高分子の送達増強のための方法および組成物
本発明は、抗原結合性ポリペプチド等の大きな高分子（すなわち、１０ｋＤａを超えるもの）の、タイトジャンクションを横切る送達を増強する組成物および方法を提供する。そのような方法および組成物は、神経性障害を処置するために、治療用抗原結合性ポリペプチドを鼻腔内投与によってＣＮＳに送達するのに特に有用である。一態様では、本発明は、イムノバインダー（例えば、ｓｃＦｖ）等の１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド、および１つまたは複数の浸透増強剤（例えば、ＰｚペプチドまたはＦＭＯＣペプチド）を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、浸透増強剤に共有結合している。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は２００８年７月１０日に出願された米国仮出願番号第６１／０７９５８６号の優先権を主張し、上記米国仮出願の内容は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、生体膜を横切って分子を送達すること、具体的には、血液脳関門を横切って抗原結合性ポリペプチドを中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することを促進する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
世界保健機構の２００６年の報告によると、世界中の１０億を超える人々が、神経性障害を患っており、そのような障害によって、毎年ほぼ６８０万人が死亡している。抗体等の治療用抗原結合性ペプチドを、過半数とはいかないまでも多数のこれらの神経性障害を処置するために使用することができた。しかし、そのような治療用抗原結合性ペプチドを使用した神経性障害の処置は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切って薬物を送達することに関連する困難によって頻繁に妨害される。
【０００４】
上皮細胞層を横切って分子を送達することを増強する化合物が発見されているが、それら化合物は一般に小分子の送達を増強することにおいてのみ有効であることが示されている。例えば、４−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏペプチドは、上皮細胞層を横切る小分子の輸送を増強することが示されているが、１０ｋＤａ以上の高分子については浸透増強作用が実証されなかった（特許文献１；非特許文献１を参照されたい）。大いに研究されているにもかかわらず、現在、治療用抗原結合性ポリペプチドをＣＮＳに送達するための好都合かつ効率的な方法はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，５３４，４９６号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙｅｎら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９５年、３６巻、２５〜３７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当該分野において、上皮層を横切って、特に、ＣＮＳ障害を処置するためにＣＮＳに、治療用抗原結合性ポリペプチドを特異的に送達することを増強する組成物および方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、少なくとも一部は、抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）等の大きな高分子（すなわち、１０ｋＤａを超えるもの）を、特に鼻粘膜に投与した際に、ＣＮＳに特異的に送達することを増強可能な浸透増強剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）（例えば、ＰｚペプチドまたはＦＭＯＣペプチド）の驚くべき発見に基づく。したがって、本発明は、上皮層を横切って抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）等の大きな高分子（すなわち、１０ｋＤａを超えるもの）を送達することを増強する組成物および方法を提供する。そのような方法および組成物は、神経性障害を処置するために、鼻腔内投与によって抗原結合性ポリペプチド（例えばｓｃＦｖ）をＣＮＳに好都合、効率的、かつ選択的に送達することを可能にするという点で特に有利である。
【０００９】
一態様では、本発明は、イムノバインダー（ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒ（例えば、ｓｃＦｖ））等の１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド、および１つまたは複数の浸透増強剤（例えば、ＰｚペプチドまたはＦＭＯＣペプチド）を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、浸透増強剤に共有結合している。
【００１０】
ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、ＴＮＦアルファ、アミロイドベータ、アミロイドベータ由来拡散性リガンド受容体、モノアミンオキシダーゼＢ、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンデカルボキシラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体（ＧＲＩＮ１としても公知である）、ＧＲＩＮＡ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＧＲＩＮ３Ａ、ＧＲＩＮ３Ｂ、ヒスタミンＨ１受容体、ムスカリン様受容体（ＣＨＲＭ１としても公知である）、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ３、ＣＨＲＭ４、ヒポクレチン受容体１、ヒポクレチン受容体２、５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＴＲ１Ａとしても公知である）、ドーパミン受容体（ＤＲＤ１としても公知である）、ＤＲＤ２、ＤＲＤ３、ＤＲＤ４、ＤＲＤ５、アドレナリンベータ１受容体、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）、およびドーパミンＤ２受容体からなる群より選択される標的抗原、特にＴＮＦアルファに特異的に結合する。
【００１１】
他の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、本明細書の表５、６および７に記載の１つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性または類似性を持つアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。
【００１２】
他の実施形態では、浸透増強剤によって、中枢神経系への抗原結合性ポリペプチドの選択的な鼻腔内送達が促進される。
【００１３】
本発明の組成物は、これらに限定しないが、特に、片頭痛、うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、てんかん、脳卒中、髄膜炎、筋萎縮性側索硬化症、不眠症、髄膜炎、記憶障害、多発性硬化症、ナルコレプシー、脳卒中、外傷性脳損傷、およびストレスを含めた神経性傷害を処置または予防するか、またはその進行を遅延させるための医薬品（または医薬品の製造）に特に有用である。
【００１４】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）、１つまたは複数の浸透増強剤（例えば、ＰｚペプチドまたはＦＭＯＣペプチド）、および使用説明書を含むキットを提供する。
【００１５】
（図面の説明）
本開示の特徴および利点は、以下の詳細な説明を以下の図面と一緒に読むとより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｓｃＦｖを４００μｇ鼻腔内投与した後の、（Ａ）嗅球、（Ｂ）大脳、（Ｃ）小脳、および（Ｄ）脳幹におけるＥＳＢＡ１０５の濃度を追跡する経時的実験を示すグラフである。
【図２】図２は、ＥＳＢＡ１０５を鼻腔内（４００μｇ／ｍＬ）または静脈内（４０μｇ／ｍＬ）のいずれかに投与した後の、（Ａ）嗅球、（Ｂ）大脳、（Ｃ）小脳、（Ｄ）脳幹、および（Ｅ）血清におけるＥＳＢＡ１０５の濃度、ならびに鼻腔内または静脈内のいずれかに同じ濃度（４００μｇ／ｍＬ）のＥＳＢＡ１０５を投与した後の（Ｆ）血清におけるＥＳＢＡ１０５の濃度を比較したグラフである。
【図３】図３は、Ｐｚペプチド有りまたは無しで鼻腔内投与した後の、異なる脳領域におけるＥＳＢＡ１０５の（Ａ）Ｃｍａｘ（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４）および（Ｂ）曝露（ＡＵＣ）脳組織対血中濃度比を示すグラフである。
【図４】図４は、鼻腔内送達後のＥＳＢＡ１０５の鼻腔からＣＮＳへの移動経路を示す図である。投与された化合物は鼻腔から血中に移動し得、血液脳関門を通って最終的に脳組織内に浸透し得る（下の経路）。あるいは、化合物は、嗅神経（Ｎ．ｏｌｆａｃｔｏｒｉｕｓ）軸索を介して（すなわち、細胞内的）かまたは神経周囲的（ｐｅｒｉｎｅｕｒｎａｌｌｙ）（すなわち、細胞外的）に、嗅球、続いて大脳に移動し得る。化合物は、同様に、三叉神経（Ｎ．ｔｒｉｇｅｍｉｎｕｓ）を介して（神経周囲的、すなわち細胞外的に）脳幹、次いで小脳に移動し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（詳細な説明）
（定義）
「浸透増強剤」という用語は、薬物が組織関門（例えば上皮）等の物理的な関門を横切って通過することを増強する任意の組成物を包含する。適切な浸透増強剤としては、４−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル（Ｐｚ）、Ｎ−メチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）、フルオロエニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、およびカルボベンゾキシ（ＣＢＺ）等の保護基にＮ末端で連結された、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号２９）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号３０）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（配列番号３１）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３２）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｌｅｕペプチドが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，４９６号を参照されたい）。
【００１８】
「Ｐｚペプチド」という用語は、Ｐｚ基にＮ末端で連結されたＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）を指す（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，４９６号を参照されたい）。
【００１９】
「ＦＭＯＣペプチド」という用語は、ＦＭＯＣ基にＮ末端で連結されたＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）を指す（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，４９６号を参照されたい）。
【００２０】
「選択的な鼻腔送達」という用語は、分子（例えば、抗原結合性ポリペプチド）を、その分子の濃度が患者の血清よりもＣＮＳにおいて高くなるような条件下で、患者に鼻腔内適用することを指す。
【００２１】
「抗原結合性ポリペプチド」という用語は、少なくともサイズが１０ｋＤａであるポリペプチドを指し、イムノバインダー、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、および抗体断片、ならびに、これらに限定されないが、ＣＴＬＡ−４、テンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）、フィブロネクチン（ＦＮ３）、ネオカルチノスタチン、ＣＢＭ４−２、リポカリン、Ｔ細胞受容体、プロテインＡドメイン（プロテインＺ）、Ｉｍ９、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、設計ＴＰＲタンパク質、亜鉛フィンガー、ｐＶＩＩＩ、鳥類膵臓ポリペプチド、ＧＣＮ４、ＷＷドメイン、Ｓｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）、Ｓｒｃ相同ドメイン２（ＳＨ２）、ＰＤＺドメイン、ＴＥＭ−１βラクタマーゼ、ＧＦＰ、チオレドキシン、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、ＰＨＤフィンガー、ＣＩ−２、ＢＰＴ１、ＡＰＰＩ、ＨＰＳＴＩ、エコチン（ｅｃｏｔｉｎ）、ＬＡＣＩ−Ｄ１、ＬＤＴＩ、ＭＴＩ−ＩＩ、サソリ毒、昆虫デフェンシンＡペプチド、ＥＥＴＩ−ＩＩ、Ｍｉｎ−２３、ＣＢＤ、ＰＢＰ、シトクロムｂ５６２、Ｌｄ１受容体ドメインＡ、γ−クリスタリン、ユビキチン、トランスフェリン、およびＣ型レクチン様ドメイン等の当該分野で公知の代替の足場に基づく抗原結合性ポリペプチドが挙げられる（例えば、Ｂｉｎｚ、２００５年、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６巻、４５９〜６９頁を参照されたい）。
【００２２】
「イムノバインダー」という用語は、抗体の抗原結合部位の全部または一部、例えば、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインの全部または一部を含有する分子を指し、したがって、イムノバインダーは、標的抗原を特異的に認識する。イムノバインダーの非限定的な例として、完全長の免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、さらに、これらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照されたい）；（ｉｖ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単腕（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ）のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなるＤａｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁）、ラクダ抗体（例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６〜４４８頁（１９９３年）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１巻：５００〜５１５頁（２００２年）を参照されたい）またはサメ抗体（例えば、サメＩｇ−ＮＡＲ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））等の単一ドメイン抗体；ならびに（ｖｉｉ）単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域であるナノボディを含めた、抗体断片が挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」の同義語である。本発明による抗体は、免疫グロブリン全体であってもよく、または免疫グロブリンの少なくとも１つの可変ドメインを含むそれらの断片、例としては、単一の可変ドメイン、Ｆｖ（Ｓｋｅｒｒａ Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０巻：１０３８〜４１頁）、ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ， Ｒ．Ｅ． ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻：４２３〜２６頁；Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ．Ｓ．ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：５８７９〜８３頁）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、もしくは当業者に周知のその他の断片であってもよい。
【００２４】
「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって接続されている抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む分子を指す。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般的な構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有し得る。
【００２５】
本明細書で使用する「抗体のフレームワーク」という用語は、可変ドメイン（ＶＬまたはＶＨのいずれか）の一部を指し、これはこの可変ドメインの抗原結合性ループの足場として働く（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、９１〜３２４２頁）。適切なフレームワークの例は、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２１９およびＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２２２に開示されている。
【００２６】
「リンカー」という用語は、２つのドメインを連結する直鎖のアミノ酸配列を指す。本発明のリンカーを、ドメインに遺伝子的および／または化学的に融合させることができる。ある特定の実施形態では、リンカーは、リンカー内に存在する２つのシステイン間で形成されたジスルフィド架橋によって形成されたループを含有する。そのようなリンカーの一般的な構造は、配列番号１８および１９に示す；配列番号１６および１７は、前記リンカーの例示的な実施形態である。さらに適切な最先端のリンカーはＧＧＧＧＳアミノ酸配列の反復からなるか、またはその改変体である。本発明の好ましい実施形態では、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー（配列番号３６）またはその誘導体（例えば配列番号３７に使用される）が使用されるが、１〜３回反復の改変体も可能である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁）。本発明に使用することができる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８巻：７２５〜７３１頁、Ｃｈｏｉら（２００１年）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻：９４〜１０６頁、Ｈｕら（１９９６年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６巻：３０５５〜３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９３巻：４１〜５６頁、およびＲｏｏｖｅｒｓら（２００１年）、Ｃａｎｃｅｒ ｌｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５０巻：５１〜５９頁に記載されている。
【００２７】
ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「改変」または「改変する」という用語は、ポリペプチド配列内へのアミノ酸の付加、またはポリペプチド配列中の既存のアミノ酸の置換の両方を指す。ポリペプチドを改変するのに適したアミノ酸は、すべての公知の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびそれらの機能性誘導体を含む（例えば、それらの全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，０４５，３３７号および第７，０８３，９７０号を参照されたい）。ある特定の実施形態では、この用語は、ポリペプチド配列からのアミノ酸の欠失を指す。
【００２８】
「標的抗原」とは、抗体が特異的に結合する抗原決定基を含有する分子（例えば、１つまたは複数の膜貫通ドメイン、ポリペプチド、ペプチドまたは糖質を有する可溶性タンパク質または膜結合タンパク質）である。
【００２９】
「神経性障害」という用語は、中枢神経系（すなわち、脳および脊髄）に影響を及ぼす恐れがある疾患および障害を含む。
【００３０】
ＣＮＳ障害という用語は、ＣＮＳにおいて顕在化する障害を指す。例として、ＣＮＳ障害は、脳腫瘍または神経性障害であり得る。
【００３１】
「有効量」という用語は、患者において疾患または障害（例えば神経性障害）を部分的、または完全に予防または抑止するのに十分な治療用（例えば、抗原結合性ポリペプチド）の量として定義する。有効量は、疾患または障害の重症度ならびに利用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、利用される特定の化合物の排出速度、処置の持続時間、利用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、病状、全体的な健康および以前の病歴を含めた種々の薬物動態因子、そして医学分野で周知の同様な因子に依存する。
【００３２】
「患者」という用語は、予防処置または治療処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物の被験体を含む。
【００３３】
「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」、および「特異的に結合する」という用語は、所定の抗原上のエピトープへの抗原の結合を指す。典型的には、抗体は、およそ、約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満等、およそ、約１０−７Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する。
【００３４】
本明細書で使用する「同一性」とは、２つのポリペプチド、分子の間、または２つの核酸の間で一致する配列を指す。比較した２つの配列のどちらの位置も同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子それぞれのある位置が、アデニンによって占有されている、または２つのポリペプチドそれぞれのある位置が、リジンによって占有されている場合）、それぞれの分子は、その位置において同一である。２つの配列間の「パーセント同一性」は、２つの配列に共有される一致する位置の数を、比較した位置の数で割った数×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０個の位置のうち６個の位置が一致する場合、２つの配列は６０％の同一性を有する。例として、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは５０％の同一性を共有する（全部で６個の位置のうち３個が一致する）。一般に、比較は最大の同一性が得られるように２つの配列をアライメントして行う。そのようなアライメントは、例えば、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）等のコンピュータプログラムによって好都合に実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３〜４５３頁の方法を使用してもたらすことができる。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｅ． ＭｅｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒ、（Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻：１１〜１７頁（１９８８年））のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップレングスペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４およびレングスウェイト１、２、３、４、５または６を使用して決定することができる。
【００３５】
「類似した」配列は、アライメントした際に、同一のアミノ酸残基および類似したアミノ酸残基を共有している配列であり、類似した残基は、アライメントした参照配列内の対応するアミノ酸残基への保存的置換である。この点に関して、参照配列内の残基の「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似している残基、例えば、類似したサイズ、形、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含めた化学的性質などを有する残基による置換である。したがって、「保存的置換改変された」配列は、１つまたは複数の保存的置換が存在するという点で参照配列または野生型配列と異なる配列である。２つの配列間の「類似性の割合」は、２つの配列に共有される一致する残基または保存的置換を含有する位置の数を、比較した位置の数で割った数×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０個の位置のうち６個が一致し、１０個の位置のうち２個が保存的置換を含有する場合、その２つの配列は８０％の正の類似性を有する。
【００３６】
本明細書で使用する「保存的配列改変」という用語は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に負の影響を及ぼすかまたは変化を与えることのないアミノ酸改変を指すものとする。そのような保存的配列改変は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加および欠失を含む。例えば、改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発等の当該分野で公知の標準技法によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換わったものを含む。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐した側鎖を持つアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、ヒト抗ＶＥＧＦ抗体内の予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられることが好ましい。抗原結合性を除去しない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２巻：１１８０〜１１８７頁（１９９３年）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１２巻（１０号）：８７９〜８８４頁（１９９９年）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９４巻：４１２〜４１７頁（１９９７年）を参照されたい）。
【００３７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の一般的な業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものに類似のまたはそれらと同等な方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。対立が生じた場合には、定義を含む、本明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は、例証のために限られ、本発明を限定するものではない。
【００３８】
本発明の種々の態様を、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載する。種々の実施形態を随意に組み合わせることができることが理解されるべきである。
【００３９】
（改良した抗原結合性ポリペプチド組成物）
一態様では、本発明は、抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）等の治療用ポリペプチドを、組織関門を横切って、より具体的には鼻粘膜を横切ってＣＮＳに送達することを増強するための組成物を提供する。そのような組成物は、一般に、抗原結合性ポリペプチドおよび浸透増強剤を含む。これらの組成物は、中枢神経系への抗原結合性ポリペプチドの選択的鼻腔内送達が可能であるという点で特に有利である。今日、生物製品は、典型的には、全身投与され、したがって高用量の薬物および／またはそれを必要とする生物を薬物に供することが必要とされている；あるいは、生物製品は、頭側カニューレによって投与される可能性がある。したがって、本発明により、抗原結合性ポリペプチドを必要とする被験体の生活の質が著しく改善される。
【００４０】
任意の抗原結合性ポリペプチドが、本発明の方法で使用するのに適している。ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドはｓｃＦｖ等のイムノバインダーである。そのようなｓｃＦｖは、その内容が参照によって本明細書に援用されるＷＯ０９／００００９８に記載されたもののような安定性および溶解性が高いフレームワーク領域を含むことが好ましい。特定の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、表５、６および７に記載の１つまたは複数のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）の類似性を持つアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、ｓｃＦｖは、表５、６および７に記載の１つまたは複数のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性、好ましくは８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。
【００４１】
好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、または配列番号２７に対して少なくとも８０％（例えば８５％、９０％、９５％または９９％）の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するフレームワーク配列を含む。
【００４２】
別の実施形態では、前記ｓｃＦｖは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号３５に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。それに加えてまたはその代わりに、前記ｓｃＦｖは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号３４に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。一実施形態では、前記ＶＨおよび／またはＶＬは、リンカーによって連結されて、一般的な構造ＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨを有する分子を生じる。前記リンカー分子は、例えば、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選択することができ、またはそれらに対して少なくとも８０％の類似性を有する配列である。
【００４３】
好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号３３に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。
【００４４】
任意の浸透増強剤を本発明の組成物に使用することができる。ある特定の実施形態では、浸透増強剤は、保護基に連結されたペプチドまたはペプチド模倣物である。本発明で使用するのに適したペプチドは、天然アミノ酸、天然ではないアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、およびアミノ酸誘導体を含めた任意の公知のアミノ酸を含有し得る。特定の実施形態では、浸透増強剤は、４−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル（Ｐｚ）、Ｎ−メチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）、フルオロエニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、およびカルボベンゾキシ（ＣＢＺ）等の保護基にＮ末端で連結されたＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号２９）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号３０）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（配列番号３１）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３２）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｌｅｕからなる群から選択されるペプチドである（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，４９６号を参照されたい）。好ましい実施形態では、浸透増強剤は、Ｐｚ基またはＦＭＯＣ基にＮ末端で連結されたＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）である（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，４９６号を参照されたい）。
【００４５】
浸透増強剤および抗原結合性タンパク質が、単一の薬学的組成物で標的組織に一緒に送達（ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒ）されてもよく、または浸透増強剤および抗原結合性タンパク質の送達が、別個の組成物で投与することによって時間的に隔てられてもよいことは、本発明の範囲内と考える。
【００４６】
さらに、浸透増強剤が、抗原結合性タンパク質に結合体化されてもよいことも本発明の範囲内と考える。当該分野で公知の物理的または化学的な結合体化様式すべてが考えられる。化学基をアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物に結合体化するために、当該分野で公知の任意の適切な化学を利用することができる。リジン残基、システイン残基およびヒスチジン残基を含めた、抗原結合性タンパク質の任意のアミノ酸残基に結合体化することができる。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、上記の抗原結合性タンパク質と一緒に送達するのに適した追加の化合物を含んでもよい。そのような薬物として、小分子、向知性薬（ｎｏｏｔｒｏｐｉｃ）、ポリペプチド、およびオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明の組成物は、これらに限定されないが、粘膜上皮（例えば鼻の上皮）および角膜組織を含めた任意の生体膜のタイトジャンクションを横切って、抗原結合性タンパク質を送達するために使用することができる。鼻の上皮に本発明の組成物を投与すると、抗原結合性タンパク質が、好ましくは血流に第一に入ることなくＣＮＳに直接的かつ特異的に送達されるので、特に好ましい標的膜は鼻の上皮である。
【００４９】
（ＣＮＳ障害の処置）
本発明の組成物は、そのような組成物によって、鼻粘膜を介して抗原結合性ポリペプチドをＣＮＳに直接的かつ選択的に送達することが可能になるので、ＣＮＳ障害を処置または予防するか、および／またはその進行を遅延させるのに特に適している。本発明の組成物を使用して処置するのに適切な障害として、行動／認知症候群、頭痛障害（例えば、片頭痛、群発頭痛および緊張性頭痛）、てんかん、外傷性脳損傷、神経変性障害（例えば、副腎脳白質ジストロフィー）、アルコール症、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリグ病としても公知である）、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病（シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病としても公知である）、ウシ海綿状脳症、キャナヴァン病、脳性麻痺、コケーン症候群、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、家族性致死性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連痴呆、ケネディ症候群、クラッベ病、レヴィー小体痴呆、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病（３型脊髄小脳性運動失調）、多系統萎縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェーウス‐メルツバッヒャー病、ピック病、原発性側索硬化症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性の貧血に続発する脊髄の亜急性連合変性症（Ｓｕｂ−ａｃｕｔｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、脊髄小脳性運動失調症、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルスゼフスキー症候群、背側ろう、および中毒性脳症、脳血管障害（例えば、一過性脳虚血発作および脳卒中）、睡眠障害、脳性麻痺、感染症（例えば、脳炎、髄膜炎、および脊髄炎）、新生物（例えば脳および脊髄腫瘍）、運動障害（例えば、片側バリズム、チック障害、およびジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群）、ＣＮＳの脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症、ギラン・バレ症候群、および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー）、末梢神経の障害（例えば、ミオパチーおよび神経筋接合部）、精神状態の変化（例えば、脳症、昏迷、および昏睡）、言語障害、腫瘍随伴性神経学的症候群、および明白な生理学的原因がない機能的な神経学的症候群を有する症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
したがって、別の態様では、本発明は中枢神経系の疾患または障害を処置または予防する方法を提供し、その方法は、疾患または障害が処置または予防されるように、その処置を必要とする被験体の鼻粘膜に、抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）および浸透増強剤（例えばＰｚペプチド）を含む組成物を有効量投与することを含む。
【００５１】
さらに別の態様では、本発明は被験体の中枢神経系に抗原結合性ポリペプチドを選択的に送達する方法を提供し、その方法は、抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）および浸透増強剤（例えばＰｚペプチド）を含む組成物を被験体の鼻粘膜と接触させることを含み、それによって抗原結合性ポリペプチドが直接的かつ選択的に中枢神経系に送達される。
【００５２】
（標的抗原）
本発明の方法で使用される抗原結合性ポリペプチドは、１つまたは複数の特異的な標的抗原に結合し得る。適切な標的抗原としては、ＴＮＦアルファ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００５８５．２）、アミロイドベータ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００４７５．１）、アミロイドベータ由来拡散性リガンド受容体（例えば、ＷＯ／２００４／０３１４００を参照されたい）、モノアミンオキシダーゼＢ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８８９．３）、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンデカルボキシラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８１．１）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿９４２１３１．１）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体（ａｅｃｅｐｔｏｒ）（ＧＲＩＮ１としても公知である）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２３．４）、ＧＲＩＮＡ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２８．１）、ＧＲＩＮ２Ｄ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２７．２）、ＧＲＩＮ２Ｃ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２６．２）、ＧＲＩＮ３Ｂ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿６１９６３５．１）、ＧＲＩＮ２Ａ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２４．１）、ＧＲＩＮ２Ｂ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２５．２）、ＧＲＩＮ３Ａ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５９７７０２．２）、ヒスタミンＨ１受容体（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８５２．１）、ムスカリン様受容体（ＣＨＲＭ１としても公知である）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７２９．２）、ＣＨＲＭ２（ＮＰ＿０００７３０．１）、ＣＨＲＭ３（ＮＰ＿０００７３１．１）、ＣＨＲＭ４（ＮＰ＿０００７３２．２）、ヒポクレチン受容体１（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１５１６．２）、ヒポクレチン受容体２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１５１７．２）、５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＴＲ１Ａとしても公知である）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００５１５．２）、ドーパミン受容体（ＤＲＤ１としても公知である）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８５．１）、ＤＲＤ２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８６．１）、ＤＲＤ３（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８７．２）、ＤＲＤ４（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８８．２）、ＤＲＤ５（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８９．１）、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１０３４．１）、アドレナリンベータ１受容体（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００６７５．１）およびドーパミンＤ２受容体（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８６．１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
（処方）
本発明の別の態様は、本発明の抗原結合性ポリペプチド／浸透増強剤組成物の薬学的処方に関係する。そのような処方は、典型的には１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド、１つまたは複数の浸透増強剤、および薬学的に許容できる担体を含む。本明細書で使用する「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合する、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。担体は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所（例えば、眼、皮膚、または上皮層への）投与、吸入による投与、非経口投与、脊髄投与または上皮投与（例えば、注射または注入によって）に適することが好ましい。投与経路に応じて、抗原結合性ポリペプチド／浸透増強剤組成物は、化合物を不活性化する恐れがある、酸による作用および他の自然条件から化合物を保護するために、材料でコーティングすることができる。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩を含んでもよい。「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物の望ましい生物活性を保持し、任意の望ましくない毒性作用を与えない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ， Ｓ． Ｍ．ら（１９７７年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．、６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。そのような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等の無毒性無機酸由来の塩、ならびに例えば、脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸等の無毒性有機酸由来の塩が挙げられる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属由来の塩、ならびに例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の無毒性有機アミンに由来する塩が挙げられる。
【００５５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤も含んでもよい。薬学的に許容できる抗酸化剤の例としては、（１）例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性抗酸化剤；（２）例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロール等の油溶性抗酸化剤；および（３）例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤が挙げられる。
【００５６】
本発明の薬学的組成物に利用することができる適切な水性担体および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物、オリーブ油等の植物油、ならびにオレイン酸エチル等の注射可能有機エステルが挙げられる。例えば、レシチン等のコーティング材料を使用することによって、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。
【００５７】
これらの組成物は、保存料、加湿薬、乳化剤および分散剤等のアジュバントも含有してもよい。微生物の存在の予防は、上記の滅菌手順、ならびに種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含めることの両方によって確実にすることができる。また、例えば糖、塩化ナトリウム等の等張剤をこの組成物に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤を含めることによって、注射可能薬学的形態の持続的な吸収を導くことができる。
【００５８】
薬学的に許容できる担体は、滅菌水溶液または滅菌分散液および滅菌注射可能溶液または滅菌注射可能分散液を即時調製するための滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の薬学的組成物へのその使用が考えられる。追加の活性化合物も組成物中に組み込むことができる。
【００５９】
薬学的組成物は、典型的には、製造および保管の条件下で滅菌されていて、かつ安定でなければならない。この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の規則的構造体として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチン等のコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによって、注射可能組成物の持続的な吸収を導くことができる。
【００６０】
滅菌注射可能溶液は、適切な溶媒中に、必要量の活性化合物と上記に列挙した成分の１つまたはそれらの組み合わせを必要に応じて一緒に組み込み、続いて微細濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本の分散媒および上記に列挙したものからの必要な他成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ滅菌ろ過したその溶液から、活性成分に任意の追加の所望の成分を加えた粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドライ（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である。
【００６１】
単回投与剤形を生成するための担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される被験体および特定の投与様式によって変わる。単回投与剤形を生成するための、担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、薬学的に許容できる担体と組み合わせて、１００パーセント中、この量は約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。
【００６２】
最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすために投与レジメンを調節する。例えば、単回ボーラス投与してもよく、いくつかに分けた用量を徐々に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示される通りに、用量を比例的に低下または増加させてもよい。投与を容易にし、用量を均一にするために、非経口用組成物を単位用量剤形に処方することが特に有利である。本明細書で使用する単位用量剤形とは、処置される被験体に対する単位用量として適合させた物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位用量剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特な特性および実現すべき特定の治療効果、および（ｂ）個体における感受性の処置のためのそのような活性化合物を化合する技術分野に固有の制限によって決定され、直接左右される。
【００６３】
本発明の別の態様は、本発明の薬学的組成物の投与方法である。代表的な送達レジメンが経口非経口（皮下、筋肉内、および静脈内を含む）、直腸、頬側、舌下、肺、経皮、鼻腔内、および経口を含み得ることは本発明の範囲内と考える。好ましい送達レジメンはである。
【００６４】
鼻腔内投与するために、固体または液体いずれかの担体を使用することができる。固体担体は、例えば、約２０〜約５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗い粉末を含み、そのような処方物は鼻道を通じて迅速に吸入されることによって投与される。液体担体が使用される場合、処方物はスプレー式点鼻薬または点鼻液として投与することができ、活性成分の油溶液または水溶液を含んでもよい。
【００６５】
鼻腔内投与に適した処方物は、活性化合物を含有し、望ましくは０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有する粒子がレシピエントの気管支樹内に送達されるようにもたらされる。一可能性として、そのような処方物は、吸入装置で使用するための穴があくカプセル、適切には、例えばゼラチンのカプセルで、あるいは、活性化合物、適切な液体または気体の噴霧剤、および場合によって界面活性剤および／または固体希釈剤等の他の成分を含む自己噴霧処方物としてのいずれかで好都合にもたらされ得る、細かく粉砕された粉末の形態である。適切な液体噴霧剤はプロパンおよびクロロフルオロカーボンを含み、適切な気体噴霧剤は二酸化炭素を含む。自己噴霧処方物は、活性化合物が溶液または懸濁物の液滴の形態で調剤される場合にも利用することができる。そのような自己噴霧処方物は、当該分野で公知の自己噴霧処方物に類似し、確立された手順によって調製することができる。自己噴霧処方物は、所望の噴霧特性を有する手動または自動いずれかの機能性バルブを備えた容器でもたらされることが適切であり、このバルブが、操作されるごとに固定量、例えば２５〜１００μｌを送達する計量型のバルブであることが有利である。別の可能性として、活性化合物は、加速気流または超音波攪拌を利用して吸入用の細かい液滴ミストを生じるアトマイザーまたはネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｓｅｒ）で使用するための溶液または懸濁物の形態であってもよい。鼻腔内で保持可能にするために、調剤する際、そのような処方物は、望ましくは１０〜２００ミクロンの範囲の粒子直径を有するべきであり、これは、必要に応じて適切な粒子サイズの粉末を使用すること、または適切なバルブを選出することによって実現することができる。他の適切な処方物は、鼻に近づけて保持した容器から鼻道を通って迅速吸入することによって投与するための、２０〜５００ミクロンの範囲の粒子直径を有する粗い粉末、および水性または油性の溶液または懸濁物中、０．２〜５％ｗ／ｖの活性化合物を含む点鼻液を含む。
【００６６】
（組成物の使用）
本発明の組成物は、例えば、神経性障害を処置、予防するか、および／またはその進行を遅延させるための医薬品として使用することができる。したがって、本明細書で開示する組成物は、神経性障害の処置または予防に有用な医薬品の製造に使用することができる。
【００６７】
好ましい実施形態では、そのような障害は、片頭痛、うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、てんかん、脳卒中、髄膜炎、筋萎縮性側索硬化症、不眠症、髄膜炎、記憶障害、多発性硬化症、ナルコレプシー、脳卒中、外傷性脳損傷、およびストレスからなる群より選択される。
【００６８】
組成物は、鼻腔内送達用に処方されることが好ましい。
【実施例】
【００６９】
（実施例）
本開示を以下の実施例によってさらに例示するが、さらに限定するものであると解釈されるべきではない。
【００７０】
一般に、本発明の実行には、別段の指定がない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、および免疫学（特に、例えば免疫グロブリンの技術）の従来の技法を利用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０頁、Ｐａｕｌ， Ｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、１６９頁）， ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ｉｒｌ Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら、 Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ． Ｐｒｅｓｓ， Ｐｕｂ．（１９９９年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２年）を参照されたい。例えば、Ｐｏｌｙｔｈｅｒｉｃｓ ＵＳ６８０３４３８；ＥＰ１７０１７４１Ａ２；ＥＰ１６４８５１８Ａ２；Ｗ００５０６５７１２Ａ２；ＷＯ０５００７１９７Ａ２；ＥＰ１４９６９４１Ａ１；ＥＰ１２２２２１７Ｂ１；ＥＰ１２１００９３Ａ４；ＥＰ１４６１３６９Ａ２；ＷＯ０３０８９０１０Ａ１；ＷＯ０３０５９９７３Ａ２；およびＥＰ１２１００９３Ａ１）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ＵＳ２００７００９２９４０Ａ１およびＥＰ１２４０３３７Ｂ１；およびＥＳＢＡＴｅｃｈ Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８９９，９０７、ＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２２５、ＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２２２，ＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２２２、ＷＯ０６／１３１０１３およびＷＯ０３０９７６９７Ａ２も参照されたい。
【００７１】
（ＥＳＢＡ１０５の精製）
分子量２６．３ｋＤａの抗ＴＮＦアルファ単鎖抗体断片であるＥＳＢＡ１０５を、前述の通りＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞から精製した（Ｆｕｒｒｅｒら（２００９年）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、５０巻、７７１〜７７８頁；Ｏｔｔｉｇｅｒら（２００９年）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、５０巻、７７９〜７８６頁）。簡単に述べると、ＥＳＢＡ１０５を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）での組換え発現、封入体からのリフォールディング、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって作製した。動物試験のために、ＥＳＢＡ１０５を５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．５）中、１０ｍｇ／ｍｌ（鼻腔内投与用）または０．５ｍｇ／ｍｌ（静脈注射用）で処方した。ＬＡＬ凝固アッセイで決定したエンドトキシン含有量は、インビボ実験に使用したすべての処方物中で０．１ＥＵを下回った。
【００７２】
（エバンスブルーの鼻腔内投与）
タンパク質をＣＮＳにターゲティングするための最適条件を、０．９％ＮａＣｌ中０．３％エバンスブルーを、鼻腔内経路を介してＢａｌｂ／ｃマウスに投与することによって最初に決定した。次いで動物を、事前に決めた時点においてＣＯ２吸入によって屠殺し、その肺および胃を収集し、エバンスブルーの存在について視覚的に検査した。動物を仰臥位でのイソフルラン（Ｐｒｏｖｅｔ、Ｌｙｓｓａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）による麻酔下に保ち、各鼻孔を、エバンスブルー２μｌで、５分間隔で、合計４０μｌに達するまで（４５分）処置することによって最適条件を得た（表１）。結果的に、本明細書に記載のすべての実施形態における、ＥＳＢＡ１０５の鼻腔内投与のためにこのプロトコルを使用した。
【００７３】
（ＥＳＢＡ１０５の鼻腔内投与および静脈内投与）
すべての動物の前採取血液（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）を、ＥＳＢＡ１０５を用いた鼻腔内または静脈内への投薬の１０日前に採取した。イソフルラン（Ｐｒｏｖｅｔ、Ｌｙｓｓａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）による麻酔下でＥＳＢＡ１０５の鼻腔内投与を行った。マウスを仰臥位に置き、合計４０μｌ（４００μｇ）のＥＳＢＡ１０５を、２μｌの液滴をピペットで取り、各鼻孔に５分ごと、全部で４５分間にわたって処置することによって投与した。鼻腔内ＰＫ試験のために、最初の鼻腔内点滴注入の１、２、４、６、８、１０、１２、および２４時間後に、４匹の動物を屠殺した。一部の実験では、一過的、可逆的にタイトジャンクションの開口を誘発することによって傍細胞マーカーの輸送を容易にする浸透増強剤であるＰｚペプチド（４−フェニルアゾベンゾキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ；Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（ＹｅｎおよびＬｅｅ（１９９４年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、２８巻、９７〜１０９頁）３ｍＭをＥＳＢＡ１０５処方物に加えた。最初の投与の１、２、および４時間後に４匹の動物を屠殺した。静脈内注射するために、マウスを拘束器（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｒ）に置き、４０μｇ（８０μｌ）のＥＳＢＡ１０５を尾静脈に注射した。静脈内用量は、４００μｇのＥＳＢＡ１０５の鼻腔内投与で、期間４時間にわたって観察された血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）に従って、全身曝露に最も近づくように選出した。各時点（１、２、および４時間）で２匹の動物を屠殺した。屠殺する際に、マウスをケタミン（Ｋｅｔａｓｏｌ１００、６５ｍｇ／ｋｇ；Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ、１３ｍｇ／ｋｇ；Ｐｒｏｖｅｔ、Ｌｙｓｓａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびアセプロマジン（Ｐｒｅｑｕｉｌｌａｎ、２ｍｇ／ｋｇ；Ａｒｏｖｅｔ、Ｚｏｌｌｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の混合物を用いて深く麻酔した。血液試料を心臓穿刺によって採取した後、ＰＢＳ２０ｍｌを用いてマウスを灌流した。脳を慎重に収集し、嗅球、視床および視床下部を含む大脳、小脳ならびに脳幹に解剖した。その組織を秤量し、ドライアイス上で凍結させ、分析するまで−８０℃で保管した。
【００７４】
（組織の調製）
分析のために組織を下記の通り調製した。溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、０．１％ＳＤＳ、プロテイナーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））１００μｌを、脳組織１５ｍｇに加えた。組織を５秒間超音波処理し（８サイクル、強度１００％）（Ｓｏｎｏｐｌｕｓ、Ｂａｎｄｅｌｉｎ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、遠心分離し、その上清をＥＬＳＡに基づくＥＳＢＡ１０５濃度の決定に供した。
【００７５】
（血清および脳組織におけるＥＳＢＡ１０５の定量化）
ＥＳＢＡ１０５濃度を、各試料を直接ＥＬＳＡにおいて３連で測定することにより決定した。９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｏｍｎｉｌａｂ、Ｍｅｔｔｍｅｎｓｔｅｔｔｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を０．５μｇ／ｍｌのヒトＴＮＦアルファ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を用いて、ＰＢＳ中、４℃で一晩コーティングした。続くステップの各間に、マイクロプレートウォッシャー（ＡＳＹＳ Ａｔｌａｎｔｉｓ、Ｓａｌｚｂｕｒｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、ＴＢＳ−Ｔ（０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０；Ａｘｏｎ Ｌａｂ、Ｂａｄｅｎ−Ｄａｅｔｔｗｙｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）用いてプレートを３回洗浄した。ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０中で１．５時間インキュベートすることによって非特異的結合部位を飽和させた。各試料の前希釈物を、それぞれのマトリックス（嗅球、大脳、小脳、脳幹または血清）１０％を含有する希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）に調製した。希釈緩衝液／それぞれのマトリックス１０％において、ＥＳＢＡ１０５の標準の参照希釈系列（５０〜０．５ｎｇ／ｍｌ）を調製した。次いで、前希釈した試料および標準の参照希釈液をウェルに加え、プレートを室温で１．５時間インキュベートした。希釈緩衝液中に１：２０，０００希釈したビオチン化したアフィニティ精製したポリクローナルウサギ抗ＥＳＢＡ１０５抗体（ＡＫ３Ａ、ＥＳＢＡＴｅｃｈ、Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、結合したＥＳＢＡ１０５を検出した（１．５時間、室温）。今度は、ＡＫ３Ａを、０．２ｎｇ／ｍｌ（希釈緩衝液）の濃度で、ポリ−西洋ワサビペルオキシダーゼストレプトアビジン（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて検出した。ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をペルオキシダーゼの基質として使用し、呈色反応を、２〜２０分後に（呈色の強度による）、１ＭのＨＣｌを加えることによって停止させた。プレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ；Ｔｅｃａｎ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、試料中のＥＳＢＡ１０５の濃度を、標準曲線からの多項回帰によって計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０３；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ＥＳＢＡ１０５の定量下限濃度（ＬＯＱ）は、それぞれ、血清において５ｎｇ／ｍｌおよび脳組織において３３ｎｇ／ｍｌであった。数学的評価およびグラフ表示のために、生じたシグナルが定量化の下限を下回った希釈していない試料をＬＯＱに設定した。
【００７６】
（実施例１）
（鼻腔内投与の様式）
本実施例は、鼻への低量投与がＣＮＳへの特異的送達をもたらすことを実証する。ＣＮＳに薬物を効率的かつ特異的に送達するために、適用された物質が鼻腔内に残存する必要があるが、いくつかの研究により、鼻腔内に適用された物質は、呼吸および経口摂取によって呼吸器系および消化管に移動する可能性があることが示されている（Ｅｙｌｅｓら（１９９９年）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ、１８９巻、７５〜７９頁；Ｋｌａｖｉｎｓｋｉｓら（１９９９年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６２巻、２５４〜２６２頁；Ｌｕｎｄｈｏｌｍら（１９９９年）Ｖａｃｃｉｎｅ、１７巻、２０３６〜２０４２頁；Ｔｒｏｌｌｅら（２０００年）Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻、２９９１〜２９９８頁）。いくつもの態様（例えば、麻酔、動物の体位、ならびに投与の量および頻度）が、鼻腔内に投与された化合物の滞留時間に影響を与え得ることが当業者には理解される。上記の鼻腔内投与プロトコルを使用して、エバンスブルーを、鼻腔内適用後に色素の投与後分布を査定するためのトレーサーとして使用した。エバンスブルー４０〜５０μｌを、いくつかの異なる方法によって鼻腔内投与した。第１に、仰臥位に保持した、麻酔したマウスまたは機敏なマウスのいずれかに単一用量を与え、その結果、どちらの場合においても肺および胃の両方に色素が移動した。第２に、麻酔した動物に、たった３分の代わりに、仰臥位で３０〜５０分間単一用量を与えた。第３に、色素量を２つの別々の１０μｌ用量で、５分間隔で投与した。これらのどちらの方法でも、エバンスブルーの肺および胃への移動は低下しなかった。最後に、仰臥位の麻酔した動物に、２μｌという低量を適用し、その結果、肺におけるエバンスブルーの痕跡は最小限のみであり、胃における青色染色は全くなかった（表１）。
【００７７】
（実施例２）
（ＥＳＢＡ１０５のＣＮＳへの送達）
本実施例は、ｓｃＦｖの鼻腔内投与がｓｃＦｖのＣＮＳへの送達をもたらすことを実証する。ＥＳＢＡ１０５（配列番号１）は、ＴＮＦアルファに特異的に結合し、阻害する単鎖抗体である（例えば、参照によって本明細書に援用されるＷＯ０６／１３１０１３を参照されたい）。上記のプロトコルによって鼻腔内投与した後、ＥＳＢＡ１０５は、分析したすべての脳領域において著しい濃度に達し、時間とともに二峰性の分布を示した。小脳および脳幹において、最初に滴下した１時間後にＥＳＢＡ１０５の最大濃度（Ｃｍａｘ）に達し、嗅球および大脳における濃度はその１時間後にピークに達した。それからＥＳＢＡ１０５レベルはすべての脳領域において低下したが、嗅球、小脳、および脳幹において、６〜１２時間後に再び上昇して明らかな第２の、より低いレベルの濃度ピークが生じ（図１）、これは、２つの異なる移動経路が存在する可能性があることを実証している。最高濃度を、嗅球および脳幹において測定した。嗅覚系（Ｎ．ｏｌｆａｃｔｏｒｉｕｓ）を通じて鼻腔につながっている嗅球において、濃度は９４５５ｎｇ／ｍｌで最高に達した。末梢三叉神経系（Ｎ．ｔｒｉｇｅｍｉｎｕｓ）を通じて鼻道につながっている脳幹では濃度はさらに高かった（１１０６７ｎｇ／ｍｌ）（表２）。大脳におけるＣｍａｘ（９７５ｎｇ／ｍｌ）は、少し遅く（２時間）、小脳または嗅球よりも、それぞれ約７〜１０分の１低かった。これらの結果は、ＥＳＢＡ１０５はまず嗅球および脳幹に達し、そこから大脳および小脳に分布することを実証している。脳幹および小脳と同様に、血清ではＥＳＢＡ１０５を最初に投与した１時間後にＣｍａｘに達し、５〜１０時間の間に二度目のピークに達した。興味深いことに、最後の１２時間の間、ＥＳＢＡ１０５レベルはほぼ一定のままであった（図１）。
【００７８】
（実施例３）
（ＥＳＢＡ１０５のＣＮＳへの送達は直接的である）
本実施例は、ＥＳＢＡ１０５の鼻腔内投与が血流を介してではなく、直接ＣＮＳへの送達をもたらすことを実証する。ＥＳＢＡ１０５が、直接ＢＢＢを通って鼻腔からＣＮＳへ移動するのか、または全身吸収および続く脳へのＢＢＢ経由の送達によって間接的に移動するのかを決定するために、鼻腔内投与について上記の静脈内注射と並べて比較した。静脈内注射した後には、ＥＳＢＡ１０５の濃度が定量化の下限を下回った大脳を除いて、分析した領域すべてにおいて、ＥＳＢＡ１０５は相当の濃度に達した。しかし、鼻腔内投与後には、すべての脳領域において相当により高い薬物濃度を測定した（図２）。鼻腔内投薬したときの小脳および脳幹における最大ＥＳＢＡ１０５レベルは、静脈内注射後の最大ＥＳＢＡ１０５レベルよりも約１０〜１８倍高かった。さらに、嗅球におけるＣｍａｘは、静脈内投与に対して鼻腔内投与については６０倍を超えて高かった（表３）。驚くべきことに、投薬はどちらの経路についても同様の全身曝露を生じるように設定したにもかかわらず、鼻腔内投与後の血清濃度は明らかに低く（図２）、６００６ｎｇ／ｍｌに達した一方、静脈内注射後のＣｍａｘは１０倍を超えて高かった（６３７０９ｎｇ／ｍｌ）（表３）。静脈内注射後、嗅球、小脳および脳幹における最大濃度（Ｃｍａｘ）および曝露（ＡＵＣ）は同様の値に達し、それぞれ、Ｃｍａｘについては２０２ｎｇ／ｍｌ、２５７ｎｇ／ｍｌ、および１７４ｎｇ／ｍｌであり、ＡＵＣについては４４８ｎｇ−ｈ／ｍｌ、５６７ｎｇ−ｈ／ｍｌ、および４１６ｎｇ−ｈ／ｍｌであった。脳組織において、静脈内注射２時間後にＣｍａｘになり、４時間後にＥＳＢＡ１０５を検出しなかった。対照的に、鼻腔内投与後に、すべての脳領域において明らかにより高い濃度を測定した。最高値は嗅球で得られ（Ｃｍａｘ：１２５８６ｎｇ／ｍｌ；ＡＵＣ；２３１３０ｎｇ−ｈ／ｍｌ）、次いで脳幹（Ｃｍａｘ：３１６９ｎｇ／ｍｌ；ＡＵＣ；７９４２ｎｇ−ｈ／ｍｌ）、小脳（Ｃｍａｘ：２８１９ｎｇ／ｍｌ；ＡＵＣ：５９０８ｎｇ−ｈ／ｍｌ）および大脳（Ｃｍａｘ：１８３１ｎｇ／ｍｌ；ＡＵＣ：２９５１ｎｇ−ｈ／ｍｌ）であった。さらに、静脈内注射と対照的に、鼻腔内投与の４時間後に、すべての脳領域においてＥＳＢＡ１０５はなお検出可能な濃度であった。これらの結果は、ＥＳＢＡ１０５は、血液からＢＢＢを横切ってＣＮＳに浸透することができ、最も効率的な送達経路は鼻腔内投与によるものであることを実証している（表３）。
【００７９】
（実施例４）
（ＰＺペプチドは、ＥＳＢＡ１０５のＢＢＢを横切る送達を改善する）
本実施例は、Ｐｚペプチドが、ｓｃＦｖのＣＮＳへの鼻腔内送達を著しく増強することを実証する。特に、Ｐｚペプチドの、ＢＢＢを通って薬物を輸送するための浸透増強剤として機能する能力を、ＥＳＢＡ１０５に３ｍＭのＰｚペプチドを加え、脳への輸送を査定することによって試験した。Ｐｚペプチドの存在下で、嗅球、大脳および小脳において、ＥＳＢＡ１０５単独よりも早くＣｍａｘに達した（最初の投薬後２時間に代わって１時間）（表４）。さらに、Ｐｚペプチドを加えることにより、嗅球および大脳におけるＣｍａｘが２〜３倍増加し（それぞれ、７３０９〜１５７８６ｎｇ／ｍｌおよび１１３３〜３４１７ｎｇ／ｍｌ）、一方脳幹におけるＣｍａｘは変化がないままであった。Ｃｍａｘの組織対血中比は、嗅球および大脳において、ＥＳＢＡ１０５単独よりもＥＳＢＡ１０５とＰｚペプチドとを同時投与した方が明らかに高かった（図３Ａ）。しかし、小脳、脳幹および血清への送達に対する影響は、あまりはっきりしなかった。要約すると、Ｐｚペプチドによって、分子量が大きいタンパク質を、全身曝露を増加させることなく嗅球および大脳に送達することを増強することができる（図３）。したがって、治療への適用に関して、Ｐｚペプチドによって、全身性副作用の危険性を増加させることなく薬物送達が増強され得る（表４）。
【００８０】
【表１】
【００８１】
【表２】
【００８２】
【表３】
【００８３】
【表４】
【００８４】
【表５−１】
【００８５】
【表５−２】
【００８６】
【表５−３】
【００８７】
【表６】
【００８８】
【表７−１】
【００８９】
【表７−２】
【００９０】
【表７−３】
【００９１】
【表８】
（等価物）
当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または日常的な実験のみを使用して、それらを究明することも可能である。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
この出願は２００８年７月１０日に出願された米国仮出願番号第６１／０７９５８６号の優先権を主張し、上記米国仮出願の内容は、参照によって本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、生体膜を横切って分子を送達すること、具体的には、血液脳関門を横切って抗原結合性ポリペプチドを中枢神経系（ＣＮＳ）に送達することを促進する組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
世界保健機構の２００６年の報告によると、世界中の１０億を超える人々が、神経性障害を患っており、そのような障害によって、毎年ほぼ６８０万人が死亡している。抗体等の治療用抗原結合性ペプチドを、過半数とはいかないまでも多数のこれらの神経性障害を処置するために使用することができた。しかし、そのような治療用抗原結合性ペプチドを使用した神経性障害の処置は、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切って薬物を送達することに関連する困難によって頻繁に妨害される。
【０００４】
上皮細胞層を横切って分子を送達することを増強する化合物が発見されているが、それら化合物は一般に小分子の送達を増強することにおいてのみ有効であることが示されている。例えば、４−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏペプチドは、上皮細胞層を横切る小分子の輸送を増強することが示されているが、１０ｋＤａ以上の高分子については浸透増強作用が実証されなかった（特許文献１；非特許文献１を参照されたい）。大いに研究されているにもかかわらず、現在、治療用抗原結合性ポリペプチドをＣＮＳに送達するための好都合かつ効率的な方法はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，５３４，４９６号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｙｅｎら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９５年、３６巻、２５〜３７頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当該分野において、上皮層を横切って、特に、ＣＮＳ障害を処置するためにＣＮＳに、治療用抗原結合性ポリペプチドを特異的に送達することを増強する組成物および方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、少なくとも一部は、抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）等の大きな高分子（すなわち、１０ｋＤａを超えるもの）を、特に鼻粘膜に投与した際に、ＣＮＳに特異的に送達することを増強可能な浸透増強剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）（例えば、ＰｚペプチドまたはＦＭＯＣペプチド）の驚くべき発見に基づく。したがって、本発明は、上皮層を横切って抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）等の大きな高分子（すなわち、１０ｋＤａを超えるもの）を送達することを増強する組成物および方法を提供する。そのような方法および組成物は、神経性障害を処置するために、鼻腔内投与によって抗原結合性ポリペプチド（例えばｓｃＦｖ）をＣＮＳに好都合、効率的、かつ選択的に送達することを可能にするという点で特に有利である。
【０００９】
一態様では、本発明は、イムノバインダー（ｉｍｍｕｎｏｂｉｎｄｅｒ（例えば、ｓｃＦｖ））等の１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド、および１つまたは複数の浸透増強剤（例えば、ＰｚペプチドまたはＦＭＯＣペプチド）を含む組成物を提供する。特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、浸透増強剤に共有結合している。
【００１０】
ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、ＴＮＦアルファ、アミロイドベータ、アミロイドベータ由来拡散性リガンド受容体、モノアミンオキシダーゼＢ、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンデカルボキシラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体（ＧＲＩＮ１としても公知である）、ＧＲＩＮＡ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＧＲＩＮ３Ａ、ＧＲＩＮ３Ｂ、ヒスタミンＨ１受容体、ムスカリン様受容体（ＣＨＲＭ１としても公知である）、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ３、ＣＨＲＭ４、ヒポクレチン受容体１、ヒポクレチン受容体２、５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＴＲ１Ａとしても公知である）、ドーパミン受容体（ＤＲＤ１としても公知である）、ＤＲＤ２、ＤＲＤ３、ＤＲＤ４、ＤＲＤ５、アドレナリンベータ１受容体、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）、およびドーパミンＤ２受容体からなる群より選択される標的抗原、特にＴＮＦアルファに特異的に結合する。
【００１１】
他の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドは、本明細書の表５、６および７に記載の１つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性または類似性を持つアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。
【００１２】
他の実施形態では、浸透増強剤によって、中枢神経系への抗原結合性ポリペプチドの選択的な鼻腔内送達が促進される。
【００１３】
本発明の組成物は、これらに限定しないが、特に、片頭痛、うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、てんかん、脳卒中、髄膜炎、筋萎縮性側索硬化症、不眠症、髄膜炎、記憶障害、多発性硬化症、ナルコレプシー、脳卒中、外傷性脳損傷、およびストレスを含めた神経性傷害を処置または予防するか、またはその進行を遅延させるための医薬品（または医薬品の製造）に特に有用である。
【００１４】
別の態様では、本発明は、１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）、１つまたは複数の浸透増強剤（例えば、ＰｚペプチドまたはＦＭＯＣペプチド）、および使用説明書を含むキットを提供する。
【００１５】
（図面の説明）
本開示の特徴および利点は、以下の詳細な説明を以下の図面と一緒に読むとより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ｓｃＦｖを４００μｇ鼻腔内投与した後の、（Ａ）嗅球、（Ｂ）大脳、（Ｃ）小脳、および（Ｄ）脳幹におけるＥＳＢＡ１０５の濃度を追跡する経時的実験を示すグラフである。
【図２】図２は、ＥＳＢＡ１０５を鼻腔内（４００μｇ／ｍＬ）または静脈内（４０μｇ／ｍＬ）のいずれかに投与した後の、（Ａ）嗅球、（Ｂ）大脳、（Ｃ）小脳、（Ｄ）脳幹、および（Ｅ）血清におけるＥＳＢＡ１０５の濃度、ならびに鼻腔内または静脈内のいずれかに同じ濃度（４００μｇ／ｍＬ）のＥＳＢＡ１０５を投与した後の（Ｆ）血清におけるＥＳＢＡ１０５の濃度を比較したグラフである。
【図３】図３は、Ｐｚペプチド有りまたは無しで鼻腔内投与した後の、異なる脳領域におけるＥＳＢＡ１０５の（Ａ）Ｃｍａｘ（平均値±ＳＥＭ、ｎ＝４）および（Ｂ）曝露（ＡＵＣ）脳組織対血中濃度比を示すグラフである。
【図４】図４は、鼻腔内送達後のＥＳＢＡ１０５の鼻腔からＣＮＳへの移動経路を示す図である。投与された化合物は鼻腔から血中に移動し得、血液脳関門を通って最終的に脳組織内に浸透し得る（下の経路）。あるいは、化合物は、嗅神経（Ｎ．ｏｌｆａｃｔｏｒｉｕｓ）軸索を介して（すなわち、細胞内的）かまたは神経周囲的（ｐｅｒｉｎｅｕｒｎａｌｌｙ）（すなわち、細胞外的）に、嗅球、続いて大脳に移動し得る。化合物は、同様に、三叉神経（Ｎ．ｔｒｉｇｅｍｉｎｕｓ）を介して（神経周囲的、すなわち細胞外的に）脳幹、次いで小脳に移動し得る。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（詳細な説明）
（定義）
「浸透増強剤」という用語は、薬物が組織関門（例えば上皮）等の物理的な関門を横切って通過することを増強する任意の組成物を包含する。適切な浸透増強剤としては、４−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル（Ｐｚ）、Ｎ−メチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）、フルオロエニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、およびカルボベンゾキシ（ＣＢＺ）等の保護基にＮ末端で連結された、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号２９）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号３０）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（配列番号３１）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３２）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｌｅｕペプチドが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，４９６号を参照されたい）。
【００１８】
「Ｐｚペプチド」という用語は、Ｐｚ基にＮ末端で連結されたＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）を指す（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，４９６号を参照されたい）。
【００１９】
「ＦＭＯＣペプチド」という用語は、ＦＭＯＣ基にＮ末端で連結されたＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）を指す（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，４９６号を参照されたい）。
【００２０】
「選択的な鼻腔送達」という用語は、分子（例えば、抗原結合性ポリペプチド）を、その分子の濃度が患者の血清よりもＣＮＳにおいて高くなるような条件下で、患者に鼻腔内適用することを指す。
【００２１】
「抗原結合性ポリペプチド」という用語は、少なくともサイズが１０ｋＤａであるポリペプチドを指し、イムノバインダー、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、および抗体断片、ならびに、これらに限定されないが、ＣＴＬＡ−４、テンダミスタット（ｔｅｎｄａｍｉｓｔａｔ）、フィブロネクチン（ＦＮ３）、ネオカルチノスタチン、ＣＢＭ４−２、リポカリン、Ｔ細胞受容体、プロテインＡドメイン（プロテインＺ）、Ｉｍ９、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、設計ＴＰＲタンパク質、亜鉛フィンガー、ｐＶＩＩＩ、鳥類膵臓ポリペプチド、ＧＣＮ４、ＷＷドメイン、Ｓｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）、Ｓｒｃ相同ドメイン２（ＳＨ２）、ＰＤＺドメイン、ＴＥＭ−１βラクタマーゼ、ＧＦＰ、チオレドキシン、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、ＰＨＤフィンガー、ＣＩ−２、ＢＰＴ１、ＡＰＰＩ、ＨＰＳＴＩ、エコチン（ｅｃｏｔｉｎ）、ＬＡＣＩ−Ｄ１、ＬＤＴＩ、ＭＴＩ−ＩＩ、サソリ毒、昆虫デフェンシンＡペプチド、ＥＥＴＩ−ＩＩ、Ｍｉｎ−２３、ＣＢＤ、ＰＢＰ、シトクロムｂ５６２、Ｌｄ１受容体ドメインＡ、γ−クリスタリン、ユビキチン、トランスフェリン、およびＣ型レクチン様ドメイン等の当該分野で公知の代替の足場に基づく抗原結合性ポリペプチドが挙げられる（例えば、Ｂｉｎｚ、２００５年、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６巻、４５９〜６９頁を参照されたい）。
【００２２】
「イムノバインダー」という用語は、抗体の抗原結合部位の全部または一部、例えば、重鎖可変ドメインおよび／または軽鎖可変ドメインの全部または一部を含有する分子を指し、したがって、イムノバインダーは、標的抗原を特異的に認識する。イムノバインダーの非限定的な例として、完全長の免疫グロブリン分子およびｓｃＦｖ、さらに、これらに限定されないが、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）本質的には、ヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’断片（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｐａｕｌ編、第３版、１９９３年）を参照されたい）；（ｉｖ）ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｖ）抗体の単腕（ｓｉｎｇｌｅ ａｒｍ）のＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインまたはＶＬドメインからなるＤａｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁）、ラクダ抗体（例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６３巻：４４６〜４４８頁（１９９３年）、およびＤｕｍｏｕｌｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１巻：５００〜５１５頁（２００２年）を参照されたい）またはサメ抗体（例えば、サメＩｇ−ＮＡＲ Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））等の単一ドメイン抗体；ならびに（ｖｉｉ）単一の可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域であるナノボディを含めた、抗体断片が挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「抗体」という用語は、「免疫グロブリン」の同義語である。本発明による抗体は、免疫グロブリン全体であってもよく、または免疫グロブリンの少なくとも１つの可変ドメインを含むそれらの断片、例としては、単一の可変ドメイン、Ｆｖ（Ｓｋｅｒｒａ Ａ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ， Ａ．（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０巻：１０３８〜４１頁）、ｓｃＦｖ（Ｂｉｒｄ， Ｒ．Ｅ． ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２巻：４２３〜２６頁；Ｈｕｓｔｏｎ， Ｊ．Ｓ．ら（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５巻：５８７９〜８３頁）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、もしくは当業者に周知のその他の断片であってもよい。
【００２４】
「単鎖抗体」または「ｓｃＦｖ」という用語は、リンカーによって接続されている抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および抗体の軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む分子を指す。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般的な構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有し得る。
【００２５】
本明細書で使用する「抗体のフレームワーク」という用語は、可変ドメイン（ＶＬまたはＶＨのいずれか）の一部を指し、これはこの可変ドメインの抗原結合性ループの足場として働く（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、９１〜３２４２頁）。適切なフレームワークの例は、参照により本明細書に援用されるＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２１９およびＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２２２に開示されている。
【００２６】
「リンカー」という用語は、２つのドメインを連結する直鎖のアミノ酸配列を指す。本発明のリンカーを、ドメインに遺伝子的および／または化学的に融合させることができる。ある特定の実施形態では、リンカーは、リンカー内に存在する２つのシステイン間で形成されたジスルフィド架橋によって形成されたループを含有する。そのようなリンカーの一般的な構造は、配列番号１８および１９に示す；配列番号１６および１７は、前記リンカーの例示的な実施形態である。さらに適切な最先端のリンカーはＧＧＧＧＳアミノ酸配列の反復からなるか、またはその改変体である。本発明の好ましい実施形態では、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー（配列番号３６）またはその誘導体（例えば配列番号３７に使用される）が使用されるが、１〜３回反復の改変体も可能である（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、（１９９３年）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁）。本発明に使用することができる他のリンカーは、Ａｌｆｔｈａｎら（１９９５年）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、８巻：７２５〜７３１頁、Ｃｈｏｉら（２００１年）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１巻：９４〜１０６頁、Ｈｕら（１９９６年）、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５６巻：３０５５〜３０６１頁、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら（１９９９年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９３巻：４１〜５６頁、およびＲｏｏｖｅｒｓら（２００１年）、Ｃａｎｃｅｒ ｌｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５０巻：５１〜５９頁に記載されている。
【００２７】
ポリペプチドのアミノ酸配列に関する「改変」または「改変する」という用語は、ポリペプチド配列内へのアミノ酸の付加、またはポリペプチド配列中の既存のアミノ酸の置換の両方を指す。ポリペプチドを改変するのに適したアミノ酸は、すべての公知の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびそれらの機能性誘導体を含む（例えば、それらの全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，０４５，３３７号および第７，０８３，９７０号を参照されたい）。ある特定の実施形態では、この用語は、ポリペプチド配列からのアミノ酸の欠失を指す。
【００２８】
「標的抗原」とは、抗体が特異的に結合する抗原決定基を含有する分子（例えば、１つまたは複数の膜貫通ドメイン、ポリペプチド、ペプチドまたは糖質を有する可溶性タンパク質または膜結合タンパク質）である。
【００２９】
「神経性障害」という用語は、中枢神経系（すなわち、脳および脊髄）に影響を及ぼす恐れがある疾患および障害を含む。
【００３０】
ＣＮＳ障害という用語は、ＣＮＳにおいて顕在化する障害を指す。例として、ＣＮＳ障害は、脳腫瘍または神経性障害であり得る。
【００３１】
「有効量」という用語は、患者において疾患または障害（例えば神経性障害）を部分的、または完全に予防または抑止するのに十分な治療用（例えば、抗原結合性ポリペプチド）の量として定義する。有効量は、疾患または障害の重症度ならびに利用される本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、利用される特定の化合物の排出速度、処置の持続時間、利用される特定の組成物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物および／または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、病状、全体的な健康および以前の病歴を含めた種々の薬物動態因子、そして医学分野で周知の同様な因子に依存する。
【００３２】
「患者」という用語は、予防処置または治療処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物の被験体を含む。
【００３３】
「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」、および「特異的に結合する」という用語は、所定の抗原上のエピトープへの抗原の結合を指す。典型的には、抗体は、およそ、約１０−８Ｍ、１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍ未満等、およそ、約１０−７Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する。
【００３４】
本明細書で使用する「同一性」とは、２つのポリペプチド、分子の間、または２つの核酸の間で一致する配列を指す。比較した２つの配列のどちらの位置も同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子それぞれのある位置が、アデニンによって占有されている、または２つのポリペプチドそれぞれのある位置が、リジンによって占有されている場合）、それぞれの分子は、その位置において同一である。２つの配列間の「パーセント同一性」は、２つの配列に共有される一致する位置の数を、比較した位置の数で割った数×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０個の位置のうち６個の位置が一致する場合、２つの配列は６０％の同一性を有する。例として、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは５０％の同一性を共有する（全部で６個の位置のうち３個が一致する）。一般に、比較は最大の同一性が得られるように２つの配列をアライメントして行う。そのようなアライメントは、例えば、Ａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，Ｉｎｃ．）等のコンピュータプログラムによって好都合に実行される、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３〜４５３頁の方法を使用してもたらすことができる。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている、Ｅ． ＭｅｙｅｒｓおよびＷ． Ｍｉｌｌｅｒ、（Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、４巻：１１〜１７頁（１９８８年））のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップレングスペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれている、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４４〜４５３頁（１９７０年））のアルゴリズムを使用して、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびにギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６または４およびレングスウェイト１、２、３、４、５または６を使用して決定することができる。
【００３５】
「類似した」配列は、アライメントした際に、同一のアミノ酸残基および類似したアミノ酸残基を共有している配列であり、類似した残基は、アライメントした参照配列内の対応するアミノ酸残基への保存的置換である。この点に関して、参照配列内の残基の「保存的置換」は、対応する参照残基に物理的または機能的に類似している残基、例えば、類似したサイズ、形、電荷、共有結合または水素結合を形成する能力を含めた化学的性質などを有する残基による置換である。したがって、「保存的置換改変された」配列は、１つまたは複数の保存的置換が存在するという点で参照配列または野生型配列と異なる配列である。２つの配列間の「類似性の割合」は、２つの配列に共有される一致する残基または保存的置換を含有する位置の数を、比較した位置の数で割った数×１００の関数である。例えば、２つの配列の１０個の位置のうち６個が一致し、１０個の位置のうち２個が保存的置換を含有する場合、その２つの配列は８０％の正の類似性を有する。
【００３６】
本明細書で使用する「保存的配列改変」という用語は、そのアミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に負の影響を及ぼすかまたは変化を与えることのないアミノ酸改変を指すものとする。そのような保存的配列改変は、ヌクレオチドおよびアミノ酸の置換、付加および欠失を含む。例えば、改変は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発等の当該分野で公知の標準技法によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換わったものを含む。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該分野で定義されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電の極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐した側鎖を持つアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、ヒト抗ＶＥＧＦ抗体内の予測される非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換えられることが好ましい。抗原結合性を除去しない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌら、 Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３２巻：１１８０〜１１８７頁（１９９３年）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、１２巻（１０号）：８７９〜８８４頁（１９９９年）；およびＢｕｒｋｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９４巻：４１２〜４１７頁（１９９７年）を参照されたい）。
【００３７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての科学技術用語は、本発明が属する分野の一般的な業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものに類似のまたはそれらと同等な方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。対立が生じた場合には、定義を含む、本明細書が優先する。さらに、材料、方法および実施例は、例証のために限られ、本発明を限定するものではない。
【００３８】
本発明の種々の態様を、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載する。種々の実施形態を随意に組み合わせることができることが理解されるべきである。
【００３９】
（改良した抗原結合性ポリペプチド組成物）
一態様では、本発明は、抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）等の治療用ポリペプチドを、組織関門を横切って、より具体的には鼻粘膜を横切ってＣＮＳに送達することを増強するための組成物を提供する。そのような組成物は、一般に、抗原結合性ポリペプチドおよび浸透増強剤を含む。これらの組成物は、中枢神経系への抗原結合性ポリペプチドの選択的鼻腔内送達が可能であるという点で特に有利である。今日、生物製品は、典型的には、全身投与され、したがって高用量の薬物および／またはそれを必要とする生物を薬物に供することが必要とされている；あるいは、生物製品は、頭側カニューレによって投与される可能性がある。したがって、本発明により、抗原結合性ポリペプチドを必要とする被験体の生活の質が著しく改善される。
【００４０】
任意の抗原結合性ポリペプチドが、本発明の方法で使用するのに適している。ある特定の実施形態では、抗原結合性ポリペプチドはｓｃＦｖ等のイムノバインダーである。そのようなｓｃＦｖは、その内容が参照によって本明細書に援用されるＷＯ０９／００００９８に記載されたもののような安定性および溶解性が高いフレームワーク領域を含むことが好ましい。特定の好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、表５、６および７に記載の１つまたは複数のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）の類似性を持つアミノ酸配列を含む。最も好ましくは、ｓｃＦｖは、表５、６および７に記載の１つまたは複数のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性、好ましくは８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。
【００４１】
好ましい実施形態では、前記ｓｃＦｖは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、または配列番号２７に対して少なくとも８０％（例えば８５％、９０％、９５％または９９％）の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有するフレームワーク配列を含む。
【００４２】
別の実施形態では、前記ｓｃＦｖは、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号３５に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。それに加えてまたはその代わりに、前記ｓｃＦｖは、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号３４に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を持つアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。一実施形態では、前記ＶＨおよび／またはＶＬは、リンカーによって連結されて、一般的な構造ＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨを有する分子を生じる。前記リンカー分子は、例えば、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３６および配列番号３７からなる群から選択することができ、またはそれらに対して少なくとも８０％の類似性を有する配列である。
【００４３】
好ましい実施形態では、ｓｃＦｖは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号３３に対して少なくとも８０％（例えば、８５％、９０％、９５％または９９％）の類似性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、さらにより好ましくは８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を持つアミノ酸配列を含む。
【００４４】
任意の浸透増強剤を本発明の組成物に使用することができる。ある特定の実施形態では、浸透増強剤は、保護基に連結されたペプチドまたはペプチド模倣物である。本発明で使用するのに適したペプチドは、天然アミノ酸、天然ではないアミノ酸、Ｄ−アミノ酸、およびアミノ酸誘導体を含めた任意の公知のアミノ酸を含有し得る。特定の実施形態では、浸透増強剤は、４−フェニルアゾベンジルオキシカルボニル（Ｐｚ）、Ｎ−メチル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）、フルオロエニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、およびカルボベンゾキシ（ＣＢＺ）等の保護基にＮ末端で連結されたＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（配列番号２９）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ（配列番号３０）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ（配列番号３１）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ（配列番号３２）、Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ＧｌｙおよびＰｒｏ−Ｌｅｕからなる群から選択されるペプチドである（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，４９６号を参照されたい）。好ましい実施形態では、浸透増強剤は、Ｐｚ基またはＦＭＯＣ基にＮ末端で連結されたＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（配列番号２８）である（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，５３４，４９６号を参照されたい）。
【００４５】
浸透増強剤および抗原結合性タンパク質が、単一の薬学的組成物で標的組織に一緒に送達（ｃｏ−ｄｅｌｉｖｅｒ）されてもよく、または浸透増強剤および抗原結合性タンパク質の送達が、別個の組成物で投与することによって時間的に隔てられてもよいことは、本発明の範囲内と考える。
【００４６】
さらに、浸透増強剤が、抗原結合性タンパク質に結合体化されてもよいことも本発明の範囲内と考える。当該分野で公知の物理的または化学的な結合体化様式すべてが考えられる。化学基をアミノ酸、アミノ酸誘導体またはアミノ酸模倣物に結合体化するために、当該分野で公知の任意の適切な化学を利用することができる。リジン残基、システイン残基およびヒスチジン残基を含めた、抗原結合性タンパク質の任意のアミノ酸残基に結合体化することができる。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本発明の組成物は、上記の抗原結合性タンパク質と一緒に送達するのに適した追加の化合物を含んでもよい。そのような薬物として、小分子、向知性薬（ｎｏｏｔｒｏｐｉｃ）、ポリペプチド、およびオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明の組成物は、これらに限定されないが、粘膜上皮（例えば鼻の上皮）および角膜組織を含めた任意の生体膜のタイトジャンクションを横切って、抗原結合性タンパク質を送達するために使用することができる。鼻の上皮に本発明の組成物を投与すると、抗原結合性タンパク質が、好ましくは血流に第一に入ることなくＣＮＳに直接的かつ特異的に送達されるので、特に好ましい標的膜は鼻の上皮である。
【００４９】
（ＣＮＳ障害の処置）
本発明の組成物は、そのような組成物によって、鼻粘膜を介して抗原結合性ポリペプチドをＣＮＳに直接的かつ選択的に送達することが可能になるので、ＣＮＳ障害を処置または予防するか、および／またはその進行を遅延させるのに特に適している。本発明の組成物を使用して処置するのに適切な障害として、行動／認知症候群、頭痛障害（例えば、片頭痛、群発頭痛および緊張性頭痛）、てんかん、外傷性脳損傷、神経変性障害（例えば、副腎脳白質ジストロフィー）、アルコール症、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリグ病としても公知である）、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病（シュピールマイアー・フォークト・シェーグレン・バッテン病としても公知である）、ウシ海綿状脳症、キャナヴァン病、脳性麻痺、コケーン症候群、皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、家族性致死性不眠症、前頭側頭葉変性症、ハンチントン病、ＨＩＶ関連痴呆、ケネディ症候群、クラッベ病、レヴィー小体痴呆、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病（３型脊髄小脳性運動失調）、多系統萎縮症、多発性硬化症、ナルコレプシー、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェーウス‐メルツバッヒャー病、ピック病、原発性側索硬化症（Ｐｒｉｍａｒｙ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性の貧血に続発する脊髄の亜急性連合変性症（Ｓｕｂ−ａｃｕｔｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、脊髄小脳性運動失調症、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルスゼフスキー症候群、背側ろう、および中毒性脳症、脳血管障害（例えば、一過性脳虚血発作および脳卒中）、睡眠障害、脳性麻痺、感染症（例えば、脳炎、髄膜炎、および脊髄炎）、新生物（例えば脳および脊髄腫瘍）、運動障害（例えば、片側バリズム、チック障害、およびジル・ドゥ・ラ・トゥレット症候群）、ＣＮＳの脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症、ギラン・バレ症候群、および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー）、末梢神経の障害（例えば、ミオパチーおよび神経筋接合部）、精神状態の変化（例えば、脳症、昏迷、および昏睡）、言語障害、腫瘍随伴性神経学的症候群、および明白な生理学的原因がない機能的な神経学的症候群を有する症候群が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
したがって、別の態様では、本発明は中枢神経系の疾患または障害を処置または予防する方法を提供し、その方法は、疾患または障害が処置または予防されるように、その処置を必要とする被験体の鼻粘膜に、抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）および浸透増強剤（例えばＰｚペプチド）を含む組成物を有効量投与することを含む。
【００５１】
さらに別の態様では、本発明は被験体の中枢神経系に抗原結合性ポリペプチドを選択的に送達する方法を提供し、その方法は、抗原結合性ポリペプチド（例えば、ｓｃＦｖ）および浸透増強剤（例えばＰｚペプチド）を含む組成物を被験体の鼻粘膜と接触させることを含み、それによって抗原結合性ポリペプチドが直接的かつ選択的に中枢神経系に送達される。
【００５２】
（標的抗原）
本発明の方法で使用される抗原結合性ポリペプチドは、１つまたは複数の特異的な標的抗原に結合し得る。適切な標的抗原としては、ＴＮＦアルファ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００５８５．２）、アミロイドベータ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００４７５．１）、アミロイドベータ由来拡散性リガンド受容体（例えば、ＷＯ／２００４／０３１４００を参照されたい）、モノアミンオキシダーゼＢ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８８９．３）、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンデカルボキシラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８１．１）、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿９４２１３１．１）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体（ａｅｃｅｐｔｏｒ）（ＧＲＩＮ１としても公知である）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２３．４）、ＧＲＩＮＡ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２８．１）、ＧＲＩＮ２Ｄ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２７．２）、ＧＲＩＮ２Ｃ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２６．２）、ＧＲＩＮ３Ｂ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿６１９６３５．１）、ＧＲＩＮ２Ａ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２４．１）、ＧＲＩＮ２Ｂ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８２５．２）、ＧＲＩＮ３Ａ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿５９７７０２．２）、ヒスタミンＨ１受容体（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００８５２．１）、ムスカリン様受容体（ＣＨＲＭ１としても公知である）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７２９．２）、ＣＨＲＭ２（ＮＰ＿０００７３０．１）、ＣＨＲＭ３（ＮＰ＿０００７３１．１）、ＣＨＲＭ４（ＮＰ＿０００７３２．２）、ヒポクレチン受容体１（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１５１６．２）、ヒポクレチン受容体２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１５１７．２）、５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＴＲ１Ａとしても公知である）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００５１５．２）、ドーパミン受容体（ＤＲＤ１としても公知である）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８５．１）、ＤＲＤ２（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８６．１）、ＤＲＤ３（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８７．２）、ＤＲＤ４（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８８．２）、ＤＲＤ５（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８９．１）、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１０３４．１）、アドレナリンベータ１受容体（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００６７５．１）およびドーパミンＤ２受容体（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０００７８６．１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
（処方）
本発明の別の態様は、本発明の抗原結合性ポリペプチド／浸透増強剤組成物の薬学的処方に関係する。そのような処方は、典型的には１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド、１つまたは複数の浸透増強剤、および薬学的に許容できる担体を含む。本明細書で使用する「薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合する、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。担体は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所（例えば、眼、皮膚、または上皮層への）投与、吸入による投与、非経口投与、脊髄投与または上皮投与（例えば、注射または注入によって）に適することが好ましい。投与経路に応じて、抗原結合性ポリペプチド／浸透増強剤組成物は、化合物を不活性化する恐れがある、酸による作用および他の自然条件から化合物を保護するために、材料でコーティングすることができる。
【００５４】
本発明の薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩を含んでもよい。「薬学的に許容できる塩」とは、親化合物の望ましい生物活性を保持し、任意の望ましくない毒性作用を与えない塩を指す（例えば、Ｂｅｒｇｅ， Ｓ． Ｍ．ら（１９７７年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．、６６巻：１〜１９頁を参照されたい）。そのような塩の例として、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等の無毒性無機酸由来の塩、ならびに例えば、脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸等の無毒性有機酸由来の塩が挙げられる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属由来の塩、ならびに例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等の無毒性有機アミンに由来する塩が挙げられる。
【００５５】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤も含んでもよい。薬学的に許容できる抗酸化剤の例としては、（１）例えば、アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等の水溶性抗酸化剤；（２）例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロール等の油溶性抗酸化剤；および（３）例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等の金属キレート剤が挙げられる。
【００５６】
本発明の薬学的組成物に利用することができる適切な水性担体および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物、オリーブ油等の植物油、ならびにオレイン酸エチル等の注射可能有機エステルが挙げられる。例えば、レシチン等のコーティング材料を使用することによって、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。
【００５７】
これらの組成物は、保存料、加湿薬、乳化剤および分散剤等のアジュバントも含有してもよい。微生物の存在の予防は、上記の滅菌手順、ならびに種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含めることの両方によって確実にすることができる。また、例えば糖、塩化ナトリウム等の等張剤をこの組成物に含めることが望ましい場合もある。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の吸収を遅延させる薬剤を含めることによって、注射可能薬学的形態の持続的な吸収を導くことができる。
【００５８】
薬学的に許容できる担体は、滅菌水溶液または滅菌分散液および滅菌注射可能溶液または滅菌注射可能分散液を即時調製するための滅菌粉末を含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で公知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の薬学的組成物へのその使用が考えられる。追加の活性化合物も組成物中に組み込むことができる。
【００５９】
薬学的組成物は、典型的には、製造および保管の条件下で滅菌されていて、かつ安定でなければならない。この組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の規則的構造体として処方することができる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチン等のコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによって、注射可能組成物の持続的な吸収を導くことができる。
【００６０】
滅菌注射可能溶液は、適切な溶媒中に、必要量の活性化合物と上記に列挙した成分の１つまたはそれらの組み合わせを必要に応じて一緒に組み込み、続いて微細濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基本の分散媒および上記に列挙したものからの必要な他成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ滅菌ろ過したその溶液から、活性成分に任意の追加の所望の成分を加えた粉末が得られる、真空乾燥およびフリーズドライ（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））である。
【００６１】
単回投与剤形を生成するための担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される被験体および特定の投与様式によって変わる。単回投与剤形を生成するための、担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる組成物の量である。一般に、薬学的に許容できる担体と組み合わせて、１００パーセント中、この量は約０．０１パーセント〜約９９パーセントの活性成分、好ましくは約０．１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１パーセント〜約３０パーセントの活性成分の範囲である。
【００６２】
最適な所望の応答（例えば、治療応答）をもたらすために投与レジメンを調節する。例えば、単回ボーラス投与してもよく、いくつかに分けた用量を徐々に投与してもよく、または治療状況の緊急性によって示される通りに、用量を比例的に低下または増加させてもよい。投与を容易にし、用量を均一にするために、非経口用組成物を単位用量剤形に処方することが特に有利である。本明細書で使用する単位用量剤形とは、処置される被験体に対する単位用量として適合させた物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要な薬学的担体と共同して所望の治療効果を生じるように計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位用量剤形の仕様は、（ａ）活性化合物の独特な特性および実現すべき特定の治療効果、および（ｂ）個体における感受性の処置のためのそのような活性化合物を化合する技術分野に固有の制限によって決定され、直接左右される。
【００６３】
本発明の別の態様は、本発明の薬学的組成物の投与方法である。代表的な送達レジメンが経口非経口（皮下、筋肉内、および静脈内を含む）、直腸、頬側、舌下、肺、経皮、鼻腔内、および経口を含み得ることは本発明の範囲内と考える。好ましい送達レジメンはである。
【００６４】
鼻腔内投与するために、固体または液体いずれかの担体を使用することができる。固体担体は、例えば、約２０〜約５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗い粉末を含み、そのような処方物は鼻道を通じて迅速に吸入されることによって投与される。液体担体が使用される場合、処方物はスプレー式点鼻薬または点鼻液として投与することができ、活性成分の油溶液または水溶液を含んでもよい。
【００６５】
鼻腔内投与に適した処方物は、活性化合物を含有し、望ましくは０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有する粒子がレシピエントの気管支樹内に送達されるようにもたらされる。一可能性として、そのような処方物は、吸入装置で使用するための穴があくカプセル、適切には、例えばゼラチンのカプセルで、あるいは、活性化合物、適切な液体または気体の噴霧剤、および場合によって界面活性剤および／または固体希釈剤等の他の成分を含む自己噴霧処方物としてのいずれかで好都合にもたらされ得る、細かく粉砕された粉末の形態である。適切な液体噴霧剤はプロパンおよびクロロフルオロカーボンを含み、適切な気体噴霧剤は二酸化炭素を含む。自己噴霧処方物は、活性化合物が溶液または懸濁物の液滴の形態で調剤される場合にも利用することができる。そのような自己噴霧処方物は、当該分野で公知の自己噴霧処方物に類似し、確立された手順によって調製することができる。自己噴霧処方物は、所望の噴霧特性を有する手動または自動いずれかの機能性バルブを備えた容器でもたらされることが適切であり、このバルブが、操作されるごとに固定量、例えば２５〜１００μｌを送達する計量型のバルブであることが有利である。別の可能性として、活性化合物は、加速気流または超音波攪拌を利用して吸入用の細かい液滴ミストを生じるアトマイザーまたはネブライザー（ｎｅｂｕｌｉｓｅｒ）で使用するための溶液または懸濁物の形態であってもよい。鼻腔内で保持可能にするために、調剤する際、そのような処方物は、望ましくは１０〜２００ミクロンの範囲の粒子直径を有するべきであり、これは、必要に応じて適切な粒子サイズの粉末を使用すること、または適切なバルブを選出することによって実現することができる。他の適切な処方物は、鼻に近づけて保持した容器から鼻道を通って迅速吸入することによって投与するための、２０〜５００ミクロンの範囲の粒子直径を有する粗い粉末、および水性または油性の溶液または懸濁物中、０．２〜５％ｗ／ｖの活性化合物を含む点鼻液を含む。
【００６６】
（組成物の使用）
本発明の組成物は、例えば、神経性障害を処置、予防するか、および／またはその進行を遅延させるための医薬品として使用することができる。したがって、本明細書で開示する組成物は、神経性障害の処置または予防に有用な医薬品の製造に使用することができる。
【００６７】
好ましい実施形態では、そのような障害は、片頭痛、うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、てんかん、脳卒中、髄膜炎、筋萎縮性側索硬化症、不眠症、髄膜炎、記憶障害、多発性硬化症、ナルコレプシー、脳卒中、外傷性脳損傷、およびストレスからなる群より選択される。
【００６８】
組成物は、鼻腔内送達用に処方されることが好ましい。
【実施例】
【００６９】
（実施例）
本開示を以下の実施例によってさらに例示するが、さらに限定するものであると解釈されるべきではない。
【００７０】
一般に、本発明の実行には、別段の指定がない限り、化学、分子生物学、組換えＤＮＡ技術、および免疫学（特に、例えば免疫グロブリンの技術）の従来の技法を利用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、５１０頁、Ｐａｕｌ， Ｓ．、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ、１６９頁）， ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ編、Ｉｒｌ Ｐｒ（１９９６年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗら、 Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ． Ｐｒｅｓｓ， Ｐｕｂ．（１９９９年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９９２年）を参照されたい。例えば、Ｐｏｌｙｔｈｅｒｉｃｓ ＵＳ６８０３４３８；ＥＰ１７０１７４１Ａ２；ＥＰ１６４８５１８Ａ２；Ｗ００５０６５７１２Ａ２；ＷＯ０５００７１９７Ａ２；ＥＰ１４９６９４１Ａ１；ＥＰ１２２２２１７Ｂ１；ＥＰ１２１００９３Ａ４；ＥＰ１４６１３６９Ａ２；ＷＯ０３０８９０１０Ａ１；ＷＯ０３０５９９７３Ａ２；およびＥＰ１２１００９３Ａ１）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ＵＳ２００７００９２９４０Ａ１およびＥＰ１２４０３３７Ｂ１；およびＥＳＢＡＴｅｃｈ Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／８９９，９０７、ＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２２５、ＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２２２，ＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２２２、ＷＯ０６／１３１０１３およびＷＯ０３０９７６９７Ａ２も参照されたい。
【００７１】
（ＥＳＢＡ１０５の精製）
分子量２６．３ｋＤａの抗ＴＮＦアルファ単鎖抗体断片であるＥＳＢＡ１０５を、前述の通りＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主細胞から精製した（Ｆｕｒｒｅｒら（２００９年）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、５０巻、７７１〜７７８頁；Ｏｔｔｉｇｅｒら（２００９年）Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、５０巻、７７９〜７８６頁）。簡単に述べると、ＥＳＢＡ１０５を、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）での組換え発現、封入体からのリフォールディング、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって作製した。動物試験のために、ＥＳＢＡ１０５を５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．５）中、１０ｍｇ／ｍｌ（鼻腔内投与用）または０．５ｍｇ／ｍｌ（静脈注射用）で処方した。ＬＡＬ凝固アッセイで決定したエンドトキシン含有量は、インビボ実験に使用したすべての処方物中で０．１ＥＵを下回った。
【００７２】
（エバンスブルーの鼻腔内投与）
タンパク質をＣＮＳにターゲティングするための最適条件を、０．９％ＮａＣｌ中０．３％エバンスブルーを、鼻腔内経路を介してＢａｌｂ／ｃマウスに投与することによって最初に決定した。次いで動物を、事前に決めた時点においてＣＯ２吸入によって屠殺し、その肺および胃を収集し、エバンスブルーの存在について視覚的に検査した。動物を仰臥位でのイソフルラン（Ｐｒｏｖｅｔ、Ｌｙｓｓａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）による麻酔下に保ち、各鼻孔を、エバンスブルー２μｌで、５分間隔で、合計４０μｌに達するまで（４５分）処置することによって最適条件を得た（表１）。結果的に、本明細書に記載のすべての実施形態における、ＥＳＢＡ１０５の鼻腔内投与のためにこのプロトコルを使用した。
【００７３】
（ＥＳＢＡ１０５の鼻腔内投与および静脈内投与）
すべての動物の前採取血液（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）を、ＥＳＢＡ１０５を用いた鼻腔内または静脈内への投薬の１０日前に採取した。イソフルラン（Ｐｒｏｖｅｔ、Ｌｙｓｓａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）による麻酔下でＥＳＢＡ１０５の鼻腔内投与を行った。マウスを仰臥位に置き、合計４０μｌ（４００μｇ）のＥＳＢＡ１０５を、２μｌの液滴をピペットで取り、各鼻孔に５分ごと、全部で４５分間にわたって処置することによって投与した。鼻腔内ＰＫ試験のために、最初の鼻腔内点滴注入の１、２、４、６、８、１０、１２、および２４時間後に、４匹の動物を屠殺した。一部の実験では、一過的、可逆的にタイトジャンクションの開口を誘発することによって傍細胞マーカーの輸送を容易にする浸透増強剤であるＰｚペプチド（４−フェニルアゾベンゾキシカルボニル−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ；Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）（ＹｅｎおよびＬｅｅ（１９９４年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、２８巻、９７〜１０９頁）３ｍＭをＥＳＢＡ１０５処方物に加えた。最初の投与の１、２、および４時間後に４匹の動物を屠殺した。静脈内注射するために、マウスを拘束器（ｒｅｓｔｒａｉｎｅｒ）に置き、４０μｇ（８０μｌ）のＥＳＢＡ１０５を尾静脈に注射した。静脈内用量は、４００μｇのＥＳＢＡ１０５の鼻腔内投与で、期間４時間にわたって観察された血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）に従って、全身曝露に最も近づくように選出した。各時点（１、２、および４時間）で２匹の動物を屠殺した。屠殺する際に、マウスをケタミン（Ｋｅｔａｓｏｌ１００、６５ｍｇ／ｋｇ；Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ、１３ｍｇ／ｋｇ；Ｐｒｏｖｅｔ、Ｌｙｓｓａｃｈ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびアセプロマジン（Ｐｒｅｑｕｉｌｌａｎ、２ｍｇ／ｋｇ；Ａｒｏｖｅｔ、Ｚｏｌｌｉｋｏｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の混合物を用いて深く麻酔した。血液試料を心臓穿刺によって採取した後、ＰＢＳ２０ｍｌを用いてマウスを灌流した。脳を慎重に収集し、嗅球、視床および視床下部を含む大脳、小脳ならびに脳幹に解剖した。その組織を秤量し、ドライアイス上で凍結させ、分析するまで−８０℃で保管した。
【００７４】
（組織の調製）
分析のために組織を下記の通り調製した。溶解緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、０．１％ＳＤＳ、プロテイナーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））１００μｌを、脳組織１５ｍｇに加えた。組織を５秒間超音波処理し（８サイクル、強度１００％）（Ｓｏｎｏｐｌｕｓ、Ｂａｎｄｅｌｉｎ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、遠心分離し、その上清をＥＬＳＡに基づくＥＳＢＡ１０５濃度の決定に供した。
【００７５】
（血清および脳組織におけるＥＳＢＡ１０５の定量化）
ＥＳＢＡ１０５濃度を、各試料を直接ＥＬＳＡにおいて３連で測定することにより決定した。９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ ＭａｘｉＳｏｒｐ；Ｏｍｎｉｌａｂ、Ｍｅｔｔｍｅｎｓｔｅｔｔｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を０．５μｇ／ｍｌのヒトＴＮＦアルファ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を用いて、ＰＢＳ中、４℃で一晩コーティングした。続くステップの各間に、マイクロプレートウォッシャー（ＡＳＹＳ Ａｔｌａｎｔｉｓ、Ｓａｌｚｂｕｒｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して、ＴＢＳ−Ｔ（０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０；Ａｘｏｎ Ｌａｂ、Ｂａｄｅｎ−Ｄａｅｔｔｗｙｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）用いてプレートを３回洗浄した。ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．２％Ｔｗｅｅｎ２０中で１．５時間インキュベートすることによって非特異的結合部位を飽和させた。各試料の前希釈物を、それぞれのマトリックス（嗅球、大脳、小脳、脳幹または血清）１０％を含有する希釈緩衝液（ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）に調製した。希釈緩衝液／それぞれのマトリックス１０％において、ＥＳＢＡ１０５の標準の参照希釈系列（５０〜０．５ｎｇ／ｍｌ）を調製した。次いで、前希釈した試料および標準の参照希釈液をウェルに加え、プレートを室温で１．５時間インキュベートした。希釈緩衝液中に１：２０，０００希釈したビオチン化したアフィニティ精製したポリクローナルウサギ抗ＥＳＢＡ１０５抗体（ＡＫ３Ａ、ＥＳＢＡＴｅｃｈ、Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、結合したＥＳＢＡ１０５を検出した（１．５時間、室温）。今度は、ＡＫ３Ａを、０．２ｎｇ／ｍｌ（希釈緩衝液）の濃度で、ポリ−西洋ワサビペルオキシダーゼストレプトアビジン（Ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂａｅｓｗｅｉｌｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて検出した。ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をペルオキシダーゼの基質として使用し、呈色反応を、２〜２０分後に（呈色の強度による）、１ＭのＨＣｌを加えることによって停止させた。プレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ；Ｔｅｃａｎ、Ｍａｅｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、試料中のＥＳＢＡ１０５の濃度を、標準曲線からの多項回帰によって計算した（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０３；ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）。ＥＳＢＡ１０５の定量下限濃度（ＬＯＱ）は、それぞれ、血清において５ｎｇ／ｍｌおよび脳組織において３３ｎｇ／ｍｌであった。数学的評価およびグラフ表示のために、生じたシグナルが定量化の下限を下回った希釈していない試料をＬＯＱに設定した。
【００７６】
（実施例１）
（鼻腔内投与の様式）
本実施例は、鼻への低量投与がＣＮＳへの特異的送達をもたらすことを実証する。ＣＮＳに薬物を効率的かつ特異的に送達するために、適用された物質が鼻腔内に残存する必要があるが、いくつかの研究により、鼻腔内に適用された物質は、呼吸および経口摂取によって呼吸器系および消化管に移動する可能性があることが示されている（Ｅｙｌｅｓら（１９９９年）Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ、１８９巻、７５〜７９頁；Ｋｌａｖｉｎｓｋｉｓら（１９９９年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１６２巻、２５４〜２６２頁；Ｌｕｎｄｈｏｌｍら（１９９９年）Ｖａｃｃｉｎｅ、１７巻、２０３６〜２０４２頁；Ｔｒｏｌｌｅら（２０００年）Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻、２９９１〜２９９８頁）。いくつもの態様（例えば、麻酔、動物の体位、ならびに投与の量および頻度）が、鼻腔内に投与された化合物の滞留時間に影響を与え得ることが当業者には理解される。上記の鼻腔内投与プロトコルを使用して、エバンスブルーを、鼻腔内適用後に色素の投与後分布を査定するためのトレーサーとして使用した。エバンスブルー４０〜５０μｌを、いくつかの異なる方法によって鼻腔内投与した。第１に、仰臥位に保持した、麻酔したマウスまたは機敏なマウスのいずれかに単一用量を与え、その結果、どちらの場合においても肺および胃の両方に色素が移動した。第２に、麻酔した動物に、たった３分の代わりに、仰臥位で３０〜５０分間単一用量を与えた。第３に、色素量を２つの別々の１０μｌ用量で、５分間隔で投与した。これらのどちらの方法でも、エバンスブルーの肺および胃への移動は低下しなかった。最後に、仰臥位の麻酔した動物に、２μｌという低量を適用し、その結果、肺におけるエバンスブルーの痕跡は最小限のみであり、胃における青色染色は全くなかった（表１）。
【００７７】
（実施例２）
（ＥＳＢＡ１０５のＣＮＳへの送達）
本実施例は、ｓｃＦｖの鼻腔内投与がｓｃＦｖのＣＮＳへの送達をもたらすことを実証する。ＥＳＢＡ１０５（配列番号１）は、ＴＮＦアルファに特異的に結合し、阻害する単鎖抗体である（例えば、参照によって本明細書に援用されるＷＯ０６／１３１０１３を参照されたい）。上記のプロトコルによって鼻腔内投与した後、ＥＳＢＡ１０５は、分析したすべての脳領域において著しい濃度に達し、時間とともに二峰性の分布を示した。小脳および脳幹において、最初に滴下した１時間後にＥＳＢＡ１０５の最大濃度（Ｃｍａｘ）に達し、嗅球および大脳における濃度はその１時間後にピークに達した。それからＥＳＢＡ１０５レベルはすべての脳領域において低下したが、嗅球、小脳、および脳幹において、６〜１２時間後に再び上昇して明らかな第２の、より低いレベルの濃度ピークが生じ（図１）、これは、２つの異なる移動経路が存在する可能性があることを実証している。最高濃度を、嗅球および脳幹において測定した。嗅覚系（Ｎ．ｏｌｆａｃｔｏｒｉｕｓ）を通じて鼻腔につながっている嗅球において、濃度は９４５５ｎｇ／ｍｌで最高に達した。末梢三叉神経系（Ｎ．ｔｒｉｇｅｍｉｎｕｓ）を通じて鼻道につながっている脳幹では濃度はさらに高かった（１１０６７ｎｇ／ｍｌ）（表２）。大脳におけるＣｍａｘ（９７５ｎｇ／ｍｌ）は、少し遅く（２時間）、小脳または嗅球よりも、それぞれ約７〜１０分の１低かった。これらの結果は、ＥＳＢＡ１０５はまず嗅球および脳幹に達し、そこから大脳および小脳に分布することを実証している。脳幹および小脳と同様に、血清ではＥＳＢＡ１０５を最初に投与した１時間後にＣｍａｘに達し、５〜１０時間の間に二度目のピークに達した。興味深いことに、最後の１２時間の間、ＥＳＢＡ１０５レベルはほぼ一定のままであった（図１）。
【００７８】
（実施例３）
（ＥＳＢＡ１０５のＣＮＳへの送達は直接的である）
本実施例は、ＥＳＢＡ１０５の鼻腔内投与が血流を介してではなく、直接ＣＮＳへの送達をもたらすことを実証する。ＥＳＢＡ１０５が、直接ＢＢＢを通って鼻腔からＣＮＳへ移動するのか、または全身吸収および続く脳へのＢＢＢ経由の送達によって間接的に移動するのかを決定するために、鼻腔内投与について上記の静脈内注射と並べて比較した。静脈内注射した後には、ＥＳＢＡ１０５の濃度が定量化の下限を下回った大脳を除いて、分析した領域すべてにおいて、ＥＳＢＡ１０５は相当の濃度に達した。しかし、鼻腔内投与後には、すべての脳領域において相当により高い薬物濃度を測定した（図２）。鼻腔内投薬したときの小脳および脳幹における最大ＥＳＢＡ１０５レベルは、静脈内注射後の最大ＥＳＢＡ１０５レベルよりも約１０〜１８倍高かった。さらに、嗅球におけるＣｍａｘは、静脈内投与に対して鼻腔内投与については６０倍を超えて高かった（表３）。驚くべきことに、投薬はどちらの経路についても同様の全身曝露を生じるように設定したにもかかわらず、鼻腔内投与後の血清濃度は明らかに低く（図２）、６００６ｎｇ／ｍｌに達した一方、静脈内注射後のＣｍａｘは１０倍を超えて高かった（６３７０９ｎｇ／ｍｌ）（表３）。静脈内注射後、嗅球、小脳および脳幹における最大濃度（Ｃｍａｘ）および曝露（ＡＵＣ）は同様の値に達し、それぞれ、Ｃｍａｘについては２０２ｎｇ／ｍｌ、２５７ｎｇ／ｍｌ、および１７４ｎｇ／ｍｌであり、ＡＵＣについては４４８ｎｇ−ｈ／ｍｌ、５６７ｎｇ−ｈ／ｍｌ、および４１６ｎｇ−ｈ／ｍｌであった。脳組織において、静脈内注射２時間後にＣｍａｘになり、４時間後にＥＳＢＡ１０５を検出しなかった。対照的に、鼻腔内投与後に、すべての脳領域において明らかにより高い濃度を測定した。最高値は嗅球で得られ（Ｃｍａｘ：１２５８６ｎｇ／ｍｌ；ＡＵＣ；２３１３０ｎｇ−ｈ／ｍｌ）、次いで脳幹（Ｃｍａｘ：３１６９ｎｇ／ｍｌ；ＡＵＣ；７９４２ｎｇ−ｈ／ｍｌ）、小脳（Ｃｍａｘ：２８１９ｎｇ／ｍｌ；ＡＵＣ：５９０８ｎｇ−ｈ／ｍｌ）および大脳（Ｃｍａｘ：１８３１ｎｇ／ｍｌ；ＡＵＣ：２９５１ｎｇ−ｈ／ｍｌ）であった。さらに、静脈内注射と対照的に、鼻腔内投与の４時間後に、すべての脳領域においてＥＳＢＡ１０５はなお検出可能な濃度であった。これらの結果は、ＥＳＢＡ１０５は、血液からＢＢＢを横切ってＣＮＳに浸透することができ、最も効率的な送達経路は鼻腔内投与によるものであることを実証している（表３）。
【００７９】
（実施例４）
（ＰＺペプチドは、ＥＳＢＡ１０５のＢＢＢを横切る送達を改善する）
本実施例は、Ｐｚペプチドが、ｓｃＦｖのＣＮＳへの鼻腔内送達を著しく増強することを実証する。特に、Ｐｚペプチドの、ＢＢＢを通って薬物を輸送するための浸透増強剤として機能する能力を、ＥＳＢＡ１０５に３ｍＭのＰｚペプチドを加え、脳への輸送を査定することによって試験した。Ｐｚペプチドの存在下で、嗅球、大脳および小脳において、ＥＳＢＡ１０５単独よりも早くＣｍａｘに達した（最初の投薬後２時間に代わって１時間）（表４）。さらに、Ｐｚペプチドを加えることにより、嗅球および大脳におけるＣｍａｘが２〜３倍増加し（それぞれ、７３０９〜１５７８６ｎｇ／ｍｌおよび１１３３〜３４１７ｎｇ／ｍｌ）、一方脳幹におけるＣｍａｘは変化がないままであった。Ｃｍａｘの組織対血中比は、嗅球および大脳において、ＥＳＢＡ１０５単独よりもＥＳＢＡ１０５とＰｚペプチドとを同時投与した方が明らかに高かった（図３Ａ）。しかし、小脳、脳幹および血清への送達に対する影響は、あまりはっきりしなかった。要約すると、Ｐｚペプチドによって、分子量が大きいタンパク質を、全身曝露を増加させることなく嗅球および大脳に送達することを増強することができる（図３）。したがって、治療への適用に関して、Ｐｚペプチドによって、全身性副作用の危険性を増加させることなく薬物送達が増強され得る（表４）。
【００８０】
【表１】
【００８１】
【表２】
【００８２】
【表３】
【００８３】
【表４】
【００８４】
【表５−１】
【００８５】
【表５−２】
【００８６】
【表５−３】
【００８７】
【表６】
【００８８】
【表７−１】
【００８９】
【表７−２】
【００９０】
【表７−３】
【００９１】
【表８】
（等価物）
当業者であれば、本明細書に記載する本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、または日常的な実験のみを使用して、それらを究明することも可能である。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合性ポリペプチドおよび浸透増強剤を含む組成物。
【請求項２】
前記浸透増強剤がＰｚペプチドまたはＦＭＯＣペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原結合性ポリペプチドがイムノバインダーである、前述の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
前記イムノバインダーがｓｃＦｖである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原結合性ポリペプチドが、ＴＮＦアルファ、アミロイドベータ、アミロイドベータ由来拡散性リガンド受容体、モノアミンオキシダーゼＢ、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンデカルボキシラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体（ＧＲＩＮ１としても公知である）、ＧＲＩＮＡ、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＩＮ３Ｂ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＮ３Ａ、ヒスタミンＨ１受容体、ムスカリン様受容体（ＣＨＲＭ１としても公知である）、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ３、ＣＨＲＭ４、ヒポクレチン受容体１、ヒポクレチン受容体２、５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＴＲ１Ａとしても公知である）、ドーパミン受容体（ＤＲＤ１としても公知である）、ＤＲＤ２、ＤＲＤ３、ＤＲＤ４、ＤＲＤ５、アドレナリンベータ１受容体、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）、およびドーパミンＤ２受容体からなる群より選択される標的抗原、特にＴＮＦアルファに特異的に結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｓｃＦｖが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、または配列番号２７と少なくとも８０％の類似性を持つアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｓｃＦｖが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号３５と少なくとも８０％の類似性を持つアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号３４と少なくとも８０％の類似性を持つアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項５または７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号３３と少なくとも８０％の類似性を持つアミノ酸配列を含む、請求項５、７または８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３６または配列番号３７と少なくとも８０％の類似性を持つアミノ酸配列をさらに含む、請求項５、７または８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗原結合性ポリペプチドが、前記浸透増強剤に共有結合している、前述の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記浸透増強剤によって、前記抗原結合性ポリペプチドの中枢神経系への選択的鼻腔内送達が促進される、前述の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
抗原結合性ポリペプチド、浸透増強剤、および使用説明書を含むキット。
【請求項１４】
医薬品として使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記医薬品が、神経性障害を処置、予防するかまたはその進行を遅延させるためのものである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
神経性障害を処置、予防するかまたはその進行を遅延させるために有用な医薬品を製造するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
前記障害が、片頭痛、うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、てんかん、脳卒中、髄膜炎、筋萎縮性側索硬化症、不眠症、髄膜炎、記憶障害、多発性硬化症、ナルコレプシー、脳卒中、外傷性脳損傷、およびストレスからなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物または請求項１６に記載の使用。
【請求項１】
抗原結合性ポリペプチドおよび浸透増強剤を含む組成物。
【請求項２】
前記浸透増強剤がＰｚペプチドまたはＦＭＯＣペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗原結合性ポリペプチドがイムノバインダーである、前述の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
前記イムノバインダーがｓｃＦｖである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原結合性ポリペプチドが、ＴＮＦアルファ、アミロイドベータ、アミロイドベータ由来拡散性リガンド受容体、モノアミンオキシダーゼＢ、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンデカルボキシラーゼ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体（ＧＲＩＮ１としても公知である）、ＧＲＩＮＡ、ＧＲＩＮ２Ｄ、ＧＲＩＮ２Ｃ、ＧＲＩＮ３Ｂ、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＮ３Ａ、ヒスタミンＨ１受容体、ムスカリン様受容体（ＣＨＲＭ１としても公知である）、ＣＨＲＭ２、ＣＨＲＭ３、ＣＨＲＭ４、ヒポクレチン受容体１、ヒポクレチン受容体２、５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＴＲ１Ａとしても公知である）、ドーパミン受容体（ＤＲＤ１としても公知である）、ＤＲＤ２、ＤＲＤ３、ＤＲＤ４、ＤＲＤ５、アドレナリンベータ１受容体、ノルエピネフリン輸送体（ＮＥＴ）、およびドーパミンＤ２受容体からなる群より選択される標的抗原、特にＴＮＦアルファに特異的に結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｓｃＦｖが、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、または配列番号２７と少なくとも８０％の類似性を持つアミノ酸配列を含む、前述の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｓｃＦｖが、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、または配列番号３５と少なくとも８０％の類似性を持つアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、または配列番号３４と少なくとも８０％の類似性を持つアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項５または７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号３３と少なくとも８０％の類似性を持つアミノ酸配列を含む、請求項５、７または８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３６または配列番号３７と少なくとも８０％の類似性を持つアミノ酸配列をさらに含む、請求項５、７または８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗原結合性ポリペプチドが、前記浸透増強剤に共有結合している、前述の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記浸透増強剤によって、前記抗原結合性ポリペプチドの中枢神経系への選択的鼻腔内送達が促進される、前述の請求項のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
抗原結合性ポリペプチド、浸透増強剤、および使用説明書を含むキット。
【請求項１４】
医薬品として使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記医薬品が、神経性障害を処置、予防するかまたはその進行を遅延させるためのものである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
神経性障害を処置、予防するかまたはその進行を遅延させるために有用な医薬品を製造するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
前記障害が、片頭痛、うつ病、アルツハイマー病、パーキンソン病、精神分裂病、てんかん、脳卒中、髄膜炎、筋萎縮性側索硬化症、不眠症、髄膜炎、記憶障害、多発性硬化症、ナルコレプシー、脳卒中、外傷性脳損傷、およびストレスからなる群より選択される、請求項１５に記載の組成物または請求項１６に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１１−５２７２８９（Ｐ２０１１−５２７２８９Ａ）
【公表日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１６９４１（Ｐ２０１１−５１６９４１）
【出願日】平成２１年７月１０日（２００９．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００３２６８
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５０２２３３３４４）エスバテック、アン アルコン バイオメディカル リサーチ ユニット、エルエルシー (19)
【氏名又は名称原語表記】ＥＳＢＡＴｅｃｈ， ａｎ Ａｌｃｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｎｉｔ， ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１０月２７日（２０１１．１０．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１０日（２００９．７．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＨ２００９／０００２４８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００３２６８
【国際公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【出願人】（５０２２３３３４４）エスバテック、アン アルコン バイオメディカル リサーチ ユニット、エルエルシー (19)
【氏名又は名称原語表記】ＥＳＢＡＴｅｃｈ， ａｎ Ａｌｃｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｕｎｉｔ， ＬＬＣ
【Ｆターム（参考）】
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