方法（ＳＰ−ＧＰ法ともいう）によって合成され得る。この実施形態では、本発明で用いられるアミロースは、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液をインキュベートしてアミロースを生成させる工程により製造される。
【０１１４】
国際公開第０２／０９７１０７号パンフレットの図１には、スクロースからのグルカン合成の概略が示されている。スクロースと無機リン酸からスクロースホスホリラーゼを用いて、グルコース−１−リン酸が生成される。生成されたグルコース−１−リン酸および反応溶液に加えたグルコース−１−リン酸は、直ちにグルカンホスホリラーゼにより適切なプライマーに転移され、α−１，４−グルカン鎖が伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度スクロースホスホリラーゼの反応にリサイクルされる仕組みになっている。
【０１１５】
まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、固体状のスクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、またはグルカンホスホリラーゼをそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、反応溶液は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。
【０１１６】
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応開始時の反応溶液中のスクロース濃度が約５〜約１００％である場合には、反応温度は代表的には、約４０℃〜約７０℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるスクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方の活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約４０℃〜約７０℃であり、より好ましくは約４５℃〜約７０℃、さらにより好ましくは約４５℃〜約６５℃である。
【０１１７】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるアミロースの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。
【０１１８】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えた金属（例えば、ステンレス）製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０１１９】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、スクロース、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。
【０１２０】
このようにして、アミロースを含有する溶液が生産される。
【０１２１】
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。
【０１２２】
（２．２．２ ＧＰ法によるアミロースの合成）
本発明で用いられるアミロースは、グルカンホスホリラーゼを、プライマーとグルコース−１−リン酸とに作用させる方法（ＧＰ法ともいう）によって合成されてもよい。この実施形態では、本発明で用いられるアミロースは、グルカンホスホリラーゼと、プライマーと、グルコース−１−リン酸とを含む反応溶液をインキュベートして、アミロースを生成させる工程により製造される。
【０１２３】
まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、プライマー、グルコース−１−リン酸、およびグルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、プライマー、グルコース−１−リン酸またはグルカンホスホリラーゼをそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、反応溶液は、プライマー、グルコース−１−リン酸およびグルカンホスホリラーゼのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。
【０１２４】
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応温度は代表的には、約３０℃〜約８０℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるグルカンホスホリラーゼの活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約３０℃〜約８０℃であり、より好ましくは約３５℃〜約７０℃、さらにより好ましくは約３７℃〜約６５℃である。
【０１２５】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるアミロースの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。
【０１２６】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えた金属（例えば、ステンレス）製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０１２７】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、プライマー、グルコース−１−リン酸およびグルカンホスホリラーゼを反応溶液に追加してもよい。
【０１２８】
このようにして、アミロースを含有する溶液が生産される。
【０１２９】
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。
【０１３０】
（２．２．３ ＣＰ−ＧＰ法によるアミロースの合成）
本発明で用いられるアミロースは、当該分野で公知の任意のアミロース合成方法によって合成され得る。例えば、β−１，４−グルカンと無機リン酸もしくはグルコース−１−リン酸、プライマーにβ−１，４−グルカンホスホリラーゼとグルカンホスホリラーゼとを同時に作用させる方法（ＣＰ−ＧＰ法ともいう）によって合成され得る。この実施形態では、本発明で用いられるアミロースは、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液をインキュベートしてアミロースを生成させる工程により製造される。ＣＰ−ＧＰ法によるアミロースの合成の詳細は、国際公開第２００５／０５６８１１号パンフレットに記載されている。国際公開第２００５／０５６８１１号パンフレットの図２には、ＣＰ−ＧＰ法において生じる反応の概略が示されている。β−１，４−グルカン（重合度ｎ）と無機リン酸から、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを用いて、グルコース−１−リン酸およびβ−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）が生成される。生成されたグルコース−１−リン酸（および溶液に加えたグルコース−１−リン酸）は、直ちにα−１，４−グルカンホスホリラーゼにより、適切なプライマー（重合度ｍ）にα−１，４−結合で転移され、α−グルカン鎖（重合度ｍ＋１）として伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度β−１，４−グルカンホスホリラーゼの反応にリサイクルされる仕組みになっている。
【０１３１】
本発明の製造方法においては例えば、まず、溶液を調製する。溶液は、例えば、適切な溶媒に、固体状のβ−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。あるいは、溶液は、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、またはα−１，４−グルカンホスホリラーゼをそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、溶液は、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。本発明の製造方法で用いられる溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。この溶液のｐＨは、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意のｐＨであり得る。ｐＨ値は、好ましくは約６〜約８であり、より好ましくは約６．５〜約７．５である。ｐＨは、反応に用いる酵素の至適ｐＨに合わせて適切に設定され得る。溶液の塩濃度もまた、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意の塩濃度であり得る。塩濃度は、好ましくは１．０ｍＭ〜５０ｍＭであり、より好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭである。
【０１３２】
β−１，４−グルカンが、セロビオースであり、β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである場合、この溶液には、α−グルカン（アミロース）の生成の際に生成するグルコースを溶液から除去するために、例えば、グルコースイソメラーゼまたはグルコースオキシダーゼ（およびムタロターゼ）をさらに添加してもよい。さらに、溶液中にカタラーゼまたはペルオキシダーゼを添加してもよい。あるいは、酵母のような、グルコースを資化することによってグルコースを溶液中から除去する微生物を添加してもよい。あるいは、グルコース特異的吸着樹脂を添加してもよい。酵素または微生物を添加する方法は、反応を連続して進行させながらグルコースを同時に除去し得るので好ましい。なお、本明細書中では、「除去する」とは、反応液中のグルコースの量を低減させることおよびグルコースを存在させなくすることを包含する。
【０１３３】
次いで、溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。溶液の温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり、添加した酵素がその活性を示す温度である。例えば、耐熱性酵素を用い、反応温度をその耐熱酵素に最適な温度にすることによって、添加した耐熱性酵素以外の混入した酵素の活性を抑え得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方の活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は、好ましくは約３０℃〜約７０℃の温度であり、より好ましくは約３５℃〜約６０℃である。
【０１３４】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるアミロースの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。
【０１３５】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えた金属（例えば、ステンレス）製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０１３６】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、β−１，４−グルカン、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼのうちの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。
【０１３７】
β−１，４−グルカンが、セロビオースであり、β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである場合、上述したように、グルコースイソメラーゼなどの酵素を添加して、α−グルカンの生産と同時に副生するグルコースを除去する工程を、生産工程と同時に行うことが好ましい。他方、グルコースを除去する工程は、α−グルカン生産工程とタイミングをずらして行ってもよい。例えば、本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、反応によって生成されたグルコースを除去するために、溶液をクロマト分画、膜分画法などの物理的グルコース除去方法で処理し、その後再度、反応を進行させてもよい。物理的グルコース除去方法は、１回実施されても、２回以上実施されてもよい。２回以上実施する場合、例えば、反応を２時間進行させた後、グルコース除去を行い、次いで再度反応を２時間進行させた後、グルコース除去を行い、次いで再度反応を２時間行うこととし得る。
【０１３８】
このようにして、α−グルカンを含有する溶液が生産される。
【０１３９】
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。
【０１４０】
（２．３ アミロース含有溶液の冷却によるアミロース粒子の形成）
次いで、アミロースを含有する反応溶液が冷却されることにより、アミロース粒子が形成される。この際、アミロース粒子径に影響を与える要因は、アミロース濃度、冷却温度、冷却時間、冷却時の攪拌の有無などである。本発明では、平均粒子径が１０マイクロメートル以上１０００マイクロメートル以下であるアミロース粒子が形成される条件であれば、任意の条件でアミロース粒子の形成が行われ得る。アミロースの濃度が高いほど粒子形成速度が速く、得られる粒子の粒子径は大きくなる。アミロース粒子を形成させる際の溶液中のアミロース濃度は、好ましくは約２重量％以上であり、より好ましくは約２．４重量％以上であり、さらに好ましくは約２．７重量％以上である。アミロース粒子を形成させる際の溶液中のアミロース濃度は、好ましくは約３０重量％以下であり、より好ましくは約２５重量％以下であり、さらに好ましくは約２０重量％以下である。冷却温度が低いほど粒子形成速度が速く、得られる粒子の粒子径は大きくなる。冷却温度は好ましくは約０℃以上であり、より好ましくは約４℃以上である。冷却温度は好ましくは約４０℃以下であり、より好ましくは約３０℃以下である。作業効率およびコストの面の観点からは、冷却温度はさらに好ましくは約１０℃〜約２５℃である。これは、このように高い温度であっても充分に大きなアミロース粒子が形成され得ることを示す。冷却は例えば、ジャケット付反応タンクのジャケットに冷却水を循環させることにより行われ得る。本明細書中では、「冷却温度」とは、アミロース含有溶液の温度をいう。冷却時間は任意に設定できる。本明細書中では、上記のような、ジャケットに冷却水を循環させて冷却を行う場合には、アミロース含有溶液の温度が冷却温度に到達してからの時間を冷却時間という。冷却時間は、経済性と作業性の観点から、好ましくは約０．５時間以上であり、より好ましくは約１時間以上である。冷却時間は、約２時間以上、約３時間以上、約４時間以上、約５時間以上、約６時間以上などであってもよい。冷却時間は、経済性と作業性の観点から、好ましくは約２４時間以下であり、より好ましくは約２０時間以下であり、さらに好ましくは約１８時間以下である。冷却時間は、約１６時間以下、約１４時間以下、約１２時間以下、約１０時間以下、約８時間以下、約６時間以下、約４時間以下などであってもよい。冷却時の攪拌は必ずしも必須ではないが、攪拌を行うと、粒子径を均一にすることが出来るため好ましい。
【０１４１】
好ましい局面では、冷却を行う際のアミロース含有溶液中のアミロース濃度は約２．７重量％〜約２０重量％であり、この場合の好ましい冷却温度は約４℃〜約２５℃であり、冷却時間は約１時間〜約１８時間である。
【０１４２】
なお、冷却を行う際のアミロース含有溶液としては、アミロース合成反応を行った反応溶液そのもの以外にも、反応溶液を濃縮した液体、部分的に精製を行った液体などを用いてもよい。
【０１４３】
（２．４ アミロース粒子の回収）
アミロース粒子は、任意の方法により回収され得る。アミロース粒子は、例えば、膜分画、濾過、遠心分離などの一般的な固液分離方法によって回収され得る。
【０１４４】
回収されたアミロース粒子は、水で洗浄されることが好ましい。水で洗浄することにより、アミロース粒子の表面に付着しているフルクトースなどの消化性の糖が除去される。
【０１４５】
回収されたアミロース粒子は、乾燥されることが好ましい。乾燥は、当該分野で公知の方法によって行われ得る。乾燥方法の例としては、例えば、気流乾燥、スプレードライ、凍結乾燥などが挙げられる。また、造粒機能をあわせ持つ乾燥装置も利用できる。乾燥することにより保存性が向上する。
【０１４６】
（３．血糖値上昇抑制用の飲食品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取しても血糖値を上昇させないので、血糖値の上昇を抑制するための飲食品素材として好適に使用され得る。本明細書中で用語「飲食品素材」とは、飲食品の原料として使用される可食性組成物をいう。すなわち、そのままでは食用にされず、他の飲食品素材と組み合わされて、調理されてから食用とされるものをいう。本発明の飲食品素材は、糖尿病、耐糖能異常、高血圧、高脂血症、肥満などに悩む被験体に有効である。本発明の飲食品素材はまた、ダイエット食品としても有効である。
【０１４７】
血糖値上昇抑制用の飲食品素材の実施形態において、本発明の飲食品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１４８】
本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、一般的な食品原料、食品添加物、水などが挙げられる。具体的には、食品原料は、例えば、単糖類、多糖類、糖アルコール、澱粉、加工澱粉、デキストリンなどの糖類、乳タンパク質、リポタンパク質、卵タンパク質、小麦タンパク質などのタンパク質、各種植物油および動物油、加工油脂などの脂質などが挙げられる。食品添加物は、例えば、ビタミン類、ミネラル類、レシチン、グリセリン脂肪酸エステルなどの乳化剤、ペクチン、ゼラチン、寒天、デキストリン、多糖類、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどの安定剤、呈味成分、着香料、着色料、酸化防止剤、ｐＨ調製剤などが挙げられる。上記食品原料、食品添加物、水などは、単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１４９】
（４．糞便量を増大させるための飲食品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取することにより糞便量を増加させるので、糞便量を増大させるための飲食品素材として好適に使用され得る。本発明の飲食品素材は、胃腸障害、便秘、下痢などの便通異常、肥満、高脂血症などに悩む被験体に有効である。本発明の飲食品素材はまた、ダイエット食品としても有効である。
【０１５０】
糞便量を増大させるための飲食品素材の実施形態において、本発明の飲食品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１５１】
本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、一般的な食品原料、食品添加物、水などが挙げられる。具体的には、食品原料は、例えば、単糖類、多糖類、糖アルコール、澱粉、加工澱粉、デキストリンなどの糖類、乳タンパク質、リポタンパク質、卵タンパク質、小麦タンパク質などのタンパク質、各種植物油および動物油、加工油脂などの脂質などが挙げられる。食品添加物は、例えば、ビタミン類、ミネラル類、レシチン、グリセリン脂肪酸エステルなどの乳化剤、ペクチン、ゼラチン、寒天、デキストリン、多糖類、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどの安定剤、食物繊維、呈味成分、着香料、着色料、酸化防止剤、ｐＨ調製剤などが挙げられる。上記食品原料、食品添加物、水などは、単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１５２】
（５．脂質の吸収を抑制させるための飲食品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取することにより脂質の吸収を抑制するので、脂質の吸収を抑制させるための飲食品素材として好適に使用され得る。
【０１５３】
本発明の飲食品素材は、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、糖尿病脂肪肝、肝硬変などに悩む被験体に有効である。本発明の飲食品素材はまた、ダイエット食品としても有効である。
【０１５４】
脂質の吸収を抑制させるための飲食品素材の実施形態において、本発明の飲食品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１５５】
本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、一般的な食品原料、食品添加物、水などが挙げられる。具体的には、食品原料は、例えば、単糖類、多糖類、糖アルコール、澱粉、加工澱粉、デキストリンなどの糖類、乳タンパク質、リポタンパク質、卵タンパク質、小麦タンパク質などのタンパク質、各種植物油および動物油、加工油脂などの脂質などが挙げられる。食品添加物は、例えば、ビタミン類、ミネラル類、レシチン、グリセリン脂肪酸エステルなどの乳化剤、ペクチン、ゼラチン、寒天、デキストリン、多糖類、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどの安定剤、食物繊維、呈味成分、着香料、着色料、酸化防止剤、ｐＨ調製剤などが挙げられる。上記食品原料、食品添加物、水などは、単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１５６】
（６．血糖値上昇抑制用の医薬品素材および医薬部外品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取しても血糖値を上昇させないので、血糖値の上昇を抑制するための医薬品素材および医薬部外品素材として好適に使用され得る。本明細書中で用語「医薬品素材」とは、医薬品の原料として使用される可食性組成物をいう。本明細書中で用語「医薬品部外品素材」とは、医薬部外品の原料として使用される可食性組成物をいう。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、糖尿病、耐糖能異常、高血圧、高脂血症、肥満などに悩む被験体に有効である。
【０１５７】
血糖値上昇抑制用の医薬品素材の実施形態において、本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１５８】
本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、医薬品および医薬部外品に使用することが認可させている医薬品原料および医薬部外品原料、水などが挙げられる。医薬品原料および医薬部外品原料、水などは単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１５９】
（７．糞便量を増大させるための医薬品素材および医薬部外品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取することにより糞便量を増加させるので、糞便量を増大させるための医薬品素材および医薬部外品素材として好適に使用され得る。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、胃腸障害、便秘、下痢などの便通異常、肥満、高脂血症などに悩む被験体に有効である。
【０１６０】
糞便量を増大させるための医薬品素材および医薬部外品素材の実施形態において、本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１６１】
本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、医薬品および医薬部外品に使用することが認可させている医薬品原料および医薬部外品原料、水などが挙げられる。医薬品原料および医薬部外品原料、水などは単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１６２】
（８．脂質の吸収を抑制させるための医薬品素材および医薬部外品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取することにより脂質の吸収を抑制するので、脂質の吸収を抑制させるための医薬品素材および医薬部外品素材として好適に使用され得る。
【０１６３】
本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、肥満、高血圧、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、糖尿病脂肪肝、肝硬変などに悩む被験体に有効である。
【０１６４】
脂質の吸収を抑制させるための医薬品素材および医薬部外品素材の実施形態において、本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１６５】
本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、医薬品および医薬部外品に使用することが認可させている医薬品原料および医薬部外品原料、水などが挙げられる。医薬品原料および医薬部外品原料、水などは単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１６６】
（９．飲食品）
本発明の飲食品は、本発明のアミロース粒子を含有する。
【０１６７】
本発明の飲食品は、任意の形態であり得る。本発明の飲食品は、例えば、固体状（例えば、粉末状、ブロック状など）、半固体状（例えば、スラリー状、ゲル状など）または液状であり得る。特定の場合には、本発明の飲食品は、粉末または液状であることが好ましい。
【０１６８】
本発明の飲食品は、食品または飲料である。食品の例としては、以下が挙げられる：米・麦・小麦粉製品（例えば、ごはん、もち、てんぷら粉、パン、麺、パスタ、ビーフン）；いも及びでんぷん食品（例えば、くずきり、はるさめ）；甘味料類（例えば、角砂糖、粉飴）；菓子類（例えば、スナック菓子、クラッカー、ビスケット、クッキー、ケーキ、パイ、カステラ、ウエハース、ボーロ、チョコレート、チョコレート菓子、キャラメル、キャンディー、錠菓、清涼菓子、チューインガム、ゼリー、ゼリー菓子、プリン、ブランマンジェ、米菓子、豆菓子、甘納豆、ようかん、くずもち、しるこ、中華まん、シリアル、クッキーミックス、プリンミックス、ゼリーミックス）；アイスクリーム類（例えば、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、氷菓）；油脂類（例えば、植物油、バター、マーガリン、治療用油脂）；種実類（例えば、ごま、ねりごま、松の実）；大豆・大豆製品（例えば、大豆水煮、豆腐、みそ）；魚介・練製品（例えば、水産練製品、かずのこ、くらげ）；畜産加工品（例えば、ハム、ソーセージ、ベーコン、ミートローフ）；卵類（例えば、ゆで卵、温泉卵、スモーク卵）；乳製品（例えば、ヨーグルト、チーズ、クリーム、粉乳、練乳）；野菜・きのこ類（例えば、漬物、やまいもパウダー）；果実加工品・ペースト類（例えば、ドライフルーツ、ジャム、マーマレード、フルーツうらごし、マッシュ、フルーツソース、ペースト、あん）；海藻類（例えば、のり、こんぶ、わかめ、もずく、海藻サラダ）；調味料類（例えば、しょうゆ、食酢、ソース類、マヨネーズ類、ドレッシング類、ケチャップ類、ルウ、みりん、料理酒、だしの素、つゆ、たれ、ごはんの素、ミックス調味料、漬け物の素、味付塩こしょう）；香辛料類（例えば、からし、こしょう、さんしょう、しょうが、とうがらし、にんにく、わさび、カレー粉、花、椒五香粉、ゆずみそ）；半料理・調理済食品（例えば、かゆ、ごはんの素、ハンバーグ、ミートボール、チキンナゲット、カレー、シチュー、ピザ、グラタン、スパゲティ、焼そば、肉まん、中華惣菜、卵豆腐、茶碗蒸し、ファーストフード）；冷凍食品（例えば、米飯類、グラタン、ピザ、めん類、いも製品、大豆製品、魚介料理、肉料理、卵料理、惣菜、菓子類、ミックスベジタブル）；缶詰・びん詰類（例えば、種実類、豆類、魚介類、肉類、野菜類、果実類、きのこ類、ソース類、デザート、スープ類、植物たんぱく製品、治療用缶詰）；即席食品（例えば、袋入りめん類、生タイプめん類、カップめん、ごはん類、カレー、シチュー、スープ、ソース、ごはんの素、植物たんぱく食品）；煮豆・佃煮類（例えば、煮豆、しいたけのり、なめたけ）；ふりかけ・そぼろ（例えば、かつおふりかけ、ゆかり、お茶漬け、そぼろ）；ベビーフード（例えば、米・めん料理、魚料理、肉料理、卵料理、乳製品料理、野菜料理、スープ、フルーツ、ジュース、水分補給飲料、茶、デザート、菓子、ソース、ふりかけ）；粉乳（例えば、一般調整粉乳、特殊調整粉乳、妊婦・授乳婦用粉乳）；経腸栄養食品（例えば、経腸栄養剤、濃厚流動食、栄養補給・栄養補助食品、経腸栄養剤・濃厚流動食用フレーバー、デザート）；その他の食品（例えば、栄養補助食品、ブレンダー食、とろみ食品、検査用食品、シリアル食品、スポーツ用食品、非常食、健康食品、高齢者用食品、ペットフード、動物用飼料）。
【０１６９】
なお、チューインガム、茶葉のように最終的に飲み込まない部分がある食品については、アミロース粒子の含有量は、飲み込まれない部分（例えば、チューインガムの場合はガムベース）の量を除外して計算される。
【０１７０】
飲料類の例としては、以下が挙げられる：乳、乳飲料、豆乳、豆乳飲料、ジュース、炭酸飲料、コーヒー、ココア、茶（例えば、紅茶、日本茶、ウーロン茶）、アルコール飲料、スポーツドリンク、野菜ジュース、栄養ドリンク、ミネラルウォーター、しるこ、ドリンクスープ。
【０１７１】
本発明の飲食品は、製造の任意の段階でアミロース粒子を添加すること以外は、その飲食品の通常の原料から通常の手順で、通常の組成で製造され得る。アミロース粒子は、例えば、直接まぶす、砂糖、食塩等の粉体に分散して噴霧する、水、だし等の液体に懸濁して浸漬または噴霧するなど、当該分野で公知の任意の方法によって食品に添加され得る。また、食品が、シュークリーム、アンパンなどのように複数の異なる組成を有する部分から構成される場合、アミロース粒子は複数の部分のうちのいずれか１つの部分に含まれてもよく、複数の部分のうちのいくつかの部分に含まれていてもよく、全ての部分に含まれていてもよい。
【０１７２】
添加方法としては、使用するアミロース粒子の全量を一度に飲食品中に投入してもよく、時間をかけて少量ずつ投入してもよい。アミロース粒子を添加するタイミングは、飲食品の加熱前、加熱中または加熱後のいずれであってもよい。添加の際もしくは添加の後には、必要に応じて飲食品の撹拌を行って、飲食品中の材料全体の表面に均一にアミロース粒子を接触させるようにすることが好ましい。
【０１７３】
特定の実施形態では、１つの実施形態では、本発明の飲食品は、低カロリー飲食品である。１つの実施形態では、本発明の飲食品は、ゼロカロリー飲食品である。本明細書中では、用語「ゼロカロリー飲食品」とは、１００ｇあたりのエネルギー量が５ｋｃａｌ以下である飲食品をいう。本明細書中では、用語「低カロリー飲食品」とは、１００ｇあたりのエネルギー量が、飲料の場合は２０ｋｃａｌ以下、食品の場合は４０ｋｃａｌ以下である飲食品をいう。すなわち、低カロリー飲食品は、ゼロカロリー飲食品を包含する。ゼロカロリー飲食品は、ノンカロリー飲食品ともいわれる。健康増進法によれば、栄養成分が少ないことを強調する表示の基準として、「低」、「軽」、「ひかえめ」、「低減」、「カット」などのエネルギー表示が可能である。また、「無」、「ゼロ」、「ノン」などのエネルギー表示は、１００ｇあたりのエネルギーが５ｋｃａｌ以下とされている。ゼロカロリー飲食品または低カロリー食品のカロリー数は、当該分野で公知の方法に従って実際に測定されてもよく、あるいは、食品成分表および厚生労働省によるエネルギー換算計数に基づいて計算されてもよい。
【０１７４】
本発明の低カロリー飲食品の１００ｇあたりのエネルギー量は、好ましくは約４０ｋｃａｌ以下であり、より好ましくは約３０ｋｃａｌ以下であり、さらに好ましくは約２０ｋｃａｌ以下であり、特に好ましくは約１０ｋｃａｌ以下であり、とりわけ好ましくは約５ｋｃａｌ以下であり、そして最も好ましくは約０ｋｃａｌである。
【０１７５】
本発明のアミロース粒子は、経口摂取しても実質的に吸収されず、エネルギーを生じないので、１００ｇあたりのエネルギー量は、約０ｋｃａｌであると考えられる。すなわち、ゼロカロリーの食品素材として知られるエリスリトールと同程度のエネルギーである。
【０１７６】
本発明の飲食品に含まれるアミロース粒子の含有量は、好ましくは約０．１重量％以上であり、より好ましくは約０．５重量％以上であり、さらに好ましくは約１重量％以上であり、特に好ましくは約５重量％以上であり、最も好ましくは約１０重量％以上である。この実施形態では、飲食品に含まれるアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以下であり、より好ましくは約４０重量％以下であり、さらに好ましくは約３０重量％以下であり、特に好ましくは約２０重量％以下であり、最も好ましくは約１５重量％以下である。
【０１７７】
本発明の飲食品は、糖尿病、耐糖能異常；胃腸障害、便秘、下痢などの便通異常、；肥満、高血圧、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、糖尿病脂肪肝、肝硬変などに悩む被験体に有効である。本発明の飲食品はまた、ダイエット食品としても有効である。
【０１７８】
（１０．医薬品および医薬部外品）
本発明の医薬品および医薬部外品は、本発明のアミロース粒子を含有する。
【０１７９】
本発明の医薬品および医薬部外品は、任意の形態であり得る。本発明の医薬品および医薬部外品は、固体状であっても、半固体状であっても、液状であってもよいが、好ましくは固体状である。本発明の医薬品は、例えば、錠剤、丸剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などであり得る。本発明の医薬部外品は、例えば、錠剤、丸剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などであり得る。本発明の医薬品または医薬部外品は、例えば、ドリンク剤であり得る。
【０１８０】
本発明の医薬品および医薬部外品は、製造の任意の段階でアミロース粒子を添加すること以外は、その医薬品および医薬部外品の通常の原料から通常の手順で、通常の組成で製造され得る。本発明のアミロース粒子を医薬品または医薬部外品に添加するには特別な工程を必要とせず、医薬品および医薬部外品の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を医薬品の種類および性状に応じて選択する。本発明の医薬品および医薬部外品は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１８１】
本発明の医薬品および医薬部外品に含まれるアミロース粒子の含有量は、好ましくは約０．１重量％以上であり、より好ましくは約０．５重量％以上であり、さらに好ましくは約１重量％以上であり、特に好ましくは約５重量％以上であり、最も好ましくは約１０重量％以上である。この実施形態では、医薬品および医薬部外品に含まれるアミロース粒子の含有量は、好ましくは約１００重量％以下であり、より好ましくは約４０重量％以下であり、さらに好ましくは約３０重量％以下であり、特に好ましくは約２０重量％以下であり、最も好ましくは約１５重量％以下である。
【０１８２】
本発明の医薬品および医薬部外品は、糖尿病、耐糖能異常；胃腸障害、便秘、下痢などの便通異常、；肥満、高血圧、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、糖尿病脂肪肝、肝硬変などに悩む被験体に有効である。
【実施例】
【０１８３】
（実施例１−３〜１−５、比較例１−１、１−２、１−６〜１−８：酵素合成アミロース粒子の製造）
３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１７５ｍＭスクロース、および種々の濃度のマルトオリゴ糖混合物（株式会社林原商事製テトラップＨ（マルトテトラオース含有量７０％以上の液体）を１３３２０、９３３０、２１３０、１０７０、８００、５３０、２７０または１３ｍｇ／リットル）を含有する水溶液（１リットル）に、国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットに記載の方法に従って調製した馬鈴薯塊茎由来の精製グルカンホスホリラーゼおよび国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットに記載の方法に従って調製したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼをそれぞれ１単位／ｍｌになるように加えて反応溶液を得た。この反応溶液を３７℃で１６時間保温することによりアミロースを合成した。合成されたアミロースの濃度は比較例１−１、１−２、１−６、１−７、実施例１−３〜１−５では約２．８重量％であり、比較例１−８では約２．４重量％であった。この合成されたアミロースを含む反応溶液を４℃で一晩保持（静置）することにより、アミロース粒子を形成させた。この反応溶液は、約０．５時間で４℃まで液温が下がり、その温度で約１８時間保持された。この冷却後の反応溶液をろ過により固液分離して、アミロース粒子の沈澱物（ケーキ）を得た。得られたアミロース粒子の沈澱物を回収した後、さらに水に懸濁し、その後、固液分離してケーキを回収した。水懸濁とケーキ回収とを数回繰り返し、反応により副生したフルクトース濃度が０．１％以下になったところで最終的にケーキを回収した。このケーキをスプレードライによって乾燥しアミロース粒子を得た。
【０１８４】
アミロース粒子の重量平均分子量（Ｍｗ）をＭＡＬＬＳ法により決定した。アミロース粒子の分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）をＭＡＬＬＳ法により決定した。アミロース粒子の平均粒子径（μｍ）をレーザー回折粒度分布測定装置(ＳＡＬＤ−２２００、(株)島津製作所製)にて粒度分布を測定することにより決定した。比較例１−１、１−２、実施例１−３〜１−５、比較例１−６、１−７のアミロース粒子は水に分散し、比較例１−８のアミロース粒子はエタノールに分散してその懸濁液を超音波で５分間分散させた。比較例１−８のアミロース粒子をエタノールに分散させたのは、水を溶媒とするとアミロース粒子が溶解してしまい、粒度分布を測定できないからであった。分散させたサンプルは、アミロース粒子を分散させた溶媒（水またはエタノール）を循環させた上記レーザー回折粒度分布測定装置のセル中に加え、粒度分布を測定した。各結果を下記の表２に示す。
【０１８５】
【表２】
得られたアミロース粒子の分子量分布を特許文献４〜７に記載されるアミロースの分子量分布と比較して図１に示す。図１において、破線は特許文献４〜７にに記載される１０２〜１０４のアミロース（重量平均分子量（Ｍｗ）３，３６７、Ｍｗ／Ｍｎ１．４５）の分子量分布を示し、１は先行技術のアミロースの分子量に相当する比較例１−１の重量平均分子量５，０００のアミロース粒子、２は比較例１−２の重量平均分子量７，０００のアミロース粒子、３は実施例１−３の重量平均分子量１９，０００のアミロース粒子、４は実施例１−４の重量平均分子量２２，０００のアミロース粒子、５は実施例１−５の重量平均分子量３７，０００のアミロース粒子、６は比較例１−６の重量平均分子量６５，０００のアミロース粒子、７は比較例１−７の重量平均分子量１０２，０００のアミロース粒子、８は比較例１−８の重量平均分子量１１００，０００のアミロース粒子の分子量分布を示す。
【０１８６】
（評価例１：アミロース粒子のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における消化性試験）
酵素合成アミロースは、分子量分布が狭く、分岐のない構造が特徴であり、分子量により固有の物性を示す。その分子の大きさおよび状態によって体内での消化性が異なり、消化されてエネルギーになるものもあれば、消化されずに食物繊維としての機能を持つものもあると考えられる。そのため、本評価例では、重量平均分子量の異なるいくつかの酵素合成アミロース粒子のα-アミラーゼによる消化性を調べた。
【０１８７】
比較例１−１で調製した重量平均分子量５，０００（５ｋ）の酵素合成アミロース（これは、特許文献４〜７にに記載されるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する）、比較例１−２、実施例１−３〜１−５、比較例１−６〜比較例１−８で調製した重量平均分子量７，０００（７ｋ）、１９，０００（１９ｋ）、２２，０００（２２ｋ）、３７，０００（３７ｋ）、６５，０００（６５ｋ）、１０２，０００（１０２ｋ）、または１１００，０００（１，１００ｋ）の酵素合成アミロース粒子１０ｍｇを室温の水１０ｍｌに添加して混合し、さらにブタ膵臓α−アミラーゼ（３．２５Ｕ）を添加してサンプルとした。このサンプルを３７℃で２４時間インキュベートすることにより、α−アミラーゼをアミロース粒子に作用させた。重量平均分子量１１００，０００（１，１００ｋ）のアミロース粒子を用いた場合のサンプルは水溶液となった。重量平均分子量５，０００（５ｋ）、７，０００（７ｋ）、１９，０００（１９ｋ）、２２，０００（２２ｋ）、３７，０００（３７ｋ）、６５，０００（６５ｋ）および１０２，０００（１０２ｋ）のアミロース粒子を用いた場合のサンプルは懸濁液となった。インキュベート前（０時間）、インキュベートを始めてから０．５時間、１時間、１．５時間、２時間および２４時間の時点でサンプリングした。このサンプルを遠心分離することによりα−アミラーゼに未分解のアミロース粒子を沈殿として除去し、α−アミラーゼにより分解され生じた可溶性成分を得た。フェノール硫酸法によりこのα−アミラーゼの分解を受けた可溶性成分の全糖量を測定することにより、各重量平均分子量の酵素合成アミロー粒子のα−アミラーゼ消化性を調べた。その結果を図２に示す。
【０１８８】
α−アミラーゼによる消化性は、添加したアミロース量を１００％とした場合の各重量平均分子量のアミロースのα−アミラーゼによる分解率によって判断した。可溶性アミロース（１，１００ｋ）の水溶液は最も分解率が高く、９０％以上分解された。先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース粒子は２４時間α−アミラーゼを作用させると約４０％の分解率を示した。重量平均分子量７，０００（７ｋ）のアミロース粒子では約２０％、重量平均分子量６５，０００（６５ｋ）および１０２，０００（１０２ｋ）のアミロース粒子では３０〜４０％の分解率を示した。これに比べ、重量平均分子量１９，０００（１９ｋ）、２２，０００（２２ｋ）および３７，０００（３７ｋ）のアミロース粒子はα−アミラーゼを作用させて２時間程度はほぼ０％の分解率を示し、２４時間反応後も２〜３％の分解率であった。これは、重量平均分子量１９，０００（１９ｋ）、２２，０００（２２ｋ）および３７，０００（３７ｋ）のアミロース粒子がほぼ１００％のα−アミラーゼ抵抗性を有することを示す。
【０１８９】
これらの結果から、重量平均分子量１９，０００（１９ｋ）、２２，０００（２２ｋ）および３７，０００（３７ｋ）の酵素合成アミロース粒子は、従来から難消化性澱粉として知られているα−アミラーゼ耐性デンプンと異なり、アミラーゼ抵抗性がほぼ１００％の非消化性澱粉であることがわかった。
【０１９０】
（評価例２：血糖値上昇抑制試験）
８週齢のラット（Ｗｉｓｔｅｒ系）に、先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース粒子を熱水で溶解した水溶液、実施例１−４の重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子の懸濁液、比較例１−７の重量平均分子量１０２，０００（１０２ｋ）のアミロース粒子の懸濁液、グルコースの水溶液、または水を胃内ゾンデにて経口投与し、各時間経過後の血糖値の上昇パターンを比較した。投与量は体重１ｋｇあたりアミロース粒子５００ｍｇとした。投与前および投与３０、６０、９０、１２０分後にＡｖｅｎｔｉｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＬＣＣのグルコースパイロットを用いて酵素電極法にて血糖値を測定した。各試験群の検体数は９〜１３匹であった。
【０１９１】
結果を図３に示す。図３においては、投与前の血糖値と比較した血糖値の上昇値をプロットした。すなわち、各時点の血糖値の測定値から、投与前の血糖値の測定値を差し引いて得られる値をプロットした。グルコースを経口投与すると急激な血糖値の上昇が見られ、３０分後に最大値を示し、その後低下した。先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース水溶液を経口投与した場合も、グルコースを経口投与した場合と同様の経過を示した。一方、重量平均分子量１０２，０００（１０２ｋ）のアミロース粒子の懸濁液を経口投与した場合、ネガティブコントロールである水摂取と比べ６０分後に血糖値の上昇が見られたが、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子の懸濁液を経口投与した場合、ネガティブコントロールである水摂取と同様の経過を示し、血糖値上昇はほとんど見られなかった。
【０１９２】
一般に、経口投与された澱粉は膵液α−アミラーゼの作用で分解され、小腸まで運ばれ体内に吸収される。グルコースおよび先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース水溶液に比べて、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子は、膵液α−アミラーゼでほとんど分解されないため、小腸上皮細胞で吸収されず、血糖値は上昇しなかったと考えられる。一方、膵液α−アミラーゼで分解される重量平均分子量１０２，０００（１０２ｋ）のアミロース粒子は、血糖値が上昇した。
【０１９３】
以上の結果から、アミラーゼに完全な抵抗性を示す重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子には血糖値上昇を抑制する機能が認められた。
【０１９４】
（評価例３：糞便排泄量への影響）
消化酵素の影響を受けない食物繊維は、小腸で吸収されずそのまま大腸に運ばれ、ビフィズス菌など腸内細菌の活性化に利用され排泄される。評価例１から２２，０００（２２ｋ）の酵素合成アミロース粒子は消化酵素の影響を受けないことがわかった。そこで酵素合成アミロース粒子の食物繊維としての腸内環境改善効果を調べるため、糞便の排泄量を可溶性澱粉と比較した。
【０１９５】
８週齢のラット（Ｗｉｓｔｅｒ系）に、先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）もしくは２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子または可溶性澱粉（市販のコーンスターチ）を含む食餌を与えた。食餌中のアミロースまたはコーンスターチの量は１０重量％であった。ラットには食餌を１４日間自由に摂取させた。試験した食餌の原料の組成を以下の表４に示す。
【０１９６】
【表４】
食餌を与えてから１２日目〜１４日目までの２日間の乾燥糞便重量（ｇ）を測定した。各試験群の検体数は６匹であった。結果を図４に示す。乾燥糞便重量（ｇ）は、食餌を与えてから１２日目〜１４日目までの２日間の糞便を集め、乾燥による重量の減少がなくなるまで乾燥させた後、その重量を測定することにより決定された。
【０１９７】
重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース粒子を用いた場合、糞便量は、可溶性澱粉を用いた場合と同等であった。この結果、先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース粒子には、糞便排泄量を増やす効果がないことがわかった。
【０１９８】
他方、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子を用いた場合、可溶性澱粉または重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース粒子を用いた場合の約３倍の糞便量が排泄された。この結果から、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子は、糞便排泄量を増やす有意な効果があることがわかった。このことから、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子は便通作用など腸内環境改善の機能性を有することが示唆された。
【０１９９】
（評価例４：血漿中のトリグリセリド濃度低下試験）
食物繊維は、脂質の吸収抑制機能が期待されている。酵素合成アミロース粒子の脂質抑制機能を調べるため、食品脂質成分であるトリグリセリドの血中への取り込み量を測定した。
【０２００】
３週齢のＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットに、高脂肪食にセルロースを加えた飼料（高脂肪食）（ＨＦ）、または高脂肪食にセルロースの代わりに重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）（Ｈ３０ｋ）のアミロース粒子を添加した飼料（２２kアミロース添加食）を８週間与える長期飼育試験を行った。ラットには食餌を自由に摂取させた。使用した飼料の材料の組成を以下の表５に示す。各試験群の検体数は８匹であった。
【０２０１】
【表５】
８週間の飼育後にラットを解剖した。８週目解剖時の血漿トリグリセライド濃度を、トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬製）を用いて定量した。図５に示したように、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子を加えた飼料を摂取させた群の血漿トリグリセライド濃度は、アミロースの代わりにセルロースを加えた高脂肪食飼料を摂取させた群の約１／２であった。この結果から、非消化性のアミロース粒子を摂取することによる食餌中の脂質の吸収抑制効果が示唆された。
【０２０２】
（評価例５：アミロース粒子の平均粒子径および形状の影響）
重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロースを用いて、粒子径および形状が異なるアミロース粒子を調製し、アミロース粒子の消化性に及ぼす粒子径および形状の影響を調べた。
【０２０３】
評価例１で試験した８種類の酵素合成アミロースの中で最も消化性が低かった重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロースについて、アミロース粒子の粒子径および形状の影響を調べた。
【０２０４】
実施例１−４で調製した重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子０．５ｇを４０ｍｌの１Ｎ水酸化カリウムに完全に溶解した後、１Ｎ塩酸で中和し、１ｍｌのリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）を1ml加え、水で100mlに希釈し、アミロースを再結晶させた。
【０２０５】
このアミロース粒子を回収および洗浄し、次いで乾燥することにより、アミロース粒子を得た。得られたアミロース粒子の平均粒子径は６．７μｍであった。
【０２０６】
このアミロース粒子について、評価例１と同様の方法でインビトロの消化性を調べた。また、評価例２と同様の方法でインビボでの消化性を調べた。結果を図６および図７に示す。図７においては、投与前の血糖値と比較した血糖値の上昇値をプロットした。すなわち、各時点の血糖値の測定値から、投与前の血糖値の測定値を差し引いて得られる値をプロットした。
【０２０７】
その結果、再結晶により製造した粒子径の小さい重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子は、膵液α−アミラーゼにより約１０％分解された（図６）。また、再結晶により製造した粒子径の小さい重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子は、血糖値の上昇が見られた（図７）。このように同じ分子量のアミロースであってもその粒子径の違いにより、アミラーゼの消化性が異なることが明らかとなった。
【０２０８】
（実施例２：アミロース粒子を加えたアイスクリーム）
実施例１−４のアミロース粒子を含むアイスクリームを試作した。表６の配合で全原料をよく混合し、アイスクリームミックスをホモジナイザーで均質化する。８５℃３０秒加熱殺菌後、急速冷却した後５℃で一晩エイジングする。そのあとフリージングを行い、カップに充填して−２５℃で３日間保存した。本実施例のアミロース粒子を加えたアイスクリームにより、１日に必要とされる食物繊維摂取量のめやすの約６０％を摂取できる。
【０２０９】
【表６】
（実施例３：アミロース粒子を加えたヨーグルト飲料）
実施例１−４のアミロース粒子を含むドリンクヨーグルトを試作した。表７の配合で全原料をよく混合し、８５℃３０秒加熱殺菌後、冷却しホモジナイザーで均質化した。本実施例のアミロース粒子を加えたヨーグルトドリンクにより、１日に必要とされる食物繊維摂取量のめやすの約６０％を摂取できる。
【０２１０】
【表７】
（実施例４：アミロース粒子を加えたクッキー）
実施例１−４のアミロース粒子を含むクッキーを試作した。表８の配合で全原料を練りこみまとめたクッキー生地を４℃に１晩保存した後、平面にのばし型を抜き、１８０℃で１５分間焼き上げた。本実施例のアミロース粒子を加えたクッキーにより、１日に必要とされる食物繊維摂取量のめやすの約６０％を摂取できる。
【０２１１】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０２１２】
本発明のアミロース粒子、ならびにそれを含む食品素材、医薬品および医薬部外品素材、飲食品、および、医薬品および医薬部外品は、糖尿病、耐糖能異常；胃腸障害、便秘、下痢などの便通異常、；肥満、高血圧、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、糖尿病脂肪肝、肝硬変などに悩む被験体に有効である。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】図１は、各種の酵素合成アミロースの分子量分布を示すグラフである。
【図２】図２は、各重量平均分子量のアミロース粒子のブタ膵臓アミラーゼによるインビトロでの消化性試験の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）によるラットの血糖値の上昇値を示す折れ線グラフである。
【図４】図４は、乾燥糞便重量（ｇ）を示す棒グラフである。
【図５】図５は、高脂肪食を与えた場合および本発明のアミロース粒子を添加した高脂肪食（２２ｋアミロース添加食）を与えた場合の血漿トリグリセライド濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す棒グラフである。
【図６】図６は、同じ重量平均分子量のアミロースから製造された異なる平均粒子径のアミロース粒子のアミラーゼ分解率（％）を示す折れ線グラフである。
【図７】図７は、本発明のアミロース粒子（アミロース粒子（実施例１−４））、再結晶により製造した粒子径の小さいアミロース粒子（０．５％アミロース水酸化カリウム溶解）または水を投与した場合の血糖値の上昇を示す折れ線グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非消化性アミロース粒子、その製造方法、ならびにそれを含有する飲食品、医薬品および医薬部外品に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、澱粉は消化されやすい糖質と考えられているが、実際には消化酵素により分解されない成分を有している。この難消化性成分は、食物繊維としての機能を発揮していると考えられている。食物繊維機能の例としては、整腸作用、便通作用などの腸内環境改善効果、血糖値上昇抑制作用、コレステロール低下作用などが挙げられる。
【０００３】
このような背景のもと、難消化性成分の含量を高めた難消化性澱粉の開発が進められている。その結果、湿熱処理澱粉（特許文献１（特開平７−２５２３０１号公報）、特許文献２（特開平１０−１９５１０５号公報））、ハイアミロース澱粉（特許文献３（特開平１１−２５５８０２号公報））、アミロスクラーゼにより合成されたアミロース（特許文献４（特表２００２−５２０４２５号公報）、特許文献５（国際公開第００／０２９２６号パンフレット）、特許文献６（特表２００２−５３３１０７号公報）および特許文献７（国際公開第００／３８５３７号パンフレット））などが開発されている。
【０００４】
しかしながら、これまでに開発されたこれらの難消化性澱粉はいずれも難消化性成分が１００％ではなく、消化性成分を含んでいる。混入している消化性成分は、体内で容易に分解吸収され、血糖値の上昇をもたらす。そのため、食物繊維としての機能を相殺してしまうだけでなく、特に重度の糖尿病患者向けの飲食品などの場合には、使用が困難であるという問題がある。各特許文献に記載される発明の欠点について以下に詳細に説明する。
【０００５】
特許文献１（特開平７−２５２３０１号公報）に記載の発明は、アミロース含量が３０重量％以上の澱粉を原料として減圧した後蒸気加圧処理することにより難消化性成分を高めようとしたものである。しかしながら、この方法により得られた難消化性澱粉含有デキストリンの難消化性成分の含量が６０％程度であり、さらに、消化性成分である単糖および重合度（ＤＰ）２〜９のオリゴ糖を６．９％含有する。そのため、この難消化性澱粉を経口摂取すると、これらの消化性成分が体内で容易に分解吸収され、血糖値の上昇をもたらす。従って、この難消化性澱粉は、低カロリー飲食品としての効果が低い。また、この方法により得られた難消化性澱粉の平均分子量は２０００である。特許文献１は、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースについて、何の示唆も開示もしていない。
【０００６】
特許文献２（特開平１０−１９５１０５号公報）に記載の発明は、酸処理した天然の澱粉を１３０℃〜１４０℃で湿熱処理することにより難消化性成分を高めようとしたものである。具体的には、アミロース含量の高い（７０重量％以上）ハイアミロースコーンスターチを原料にし、湿熱処理を加えることで約６６％の食物繊維含量が得られている。特許文献２は、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースについて、何の示唆も開示もしていない。
【０００７】
特許文献３（特開平１１−２５５８０２号公報）に記載の発明は、アミロース含量が３０重量％以上の高アミロース澱粉を原料として、ＣＧＴａｓｅを作用させ、澱粉粒を保持した状態で澱粉成分の易溶出部分をシクロデキストリンに変換することにより難消化性成分を高めようとしたものである。難消化性成分は最高７７％得られている。しかし、本難消化性澱粉は、世界食品添加物専門会議で許容摂取量が制限（５mg／ｋｇ／日まで）されている食品添加物であるβ−ＣＤを含有している。そのため、この難消化性澱粉を食物繊維として多量に摂取するのは望ましくない。特許文献３は、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下の酵素合成アミロースについて、何の示唆も開示もしていない。
【０００８】
特許文献４（特表２００２−５２０４２５号公報）および特許文献５（国際公開第００／０２９２６号パンフレット）には、水不溶性の線状α−１，４−Ｄ−グルカンから得られるレジスタントスターチ（ＲＳ）が開示されている。特許文献４および５の請求項は非常に広範囲であるが、具体的に開示されているのは、１種類のレジスタントスターチのみである。このレジスタントスターチは、スクロースにアミロスクラーゼという酵素を作用させる方法により製造された、数平均分子量（Ｍｎ）２３２６、重量平均分子量（Ｍｗ）３３６７、分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）約１．４５の線状α−１，４−Ｄ−グルカンを出発原料とし、この線状α−１，４−Ｄ−グルカンの１０％水分散液を加熱しゲル化させた後冷却する処理（戻し凝集処理）を行うことにより製造されている。この方法により得られる生成物においては、ＲＳ含有量が７０〜８７％まで上昇している。特許文献４および５はさらに、線状α−１，４−Ｄ−グルカンの濃度を３０％に上昇させて同様の戻し凝集処理を行うことによる、ＲＳ含有量９３〜９４％の生成物の製造を記載している。
【０００９】
このように特許文献４および５は、アミロスクラーゼで製造される比較的低分子量のα−１，４−Ｄ−グルカンを、戻し凝集という特殊な処理を行い、ＲＳ含有量を最大９４％まで高めた生成物を開示している。しかしながら、ここではＲＳ含有量が１００％でないため、当然消化される成分が含まれている。従って、特許文献４および５はα−アミラーゼによる分解を実質的に受けないアミロース粒子を示唆も開示していない。特許文献４および５は、α−アミラーゼによる分解性がα−１，４−Ｄ−グルカンの分子量および分子量分散度に大きな影響を受けることを示唆も開示もしていない。特許文献４および５は、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けないアミロース粒子が、戻し凝集という処理を経なくても製造可能であることについて示唆も開示もしていない。
【００１０】
特許文献４および５は、その発明に使用可能なα−１，４−Ｄ−グルカンを、請求項では分子量が７５〜１０，０００，０００と非常に広く規定している。しかしながらこの記載は理解不可能である。下限の７５は、グルコースの分子量（１８０）より小さく、α−１，４−Ｄ−グルカンの分子量としてそもそも適切でない。さらにグルコース（分子量１８０）およびマルトオリゴ糖（分子量３６０〜１８００）は最も消化吸収に優れた糖質であり、これらが難消化性澱粉とは理解できない。さらに特許文献４および５の発明者らが、実施例で使用しているのは、アミロスクラーゼを利用して製造されるα−１，４−Ｄ−グルカンのみである。この方法についての説明は００３２〜００３４段落にあるが、この方法で製造されるα−１，４−Ｄ−グルカンの分子量は、実施例で開示のとおり、平均分子量で数千（数平均分子量２３２６、重量平均分子量３３６７）程度でしかない。さらにアミロスクラーゼを利用するα−１，４−Ｄ−グルカンの製造法では、原理的に分子量１万を超えるようなα−１，４−Ｄ−グルカンを合成することはできない。高分子量α−１，４−Ｄ−グルカンを作るためには、００３４段落に記載されているアクセプター分子のモル数が、スクロースのモル数に対して低い条件で反応させる必要がある。しかし００３４段落に記載されているとおり、アミロスクラーゼはスクロースを原料として自身の働きによってアクセプター分子を作り出すことが出来るため、そもそもアクセプター分子の濃度を低くコントロールすることはできない。また、この方法では分子量分散度を制御する手段もない。従って、特許文献４および５は、重量平均分子量が１２，０００以上のアミロースを実質的に記載していない。
【００１１】
特許文献６（特表２００２−５３３１０７号公報）および特許文献７（国際公開第００／３８５３７号パンフレット）は、水不溶性の線状α−１，４−Ｄ−グルカンおよび／またはそれから得られるレジスタントスターチ、および少なくとも一つの食品添加物または飼料添加物を含む組成物、および該組成物を使用して得られる食品と薬品について開示している。特許文献６および７は、最も好適に利用される線状α−１，４−Ｄ−グルカンは、重量平均分子量（Ｍｗ）２０００〜８０００（００３１段落）、分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）１．５〜１５（００３３段落）であると開示している。また、特許文献６および７は、重合度１０から３５の含有量が高い線状α−１，４−Ｄ−グルカンが好ましい（００３２段落）と開示している。また、当該水不溶性の線状α−１，４−Ｄ−グルカン具体的な製造法として、スクロースにアミロスクラーゼという酵素を作用させる方法を開示している（００４０〜００４２段落）。さらにこの線状α−１，４−Ｄ−グルカンに特許文献４（特表２００２−５２０４２５号公報）の方法を利用して製造されたレジスタントスターチが好適に利用できると開示している。また、水不溶性の線状α−１，４−Ｄ−グルカンおよび／またはそれから得られるレジスタントスターチは特に好ましくは平均直径が１μｍから５μｍの微粒子であることが好適であるとしている（００６３段落）。
【００１２】
特許文献６および７の請求項は非常に広範囲であるが、具体的に実施例で開示されているのは、数平均分子量（Ｍｎ）２３２６、重量平均分子量（Ｍｗ）３３６７、分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）約１．４５の線状α−１，４−Ｄ−グルカンを利用した場合である。そしてこの線状α−１，４−Ｄ−グルカンを特許文献４（特表２００２−５２０４２５号公報）に記載の方法（α−１，４−Ｄ−グルカンの水分散液を加熱しゲル化させた後冷却する、戻し凝集処理）に従い製造した生成物（ＲＳ含有量７０〜８７％）をさらに実施例で使用している。この生成物を含有するヨーグルトを人に摂取させる試験が行われた。特許文献６および７の表２の結果を以下の表１に抜粋する。
【００１３】
【表１】
レジスタントスターチ含有ヨーグルト摂取群（ＲＳビフィド後）は、レジスタントスターチなしヨーグルト摂取群（ＬＣ１後）と比較し、糞便中のビフィド菌の相対的含有量が増加（１０．３％→１３．９％）していることが開示されている。
【００１４】
他方、糞便量に関しては、ＲＳビフィド後においてプラスマイナス３５ｇという誤差を考慮すると、レジスタントスターチなしヨーグルトの摂取による糞便量の増加（１３７ｇ−１２５ｇ＝１２ｇ）とレジスタントスターチ含有ヨーグルト摂取による糞便量の増加（１４８ｇ−１２７ｇ＝２１ｇ）とは実質的に差がなく、このことは、レジスタントスターチの有無が糞便量に実質的に影響を与えないことを示している。この結果は、特許文献６および７のレジスタントスターチが大腸内で糞便量を増加させるほどの作用は発揮できていないことを示している。
【００１５】
このように、特許文献６および７は、大腸のビフィド菌を活性化するが、大腸内での食物繊維の役割である便通改善剤として作用しないレジスタントスターチを開示している。特許文献６および７は、消化される成分を含まない、つまり実質的にα−アミラーゼによる分解を受けないアミロース粒子の摂取についてもその効果についても示唆も開示もしていない。
【００１６】
逆に、上記特許文献６および７の表２から理解されるとおり、アミロースは大腸内で糞便量を増加させる食物繊維としての作用がないということが技術常識であった。
【００１７】
特許文献８（国際公開第２００２／０９７１０７号パンフレット）には、ＳＰ−ＧＰ法を利用したグルカンの製造法が記載されている。特許文献８には、不溶性アミロースには食物繊維と同様の働きが予測され、健康食品への利用も期待できることが記載されている。特許文献８は、種々の条件でグルカンを合成することを記載している。しかし、特許文献８は、グルカンの分子量が代表的には約８×１０３以上であり、好ましくは約１×１０４以上であると記載しているが、具体的な重量平均分子量については表１５に７１２ＫＤａまたは７１５ＫＤａと記載するだけであり、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００という低分子量のグルカンの有する特徴については記載していない。このような高分子量のグルカンは水溶性であり、非常に濃度を高くするかまたはエタノールなどの有機溶媒を用いなければ沈澱を形成しない。特許文献８では、限外濾過を行って精製しているが、これは、グルカンが溶解していることを示す。特許文献８はまた、アミロースを冷却することによりアミロース粒子が形成されることを記載していない。
【００１８】
特許文献９（特開２００４−３１５４８１号公報）は、重量平均分子量約１万のアミロースおよび３万のアミロースを開示する。特許文献９は、種々の分子量のα−１，４グルカンを合成し、その中で重量平均分子量約１万または３万の低分子のα−１，４グルカンは沈殿を形成し、水不溶性であることを記載している。しかし、特許文献９は、１２，０００〜５５，０００という低分子量のグルカンの有する特性については記載していない。特許文献９では、１０６ｍＭのスクロースを用いてアミロースを合成している。特許文献９の条件で合成されるアミロース濃度は約１．６重量％程度である。特許文献９には、「１６時間保温し、反応終了後、生成したα−１，４−グルカンの収率（％）、重量平均分子量（Ｍｗ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を決定した」と記載されている。すなわち、特許文献９では、冷却を行っていないし、反応終了後、すぐに測定を行っている。アミロース粒子の大きさに影響を与えるのは、アミロース濃度、冷却温度、冷却時間、冷却時の攪拌の有無などである。特許文献９に記載されるアミロース濃度で、冷却を行わずに、短時間で形成されるアミロース粒子の平均粒子径は、非常に小さい。本願明細書の評価例５に記載するように、同じ分子量のアミロースから形成されるアミロース粒子であっても、平均粒子径が小さいと消化性が高い。このように、特許文献９に記載される沈澱は、消化性の高いものである。特許文献９はまた、アミロースを冷却することにより食物繊維として作用するアミロース粒子が形成されることを記載していない。
【００１９】
特許文献１０（国際公開第２００５／０１００９３号パンフレット）は、重量平均分子量約３万のα−１，４−グルカンを開示する。特許文献１０は、生成したα−１，４−グルカンが低分子量である場合は生成物が反応液中で沈澱すること、および沈澱／可溶化の境界が一般に分子量約１００ｋＤａ（すなわち、約１０万Ｄａ）程度であることを記載している。しかし、特許文献１０は、１２，０００〜５５，０００という低分子量のグルカンの有する特性については記載していない。特許文献１０では、１０６ｍＭのスクロースを用いてアミロースを合成している。特許文献１０の条件で合成されるアミロース濃度は約１．６重量％程度である。特許文献１０には、「１６時間保温し、反応終了後、生成したα−１，４−グルカンの収率（％）、重量平均分子量（Ｍｗ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を決定した」と記載されている。すなわち、特許文献１０では、冷却を行っていないし、反応終了後、すぐに測定を行っている。特許文献１０に記載されるアミロース濃度で、冷却を行わずに、短時間で形成されるアミロース粒子の平均粒子径は、非常に小さい。そのため、特許文献１０に記載される沈澱は、消化性の高いものである。特許文献１０はまた、アミロースを冷却することにより食物繊維として作用するアミロース粒子が形成されることを記載していない。
【００２０】
特許文献１１（国際公開第２００５／０５０１８６７８号パンフレット）は、重量平均分子量約１万、３万のα−１，４−グルカンを開示する。特許文献１１は、種々の分子量のα−１，４グルカンを合成し、その中で重量平均分子量約１万および３万の低分子のα−１，４グルカンは沈殿を形成し、水不溶性であることを記載している。特許文献１１は、生成したα−１，４−グルカンが低分子量である場合は生成物が反応液中で沈澱すること、および分子量約２００ｋＤａ（すなわち、約２０万Ｄａ）未満では沈澱し、その結晶形が老化型および非晶質であることを記載している。しかし、特許文献１１は、１２，０００〜５５，０００という低分子量のグルカンの有する特性については記載していない。特許文献１１では、１０６ｍＭのスクロースを用いてアミロースを合成している。特許文献１１の条件で合成されるアミロース濃度は約１．６重量％程度である。特許文献１１には、「１６時間保温し、反応終了後、生成したα−１，４−グルカンの収率（％）、重量平均分子量（Ｍｗ）および分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）を決定した」と記載されている。すなわち、特許文献１１では、冷却を行っていないし、反応終了後、すぐに測定を行っている。特許文献１１に記載されるアミロース濃度で、冷却を行わずに、短時間で形成されるアミロース粒子の平均粒子径は、非常に小さい。そのため、特許文献１１に記載される沈澱は、消化性の高いものである。特許文献１１はまた、アミロースを冷却することにより食物繊維として作用するアミロース粒子が形成されることを記載していない。
【特許文献１】特開平７−２５２３０１号公報
【特許文献２】特開平１０−１９５１０５号公報
【特許文献３】特開平１１−２５５８０２号公報
【特許文献４】特表２００２−５２０４２５号公報
【特許文献５】国際公開第００／０２９２６号パンフレット
【特許文献６】特表２００２−５３３１０７号公報
【特許文献７】国際公開第００／３８５３７号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００２／０９７１０７号パンフレット
【特許文献９】特開２００４−３１５４８１号公報
【特許文献１０】国際公開第２００５／０１００９３号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第２００５／０５０１８６７８号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、実質的にα−アミラーゼによる分解を受けないアミロース粒子を提供すること、およびその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、アミロースの消化性には非常に大きな重合度依存性があることを見出し、さらに詳細に研究を行ったところ、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースから実質的になるアミロース粒子は、インビトロのα−アミラーゼ消化試験では、実質的に分解を受けず、かつ経口投与しても血糖上昇をもたらさない性質を有していることを見出し、本発明を完成させた。さらに本発明のアミロース粒子を経口摂取した場合、糞便量の顕著な上昇が見られ、食物繊維としての機能が強く発現していることを確認した。
【００２３】
このように本発明は、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない特徴を有するアミロース粒子という新規飲食品原料、医薬品素材および医薬部外品素材を初めて提供するものであり、さらにはその機能を生かした飲食品および医薬品および医薬部外品の開発を可能とするものである。
【００２４】
上記目的を達成するために、本発明は、例えば、以下の手段を提供する：
（項目１）
重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースからなるアミロース粒子であって、かつ、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない、アミロース粒子。
【００２５】
（項目２）
前記アミロースの重量平均分子量が１５，０００〜４５，０００である、項目１に記載のアミロース粒子。
【００２６】
（項目３）
前記アミロースの重量平均分子量が１８，０００〜４０，０００である、項目１に記載のアミロース粒子。
【００２７】
（項目４）
平均粒子径が１０マイクロメートル以上１０００マイクロメートル以下である、項目１に記載のアミロース粒子。
【００２８】
（項目５）
血糖値上昇抑制用の飲食品素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【００２９】
（項目６）
糞便量を増大させるための飲食品素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【００３０】
（項目７）
脂質の吸収を抑制させるための飲食品素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【００３１】
（項目８）
血糖値上昇抑制用の医薬品または医薬部外品の素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【００３２】
（項目９）
糞便量を増大させるための医薬品または医薬部外品の素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【００３３】
（項目１０）
脂質の吸収を抑制させるための医薬品または医薬部外品の素材であって、項目１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【００３４】
（項目１１）
重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下の酵素合成アミロースから実質的になるアミロース粒子の製造方法であって、該方法は、
グルカンホスホリラーゼの酵素反応により、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；
該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；
該アミロース粒子を回収する工程；
を包含する、方法。
【００３５】
（項目１２）
前記プライマーが、マルトオリゴ糖である、項目１１に記載の方法。
【００３６】
（項目１３）
前記アミロース粒子が、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない、項目１１に記載の方法。
【００３７】
（項目１４）
前記冷却が、前記アミロース粒子の平均粒子径が１０マイクロメートル以上１０００マイクロメートル以下となる冷却条件で行われる、項目１１に記載の方法。
【００３８】
（項目１５）
前記アミロース粒子を水で洗浄する工程をさらに包含する、項目１１に記載の方法。
【００３９】
（項目１６）
項目１に記載のアミロース粒子を含有する飲食品。
【００４０】
（項目１７）
項目１に記載のアミロース粒子を含有する医薬品または医薬部外品。
【発明の効果】
【００４１】
本発明のアミロース粒子は、これまで公開されてきた難消化性澱粉およびアミロースとは、その成分が異なり、またその製造方法が異なっており、従来技術に対し新規性を有している。
【００４２】
さらに本発明のアミロース粒子は、実質的に非消化性成分のみからなり、消化される成分を実質的に有していない。ここに従来技術からの進歩性が認められる。さらに今回のアミロース粒子は消化される成分を実質的に有していないため、経口摂取しても、血糖値を実質的に上昇させないという優位性を有している。さらに今回のアミロース粒子は消化される成分を実質的に有していないため、他の難消化性澱粉よりも優れた糞便増加機能を有しており、ここにも進歩性が認められる。
【００４３】
特に実質的に非消化性成分のみからなり、消化される成分を実質的に有していないアミロース粒子を提供することの価値は以下にあると思われる。
【００４４】
食物繊維は、ヒトの消化酵素で分解されず、整腸作用、便通作用など腸内環境改善効果、血糖値上昇抑制作用、コレステロール低下作用がある。特にセルロースはヒトの消化酵素でまったく分解されない。一方、従来公知の難消化性澱粉はわずかであるがヒトの消化酵素により分解され代謝される。そのため血中のグルコース濃度の上昇をもたらす。難消化性澱粉を便通改善など腸内環境改善効果を期待した飲食品に利用する場合、その効果を発揮するために難消化性澱粉の多量の添加が必要となり、代謝される糖質含量も増える。その結果、血中のグルコース濃度の上昇につながる。例えば、食物繊維を糖尿病患者向けの低カロリー飲食品に利用する場合、エネルギー摂取量および血中に取り込まれるグルコース量の影響は大きく、特に重度の糖尿病患者にとって食物繊維中の微量の消化成分は無視できない。本発明の消化される部分を有していないアミロース粒子の効果は飲食品産業にとって、医薬品産業にとって、また、医薬部外品産業にとって、非常に重要である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４６】
（１．アミロース粒子）
本発明のアミロース粒子は、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない。本明細書中で用語「α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない」とは、アミロース粒子１０ｍｇを水１０ｍｌに懸濁した試料にブタ膵臓α−アミラーゼ（３．２５Ｕ）を３７℃にて２時間作用させた場合のアミロース粒子の残存率が９５％以上であることをいう。この場合のアミロース粒子の残存率は好ましくは約９５．５％以上であり、より好ましくは約９６％以上であり、さらに好ましくは約９７％以上であり、一層好ましくは約９８％以上であり、特に好ましくは約９９％以上であり、最も好ましくは１００％である。上限は特にないが、例えば、１００％以下のものを使用可能である。本発明のアミロース粒子は、アミロース粒子１０ｍｇを水１０ｍｌに懸濁した試料にブタ膵臓α−アミラーゼ（３．２５Ｕ）を３７℃にて約２時間以上作用させた場合のアミロース粒子の残存率が９５％以上であることが好ましい。本発明のアミロース粒子は、作用時間が好ましくは約３時間以上、より好ましくは約４時間以上、さらに好ましくは約５時間以上である場合に９５％以上の残存率を示すことが好ましい。なお、本明細書中では、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けないことを、「アミラーゼ抵抗性がある」または「アミラーゼ抵抗性がほぼ１００％である」ともいう。
【００４７】
本発明のアミロース粒子は、実質的にアミロースからなる。本明細書中では用語「実質的にアミロースからなる」とは、アミロースが約９５重量％以上を占めることをいう。アミロース粒子中のアミロースの含有量は、好ましくは約９５．５重量％以上であり、より好ましくは約９６重量％以上であり、さらに好ましくは約９７重量％以上であり、一層好ましくは約９８重量％以上であり、特に好ましくは約９９重量％以上であり、最も好ましくは約１００％である。
【００４８】
本明細書中で用語「アミロース」とは、α−１，４−グルコシド結合によって連結された２以上のＤ−グルコース単位から構成される直鎖状の糖をいう。
【００４９】
本発明のアミロース粒子に含まれるアミロースの重量平均分子量は、約１２，０００以上であり、より好ましくは約１３，０００以上であり、さらに好ましくは約１５，０００以上であり、一層好ましくは約１７，０００以上であり、特に好ましくは約１８，０００以上であり、最も好ましくは約１９，０００以上である。本発明のアミロース粒子に含まれるアミロースの重量平均分子量は、約５５，０００以下であり、より好ましくは約５４，０００以下であり、さらに好ましくは約５３，０００以下であり、さらにより好ましくは約５２，０００以下であり、一層好ましくは約５０，０００以下であり、さらに一層好ましくは約４５，０００以下であり、特に好ましくは約４０，０００以下であり、最も好ましくは約３７，０００以下である。
【００５０】
本発明のアミロース粒子に含まれるアミロースの分子量分散度は、１．２５以下である。本明細書中では、分子量分散度とは、重量平均分子量（Ｍｗ）／数平均分子量（Ｍｎ）をいう。本明細書中では、分子量分散度を「分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）」と記載する場合もある。分子量分散度は、好ましくは１．２４以下であり、より好ましくは１．２３以下であり、さらに好ましくは１．２以下であり、いっそう好ましくは１．１５以下であり、特に好ましくは１．１以下である。
【００５１】
アミロースのような高分子は、一般に均一な分子ではなく、種々の大きさの分子の混合物であるため、その分子量は数平均分子量（Ｍｎ）もしくは重量平均分子量（Ｍｗ）で評価する。Ｍｎは、その系の全質量を、その系に含まれる分子の個数で割ったものである。すなわち数分率による平均である。一方、Ｍｗは重量分率による平均である。完全に均一な物質であれば、Ｍｗ＝Ｍｎとなるが、高分子は一般に分子量分布を有するためＭｗ＞Ｍｎとなる。したがって、Ｍｗ／Ｍｎが１に近いほど、分子量の均一度が大きい（分子量分布が狭い）ということになる。一般的に高分子物質は、分子量により性質が異なるため、分子量分布の大きな高分子はさまざまな性質をもったものの混合物となる。このため、特定の機能を発揮させたいときには、分子量分布の狭いものが好適に利用される。
【００５２】
Ｍｎは、分子の個数を評価することにより、決定できる。すなわち、アミロースなどにおいては、還元性末端数を測定することにより決定できる。還元性末端数の測定は、例えばＴａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９６．１７８：ｐ．１６００−１６０６に記載されるＭｏｄｉｆｉｅｄ Ｐａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ法により決定できる。また、Ｍｎは、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載される示差屈折計と多角度光散乱検出器とを併用したゲルろ過クロマトグラフィー（ＭＡＬＬＳ法）によっても、決定できる。Ｍｗは、Ｔａｋａｔａ，Ｈ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｇｌｙｃｏｓｃｉ．，２００３．５０：ｐ．１５−２０に記載されるＭＡＬＬＳ法によって決定できる。
【００５３】
本発明のアミロース粒子の平均粒子径は、好ましくは約１０マイクロメートル以上であり、より好ましくは約２０マイクロメートル以上であり、さらに好ましくは約３０マイクロメートル以上であり、特に好ましくは約４０マイクロメートル以上であり、最も好ましくは約５０マイクロメートル以上である。本発明のアミロース粒子の平均粒子径は、好ましくは約１０００マイクロメートル以下であり、より好ましくは約５００マイクロメートル以下であり、さらに好ましくは約４００マイクロメートル以下であり、さらにより好ましくは約３００マイクロメートル以下であり、特に好ましくは約２００マイクロメートル以下であり、最も好ましくは約１００マイクロメートル以下である。本明細書中の「平均粒子径」とは、数平均粒子径であり、数平均粒子径は、島津レーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−２２００、（株）島津製作所製）によって測定され得る。
【００５４】
（２．アミロース粒子の製造方法）
本発明のアミロース粒子は、グルカンホスホリラーゼの酵素反応により、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；および該アミロース粒子を回収する工程により製造される。より具体的には、グルカンホスホリラーゼの酵素反応の方法としては、グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）とスクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）とを併用してスクロースに作用させる方法（ＳＰ-ＧＰ法という）、グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）を単独でグルコース−１−リン酸に作用させる方法（ＧＰ法）、グルカンホスホリラーゼ（ＧＰ）とβ−１，４−グルカンホスホリラーゼ（ＣＰ）とを併用してβ−１，４−グルカンに作用させる方法（ＣＰ-ＧＰ法）の三種類の方法が可能である。このような、グルカンホスホリラーゼを利用して製造されるアミロースは、酵素合成アミロースとも呼ばれる。
【００５５】
ＳＰ−ＧＰ法による本発明のアミロース粒子は、スクロース、無機リン酸もしくはグルコース−１−リン酸、プライマー、スクロースホスホリラーゼ、グルカンホスホリラーゼおよび水を含有する反応液をインキュベートして、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；および該アミロース粒子を回収する工程を包含する。
【００５６】
ＧＰ法による本発明のアミロース粒子は、グルコース−１−リン酸、プライマー、グルカンホスホリラーゼおよび水を含有する反応液をインキュベートして、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；および該アミロース粒子を回収する工程により製造される。
【００５７】
ＣＰ−ＧＰ法による本発明のアミロース粒子は、β−１，４−グルカン、無機リン酸もしくはグルコース−１−リン酸、プライマー、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、グルカンホスホリラーゼおよび水を含有する反応液をインキュベートして、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；および該アミロース粒子を回収する工程により製造される。
【００５８】
本発明の製造方法を用いた場合、戻り凝集などの複雑な工程を行う必要がない。
【００５９】
（２．１ 材料）
本発明の製造方法では、例えば、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカン、スクロースホスホリラーゼ、グルカンホスホリラーゼ、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびそれを溶かしている溶媒である水を主な材料として用いる。これらの材料は通常、反応開始時に全て添加されるが、反応の途中でこれらのうちの任意の材料を追加して添加してもよい。
【００６０】
（２．１．１ スクロース）
スクロースは、Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１で示される、分子量約３４２の二糖である。スクロースは、光合成能を有するあらゆる植物中に存在する。スクロースは、植物から単離されてもよいし、化学的に合成されてもよい。コストの面からみて、スクロースを植物から単離することが好ましい。スクロースを多量に含む植物の例としては、サトウキビ、サトウダイコンなどが挙げられる。サトウキビは、汁液中に約２０％のスクロースを含む。サトウダイコンは、汁液中に約１０〜１５％のスクロースを含む。スクロースは、スクロースを含む植物の汁液から精製糖に至るいずれの精製段階のものとして提供されてもよい。
【００６１】
本発明の方法で使用されるスクロースは、純粋なものであることが好ましい。しかし、本発明のスクロースの効果を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んでいてもよい。
【００６２】
溶液中に含まれるスクロースの濃度は、代表的には約５〜１００％、好ましくは約８〜８０％、より好ましくは約８〜５０％である。なお、本明細書中でスクロースの濃度は、Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅで、すなわち、
（スクロースの重量）×１００／（溶液の容量）
で計算する。スクロースの重量が多すぎると、反応中に未反応のスクロースが析出する場合がある。スクロースの使用量が少なすぎると、高温での反応において収率が低下する場合がある。
【００６３】
（２．１．２ 無機リン酸もしくはグルコース−１−リン酸）
本明細書中において、無機リン酸とは、スクロースホスホリラーゼの反応においてリン酸基質を供与し得る物質をいう。ここでリン酸基質とは、グルコース−１−リン酸のリン酸部分（ｍｏｉｅｔｙ）の原料となる物質をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒されるスクロース加リン酸分解において、無機リン酸はリン酸イオンの形態で基質として作用していると考えられる。当該分野ではこの基質を慣習的に無機リン酸というので、本明細書中でも、この基質を無機リン酸という。無機リン酸には、リン酸およびリン酸の無機塩が含まれる。通常、無機リン酸は、アルカリ金属イオンなどの陽イオンを含む水中で使用される。この場合、リン酸とリン酸塩とリン酸イオンとは平衡状態になるので、リン酸とリン酸塩とは区別をしにくい。従って、便宜上、リン酸とリン酸塩とを合わせて無機リン酸という。無機リン酸は、反応開始時の反応溶液中に１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されてもよい。
【００６４】
無機リン酸は、例えば、ポリリン酸（例えば、ピロリン酸、三リン酸および四リン酸）のようなリン酸縮合体またはその塩を、物理的、化学的または酵素反応などによって分解したものを反応溶液に添加することによって提供され得る。
【００６５】
本明細書において、グルコース−１−リン酸とは、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩をいう。グルコース−１−リン酸は好ましくは、狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意の金属塩であり、より好ましくはグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）の任意のアルカリ金属塩である。グルコース−１−リン酸の好ましい具体例としては、グルコース−１−リン酸二ナトリウム、グルコース−１−リン酸二カリウム、グルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）、などが挙げられる。本明細書において、括弧書きで化学式を書いていないグルコース−１−リン酸は、広義のグルコース−１−リン酸、すなわち狭義のグルコース−１−リン酸（Ｃ６Ｈ１３Ｏ９Ｐ）およびその塩を示す。
【００６６】
グルコース−１−リン酸は反応開始時の反応溶液中に、１種類のみ含有されてもよく、複数種類含有されていてもよい。
【００６７】
反応溶液中に含まれる無機リン酸のモル濃度とグルコース−１−リン酸のモル濃度との合計は、代表的には約１ｍＭ〜約１０００ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、より好ましくは約２０ｍＭ〜約２５０ｍＭである。無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の量が多すぎると、アミロースの収率が低下する場合がある。使用量が少なすぎると、アミロースの合成に時間がかかる場合がある。
【００６８】
反応溶液中の無機リン酸の含有量は、国際公開第０２／０９７１０７号パンフレットの１．４に記載の方法によって定量され得る。反応溶液中のグルコース−１−リン酸の含有量は、国際公開第０２／０９７１０７号パンフレットの１．３に記載の方法によって定量され得る。反応に関与しないリン含有物質を使わない場合、そのような場合は原子吸光法によって無機リン酸およびグルコース−１−リン酸の合計含有量を測定してもよい。
【００６９】
（２．１．３ プライマー）
本発明の方法で用いられるプライマーは、本発明で使用されるアミロースの合成において出発物質として作用する分子をいう。プライマーは、α−１，４−グルコシド結合で糖単位が結合できる遊離部分を１個以上有すれば、他の部分は糖以外の部分によって形成されていてもよい。本発明の方法では、プライマーに対して糖単位がα−１，４−グルコシド結合で順次結合されて、アミロースが合成される。プライマーとしては、グルカンホスホリラーゼによって糖単位が付加され得る任意の糖が挙げられる。本発明で用いられるプライマーは、α−１，４−グルコシド結合のみを含むα−１，４−グルカンであることが好ましい。
【００７０】
プライマーの例としては、低分子量アミロースが挙げられる。
【００７１】
本明細書中でプライマーに用いられる、用語「低分子量アミロース」とは、重合度が５０以下のアミロースをいう。本発明で用いられる低分子量アミロースの重合度は、好ましくは約２以上であり、より好ましくは約３以上であり、さらに好ましくは約４以上である。本発明で用いられる低分子量アミロースの重合度は、好ましくは約５０以下であり、より好ましくは約４０以下であり、さらに好ましくは約３０以下であり、一層好ましくは約３０以下であり、特に好ましくは約２０以下であり、最も好ましくは約１０以下である。低分子量アミロースのうち、重合度が２以上１０以下のものは特に、マルトオリゴ糖ともいう。
【００７２】
本明細書中では、用語「マルトオリゴ糖」とは、２〜１０個のグルコースが脱水縮合して生じた物質であって、α−１，４結合によって連結された物質をいう。マルトオリゴ糖の重合度は、好ましくは約４以上であり、より好ましくは約５以上であり、さらに好ましくは約７以上である。マルトオリゴ糖の重合度は、好ましくは約１０以下であり、より好ましくは約９以下であり、さらに好ましくは約８以下である。
【００７３】
マルトオリゴ糖の例としては、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、マルトオクタオース、マルトノナオース、マルトデカオースなどのマルトオリゴ糖が挙げられる。マルトオリゴ糖は、好ましくはマルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオースまたはマルトヘプタオースである。
【００７４】
プライマーは１種類の化合物であっても、複数の化合物の混合物であってもよい。コストが低いため、マルトオリゴ糖の混合物をプライマーとして使用することが好ましい。
【００７５】
合成されるアミロースの重合度は、使用されるプライマーの重合度、およびプライマーのモル濃度と基質のモル濃度との比率によって決定される。ここでいう基質とは、ＳＰ-ＧＰ法ではスクロース、ＧＰ法ではグルコース−１−リン酸、ＣＰ-ＧＰ法ではβ−１，４−グルカンのことである。使用されるプライマーの重合度が同じであれば、基質のモル濃度に対するプライマーのモル濃度が多くなるほど、得られるアミロースの重合度は小さくなる。
【００７６】
好ましい実施形態では、本発明の方法においては、重合度２〜１０のマルトオリゴ糖をプライマーとして使用する場合、基質のモル濃度を１００としたときのプライマーのモル濃度は、好ましくは約０．４５以上であり、より好ましくは約０．５以上であり、さらに好ましくは約０．５５以上であり、さらにより好ましくは約０．６以上であり、特に好ましくは約０．６５以上であり、最も好ましくは約０．７以上である。本発明の方法においては、重合度２〜１０のマルトオリゴ糖をプライマーとして使用する場合、基質のモル濃度を１００としたときのプライマーのモル濃度は、好ましくは約４．５以下であり、より好ましくは約４以下であり、さらに好ましくは約３．５以下であり、さらに好ましくは約３以下であり、さらにより好ましくは約２．５以下であり、特に好ましくは約２．２以下であり、最も好ましくは約２．０以下である。
【００７７】
（２．１．４ β−１，４−グルカン）
本明細書中では「β−１，４−グルカン」とは、Ｄ−グルコースを構成単位とする糖であって、β−１，４−グルコシド結合によって連結された糖単位を少なくとも２糖単位以上有する糖をいう。β−１，４−グルカンは、直鎖状の分子であり得る。直鎖状β−グルカンとβ−１，４−グルカンとセルロースとは同義語である。直鎖状β−グルカンでは、β−１，４−グルコシド結合によってのみ糖単位の間が連結されている。１分子のβ−１，４−グルカンに含まれる糖単位の数を、このβ−１，４−グルカンの重合度という。β−１，４−グルカンの重合度は、好ましくは、約２〜約１０であり、より好ましくは約２〜約８であり、より好ましくは約２〜約５である。重合度が約２〜約１０のβ−１，４−グルカンを、セロオリゴ糖ともいう。重合度が２のβ−１，４−グルカンを特に、セロビオースという。重合度が３のβ−１，４−グルカンをセロトリオースという。重合度が４のβ−１，４−グルカンをセロテトラオースという。β−１，４−グルカンの重合度が低いほど溶解度が高く、取り扱いが容易であるので、重合度の低いβ−１，４−グルカンがより好ましい。β−１，４−グルカンは、あらゆる植物中に存在する。β−１，４−グルカンは、植物から単離されたまま未改変のものであってもよく、植物から単離したものを化学的または酵素的に処理することによって得られたものであってもよい。β−１，４−グルカンはまた、古紙、建材、古布などの廃棄物から再生されるセルロースまたはそれから調製されたものであってもよい。例えば、植物から単離した高分子量のセルロースに対してセルラーゼを作用させることによって、より低分子量のセロオリゴ糖が得られる。植物からセロオリゴ糖を大量に生産する方法は当該分野で公知である。このような文献の例としては、特開２００１−９５５９４号公報が挙げられる。β−１，４−グルカンは、β−１，４−グルカンを含む植物破砕液から精製β−１，４−グルカンに至るいずれの生成段階のものとして提供されてもよい。本発明の方法で使用されるβ−１，４−グルカンは、純粋なものであることが好ましい。しかし、本発明で用いる酵素の作用を阻害しない限り、任意の他の夾雑物を含んでいてもよい。
【００７８】
溶液中に含まれるβ−１，４−グルカンの濃度は、代表的には約０．１％〜約４０％であり、好ましくは約０．５％〜約３０％であり、より好ましくは約１％〜約２０％であり、特に好ましくは約２％〜約１５％であり、最も好ましくは約３％〜約１２％である。なお、本明細書中でβ−１，４−グルカンの濃度は、Ｗｅｉｇｈｔ／Ｖｏｌｕｍｅで、すなわち、
（β−１，４−グルカンの重量）×１００／（溶液の容量）
で計算する。β−１，４−グルカンの重量が多すぎると、溶液中に未反応のβ−１，４−アミロースが析出する場合がある。β−１，４−グルカンの使用量が少なすぎると、高温での反応において、反応自体は起こるものの、収率が低下する場合がある。
【００７９】
（２．１．５ スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ．２．４．１．７））
本明細書中では、「スクロースホスホリラーゼ」とは、スクロースのα−グリコシル基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。スクロースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【００８０】
【化１】
スクロースホスホリラーゼは、自然界では種々の生物に含まれる。スクロースホスホリラーゼを産生する生物の例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属する細菌（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ）、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．、Ｐｕｌｌｕｌａｒｉａ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｉｎｕｍ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ｍｏｎｉｌｉａ ｓｉｔｏｐｈｉｌａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｅａ ｅｓｃｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、およびＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
スクロースホスホリラーゼは、スクロースホスホリラーゼを産生する任意の生物由来であり得る。スクロースホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、単独で存在する場合の耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、スクロースホスホリラーゼを４％のスクロース存在下で５５℃にて３０分間加熱した場合に加熱前のスクロースホスホリラーゼの活性の５０％以上の活性を保持するものであることが好ましい。スクロースホスホリラーゼは、好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属の細菌由来であり、さらに好ましくはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓ由来である。
【００８２】
本明細書中では、酵素がある生物に「由来する」とは、その生物から直接単離したことのみを意味するのではなく、その生物を何らかの形で利用することによりその酵素が得られることをいう。例えば、その生物から入手したその酵素をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、その大腸菌から酵素を単離する場合も、その酵素はその生物に「由来する」という。
【００８３】
本発明で用いられるスクロースホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、スクロースホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。本発明で用いられるスクロースホスホリラーゼは、上記の生物から単離したスクロースホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【００８４】
このようなスクロースホスホリラーゼは、当該分野で公知の方法によって調製され得る。例えば、国際公開第０２／０９７１０７号パンフレットに記載される方法によって調製され得る。
【００８５】
スクロースホスホリラーゼは、未精製のものであっても精製されたものであってもよいが、好ましくはある程度精製されたものである。
【００８６】
本発明の方法において反応開始時の溶液中に含まれるスクロースホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約０．０５Ｕ／ｇスクロース以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｇスクロース以上であり、さらに好ましくは約０．５Ｕ／ｇスクロース以上であり、特に好ましくは約１Ｕ／ｇスクロース以上であり、最も好ましくは約１０Ｕ／ｇスクロース以上である。本発明の方法において反応開始時の溶液中に含まれるスクロースホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約１０００Ｕ／ｇスクロース以下であり、より好ましくは約５００Ｕ／ｇスクロース以下であり、さらに好ましくは約３００Ｕ／ｇスクロース以下であり、特に好ましくは約１００Ｕ／ｇスクロース以下であり、最も好ましくは約５０Ｕ／ｇスクロース以下である。スクロースホスホリラーゼの重量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、アミロースの収率が低下する場合がある。
【００８７】
スクロースホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。スクロースホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。スクロースホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。
【００８８】
（２．１．６ グルカンホスホリラーゼ（ＥＣ．２．４．１．１））
グルカンホスホリラーゼとは、α−１，４−グルカンの加リン酸分解を触媒する酵素の総称であり、ホスホリラーゼ、スターチホスホリラーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、マルトデキストリンホスホリラーゼなどと呼ばれる場合もある。グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるα−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存する。生体内では、無機リン酸の量が多いので、グルカンホスホリラーゼは加リン酸分解の方向に反応が進む。本発明の方法では、無機リン酸は、スクロースの加リン酸分解に使われ、反応溶液中に含まれる無機リン酸の量が少ないので、α−１，４−グルカンの合成の方向に反応が進む。
【００８９】
グルカンホスホリラーゼは、デンプンまたはグリコーゲンを貯蔵し得る種々の植物、動物および微生物中に普遍的に存在すると考えられる。
【００９０】
グルカンホスホリラーゼを産生する植物の例としては、藻類、ジャガイモ（馬鈴薯ともいう）、サツマイモ（甘藷ともいう）、ヤマイモ、サトイモ、キャッサバなどの芋類、キャベツ、ホウレンソウなどの野菜類、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギ、ライムギ、アワなどの穀類、えんどう豆、大豆、小豆、うずら豆などの豆類などが挙げられる。
【００９１】
グルカンホスホリラーゼを産生する動物の例としては、ヒト、ウサギ、ラット、ブタなどの哺乳類などが挙げられる。
【００９２】
グルカンホスホリラーゼを産生する微生物の例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ａｑｕｉｆｅｘ ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｓｕｌｕｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓなどが挙げられる。グルカンホスホリラーゼを産生する生物はこれらに限定されない。
【００９３】
本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、ジャガイモ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来することが好ましく、ジャガイモに由来することがより好ましい。本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、反応至適温度が高いことが好ましい。反応至適温度が高いグルカンホスホリラーゼは、例えば、高度好熱細菌に由来し得る。
【００９４】
本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、グルカンホスホリラーゼを産生する動物、植物、および微生物から直接単離され得る。
【００９５】
本発明で用いられるグルカンホスホリラーゼは、これらの動物、植物または微生物から単離したグルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【００９６】
グルカンホスホリラーゼは、上記のスクロースホスホリラーゼと同様に、遺伝子組換えされた微生物から得られ得る。
【００９７】
このようなグルカンホスホリラーゼは、当該分野で公知の方法によって調製され得る。例えば、国際公開第０２／０９７１０７号パンフレットに記載される方法によって調製され得る。
【００９８】
グルカンホスホリラーゼは、未精製のものであっても精製されたものであってもよいが、好ましくはある程度精製されたものである。
【００９９】
本発明の方法において反応開始時の溶液中に含まれるグルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約０．０５Ｕ／ｇスクロース以上であり、より好ましくは約０．１Ｕ／ｇスクロース以上であり、さらに好ましくは約０．５Ｕ／ｇスクロース以上であり、特に好ましくは約１Ｕ／ｇスクロース以上であり、最も好ましくは約１０Ｕ／ｇスクロース以上である。本発明の方法において反応開始時の溶液中に含まれるグルカンホスホリラーゼの量は、反応開始時の溶液中のスクロースに対して、好ましくは約１０００Ｕ／ｇスクロース以下であり、より好ましくは約５００Ｕ／ｇスクロース以下であり、さらに好ましくは約３００Ｕ／ｇスクロース以下であり、特に好ましくは約１００Ｕ／ｇスクロース以下であり、最も好ましくは約５０Ｕ／ｇスクロース以下である。グルカンホスホリラーゼの使用量が多すぎると、反応中に変性した酵素が凝集しやすくなる場合がある。使用量が少なすぎると、アミロースの収率が低下する場合がある。
【０１００】
グルカンホスホリラーゼは、固定化されていても固定化されていなくともよい。グルカンホスホリラーゼは、固定化されることが好ましい。固定化の方法としては、担体結合法（たとえば、共有結合法、イオン結合法、または物理的吸着法）、架橋法または包括法（格子型またはマイクロカプセル型）など、当業者に周知の方法が使用され得る。グルカンホスホリラーゼは、担体上に固定化されていることが好ましい。グルカンホスホリラーゼはまた、スクロースホスホリラーゼと同じ担体上に固定化されていてもよいし、別の担体上に固定化されていてもよい。同じ担体上に固定化されていることが好ましい。
【０１０１】
（２．１．７ β−１，４−グルカンホスホリラーゼ）
本明細書中では、「β−１，４−グルカンホスホリラーゼ」とは、β−１，４−グルカンの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う任意の酵素をいう。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、加リン酸分解の逆反応であるβ−１，４−グルカン合成反応をも触媒し得る。反応がどちらの方向に進むかは、基質の量に依存するが、この反応は、β−１，４−グルカン合成反応の方向に進みやすい傾向がある。β−１，４−グルカンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【０１０２】
【化２】
なお、この式において、出発時のβ−１，４−グルカンの重合度が２の場合、β−１，４−グルカンの代わりにグルコースが得られる。
【０１０３】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼは好ましくは、セロビオースホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．２０）またはセロデキストリンホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．４９）である。
【０１０４】
セロビオースホスホリラーゼは、セロビオースの非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロビオースホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【０１０５】
【化３】
セロデキストリンホスホリラーゼは、重合度３以上のセロオリゴ糖の非還元末端側グルコース残基をリン酸基に転移して加リン酸分解を行う酵素をいう。セロオリゴ糖は、セロデキストリンとも呼ばれる。セロデキストリンホスホリラーゼによって触媒される反応は、次式により示される：
【０１０６】
【化４】
本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロビオースである場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においては、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。本発明の方法においてはまた、β−１，４−グルカンがセロオリゴ糖である場合、β−１，４−グルカンホスホリラーゼとしてセロビオースホスホリラーゼおよびセロデキストリンホスホリラーゼを用いることが好ましい。この場合、セロデキストリンホスホリラーゼの作用によってセロオリゴ糖が分解されることによって生じたグルコース−１−リン酸がα−グルカン合成に使用され、かつ最終的に生じたセロビオースをセロビオースホスホリラーゼによって分解し得るので、セロオリゴ糖からα−グルカンの合成速度がより速くなる。
【０１０７】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）は、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ（好ましくはセロビオースホスホリラーゼまたはセロデキストリンホスホリラーゼ、最も好ましくはセロビオースホスホリラーゼ）を産生する任意の生物由来であり得る。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、ある程度の耐熱性を有することが好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、耐熱性が高ければ高いほど好ましい。例えば、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを１．４ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で５５℃にて２０分間加熱した場合に加熱前のβ−１，４−グルカンホスホリラーゼの活性の５０％以上の活性を保持するものであることが好ましく、６０％以上の活性を保持するものであることがより好ましく、７０％以上の活性を保持するものであることがさらに好ましく、８０％以上の活性を保持するものであることが特に好ましく、８５％以上の活性を保持するものであることが最も好ましい。β−１，４−グルカンホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来である。
【０１０８】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。
【０１０９】
β−１，４−グルカンホスホリラーゼがセロビオースホスホリラーゼである場合、セロビオースホスホリラーゼは、好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｏｃｏｒａｒｉｕｍ、Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｇｉｌｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ
ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｓ ｆｌａｖｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｆｏｍｅｓ ａｎｎｏｓ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓｐ．からなる群より選択される細菌由来であり、より好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍまたはＣｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．由来であり、最も好ましくはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ由来である。
【０１１０】
本発明で用いられるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記のような自然界に存在する、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する生物から直接単離され得る。本発明で用いられるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼは、上記の生物から単離したβ−１，４−グルカンホスホリラーゼをコードする遺伝子を用いて遺伝子組換えされた微生物（例えば、細菌、真菌など）から単離してもよい。
【０１１１】
（２．１．８ 水）
水は、軟水、中間水および硬水のいずれであってもよい。硬水とは、硬度２０°以上の水をいい、中間水とは、硬度１０°以上２０°未満の水をいい、軟水とは、硬度１０°未満の水をいう。水は、好ましくは軟水または中間水であり、より好ましくは軟水である。
【０１１２】
（２．１．９ 他の材料）
スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカン、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼなどの材料を含む溶液中には、スクロースホスホリラーゼとスクロースとの間の相互作用、グルカンホスホリラーゼとプライマーとの間の相互作用およびβ−１，４−グルカンホスホリラーゼとβ−１，４−グルカンとの間の相互作用を妨害しない限り、任意の他の物質を含み得る。このような物質の例としては、緩衝剤、スクロースホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを産生する微生物（例えば、細菌、真菌など）の成分、塩類、培地成分などが挙げられる。
【０１１３】
（２．２．１ ＳＰ−ＧＰ法によるアミロースの合成）
本発明で用いられるアミロースは、当該分野で公知の任意のアミロース合成方法によって合成され得る。例えば、スクロースとプライマーにスクロースホスホリラーゼとグルカンホスホリラーゼとを同時に作用させる方法（ＳＰ−ＧＰ法ともいう）によって合成され得る。この実施形態では、本発明で用いられるアミロースは、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液をインキュベートしてアミロースを生成させる工程により製造される。
【０１１４】
国際公開第０２／０９７１０７号パンフレットの図１には、スクロースからのグルカン合成の概略が示されている。スクロースと無機リン酸からスクロースホスホリラーゼを用いて、グルコース−１−リン酸が生成される。生成されたグルコース−１−リン酸および反応溶液に加えたグルコース−１−リン酸は、直ちにグルカンホスホリラーゼにより適切なプライマーに転移され、α−１，４−グルカン鎖が伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度スクロースホスホリラーゼの反応にリサイクルされる仕組みになっている。
【０１１５】
まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、固体状のスクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、またはグルカンホスホリラーゼをそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、反応溶液は、スクロース、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、スクロースホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。
【０１１６】
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応開始時の反応溶液中のスクロース濃度が約５〜約１００％である場合には、反応温度は代表的には、約４０℃〜約７０℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるスクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方の活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約４０℃〜約７０℃であり、より好ましくは約４５℃〜約７０℃、さらにより好ましくは約４５℃〜約６５℃である。
【０１１７】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるアミロースの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。
【０１１８】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えた金属（例えば、ステンレス）製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０１１９】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、スクロース、スクロースホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。
【０１２０】
このようにして、アミロースを含有する溶液が生産される。
【０１２１】
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。
【０１２２】
（２．２．２ ＧＰ法によるアミロースの合成）
本発明で用いられるアミロースは、グルカンホスホリラーゼを、プライマーとグルコース−１−リン酸とに作用させる方法（ＧＰ法ともいう）によって合成されてもよい。この実施形態では、本発明で用いられるアミロースは、グルカンホスホリラーゼと、プライマーと、グルコース−１−リン酸とを含む反応溶液をインキュベートして、アミロースを生成させる工程により製造される。
【０１２３】
まず、反応溶液を調製する。反応溶液は、例えば、適切な溶媒に、プライマー、グルコース−１−リン酸、およびグルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。あるいは、反応溶液は、プライマー、グルコース−１−リン酸またはグルカンホスホリラーゼをそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、反応溶液は、プライマー、グルコース−１−リン酸およびグルカンホスホリラーゼのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。この反応溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。
【０１２４】
次いで、反応溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。反応温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり得る。反応温度は代表的には、約３０℃〜約８０℃の温度であり得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるグルカンホスホリラーゼの活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は好ましくは約３０℃〜約８０℃であり、より好ましくは約３５℃〜約７０℃、さらにより好ましくは約３７℃〜約６５℃である。
【０１２５】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるアミロースの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。
【０１２６】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えた金属（例えば、ステンレス）製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０１２７】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、プライマー、グルコース−１−リン酸およびグルカンホスホリラーゼを反応溶液に追加してもよい。
【０１２８】
このようにして、アミロースを含有する溶液が生産される。
【０１２９】
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。
【０１３０】
（２．２．３ ＣＰ−ＧＰ法によるアミロースの合成）
本発明で用いられるアミロースは、当該分野で公知の任意のアミロース合成方法によって合成され得る。例えば、β−１，４−グルカンと無機リン酸もしくはグルコース−１−リン酸、プライマーにβ−１，４−グルカンホスホリラーゼとグルカンホスホリラーゼとを同時に作用させる方法（ＣＰ−ＧＰ法ともいう）によって合成され得る。この実施形態では、本発明で用いられるアミロースは、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびグルカンホスホリラーゼを含む反応溶液をインキュベートしてアミロースを生成させる工程により製造される。ＣＰ−ＧＰ法によるアミロースの合成の詳細は、国際公開第２００５／０５６８１１号パンフレットに記載されている。国際公開第２００５／０５６８１１号パンフレットの図２には、ＣＰ−ＧＰ法において生じる反応の概略が示されている。β−１，４−グルカン（重合度ｎ）と無機リン酸から、β−１，４−グルカンホスホリラーゼを用いて、グルコース−１−リン酸およびβ−１，４−グルカン（重合度ｎ−１）が生成される。生成されたグルコース−１−リン酸（および溶液に加えたグルコース−１−リン酸）は、直ちにα−１，４−グルカンホスホリラーゼにより、適切なプライマー（重合度ｍ）にα−１，４−結合で転移され、α−グルカン鎖（重合度ｍ＋１）として伸長される。また、その際に生成される無機リン酸は、再度β−１，４−グルカンホスホリラーゼの反応にリサイクルされる仕組みになっている。
【０１３１】
本発明の製造方法においては例えば、まず、溶液を調製する。溶液は、例えば、適切な溶媒に、固体状のβ−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼを添加することにより調製され得る。あるいは、溶液は、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、またはα−１，４−グルカンホスホリラーゼをそれぞれ含む溶液を混合することによって調製してもよい。あるいは、溶液は、β−１，４−グルカン、プライマー、無機リン酸またはグルコース−１−リン酸、β−１，４−グルカンホスホリラーゼ、およびα−１，４−グルカンホスホリラーゼのうちのいくつかの成分を含む溶液に固体状の他の成分を混合することによって調製してもよい。本発明の製造方法で用いられる溶液には、酵素反応を阻害しない限り、必要に応じて、ｐＨを調整する目的で任意の緩衝剤を加えてもよい。この溶液のｐＨは、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意のｐＨであり得る。ｐＨ値は、好ましくは約６〜約８であり、より好ましくは約６．５〜約７．５である。ｐＨは、反応に用いる酵素の至適ｐＨに合わせて適切に設定され得る。溶液の塩濃度もまた、酵素反応を過度に阻害しない限り、任意の塩濃度であり得る。塩濃度は、好ましくは１．０ｍＭ〜５０ｍＭであり、より好ましくは５ｍＭ〜３０ｍＭである。
【０１３２】
β−１，４−グルカンが、セロビオースであり、β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである場合、この溶液には、α−グルカン（アミロース）の生成の際に生成するグルコースを溶液から除去するために、例えば、グルコースイソメラーゼまたはグルコースオキシダーゼ（およびムタロターゼ）をさらに添加してもよい。さらに、溶液中にカタラーゼまたはペルオキシダーゼを添加してもよい。あるいは、酵母のような、グルコースを資化することによってグルコースを溶液中から除去する微生物を添加してもよい。あるいは、グルコース特異的吸着樹脂を添加してもよい。酵素または微生物を添加する方法は、反応を連続して進行させながらグルコースを同時に除去し得るので好ましい。なお、本明細書中では、「除去する」とは、反応液中のグルコースの量を低減させることおよびグルコースを存在させなくすることを包含する。
【０１３３】
次いで、溶液を、当該分野で公知の方法によって必要に応じて加熱することにより、反応させる。溶液の温度は、本発明の効果が得られる限り、任意の温度であり、添加した酵素がその活性を示す温度である。例えば、耐熱性酵素を用い、反応温度をその耐熱酵素に最適な温度にすることによって、添加した耐熱性酵素以外の混入した酵素の活性を抑え得る。この反応工程における溶液の温度は、所定の反応時間後に反応前のこの溶液に含まれるβ−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびグルカンホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方の活性の約５０％以上、より好ましくは約８０％以上の活性が残る温度であることが好ましい。この温度は、好ましくは約３０℃〜約７０℃の温度であり、より好ましくは約３５℃〜約６０℃である。
【０１３４】
反応時間は、反応温度、反応により生産されるアミロースの分子量および酵素の残存活性を考慮して、任意の時間で設定され得る。反応時間は、代表的には約１時間〜約１００時間、より好ましくは約１時間〜約７２時間、さらにより好ましくは約２時間〜約３６時間、最も好ましくは約２時間〜約２４時間である。
【０１３５】
加熱は、どのような手段を用いて行ってもよいが、溶液全体に均質に熱が伝わるように、攪拌を行いながら加熱することが好ましい。溶液は、例えば、温水ジャケットと攪拌装置を備えた金属（例えば、ステンレス）製反応タンクの中に入れられて攪拌される。
【０１３６】
本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、β−１，４−グルカン、β−１，４−グルカンホスホリラーゼおよびα−１，４−グルカンホスホリラーゼのうちの少なくとも１つを反応溶液に追加してもよい。
【０１３７】
β−１，４−グルカンが、セロビオースであり、β−１，４−グルカンホスホリラーゼが、セロビオースホスホリラーゼである場合、上述したように、グルコースイソメラーゼなどの酵素を添加して、α−グルカンの生産と同時に副生するグルコースを除去する工程を、生産工程と同時に行うことが好ましい。他方、グルコースを除去する工程は、α−グルカン生産工程とタイミングをずらして行ってもよい。例えば、本発明の方法ではまた、反応がある程度進んだ段階で、反応によって生成されたグルコースを除去するために、溶液をクロマト分画、膜分画法などの物理的グルコース除去方法で処理し、その後再度、反応を進行させてもよい。物理的グルコース除去方法は、１回実施されても、２回以上実施されてもよい。２回以上実施する場合、例えば、反応を２時間進行させた後、グルコース除去を行い、次いで再度反応を２時間進行させた後、グルコース除去を行い、次いで再度反応を２時間行うこととし得る。
【０１３８】
このようにして、α−グルカンを含有する溶液が生産される。
【０１３９】
反応終了後、反応溶液は、必要に応じて例えば、１００℃にて１０分間加熱することによって反応溶液中の酵素を失活させ得る。あるいは、酵素を失活させる処理を行うことなく後の工程を行ってもよい。
【０１４０】
（２．３ アミロース含有溶液の冷却によるアミロース粒子の形成）
次いで、アミロースを含有する反応溶液が冷却されることにより、アミロース粒子が形成される。この際、アミロース粒子径に影響を与える要因は、アミロース濃度、冷却温度、冷却時間、冷却時の攪拌の有無などである。本発明では、平均粒子径が１０マイクロメートル以上１０００マイクロメートル以下であるアミロース粒子が形成される条件であれば、任意の条件でアミロース粒子の形成が行われ得る。アミロースの濃度が高いほど粒子形成速度が速く、得られる粒子の粒子径は大きくなる。アミロース粒子を形成させる際の溶液中のアミロース濃度は、好ましくは約２重量％以上であり、より好ましくは約２．４重量％以上であり、さらに好ましくは約２．７重量％以上である。アミロース粒子を形成させる際の溶液中のアミロース濃度は、好ましくは約３０重量％以下であり、より好ましくは約２５重量％以下であり、さらに好ましくは約２０重量％以下である。冷却温度が低いほど粒子形成速度が速く、得られる粒子の粒子径は大きくなる。冷却温度は好ましくは約０℃以上であり、より好ましくは約４℃以上である。冷却温度は好ましくは約４０℃以下であり、より好ましくは約３０℃以下である。作業効率およびコストの面の観点からは、冷却温度はさらに好ましくは約１０℃〜約２５℃である。これは、このように高い温度であっても充分に大きなアミロース粒子が形成され得ることを示す。冷却は例えば、ジャケット付反応タンクのジャケットに冷却水を循環させることにより行われ得る。本明細書中では、「冷却温度」とは、アミロース含有溶液の温度をいう。冷却時間は任意に設定できる。本明細書中では、上記のような、ジャケットに冷却水を循環させて冷却を行う場合には、アミロース含有溶液の温度が冷却温度に到達してからの時間を冷却時間という。冷却時間は、経済性と作業性の観点から、好ましくは約０．５時間以上であり、より好ましくは約１時間以上である。冷却時間は、約２時間以上、約３時間以上、約４時間以上、約５時間以上、約６時間以上などであってもよい。冷却時間は、経済性と作業性の観点から、好ましくは約２４時間以下であり、より好ましくは約２０時間以下であり、さらに好ましくは約１８時間以下である。冷却時間は、約１６時間以下、約１４時間以下、約１２時間以下、約１０時間以下、約８時間以下、約６時間以下、約４時間以下などであってもよい。冷却時の攪拌は必ずしも必須ではないが、攪拌を行うと、粒子径を均一にすることが出来るため好ましい。
【０１４１】
好ましい局面では、冷却を行う際のアミロース含有溶液中のアミロース濃度は約２．７重量％〜約２０重量％であり、この場合の好ましい冷却温度は約４℃〜約２５℃であり、冷却時間は約１時間〜約１８時間である。
【０１４２】
なお、冷却を行う際のアミロース含有溶液としては、アミロース合成反応を行った反応溶液そのもの以外にも、反応溶液を濃縮した液体、部分的に精製を行った液体などを用いてもよい。
【０１４３】
（２．４ アミロース粒子の回収）
アミロース粒子は、任意の方法により回収され得る。アミロース粒子は、例えば、膜分画、濾過、遠心分離などの一般的な固液分離方法によって回収され得る。
【０１４４】
回収されたアミロース粒子は、水で洗浄されることが好ましい。水で洗浄することにより、アミロース粒子の表面に付着しているフルクトースなどの消化性の糖が除去される。
【０１４５】
回収されたアミロース粒子は、乾燥されることが好ましい。乾燥は、当該分野で公知の方法によって行われ得る。乾燥方法の例としては、例えば、気流乾燥、スプレードライ、凍結乾燥などが挙げられる。また、造粒機能をあわせ持つ乾燥装置も利用できる。乾燥することにより保存性が向上する。
【０１４６】
（３．血糖値上昇抑制用の飲食品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取しても血糖値を上昇させないので、血糖値の上昇を抑制するための飲食品素材として好適に使用され得る。本明細書中で用語「飲食品素材」とは、飲食品の原料として使用される可食性組成物をいう。すなわち、そのままでは食用にされず、他の飲食品素材と組み合わされて、調理されてから食用とされるものをいう。本発明の飲食品素材は、糖尿病、耐糖能異常、高血圧、高脂血症、肥満などに悩む被験体に有効である。本発明の飲食品素材はまた、ダイエット食品としても有効である。
【０１４７】
血糖値上昇抑制用の飲食品素材の実施形態において、本発明の飲食品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１４８】
本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、一般的な食品原料、食品添加物、水などが挙げられる。具体的には、食品原料は、例えば、単糖類、多糖類、糖アルコール、澱粉、加工澱粉、デキストリンなどの糖類、乳タンパク質、リポタンパク質、卵タンパク質、小麦タンパク質などのタンパク質、各種植物油および動物油、加工油脂などの脂質などが挙げられる。食品添加物は、例えば、ビタミン類、ミネラル類、レシチン、グリセリン脂肪酸エステルなどの乳化剤、ペクチン、ゼラチン、寒天、デキストリン、多糖類、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどの安定剤、呈味成分、着香料、着色料、酸化防止剤、ｐＨ調製剤などが挙げられる。上記食品原料、食品添加物、水などは、単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１４９】
（４．糞便量を増大させるための飲食品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取することにより糞便量を増加させるので、糞便量を増大させるための飲食品素材として好適に使用され得る。本発明の飲食品素材は、胃腸障害、便秘、下痢などの便通異常、肥満、高脂血症などに悩む被験体に有効である。本発明の飲食品素材はまた、ダイエット食品としても有効である。
【０１５０】
糞便量を増大させるための飲食品素材の実施形態において、本発明の飲食品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１５１】
本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、一般的な食品原料、食品添加物、水などが挙げられる。具体的には、食品原料は、例えば、単糖類、多糖類、糖アルコール、澱粉、加工澱粉、デキストリンなどの糖類、乳タンパク質、リポタンパク質、卵タンパク質、小麦タンパク質などのタンパク質、各種植物油および動物油、加工油脂などの脂質などが挙げられる。食品添加物は、例えば、ビタミン類、ミネラル類、レシチン、グリセリン脂肪酸エステルなどの乳化剤、ペクチン、ゼラチン、寒天、デキストリン、多糖類、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどの安定剤、食物繊維、呈味成分、着香料、着色料、酸化防止剤、ｐＨ調製剤などが挙げられる。上記食品原料、食品添加物、水などは、単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１５２】
（５．脂質の吸収を抑制させるための飲食品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取することにより脂質の吸収を抑制するので、脂質の吸収を抑制させるための飲食品素材として好適に使用され得る。
【０１５３】
本発明の飲食品素材は、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、糖尿病脂肪肝、肝硬変などに悩む被験体に有効である。本発明の飲食品素材はまた、ダイエット食品としても有効である。
【０１５４】
脂質の吸収を抑制させるための飲食品素材の実施形態において、本発明の飲食品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の飲食品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１５５】
本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、一般的な食品原料、食品添加物、水などが挙げられる。具体的には、食品原料は、例えば、単糖類、多糖類、糖アルコール、澱粉、加工澱粉、デキストリンなどの糖類、乳タンパク質、リポタンパク質、卵タンパク質、小麦タンパク質などのタンパク質、各種植物油および動物油、加工油脂などの脂質などが挙げられる。食品添加物は、例えば、ビタミン類、ミネラル類、レシチン、グリセリン脂肪酸エステルなどの乳化剤、ペクチン、ゼラチン、寒天、デキストリン、多糖類、アルギン酸プロピレングリコールエステルなどの安定剤、食物繊維、呈味成分、着香料、着色料、酸化防止剤、ｐＨ調製剤などが挙げられる。上記食品原料、食品添加物、水などは、単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の飲食品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１５６】
（６．血糖値上昇抑制用の医薬品素材および医薬部外品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取しても血糖値を上昇させないので、血糖値の上昇を抑制するための医薬品素材および医薬部外品素材として好適に使用され得る。本明細書中で用語「医薬品素材」とは、医薬品の原料として使用される可食性組成物をいう。本明細書中で用語「医薬品部外品素材」とは、医薬部外品の原料として使用される可食性組成物をいう。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、糖尿病、耐糖能異常、高血圧、高脂血症、肥満などに悩む被験体に有効である。
【０１５７】
血糖値上昇抑制用の医薬品素材の実施形態において、本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１５８】
本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、医薬品および医薬部外品に使用することが認可させている医薬品原料および医薬部外品原料、水などが挙げられる。医薬品原料および医薬部外品原料、水などは単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１５９】
（７．糞便量を増大させるための医薬品素材および医薬部外品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取することにより糞便量を増加させるので、糞便量を増大させるための医薬品素材および医薬部外品素材として好適に使用され得る。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、胃腸障害、便秘、下痢などの便通異常、肥満、高脂血症などに悩む被験体に有効である。
【０１６０】
糞便量を増大させるための医薬品素材および医薬部外品素材の実施形態において、本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１６１】
本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、医薬品および医薬部外品に使用することが認可させている医薬品原料および医薬部外品原料、水などが挙げられる。医薬品原料および医薬部外品原料、水などは単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１６２】
（８．脂質の吸収を抑制させるための医薬品素材および医薬部外品素材）
本発明のアミロース粒子は、経口摂取することにより脂質の吸収を抑制するので、脂質の吸収を抑制させるための医薬品素材および医薬部外品素材として好適に使用され得る。
【０１６３】
本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、肥満、高血圧、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、糖尿病脂肪肝、肝硬変などに悩む被験体に有効である。
【０１６４】
脂質の吸収を抑制させるための医薬品素材および医薬部外品素材の実施形態において、本発明の医薬品素材および医薬部外品素材は、アミロース粒子のみからなっていてもよく、他の物質を含んでもよい。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以上であり、より好ましくは約６０重量％以上であり、さらに好ましくは約７０重量％以上であり、一層好ましくは約８０重量％以上であり、最も好ましくは約９０重量％以上である。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材中の本発明のアミロース粒子の含有量に特に上限はなく、例えば、約９９重量％以下、約９８重量％以下、約９７重量％以下、約９６重量％以下、約９５重量％以下などであり得る。
【０１６５】
本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質の例としては、特に限定されないが、医薬品および医薬部外品に使用することが認可させている医薬品原料および医薬部外品原料、水などが挙げられる。医薬品原料および医薬部外品原料、水などは単独で用いることもでき、また二種以上を組み合わせて用いることもできる。本発明の医薬品素材および医薬部外品素材に含まれる、アミロース粒子以外の物質は、非消化性であることが好ましい。
【０１６６】
（９．飲食品）
本発明の飲食品は、本発明のアミロース粒子を含有する。
【０１６７】
本発明の飲食品は、任意の形態であり得る。本発明の飲食品は、例えば、固体状（例えば、粉末状、ブロック状など）、半固体状（例えば、スラリー状、ゲル状など）または液状であり得る。特定の場合には、本発明の飲食品は、粉末または液状であることが好ましい。
【０１６８】
本発明の飲食品は、食品または飲料である。食品の例としては、以下が挙げられる：米・麦・小麦粉製品（例えば、ごはん、もち、てんぷら粉、パン、麺、パスタ、ビーフン）；いも及びでんぷん食品（例えば、くずきり、はるさめ）；甘味料類（例えば、角砂糖、粉飴）；菓子類（例えば、スナック菓子、クラッカー、ビスケット、クッキー、ケーキ、パイ、カステラ、ウエハース、ボーロ、チョコレート、チョコレート菓子、キャラメル、キャンディー、錠菓、清涼菓子、チューインガム、ゼリー、ゼリー菓子、プリン、ブランマンジェ、米菓子、豆菓子、甘納豆、ようかん、くずもち、しるこ、中華まん、シリアル、クッキーミックス、プリンミックス、ゼリーミックス）；アイスクリーム類（例えば、アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、氷菓）；油脂類（例えば、植物油、バター、マーガリン、治療用油脂）；種実類（例えば、ごま、ねりごま、松の実）；大豆・大豆製品（例えば、大豆水煮、豆腐、みそ）；魚介・練製品（例えば、水産練製品、かずのこ、くらげ）；畜産加工品（例えば、ハム、ソーセージ、ベーコン、ミートローフ）；卵類（例えば、ゆで卵、温泉卵、スモーク卵）；乳製品（例えば、ヨーグルト、チーズ、クリーム、粉乳、練乳）；野菜・きのこ類（例えば、漬物、やまいもパウダー）；果実加工品・ペースト類（例えば、ドライフルーツ、ジャム、マーマレード、フルーツうらごし、マッシュ、フルーツソース、ペースト、あん）；海藻類（例えば、のり、こんぶ、わかめ、もずく、海藻サラダ）；調味料類（例えば、しょうゆ、食酢、ソース類、マヨネーズ類、ドレッシング類、ケチャップ類、ルウ、みりん、料理酒、だしの素、つゆ、たれ、ごはんの素、ミックス調味料、漬け物の素、味付塩こしょう）；香辛料類（例えば、からし、こしょう、さんしょう、しょうが、とうがらし、にんにく、わさび、カレー粉、花、椒五香粉、ゆずみそ）；半料理・調理済食品（例えば、かゆ、ごはんの素、ハンバーグ、ミートボール、チキンナゲット、カレー、シチュー、ピザ、グラタン、スパゲティ、焼そば、肉まん、中華惣菜、卵豆腐、茶碗蒸し、ファーストフード）；冷凍食品（例えば、米飯類、グラタン、ピザ、めん類、いも製品、大豆製品、魚介料理、肉料理、卵料理、惣菜、菓子類、ミックスベジタブル）；缶詰・びん詰類（例えば、種実類、豆類、魚介類、肉類、野菜類、果実類、きのこ類、ソース類、デザート、スープ類、植物たんぱく製品、治療用缶詰）；即席食品（例えば、袋入りめん類、生タイプめん類、カップめん、ごはん類、カレー、シチュー、スープ、ソース、ごはんの素、植物たんぱく食品）；煮豆・佃煮類（例えば、煮豆、しいたけのり、なめたけ）；ふりかけ・そぼろ（例えば、かつおふりかけ、ゆかり、お茶漬け、そぼろ）；ベビーフード（例えば、米・めん料理、魚料理、肉料理、卵料理、乳製品料理、野菜料理、スープ、フルーツ、ジュース、水分補給飲料、茶、デザート、菓子、ソース、ふりかけ）；粉乳（例えば、一般調整粉乳、特殊調整粉乳、妊婦・授乳婦用粉乳）；経腸栄養食品（例えば、経腸栄養剤、濃厚流動食、栄養補給・栄養補助食品、経腸栄養剤・濃厚流動食用フレーバー、デザート）；その他の食品（例えば、栄養補助食品、ブレンダー食、とろみ食品、検査用食品、シリアル食品、スポーツ用食品、非常食、健康食品、高齢者用食品、ペットフード、動物用飼料）。
【０１６９】
なお、チューインガム、茶葉のように最終的に飲み込まない部分がある食品については、アミロース粒子の含有量は、飲み込まれない部分（例えば、チューインガムの場合はガムベース）の量を除外して計算される。
【０１７０】
飲料類の例としては、以下が挙げられる：乳、乳飲料、豆乳、豆乳飲料、ジュース、炭酸飲料、コーヒー、ココア、茶（例えば、紅茶、日本茶、ウーロン茶）、アルコール飲料、スポーツドリンク、野菜ジュース、栄養ドリンク、ミネラルウォーター、しるこ、ドリンクスープ。
【０１７１】
本発明の飲食品は、製造の任意の段階でアミロース粒子を添加すること以外は、その飲食品の通常の原料から通常の手順で、通常の組成で製造され得る。アミロース粒子は、例えば、直接まぶす、砂糖、食塩等の粉体に分散して噴霧する、水、だし等の液体に懸濁して浸漬または噴霧するなど、当該分野で公知の任意の方法によって食品に添加され得る。また、食品が、シュークリーム、アンパンなどのように複数の異なる組成を有する部分から構成される場合、アミロース粒子は複数の部分のうちのいずれか１つの部分に含まれてもよく、複数の部分のうちのいくつかの部分に含まれていてもよく、全ての部分に含まれていてもよい。
【０１７２】
添加方法としては、使用するアミロース粒子の全量を一度に飲食品中に投入してもよく、時間をかけて少量ずつ投入してもよい。アミロース粒子を添加するタイミングは、飲食品の加熱前、加熱中または加熱後のいずれであってもよい。添加の際もしくは添加の後には、必要に応じて飲食品の撹拌を行って、飲食品中の材料全体の表面に均一にアミロース粒子を接触させるようにすることが好ましい。
【０１７３】
特定の実施形態では、１つの実施形態では、本発明の飲食品は、低カロリー飲食品である。１つの実施形態では、本発明の飲食品は、ゼロカロリー飲食品である。本明細書中では、用語「ゼロカロリー飲食品」とは、１００ｇあたりのエネルギー量が５ｋｃａｌ以下である飲食品をいう。本明細書中では、用語「低カロリー飲食品」とは、１００ｇあたりのエネルギー量が、飲料の場合は２０ｋｃａｌ以下、食品の場合は４０ｋｃａｌ以下である飲食品をいう。すなわち、低カロリー飲食品は、ゼロカロリー飲食品を包含する。ゼロカロリー飲食品は、ノンカロリー飲食品ともいわれる。健康増進法によれば、栄養成分が少ないことを強調する表示の基準として、「低」、「軽」、「ひかえめ」、「低減」、「カット」などのエネルギー表示が可能である。また、「無」、「ゼロ」、「ノン」などのエネルギー表示は、１００ｇあたりのエネルギーが５ｋｃａｌ以下とされている。ゼロカロリー飲食品または低カロリー食品のカロリー数は、当該分野で公知の方法に従って実際に測定されてもよく、あるいは、食品成分表および厚生労働省によるエネルギー換算計数に基づいて計算されてもよい。
【０１７４】
本発明の低カロリー飲食品の１００ｇあたりのエネルギー量は、好ましくは約４０ｋｃａｌ以下であり、より好ましくは約３０ｋｃａｌ以下であり、さらに好ましくは約２０ｋｃａｌ以下であり、特に好ましくは約１０ｋｃａｌ以下であり、とりわけ好ましくは約５ｋｃａｌ以下であり、そして最も好ましくは約０ｋｃａｌである。
【０１７５】
本発明のアミロース粒子は、経口摂取しても実質的に吸収されず、エネルギーを生じないので、１００ｇあたりのエネルギー量は、約０ｋｃａｌであると考えられる。すなわち、ゼロカロリーの食品素材として知られるエリスリトールと同程度のエネルギーである。
【０１７６】
本発明の飲食品に含まれるアミロース粒子の含有量は、好ましくは約０．１重量％以上であり、より好ましくは約０．５重量％以上であり、さらに好ましくは約１重量％以上であり、特に好ましくは約５重量％以上であり、最も好ましくは約１０重量％以上である。この実施形態では、飲食品に含まれるアミロース粒子の含有量は、好ましくは約５０重量％以下であり、より好ましくは約４０重量％以下であり、さらに好ましくは約３０重量％以下であり、特に好ましくは約２０重量％以下であり、最も好ましくは約１５重量％以下である。
【０１７７】
本発明の飲食品は、糖尿病、耐糖能異常；胃腸障害、便秘、下痢などの便通異常、；肥満、高血圧、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、糖尿病脂肪肝、肝硬変などに悩む被験体に有効である。本発明の飲食品はまた、ダイエット食品としても有効である。
【０１７８】
（１０．医薬品および医薬部外品）
本発明の医薬品および医薬部外品は、本発明のアミロース粒子を含有する。
【０１７９】
本発明の医薬品および医薬部外品は、任意の形態であり得る。本発明の医薬品および医薬部外品は、固体状であっても、半固体状であっても、液状であってもよいが、好ましくは固体状である。本発明の医薬品は、例えば、錠剤、丸剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などであり得る。本発明の医薬部外品は、例えば、錠剤、丸剤、トローチ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤などであり得る。本発明の医薬品または医薬部外品は、例えば、ドリンク剤であり得る。
【０１８０】
本発明の医薬品および医薬部外品は、製造の任意の段階でアミロース粒子を添加すること以外は、その医薬品および医薬部外品の通常の原料から通常の手順で、通常の組成で製造され得る。本発明のアミロース粒子を医薬品または医薬部外品に添加するには特別な工程を必要とせず、医薬品および医薬部外品の製造工程の初期において原料と共に添加するか、製造工程中に添加するか、あるいは製造工程の終期に添加する。添加方式は混和、混練、溶解、浸漬、散布、噴霧、塗布等通常の方法を医薬品の種類および性状に応じて選択する。本発明の医薬品および医薬部外品は、当業者に公知の方法に従って調製され得る。
【０１８１】
本発明の医薬品および医薬部外品に含まれるアミロース粒子の含有量は、好ましくは約０．１重量％以上であり、より好ましくは約０．５重量％以上であり、さらに好ましくは約１重量％以上であり、特に好ましくは約５重量％以上であり、最も好ましくは約１０重量％以上である。この実施形態では、医薬品および医薬部外品に含まれるアミロース粒子の含有量は、好ましくは約１００重量％以下であり、より好ましくは約４０重量％以下であり、さらに好ましくは約３０重量％以下であり、特に好ましくは約２０重量％以下であり、最も好ましくは約１５重量％以下である。
【０１８２】
本発明の医薬品および医薬部外品は、糖尿病、耐糖能異常；胃腸障害、便秘、下痢などの便通異常、；肥満、高血圧、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、糖尿病脂肪肝、肝硬変などに悩む被験体に有効である。
【実施例】
【０１８３】
（実施例１−３〜１−５、比較例１−１、１−２、１−６〜１−８：酵素合成アミロース粒子の製造）
３０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１７５ｍＭスクロース、および種々の濃度のマルトオリゴ糖混合物（株式会社林原商事製テトラップＨ（マルトテトラオース含有量７０％以上の液体）を１３３２０、９３３０、２１３０、１０７０、８００、５３０、２７０または１３ｍｇ／リットル）を含有する水溶液（１リットル）に、国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットに記載の方法に従って調製した馬鈴薯塊茎由来の精製グルカンホスホリラーゼおよび国際公開第ＷＯ０２／０９７１０７号パンフレットに記載の方法に従って調製したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ由来スクロースホスホリラーゼをそれぞれ１単位／ｍｌになるように加えて反応溶液を得た。この反応溶液を３７℃で１６時間保温することによりアミロースを合成した。合成されたアミロースの濃度は比較例１−１、１−２、１−６、１−７、実施例１−３〜１−５では約２．８重量％であり、比較例１−８では約２．４重量％であった。この合成されたアミロースを含む反応溶液を４℃で一晩保持（静置）することにより、アミロース粒子を形成させた。この反応溶液は、約０．５時間で４℃まで液温が下がり、その温度で約１８時間保持された。この冷却後の反応溶液をろ過により固液分離して、アミロース粒子の沈澱物（ケーキ）を得た。得られたアミロース粒子の沈澱物を回収した後、さらに水に懸濁し、その後、固液分離してケーキを回収した。水懸濁とケーキ回収とを数回繰り返し、反応により副生したフルクトース濃度が０．１％以下になったところで最終的にケーキを回収した。このケーキをスプレードライによって乾燥しアミロース粒子を得た。
【０１８４】
アミロース粒子の重量平均分子量（Ｍｗ）をＭＡＬＬＳ法により決定した。アミロース粒子の分子量分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）をＭＡＬＬＳ法により決定した。アミロース粒子の平均粒子径（μｍ）をレーザー回折粒度分布測定装置(ＳＡＬＤ−２２００、(株)島津製作所製)にて粒度分布を測定することにより決定した。比較例１−１、１−２、実施例１−３〜１−５、比較例１−６、１−７のアミロース粒子は水に分散し、比較例１−８のアミロース粒子はエタノールに分散してその懸濁液を超音波で５分間分散させた。比較例１−８のアミロース粒子をエタノールに分散させたのは、水を溶媒とするとアミロース粒子が溶解してしまい、粒度分布を測定できないからであった。分散させたサンプルは、アミロース粒子を分散させた溶媒（水またはエタノール）を循環させた上記レーザー回折粒度分布測定装置のセル中に加え、粒度分布を測定した。各結果を下記の表２に示す。
【０１８５】
【表２】
得られたアミロース粒子の分子量分布を特許文献４〜７に記載されるアミロースの分子量分布と比較して図１に示す。図１において、破線は特許文献４〜７にに記載される１０２〜１０４のアミロース（重量平均分子量（Ｍｗ）３，３６７、Ｍｗ／Ｍｎ１．４５）の分子量分布を示し、１は先行技術のアミロースの分子量に相当する比較例１−１の重量平均分子量５，０００のアミロース粒子、２は比較例１−２の重量平均分子量７，０００のアミロース粒子、３は実施例１−３の重量平均分子量１９，０００のアミロース粒子、４は実施例１−４の重量平均分子量２２，０００のアミロース粒子、５は実施例１−５の重量平均分子量３７，０００のアミロース粒子、６は比較例１−６の重量平均分子量６５，０００のアミロース粒子、７は比較例１−７の重量平均分子量１０２，０００のアミロース粒子、８は比較例１−８の重量平均分子量１１００，０００のアミロース粒子の分子量分布を示す。
【０１８６】
（評価例１：アミロース粒子のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）における消化性試験）
酵素合成アミロースは、分子量分布が狭く、分岐のない構造が特徴であり、分子量により固有の物性を示す。その分子の大きさおよび状態によって体内での消化性が異なり、消化されてエネルギーになるものもあれば、消化されずに食物繊維としての機能を持つものもあると考えられる。そのため、本評価例では、重量平均分子量の異なるいくつかの酵素合成アミロース粒子のα-アミラーゼによる消化性を調べた。
【０１８７】
比較例１−１で調製した重量平均分子量５，０００（５ｋ）の酵素合成アミロース（これは、特許文献４〜７にに記載されるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する）、比較例１−２、実施例１−３〜１−５、比較例１−６〜比較例１−８で調製した重量平均分子量７，０００（７ｋ）、１９，０００（１９ｋ）、２２，０００（２２ｋ）、３７，０００（３７ｋ）、６５，０００（６５ｋ）、１０２，０００（１０２ｋ）、または１１００，０００（１，１００ｋ）の酵素合成アミロース粒子１０ｍｇを室温の水１０ｍｌに添加して混合し、さらにブタ膵臓α−アミラーゼ（３．２５Ｕ）を添加してサンプルとした。このサンプルを３７℃で２４時間インキュベートすることにより、α−アミラーゼをアミロース粒子に作用させた。重量平均分子量１１００，０００（１，１００ｋ）のアミロース粒子を用いた場合のサンプルは水溶液となった。重量平均分子量５，０００（５ｋ）、７，０００（７ｋ）、１９，０００（１９ｋ）、２２，０００（２２ｋ）、３７，０００（３７ｋ）、６５，０００（６５ｋ）および１０２，０００（１０２ｋ）のアミロース粒子を用いた場合のサンプルは懸濁液となった。インキュベート前（０時間）、インキュベートを始めてから０．５時間、１時間、１．５時間、２時間および２４時間の時点でサンプリングした。このサンプルを遠心分離することによりα−アミラーゼに未分解のアミロース粒子を沈殿として除去し、α−アミラーゼにより分解され生じた可溶性成分を得た。フェノール硫酸法によりこのα−アミラーゼの分解を受けた可溶性成分の全糖量を測定することにより、各重量平均分子量の酵素合成アミロー粒子のα−アミラーゼ消化性を調べた。その結果を図２に示す。
【０１８８】
α−アミラーゼによる消化性は、添加したアミロース量を１００％とした場合の各重量平均分子量のアミロースのα−アミラーゼによる分解率によって判断した。可溶性アミロース（１，１００ｋ）の水溶液は最も分解率が高く、９０％以上分解された。先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース粒子は２４時間α−アミラーゼを作用させると約４０％の分解率を示した。重量平均分子量７，０００（７ｋ）のアミロース粒子では約２０％、重量平均分子量６５，０００（６５ｋ）および１０２，０００（１０２ｋ）のアミロース粒子では３０〜４０％の分解率を示した。これに比べ、重量平均分子量１９，０００（１９ｋ）、２２，０００（２２ｋ）および３７，０００（３７ｋ）のアミロース粒子はα−アミラーゼを作用させて２時間程度はほぼ０％の分解率を示し、２４時間反応後も２〜３％の分解率であった。これは、重量平均分子量１９，０００（１９ｋ）、２２，０００（２２ｋ）および３７，０００（３７ｋ）のアミロース粒子がほぼ１００％のα−アミラーゼ抵抗性を有することを示す。
【０１８９】
これらの結果から、重量平均分子量１９，０００（１９ｋ）、２２，０００（２２ｋ）および３７，０００（３７ｋ）の酵素合成アミロース粒子は、従来から難消化性澱粉として知られているα−アミラーゼ耐性デンプンと異なり、アミラーゼ抵抗性がほぼ１００％の非消化性澱粉であることがわかった。
【０１９０】
（評価例２：血糖値上昇抑制試験）
８週齢のラット（Ｗｉｓｔｅｒ系）に、先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース粒子を熱水で溶解した水溶液、実施例１−４の重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子の懸濁液、比較例１−７の重量平均分子量１０２，０００（１０２ｋ）のアミロース粒子の懸濁液、グルコースの水溶液、または水を胃内ゾンデにて経口投与し、各時間経過後の血糖値の上昇パターンを比較した。投与量は体重１ｋｇあたりアミロース粒子５００ｍｇとした。投与前および投与３０、６０、９０、１２０分後にＡｖｅｎｔｉｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＬＣＣのグルコースパイロットを用いて酵素電極法にて血糖値を測定した。各試験群の検体数は９〜１３匹であった。
【０１９１】
結果を図３に示す。図３においては、投与前の血糖値と比較した血糖値の上昇値をプロットした。すなわち、各時点の血糖値の測定値から、投与前の血糖値の測定値を差し引いて得られる値をプロットした。グルコースを経口投与すると急激な血糖値の上昇が見られ、３０分後に最大値を示し、その後低下した。先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース水溶液を経口投与した場合も、グルコースを経口投与した場合と同様の経過を示した。一方、重量平均分子量１０２，０００（１０２ｋ）のアミロース粒子の懸濁液を経口投与した場合、ネガティブコントロールである水摂取と比べ６０分後に血糖値の上昇が見られたが、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子の懸濁液を経口投与した場合、ネガティブコントロールである水摂取と同様の経過を示し、血糖値上昇はほとんど見られなかった。
【０１９２】
一般に、経口投与された澱粉は膵液α−アミラーゼの作用で分解され、小腸まで運ばれ体内に吸収される。グルコースおよび先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース水溶液に比べて、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子は、膵液α−アミラーゼでほとんど分解されないため、小腸上皮細胞で吸収されず、血糖値は上昇しなかったと考えられる。一方、膵液α−アミラーゼで分解される重量平均分子量１０２，０００（１０２ｋ）のアミロース粒子は、血糖値が上昇した。
【０１９３】
以上の結果から、アミラーゼに完全な抵抗性を示す重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子には血糖値上昇を抑制する機能が認められた。
【０１９４】
（評価例３：糞便排泄量への影響）
消化酵素の影響を受けない食物繊維は、小腸で吸収されずそのまま大腸に運ばれ、ビフィズス菌など腸内細菌の活性化に利用され排泄される。評価例１から２２，０００（２２ｋ）の酵素合成アミロース粒子は消化酵素の影響を受けないことがわかった。そこで酵素合成アミロース粒子の食物繊維としての腸内環境改善効果を調べるため、糞便の排泄量を可溶性澱粉と比較した。
【０１９５】
８週齢のラット（Ｗｉｓｔｅｒ系）に、先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）もしくは２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子または可溶性澱粉（市販のコーンスターチ）を含む食餌を与えた。食餌中のアミロースまたはコーンスターチの量は１０重量％であった。ラットには食餌を１４日間自由に摂取させた。試験した食餌の原料の組成を以下の表４に示す。
【０１９６】
【表４】
食餌を与えてから１２日目〜１４日目までの２日間の乾燥糞便重量（ｇ）を測定した。各試験群の検体数は６匹であった。結果を図４に示す。乾燥糞便重量（ｇ）は、食餌を与えてから１２日目〜１４日目までの２日間の糞便を集め、乾燥による重量の減少がなくなるまで乾燥させた後、その重量を測定することにより決定された。
【０１９７】
重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース粒子を用いた場合、糞便量は、可溶性澱粉を用いた場合と同等であった。この結果、先行技術であるα−アミラーゼ耐性デンプンの分子量に相当する重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース粒子には、糞便排泄量を増やす効果がないことがわかった。
【０１９８】
他方、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子を用いた場合、可溶性澱粉または重量平均分子量５，０００（５ｋ）のアミロース粒子を用いた場合の約３倍の糞便量が排泄された。この結果から、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子は、糞便排泄量を増やす有意な効果があることがわかった。このことから、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子は便通作用など腸内環境改善の機能性を有することが示唆された。
【０１９９】
（評価例４：血漿中のトリグリセリド濃度低下試験）
食物繊維は、脂質の吸収抑制機能が期待されている。酵素合成アミロース粒子の脂質抑制機能を調べるため、食品脂質成分であるトリグリセリドの血中への取り込み量を測定した。
【０２００】
３週齢のＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットに、高脂肪食にセルロースを加えた飼料（高脂肪食）（ＨＦ）、または高脂肪食にセルロースの代わりに重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）（Ｈ３０ｋ）のアミロース粒子を添加した飼料（２２kアミロース添加食）を８週間与える長期飼育試験を行った。ラットには食餌を自由に摂取させた。使用した飼料の材料の組成を以下の表５に示す。各試験群の検体数は８匹であった。
【０２０１】
【表５】
８週間の飼育後にラットを解剖した。８週目解剖時の血漿トリグリセライド濃度を、トリグリセライドＥ−テストワコー（和光純薬製）を用いて定量した。図５に示したように、重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子を加えた飼料を摂取させた群の血漿トリグリセライド濃度は、アミロースの代わりにセルロースを加えた高脂肪食飼料を摂取させた群の約１／２であった。この結果から、非消化性のアミロース粒子を摂取することによる食餌中の脂質の吸収抑制効果が示唆された。
【０２０２】
（評価例５：アミロース粒子の平均粒子径および形状の影響）
重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロースを用いて、粒子径および形状が異なるアミロース粒子を調製し、アミロース粒子の消化性に及ぼす粒子径および形状の影響を調べた。
【０２０３】
評価例１で試験した８種類の酵素合成アミロースの中で最も消化性が低かった重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロースについて、アミロース粒子の粒子径および形状の影響を調べた。
【０２０４】
実施例１−４で調製した重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子０．５ｇを４０ｍｌの１Ｎ水酸化カリウムに完全に溶解した後、１Ｎ塩酸で中和し、１ｍｌのリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）を1ml加え、水で100mlに希釈し、アミロースを再結晶させた。
【０２０５】
このアミロース粒子を回収および洗浄し、次いで乾燥することにより、アミロース粒子を得た。得られたアミロース粒子の平均粒子径は６．７μｍであった。
【０２０６】
このアミロース粒子について、評価例１と同様の方法でインビトロの消化性を調べた。また、評価例２と同様の方法でインビボでの消化性を調べた。結果を図６および図７に示す。図７においては、投与前の血糖値と比較した血糖値の上昇値をプロットした。すなわち、各時点の血糖値の測定値から、投与前の血糖値の測定値を差し引いて得られる値をプロットした。
【０２０７】
その結果、再結晶により製造した粒子径の小さい重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子は、膵液α−アミラーゼにより約１０％分解された（図６）。また、再結晶により製造した粒子径の小さい重量平均分子量２２，０００（２２ｋ）のアミロース粒子は、血糖値の上昇が見られた（図７）。このように同じ分子量のアミロースであってもその粒子径の違いにより、アミラーゼの消化性が異なることが明らかとなった。
【０２０８】
（実施例２：アミロース粒子を加えたアイスクリーム）
実施例１−４のアミロース粒子を含むアイスクリームを試作した。表６の配合で全原料をよく混合し、アイスクリームミックスをホモジナイザーで均質化する。８５℃３０秒加熱殺菌後、急速冷却した後５℃で一晩エイジングする。そのあとフリージングを行い、カップに充填して−２５℃で３日間保存した。本実施例のアミロース粒子を加えたアイスクリームにより、１日に必要とされる食物繊維摂取量のめやすの約６０％を摂取できる。
【０２０９】
【表６】
（実施例３：アミロース粒子を加えたヨーグルト飲料）
実施例１−４のアミロース粒子を含むドリンクヨーグルトを試作した。表７の配合で全原料をよく混合し、８５℃３０秒加熱殺菌後、冷却しホモジナイザーで均質化した。本実施例のアミロース粒子を加えたヨーグルトドリンクにより、１日に必要とされる食物繊維摂取量のめやすの約６０％を摂取できる。
【０２１０】
【表７】
（実施例４：アミロース粒子を加えたクッキー）
実施例１−４のアミロース粒子を含むクッキーを試作した。表８の配合で全原料を練りこみまとめたクッキー生地を４℃に１晩保存した後、平面にのばし型を抜き、１８０℃で１５分間焼き上げた。本実施例のアミロース粒子を加えたクッキーにより、１日に必要とされる食物繊維摂取量のめやすの約６０％を摂取できる。
【０２１１】
【表８】
【産業上の利用可能性】
【０２１２】
本発明のアミロース粒子、ならびにそれを含む食品素材、医薬品および医薬部外品素材、飲食品、および、医薬品および医薬部外品は、糖尿病、耐糖能異常；胃腸障害、便秘、下痢などの便通異常、；肥満、高血圧、高脂血症、高コレステロール血症、動脈硬化症、糖尿病脂肪肝、肝硬変などに悩む被験体に有効である。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】図１は、各種の酵素合成アミロースの分子量分布を示すグラフである。
【図２】図２は、各重量平均分子量のアミロース粒子のブタ膵臓アミラーゼによるインビトロでの消化性試験の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）によるラットの血糖値の上昇値を示す折れ線グラフである。
【図４】図４は、乾燥糞便重量（ｇ）を示す棒グラフである。
【図５】図５は、高脂肪食を与えた場合および本発明のアミロース粒子を添加した高脂肪食（２２ｋアミロース添加食）を与えた場合の血漿トリグリセライド濃度（ｍｇ／ｄＬ）を示す棒グラフである。
【図６】図６は、同じ重量平均分子量のアミロースから製造された異なる平均粒子径のアミロース粒子のアミラーゼ分解率（％）を示す折れ線グラフである。
【図７】図７は、本発明のアミロース粒子（アミロース粒子（実施例１−４））、再結晶により製造した粒子径の小さいアミロース粒子（０．５％アミロース水酸化カリウム溶解）または水を投与した場合の血糖値の上昇を示す折れ線グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースから実質的になるアミロース粒子であって、かつ、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない、アミロース粒子。
【請求項２】
前記アミロースの重量平均分子量が１５，０００〜４５，０００である、請求項１に記載のアミロース粒子。
【請求項３】
前記アミロースの重量平均分子量が１８，０００〜４０，０００である、請求項１に記載のアミロース粒子。
【請求項４】
平均粒子径が１０マイクロメートル以上１０００マイクロメートル以下である、請求項１に記載のアミロース粒子。
【請求項５】
血糖値上昇抑制用の飲食品素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【請求項６】
糞便量を増大させるための飲食品素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【請求項７】
脂質の吸収を抑制させるための飲食品素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【請求項８】
血糖値上昇抑制用の医薬品または医薬部外品の素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【請求項９】
糞便量を増大させるための医薬品または医薬部外品の素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【請求項１０】
脂質の吸収を抑制させるための医薬品または医薬部外品の素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【請求項１１】
重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下の酵素合成アミロースから実質的になるアミロース粒子の製造方法であって、該方法は、
グルカンホスホリラーゼの酵素反応により、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；
該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；
該アミロース粒子を回収する工程；
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記プライマーが、マルトオリゴ糖である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミロース粒子が、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記冷却が、前記アミロース粒子の平均粒子径が１０マイクロメートル以上１０００マイクロメートル以下となる冷却条件で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アミロース粒子を水で洗浄する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のアミロース粒子を含有する飲食品。
【請求項１７】
請求項１に記載のアミロース粒子を含有する医薬品または医薬部外品。
【請求項１】
重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースから実質的になるアミロース粒子であって、かつ、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない、アミロース粒子。
【請求項２】
前記アミロースの重量平均分子量が１５，０００〜４５，０００である、請求項１に記載のアミロース粒子。
【請求項３】
前記アミロースの重量平均分子量が１８，０００〜４０，０００である、請求項１に記載のアミロース粒子。
【請求項４】
平均粒子径が１０マイクロメートル以上１０００マイクロメートル以下である、請求項１に記載のアミロース粒子。
【請求項５】
血糖値上昇抑制用の飲食品素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【請求項６】
糞便量を増大させるための飲食品素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【請求項７】
脂質の吸収を抑制させるための飲食品素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、飲食品素材。
【請求項８】
血糖値上昇抑制用の医薬品または医薬部外品の素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【請求項９】
糞便量を増大させるための医薬品または医薬部外品の素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【請求項１０】
脂質の吸収を抑制させるための医薬品または医薬部外品の素材であって、請求項１に記載のアミロース粒子を含む、医薬品または医薬部外品の素材。
【請求項１１】
重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００で、かつ分子量分散度が１．２５以下の酵素合成アミロースから実質的になるアミロース粒子の製造方法であって、該方法は、
グルカンホスホリラーゼの酵素反応により、重量平均分子量が１２，０００〜５５，０００、かつ分子量分散度が１．２５以下のアミロースを生成させる工程；
該アミロースを含む反応液を冷却してアミロース粒子を形成させる工程；
該アミロース粒子を回収する工程；
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記プライマーが、マルトオリゴ糖である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アミロース粒子が、α−アミラーゼによる分解を実質的に受けない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記冷却が、前記アミロース粒子の平均粒子径が１０マイクロメートル以上１０００マイクロメートル以下となる冷却条件で行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記アミロース粒子を水で洗浄する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のアミロース粒子を含有する飲食品。
【請求項１７】
請求項１に記載のアミロース粒子を含有する医薬品または医薬部外品。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００８−２８０４６６（Ｐ２００８−２８０４６６Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２７４３３（Ｐ２００７−１２７４３３）
【出願日】平成１９年５月１１日（２００７．５．１１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）「国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１８年度生物系特定産業技術研究支援センター「生物系産業創出のための異分野融合研究支援事業」産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）」
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【出願人】（００００００２２８）江崎グリコ株式会社 (187)
【出願人】（５９１１７３２１３）三和澱粉工業株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１１日（２００７．５．１１）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）「国等の委託研究の成果に係る特許出願（平成１８年度生物系特定産業技術研究支援センター「生物系産業創出のための異分野融合研究支援事業」産業活力再生特別措置法第３０条の適用を受けるもの）」
【出願人】（５０５１２７７２１）公立大学法人大阪府立大学 (688)
【出願人】（００００００２２８）江崎グリコ株式会社 (187)
【出願人】（５９１１７３２１３）三和澱粉工業株式会社 (33)
【Ｆターム（参考）】
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