Ｃεへの免疫グロブリン重鎖クラススイッチングが増強された高ＩｇＥ動物モデル
免疫グロブリン重鎖遺伝子がｃイプシロンへのスイッチの増強された確率を有する動物モデル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についてのクロスリファレンス
本出願は、２００９年２月２７日に出願された「Ｃεへの免疫グロブリン重鎖クラススイッチングが増強された高ＩｇＥ動物モデル」と題する米国仮特許出願出願番号６１／１５６，２９９に対して優先権を主張する。
【０００２】
配列表
配列番号：１−２０を含む配列表は、表１として本願明細書に添付される。配列表において提供されるそれぞれの配列は、あらゆる目的のために、その全てが本願明細書に援用されたものとする。
【０００３】
技術分野
この開示は、アレルギー治療を試験するための組み換えマウス及び方法に関連する。
【０００４】
背景
喘息は、先進国世界人口の５分の１に影響を及ぼす衰弱性疾患である。重症喘息は、入院及び健康管理費用の主要な原因である。臨床診療において、喘息は、皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）又はインビトロ技術（ＲＡＳＴ又はＥＬＩＳＡ）によって検出される局所的空中アレルゲンに対する循環ＩｇＥの有無によりアトピー性又は非アトピー性に分類される。これらのＩｇＥ抗体はマストセル上の高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）と相互作用し、アレルゲン誘発の即時過敏症及び疾患の急性増悪を引き起こす。
【０００５】
成体喘息患者の約３分の１は非アトピー性に分類される。それらはより重症疾患（多くの場合慢性鼻副鼻腔炎と関連している）を有する傾向があるが、アレルゲンへの急性反応性の欠如は別として、それらの疾患は臨床的に類似している。
【０００６】
アレルギーは、一般に即時過敏症型の、アレルゲンと呼ばれる抗原の特定の型に対する免疫反応である。そのような反応は、アナフィラキシー、アレルギー性鼻炎（花粉症）、蕁麻疹及びアレルギー性喘息の発作の基礎をなしており、ブタクサ、花粉、ミツバチ又はスズメバチの毒、動物の鱗屑、カビ又はハウスダスト（例えばダニ）の成分のような共通のアレルゲンによって誘発され得る。
【０００７】
喘息、アレルギー性鼻炎及び過敏性皮膚炎の間には近い一致がある；これらの対象物の一つの存在は、他の２つの相対リスクを、対象の生涯にわたり３−３０倍増加させる。これらの疾患のうちの３つ全ては、高レベルの非特異性及び抗原特異性血清免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）と関連している。
【０００８】
ヒトにおいて、即時過敏症（ＩＨ）は、皮膚及びその他に存在するマストセル及び好塩基球の表面に固着されたＩｇＥアイソタイプの抗体によって媒介される。これらの細胞結合ＩｇＥ分子への抗原の結合は、細胞からヒスタミンのようなメディエーターの放出を誘発し、メディエーターが臨床現象（例えばアレルギー性反応を象徴する組織の膨張、そう痒又は気管支の平滑筋収縮）を誘導する。
【０００９】
特定のアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体は、アレルゲンの接触に応じてＢリンパ球によって産生及び分泌される。まず最初に、Ｂリンパ球（又はＢ細胞）はＩｇＭアイソタイプの抗体を発現し、それぞれのＢ細胞は特定の抗原決定基に特異的な抗体を製造することに関与している。抗原決定基を有するアレルゲン及びＴリンパ球によって製造される特定の因子の両方との接触により、Ｂ細胞がいわゆる抗体重鎖クラススイッチを経るように誘導される（Ｂ細胞によって産生される抗体の抗原特異性部分は変化しない）が、それはＩｇＭアイソタイプのμ−重鎖よりもε−重鎖（産生ＩｇＥ抗体）に付着される。そのようなクラススイッチは一見特定のＢ細胞にとって永続的であり、そうするように刺激されたときはいつでもアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体を分泌する。
【００１０】
マウスにおけるオバルブミン（ＯＶＡ）−誘導喘息は、ヒト喘息の最も一般的に用いられるモデルの一つである。Ｔｈ２型細胞は、ＯＶＡ誘導喘息の病因において決定的であると考えられる。Ｔｈ２リンパ球がアレルギー性喘息の開始、進行及び持続において重要な役割を果たすことは公知であるのに対して、免疫調節性メカニズムについては理解されるべきことが多く存在する。このモデルは、高ＩｇＥと関連するヒト疾患を模倣していない。
【００１１】
アレルギー性喘息モデルは、大きい動物モデル（例えばネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ及びサル）においても記載されている。これらの種の中で、ネコが自然に特発性の喘息を発症するので、ネコ科のものは特に興味がある。しかしながら、大きい動物モデルは、高価で、時間がかかり、免疫学的及び／又は分子ツールとしての利用可能性が限られている。
【００１２】
ＵＳ６１１８０４４（２０００）は、ＩｇＥ重鎖定常領域を有し、予め定義された抗原（すなわちＴＮＰ）に特異的な、導入遺伝子によってコード化される抗体型分子を恒常的に発現するトランスジェニックマウスを提供する。それは、未知又は非特異的抗原に対してポリクローナル反応を生じない。
【００１３】
現在、ヒト喘息の多くの主要な病理学的特徴（例えば平滑筋のマストセル浸潤）を欠いていることから、慢性気道疾患の望ましいモデルは存在しない。さらに、マウスは喘息にかからないので、それらのほぼ全ては時間とともに自然に回復する。したがって、抗体レパートリーがポリクローナルである天然のヒト以外の動物と比較して高いＩｇＥ反応を起こすことが可能なヒト以外の動物モデルを有することが望ましい。
【００１４】
現在、アレルギーに対する共通の治療は、推測されるアレルゲンの回避；特定の保護メカニズムを刺激し、それにより最終的にはアレルゲンへの宿主の感度を減少させる免疫療法としてのアレルゲンの注入；コルチコステロイドのような薬剤（マストセルからアレルギーのメディエーターの放出に干渉する）；及び抗ヒスタミン薬のような薬剤（放出されたメディエーターの生物学的作用を阻害する）を含む。しかしながら、アレルギー治療（特に副作用のないＢ細胞においてＩｇＥアイソタイプスイッチを阻害する治療剤）を試験するための望ましい動物モデルが存在しない。
【００１５】
したがって、高いＩｇＥ反応を起こす能力を有する細胞及び／又は動物を有することが望ましい。換言すれば、ＩｇＥ製造のための選択的鎖スイッチ組換えの速度を増強することが望ましい。
発明の簡単な要約
【００１６】
進行中の調査にもかかわらず、非特異的抗原（すなわち予め定義されていない抗原）へのポリクローナル反応を起こす喘息、アレルギー及び他の免疫性病態へのＩｇＥの関与のインビボモデルに対するニーズがある。高い血清ＩｇＥ反応がある高ＩｇＥ産生インビボ動物モデルも存在しない。
【００１７】
本願明細書において、抗アレルギー薬のサーチ及び／又は評価のための信頼性が高いモデルとして有用な組換え非ヒト動物（及びそれを用いる方法）が提供される。
【００１８】
野生型（すなわち天然又は未改変の）免疫グロブリン遺伝子座に実質的に類似する遺伝子座のゲノム構造を有し、抗原曝露に応答して免疫グロブリンの完全なレパートリーを提供する潜在性を保持する動物モデルは、ＩｇＥアイソタイプスイッチを阻害する抗アレルギー薬のサーチ及び／又は評価を可能にする。
【００１９】
本願明細書の開示は、アレルギー治療を試験するための動物モデルを提供する。動物モデルは抗原チ曝露への応答において抗体産生の広い多様性を提供し、抗体アイソタイプの完全な多様性及び抗原上のエピトープへの特異性の完全な成分を産生する。動物モデルは、さらに、アレルギー及び喘息に対するＩｇＥの生理的重要性を理解する手段を提供する。
【００２０】
第一の実施態様において、以下を含むターゲッティングベクターが提供される：
ａ）変更されるスイッチ領域の５’末端（５’アーム／アクセプター）に相同なＤＮＡの断片は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）のヌクレオチド２５４７０６２８から２５４６８１６１（配列番号：５）に対応する少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２００ヌクレオチド及び少なくとも２４００ヌクレオチドからなる群から選択される；
ｂ）選択可能な遺伝子マーカー；
ｃ）ドナースイッチ領域をコード化する、所望の／ドナーのＤＮＡ配列；及び
ｄ）変更されるスイッチ領域の３’末端（３’アーム／アクセプター）に相同なＤＮＡの第二の断片は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ １系統）のヌクレオチド２５４７０６２８から２５４６８１６（配列番号：８）に対応する少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２００ヌクレオチド及び少なくとも２４００ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２１】
一態様において、ターゲッティングベクターは、配列番号：４又は５を含む５’アームを有する。実施態様において、５’アームは、配列番号：４の残基２５−２４７１を含む。更なる態様において、５’アームは、内因性Ｉεの領域３’及び内因性Ｓεの５’に相同である。第二の態様において、ターゲッティングベクターは、配列番号：７又は８を含む３’アームを有する。実施態様において、３’アームは、配列番号：７の残基２−２４９５を含む。第三の態様において、ターゲッティングベクターは、ネオマイシン及びチミジンキナーゼからなる群から選択される選択可能な遺伝子マーカーを有する。更なる態様において、選択可能な遺伝子マーカーは、ネオマイシンである。第四の態様において、ターゲッティングベクターは、ｌｏｘｐ部位が隣接する選択可能な遺伝子マーカーを有する。第五の態様において、ターゲッティングベクターは、ヒト及びマウスからなる群から選択される所望のスイッチ領域を有する。第六の態様において、所望のスイッチ領域は、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択される。第七の態様において、所望のスイッチ領域は、マウスＳμ領域の大部分を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ断片である。第八の態様において、所望のスイッチ領域は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）のヌクレオチド２５６１７１７２から２５６１５７６１（配列番号：６）を含む。第九の態様において、４．９ｋｂのＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むＳμ領域は、ＢＡＣクローンＲＰ２３−３５４Ｌ１６から単離されたゲノム断片を含むプラスミドからサブクローニングされた。
【００２２】
第二の実施形態において、以下の工程を含む改変された胚性幹細胞をインビトロで製造する方法が提供される：
ａ）以下から選択される、Ｃεを発現するためにクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の確率を増強するために前記細胞のゲノムＤＮＡを改変する工程；
ｂ）内因性のＳε領域に直列に少なくとも一つの付加的なＳεコピーを付加することによってＳε長を増加させる工程；
ｃ）Ｓε領域の置換；及び
ｄ）正しく改変されたゲノムＤＮＡのために細胞を選択する工程。
【００２３】
ある態様において、改変は、Ｓε領域の、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択されるスイッチ領域での置換である。更なる態様において、改変は、Ｓε領域の、Ｓμ領域での置換である。更なる態様において、改変は、任意のアクセプターＳ領域（Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３、Ｓａ）のＳｍでの置換、又はその逆である。
【００２４】
第三の実施態様において、以下の工程を含む改変された胚性幹細胞（ＥＳＣ）をインビトロで製造するための方法が提供される：
ａ）ＳμをＳε領域と交換するために請求項１のベクターを用いる工程
ｂ）正しく改変されたゲノムＤＮＡの細胞を選択する工程。
【００２５】
一つの態様において、本発明の方法は、Ｓε領域を、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択されるスイッチ領域で置換する改変を提供する。更なる態様において、本発明の方法は、Ｓε領域をＳμ領域で置換する改変を提供する。別の態様において、本発明の方法は、ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６から選択されるマウス系統のＥＳＣを提供する。
【００２６】
第四の実施態様において、以下の非ヒト動物が提供される：
ａ）ＩｇＨ遺伝子座の少なくとも一つのアレルが、非改変アレルと比較してＩｇＥ発現／産生／分泌／速度を増強するように改変されている；及び
ｂ）以下からなる群から選択されるＩｇＥプロファイルを有している：
ｉ．全ての血清抗体のＩｇＥ画分が０．０４％以上である；
ｉｉ．ＩｇＥ血清中濃度が４，０００ｎｇ／ｍｌ以上である；
ｉｉｉ．ＩｇＧ／ＩｇＥの比率が１０未満である。
【００２７】
第一の態様において、ヒト以外の哺乳動物は、４，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１０，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上、３０，０００ｎｇ／ｍｌ以上、９０，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１０μｇ／ｍｌ以上、２０μｇ／ｍｌ以上、３０μｇ／ｍｌ以上、４０μｇ／ｍｌ以上、５０μｇ／ｍｌ以上、６０μｇ／ｍｌ以上、７０μｇ／ｍｌ以上、８０μｇ／ｍｌ以上、９０μｇ／ｍｌ以上又は１００μｇ／ｍｌ以上のＩｇＥ血清レベルを有する。第二の態様において、ヒト以外の哺乳動物は、０．１から１０のＩｇＧ／ＩｇＥ比を有する。第三の態様において、ヒト以外の哺乳動物は、１００ｎｇ／ｍＬから１００００ｎｇ／ｍＬの曝露されていない（すなわち休止期の）ＩｇＥ血清中濃度を有している。第四の態様において、ヒト以外の哺乳動物は、１０００ｎｇ／ｍＬから１００００００ｎｇ／ｍＬの曝露された（すなわち活性化又は刺激された）ＩｇＥ血清中濃度を有している。第五の態様において、動物モデルはヒト以外の脊椎動物である。第六の態様において、動物モデルは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ又は霊長類である。第七の態様において、本願明細書に記載される非動物のゲノムは、より多くのＩｇＥを発現／産生するように改変されたＩｇＨ遺伝子座のＳε領域を有している。第八の態様において、ヒト以外の動物／哺乳動物モデルは、ジーンターゲッティングによって達成される改変を有する。第九の態様において、ヒト以外の哺乳動物は、少なくとも０．０４％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％又は１．０％のＩｇＥ画分を有する。
【００２８】
第五の実施態様において、アレルギー性疾患の治療方法の投与の前、同時又は後に動物をアレルゲンに暴露すること、及びＩｇＥ反応を評価することを含む、動物モデルを用いたアレルギー治療を試験する方法が提供される。本発明の方法の第一の態様において、抗原曝露への応答におけるＩｇＥレベルは、アレルギー治療をしない場合よりも低い。第二の態様において、試験動物及びコントロール動物は、同腹仔である。
【００２９】
第六の実施態様において、アレルギー治療を試験する方法によりアレルギーの治療のための医薬として同定された化合物の使用が提供される。
【００３０】
第七の実施態様において、本願明細書に記載される動物モデルから入手可能な細胞株が提供される。
【００３１】
第八の実施態様において、本願明細書に記載される動物モデルから単離される細胞が提供される。
【００３２】
第九の実施態様において、非ヒト動物モデルの作出方法が提供され、前記方法は：
ａ）断片がＣε−コード化領域の上流においてゲノムＤＮＡに組み込まれ、Ｃε−コード化領域に作動可能に連結されるように、マウスの受精卵に配列番号：６（Ｓμ）をコード化するプラスミドの直線化断片を顕微注入すること、ｂ）前もって偽妊娠を誘導するように処理された雌マウスの卵管に前記受精卵を移植すること、及びｃ）雌マウスの子宮において前記卵子を発生させること、を含む。
【００３３】
第十の実施態様において、ＩｇＥ産生率を増強するように改変されたＩｇＨ遺伝子座の少なくとも一つのアレルを含む改変ゲノムを生殖系列に含む組換えマウスが提供される。第一の態様において、組換えマウスは、Ｓε領域のＳμ領域又はその機能部分での置換を含む改変を有する。第二の態様において、Ｓμ機能部分は、少なくとも１ｋｂから１０ｋｂ長である。
【００３４】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明白になる。しかしながら、この詳細な説明から本発明の範囲及び趣旨の様々な変型及び改変が当業者にとって明らかになるので、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しているが、例示することのみを目的としていることはよく理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、マウスＩｇＨ遺伝子座の遺伝子改変の概略図である。（Ａ）生殖系列配置におけるＣｍまでの可変領域のゲノム機構。（Ｂ）Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子組換えは、Ｂ細胞を産生する低親和性ＩｇＭの大きいプールを生成する機能コード化可変領域を構築する。（Ｃ）ＡＩＤ及び生殖系列転写の誘導に付随するＢ細胞の活性化はＳＨＭを引き起こし、ポイントミューテーションは構築された可変領域に導入される（アスタリスク）。Ｓｍ及び下流のＳ領域（例えばＳｇ１）におけるＡＩＤ媒介ＤＳＢｓ（電光シンボル）は、新規のアイソタイプ（例えばＩｇＧ１）転写を引き起こすために接続される。さらに、切除された環状の断片は、介在配列を接続することによって生成される。
【００３６】
【図２Ａ】図２Ａは、ジーンターゲッティングストラテジーの概略図及びマウスＳε領域の改変のための組換え部位を例示する。Ｃｒｅ＿ｌｏｘＰ遺伝子組換え後の標的アレルの構造は、一番下に例示される。制限酵素切断部位は明示される。Ｒ１は、ＥｃｏＲＩのためのスプライスサイトを示す。他の全ての制限酵素は、それらの正式な表記を有する。
【００３７】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ターゲッティングベクターｐＳＷ３１２の概略図である。実施例３を参照のこと。
【００３８】
【図３】図３は、ドナースイッチ領域を有するＳε領域の置換の前後のマウスＩｇＨ遺伝子座全体の概略図である。このダイアグラムにおいて、ドナースイッチ領域はＳμである。上のパネルは、未改変ＩｇＨ遺伝子座である；下のパネルは、本願明細書に記載される改変ＩｇＥ遺伝子座を例示する。
【００３９】
【図４Ａ】図４Ａは、未改変（すなわち野生型）ゲノム遺伝子座の概略図であり、制限酵素認識部位、プローブ及びスイッチ領域の相対的位置関係を例示する。５’相同アームは、ブラックボックスによって表される。３’相同アームは、灰色のボックスによって表される。
【００４０】
【図４Ｂ】図４Ｂは、改変ゲノム遺伝子座の概略図であり、Ｓｍで置換されたＳｅを有する制限酵素認識部位、プローブ及びスイッチ領域の相対的位置関係を例示する。５’相同アームは、ブラックボックスによって表される。３’相同アームは、灰色のボックスによって表される。
【００４１】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＳμでのＳεの置換を確認するサザンブロットである。野生型Ｂ６試料は関連する大きさのバンドを一つのみ示し、単一のゲノムＩ領域の存在を示しているのに対し、標的胚性幹細胞試料は異なる大きさの２つのバンドとして明らかにされた野生型及び標的Ｓ部位（ＳεがＳμで置換されている）を示す。これは、意図されたスイッチ領域の成功したターゲッティング及び置換を示す。
【００４２】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＳμでのＳεの置換を確認するサザンブロットである。野生型Ｂ６試料は関連する大きさのバンドを一つのみ示し、単一のゲノムＩ領域の存在を示しているのに対し、標的胚性幹細胞試料は異なる大きさの２つのバンドとして明らかにされた野生型及び標的Ｓ部位（ＳεがＳμで置換されている）を示す。これは、意図されたスイッチ領域の成功したターゲッティング及び置換を示す。
【００４３】
図５−１１は、本願明細書に記載されるヌクレオチドを示す。ヌクレオチド塩基コードは、以下の通りである：Ａ又はａはアデニンである；Ｃ又はｃはシトシンである；Ｇ又はｇはグアニンである；Ｔ又はｔはチミンである；Ｍ又はｍは、アデニン又はシトシンである；Ｓ又はｓは、シトシン又はグアニンである；及び、Ｎ又はｎは、アデニン又はシトシン又はグアニン又はチミンである。
【００４４】
【図５】図５は、マウスの２つのヌクレオチド配列を示す。モチーフＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＧ（図５Ａに示される配列番号：１）はＳｍ及びＳｅにおいて見いだされ、第二のモチーフＧＡＧＣＴＧＡＣＴはＳｅ領域においてわずかにＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴに改変された（Ｓｍモチーフと比較して付加されたＧを有する）（図５Ｂに示される配列番号：２）。
【００４５】
【図６】図６は、ＩｇＨ遺伝子座のＢａｍＨＩ／ＰＶｕＩ断片から欠失された２０５５塩基対（配列番号：３）を示す。
【００４６】
【図７】図７は、Ａ）配列番号：４、２４７１塩基対５’アーム（１２９マウス）、及びＢ）ＮＣＢＩ ＮＴ＿１６６３１８のヌクレオチド２５４６８１６１から２５４７０６２８に対応する配列番号：５、２４６７の塩基対５’アーム（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ系統）を示す。
【００４７】
【図８】図８は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）のヌクレオチド２５６１７１７２から２５６１５７６１に対応する配列番号：６（大文字で）（１１４１の塩基対）を示す。
【００４８】
【図９】図９は、Ａ）配列番号：７、３’アーム（１２９マウス配列）、及びＢ）ＮＣＢＩ ＮＴ＿１６６３１８の２５４６３２７３から２５４６６１０６に対応する配列番号：８、３’アーム（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ配列）を示す。
【００４９】
【図１０】図１０は、Ａ）ＢａｍＨＩの３．７ｋｂ上流（５’プローブを設計するために用いられた）（配列番号：９）、及びＢ） ＰＶＵＩからＥＣＯＲＩの断片（３’プローブを設計するために用いられた）（配列番号：１０）を示す。
【００５０】
【図１１】図１１は、実施例２において用いられたプローブを示す。Ａ）配列番号：１１、Ｉ−ｍｕ Ｆｏｒｗａｒｄ−１（２１塩基対）；及びＢ）配列番号：１２、Ｃ−ｅｐｓｉｌｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−１（３０塩基対）；Ｃ）配列番号：１３、Ｅ−ｍｕ Ｆｏｒｗａｒｄ−２（２０塩基対）；Ｄ）配列番号：１４、Ｃ−ｅｐｓｉｌｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−２（３０塩基対）；Ｅ）配列番号：１５、Ｆｏｒｗａｒｄ：ＳＭ５’（２０塩基対）；Ｆ）配列番号：１６、９２２５Ｆ（１９塩基対）；Ｇ）配列番号：１７、９５１８Ｆ（２６塩基対）；及びＨ）配列番号：１８、Ｒｅｖｅｒｓｅ（３０塩基対）。
【００５１】
【図１２】図１２は、ＢＡＣ ＲＰ２３−１３５Ｌ１２（Invitrogen）から読み出されたＩｇＥ Ｃ５７ＢＬ／６ゲノム配列（太字で下線を引かれたフォントに示された欠失されるＳｅ領域）である（配列番号：１９）。
【００５２】
【図１３】図１３Ａ−Ｄは、免疫刺激後の野生型（ＷＴ）及びヘテロ接合体（ＨＥＴ）脾細胞における様々な免疫グロブリンの細胞内レベルのＦＡＣＳデータをまとめている。図１３Ａは、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激後のＩｇＭレベルがＷＴ及びＨＥＴ動物で同一であることを示す棒グラフである。図１３Ｂは、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激後のＩｇＧ３レベルがＷＴ及びＨＥＴ動物で同一であることを示す棒グラフである。図１３Ｃは、ＩＬ−４と抗ＣＤ４０（４／４０）の併用刺激後のＩｇＧ１レベルがＷＴと比較してＨＥＴ動物において減少したことを示す棒グラフである。図１３Ｄは、ＩＬ−４と抗ＣＤ４０（４／４０）の併用刺激後のＩｇＥレベルがＷＴと比較してＨＥＴ動物において増加したことを示す棒グラフである。
【００５３】
【図１４】図１４Ａ−Ｄは、図１３に示されるデータを作成するために用いられたものと同一の脾細胞についてのＥＬＩＳＡデータを要約している。刺激後６日目において、ＦＡＣＳ解析のために用いられたものと同じように刺激された脾細胞（３匹のＨｅｔ及び３匹のＷＴマウス）の上清は、ＥＬＩＳＡアッセイに用いられた。ＦＡＣＳ解析において観察されたものと一致して、ＩＬ４／抗−ＣＤ４０で刺激された場合、ＷＴと比較してＨｅｔにおいて増加したＩｇＥ発現レベル及び減少したＩｇＧ１発現レベルも観察された。これは、ＩｇＧ１へのスイッチと競合し、ＩｇＥスイッチレベルを増加させるＳｍＫＩ部位において頻繁な破壊が発生していることを示唆する。ＬＰＳ刺激はコントロールとして働き、ＷＴ及びＨｅｔが同様のＩｇＭ及びＩｇＧ３レベルを有することを示しており、他のスイッチ配列がクラススイッチのために利用できる場合、遺伝子座が未改変で、正常に機能することを示唆する。
【発明の詳細な説明】
【００５４】
本発明は、次に、参照することを目的に以下の定義及び例のみを用いて詳述される。本願明細書に言及される全ての特許及び刊行物は、特許及び刊行物中で開示される全ての配列を含めて、明確に出典明示により援用されたものとする。
【００５５】
本願明細書に定義されない限り、本願明細書において用いられる全ての専門的及び科学的な用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED.、John Wiley and Sons, New York (1994)及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本発明において用いられる用語の一般的な定義の多くを当業者に提供する。本願明細書に記載されるものと類似又は同等なあらゆる方法及び材料を本発明を実行又は試験する際に用いることができるが、好ましい方法及び材料を記載する。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。特に明記しない限り、それぞれ核酸は左から右に５’から３’方向に記載され；アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載される。専門家は、技術の定義及び用語について、特にSambrook et al., 1989, and Ausubel FM et al., 1993を参考にする。本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び試薬には限定されず、異なり得ることはよく理解されることである。
【００５６】
数値範囲は、範囲を定義している数値を含む。
【００５７】
特に明記しない限り、それぞれ核酸は左から右に５’から３’方向に記載され；アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載される。
【００５８】
本願明細書に提供される見出しは、明細書全体を参照することで得られる本発明の様々な態様又は実施態様を限定するものではない。したがって、下記に定義される用語は、明細書全体を参照することでより明確に定義される。
【００５９】
定義
新規な組換え非ヒト宿主、特に哺乳動物宿主、通常ミューリン（ｍｕｒｉｎｅ）は提供され、宿主は免疫原（抗原とも称される）に対して免疫応答を開始することが可能である。総血清Ｉｇ濃度の高いＩｇＥ成分又は画分を伴うが、産生される免疫応答は抗体の完全なレパートリーである。
【００６０】
「組換え」は、動物又は細胞のＤＮＡが遺伝子工学による改変を含むことを意味する。したがって、例えば、「組換え動物」は、本願明細書に記載されるように、少なくとも一部の細胞が遺伝子組換えを含むものである。同様に、「組換え細胞」は、本願明細書に記載されるように、そのゲノムが遺伝子組み替えを有するものである。
【００６１】
「非特異的抗原」は、単独又はより大きな分子（タンパク質）と複合体を形成した後に免疫応答を引き起こし、免疫応答の産物（抗体又はＴ細胞）と結合可能な、身体にとって異質なあらゆる物質（免疫原又はハプテン）を意味する。
【００６２】
本明細書において使用されるように、「アイソタイプ」は、重鎖定常域遺伝子によってコード化される抗体クラス（例えばＩｇＭ又はＩｇＧ１）を意味する。
【００６３】
本明細書において使用されるように、「アイソタイプスイッチング」は、抗体のクラス又はアイソタイプがあるＩｇクラスから他のＩｇクラスに変化する現象を意味する。
【００６４】
本明細書において使用されるように、「非スイッチアイソタイプ」は、アイソタイプスイッチングが起こらなかった場合に産生される重鎖のアイソタイプクラスを意味する；非スイッチアイソタイプをコード化しているＣＨ遺伝子は、一般的に機能的に再編成されたＶＤＪ遺伝子のすぐ下流の第一のＣＨ遺伝子である。
【００６５】
本明細書において使用されるように、用語「スイッチ配列」は、スイッチ組換えに関与するＤＮＡ配列を意味する。クラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の間、「スイッチドナー」配列（一般的にμスイッチ領域）は、スイッチ組換えの間に欠失される領域の５’（すなわち上流）に存在する。「スイッチアクセプター」領域は、欠失される領域と置換定常領域（例えばγ、ε等）との間に存在する。遺伝子組換えが常に発生する特定の部位がないように、最終的な遺伝子配列は一般的に予測可能でない。スイッチ配列は、本願明細書においてスイッチ領域と交換可能に用いられる。
【００６６】
本願明細書に記載される遺伝子改変（すなわち組換え）動物において、スイッチアクセプター領域は、血清ＩｇＥレベルが上昇するように、ＣＳＲを増強するように改変される。
【００６７】
Ｓ領域は、長さにおいて大きく異なる、大きな反復性イントロン配列である（反復領域は、マウスにおいて２．０から６．５ｋｂにわたる）。哺乳動物Ｓ領域は、非鋳型鎖上で非常にＧが豊富であり、主にＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴ、ＧＧＧＣＴ、ＧＡＧＣＴ及びＡＧＣＴなどの特定のモチーフが優勢な直列型の反復ユニットから構成される。
【００６８】
用語「再編成された」は、本願明細書で用いられるように、基本的に完全なＶＨ又はＶＬドメインのそれぞれをコード化しているコンフォメーションにおいてＶセグメントがＤ−Ｊ又はＪセグメントに隣接して位置する、重鎖又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を意味する。再編成された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡとの比較により同定することができる；再編成された遺伝子座は、少なくとも一つの組換え七量体／九量体相同エレメントを有する。
【００６９】
用語「再編成されていない」又は「生殖系列配置」は、Ｖセグメントに関して本願明細書において用いられるように、ＶセグメントがＤ又はＪセグメントと隣接するために組み換えられていない配置を意味する。図１を参照のこと。
【００７０】
核酸のために、用語「実質的な相同性」は、２つの核酸又はその明示された配列は、最適に整列して比較した場合、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を伴い、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は約９０から９５％、より好ましくはヌクレオチドの少なくとも約９８〜９９．５％が同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で相補鎖にハイブリダイズする場合、実質的な相同性が存在する。核酸は、細胞全体、細胞可溶化物、又は部分的に精製されたか実質的に純粋な形態中に存在し得る。アルカリ性の／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野で周知の他の標準技術を含む標準技術によって、他の細胞成分又は他の不純物、例えば他の細胞の核酸又はタンパク質から精製された場合、核酸は「単離された」又は「実質的に純粋になる」。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)を参照のこと。
【００７１】
ｃＤＮＡ、ゲノム又は混合物からの本発明の核酸組成は、多くの場合天然配列であるが（改変された制限酵素認識部位などを除いて）、遺伝子配列を提供する標準技術に従って変異させてもよい。コード化配列に対して、これらの変異は要望通りにアミノ酸配列に影響を及ぼし得る。特に、天然のＶ配列、Ｄ配列、Ｊ配列、定常配列、スイッチ配列及び本明細書に記載される他の配列に実質的に相同的なＤＮＡ配列又はそれから誘導されるＤＮＡ配列が意図される（「誘導された」は、配列が同一又は他の配列から改変されることを示す）。
【００７２】
核酸が他の核酸配列と共に機能的関係に入れられる場合、核酸は「作動可能に連結される」。例えば、配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーター又はエンハンサーはコード化配列に作動可能に連結される。転写制御配列に関して、作動可能に連結は、連結されるＤＮＡ配列が近接し、２つのタンパク質コード化領域を連結する必要がある場合に近接し、リーディングフレーム中に存在することを意味する。スイッチ配列に対して、作動可能に連結は、配列がスイッチ組換えをもたらすことが可能なことを示す。
【００７３】
抗体レパートリーを伴って異物抗原刺激に反応する非ヒト動物の設計は、動物に含まれる免疫グロブリン遺伝子がＢ細胞発生経路にわたって正しく機能することが必要である。重鎖遺伝子の正しい機能は、アイソタイプスイッチングを含む。したがって、本発明の遺伝子は、アイソタイプスイッチング及び以下の一以上を生じさせるために構築される：（１）高レベル及び細胞型特異的な発現、（２）機能遺伝子再構成、（３）アレル排除の活性化及びアレル排除への反応、（４）充分な一次レパートリーの発現、（５）シグナル伝達、（６）体細胞性過剰変異及び（７）免疫応答中のＩｇＥ抗体遺伝子座の支配。
【００７４】
マウスにおいて、ＣＨ遺伝子は、５’−Ｖ（Ｄ）Ｊ−Ｃμ−Ｃδ−Ｃγ３−Ｃγ１−Ｃγ２ｂ−Ｃγ２ａ−Ｃε−Ｃα−３’の順で編成される。ＣＳＲは、個々のＣＨ遺伝子の１から１０キロベース（ｋｂ）の反復ＤＮＡエレメント５’であるスイッチ（Ｓ）領域において発生する。ＣＳＲはＣｍ（Ｓｍ）上流のＳ領域とＳ領域の下流の間での組換えから生じ、介在配列の欠失が付随する。
【００７５】
免疫グロブリン
免疫系は、抗体を産生することによって異種侵入物（抗原）に応答する。抗体は、侵入する微生物に自身を付着させ、破壊するためにそれらを標識する、又は細胞に感染するのを予防するタンパク質分子である。抗体は、抗原特異的である。すなわち、抗原暴露に応答して産生される抗体は、その抗原に特異的である。
【００７６】
哺乳動物は、四つのＩｇアイソタイプ（又はクラス）を産生する：ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＡ（それぞれ、μ、γ、ε及びα定常領域によってコード化される）。
【００７７】
関連するＩｇＧサブクラスは、異なるＣγ領域によってコード化される。それぞれのＩｇアイソタイプは、抗原除去の特定の形態に特殊化されている。ＩｇＭ（Ｂ細胞によって合成される第一のアイソタイプ）は、補体を活性化する。ＩｇＧ（血清において最も豊富なアイソタイプ）は、食細胞上の受容体に結合する。ＩｇＧ抗体は、胎児へ母性保護を提供するために、胎盤を越える。ＩｇＡ抗体は、分泌物（例えば涙及び唾液）において豊富である；それらは、侵入した病原体の増殖を予防するために被覆する。ＩｇＥ抗体は寄生線虫に対する保護を提供することができるが、それらは先進国において悪者である：それらは好塩基及びマストセルに結合し、ヒスタミン放出を活性化して、アレルギー応答を引き起こす。
【００７８】
免疫原（又は抗原）は、抗体反応を誘発することができる。多くの異なる型の抗原の成功した認識及び根絶には、抗体の多様性が必要とされる；それらのアミノ酸組成は異なり、それらが多くの異なる抗原と相互作用することができる。ヒトは約１００億の異なる抗体を生成し、それぞれの抗原の異なるエピトープに結合することが可能であることが推測されている。異なる抗体の膨大なレパートリーが単一の個体において生成されるにもかかわらず、これらのタンパク質を製作するために利用可能な遺伝子の数は限られている。脊椎動物Ｂ細胞が比較的少ない抗体遺伝子から抗体の多様なプールを生成することを可能とするいくつかの複雑な遺伝子のメカニズムが進化してきた。
【００７９】
Ｂ細胞の発生
Ｂ細胞は、成熟した機能的細胞になる前に、骨髄及び脾臓において一連の分化チェックポイントを経る。分化を続けるか、細胞死を経るかの決定は、これらのチェックポイントで発生し、主に免疫グロブリンＢ細胞受容体（ＢＣＲ）及び抗原結合性及びシグナル伝達分子として機能する能力を中心に展開する。そのような最初の二つのチェックポイントは、新しく合成された重鎖（Ｈ）がプレ−ＢＣＲを形成するために代替軽鎖（Ｌ）と結合するプロ−Ｂからプレ−Ｂへの移行における骨髄、及びＨ鎖がＢＣＲを形成するために通常のＬ鎖と結合するｐｒｅ−Ｂから未分化Ｂ細胞のステージにおける骨髄に存在する。プレ−ＢＣＲ又はＢＣＲを形成することができない細胞はアポトーシス（プログラム細胞死）を経るが、ＢＣＲを形成することができるものは分化を続ける。末梢へ移動する成熟Ｂ細胞は抗原によって活性化され、抗体を分泌するプラズマ細胞又はメモリーＢ細胞となり、より迅速に抗原への２度目の暴露に反応する。抗原活性化Ｂ細胞が増殖するのを止める場合、それらは成熟プラズマ細胞に分化することができる。プラズマ細胞は、基本的に『抗体工場』である。（Hardy & Hayakawa, B Cell Development Pathways, Annu Rev Immunol. (2001) 19:595-621を参照。）
【００８０】
最初に、全てのＢ細胞は、ＩｇＭ抗体を産生する。ｍ重鎖の可変領域ドメインをコード化しているＶ、Ｄ及びＪエレメントは、ＩｇＭＣ領域をコード化するＣｍエキソンに隣接して免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座の５’末端に位置する。適切な刺激に続いて、Ｂ細胞は、抗体の抗原特異性を保持しながら、クラススイッチングにより、産生する抗体のアイソタイプを変えることができる。クラススイッチングは、クラススイッチ組換え（ＣＳＲ）と呼ばれるメカニズムによって、重鎖遺伝子座において発生する。このメカニズムは、それぞれの定常域遺伝子（δ−鎖を除く）の上流のＤＮＡにおいて見いだされるスイッチ（Ｓ）領域と呼ばれる保存されたヌクレオチドのモチーフに依存する。このプロセスにおいて、ゲノムＤＮＡはスプライシングされ、それぞれＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＡアイソタイプのγ、ε及びα鎖をコード化するＣ領域エキソンにＶＤＪエレメントを並置するために再結合される；これらのＣ−領域エキソンは、ＩｇＨ領域のさらに下流に位置する。このプロセスは、異なるアイソタイプの抗体をコード化する免疫グロブリン遺伝子をもたらす。
【００８１】
Ｓ領域
活性化Ｂ細胞におけるＣγ、Ｃε及びＣα遺伝子の発現の抗体クラススイッチングの分子基盤は、ＶＤＪ遺伝子の次に新規なＣＨ遺伝子の３’に配置する遺伝子組換えである。明確なＩｇクラススイッチ組換え部位は、Ｓ領域（Ｃδ以外のそれぞれのＣＨ遺伝子の５’に存在する高頻度反復ＤＮＡ配列）中に位置する。
【００８２】
全てのミューリン及び多くのヒトのＳ領域は、少なくとも部分的に配列決定されている。それらは１−１０ｋｂ長であり、高度に反復しており、ＧＣが豊富である。ミューリン及びヒトのＳμは、大部分が均一に、２つの五量体配列ＧＡＧＣＴ及びＧＧＧＧＴ及び七量体配列（Ｃ／Ｔ）ＡＧＧＴＴＧから構成される。他のＳ領域の全ても五量体配列の複数のコピーを含む。Ｓμを除く全てのミューリンＳ領域は、Ｓγ１、Ｓγ３及びＳγ２ｂに対する４９塩基対の反複、Ｓγ２ａに対する５２塩基対の反複、Ｓαに対する８０塩基対の反複及びＳεに対する４０塩基対の反複を有する、配列及び長さにおいて異なるタンデムリピートから構成される。ヒト及びミューリンのＳμは、Ｓγ領域よりもＳε及びＳαに相同であり、各々相当の相同性を有する。Ｓ領域は、ヒトＳ領域がマウス細胞におけるスイッチ組換えのための基質として用いることができるように十分にヒト及びマウス間で保存されている。Ｓμ、Ｓε及びＳα領域は、２種間で、Ｓγ領域よりも相同である。実際、マウスＳｍモチーフＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＧ（配列番号：１）はＳｅにおいて見いだされ、第二のモチーフＧＡＧＣＴＧＡＣＴはＳｅ領域においてＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴ（Ｓｍモチーフと比較して付加されたＧを有する）（配列番号：２）としてわずかに改変されている。Ｓ領域の長さは多くの対立形質の変異（長さ多型）の影響を受けており、特定のＳ領域の特定サイズに対する機能的要件がないことを示している。
【００８３】
ＩｇＥ及び血清ＩｇＥレベル
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は、哺乳動物においてのみ見いだされる抗体のクラス（又は免疫グロブリン「アイソタイプ」）である。それは、アレルギーにおいて重要な役割を果たし、特に１型過敏症と関連している。ＩｇＥは、マンソン住血吸虫、旋毛虫及びカンテツなどほとんどの寄生虫への免疫システムの応答にも関与しており、特定の寄生原虫（例えばマラリヤ原虫）に対する免疫防御においても重要であり得る。
【００８４】
ＩｇＥは一般的に最も少ないアイソタイプであるが−ＩｇＧ（大部分の典型的な適応免疫応答に関与するアイソタイプ）の１０ｍｇ／ｍｌと比較して、正常な（「非アトピー性の」）個体の血清ＩｇＥレベルはＩｇＧ濃度の０．０５％である−それは最も強力な免疫反応を起動させることが可能である。
【００８５】
アトピー性の個体は、（高ＩｇＥ症候群患者のように）血液中に正常レベルの最大１０倍のＩｇＥを有し得る。好塩基及びマストセル（炎症反応を媒介することが可能）は「初回抗原刺激を受けて」、（喘息における気道収縮、湿疹における局所的炎症、アレルギー性鼻炎における増加した粘液分泌及び増加した血管透過などのアレルギーと関連する症状の多くを引き起こす）ヒスタミン、ロイコトリエン及び特定のインターロイキンのような化学物質を放出する準備ができるようになり、他の免疫細胞が組織に接近できるように（しかし、アナフィラキシーのように血圧の潜在的に致命的な効果を導き得る）、「アレルゲン」（一般的にこれは塵ダニＤｅｒＰ１、ネコＦｅｌＤ１、クサ又はブタクサ花粉などのタンパク質である。）を特異的に認識するＩｇＥは、その高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）と固有の長期相互作用を有する。それぞれの反応のメカニズムは周知であるにもかかわらず、他が単に鼻水となる場合でも、なぜいくつかのアレルギーがそのような急激な感受性を発達させるかはまだよく分かっていない。
【００８６】
血清総ＩｇＥ濃度試験は、血清試料中の総ＩｇＥレベルの測定を可能にする。ＩｇＥの高いレベルは、アレルギーの存在と関連している。ある総血清ＩｇＥの試験方法は、ＰＲＩＳＴ（ペーパーラジオイムノソルベント試験）である。この試験は、血清試料を放射性ヨウ素で標識されたＩｇＥと反応させることが関与している。結合した放射性ヨウ素（試験手順の完了後に算出される）は、血清試料中の総ＩｇＥ量に比例する。臨床免疫学において、免疫グロブリンの個々のクラスのレベルは、患者の抗体プロファイルを解明するために、比濁分析（又は濁り測定）で測定される。ＩｇＥレベルを測定する他の方法は、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、ウエスタンブロット、免疫拡散及び免疫電気泳動である。
【００８７】
１００ｋＵ／Ｌ以上のＵｎｉＣＡＰ２５０（登録商標）システムを用いた血清総ＩｇＥ濃度の測定結果は、上昇していると考えられる。ＩｇＥを測定する高感度二抗体ラジオイムノアッセイ法を用いたある研究において、明白なアレルギー症状のない健常人の血清ＩｇＥは、６から１０００ｎｇ／ｍｌの１３０倍の範囲にわたって変化していた。アレルギー性呼吸器疾患を有する患者において、ＩｇＥ濃度の範囲は相当な範囲で健常人と重なっているが、約３５％の未治療のアレルギー性個体は正常の９７パーセンタイルより高いＩｇＥ濃度を有し、５１％は９５パーセンタイルより高い。（G.J. Gleich, A.K. Averbach and H.A. Swedlund, Measurement of IgE in normal and allergic serum by radioimmunoassay. J. Lab. Clin. Med. 77 (1971), p. 690を参照。）
【００８８】
他の研究において、正常な成人の幾何平均ＩｇＥレベルは１０５ｎｇ／ｍｌであり、５〜２０４５の９５％区間であった。成人のＩｇＥの正常レベルは、約１００〜４００ｎｇ／ｍｌであり、ＩｇＧの１／４００，０００であることが報告されている。（Waldmann et al., The Journal of Immunology, 1972, 109: 304-310；Medical Immunology - 10th Ed. (2001) TG Parslow, DP Stites, AI Terr and JB Imboden, eds.、表７−２を参照）。
【００８９】
若者（２４−４３歳）、老人（６６−９６）及び百歳以上の人（９９−１０８）間の血清Ｉｇレベルの比較については、Listi et al., A Study of Serum Immunoglobulin Levels in Elderly Persons That Provides New Insights into B Cell Immunosenescence. Ann. N.Y. Acad. Sci (2006) 1089:487-495を参照のこと。特に、正常個体の免疫グロブリンの年齢及び性別に関連する血清中濃度についてはListi et al.（前掲）の表２を参照のこと。
【００９０】
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は、通常全ての血清抗体のごくわずかな画分（０．００４％）のみを示すにもかかわらず、アレルギー性疾患に中心的に関与していることから、臨床的見地から極めて重要である。アレルギー応答に関与する炎症細胞の２つの分化した型（マストセル及び好塩基）は、固有の、ＩｇＥ抗体に特異的な高親和性Ｆｃ受容体を有する。したがって、血液及び組織液中でＩｇＥはとても低い濃度（およそ１０−７Ｍ）にもかかわらず、これらの細胞の表面は、血液から吸収され、抗原受容体としての役割をするＩｇＥ抗体で常に装飾されている。その受動的に結合したＩｇＥ分子が抗原と接触する場合、マストセル又は好塩基は、アレルギー性疾患の急性の徴候の多くを産生する炎症媒介物質を放出する。血清ＩｇＥの高いレベルは、ぜん虫又は他の特定の多細胞寄生虫による感染も示し得る。ＩｇＧ及びＩｇＤの様に、ＩｇＥは単量体形態で存在する。Ｆｃ受容体は、主にε鎖のＣＨ３ドメインを認識するように見える。Medical Immunology - 10th Ed.（2001；上掲）を参照のこと。
【００９１】
ヒトにおける免疫グロブリンＥの血清中濃度は多様であるが、約２５００ｎｇ／ｍｌを超える血清ＩｇＥレベルが種々の疾患と関連していることは明らかである。同様の低レベルのＩｇＥがマウスにおいて報告されている（Pinaud et al., Localization of the 3' IgH locus Elements that Effect Long-Distance Regulation of Class Switch Recombination, Immunity (2001) 15(2): 187-199を参照）。
【００９２】
ジーンターゲッティング及びプラスミド
ジーンターゲッティングは、設計された外因性ＤＮＡフラグメントとマウス胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノムとの間で相同組換えを利用する技術である。導入されたＤＮＡフラグメントに含まれる同一の領域と天然の染色体間の遺伝子組換えは、設計されたＤＮＡでの染色体の一部の置換を引き起こす。これらの改変ＥＳ細胞は、胚盤胞に注射され、ＩＣＭ（内部細胞塊）の割球とともに胎児の発生に組み込まれ、寄与する。
【００９３】
手短に言えば、相同組換えを通して、変異された形態で特定の遺伝子の野生型アレルを置換するジーンターゲッティングベクターは設計される。標的ＥＳ細胞は、２−４日目の胚盤胞に移植(implant)され、偽妊娠母体に移植(transfer)される（下記参照）。
【００９４】
本願明細書において用いられるターゲッティングベクターは、四つの成分を有する：
ａ．５’アーム（５’フランキング領域とも称される）；
ｂ．選択マーカー；
ｃ．ドナースイッチ領域をコード化するＤＮＡ配列；及び
ｄ．３’アーム（５’フランキング領域とも称される）。
５’アームは、置換されるスイッチ領域の５’末端に相同なＤＮＡ断片である。選択マーカーは、相同組換えにおいて選択可能な表現型を与える。選択マーカーは、ｌｏｘｐ部位に隣接してもよい。ドナースイッチ領域は、選択マーカーの前後いずれであってもよい。３’アームは、置換されるスイッチ領域の３’末端に相同なＤＮＡ断片である。
【００９５】
５’及び３’フランキング領域は、どのような長さであってもよいが、相同性の程度に依存している。ここで使用されるように、２つのＤＮＡ配列部分間の「実質的な相同性」は、ＤＮＡフラグメントが遺伝子組換えコンピテント細胞に共同導入する場合に、配列部分が検出可能な遺伝子組換えを容易にするために十分に相同であることを意味する。ヌクレオチド配列が互いに少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％及び最も好ましくは１００％同一である場合、２つの配列部分は実質的に相同である。これは、相同性の減少が対応する相同組換えの成功の頻度を減少させるからである。配列相同性の実際的な下限は、相同性がさらに減少すると、遺伝子組換えコンピテント哺乳動物細胞のＤＮＡ断片の検出可能な相同組換えを媒介しない相同性として定義される。５’及び３’フランキング領域は、それぞれの相同配列部分について、好ましくは少なくとも５００塩基対、より好ましくは１０００塩基対、次に最も好ましくは約１８００塩基対及び最も好ましくは１８００塩基対より大きい。
【００９６】
望ましくは、マーカー遺伝子は、欠失する配列を置換するための標的構築物において用いられる。様々なマーカー、特に正の選択を可能とするものが使用され得る。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（「ｎｅｏ」）の遺伝子の発現から生じるＧ４１８耐性の使用が特に興味がある。ゲノム中のマーカー遺伝子の存在は、組込みが起こったことを示す。
【００９７】
Ｓε領域が置換される領域である場合、ドナースイッチ領域はＳμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ又はＳγ３領域であってもよい。ドナー領域は、刺激・非組換え条件下で（すなわちスイッチ領域は変更されていない）、Ｃεより高いレベルでの関連する重鎖の発現を引き起こすものである。
【００９８】
ほとんどの場合、サザンブロットハイブリダイゼーションによるＤＮＡ分析は、組込み位置を確認するために使用される。挿入物及び相同組込みが発生する領域に隣接する５’及び３’領域の配列に対するプローブを用いることによって、相同的ターゲッティングが起こったことを証明することができる。
【００９９】
ＰＣＲは、相同組換えの存在の検出において有利に用いられ得る。標的構築物内の配列に相補的なＣＲプライマー、及び標的遺伝子座において構築物の外側の配列に相補的なＰＣＲプライマーが用いられ得る。この方法において、相同組換えが起こった場合、相補鎖に存在する両方のプライマーを有するＤＮＡ分子のみが得られる。予想される大きさの断片を示すことによって、例えばサザンブロット分析を用いて、相同組換えの発生が裏付けられる。
【０１００】
標的構築物が調製され、例えば原核生物の配列などあらゆる望ましくない配列が取り除かれると、構築物は標的細胞（例えばＥＳ細胞）に導入され得る（下記参照）。標的細胞にＤＮＡを導入するためのあらゆる便利な技術が用いられ得る。技術は、原形質融合（例えば酵母スフェロプラスト）を含む：細胞融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介ＤＮＡ移入又は直接的なマイクロインジェクション。
【０１０１】
標的細胞の形質転換又は形質移入の後、標的細胞は、前述のように陽性及び／又は陰性マーカー、ネオマイシン耐性及びアシクロビル又はガンシクロビル耐性を用いて選択され得る。望ましい表現型を示す細胞は、それから切断分析、電気泳動、サザン分析、ＰＣＲ等によってさらに解析されてもよい。標的遺伝子座において望ましい改変の存在を示す断片を同定することによって、相同組換えがＣεへのスイッチを増強するようにＩｇＨの変更が起こった細胞を同定することができる。
【０１０２】
胚性幹（ＥＳ）細胞法
Ａ．ＥＳ細胞へのｃＤＮＡの導入
ＥＳ細胞の培養方法及び後の組換え動物の作出方法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿及び直接注入法のような種々の方法によるＥＳ細胞へのＤＮＡの導入方法はTeratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, ed. E.J. Robertson, (IRL Press 1987)に詳述されており、その教示は本願明細書に援用される。組換えＥＳ細胞の望ましいクローンの選択は、いくつかの手段の一つによって達成される。配列特異的遺伝子組込みが関与する場合、対象の遺伝子と組換えるための核酸配列又はその発現を制御するための配列は、マーカー（例えばネオマイシン耐性）をコード化する遺伝子と共沈澱される。形質移入は、Lovell-Badge, in Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, ed. E.J. Robertson, (IRL Press 1987)又はPotter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161 (1984)に詳述されるいくつかの方法の一つによって実行される。リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿、直接注入及びエレクトロポレーションは、好ましい方法である。これらの手法において、多くのＥＳ細胞（例えば０．５×１０６）組織培養ディッシュに播種され、最終容量１００μｌ中の５０ｍｇのリポフェクチンの存在下で沈澱された直線化された核酸配列及び１ｍｇのｐＳＶ２ｎｅｏＤＮＡの混合物でトランスフェクションさせた（Southern and Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1: 327-341 (1982)）。細胞には、Ｇ４１８などの抗生物質（２００から５００μｇ／ｍｌ）が添加されたＤＭＥＭ中の１０％ウシ胎児血清を含む選択培地が供給される。Ｇ４１８に耐性の細胞のコロニーをクローニングリングを用いて単離し、増殖させる。ＤＮＡは薬剤抵抗性クローンから抽出され、プローブとして核酸配列を用いるサザンブロッティング実験は望ましい核酸配列を有するクローンを同定するために用いられる。いくつかの実験において、ＰＣＲ法は、対象のクローンを同定するために用いられる。
【０１０３】
ＥＳ細胞に導入されるＤＮＡ分子は、相同組換えのプロセスを通して染色体にも組み込まれる（Capecchi, (1989) Science 244:1288-1292に記載される）。直接注入により高効率な組み込みが起こる。所望のクローンは、注入されたＥＳ細胞のプールから調製されたＤＮＡのＰＣＲにより同定される。プール中の陽性細胞は、細胞クローニングの後にＰＣＲによって同定される（Zimmer and Bruss, Nature 338, 150-153 (1989)）。エレクトロポレーションによるＤＮＡの導入は、効率的でなく、選択ステップを必要とする。組換え事象の正の選択（すなわちネオ耐性）及び二重正−負の選択（すなわちネオ耐性及びガンシクロビル耐性）のための方法及び後のＰＣＲによる所望のクローンの同定は、Joyner et al., Nature 338, 153-156 (1989) and Capecchi, (1989)に記載されており、その教示は本願明細書に援用される。
【０１０４】
Ｂ．胚の回収及びＥＳ細胞の注入
雌の動物に、マウスで用いられる標準技術（妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ；Sigma）の注射に続いて４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ；Sigma）の注射）を変更して作られた方法論を用いて過排卵を誘導する。雌を、ｈＣＧ注射の直後に雄と共に置く。ｈＣＧのおよそ一日後、交配させた雌は犠牲となり、胚を切り取られた卵管から回収し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Sigma）を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に入れる。周囲の卵丘細胞は、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で除去する。前核期胚ｗ洗浄し、注入までの時間、加湿された５％ ＣＯ２、９５％空気の３７．５℃インキュベーター中の０．５％ＢＳＡを含むアール均衡塩溶液（ＥＢＳＳ）に入れる。
【０１０５】
雄と交配した、自然に性周期が回っているか過排卵させた雌を、ＥＳ細胞の注入のための胚を採取するために用いる。適切な時期の胚は、受胎交配の後に回収する。交配した雌の子宮角を灌流し、胚をＥＳ細胞と共に注入するための１０％仔ウシ血清を加えたダルベッコの改質基本培地に入れる。約１０−２０のＥＳ細胞を、約２０μｍの内径のガラス顕微針を用いて胚盤胞に注入する。
【０１０６】
Ｃ．偽妊娠雌への胚移植
ランダムに性周期が回っている成熟雌を、精管切除された雄とペアリングさせる。ＥＳ細胞を含む胚盤胞の着床が必要な場合、それらが交配後２．５〜３．５日（マウスに対して、又はより大きな動物に対してはより遅い）になるように、レシピエント雌を交配させる。胚移植時、レシピエント雌を麻酔する。卵巣を卵管上の体壁を切開することによって露出させ、卵巣及び子宮を外在化させる。胚盤胞が移される針で子宮角に穴を空ける。移植後、卵巣及び子宮を体内へ戻し、切開部を縫合することによって閉じる。さらに移植する場合、この手順を反対側においても繰り返す。
【０１０７】
胚の操作及びＤＮＡのマイクロインジェクションのための手法はHogan et al., Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986)に詳述されており、その教示は本願明細書に援用される。これらの技術は他の動物種の胚に容易に適用でき、成功率は低いが、当業者にとっては通常の業務である。
【０１０８】
Ｄ．組換え動物の同定
試料（１−２ｃｍのマウス尾部）は、幼若動物から切除される。より大きな動物については、血液又は他の組織を用いることができる。相同組換え実験のキメラを試験するため、すなわち動物に対する標的ＥＳ細胞の寄付を探すために、より大きな動物においては血液が検査されるが、マウスにおいては毛色が用いられてきた。ＤＮＡは、組換えファウンダー（Ｆ０）動物及びそれらの後代（Ｆ１及びＦ２）を検出するために、調製され、サザンブロット及びＰＣＲによって解析される。
【０１０９】
一旦組換え動物が同定されると、系統は従前通りの交配によって確立される。
【０１１０】
サザン分析
ＤＮＡは、標準のフェノール抽出手法によって又はセシウム勾配遠心分離によって細胞株から得られた。
【０１１１】
Ａ．フェノール抽出
細胞のフラスコをＨＢＳＳバッファーで洗浄し、２．５ｍｌ／１００ｃｍ２の溶解溶液（１％ドデシル硫酸ナトリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭＥＤＴＡ／１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）を添加する。全ての細胞が可溶化されたあと、それらを５０ｍｌ円錐チューブに移し、最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを添加する。溶解物を、ＤＮＡｓｅ酵素を不活性化するために１０分間６５℃でインキューベートし、次いで３７℃、オーバーナイトでインキューベートした。この溶解物に、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０中で平衡化された新しいフェノールの等量を添加し、チューブを室温（２２−２４℃）で５分間穏やかに反転し、次いで５分間２０００ｇで遠心分離し、表面の（水）層を第二のチューブに移す。５０％フェノール／５０％クロロホルム（ｖ／ｖ）の等量を添加し、反転遠心分離プロセスを繰り返した。上清を第３のチューブへ移し、クロロホルムの等量を添加する。第３の反転（遠心分離サイクル）の後、上清を第４のチューブに移し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２．５倍量の低温エタノールの添加により沈殿させる。７０％エタノールで生じた沈殿物を洗浄し、ペレットを空気乾燥した後に、ＴＥバッファー（１０ｍＭトリスｐＨ７．４／１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁し、５０％μｇ／ｍｌの最終濃度のＲＮａｓｅを添加する（ＲＮａｓｅは、新たに懸濁された酵素を３０分間、７０℃で加熱することによってＤＮエースを含まないように調製される）。溶液を、１：１ ＳＳ−フェノール：クロロホルムの等量で抽出する。上記のような遠心分離により相が分離され、上清を等量のクロロホルムで抽出する。上記のような遠心分離に続いて、上清を等量のクロロホルムで抽出する。遠心分離に続いて、上清中のＤＮＡを１２．５ｍｌのエタノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄及び風乾する。ペレットを、ＴＥバッファーに懸濁し、ＤＮＡ収量を２６０ｎＭのＯ．Ｄ．で測定し、純度は２６０／２８０比率により測定する。ＤＮＡ調製物を、４℃でＴＥ中に保存する。
【０１１２】
Ｂ．培養細胞からのＲＮＡ及びＤＮＡの塩化セシウム調製法
細胞のフラスコをＨＢＳで洗浄し、２．５ｍｌ／１００ｃｍ２のグアニジンイソシアネート（ＧＩＴ）バッファーを添加した。グアニジンイソチオシアネートバッファーは、４ＭＧＩＴ／２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６／０．８％ベータ−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）であった。３−５分後、穏やかな揺れで、細胞溶解物を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ １０ｍｌ超遠心器チューブ中の４ｍｌの塩化セシウムバッファー上に層とした。チューブはＧＩＴバッファーで最上部まで満たされ、２００℃、３２，０００ｒｐｍ（１７４，０００×ｇ）でオーバーナイトで回転させた。チューブの上から３分の２のＧＩＴ溶液を取り除いて廃棄し、ＤＮＡを含むチューブの下から３分の１の塩化セシウム溶液を第二のチューブに移した。チューブの底のＲＮＡペレットを、２００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６に再懸濁し、１．５ｍｌマイクロチューブに移した。７５０μｌのエタノールをこのチューブに添加し、チューブを１０分間ドライアイスに入れた。１０分間の微量遠心分離の後、上清を廃棄し、３００μｌの７０％エタノールを添加し、チューブを再び微量遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを真空遠心機において乾燥させた。ペレットを、２００μｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。ＲＮＡ調製を、−７０℃のエタノール沈殿物として保存した。ＤＮＡを含む４ｍｌのＣｓＣｌを、ｄＨ２Ｏで希釈した。これに、３０ｍｌの低温エタノールを添加した。ＤＮＡ沈殿物を回収し、新しい５０ｍｌチューブに移し、７０％エタノールですすいで、次いで空気乾燥させた。次いでペレットをプロテインキナーゼバッファー中に再懸濁し、１０ｍｇのプロテイナーゼＫを添加した。６５℃での１５分間のインキュベーションの後、溶液を３７℃、オーバーナイトでインキューベートした。加水分解物を１：１ ＳＳ−フェノール：クロロホルムを用いて抽出し、クロロホルム、エタノール沈殿に続いて、上記のように定量する。
【０１１３】
Ｃ．制限酵素消化、電気泳動及びサザンブロット法
制限エンドヌクレアーゼ消化条件は、供給元の推奨基準に従った。ゲノムＤＮＡに対しての制限酵素消化は、３７℃で４−６時間あった。簡素なＤＮＡ調製（クローニング又はＰＣＲ増幅）では、インキュベーションは３７℃で１−２時間だった。多くの場合、１０μｇのＤＮＡは、１５０μｌ量において消化された。消化物を、３μｌの５ＭＮａＣｌ及び３７５μｌ（２．５倍量）の低温エタノールを添加して沈澱させ、４℃で１０分間微量遠心分離し、５００μｌの低温７０％エタノールで洗浄し、微量遠心分離した。
【０１１４】
ペレットを、真空微量遠心管中で空気乾燥させ、１７μｌの電気泳動ランニングバッファー（通常ＴＡＥバッファー）及び３μｌのローディングバッファー（５０％グリセロール／１％ブロムフェノールブルーを含むＴＡＥバッファー）に再懸濁し、６８℃で１０分間加熱し、別のウェルにサイズマーカーとして働くラムダ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物をロードすると共にアガロースゲルのウェルにロードした。ゲル中のアガロースの濃度は１．０％であった。８−１６時間の電気泳動に続いて、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、マーカーバンドの泳動距離を測定及び記録し、ゲルを撮影した。
【０１１５】
消化されたＤＮＡをＮｙｔｒａｎ膜へ真空転写した。ゲルを吸引装置上のＮｙｔｒａｎ膜上に敷設し、５００ｍｌの０．４ＭＮａＯＨ／０．８ＭＮａＣｌで覆い、５０ｃｍの水圧で４分間真空加圧した。ＮａＣｌ−ＮａＯＨ溶液を除去し、５００ｍｌの１０×ＳＳＣを添加し、５０ｃｍの水圧で３０−６０分間加圧した。サザンブロットを８０℃で２時間乾燥し、野菜凍結バッグ中で保存した。
【０１１６】
Ｄ．サザンハイブリダイゼーション
サザンブロットを、熱封止可能なプラスチック袋に入れ、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸エステル及び２００μｇ／ｍｌニシン精液ＤＮＡを含む１０ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファーでインキューベートし、６５℃で１５分間インキューベートした。次いでバッグの隅を切り取り、放射性同位元素標識オリゴヌクレオチドプローブを添加した（約１０７ｄｐｍ）。バッグを再封止し、６５℃のオーブン又はウォーターバスに入れ、１２−１６時間穏やかに揺らすか振盪した。次いで膜をバッグから取り除き、特異的に結合したプローブと比較して背景の放射能が低くなるまで、一連の漸増希釈したより高い温度（ストリンジェンシーを増加させる）のＳＳＣバッファーで洗浄した。次いで、暗室において、膜を増強装置スクリーンを備えたＸ線フィルムカセットに置かれたビニール袋に入れ、Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ ５フィルムを一枚加え、シグナル強度に合わせた時間封入されたカセットを７０℃に入れた。通常、時間を変化させた後の暴露は有用である。フィルムは、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ自動現像液で現像した。膜を数回ハイブリダイズしてもよい。Ｎｙｔｒａｎ膜を、２分間沸騰している０．１×ＳＳＣで加熱させることによって、標識プローブを解離させてもよい。
【０１１７】
Ｂ細胞培養
Ｂ細胞を、ネガティブセレクションによって脾臓から精製してもよい。簡潔には、単個細胞浮遊液中のＴ細胞を、抗体で被覆し、補体溶解によって枯渇させる。残りの脾臓細胞を、非連続的パーコール（GE Healthcare）勾配を通して層状化した。休止Ｂ細胞を６６％〜７０％境界面から選択し、総Ｂ細胞（５０−７０％パーコール境界面）を用いた。Ｂ細胞は、１０％ヒート不活性ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１００ｍＭ非必須アミノ酸及び５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノールが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma Aldrich）からなるＢ細胞培地で培養してもよい。
【０１１８】
インビボ高ＩｇＥ産生の確認
組換え動物を、当該分野で公知の技術を用いて、血清ＩｇＥレベルの上昇について試験する。例えば、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ特異的ＩｇＥ血液検査（文献は：ＣＡＰ ＲＡＳＴ、ＣＡＰ ＦＥＩＡ（フッ化酵素免疫検定法）及びファルマシアＣＡＰとしても記載される）を用いてもよい。
【０１１９】
他の方法は、当該技術分野において公知である。そのような方法は、例えば、抗ＩｇＥ抗体を用いた酵素結合免疫吸着検定法及び潜在的にＦＡＣＳを含む。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法又はＥＩＡとも称される）は、抗体又は試料中の抗原の存在を検出するために免疫学において主に用いられる生化学技術である。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）は、単一の細胞が混合された大きな群を解析するための強力な技術である。高い割合を占めるＩｇＥ陽性細胞は、高いＩｇＥ血清レベルを示す。
【０１２０】
ハイブリドーマ作出
ＩｇＥを産生するハイブリドーマを調製するために公知の標準的な技術を用い得る。例えばKohler & Milstein (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256:495及びKohler & Milstein (1976) Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. Eur. J. Immunol. 6:511参照。
【０１２１】
簡潔には、免疫化された脾細胞を洗浄し、適切な条件下で骨髄腫細胞と融合させる。ハイブリドーマを２４時間後にＨＡＴ又は他の選択薬剤に暴露させ、融合していない骨髄腫細胞を死滅させる。融合していない脾細胞も限られた生存期間を有しており、ハイブリドーマは培養物中に残された唯一の増殖性細胞である。
【０１２２】
クラススイッチングについてのアッセイ
アッセイは、当該技術分野において公知であり、例えば、Shinkura, R. et al. Nat. Immunol. (2003) 4, 435-441 and Zarrin, et al., Nat. Immunol. (2004) 5, 1275-1281に記載されている。簡潔には、脾細胞を、ハイブリドーマを作出するために抗ＣＤ４０及びＩＬ−４によって４日間刺激するか、ＥＬＩＳＡを行うために６日間刺激した。モノクローナル抗−ＩｇＥ抗体を、ＩｇＥ（変異アレル）を検出するために用い得る。総ＩｇＥを、ポリクローナル抗ＩｇＥ抗体（Southern Biotechnology Associates）で測定してもよい。
【０１２３】
例えば、ＩｇＨ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成及びＣＳＲを評価するためのサザンブロット分析を記載するSouthern and Berg (Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Appl Genet (1982) 1: 327-341)を参照のこと。
【０１２４】
ε生殖系列転写は、Ｂ細胞のＩｇＥの合成への関与の最初の工程を特徴付ける。したがって、ε免疫グロブリン重鎖生殖系列遺伝子転写（ＧＬＴ；εＧＬＴ）、円転写産（ＣＴ；Ｉε−Ｃμ ＣＴ又はＩεＣγＣＴ）及びＩｇＥの重鎖をコード化するｍＲＮＡ（εｍＲＮＡ）及び活性化を誘導されたシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を調べるためにＲＴ−ＰＣＲを用いてもよい（Takhar et al., J Allergy Clin Immunol (2007) 119(1): 213-218を参照）。
【０１２５】
後の実験の開示において、以下の略語が適用される：ｅｑ（同等な）；Ｍ（モル）；μＭ（マイクロモル）；Ｎ（正常な）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）；Ｃｉ（キュリー）；ｍＣｉ（ミリキュリー）；μＣｉ（マイクロキュリー）；ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ）。
【実施例】
【０１２６】
本発明は、以下の実施例において詳述されるが、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定することを意図するものではない。添付された図面は、本明細書の不可欠な部分及び本発明の記載と考えられるべきである。全ての引用文献は、そこに記載される全てが出典明示により本願明細書に援用される。以下の実施例は、例示するために提供されるのであって、特許請求の範囲に記載された発明を限定するものではない。
【０１２７】
実施例１ 変異マウスの遺伝子ターゲティング／ジェネレーション
この実施例は、ターゲッティングベクターの構築、胚性幹細胞（ＥＳ）の形質転換及び変異マウスの産生を例示する。
【０１２８】
Ｉ．一般的な手法
Ａ．胚性幹細胞（ＥＳ）の形質転換
標的化構築物を、ＮＣＢＩにおいてＮＴ＿１６６３１８として利用可能な配列情報に基づいて設計した。（Waterston et al., Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature. (2002) 420(6915): 520-62も参照のこと。）ＢａｍＨＩ／ＰＶｕＩ断片（Ｓｅ領域を含めて７０２２ｂｐ（１２９マウス）；Ｓｅ領域を含めて７３５５ｂｐ（Ｂ６マウス））を、１２９又はＣ５７Ｂ６ ＢＡＣクローンから単離し、増幅した。
【０１２９】
以下の配列（５’→３’；配列番号：３）は、ＢａｍＨＩ／ＰＶｕＩ断片から欠失され、大部分のマウスＳｍ領域を含むＮｅｏカセットとＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩで置換された（図２及び配列番号：６を参照）。
【０１３０】
類似の構築物を、ＩｇＨ遺伝子座に存在するアレルの系統間の相違を説明するために、標的１２９ＳｖＥｖ ＥＳ細胞に製作してもよい。
【０１３１】
Ｂ．胚性幹細胞（ＥＳ）の形質転換
上記のプラスミドをＰｖｕＩ制限酵素を用いて直線化した。ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、ペレット状にして、５０μｌＴＥ中に再懸濁させた。当該分野で公知の技術を用いて（例えばTempleton et al., Efficient gene targeting in mouse embryonic stem cells, Gene Therapy (1997) 4:700-709を参照）、１０６ＥＳ細胞をエレクトロポレーションにより直線化されたベクターで形質移入し、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）を用いて選択した。その後、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換システムを用いてＮｅｏ遺伝子を欠失させた。少なくとも３００塩基対の、同定された組換え構築物（図２に示される）の配列番号：９（５’プローブ）及び配列番号：１０（３’プローブ）から設計された二つのプローブを用いたサザン分析によって適切に目標化されたクローンを同定した。
【０１３２】
Ｃ．変異マウスの産生
改変されたＩｇＨ遺伝子座を有するマウスを作出するために生殖系列マウスを産生した。Ｓμ／Ｓεの相同組み換えを示すＥＳ細胞クローンをＣ５７Ｂ６胚盤胞に注入し、生じた雄キメラをＣ５７Ｂ６雌と交配させた。ヘテロ接合及びホモ接合の変異マウスの生殖細胞系伝達を、毛色によって評価した。
【０１３３】
ＩＩ．特定の手法
Ａ． ターゲティングベクター構築
ＥＳ細胞のＣ５７ＢＬ／６ ＩｇＥ遺伝子座を標的とする構築物を、組み換え設計及び標準的な分子クローニング技術を用いて製作した。Liu et al., A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Research (2003) vol. 13 (3) pp. 476-84を参照のこと。
【０１３４】
ＮＣＢＩにおいてＮＴ＿１６６３１８として利用可能な配列情報に基づいて標的化構築物を設計した。（Waterston et al., Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature. (2002) 420(6915): 520-62）も参照のこと。
【０１３５】
最初に、Ｃ５７ＢＬ／６スイッチイプシロン（本明細書においてＳｅ又はＳε又はＳイプシロンと称する）を含むマウスＢＡＣ（ＲＰ２３−１３５Ｌ１２；Invitrogen, Carlsbad, CA）の６９８８塩基対ゲノム断片（配列番号：１９；図１３）領域／配列を単離し、胚性幹（ＥＳ）細胞ターゲッティングにおいて用いるためにｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡと称されるネガティブセレクションマーカー、ジフテリアトキシンＡ（ＤＴＡ）を含むプラスミドに導入し（Warming et al., Mol. Cell. Biol. (2006) 26 (18): 6913-22を参照）、ｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡ−ＩｇＥを得た。
【０１３６】
次に、ｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｅｍ７−Ｎｅｏ−ＢＧＨｐＡ−ｌｏｘＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＡｓｃＩ−ＮｈｅＩカセットを相同組み換えを用いてＩｇＥ断片に挿入し、後のスイッチｍｕ領域（本明細書においてＳＭｕ又はＳμ又はＳｍと称する）の挿入のために内因性のＳε領域をＬｏｘＰが導入されたＮｅｏ及びポリリンカーで置換した（「ｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡ−ＩｇＥ−ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ｌｏｘ−ＭＣＳ」）。
【０１３７】
最後に、Ｃ５７ＢＬ／６ＳＭｕを含む４．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩ断片をＢＡＣ ＲＰ２３−１３５Ｌ１２（Invitrogen）から単離し、三方向ライゲーションを用いてこの断片をｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡ−ＩｇＥ−ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ｌｏｘ−ＭＣＳにクローニングした（６．２ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片及び４．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ断片（両方ともｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡ−ＩｇＥ−Ｎｅｏ−ＭＣＳ）の４．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩ Ｓｍｕ断片へのライゲーション）。生じた構築物は、「ｐＳＷ３１２」と称される（ｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡ−ＩｇＥ−ｌｏｘ−ｎｅｏ−ｌｏｘ−Ｓｍｕ）。図２Ｂを参照のこと。
【０１３８】
Ｂ．胚性幹細胞（ＥＳ）の形質転換
Ｃ５７ＢＬ／６ ＥＳ細胞を標準法（Ｇ４１８陽性及びＤＴＡ陰性選択）を用いて標的化し、陽性クローンをＰＣＲ及びｔａｑｍａｎの解析を用いて同定した。適切に標的化されたクローンは、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡ及び外部３’プローブを用いたサザンブロット解析によって確認された（構築物の３’末端及び内因性ＩｇＥ ＨｉｎｄＩＩＩ部位間の配列）（配列番号：２０）：
【０１３９】
Ｃ．変異マウスの産生
改変されたＩｇＨ遺伝子座を有するマウスを作出するために生殖系列マウスを産生した。Ｓμ／Ｓεの相同組み換えを示すＥＳ細胞クローンをＣ５７Ｂ６胚盤胞に注入し、生じた雄キメラをＣ５７Ｂ６雌と交配させた。ヘテロ接合及びホモ接合の変異マウスの生殖細胞系伝達を、毛色によって評価した。
【０１４０】
実施例２ アイソタイプスイッチを誘導するインビトロでの刺激（抗ＣＤ４０／ＩＬ４；ＬＰＳ）
以下の実施例は、どのようにＢ細胞が集められ、クラススイッチ組換え（ＣＳＲ）について解析されたかを詳述する。
【０１４１】
６−８週齢の野生型又はヘテロ接合型動物の脾臓細胞を、抗ＣＤ４０（１μｇ／ｍＬ；ＨＭ４０−３、Pharmingen）に加えてＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）又はリポポリサッカライド（ＬＰＳ、２０μｇ／ｍＬ）でインビトロにおいて刺激した。１．５×１０６の細胞は、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン及び１００μＭβ−メルカプトエタノールが添加されたＲＰＭＩ培地の６ウェルプレート（０．５×１０６／ｍＬ）の一つに播種された。刺激後、活性化Ｂ細胞培養を、４−５日目にハイブリドーマを作製するために、又は６日目にＥＬＩＺＡでＩｇレベルを測定するために用いた（標準法を用いて；例えばMonoclonal Antibodies: Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology (2007) vol. 378:1-13参照）。検出抗体としてモノクローナル抗マウス抗体（Pharmingen）に続いてアルカリフォスフォターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ１（Southern Biotechnology）をＩｇレベルを検出するために用いた。
精製されたマウスＩｇ（Pharmingen）を基準として用いた。
【０１４２】
脾細胞上のＰＥ抗マウスＩｇ（Pharmingen）抗体を用いて表面Ｉｇ染色を行った。刺激４日目にＦＡＣＳ解析を行った。試料を、ＦＡＣＳ Ｓｃａｎ（Becton Dickinson）に回収し、Ｆｌｏｊｏ解析ソフトウェアを用いて解析した。
【０１４３】
サザンブロット解析によってＣＳＲを評価した。簡潔には、ＩｇＨ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成及びＣＳＲを評価するためにハイブリドーマクローンのゲノムＤＮＡを用いた。ハイブリドーマゲノムＤＮＡ（約１５０ｕｌ）をＥｃｏＲＩ（NEB）制限酵素を用いてオーバーナイトで消化し、試料を０．７％アガロースゲルにアプライすることにより消化物を分離した。分離された試料を、Ｚｅｔａ−プローブブロッティングメンブレン（Bio-Rad）に転写し、ＵＶ架橋により固定及び／又は８０°摂氏真空オーブンにおいて（２０分）乾燥させ、標準のサザンブロッティングプロトコル（Molecular Cloning, 3rd Edition Vol.1, pages 6.33-6.64）に従って３２Ｐ標識Ｉ−ｍｕ、Ｃ−ｍｕ、Ｉ−ｅｐｓｉｌｏｎ又はＣ−ｅｐｓｉｌｏｎプローブを用いて精査した。標識されたＤＮＡを、メンブレンをＸ線フィルム（Kodak）上に置くことによって視覚化した。
【０１４４】
ＩｇＥ陽性ハイブリドーマクローンにおけるＳ−ｍｕ及びＳ−ｅｐｓｉｌｏｎ ＣＳＲの接合を配列決定するために、この領域を増幅及び配列決定するためにネステッドＰＣＲを用いた。最初に、我々は、ＰＣＲでゲノムハイブリドーマＤＮＡのこの領域を増幅するために、Ｉ−ｍｕ Ｆｏｒｗａｒｄ−１：５’−ＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：１１）及びＣ−ｅｐｓｉｌｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−１：５’−ＣＣＴＧＡＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号：１２）プライマーを用いた。ＰＣＲサイクルは９４℃で２分間であった；（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒及び６８℃で１５０秒）×３５サイクル、６８℃で７分間。このＰＣＲ工程からの産物は、第二のＰＣＲサイクルのテンプレート（２μｌ）として用いられた、以下のプライマを用いた：Ｅ−ｍｕ Ｆｏｒｗａｒｄ−２：５’−ＡＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＴＴ−３’（配列番号：１３）及びＣ−ｅｐｓｉｌｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−２：５’−ＴＡＧＧＴＴＡＧＡＣＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＣＡＣＴＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号：１４）。アニーリング温度を５５℃に低下させた以外は、ＰＣＲプログラムは上記と同一であった。ＰＣＲ産物をゲル精製し（Quigen）、以下のプライマーを用いて直接的に配列決定した：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＳＭ５’：５’−ＧＴＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧ−３’（配列番号：１５）；９２２５Ｆ：５’−ＴＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧ−３’（配列番号：１６）；９５１８Ｆ：ＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＧＣＧＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：１７）；Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＣＣＣＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＧＣ−３’（配列番号：１８）。
【０１４５】
実施例３ 細胞内ＩｇＥ染色及びＦＡＣＳ解析
この実施例は、異なる刺激への暴露後のヘテロ接合マウス及び野生型マウスから得られた組織のＩｇＥの細胞内染色及びＦＡＣＳ 解析を示す。
【０１４６】
０．５×１０６の脾細胞を遠心沈澱させ、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ウシ胎児血清）中に再懸濁した。抗ＩｇＥ抗体（e-Bioscience, San Diego, CA; Cat. No. 14-5992-85）を、表面ＩｇＥ分子をブロックするために１ｇ／試料で添加した。細胞を４℃で１５分間インキューベートし、次いでＦＡＣＳバッファーで二回洗浄し、１７００のｒｐｍで３分間の遠心分離によってペレット状にした。ペレット状の細胞を１％ウシ胎児血清ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１４７】
細胞をボルテックスし、細胞を固定するためにＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（BD Biosciences, San Jose, CA; Cat. No. 554722）２００μｌ／試料で添加した。４℃で２０分間インキューベートした。
【０１４８】
細胞を１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（BD Biosciences, San Diego, CA; Cat. No. 554723）で２回洗浄し、Ｆｃ−ブロッカーを含む２５０ｌの１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーに再懸濁した。細胞アリコートは、１：２００の最終抗体希釈のＢ２２０−ＦＩＴＣと共にビオチン−アイソタイプコントロール（e-Bioscience, 13-4301-82）又は抗ＩｇＥ−ビオチン（e-Bioscience, 13-5992-82）での染色のために用いられた。４℃で３０分間インキューベートした。
【０１４９】
細胞を１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで二回洗浄した。
【０１５０】
１×ＢＤＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ中のストレプトアビジン−ＰＥ（Pharmingen）を１：２００の希釈で添加した。４℃で１０分間インキューベートした。
【０１５１】
ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで二度洗浄し、細胞を２００ｌのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、細胞を解析するためにＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ装置及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏプログラムを用いたＦＡＣＳ解析を行った。
【０１５２】
結果を図１３に示す。図１３において、ＩｇＥに対して陽性に染色した細胞数がＷＴと比較して増加したことが分かる。ＦＡＣＳ結果は、ＩｇＧ１レベルがＷＴと比較してＨｅｔの約半分に低下する一方、ＩｇＥ発現Ｂ細胞の割合がＷＴ動物と比較してＨｅｔ動物において増加する（約二倍）ことを示す。これは、ＳｍＫＩ（Ｓｅの代わりに）を有することが、この遺伝子座と競合することによってＩｇＧ１にスイッチする機会が減少すると同時に、ＩｇＥへスイッチすることを増加させることを証明する。
【０１５３】
実施例４ ＩｇＥアッセイ／測定
この実施例は、曝露されたか曝露されていない組換え動物又はインビトロの細胞培養においてＩｇＥを測定するために、ＥＬＩＳＡ（ルミネックス又は従来のＥＬＩＳＡ）の使用を示す。インビトロでの細胞培養において、細胞をＬＰＳ又は抗ＣＤ４０／ＩＬ４で刺激してもよい。
【０１５４】
ルミネックスマウス７−ｐｌｅｘ免疫グロブリンアイソタイプアッセイ
このアッセイは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍの単一のウェルにおいてマウスモノクローナル細胞培養上清又は血清試料（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｅｒｕｍ Ｄｉｌｕｅｎｔを用いる）をアイソタイプ同定（重鎖：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ；及び軽鎖：カッパ又はラムダ）するためにマルチプレックスアッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｅａｄｌｙｔｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｃａｔ＃４８−３００）を用いる。
【０１５５】
用いる前に、あらゆる粒子を取り除くために細胞培養上清を１４，０００×ｇで遠心分離する。同様に、粒子及び脂質層を取り除くために、アッセイの前に血清及び血漿試料を遠心沈澱（８０００×ｇ）する。これは、洗浄プレート及び試料針をつまらせることを予防する。
【０１５６】
ビーズベースマルチプレックスアッセイに用いられる材料
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｅａｄｌｙｔｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ Ｃａｔ＃４８−３００（Ｂｅａｄｌｙｔｅサイトカインアッセイバッファー、Ｃａｔ＃４３−００２、Ｂｅａｄｌｙｔｅマウスマルチ−免疫グロブリンビーズ、Ｃａｔ＃４２−０４５、Ｂｅａｄｌｙｔｅマウス免疫グロブリンポジティブコントロール、Ｃａｔ＃４３−００８、Ｂｅａｄｌｙｔｅ抗マウスｋ軽鎖、ＰＥ（１００×）、Ｃａｔ＃４４−０２９、Ｂｅａｄｌｙｔｅ抗マウスラムダ軽鎖、ＰＥ（１００×）、Ｃａｔ＃４４−０２９を含む）。
【０１５７】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｅａｄｌｙｔｅ マウスアイソタイピング血清希釈液（５×）、Ｃａｔ＃４３−０３３（１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水）。
【０１５８】
Ｉｇ標準曲線試薬：ミリポア：凍結乾燥Ｂｅａｄｌｙｔｅマウスマルチ免疫グロブリン標準（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）（ｂａｌｂ／ｃマウスＣａｔ＃４７−３００）。
【０１５９】
フィルタープレート：界面活性剤を含まないミリポアマルチスクリーン−ＨＡ０．４５μｍ。
【０１６０】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（注：ｄｄＨ２Ｏを提供するあらゆるシステムを作用する。）
【０１６１】
アッセイは、製造業者の説明書に従って行われ得る。
【０１６２】
ビーズベースマルチプレックスアッセイを行うための一般的なプロトコール
適切な希釈液に希釈する前にあらゆる粒子を沈殿させるために試料を（必要に応じて）遠心分離する。適切な希釈液に標準を再懸濁し、二倍階段希釈を用いた８点標準曲線を作成する。ウェルにつき５０−１００μｌアッセイ希釈液でフィルタープレートを濡らす。
【０１６３】
プレート嵌合：それぞれのウェルに標準又は試料を５０μｌ添加する。均質な懸濁液を産生するために、１５−２０秒間結合したビーズを音波破砕する。少なくとも１０秒間ビーズを十分にボルテックスする。ウェルにつき１５００のビーズとなるようビーズを希釈して、それぞれのウェルに希釈されたビーズ懸濁液２５μｌを添加する。暗所において室温で１５分間インキューベートする。（インキュベーション時間は異なり、一般的に１５分から２時間の間である。ビーズ及び試料の一次インキュベーションは、より大きな低感受性で、４℃、オーバーナイトで行うことができる。）。
【０１６４】
洗浄工程：液体を取り除くために、フィルタープレートの底部に真空マニホールドを適用し、拭き取る。アッセイ希釈液の７５μｌを添加することによって洗浄し、吸い取り、拭き取る。洗浄を２度繰り返す。ビーズをアッセイ希釈液７５μｌに再懸濁する。それぞれのウェルに検出抗体溶液２５μｌを添加する。暗所において室温で１５分間インキューベートする。液体を取り除くために、フィルタープレートの底部に真空マニホールドを適用する。アッセイ希釈液の１２５μｌを添加することによって洗浄し、吸い取り、拭き取る。洗浄を２度繰り返す。ビーズをアッセイバッファー１２５μｌに再懸濁する。プレートシェーカー上で１分間インキューベートする。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００計測器の結果を読む。データ評価：４−ＰＬ又は５−ＰＬカーブの試料濃度を推定する。
【０１６５】
刺激後６日目に、ＦＡＣＳ解析のために用いられた同様に刺激された脾細胞（３匹のＨｅｔ及び３匹のＷＴマウス）の上清を、上記の通りにＥＬＩＳＡアッセイに用いた。我々がＦＡＣＳ解析において観察したものに一致して、我々は、ＩＬ４／抗ＣＤ４０で刺激した場合にＷＴと比較してＩｇＥ発現レベルの増加及びＩｇＧ１発現レベルの減少を観察した。これは、ＩｇＧ１へのスイッチと競合するＳｍＫＩ部位においてより頻繁に発生する破壊及びＩｇＥスイッチの増加があることを示唆している。ＬＰＳ刺激は、コントロールとしての役割を果たし、ＷＴ及びＨｅｔが同様のＩｇＭ及びＩｇＧ３レベルを有することを示しており、他のスイッチ領域がクラススイッチングに利用できる場合、遺伝子座は未改変であり、正常に機能することを示唆する。図１４を参照のこと。
【０１６６】
総マウスＩｇＥ結合ＥＬＩＳＡ
このアッセイは、ｎａｉｖｅ及び免疫動物のマウスのＩｇＥ血清レベルを定量するために行われる。
【０１６７】
Ｉ．捕捉抗体での被覆：
精製された抗マウスＩｇＥ捕捉ｍＡｂを（ラット抗ｍｕ ＩｇＥ（クローンＲ３５−９２、BD Pharmingen, San Diego, CA）、４℃保存、Ｃａｔ ＃５５３４１６（０．５ｍｇ／ｍｌ））、コーティングバッファー（０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩、ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌａに希釈する。増強されたタンパク質−結合ＥＬＩＳＡプレート（例えばＮｕｎｃ免疫プレートＣａｔ ＃４６４７１８、３８４−Ｗｅｌｌ）に、ウェルにつき１００μｌを添加する。全てのウェルが捕捉抗体溶液によっておおわれるように、プレートを振盪する。プレートをおおい、４℃、オーバーナイトでインキューベートする。［注：３７℃で１時間行ってもよい。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で、プレート３回洗浄する。それぞれの洗浄について、ウェルを２００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で満たし、吸引又は除去の前に少なくとも１分静置させる。最終工程として、過剰なバッファーを取り除くために、プレートをペーパータオル上で軽くたたく。
【０１６８】
ＩＩ．ブロッキング：
ウェルにつきブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ウシ血清アルブミン＋１０ｐｐｍプロクリン、ｐＨ７．４）５０μｌでプレートをブロッキングする。プレートをおおって及び穏やかに撹拌しながらＲＴで１時間インキューベートする。上記のように、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）でプレートを３回洗浄する。
【０１６９】
ＩＩＩ．標準及び試料を適用する：
カラム１を空のウェルとして残す（すなわち抗原を添加しない、ウェルにつきブロッキングバッファー２５μｌのみ）。標準（ウェルにつき２５μｌ）の複製のためにカラム２及び３を用いる：５００ｕｇ／ｍｌストック標準抗体から１０ｎｇ／ｍｌ（１：５０，０００）の開始標準濃度までの標準曲線を作成する。１：２段階希釈物（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１５ｐｐｍプロクリン＋０．２％ＢｇＧ＋０．２５％ＣＨＡＰＳ＋５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を作製する。マウスＩｇＥ標準曲線：１０．０、５．０、２．５０、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６、０ｎｇ／ｍｌ。アッセイコントロールは、以下の希釈：８ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌのマウスＩｇＥκアイソタイプコントロール（BD Bioscience、Ｃａｔａｌｏｇ ＃５５７０７９、メインストック：０．５ｍｇ／ｍｌ、４℃で保存）。ブロッキングバッファー中の様々な希釈の試料（ウェルにつき２５μｌ）を添加するために残りのカラムを用いる。血清試料を、アッセイ希釈物（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１５ｐｐｍプロクリン）で希釈する（ハミルトン希釈装置を用いて、１：２５最小初期希釈、１：３連続希釈）。プレートを覆い、穏やかに撹拌しながら２時間インキューベートする。［注：ＲＴで少なくとも１時間又は４℃でオーバーナイトで行われる。］上記のように、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）でプレートを６回洗浄し、１時間撹拌しながらインキューベートする。
【０１７０】
ＩＶ．検出抗体とのインキュベーション：
ウェルにつき２５μｌのビオチン化抗マウスＩｇＥを添加する（ラット抗ｍｕ ＩｇＥ−ビオチン、クローンＲ３５−１１８、BD Pharmingen, San Diego, CA、０．５μｇ／ｍｌ、４℃、Ｃａｔ ＃５５３４１９）。プレートを覆い、穏やか撹拌しながら３０分間ＲＴでインキューベートする。上記のように、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）でプレートを６回洗浄する。
【０１７１】
Ｖ．ストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡｖ−ＨＲＰ）を添加する：
ストレプトアビジン−ＨＲＰ（GE Healthcare、前Amersham Biosciences, Piscataway, NJ、１ｍｇ／ｍｌ、４℃保存、Ｃａｔ ＃ＲＰＮ４４０１）を１：２０，０００に、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌにブロッキングバッファーで希釈する。ウェルにつき２５μｌを添加し、３０分間撹拌しながらインキューベートする。［注：アビジン−ＨＲＰは、当該技術分野において言及されるように、適切に改変してストレプトアビジン−ＨＲＰの代わりに用いられてもよい。］プレートを覆い、３０分間のＲＴでインキューベートする。このプロトコルにおいて上記のように、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）でプレートを６回洗浄する。
【０１７２】
ＶＩ．基質を添加し、発色させる：
ＴＭＢ Ａの一部をＴＭＢ Ｂの一部に混合する（ＴＭＢペルオキシダーゼ溶液Ａ及びＢ（KPL, Gaithersburg, MD、それぞれＣａｔ＃ ５０−７６−０２及び５０−６５−０２）、４℃保存）。それぞれのウェルに２５μｌのＴＭＢ基質を添加し、振盪する。発色させるために室温で１５分インキューベートし消光させるために１ＭＨ３ＰＯ４を２５μｌ添加する。４５０−６５０ｎｍでプレートを読みとる。
【０１７３】
標準曲線から血清試料ＩｇＥレベルを内挿する。
【０１７４】
実施例５ 抗体アイソタイプを定量するハイブリドーマ
ハイブリドーマを当該分野の公知技術を用いて構築する。実施例４のアッセイを用いて、免疫グロブリンアイソタイプの特性を示す。
【０１７５】
結合親和性、エピトープ特性評価及び関連する経路における作用様式について抗体の特性を決定する。
【０１７６】
実施例６ 免疫化：インビボでスイッチするアイソタイプを誘導するＴＮＰ−ＯＶＡ；ＯＶＡ；フィコール
本明細書に記載されているように、この実施例は組換え動物のインビボにおける免疫化を例示する。
【０１７７】
８週間齢、性別の適合した、約２５−３０ｇの重さのＢａｌｂ／Ｃマウスを、１００μｌ無菌ＰＢＳ中のＴＮＰ−ＯＶＡ５０μｇ／ａｌｕｍ２ｍｇ又はＴＮＰ−フィコール５０μｌの腹腔内投与により免疫化し、２８日目に追加免疫した。６０μｌ試料は、実施例４に記載されるアッセイを用いて抗体アイソタイプ測定のために３、７、１４、２１、２８、３５及び４２日目に尾静脈から採取される。
【０１７８】
ＩＩ．抗原誘導腹膜炎モデルと腹水ヒスタミンの測定。
動物及び感作手法
８週齢、約２５−３０ｇのパスツール研究所（Paris, France）で飼育されたＢａｌｂ／Ｃマウスを、１．６ｍｇの水酸化アルミニウム（Andersson & Brattsand, 1982）に吸着された１００ｇＬｇオバルブミンを含む０．４ｍｌ０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ（生理食塩水）の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって、能動感作した。７日間後、動物にＡｌ（ＯＨ）３の存在下で同用量のオバルブミンを接種し、７日後に用いた。
【０１７９】
抗原誘導腹膜炎
腹膜炎は、無菌生理食塩水に希釈された２．５又は２５ｇｍ／ｍｌのオバルブミンを含む溶液０．４ｍｌを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することによって誘導する（腔につき注射された最終的な用量としてオバルブミン１又は１０μｇ）。コントロール動物には、同量の無菌生理食塩水を接種する。抗原曝露後の様々な時間間隔（３０分−１６４ｈ）で、動物を過量のエーテルによって安楽死させ、腹腔を切開し、３ｍｌのヘパリン生理食塩水（１ｍｌにつき１０Ｕ）で洗浄する。初期容積の約９０％は回収される。まれなケースにおいて、腹腔において出血がみられる場合、動物は用いられる。
【０１８０】
ヒスタミンレベルは、当該分野で公知の方法を用いて測定する。
【０１８１】
実施例７ ＩｇＥを誘導するためのブラジル鉤虫の感染
この実施例は、寄生虫、ブラジル鉤虫の感染へのＩｇＥ反応を例示する。
【０１８２】
ブラジル鉤虫の発生過程はマウスにおいて特性が明らかとされている（Love, Nippostrongylus brasiliensis infections in mice: the immunological basis of worm expulstion, (1975) Parasitiology 70:11）。マウスにおいて感染幼虫（Ｌ３）が皮膚に侵入すると、リンパ及び血管系を経て肺まで運ばれる。気管−食道への移動の後、第四期の幼虫（本来のＬ３用量の約１５−３５％）は、小腸の内腔へと運ばれ、成熟する。感染は、幼虫の播種の後の７日目までに明らかとなる。糞便の卵排出量の急低下が先行して起こり、虫の排除は、明らかとなったすぐ後に起こる（約日９及び実質的に１２日目までに完了する）。
【０１８３】
実験条件化でのブラジル鉤虫の維持、感染方法、虫の移行及び計数のための虫の回収は先に記載される（Love & Ogilvie, Nippostrongylus brasiliensis in young rats. Lymphocytes expel larval infections but not adult worms. (1975) Clin. Exp. Immunol. 21:155）。生きている虫を、虫のマウントから精製する。精製された虫を、計数し、２５００虫／ｍｌでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁する。Ogilvieによって記載されるように（Reagin-like antibodies in animals immune to helminth parasites Nature (1964) 204:91）、マウスを５００虫／２００μｌで皮下注射により感染させる。感染させられたマウスを通常の食事で飼い、任意で抗生水（５０００ｍｌｄｄＨ２Ｏ中の０．５ｇポリミキシンＢ及び１０ｇ硫酸ネオマイシン）を５日間に提供した。肺炎症について９日目にマウスを確認し、実施例４で提供された方法を用いて９日目及び１５日目に血清ＩｇＥレベルを確認する。
【０１８４】
実施例８ ＩｇＥ（気道、皮膚）を誘導するためのアレルゲンパネルでの感作
この実施例は、様々なアレルゲンへのＩｇＥ反応を例示する。
【０１８５】
アレルゲン（臨床で用いられる）（例えば塵ダニ、コナヒョウダニ、ヤケヒョウヒダニ、ワモンゴキブリ、アルテルナリア属テニウス(Alternaria tenuis)、アスペルギルス、クロカワカビ(Cladosporidium herbarum)、ネコ、イヌ、オオバコ−スイバ類、ブタクサ(Short Ragweed)、ウエストオーク(West Oak)混合、草混合／ギョウギシバ(Bermuda)／セイバンモロコシ(Johnson)、真菌及び他のアレルゲン）のパネルを様々な用量で注射し、血清免疫グロブリンレベルを上記の通りに評価する。
【０１８６】
実施例９ 所望の治療の投与に続く血清ＩｇＥ及びメモリーＩｇＥ陽性Ｂ細胞の評価
この実施例は、様々な治療が様々な条件の下でＩｇＥ反応にどのように影響するかについて例示する。予防的及び治療的介入を、同様の方法で評価する。提案された治療剤への言及は、予防的及び治療的介入を包含することを意図している。
【０１８７】
ｎａｉｖｅ動物の血清ＩｇＥ濃度を測定する。動物をランダムに７つの群の一つに割当てた。第一の群は、治療的介入又は抗原曝露を受けない。第二の群は、ビヒクルのみを受け（すなわち抗原を受けない）、ついで提案された治療剤を受ける。第三の群は、抗原曝露を受け、ついで提案された治療剤を接種される。第四の群は、提案された治療剤を受け、ついでビヒクルのみを受ける。第五の群は、提案された治療剤を受け、ついで抗原曝露を受ける。第六の群は、ビヒクルのみを受ける（すなわち提案された治療剤を受けない）。第七の群は、抗原曝露のみを受ける（すなわち提案された治療剤を受けない）。
【０１８８】
抗原曝露と提案された治療剤の投与（又はその逆）との間隔は、最適投与時間を決定するために変化し得る。
【０１８９】
提案された治療のＩｇＥ血清レベルを調整する能力を評価するために、動物ＩｇＥレベルを長時間測定する。実施例４に記載されるアッセイを用いた抗体アイソタイプ測定のために３、７、１４、２１、２８、３５及び４２日目（抗原曝露後）に尾静脈から試料を６０μｌ採取する。
【０１９０】
本願明細書に記載されている実施例及び実施態様は、例証することのみを目的とし、その様々な改変又は変更は当業者に示唆され、本出願及び添付の請求の範囲の趣旨に含まれるべきであることはよく理解される。本願明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のためのその全てが本願明細書に出典明示により援用されるものとする。
【０１９１】
産業上の利用可能性
本願明細書に提供される胚性幹細胞は、非特異的アレルゲンへのインビボモデルＩｇＥ反応の産生を可能にする。
【０１９２】
本願明細書に記載されるインビボ動物モデルは、非特異的アレルゲンへのＩｇＥ反応の完全なレパートリーを提供する。
表１：配列の概要
【０１９３】
引用リスト
特許文献
Karasuyama et al., US 6118044 - September 12, 2000 - Transgenic non-human animal allergy models
【０１９４】
非特許文献
Gerstein et al., Isotype switching of an immunoglobulin heavy chain transgene occurs by DNA recombination between different chromosomes, Cell (1990) 63:537-548[195] Liu et al., A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Research (2003) vol. 13 (3) pp. 476-84
【０１９５】
Pan et al., Characterization of Human γ4 Switch Region Polymorphisms Suggests a Meiotic Recombinational Hot Spot Within the Ig Locus: Influence of S Region Length on IgG4 Production, J. Immunol. (1998) 161:3520-3526
【０１９６】
Schmidtz, J and Radbruch, A, Immunoglobulin Class Switching in Encyclopedia of Immunology, Delves and Roitt (eds.), pages 1302-1306
【０１９７】
Szurek et al., Complete nucleotide sequence of the murine gamma-3 switch region and analysis of switch recombination in two gamma-3 expressing hybridomas, J. Immunol. 135:620-626 (1985)
【０１９８】
Warming et al., Mol. Cell. Biol. (2006) 26 (18): 6913-22) for subsequent use in embryonic stem (ES) cell targeting, resulting in "pBlight-DTA-IgE"
【０１９９】
Waterston et al., Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature. (2002) 420(6915): 520-62
【０２００】
Zarrin et al., Influence of switch region length on immunoglobulin class switch recombination, Proc Natl Acad Sci (2005) 102(7): 2466-2470
【０２０１】
Zarrin et al., Antibody Class Switching Mediated by Yeast Endonuclease-Generated DNA Breaks, Science (2007) 315:377-381
【０２０２】
Zarrin et al., Sgamma3 switch sequences function in place of endogenous Sgamma1 to mediate antibody class switching, (2008) J. Exp. Med. 205, 1567
【図１Ａ】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についてのクロスリファレンス
本出願は、２００９年２月２７日に出願された「Ｃεへの免疫グロブリン重鎖クラススイッチングが増強された高ＩｇＥ動物モデル」と題する米国仮特許出願出願番号６１／１５６，２９９に対して優先権を主張する。
【０００２】
配列表
配列番号：１−２０を含む配列表は、表１として本願明細書に添付される。配列表において提供されるそれぞれの配列は、あらゆる目的のために、その全てが本願明細書に援用されたものとする。
【０００３】
技術分野
この開示は、アレルギー治療を試験するための組み換えマウス及び方法に関連する。
【０００４】
背景
喘息は、先進国世界人口の５分の１に影響を及ぼす衰弱性疾患である。重症喘息は、入院及び健康管理費用の主要な原因である。臨床診療において、喘息は、皮膚プリックテスト（ＳＰＴ）又はインビトロ技術（ＲＡＳＴ又はＥＬＩＳＡ）によって検出される局所的空中アレルゲンに対する循環ＩｇＥの有無によりアトピー性又は非アトピー性に分類される。これらのＩｇＥ抗体はマストセル上の高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃｅＲＩ）と相互作用し、アレルゲン誘発の即時過敏症及び疾患の急性増悪を引き起こす。
【０００５】
成体喘息患者の約３分の１は非アトピー性に分類される。それらはより重症疾患（多くの場合慢性鼻副鼻腔炎と関連している）を有する傾向があるが、アレルゲンへの急性反応性の欠如は別として、それらの疾患は臨床的に類似している。
【０００６】
アレルギーは、一般に即時過敏症型の、アレルゲンと呼ばれる抗原の特定の型に対する免疫反応である。そのような反応は、アナフィラキシー、アレルギー性鼻炎（花粉症）、蕁麻疹及びアレルギー性喘息の発作の基礎をなしており、ブタクサ、花粉、ミツバチ又はスズメバチの毒、動物の鱗屑、カビ又はハウスダスト（例えばダニ）の成分のような共通のアレルゲンによって誘発され得る。
【０００７】
喘息、アレルギー性鼻炎及び過敏性皮膚炎の間には近い一致がある；これらの対象物の一つの存在は、他の２つの相対リスクを、対象の生涯にわたり３−３０倍増加させる。これらの疾患のうちの３つ全ては、高レベルの非特異性及び抗原特異性血清免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）と関連している。
【０００８】
ヒトにおいて、即時過敏症（ＩＨ）は、皮膚及びその他に存在するマストセル及び好塩基球の表面に固着されたＩｇＥアイソタイプの抗体によって媒介される。これらの細胞結合ＩｇＥ分子への抗原の結合は、細胞からヒスタミンのようなメディエーターの放出を誘発し、メディエーターが臨床現象（例えばアレルギー性反応を象徴する組織の膨張、そう痒又は気管支の平滑筋収縮）を誘導する。
【０００９】
特定のアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体は、アレルゲンの接触に応じてＢリンパ球によって産生及び分泌される。まず最初に、Ｂリンパ球（又はＢ細胞）はＩｇＭアイソタイプの抗体を発現し、それぞれのＢ細胞は特定の抗原決定基に特異的な抗体を製造することに関与している。抗原決定基を有するアレルゲン及びＴリンパ球によって製造される特定の因子の両方との接触により、Ｂ細胞がいわゆる抗体重鎖クラススイッチを経るように誘導される（Ｂ細胞によって産生される抗体の抗原特異性部分は変化しない）が、それはＩｇＭアイソタイプのμ−重鎖よりもε−重鎖（産生ＩｇＥ抗体）に付着される。そのようなクラススイッチは一見特定のＢ細胞にとって永続的であり、そうするように刺激されたときはいつでもアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体を分泌する。
【００１０】
マウスにおけるオバルブミン（ＯＶＡ）−誘導喘息は、ヒト喘息の最も一般的に用いられるモデルの一つである。Ｔｈ２型細胞は、ＯＶＡ誘導喘息の病因において決定的であると考えられる。Ｔｈ２リンパ球がアレルギー性喘息の開始、進行及び持続において重要な役割を果たすことは公知であるのに対して、免疫調節性メカニズムについては理解されるべきことが多く存在する。このモデルは、高ＩｇＥと関連するヒト疾患を模倣していない。
【００１１】
アレルギー性喘息モデルは、大きい動物モデル（例えばネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ及びサル）においても記載されている。これらの種の中で、ネコが自然に特発性の喘息を発症するので、ネコ科のものは特に興味がある。しかしながら、大きい動物モデルは、高価で、時間がかかり、免疫学的及び／又は分子ツールとしての利用可能性が限られている。
【００１２】
ＵＳ６１１８０４４（２０００）は、ＩｇＥ重鎖定常領域を有し、予め定義された抗原（すなわちＴＮＰ）に特異的な、導入遺伝子によってコード化される抗体型分子を恒常的に発現するトランスジェニックマウスを提供する。それは、未知又は非特異的抗原に対してポリクローナル反応を生じない。
【００１３】
現在、ヒト喘息の多くの主要な病理学的特徴（例えば平滑筋のマストセル浸潤）を欠いていることから、慢性気道疾患の望ましいモデルは存在しない。さらに、マウスは喘息にかからないので、それらのほぼ全ては時間とともに自然に回復する。したがって、抗体レパートリーがポリクローナルである天然のヒト以外の動物と比較して高いＩｇＥ反応を起こすことが可能なヒト以外の動物モデルを有することが望ましい。
【００１４】
現在、アレルギーに対する共通の治療は、推測されるアレルゲンの回避；特定の保護メカニズムを刺激し、それにより最終的にはアレルゲンへの宿主の感度を減少させる免疫療法としてのアレルゲンの注入；コルチコステロイドのような薬剤（マストセルからアレルギーのメディエーターの放出に干渉する）；及び抗ヒスタミン薬のような薬剤（放出されたメディエーターの生物学的作用を阻害する）を含む。しかしながら、アレルギー治療（特に副作用のないＢ細胞においてＩｇＥアイソタイプスイッチを阻害する治療剤）を試験するための望ましい動物モデルが存在しない。
【００１５】
したがって、高いＩｇＥ反応を起こす能力を有する細胞及び／又は動物を有することが望ましい。換言すれば、ＩｇＥ製造のための選択的鎖スイッチ組換えの速度を増強することが望ましい。
発明の簡単な要約
【００１６】
進行中の調査にもかかわらず、非特異的抗原（すなわち予め定義されていない抗原）へのポリクローナル反応を起こす喘息、アレルギー及び他の免疫性病態へのＩｇＥの関与のインビボモデルに対するニーズがある。高い血清ＩｇＥ反応がある高ＩｇＥ産生インビボ動物モデルも存在しない。
【００１７】
本願明細書において、抗アレルギー薬のサーチ及び／又は評価のための信頼性が高いモデルとして有用な組換え非ヒト動物（及びそれを用いる方法）が提供される。
【００１８】
野生型（すなわち天然又は未改変の）免疫グロブリン遺伝子座に実質的に類似する遺伝子座のゲノム構造を有し、抗原曝露に応答して免疫グロブリンの完全なレパートリーを提供する潜在性を保持する動物モデルは、ＩｇＥアイソタイプスイッチを阻害する抗アレルギー薬のサーチ及び／又は評価を可能にする。
【００１９】
本願明細書の開示は、アレルギー治療を試験するための動物モデルを提供する。動物モデルは抗原チ曝露への応答において抗体産生の広い多様性を提供し、抗体アイソタイプの完全な多様性及び抗原上のエピトープへの特異性の完全な成分を産生する。動物モデルは、さらに、アレルギー及び喘息に対するＩｇＥの生理的重要性を理解する手段を提供する。
【００２０】
第一の実施態様において、以下を含むターゲッティングベクターが提供される：
ａ）変更されるスイッチ領域の５’末端（５’アーム／アクセプター）に相同なＤＮＡの断片は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）のヌクレオチド２５４７０６２８から２５４６８１６１（配列番号：５）に対応する少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２００ヌクレオチド及び少なくとも２４００ヌクレオチドからなる群から選択される；
ｂ）選択可能な遺伝子マーカー；
ｃ）ドナースイッチ領域をコード化する、所望の／ドナーのＤＮＡ配列；及び
ｄ）変更されるスイッチ領域の３’末端（３’アーム／アクセプター）に相同なＤＮＡの第二の断片は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ １系統）のヌクレオチド２５４７０６２８から２５４６８１６（配列番号：８）に対応する少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２００ヌクレオチド及び少なくとも２４００ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２１】
一態様において、ターゲッティングベクターは、配列番号：４又は５を含む５’アームを有する。実施態様において、５’アームは、配列番号：４の残基２５−２４７１を含む。更なる態様において、５’アームは、内因性Ｉεの領域３’及び内因性Ｓεの５’に相同である。第二の態様において、ターゲッティングベクターは、配列番号：７又は８を含む３’アームを有する。実施態様において、３’アームは、配列番号：７の残基２−２４９５を含む。第三の態様において、ターゲッティングベクターは、ネオマイシン及びチミジンキナーゼからなる群から選択される選択可能な遺伝子マーカーを有する。更なる態様において、選択可能な遺伝子マーカーは、ネオマイシンである。第四の態様において、ターゲッティングベクターは、ｌｏｘｐ部位が隣接する選択可能な遺伝子マーカーを有する。第五の態様において、ターゲッティングベクターは、ヒト及びマウスからなる群から選択される所望のスイッチ領域を有する。第六の態様において、所望のスイッチ領域は、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択される。第七の態様において、所望のスイッチ領域は、マウスＳμ領域の大部分を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ断片である。第八の態様において、所望のスイッチ領域は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）のヌクレオチド２５６１７１７２から２５６１５７６１（配列番号：６）を含む。第九の態様において、４．９ｋｂのＮｈｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含むＳμ領域は、ＢＡＣクローンＲＰ２３−３５４Ｌ１６から単離されたゲノム断片を含むプラスミドからサブクローニングされた。
【００２２】
第二の実施形態において、以下の工程を含む改変された胚性幹細胞をインビトロで製造する方法が提供される：
ａ）以下から選択される、Ｃεを発現するためにクラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の確率を増強するために前記細胞のゲノムＤＮＡを改変する工程；
ｂ）内因性のＳε領域に直列に少なくとも一つの付加的なＳεコピーを付加することによってＳε長を増加させる工程；
ｃ）Ｓε領域の置換；及び
ｄ）正しく改変されたゲノムＤＮＡのために細胞を選択する工程。
【００２３】
ある態様において、改変は、Ｓε領域の、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択されるスイッチ領域での置換である。更なる態様において、改変は、Ｓε領域の、Ｓμ領域での置換である。更なる態様において、改変は、任意のアクセプターＳ領域（Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３、Ｓａ）のＳｍでの置換、又はその逆である。
【００２４】
第三の実施態様において、以下の工程を含む改変された胚性幹細胞（ＥＳＣ）をインビトロで製造するための方法が提供される：
ａ）ＳμをＳε領域と交換するために請求項１のベクターを用いる工程
ｂ）正しく改変されたゲノムＤＮＡの細胞を選択する工程。
【００２５】
一つの態様において、本発明の方法は、Ｓε領域を、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択されるスイッチ領域で置換する改変を提供する。更なる態様において、本発明の方法は、Ｓε領域をＳμ領域で置換する改変を提供する。別の態様において、本発明の方法は、ＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６から選択されるマウス系統のＥＳＣを提供する。
【００２６】
第四の実施態様において、以下の非ヒト動物が提供される：
ａ）ＩｇＨ遺伝子座の少なくとも一つのアレルが、非改変アレルと比較してＩｇＥ発現／産生／分泌／速度を増強するように改変されている；及び
ｂ）以下からなる群から選択されるＩｇＥプロファイルを有している：
ｉ．全ての血清抗体のＩｇＥ画分が０．０４％以上である；
ｉｉ．ＩｇＥ血清中濃度が４，０００ｎｇ／ｍｌ以上である；
ｉｉｉ．ＩｇＧ／ＩｇＥの比率が１０未満である。
【００２７】
第一の態様において、ヒト以外の哺乳動物は、４，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１０，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１５，０００ｎｇ／ｍｌ以上、３０，０００ｎｇ／ｍｌ以上、９０，０００ｎｇ／ｍｌ以上、１０μｇ／ｍｌ以上、２０μｇ／ｍｌ以上、３０μｇ／ｍｌ以上、４０μｇ／ｍｌ以上、５０μｇ／ｍｌ以上、６０μｇ／ｍｌ以上、７０μｇ／ｍｌ以上、８０μｇ／ｍｌ以上、９０μｇ／ｍｌ以上又は１００μｇ／ｍｌ以上のＩｇＥ血清レベルを有する。第二の態様において、ヒト以外の哺乳動物は、０．１から１０のＩｇＧ／ＩｇＥ比を有する。第三の態様において、ヒト以外の哺乳動物は、１００ｎｇ／ｍＬから１００００ｎｇ／ｍＬの曝露されていない（すなわち休止期の）ＩｇＥ血清中濃度を有している。第四の態様において、ヒト以外の哺乳動物は、１０００ｎｇ／ｍＬから１００００００ｎｇ／ｍＬの曝露された（すなわち活性化又は刺激された）ＩｇＥ血清中濃度を有している。第五の態様において、動物モデルはヒト以外の脊椎動物である。第六の態様において、動物モデルは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ又は霊長類である。第七の態様において、本願明細書に記載される非動物のゲノムは、より多くのＩｇＥを発現／産生するように改変されたＩｇＨ遺伝子座のＳε領域を有している。第八の態様において、ヒト以外の動物／哺乳動物モデルは、ジーンターゲッティングによって達成される改変を有する。第九の態様において、ヒト以外の哺乳動物は、少なくとも０．０４％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％又は１．０％のＩｇＥ画分を有する。
【００２８】
第五の実施態様において、アレルギー性疾患の治療方法の投与の前、同時又は後に動物をアレルゲンに暴露すること、及びＩｇＥ反応を評価することを含む、動物モデルを用いたアレルギー治療を試験する方法が提供される。本発明の方法の第一の態様において、抗原曝露への応答におけるＩｇＥレベルは、アレルギー治療をしない場合よりも低い。第二の態様において、試験動物及びコントロール動物は、同腹仔である。
【００２９】
第六の実施態様において、アレルギー治療を試験する方法によりアレルギーの治療のための医薬として同定された化合物の使用が提供される。
【００３０】
第七の実施態様において、本願明細書に記載される動物モデルから入手可能な細胞株が提供される。
【００３１】
第八の実施態様において、本願明細書に記載される動物モデルから単離される細胞が提供される。
【００３２】
第九の実施態様において、非ヒト動物モデルの作出方法が提供され、前記方法は：
ａ）断片がＣε−コード化領域の上流においてゲノムＤＮＡに組み込まれ、Ｃε−コード化領域に作動可能に連結されるように、マウスの受精卵に配列番号：６（Ｓμ）をコード化するプラスミドの直線化断片を顕微注入すること、ｂ）前もって偽妊娠を誘導するように処理された雌マウスの卵管に前記受精卵を移植すること、及びｃ）雌マウスの子宮において前記卵子を発生させること、を含む。
【００３３】
第十の実施態様において、ＩｇＥ産生率を増強するように改変されたＩｇＨ遺伝子座の少なくとも一つのアレルを含む改変ゲノムを生殖系列に含む組換えマウスが提供される。第一の態様において、組換えマウスは、Ｓε領域のＳμ領域又はその機能部分での置換を含む改変を有する。第二の態様において、Ｓμ機能部分は、少なくとも１ｋｂから１０ｋｂ長である。
【００３４】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明白になる。しかしながら、この詳細な説明から本発明の範囲及び趣旨の様々な変型及び改変が当業者にとって明らかになるので、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しているが、例示することのみを目的としていることはよく理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、マウスＩｇＨ遺伝子座の遺伝子改変の概略図である。（Ａ）生殖系列配置におけるＣｍまでの可変領域のゲノム機構。（Ｂ）Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子組換えは、Ｂ細胞を産生する低親和性ＩｇＭの大きいプールを生成する機能コード化可変領域を構築する。（Ｃ）ＡＩＤ及び生殖系列転写の誘導に付随するＢ細胞の活性化はＳＨＭを引き起こし、ポイントミューテーションは構築された可変領域に導入される（アスタリスク）。Ｓｍ及び下流のＳ領域（例えばＳｇ１）におけるＡＩＤ媒介ＤＳＢｓ（電光シンボル）は、新規のアイソタイプ（例えばＩｇＧ１）転写を引き起こすために接続される。さらに、切除された環状の断片は、介在配列を接続することによって生成される。
【００３６】
【図２Ａ】図２Ａは、ジーンターゲッティングストラテジーの概略図及びマウスＳε領域の改変のための組換え部位を例示する。Ｃｒｅ＿ｌｏｘＰ遺伝子組換え後の標的アレルの構造は、一番下に例示される。制限酵素切断部位は明示される。Ｒ１は、ＥｃｏＲＩのためのスプライスサイトを示す。他の全ての制限酵素は、それらの正式な表記を有する。
【００３７】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ターゲッティングベクターｐＳＷ３１２の概略図である。実施例３を参照のこと。
【００３８】
【図３】図３は、ドナースイッチ領域を有するＳε領域の置換の前後のマウスＩｇＨ遺伝子座全体の概略図である。このダイアグラムにおいて、ドナースイッチ領域はＳμである。上のパネルは、未改変ＩｇＨ遺伝子座である；下のパネルは、本願明細書に記載される改変ＩｇＥ遺伝子座を例示する。
【００３９】
【図４Ａ】図４Ａは、未改変（すなわち野生型）ゲノム遺伝子座の概略図であり、制限酵素認識部位、プローブ及びスイッチ領域の相対的位置関係を例示する。５’相同アームは、ブラックボックスによって表される。３’相同アームは、灰色のボックスによって表される。
【００４０】
【図４Ｂ】図４Ｂは、改変ゲノム遺伝子座の概略図であり、Ｓｍで置換されたＳｅを有する制限酵素認識部位、プローブ及びスイッチ領域の相対的位置関係を例示する。５’相同アームは、ブラックボックスによって表される。３’相同アームは、灰色のボックスによって表される。
【００４１】
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＳμでのＳεの置換を確認するサザンブロットである。野生型Ｂ６試料は関連する大きさのバンドを一つのみ示し、単一のゲノムＩ領域の存在を示しているのに対し、標的胚性幹細胞試料は異なる大きさの２つのバンドとして明らかにされた野生型及び標的Ｓ部位（ＳεがＳμで置換されている）を示す。これは、意図されたスイッチ領域の成功したターゲッティング及び置換を示す。
【００４２】
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＳμでのＳεの置換を確認するサザンブロットである。野生型Ｂ６試料は関連する大きさのバンドを一つのみ示し、単一のゲノムＩ領域の存在を示しているのに対し、標的胚性幹細胞試料は異なる大きさの２つのバンドとして明らかにされた野生型及び標的Ｓ部位（ＳεがＳμで置換されている）を示す。これは、意図されたスイッチ領域の成功したターゲッティング及び置換を示す。
【００４３】
図５−１１は、本願明細書に記載されるヌクレオチドを示す。ヌクレオチド塩基コードは、以下の通りである：Ａ又はａはアデニンである；Ｃ又はｃはシトシンである；Ｇ又はｇはグアニンである；Ｔ又はｔはチミンである；Ｍ又はｍは、アデニン又はシトシンである；Ｓ又はｓは、シトシン又はグアニンである；及び、Ｎ又はｎは、アデニン又はシトシン又はグアニン又はチミンである。
【００４４】
【図５】図５は、マウスの２つのヌクレオチド配列を示す。モチーフＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＧ（図５Ａに示される配列番号：１）はＳｍ及びＳｅにおいて見いだされ、第二のモチーフＧＡＧＣＴＧＡＣＴはＳｅ領域においてわずかにＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴに改変された（Ｓｍモチーフと比較して付加されたＧを有する）（図５Ｂに示される配列番号：２）。
【００４５】
【図６】図６は、ＩｇＨ遺伝子座のＢａｍＨＩ／ＰＶｕＩ断片から欠失された２０５５塩基対（配列番号：３）を示す。
【００４６】
【図７】図７は、Ａ）配列番号：４、２４７１塩基対５’アーム（１２９マウス）、及びＢ）ＮＣＢＩ ＮＴ＿１６６３１８のヌクレオチド２５４６８１６１から２５４７０６２８に対応する配列番号：５、２４６７の塩基対５’アーム（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ系統）を示す。
【００４７】
【図８】図８は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）のヌクレオチド２５６１７１７２から２５６１５７６１に対応する配列番号：６（大文字で）（１１４１の塩基対）を示す。
【００４８】
【図９】図９は、Ａ）配列番号：７、３’アーム（１２９マウス配列）、及びＢ）ＮＣＢＩ ＮＴ＿１６６３１８の２５４６３２７３から２５４６６１０６に対応する配列番号：８、３’アーム（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ配列）を示す。
【００４９】
【図１０】図１０は、Ａ）ＢａｍＨＩの３．７ｋｂ上流（５’プローブを設計するために用いられた）（配列番号：９）、及びＢ） ＰＶＵＩからＥＣＯＲＩの断片（３’プローブを設計するために用いられた）（配列番号：１０）を示す。
【００５０】
【図１１】図１１は、実施例２において用いられたプローブを示す。Ａ）配列番号：１１、Ｉ−ｍｕ Ｆｏｒｗａｒｄ−１（２１塩基対）；及びＢ）配列番号：１２、Ｃ−ｅｐｓｉｌｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−１（３０塩基対）；Ｃ）配列番号：１３、Ｅ−ｍｕ Ｆｏｒｗａｒｄ−２（２０塩基対）；Ｄ）配列番号：１４、Ｃ−ｅｐｓｉｌｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−２（３０塩基対）；Ｅ）配列番号：１５、Ｆｏｒｗａｒｄ：ＳＭ５’（２０塩基対）；Ｆ）配列番号：１６、９２２５Ｆ（１９塩基対）；Ｇ）配列番号：１７、９５１８Ｆ（２６塩基対）；及びＨ）配列番号：１８、Ｒｅｖｅｒｓｅ（３０塩基対）。
【００５１】
【図１２】図１２は、ＢＡＣ ＲＰ２３−１３５Ｌ１２（Invitrogen）から読み出されたＩｇＥ Ｃ５７ＢＬ／６ゲノム配列（太字で下線を引かれたフォントに示された欠失されるＳｅ領域）である（配列番号：１９）。
【００５２】
【図１３】図１３Ａ−Ｄは、免疫刺激後の野生型（ＷＴ）及びヘテロ接合体（ＨＥＴ）脾細胞における様々な免疫グロブリンの細胞内レベルのＦＡＣＳデータをまとめている。図１３Ａは、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激後のＩｇＭレベルがＷＴ及びＨＥＴ動物で同一であることを示す棒グラフである。図１３Ｂは、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）刺激後のＩｇＧ３レベルがＷＴ及びＨＥＴ動物で同一であることを示す棒グラフである。図１３Ｃは、ＩＬ−４と抗ＣＤ４０（４／４０）の併用刺激後のＩｇＧ１レベルがＷＴと比較してＨＥＴ動物において減少したことを示す棒グラフである。図１３Ｄは、ＩＬ−４と抗ＣＤ４０（４／４０）の併用刺激後のＩｇＥレベルがＷＴと比較してＨＥＴ動物において増加したことを示す棒グラフである。
【００５３】
【図１４】図１４Ａ−Ｄは、図１３に示されるデータを作成するために用いられたものと同一の脾細胞についてのＥＬＩＳＡデータを要約している。刺激後６日目において、ＦＡＣＳ解析のために用いられたものと同じように刺激された脾細胞（３匹のＨｅｔ及び３匹のＷＴマウス）の上清は、ＥＬＩＳＡアッセイに用いられた。ＦＡＣＳ解析において観察されたものと一致して、ＩＬ４／抗−ＣＤ４０で刺激された場合、ＷＴと比較してＨｅｔにおいて増加したＩｇＥ発現レベル及び減少したＩｇＧ１発現レベルも観察された。これは、ＩｇＧ１へのスイッチと競合し、ＩｇＥスイッチレベルを増加させるＳｍＫＩ部位において頻繁な破壊が発生していることを示唆する。ＬＰＳ刺激はコントロールとして働き、ＷＴ及びＨｅｔが同様のＩｇＭ及びＩｇＧ３レベルを有することを示しており、他のスイッチ配列がクラススイッチのために利用できる場合、遺伝子座が未改変で、正常に機能することを示唆する。
【発明の詳細な説明】
【００５４】
本発明は、次に、参照することを目的に以下の定義及び例のみを用いて詳述される。本願明細書に言及される全ての特許及び刊行物は、特許及び刊行物中で開示される全ての配列を含めて、明確に出典明示により援用されたものとする。
【００５５】
本願明細書に定義されない限り、本願明細書において用いられる全ての専門的及び科学的な用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED.、John Wiley and Sons, New York (1994)及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、本発明において用いられる用語の一般的な定義の多くを当業者に提供する。本願明細書に記載されるものと類似又は同等なあらゆる方法及び材料を本発明を実行又は試験する際に用いることができるが、好ましい方法及び材料を記載する。数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。特に明記しない限り、それぞれ核酸は左から右に５’から３’方向に記載され；アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載される。専門家は、技術の定義及び用語について、特にSambrook et al., 1989, and Ausubel FM et al., 1993を参考にする。本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び試薬には限定されず、異なり得ることはよく理解されることである。
【００５６】
数値範囲は、範囲を定義している数値を含む。
【００５７】
特に明記しない限り、それぞれ核酸は左から右に５’から３’方向に記載され；アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に記載される。
【００５８】
本願明細書に提供される見出しは、明細書全体を参照することで得られる本発明の様々な態様又は実施態様を限定するものではない。したがって、下記に定義される用語は、明細書全体を参照することでより明確に定義される。
【００５９】
定義
新規な組換え非ヒト宿主、特に哺乳動物宿主、通常ミューリン（ｍｕｒｉｎｅ）は提供され、宿主は免疫原（抗原とも称される）に対して免疫応答を開始することが可能である。総血清Ｉｇ濃度の高いＩｇＥ成分又は画分を伴うが、産生される免疫応答は抗体の完全なレパートリーである。
【００６０】
「組換え」は、動物又は細胞のＤＮＡが遺伝子工学による改変を含むことを意味する。したがって、例えば、「組換え動物」は、本願明細書に記載されるように、少なくとも一部の細胞が遺伝子組換えを含むものである。同様に、「組換え細胞」は、本願明細書に記載されるように、そのゲノムが遺伝子組み替えを有するものである。
【００６１】
「非特異的抗原」は、単独又はより大きな分子（タンパク質）と複合体を形成した後に免疫応答を引き起こし、免疫応答の産物（抗体又はＴ細胞）と結合可能な、身体にとって異質なあらゆる物質（免疫原又はハプテン）を意味する。
【００６２】
本明細書において使用されるように、「アイソタイプ」は、重鎖定常域遺伝子によってコード化される抗体クラス（例えばＩｇＭ又はＩｇＧ１）を意味する。
【００６３】
本明細書において使用されるように、「アイソタイプスイッチング」は、抗体のクラス又はアイソタイプがあるＩｇクラスから他のＩｇクラスに変化する現象を意味する。
【００６４】
本明細書において使用されるように、「非スイッチアイソタイプ」は、アイソタイプスイッチングが起こらなかった場合に産生される重鎖のアイソタイプクラスを意味する；非スイッチアイソタイプをコード化しているＣＨ遺伝子は、一般的に機能的に再編成されたＶＤＪ遺伝子のすぐ下流の第一のＣＨ遺伝子である。
【００６５】
本明細書において使用されるように、用語「スイッチ配列」は、スイッチ組換えに関与するＤＮＡ配列を意味する。クラススイッチ組換え（ＣＳＲ）の間、「スイッチドナー」配列（一般的にμスイッチ領域）は、スイッチ組換えの間に欠失される領域の５’（すなわち上流）に存在する。「スイッチアクセプター」領域は、欠失される領域と置換定常領域（例えばγ、ε等）との間に存在する。遺伝子組換えが常に発生する特定の部位がないように、最終的な遺伝子配列は一般的に予測可能でない。スイッチ配列は、本願明細書においてスイッチ領域と交換可能に用いられる。
【００６６】
本願明細書に記載される遺伝子改変（すなわち組換え）動物において、スイッチアクセプター領域は、血清ＩｇＥレベルが上昇するように、ＣＳＲを増強するように改変される。
【００６７】
Ｓ領域は、長さにおいて大きく異なる、大きな反復性イントロン配列である（反復領域は、マウスにおいて２．０から６．５ｋｂにわたる）。哺乳動物Ｓ領域は、非鋳型鎖上で非常にＧが豊富であり、主にＴＧＧＧＧ、ＧＧＧＧＴ、ＧＧＧＣＴ、ＧＡＧＣＴ及びＡＧＣＴなどの特定のモチーフが優勢な直列型の反復ユニットから構成される。
【００６８】
用語「再編成された」は、本願明細書で用いられるように、基本的に完全なＶＨ又はＶＬドメインのそれぞれをコード化しているコンフォメーションにおいてＶセグメントがＤ−Ｊ又はＪセグメントに隣接して位置する、重鎖又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を意味する。再編成された免疫グロブリン遺伝子座は、生殖系列ＤＮＡとの比較により同定することができる；再編成された遺伝子座は、少なくとも一つの組換え七量体／九量体相同エレメントを有する。
【００６９】
用語「再編成されていない」又は「生殖系列配置」は、Ｖセグメントに関して本願明細書において用いられるように、ＶセグメントがＤ又はＪセグメントと隣接するために組み換えられていない配置を意味する。図１を参照のこと。
【００７０】
核酸のために、用語「実質的な相同性」は、２つの核酸又はその明示された配列は、最適に整列して比較した場合、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を伴い、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常は約９０から９５％、より好ましくはヌクレオチドの少なくとも約９８〜９９．５％が同一であることを示す。あるいは、セグメントが選択的ハイブリダイゼーション条件下で相補鎖にハイブリダイズする場合、実質的な相同性が存在する。核酸は、細胞全体、細胞可溶化物、又は部分的に精製されたか実質的に純粋な形態中に存在し得る。アルカリ性の／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガロースゲル電気泳動及び当該技術分野で周知の他の標準技術を含む標準技術によって、他の細胞成分又は他の不純物、例えば他の細胞の核酸又はタンパク質から精製された場合、核酸は「単離された」又は「実質的に純粋になる」。F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)を参照のこと。
【００７１】
ｃＤＮＡ、ゲノム又は混合物からの本発明の核酸組成は、多くの場合天然配列であるが（改変された制限酵素認識部位などを除いて）、遺伝子配列を提供する標準技術に従って変異させてもよい。コード化配列に対して、これらの変異は要望通りにアミノ酸配列に影響を及ぼし得る。特に、天然のＶ配列、Ｄ配列、Ｊ配列、定常配列、スイッチ配列及び本明細書に記載される他の配列に実質的に相同的なＤＮＡ配列又はそれから誘導されるＤＮＡ配列が意図される（「誘導された」は、配列が同一又は他の配列から改変されることを示す）。
【００７２】
核酸が他の核酸配列と共に機能的関係に入れられる場合、核酸は「作動可能に連結される」。例えば、配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーター又はエンハンサーはコード化配列に作動可能に連結される。転写制御配列に関して、作動可能に連結は、連結されるＤＮＡ配列が近接し、２つのタンパク質コード化領域を連結する必要がある場合に近接し、リーディングフレーム中に存在することを意味する。スイッチ配列に対して、作動可能に連結は、配列がスイッチ組換えをもたらすことが可能なことを示す。
【００７３】
抗体レパートリーを伴って異物抗原刺激に反応する非ヒト動物の設計は、動物に含まれる免疫グロブリン遺伝子がＢ細胞発生経路にわたって正しく機能することが必要である。重鎖遺伝子の正しい機能は、アイソタイプスイッチングを含む。したがって、本発明の遺伝子は、アイソタイプスイッチング及び以下の一以上を生じさせるために構築される：（１）高レベル及び細胞型特異的な発現、（２）機能遺伝子再構成、（３）アレル排除の活性化及びアレル排除への反応、（４）充分な一次レパートリーの発現、（５）シグナル伝達、（６）体細胞性過剰変異及び（７）免疫応答中のＩｇＥ抗体遺伝子座の支配。
【００７４】
マウスにおいて、ＣＨ遺伝子は、５’−Ｖ（Ｄ）Ｊ−Ｃμ−Ｃδ−Ｃγ３−Ｃγ１−Ｃγ２ｂ−Ｃγ２ａ−Ｃε−Ｃα−３’の順で編成される。ＣＳＲは、個々のＣＨ遺伝子の１から１０キロベース（ｋｂ）の反復ＤＮＡエレメント５’であるスイッチ（Ｓ）領域において発生する。ＣＳＲはＣｍ（Ｓｍ）上流のＳ領域とＳ領域の下流の間での組換えから生じ、介在配列の欠失が付随する。
【００７５】
免疫グロブリン
免疫系は、抗体を産生することによって異種侵入物（抗原）に応答する。抗体は、侵入する微生物に自身を付着させ、破壊するためにそれらを標識する、又は細胞に感染するのを予防するタンパク質分子である。抗体は、抗原特異的である。すなわち、抗原暴露に応答して産生される抗体は、その抗原に特異的である。
【００７６】
哺乳動物は、四つのＩｇアイソタイプ（又はクラス）を産生する：ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＡ（それぞれ、μ、γ、ε及びα定常領域によってコード化される）。
【００７７】
関連するＩｇＧサブクラスは、異なるＣγ領域によってコード化される。それぞれのＩｇアイソタイプは、抗原除去の特定の形態に特殊化されている。ＩｇＭ（Ｂ細胞によって合成される第一のアイソタイプ）は、補体を活性化する。ＩｇＧ（血清において最も豊富なアイソタイプ）は、食細胞上の受容体に結合する。ＩｇＧ抗体は、胎児へ母性保護を提供するために、胎盤を越える。ＩｇＡ抗体は、分泌物（例えば涙及び唾液）において豊富である；それらは、侵入した病原体の増殖を予防するために被覆する。ＩｇＥ抗体は寄生線虫に対する保護を提供することができるが、それらは先進国において悪者である：それらは好塩基及びマストセルに結合し、ヒスタミン放出を活性化して、アレルギー応答を引き起こす。
【００７８】
免疫原（又は抗原）は、抗体反応を誘発することができる。多くの異なる型の抗原の成功した認識及び根絶には、抗体の多様性が必要とされる；それらのアミノ酸組成は異なり、それらが多くの異なる抗原と相互作用することができる。ヒトは約１００億の異なる抗体を生成し、それぞれの抗原の異なるエピトープに結合することが可能であることが推測されている。異なる抗体の膨大なレパートリーが単一の個体において生成されるにもかかわらず、これらのタンパク質を製作するために利用可能な遺伝子の数は限られている。脊椎動物Ｂ細胞が比較的少ない抗体遺伝子から抗体の多様なプールを生成することを可能とするいくつかの複雑な遺伝子のメカニズムが進化してきた。
【００７９】
Ｂ細胞の発生
Ｂ細胞は、成熟した機能的細胞になる前に、骨髄及び脾臓において一連の分化チェックポイントを経る。分化を続けるか、細胞死を経るかの決定は、これらのチェックポイントで発生し、主に免疫グロブリンＢ細胞受容体（ＢＣＲ）及び抗原結合性及びシグナル伝達分子として機能する能力を中心に展開する。そのような最初の二つのチェックポイントは、新しく合成された重鎖（Ｈ）がプレ−ＢＣＲを形成するために代替軽鎖（Ｌ）と結合するプロ−Ｂからプレ−Ｂへの移行における骨髄、及びＨ鎖がＢＣＲを形成するために通常のＬ鎖と結合するｐｒｅ−Ｂから未分化Ｂ細胞のステージにおける骨髄に存在する。プレ−ＢＣＲ又はＢＣＲを形成することができない細胞はアポトーシス（プログラム細胞死）を経るが、ＢＣＲを形成することができるものは分化を続ける。末梢へ移動する成熟Ｂ細胞は抗原によって活性化され、抗体を分泌するプラズマ細胞又はメモリーＢ細胞となり、より迅速に抗原への２度目の暴露に反応する。抗原活性化Ｂ細胞が増殖するのを止める場合、それらは成熟プラズマ細胞に分化することができる。プラズマ細胞は、基本的に『抗体工場』である。（Hardy & Hayakawa, B Cell Development Pathways, Annu Rev Immunol. (2001) 19:595-621を参照。）
【００８０】
最初に、全てのＢ細胞は、ＩｇＭ抗体を産生する。ｍ重鎖の可変領域ドメインをコード化しているＶ、Ｄ及びＪエレメントは、ＩｇＭＣ領域をコード化するＣｍエキソンに隣接して免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座の５’末端に位置する。適切な刺激に続いて、Ｂ細胞は、抗体の抗原特異性を保持しながら、クラススイッチングにより、産生する抗体のアイソタイプを変えることができる。クラススイッチングは、クラススイッチ組換え（ＣＳＲ）と呼ばれるメカニズムによって、重鎖遺伝子座において発生する。このメカニズムは、それぞれの定常域遺伝子（δ−鎖を除く）の上流のＤＮＡにおいて見いだされるスイッチ（Ｓ）領域と呼ばれる保存されたヌクレオチドのモチーフに依存する。このプロセスにおいて、ゲノムＤＮＡはスプライシングされ、それぞれＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＡアイソタイプのγ、ε及びα鎖をコード化するＣ領域エキソンにＶＤＪエレメントを並置するために再結合される；これらのＣ−領域エキソンは、ＩｇＨ領域のさらに下流に位置する。このプロセスは、異なるアイソタイプの抗体をコード化する免疫グロブリン遺伝子をもたらす。
【００８１】
Ｓ領域
活性化Ｂ細胞におけるＣγ、Ｃε及びＣα遺伝子の発現の抗体クラススイッチングの分子基盤は、ＶＤＪ遺伝子の次に新規なＣＨ遺伝子の３’に配置する遺伝子組換えである。明確なＩｇクラススイッチ組換え部位は、Ｓ領域（Ｃδ以外のそれぞれのＣＨ遺伝子の５’に存在する高頻度反復ＤＮＡ配列）中に位置する。
【００８２】
全てのミューリン及び多くのヒトのＳ領域は、少なくとも部分的に配列決定されている。それらは１−１０ｋｂ長であり、高度に反復しており、ＧＣが豊富である。ミューリン及びヒトのＳμは、大部分が均一に、２つの五量体配列ＧＡＧＣＴ及びＧＧＧＧＴ及び七量体配列（Ｃ／Ｔ）ＡＧＧＴＴＧから構成される。他のＳ領域の全ても五量体配列の複数のコピーを含む。Ｓμを除く全てのミューリンＳ領域は、Ｓγ１、Ｓγ３及びＳγ２ｂに対する４９塩基対の反複、Ｓγ２ａに対する５２塩基対の反複、Ｓαに対する８０塩基対の反複及びＳεに対する４０塩基対の反複を有する、配列及び長さにおいて異なるタンデムリピートから構成される。ヒト及びミューリンのＳμは、Ｓγ領域よりもＳε及びＳαに相同であり、各々相当の相同性を有する。Ｓ領域は、ヒトＳ領域がマウス細胞におけるスイッチ組換えのための基質として用いることができるように十分にヒト及びマウス間で保存されている。Ｓμ、Ｓε及びＳα領域は、２種間で、Ｓγ領域よりも相同である。実際、マウスＳｍモチーフＧＧＧＣＴＧＧＧＣＴＧ（配列番号：１）はＳｅにおいて見いだされ、第二のモチーフＧＡＧＣＴＧＡＣＴはＳｅ領域においてＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴ（Ｓｍモチーフと比較して付加されたＧを有する）（配列番号：２）としてわずかに改変されている。Ｓ領域の長さは多くの対立形質の変異（長さ多型）の影響を受けており、特定のＳ領域の特定サイズに対する機能的要件がないことを示している。
【００８３】
ＩｇＥ及び血清ＩｇＥレベル
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は、哺乳動物においてのみ見いだされる抗体のクラス（又は免疫グロブリン「アイソタイプ」）である。それは、アレルギーにおいて重要な役割を果たし、特に１型過敏症と関連している。ＩｇＥは、マンソン住血吸虫、旋毛虫及びカンテツなどほとんどの寄生虫への免疫システムの応答にも関与しており、特定の寄生原虫（例えばマラリヤ原虫）に対する免疫防御においても重要であり得る。
【００８４】
ＩｇＥは一般的に最も少ないアイソタイプであるが−ＩｇＧ（大部分の典型的な適応免疫応答に関与するアイソタイプ）の１０ｍｇ／ｍｌと比較して、正常な（「非アトピー性の」）個体の血清ＩｇＥレベルはＩｇＧ濃度の０．０５％である−それは最も強力な免疫反応を起動させることが可能である。
【００８５】
アトピー性の個体は、（高ＩｇＥ症候群患者のように）血液中に正常レベルの最大１０倍のＩｇＥを有し得る。好塩基及びマストセル（炎症反応を媒介することが可能）は「初回抗原刺激を受けて」、（喘息における気道収縮、湿疹における局所的炎症、アレルギー性鼻炎における増加した粘液分泌及び増加した血管透過などのアレルギーと関連する症状の多くを引き起こす）ヒスタミン、ロイコトリエン及び特定のインターロイキンのような化学物質を放出する準備ができるようになり、他の免疫細胞が組織に接近できるように（しかし、アナフィラキシーのように血圧の潜在的に致命的な効果を導き得る）、「アレルゲン」（一般的にこれは塵ダニＤｅｒＰ１、ネコＦｅｌＤ１、クサ又はブタクサ花粉などのタンパク質である。）を特異的に認識するＩｇＥは、その高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）と固有の長期相互作用を有する。それぞれの反応のメカニズムは周知であるにもかかわらず、他が単に鼻水となる場合でも、なぜいくつかのアレルギーがそのような急激な感受性を発達させるかはまだよく分かっていない。
【００８６】
血清総ＩｇＥ濃度試験は、血清試料中の総ＩｇＥレベルの測定を可能にする。ＩｇＥの高いレベルは、アレルギーの存在と関連している。ある総血清ＩｇＥの試験方法は、ＰＲＩＳＴ（ペーパーラジオイムノソルベント試験）である。この試験は、血清試料を放射性ヨウ素で標識されたＩｇＥと反応させることが関与している。結合した放射性ヨウ素（試験手順の完了後に算出される）は、血清試料中の総ＩｇＥ量に比例する。臨床免疫学において、免疫グロブリンの個々のクラスのレベルは、患者の抗体プロファイルを解明するために、比濁分析（又は濁り測定）で測定される。ＩｇＥレベルを測定する他の方法は、ＥＬＩＳＡ、免疫蛍光法、ウエスタンブロット、免疫拡散及び免疫電気泳動である。
【００８７】
１００ｋＵ／Ｌ以上のＵｎｉＣＡＰ２５０（登録商標）システムを用いた血清総ＩｇＥ濃度の測定結果は、上昇していると考えられる。ＩｇＥを測定する高感度二抗体ラジオイムノアッセイ法を用いたある研究において、明白なアレルギー症状のない健常人の血清ＩｇＥは、６から１０００ｎｇ／ｍｌの１３０倍の範囲にわたって変化していた。アレルギー性呼吸器疾患を有する患者において、ＩｇＥ濃度の範囲は相当な範囲で健常人と重なっているが、約３５％の未治療のアレルギー性個体は正常の９７パーセンタイルより高いＩｇＥ濃度を有し、５１％は９５パーセンタイルより高い。（G.J. Gleich, A.K. Averbach and H.A. Swedlund, Measurement of IgE in normal and allergic serum by radioimmunoassay. J. Lab. Clin. Med. 77 (1971), p. 690を参照。）
【００８８】
他の研究において、正常な成人の幾何平均ＩｇＥレベルは１０５ｎｇ／ｍｌであり、５〜２０４５の９５％区間であった。成人のＩｇＥの正常レベルは、約１００〜４００ｎｇ／ｍｌであり、ＩｇＧの１／４００，０００であることが報告されている。（Waldmann et al., The Journal of Immunology, 1972, 109: 304-310；Medical Immunology - 10th Ed. (2001) TG Parslow, DP Stites, AI Terr and JB Imboden, eds.、表７−２を参照）。
【００８９】
若者（２４−４３歳）、老人（６６−９６）及び百歳以上の人（９９−１０８）間の血清Ｉｇレベルの比較については、Listi et al., A Study of Serum Immunoglobulin Levels in Elderly Persons That Provides New Insights into B Cell Immunosenescence. Ann. N.Y. Acad. Sci (2006) 1089:487-495を参照のこと。特に、正常個体の免疫グロブリンの年齢及び性別に関連する血清中濃度についてはListi et al.（前掲）の表２を参照のこと。
【００９０】
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は、通常全ての血清抗体のごくわずかな画分（０．００４％）のみを示すにもかかわらず、アレルギー性疾患に中心的に関与していることから、臨床的見地から極めて重要である。アレルギー応答に関与する炎症細胞の２つの分化した型（マストセル及び好塩基）は、固有の、ＩｇＥ抗体に特異的な高親和性Ｆｃ受容体を有する。したがって、血液及び組織液中でＩｇＥはとても低い濃度（およそ１０−７Ｍ）にもかかわらず、これらの細胞の表面は、血液から吸収され、抗原受容体としての役割をするＩｇＥ抗体で常に装飾されている。その受動的に結合したＩｇＥ分子が抗原と接触する場合、マストセル又は好塩基は、アレルギー性疾患の急性の徴候の多くを産生する炎症媒介物質を放出する。血清ＩｇＥの高いレベルは、ぜん虫又は他の特定の多細胞寄生虫による感染も示し得る。ＩｇＧ及びＩｇＤの様に、ＩｇＥは単量体形態で存在する。Ｆｃ受容体は、主にε鎖のＣＨ３ドメインを認識するように見える。Medical Immunology - 10th Ed.（2001；上掲）を参照のこと。
【００９１】
ヒトにおける免疫グロブリンＥの血清中濃度は多様であるが、約２５００ｎｇ／ｍｌを超える血清ＩｇＥレベルが種々の疾患と関連していることは明らかである。同様の低レベルのＩｇＥがマウスにおいて報告されている（Pinaud et al., Localization of the 3' IgH locus Elements that Effect Long-Distance Regulation of Class Switch Recombination, Immunity (2001) 15(2): 187-199を参照）。
【００９２】
ジーンターゲッティング及びプラスミド
ジーンターゲッティングは、設計された外因性ＤＮＡフラグメントとマウス胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノムとの間で相同組換えを利用する技術である。導入されたＤＮＡフラグメントに含まれる同一の領域と天然の染色体間の遺伝子組換えは、設計されたＤＮＡでの染色体の一部の置換を引き起こす。これらの改変ＥＳ細胞は、胚盤胞に注射され、ＩＣＭ（内部細胞塊）の割球とともに胎児の発生に組み込まれ、寄与する。
【００９３】
手短に言えば、相同組換えを通して、変異された形態で特定の遺伝子の野生型アレルを置換するジーンターゲッティングベクターは設計される。標的ＥＳ細胞は、２−４日目の胚盤胞に移植(implant)され、偽妊娠母体に移植(transfer)される（下記参照）。
【００９４】
本願明細書において用いられるターゲッティングベクターは、四つの成分を有する：
ａ．５’アーム（５’フランキング領域とも称される）；
ｂ．選択マーカー；
ｃ．ドナースイッチ領域をコード化するＤＮＡ配列；及び
ｄ．３’アーム（５’フランキング領域とも称される）。
５’アームは、置換されるスイッチ領域の５’末端に相同なＤＮＡ断片である。選択マーカーは、相同組換えにおいて選択可能な表現型を与える。選択マーカーは、ｌｏｘｐ部位に隣接してもよい。ドナースイッチ領域は、選択マーカーの前後いずれであってもよい。３’アームは、置換されるスイッチ領域の３’末端に相同なＤＮＡ断片である。
【００９５】
５’及び３’フランキング領域は、どのような長さであってもよいが、相同性の程度に依存している。ここで使用されるように、２つのＤＮＡ配列部分間の「実質的な相同性」は、ＤＮＡフラグメントが遺伝子組換えコンピテント細胞に共同導入する場合に、配列部分が検出可能な遺伝子組換えを容易にするために十分に相同であることを意味する。ヌクレオチド配列が互いに少なくとも４０％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも８０％及び最も好ましくは１００％同一である場合、２つの配列部分は実質的に相同である。これは、相同性の減少が対応する相同組換えの成功の頻度を減少させるからである。配列相同性の実際的な下限は、相同性がさらに減少すると、遺伝子組換えコンピテント哺乳動物細胞のＤＮＡ断片の検出可能な相同組換えを媒介しない相同性として定義される。５’及び３’フランキング領域は、それぞれの相同配列部分について、好ましくは少なくとも５００塩基対、より好ましくは１０００塩基対、次に最も好ましくは約１８００塩基対及び最も好ましくは１８００塩基対より大きい。
【００９６】
望ましくは、マーカー遺伝子は、欠失する配列を置換するための標的構築物において用いられる。様々なマーカー、特に正の選択を可能とするものが使用され得る。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（「ｎｅｏ」）の遺伝子の発現から生じるＧ４１８耐性の使用が特に興味がある。ゲノム中のマーカー遺伝子の存在は、組込みが起こったことを示す。
【００９７】
Ｓε領域が置換される領域である場合、ドナースイッチ領域はＳμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ又はＳγ３領域であってもよい。ドナー領域は、刺激・非組換え条件下で（すなわちスイッチ領域は変更されていない）、Ｃεより高いレベルでの関連する重鎖の発現を引き起こすものである。
【００９８】
ほとんどの場合、サザンブロットハイブリダイゼーションによるＤＮＡ分析は、組込み位置を確認するために使用される。挿入物及び相同組込みが発生する領域に隣接する５’及び３’領域の配列に対するプローブを用いることによって、相同的ターゲッティングが起こったことを証明することができる。
【００９９】
ＰＣＲは、相同組換えの存在の検出において有利に用いられ得る。標的構築物内の配列に相補的なＣＲプライマー、及び標的遺伝子座において構築物の外側の配列に相補的なＰＣＲプライマーが用いられ得る。この方法において、相同組換えが起こった場合、相補鎖に存在する両方のプライマーを有するＤＮＡ分子のみが得られる。予想される大きさの断片を示すことによって、例えばサザンブロット分析を用いて、相同組換えの発生が裏付けられる。
【０１００】
標的構築物が調製され、例えば原核生物の配列などあらゆる望ましくない配列が取り除かれると、構築物は標的細胞（例えばＥＳ細胞）に導入され得る（下記参照）。標的細胞にＤＮＡを導入するためのあらゆる便利な技術が用いられ得る。技術は、原形質融合（例えば酵母スフェロプラスト）を含む：細胞融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介ＤＮＡ移入又は直接的なマイクロインジェクション。
【０１０１】
標的細胞の形質転換又は形質移入の後、標的細胞は、前述のように陽性及び／又は陰性マーカー、ネオマイシン耐性及びアシクロビル又はガンシクロビル耐性を用いて選択され得る。望ましい表現型を示す細胞は、それから切断分析、電気泳動、サザン分析、ＰＣＲ等によってさらに解析されてもよい。標的遺伝子座において望ましい改変の存在を示す断片を同定することによって、相同組換えがＣεへのスイッチを増強するようにＩｇＨの変更が起こった細胞を同定することができる。
【０１０２】
胚性幹（ＥＳ）細胞法
Ａ．ＥＳ細胞へのｃＤＮＡの導入
ＥＳ細胞の培養方法及び後の組換え動物の作出方法、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿及び直接注入法のような種々の方法によるＥＳ細胞へのＤＮＡの導入方法はTeratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, ed. E.J. Robertson, (IRL Press 1987)に詳述されており、その教示は本願明細書に援用される。組換えＥＳ細胞の望ましいクローンの選択は、いくつかの手段の一つによって達成される。配列特異的遺伝子組込みが関与する場合、対象の遺伝子と組換えるための核酸配列又はその発現を制御するための配列は、マーカー（例えばネオマイシン耐性）をコード化する遺伝子と共沈澱される。形質移入は、Lovell-Badge, in Teratocarcinomas and embryonic stem cells, a practical approach, ed. E.J. Robertson, (IRL Press 1987)又はPotter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 7161 (1984)に詳述されるいくつかの方法の一つによって実行される。リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿、直接注入及びエレクトロポレーションは、好ましい方法である。これらの手法において、多くのＥＳ細胞（例えば０．５×１０６）組織培養ディッシュに播種され、最終容量１００μｌ中の５０ｍｇのリポフェクチンの存在下で沈澱された直線化された核酸配列及び１ｍｇのｐＳＶ２ｎｅｏＤＮＡの混合物でトランスフェクションさせた（Southern and Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1: 327-341 (1982)）。細胞には、Ｇ４１８などの抗生物質（２００から５００μｇ／ｍｌ）が添加されたＤＭＥＭ中の１０％ウシ胎児血清を含む選択培地が供給される。Ｇ４１８に耐性の細胞のコロニーをクローニングリングを用いて単離し、増殖させる。ＤＮＡは薬剤抵抗性クローンから抽出され、プローブとして核酸配列を用いるサザンブロッティング実験は望ましい核酸配列を有するクローンを同定するために用いられる。いくつかの実験において、ＰＣＲ法は、対象のクローンを同定するために用いられる。
【０１０３】
ＥＳ細胞に導入されるＤＮＡ分子は、相同組換えのプロセスを通して染色体にも組み込まれる（Capecchi, (1989) Science 244:1288-1292に記載される）。直接注入により高効率な組み込みが起こる。所望のクローンは、注入されたＥＳ細胞のプールから調製されたＤＮＡのＰＣＲにより同定される。プール中の陽性細胞は、細胞クローニングの後にＰＣＲによって同定される（Zimmer and Bruss, Nature 338, 150-153 (1989)）。エレクトロポレーションによるＤＮＡの導入は、効率的でなく、選択ステップを必要とする。組換え事象の正の選択（すなわちネオ耐性）及び二重正−負の選択（すなわちネオ耐性及びガンシクロビル耐性）のための方法及び後のＰＣＲによる所望のクローンの同定は、Joyner et al., Nature 338, 153-156 (1989) and Capecchi, (1989)に記載されており、その教示は本願明細書に援用される。
【０１０４】
Ｂ．胚の回収及びＥＳ細胞の注入
雌の動物に、マウスで用いられる標準技術（妊馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ；Sigma）の注射に続いて４８時間後にヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ；Sigma）の注射）を変更して作られた方法論を用いて過排卵を誘導する。雌を、ｈＣＧ注射の直後に雄と共に置く。ｈＣＧのおよそ一日後、交配させた雌は犠牲となり、胚を切り取られた卵管から回収し、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Sigma）を含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水に入れる。周囲の卵丘細胞は、ヒアルロニダーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）で除去する。前核期胚ｗ洗浄し、注入までの時間、加湿された５％ ＣＯ２、９５％空気の３７．５℃インキュベーター中の０．５％ＢＳＡを含むアール均衡塩溶液（ＥＢＳＳ）に入れる。
【０１０５】
雄と交配した、自然に性周期が回っているか過排卵させた雌を、ＥＳ細胞の注入のための胚を採取するために用いる。適切な時期の胚は、受胎交配の後に回収する。交配した雌の子宮角を灌流し、胚をＥＳ細胞と共に注入するための１０％仔ウシ血清を加えたダルベッコの改質基本培地に入れる。約１０−２０のＥＳ細胞を、約２０μｍの内径のガラス顕微針を用いて胚盤胞に注入する。
【０１０６】
Ｃ．偽妊娠雌への胚移植
ランダムに性周期が回っている成熟雌を、精管切除された雄とペアリングさせる。ＥＳ細胞を含む胚盤胞の着床が必要な場合、それらが交配後２．５〜３．５日（マウスに対して、又はより大きな動物に対してはより遅い）になるように、レシピエント雌を交配させる。胚移植時、レシピエント雌を麻酔する。卵巣を卵管上の体壁を切開することによって露出させ、卵巣及び子宮を外在化させる。胚盤胞が移される針で子宮角に穴を空ける。移植後、卵巣及び子宮を体内へ戻し、切開部を縫合することによって閉じる。さらに移植する場合、この手順を反対側においても繰り返す。
【０１０７】
胚の操作及びＤＮＡのマイクロインジェクションのための手法はHogan et al., Manipulating the mouse embryo, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1986)に詳述されており、その教示は本願明細書に援用される。これらの技術は他の動物種の胚に容易に適用でき、成功率は低いが、当業者にとっては通常の業務である。
【０１０８】
Ｄ．組換え動物の同定
試料（１−２ｃｍのマウス尾部）は、幼若動物から切除される。より大きな動物については、血液又は他の組織を用いることができる。相同組換え実験のキメラを試験するため、すなわち動物に対する標的ＥＳ細胞の寄付を探すために、より大きな動物においては血液が検査されるが、マウスにおいては毛色が用いられてきた。ＤＮＡは、組換えファウンダー（Ｆ０）動物及びそれらの後代（Ｆ１及びＦ２）を検出するために、調製され、サザンブロット及びＰＣＲによって解析される。
【０１０９】
一旦組換え動物が同定されると、系統は従前通りの交配によって確立される。
【０１１０】
サザン分析
ＤＮＡは、標準のフェノール抽出手法によって又はセシウム勾配遠心分離によって細胞株から得られた。
【０１１１】
Ａ．フェノール抽出
細胞のフラスコをＨＢＳＳバッファーで洗浄し、２．５ｍｌ／１００ｃｍ２の溶解溶液（１％ドデシル硫酸ナトリウム／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／１０ｍＭＥＤＴＡ／１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）を添加する。全ての細胞が可溶化されたあと、それらを５０ｍｌ円錐チューブに移し、最終濃度０．４ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを添加する。溶解物を、ＤＮＡｓｅ酵素を不活性化するために１０分間６５℃でインキューベートし、次いで３７℃、オーバーナイトでインキューベートした。この溶解物に、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０中で平衡化された新しいフェノールの等量を添加し、チューブを室温（２２−２４℃）で５分間穏やかに反転し、次いで５分間２０００ｇで遠心分離し、表面の（水）層を第二のチューブに移す。５０％フェノール／５０％クロロホルム（ｖ／ｖ）の等量を添加し、反転遠心分離プロセスを繰り返した。上清を第３のチューブへ移し、クロロホルムの等量を添加する。第３の反転（遠心分離サイクル）の後、上清を第４のチューブに移し、１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム、２．５倍量の低温エタノールの添加により沈殿させる。７０％エタノールで生じた沈殿物を洗浄し、ペレットを空気乾燥した後に、ＴＥバッファー（１０ｍＭトリスｐＨ７．４／１ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁し、５０％μｇ／ｍｌの最終濃度のＲＮａｓｅを添加する（ＲＮａｓｅは、新たに懸濁された酵素を３０分間、７０℃で加熱することによってＤＮエースを含まないように調製される）。溶液を、１：１ ＳＳ−フェノール：クロロホルムの等量で抽出する。上記のような遠心分離により相が分離され、上清を等量のクロロホルムで抽出する。上記のような遠心分離に続いて、上清を等量のクロロホルムで抽出する。遠心分離に続いて、上清中のＤＮＡを１２．５ｍｌのエタノールで沈殿させ、７０％エタノールで洗浄及び風乾する。ペレットを、ＴＥバッファーに懸濁し、ＤＮＡ収量を２６０ｎＭのＯ．Ｄ．で測定し、純度は２６０／２８０比率により測定する。ＤＮＡ調製物を、４℃でＴＥ中に保存する。
【０１１２】
Ｂ．培養細胞からのＲＮＡ及びＤＮＡの塩化セシウム調製法
細胞のフラスコをＨＢＳで洗浄し、２．５ｍｌ／１００ｃｍ２のグアニジンイソシアネート（ＧＩＴ）バッファーを添加した。グアニジンイソチオシアネートバッファーは、４ＭＧＩＴ／２５ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６／０．８％ベータ−メルカプトエタノール（ｖ／ｖ）であった。３−５分後、穏やかな揺れで、細胞溶解物を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ １０ｍｌ超遠心器チューブ中の４ｍｌの塩化セシウムバッファー上に層とした。チューブはＧＩＴバッファーで最上部まで満たされ、２００℃、３２，０００ｒｐｍ（１７４，０００×ｇ）でオーバーナイトで回転させた。チューブの上から３分の２のＧＩＴ溶液を取り除いて廃棄し、ＤＮＡを含むチューブの下から３分の１の塩化セシウム溶液を第二のチューブに移した。チューブの底のＲＮＡペレットを、２００μｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ６に再懸濁し、１．５ｍｌマイクロチューブに移した。７５０μｌのエタノールをこのチューブに添加し、チューブを１０分間ドライアイスに入れた。１０分間の微量遠心分離の後、上清を廃棄し、３００μｌの７０％エタノールを添加し、チューブを再び微量遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを真空遠心機において乾燥させた。ペレットを、２００μｌのｄＨ２Ｏ中に再懸濁した。ＲＮＡ調製を、−７０℃のエタノール沈殿物として保存した。ＤＮＡを含む４ｍｌのＣｓＣｌを、ｄＨ２Ｏで希釈した。これに、３０ｍｌの低温エタノールを添加した。ＤＮＡ沈殿物を回収し、新しい５０ｍｌチューブに移し、７０％エタノールですすいで、次いで空気乾燥させた。次いでペレットをプロテインキナーゼバッファー中に再懸濁し、１０ｍｇのプロテイナーゼＫを添加した。６５℃での１５分間のインキュベーションの後、溶液を３７℃、オーバーナイトでインキューベートした。加水分解物を１：１ ＳＳ−フェノール：クロロホルムを用いて抽出し、クロロホルム、エタノール沈殿に続いて、上記のように定量する。
【０１１３】
Ｃ．制限酵素消化、電気泳動及びサザンブロット法
制限エンドヌクレアーゼ消化条件は、供給元の推奨基準に従った。ゲノムＤＮＡに対しての制限酵素消化は、３７℃で４−６時間あった。簡素なＤＮＡ調製（クローニング又はＰＣＲ増幅）では、インキュベーションは３７℃で１−２時間だった。多くの場合、１０μｇのＤＮＡは、１５０μｌ量において消化された。消化物を、３μｌの５ＭＮａＣｌ及び３７５μｌ（２．５倍量）の低温エタノールを添加して沈澱させ、４℃で１０分間微量遠心分離し、５００μｌの低温７０％エタノールで洗浄し、微量遠心分離した。
【０１１４】
ペレットを、真空微量遠心管中で空気乾燥させ、１７μｌの電気泳動ランニングバッファー（通常ＴＡＥバッファー）及び３μｌのローディングバッファー（５０％グリセロール／１％ブロムフェノールブルーを含むＴＡＥバッファー）に再懸濁し、６８℃で１０分間加熱し、別のウェルにサイズマーカーとして働くラムダ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物をロードすると共にアガロースゲルのウェルにロードした。ゲル中のアガロースの濃度は１．０％であった。８−１６時間の電気泳動に続いて、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、マーカーバンドの泳動距離を測定及び記録し、ゲルを撮影した。
【０１１５】
消化されたＤＮＡをＮｙｔｒａｎ膜へ真空転写した。ゲルを吸引装置上のＮｙｔｒａｎ膜上に敷設し、５００ｍｌの０．４ＭＮａＯＨ／０．８ＭＮａＣｌで覆い、５０ｃｍの水圧で４分間真空加圧した。ＮａＣｌ−ＮａＯＨ溶液を除去し、５００ｍｌの１０×ＳＳＣを添加し、５０ｃｍの水圧で３０−６０分間加圧した。サザンブロットを８０℃で２時間乾燥し、野菜凍結バッグ中で保存した。
【０１１６】
Ｄ．サザンハイブリダイゼーション
サザンブロットを、熱封止可能なプラスチック袋に入れ、１ＭＮａＣｌ、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸エステル及び２００μｇ／ｍｌニシン精液ＤＮＡを含む１０ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファーでインキューベートし、６５℃で１５分間インキューベートした。次いでバッグの隅を切り取り、放射性同位元素標識オリゴヌクレオチドプローブを添加した（約１０７ｄｐｍ）。バッグを再封止し、６５℃のオーブン又はウォーターバスに入れ、１２−１６時間穏やかに揺らすか振盪した。次いで膜をバッグから取り除き、特異的に結合したプローブと比較して背景の放射能が低くなるまで、一連の漸増希釈したより高い温度（ストリンジェンシーを増加させる）のＳＳＣバッファーで洗浄した。次いで、暗室において、膜を増強装置スクリーンを備えたＸ線フィルムカセットに置かれたビニール袋に入れ、Ｋｏｄａｋ ＸＡＲ ５フィルムを一枚加え、シグナル強度に合わせた時間封入されたカセットを７０℃に入れた。通常、時間を変化させた後の暴露は有用である。フィルムは、Ｋｏｄａｋ Ｘ−ＯＭＡＴ自動現像液で現像した。膜を数回ハイブリダイズしてもよい。Ｎｙｔｒａｎ膜を、２分間沸騰している０．１×ＳＳＣで加熱させることによって、標識プローブを解離させてもよい。
【０１１７】
Ｂ細胞培養
Ｂ細胞を、ネガティブセレクションによって脾臓から精製してもよい。簡潔には、単個細胞浮遊液中のＴ細胞を、抗体で被覆し、補体溶解によって枯渇させる。残りの脾臓細胞を、非連続的パーコール（GE Healthcare）勾配を通して層状化した。休止Ｂ細胞を６６％〜７０％境界面から選択し、総Ｂ細胞（５０−７０％パーコール境界面）を用いた。Ｂ細胞は、１０％ヒート不活性ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及びストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭＨｅｐｅｓ、１００ｍＭ非必須アミノ酸及び５×１０−５Ｍ２−メルカプトエタノールが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Sigma Aldrich）からなるＢ細胞培地で培養してもよい。
【０１１８】
インビボ高ＩｇＥ産生の確認
組換え動物を、当該分野で公知の技術を用いて、血清ＩｇＥレベルの上昇について試験する。例えば、ＩｍｍｕｎｏＣＡＰ特異的ＩｇＥ血液検査（文献は：ＣＡＰ ＲＡＳＴ、ＣＡＰ ＦＥＩＡ（フッ化酵素免疫検定法）及びファルマシアＣＡＰとしても記載される）を用いてもよい。
【０１１９】
他の方法は、当該技術分野において公知である。そのような方法は、例えば、抗ＩｇＥ抗体を用いた酵素結合免疫吸着検定法及び潜在的にＦＡＣＳを含む。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ、酵素免疫測定法又はＥＩＡとも称される）は、抗体又は試料中の抗原の存在を検出するために免疫学において主に用いられる生化学技術である。蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）は、単一の細胞が混合された大きな群を解析するための強力な技術である。高い割合を占めるＩｇＥ陽性細胞は、高いＩｇＥ血清レベルを示す。
【０１２０】
ハイブリドーマ作出
ＩｇＥを産生するハイブリドーマを調製するために公知の標準的な技術を用い得る。例えばKohler & Milstein (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature 256:495及びKohler & Milstein (1976) Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. Eur. J. Immunol. 6:511参照。
【０１２１】
簡潔には、免疫化された脾細胞を洗浄し、適切な条件下で骨髄腫細胞と融合させる。ハイブリドーマを２４時間後にＨＡＴ又は他の選択薬剤に暴露させ、融合していない骨髄腫細胞を死滅させる。融合していない脾細胞も限られた生存期間を有しており、ハイブリドーマは培養物中に残された唯一の増殖性細胞である。
【０１２２】
クラススイッチングについてのアッセイ
アッセイは、当該技術分野において公知であり、例えば、Shinkura, R. et al. Nat. Immunol. (2003) 4, 435-441 and Zarrin, et al., Nat. Immunol. (2004) 5, 1275-1281に記載されている。簡潔には、脾細胞を、ハイブリドーマを作出するために抗ＣＤ４０及びＩＬ−４によって４日間刺激するか、ＥＬＩＳＡを行うために６日間刺激した。モノクローナル抗−ＩｇＥ抗体を、ＩｇＥ（変異アレル）を検出するために用い得る。総ＩｇＥを、ポリクローナル抗ＩｇＥ抗体（Southern Biotechnology Associates）で測定してもよい。
【０１２３】
例えば、ＩｇＨ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成及びＣＳＲを評価するためのサザンブロット分析を記載するSouthern and Berg (Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J Mol Appl Genet (1982) 1: 327-341)を参照のこと。
【０１２４】
ε生殖系列転写は、Ｂ細胞のＩｇＥの合成への関与の最初の工程を特徴付ける。したがって、ε免疫グロブリン重鎖生殖系列遺伝子転写（ＧＬＴ；εＧＬＴ）、円転写産（ＣＴ；Ｉε−Ｃμ ＣＴ又はＩεＣγＣＴ）及びＩｇＥの重鎖をコード化するｍＲＮＡ（εｍＲＮＡ）及び活性化を誘導されたシチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）を調べるためにＲＴ−ＰＣＲを用いてもよい（Takhar et al., J Allergy Clin Immunol (2007) 119(1): 213-218を参照）。
【０１２５】
後の実験の開示において、以下の略語が適用される：ｅｑ（同等な）；Ｍ（モル）；μＭ（マイクロモル）；Ｎ（正常な）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｋｇ（キログラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｌ（リットル）；ｍｌ（ミリリットル）；μｌ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；℃（摂氏温度）；ｈ（時間）；ｍｉｎ（分）；ｓｅｃ（秒）；ｍｓｅｃ（ミリ秒）；Ｃｉ（キュリー）；ｍＣｉ（ミリキュリー）；μＣｉ（マイクロキュリー）；ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィ）。
【実施例】
【０１２６】
本発明は、以下の実施例において詳述されるが、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定することを意図するものではない。添付された図面は、本明細書の不可欠な部分及び本発明の記載と考えられるべきである。全ての引用文献は、そこに記載される全てが出典明示により本願明細書に援用される。以下の実施例は、例示するために提供されるのであって、特許請求の範囲に記載された発明を限定するものではない。
【０１２７】
実施例１ 変異マウスの遺伝子ターゲティング／ジェネレーション
この実施例は、ターゲッティングベクターの構築、胚性幹細胞（ＥＳ）の形質転換及び変異マウスの産生を例示する。
【０１２８】
Ｉ．一般的な手法
Ａ．胚性幹細胞（ＥＳ）の形質転換
標的化構築物を、ＮＣＢＩにおいてＮＴ＿１６６３１８として利用可能な配列情報に基づいて設計した。（Waterston et al., Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature. (2002) 420(6915): 520-62も参照のこと。）ＢａｍＨＩ／ＰＶｕＩ断片（Ｓｅ領域を含めて７０２２ｂｐ（１２９マウス）；Ｓｅ領域を含めて７３５５ｂｐ（Ｂ６マウス））を、１２９又はＣ５７Ｂ６ ＢＡＣクローンから単離し、増幅した。
【０１２９】
以下の配列（５’→３’；配列番号：３）は、ＢａｍＨＩ／ＰＶｕＩ断片から欠失され、大部分のマウスＳｍ領域を含むＮｅｏカセットとＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩで置換された（図２及び配列番号：６を参照）。
【０１３０】
類似の構築物を、ＩｇＨ遺伝子座に存在するアレルの系統間の相違を説明するために、標的１２９ＳｖＥｖ ＥＳ細胞に製作してもよい。
【０１３１】
Ｂ．胚性幹細胞（ＥＳ）の形質転換
上記のプラスミドをＰｖｕＩ制限酵素を用いて直線化した。ＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、ペレット状にして、５０μｌＴＥ中に再懸濁させた。当該分野で公知の技術を用いて（例えばTempleton et al., Efficient gene targeting in mouse embryonic stem cells, Gene Therapy (1997) 4:700-709を参照）、１０６ＥＳ細胞をエレクトロポレーションにより直線化されたベクターで形質移入し、Ｇ４１８（４００μｇ／ｍｌ）を用いて選択した。その後、ｃｒｅ／ｌｏｘＰ組換システムを用いてＮｅｏ遺伝子を欠失させた。少なくとも３００塩基対の、同定された組換え構築物（図２に示される）の配列番号：９（５’プローブ）及び配列番号：１０（３’プローブ）から設計された二つのプローブを用いたサザン分析によって適切に目標化されたクローンを同定した。
【０１３２】
Ｃ．変異マウスの産生
改変されたＩｇＨ遺伝子座を有するマウスを作出するために生殖系列マウスを産生した。Ｓμ／Ｓεの相同組み換えを示すＥＳ細胞クローンをＣ５７Ｂ６胚盤胞に注入し、生じた雄キメラをＣ５７Ｂ６雌と交配させた。ヘテロ接合及びホモ接合の変異マウスの生殖細胞系伝達を、毛色によって評価した。
【０１３３】
ＩＩ．特定の手法
Ａ． ターゲティングベクター構築
ＥＳ細胞のＣ５７ＢＬ／６ ＩｇＥ遺伝子座を標的とする構築物を、組み換え設計及び標準的な分子クローニング技術を用いて製作した。Liu et al., A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Research (2003) vol. 13 (3) pp. 476-84を参照のこと。
【０１３４】
ＮＣＢＩにおいてＮＴ＿１６６３１８として利用可能な配列情報に基づいて標的化構築物を設計した。（Waterston et al., Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature. (2002) 420(6915): 520-62）も参照のこと。
【０１３５】
最初に、Ｃ５７ＢＬ／６スイッチイプシロン（本明細書においてＳｅ又はＳε又はＳイプシロンと称する）を含むマウスＢＡＣ（ＲＰ２３−１３５Ｌ１２；Invitrogen, Carlsbad, CA）の６９８８塩基対ゲノム断片（配列番号：１９；図１３）領域／配列を単離し、胚性幹（ＥＳ）細胞ターゲッティングにおいて用いるためにｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡと称されるネガティブセレクションマーカー、ジフテリアトキシンＡ（ＤＴＡ）を含むプラスミドに導入し（Warming et al., Mol. Cell. Biol. (2006) 26 (18): 6913-22を参照）、ｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡ−ＩｇＥを得た。
【０１３６】
次に、ｌｏｘＰ−ＰＧＫ−ｅｍ７−Ｎｅｏ−ＢＧＨｐＡ−ｌｏｘＰ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＳａｌＩ−ＡｓｃＩ−ＮｈｅＩカセットを相同組み換えを用いてＩｇＥ断片に挿入し、後のスイッチｍｕ領域（本明細書においてＳＭｕ又はＳμ又はＳｍと称する）の挿入のために内因性のＳε領域をＬｏｘＰが導入されたＮｅｏ及びポリリンカーで置換した（「ｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡ−ＩｇＥ−ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ｌｏｘ−ＭＣＳ」）。
【０１３７】
最後に、Ｃ５７ＢＬ／６ＳＭｕを含む４．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩ断片をＢＡＣ ＲＰ２３−１３５Ｌ１２（Invitrogen）から単離し、三方向ライゲーションを用いてこの断片をｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡ−ＩｇＥ−ｌｏｘ−Ｎｅｏ−ｌｏｘ−ＭＣＳにクローニングした（６．２ｋｂのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片及び４．１ｋｂのＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ断片（両方ともｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡ−ＩｇＥ−Ｎｅｏ−ＭＣＳ）の４．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩ Ｓｍｕ断片へのライゲーション）。生じた構築物は、「ｐＳＷ３１２」と称される（ｐＢｌｉｇｈｔ−ＤＴＡ−ＩｇＥ−ｌｏｘ−ｎｅｏ−ｌｏｘ−Ｓｍｕ）。図２Ｂを参照のこと。
【０１３８】
Ｂ．胚性幹細胞（ＥＳ）の形質転換
Ｃ５７ＢＬ／６ ＥＳ細胞を標準法（Ｇ４１８陽性及びＤＴＡ陰性選択）を用いて標的化し、陽性クローンをＰＣＲ及びｔａｑｍａｎの解析を用いて同定した。適切に標的化されたクローンは、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ゲノムＤＮＡ及び外部３’プローブを用いたサザンブロット解析によって確認された（構築物の３’末端及び内因性ＩｇＥ ＨｉｎｄＩＩＩ部位間の配列）（配列番号：２０）：
【０１３９】
Ｃ．変異マウスの産生
改変されたＩｇＨ遺伝子座を有するマウスを作出するために生殖系列マウスを産生した。Ｓμ／Ｓεの相同組み換えを示すＥＳ細胞クローンをＣ５７Ｂ６胚盤胞に注入し、生じた雄キメラをＣ５７Ｂ６雌と交配させた。ヘテロ接合及びホモ接合の変異マウスの生殖細胞系伝達を、毛色によって評価した。
【０１４０】
実施例２ アイソタイプスイッチを誘導するインビトロでの刺激（抗ＣＤ４０／ＩＬ４；ＬＰＳ）
以下の実施例は、どのようにＢ細胞が集められ、クラススイッチ組換え（ＣＳＲ）について解析されたかを詳述する。
【０１４１】
６−８週齢の野生型又はヘテロ接合型動物の脾臓細胞を、抗ＣＤ４０（１μｇ／ｍＬ；ＨＭ４０−３、Pharmingen）に加えてＩＬ−４（２５ｎｇ／ｍｌ）又はリポポリサッカライド（ＬＰＳ、２０μｇ／ｍＬ）でインビトロにおいて刺激した。１．５×１０６の細胞は、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン−ストレプトマイシン及び１００μＭβ−メルカプトエタノールが添加されたＲＰＭＩ培地の６ウェルプレート（０．５×１０６／ｍＬ）の一つに播種された。刺激後、活性化Ｂ細胞培養を、４−５日目にハイブリドーマを作製するために、又は６日目にＥＬＩＺＡでＩｇレベルを測定するために用いた（標準法を用いて；例えばMonoclonal Antibodies: Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology (2007) vol. 378:1-13参照）。検出抗体としてモノクローナル抗マウス抗体（Pharmingen）に続いてアルカリフォスフォターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ１（Southern Biotechnology）をＩｇレベルを検出するために用いた。
精製されたマウスＩｇ（Pharmingen）を基準として用いた。
【０１４２】
脾細胞上のＰＥ抗マウスＩｇ（Pharmingen）抗体を用いて表面Ｉｇ染色を行った。刺激４日目にＦＡＣＳ解析を行った。試料を、ＦＡＣＳ Ｓｃａｎ（Becton Dickinson）に回収し、Ｆｌｏｊｏ解析ソフトウェアを用いて解析した。
【０１４３】
サザンブロット解析によってＣＳＲを評価した。簡潔には、ＩｇＨ遺伝子座におけるＤＮＡ再構成及びＣＳＲを評価するためにハイブリドーマクローンのゲノムＤＮＡを用いた。ハイブリドーマゲノムＤＮＡ（約１５０ｕｌ）をＥｃｏＲＩ（NEB）制限酵素を用いてオーバーナイトで消化し、試料を０．７％アガロースゲルにアプライすることにより消化物を分離した。分離された試料を、Ｚｅｔａ−プローブブロッティングメンブレン（Bio-Rad）に転写し、ＵＶ架橋により固定及び／又は８０°摂氏真空オーブンにおいて（２０分）乾燥させ、標準のサザンブロッティングプロトコル（Molecular Cloning, 3rd Edition Vol.1, pages 6.33-6.64）に従って３２Ｐ標識Ｉ−ｍｕ、Ｃ−ｍｕ、Ｉ−ｅｐｓｉｌｏｎ又はＣ−ｅｐｓｉｌｏｎプローブを用いて精査した。標識されたＤＮＡを、メンブレンをＸ線フィルム（Kodak）上に置くことによって視覚化した。
【０１４４】
ＩｇＥ陽性ハイブリドーマクローンにおけるＳ−ｍｕ及びＳ−ｅｐｓｉｌｏｎ ＣＳＲの接合を配列決定するために、この領域を増幅及び配列決定するためにネステッドＰＣＲを用いた。最初に、我々は、ＰＣＲでゲノムハイブリドーマＤＮＡのこの領域を増幅するために、Ｉ−ｍｕ Ｆｏｒｗａｒｄ−１：５’−ＣＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＴＡＴＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：１１）及びＣ−ｅｐｓｉｌｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−１：５’−ＣＣＴＧＡＴＡＧＡＧＧＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＣＣ−３’（配列番号：１２）プライマーを用いた。ＰＣＲサイクルは９４℃で２分間であった；（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒及び６８℃で１５０秒）×３５サイクル、６８℃で７分間。このＰＣＲ工程からの産物は、第二のＰＣＲサイクルのテンプレート（２μｌ）として用いられた、以下のプライマを用いた：Ｅ−ｍｕ Ｆｏｒｗａｒｄ−２：５’−ＡＧＡＣＣＴＧＧＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＴＴ−３’（配列番号：１３）及びＣ−ｅｐｓｉｌｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−２：５’−ＴＡＧＧＴＴＡＧＡＣＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＣＡＣＴＧＣＡＴＧＣ−３’（配列番号：１４）。アニーリング温度を５５℃に低下させた以外は、ＰＣＲプログラムは上記と同一であった。ＰＣＲ産物をゲル精製し（Quigen）、以下のプライマーを用いて直接的に配列決定した：Ｆｏｒｗａｒｄ：ＳＭ５’：５’−ＧＴＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧ−３’（配列番号：１５）；９２２５Ｆ：５’−ＴＴＧＡＧＡＧＣＣＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧ−３’（配列番号：１６）；９５１８Ｆ：ＴＧＡＧＣＴＣＡＧＣＴＡＴＧＣＴＡＣＧＣＧＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：１７）；Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’−ＧＣＣＣＧＡＴＴＧＧＣＴＣＴＡＣＣＴＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＧＣ−３’（配列番号：１８）。
【０１４５】
実施例３ 細胞内ＩｇＥ染色及びＦＡＣＳ解析
この実施例は、異なる刺激への暴露後のヘテロ接合マウス及び野生型マウスから得られた組織のＩｇＥの細胞内染色及びＦＡＣＳ 解析を示す。
【０１４６】
０．５×１０６の脾細胞を遠心沈澱させ、ＦＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ウシ胎児血清）中に再懸濁した。抗ＩｇＥ抗体（e-Bioscience, San Diego, CA; Cat. No. 14-5992-85）を、表面ＩｇＥ分子をブロックするために１ｇ／試料で添加した。細胞を４℃で１５分間インキューベートし、次いでＦＡＣＳバッファーで二回洗浄し、１７００のｒｐｍで３分間の遠心分離によってペレット状にした。ペレット状の細胞を１％ウシ胎児血清ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１４７】
細胞をボルテックスし、細胞を固定するためにＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（BD Biosciences, San Jose, CA; Cat. No. 554722）２００μｌ／試料で添加した。４℃で２０分間インキューベートした。
【０１４８】
細胞を１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（BD Biosciences, San Diego, CA; Cat. No. 554723）で２回洗浄し、Ｆｃ−ブロッカーを含む２５０ｌの１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーに再懸濁した。細胞アリコートは、１：２００の最終抗体希釈のＢ２２０−ＦＩＴＣと共にビオチン−アイソタイプコントロール（e-Bioscience, 13-4301-82）又は抗ＩｇＥ−ビオチン（e-Bioscience, 13-5992-82）での染色のために用いられた。４℃で３０分間インキューベートした。
【０１４９】
細胞を１×ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで二回洗浄した。
【０１５０】
１×ＢＤＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ中のストレプトアビジン−ＰＥ（Pharmingen）を１：２００の希釈で添加した。４℃で１０分間インキューベートした。
【０１５１】
ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで二度洗浄し、細胞を２００ｌのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、細胞を解析するためにＢＤ ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ装置及びＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏプログラムを用いたＦＡＣＳ解析を行った。
【０１５２】
結果を図１３に示す。図１３において、ＩｇＥに対して陽性に染色した細胞数がＷＴと比較して増加したことが分かる。ＦＡＣＳ結果は、ＩｇＧ１レベルがＷＴと比較してＨｅｔの約半分に低下する一方、ＩｇＥ発現Ｂ細胞の割合がＷＴ動物と比較してＨｅｔ動物において増加する（約二倍）ことを示す。これは、ＳｍＫＩ（Ｓｅの代わりに）を有することが、この遺伝子座と競合することによってＩｇＧ１にスイッチする機会が減少すると同時に、ＩｇＥへスイッチすることを増加させることを証明する。
【０１５３】
実施例４ ＩｇＥアッセイ／測定
この実施例は、曝露されたか曝露されていない組換え動物又はインビトロの細胞培養においてＩｇＥを測定するために、ＥＬＩＳＡ（ルミネックス又は従来のＥＬＩＳＡ）の使用を示す。インビトロでの細胞培養において、細胞をＬＰＳ又は抗ＣＤ４０／ＩＬ４で刺激してもよい。
【０１５４】
ルミネックスマウス７−ｐｌｅｘ免疫グロブリンアイソタイプアッセイ
このアッセイは、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍの単一のウェルにおいてマウスモノクローナル細胞培養上清又は血清試料（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｓｅｒｕｍ Ｄｉｌｕｅｎｔを用いる）をアイソタイプ同定（重鎖：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ；及び軽鎖：カッパ又はラムダ）するためにマルチプレックスアッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｅａｄｌｙｔｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｃａｔ＃４８−３００）を用いる。
【０１５５】
用いる前に、あらゆる粒子を取り除くために細胞培養上清を１４，０００×ｇで遠心分離する。同様に、粒子及び脂質層を取り除くために、アッセイの前に血清及び血漿試料を遠心沈澱（８０００×ｇ）する。これは、洗浄プレート及び試料針をつまらせることを予防する。
【０１５６】
ビーズベースマルチプレックスアッセイに用いられる材料
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｅａｄｌｙｔｅ Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ Ｃａｔ＃４８−３００（Ｂｅａｄｌｙｔｅサイトカインアッセイバッファー、Ｃａｔ＃４３−００２、Ｂｅａｄｌｙｔｅマウスマルチ−免疫グロブリンビーズ、Ｃａｔ＃４２−０４５、Ｂｅａｄｌｙｔｅマウス免疫グロブリンポジティブコントロール、Ｃａｔ＃４３−００８、Ｂｅａｄｌｙｔｅ抗マウスｋ軽鎖、ＰＥ（１００×）、Ｃａｔ＃４４−０２９、Ｂｅａｄｌｙｔｅ抗マウスラムダ軽鎖、ＰＥ（１００×）、Ｃａｔ＃４４−０２９を含む）。
【０１５７】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｅａｄｌｙｔｅ マウスアイソタイピング血清希釈液（５×）、Ｃａｔ＃４３−０３３（１％ウシ血清アルブミンを含むリン酸緩衝生理食塩水）。
【０１５８】
Ｉｇ標準曲線試薬：ミリポア：凍結乾燥Ｂｅａｄｌｙｔｅマウスマルチ免疫グロブリン標準（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）（ｂａｌｂ／ｃマウスＣａｔ＃４７−３００）。
【０１５９】
フィルタープレート：界面活性剤を含まないミリポアマルチスクリーン−ＨＡ０．４５μｍ。
【０１６０】
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（注：ｄｄＨ２Ｏを提供するあらゆるシステムを作用する。）
【０１６１】
アッセイは、製造業者の説明書に従って行われ得る。
【０１６２】
ビーズベースマルチプレックスアッセイを行うための一般的なプロトコール
適切な希釈液に希釈する前にあらゆる粒子を沈殿させるために試料を（必要に応じて）遠心分離する。適切な希釈液に標準を再懸濁し、二倍階段希釈を用いた８点標準曲線を作成する。ウェルにつき５０−１００μｌアッセイ希釈液でフィルタープレートを濡らす。
【０１６３】
プレート嵌合：それぞれのウェルに標準又は試料を５０μｌ添加する。均質な懸濁液を産生するために、１５−２０秒間結合したビーズを音波破砕する。少なくとも１０秒間ビーズを十分にボルテックスする。ウェルにつき１５００のビーズとなるようビーズを希釈して、それぞれのウェルに希釈されたビーズ懸濁液２５μｌを添加する。暗所において室温で１５分間インキューベートする。（インキュベーション時間は異なり、一般的に１５分から２時間の間である。ビーズ及び試料の一次インキュベーションは、より大きな低感受性で、４℃、オーバーナイトで行うことができる。）。
【０１６４】
洗浄工程：液体を取り除くために、フィルタープレートの底部に真空マニホールドを適用し、拭き取る。アッセイ希釈液の７５μｌを添加することによって洗浄し、吸い取り、拭き取る。洗浄を２度繰り返す。ビーズをアッセイ希釈液７５μｌに再懸濁する。それぞれのウェルに検出抗体溶液２５μｌを添加する。暗所において室温で１５分間インキューベートする。液体を取り除くために、フィルタープレートの底部に真空マニホールドを適用する。アッセイ希釈液の１２５μｌを添加することによって洗浄し、吸い取り、拭き取る。洗浄を２度繰り返す。ビーズをアッセイバッファー１２５μｌに再懸濁する。プレートシェーカー上で１分間インキューベートする。Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）１００計測器の結果を読む。データ評価：４−ＰＬ又は５−ＰＬカーブの試料濃度を推定する。
【０１６５】
刺激後６日目に、ＦＡＣＳ解析のために用いられた同様に刺激された脾細胞（３匹のＨｅｔ及び３匹のＷＴマウス）の上清を、上記の通りにＥＬＩＳＡアッセイに用いた。我々がＦＡＣＳ解析において観察したものに一致して、我々は、ＩＬ４／抗ＣＤ４０で刺激した場合にＷＴと比較してＩｇＥ発現レベルの増加及びＩｇＧ１発現レベルの減少を観察した。これは、ＩｇＧ１へのスイッチと競合するＳｍＫＩ部位においてより頻繁に発生する破壊及びＩｇＥスイッチの増加があることを示唆している。ＬＰＳ刺激は、コントロールとしての役割を果たし、ＷＴ及びＨｅｔが同様のＩｇＭ及びＩｇＧ３レベルを有することを示しており、他のスイッチ領域がクラススイッチングに利用できる場合、遺伝子座は未改変であり、正常に機能することを示唆する。図１４を参照のこと。
【０１６６】
総マウスＩｇＥ結合ＥＬＩＳＡ
このアッセイは、ｎａｉｖｅ及び免疫動物のマウスのＩｇＥ血清レベルを定量するために行われる。
【０１６７】
Ｉ．捕捉抗体での被覆：
精製された抗マウスＩｇＥ捕捉ｍＡｂを（ラット抗ｍｕ ＩｇＥ（クローンＲ３５−９２、BD Pharmingen, San Diego, CA）、４℃保存、Ｃａｔ ＃５５３４１６（０．５ｍｇ／ｍｌ））、コーティングバッファー（０．０５Ｍ炭酸塩／重炭酸塩、ｐＨ９．６）で２μｇ／ｍｌａに希釈する。増強されたタンパク質−結合ＥＬＩＳＡプレート（例えばＮｕｎｃ免疫プレートＣａｔ ＃４６４７１８、３８４−Ｗｅｌｌ）に、ウェルにつき１００μｌを添加する。全てのウェルが捕捉抗体溶液によっておおわれるように、プレートを振盪する。プレートをおおい、４℃、オーバーナイトでインキューベートする。［注：３７℃で１時間行ってもよい。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で、プレート３回洗浄する。それぞれの洗浄について、ウェルを２００μｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）で満たし、吸引又は除去の前に少なくとも１分静置させる。最終工程として、過剰なバッファーを取り除くために、プレートをペーパータオル上で軽くたたく。
【０１６８】
ＩＩ．ブロッキング：
ウェルにつきブロッキングバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ウシ血清アルブミン＋１０ｐｐｍプロクリン、ｐＨ７．４）５０μｌでプレートをブロッキングする。プレートをおおって及び穏やかに撹拌しながらＲＴで１時間インキューベートする。上記のように、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）でプレートを３回洗浄する。
【０１６９】
ＩＩＩ．標準及び試料を適用する：
カラム１を空のウェルとして残す（すなわち抗原を添加しない、ウェルにつきブロッキングバッファー２５μｌのみ）。標準（ウェルにつき２５μｌ）の複製のためにカラム２及び３を用いる：５００ｕｇ／ｍｌストック標準抗体から１０ｎｇ／ｍｌ（１：５０，０００）の開始標準濃度までの標準曲線を作成する。１：２段階希釈物（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１５ｐｐｍプロクリン＋０．２％ＢｇＧ＋０．２５％ＣＨＡＰＳ＋５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を作製する。マウスＩｇＥ標準曲線：１０．０、５．０、２．５０、１．２５、０．６２５、０．３１３、０．１５６、０ｎｇ／ｍｌ。アッセイコントロールは、以下の希釈：８ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌのマウスＩｇＥκアイソタイプコントロール（BD Bioscience、Ｃａｔａｌｏｇ ＃５５７０７９、メインストック：０．５ｍｇ／ｍｌ、４℃で保存）。ブロッキングバッファー中の様々な希釈の試料（ウェルにつき２５μｌ）を添加するために残りのカラムを用いる。血清試料を、アッセイ希釈物（ＰＢＳ＋０．５％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０＋１５ｐｐｍプロクリン）で希釈する（ハミルトン希釈装置を用いて、１：２５最小初期希釈、１：３連続希釈）。プレートを覆い、穏やかに撹拌しながら２時間インキューベートする。［注：ＲＴで少なくとも１時間又は４℃でオーバーナイトで行われる。］上記のように、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）でプレートを６回洗浄し、１時間撹拌しながらインキューベートする。
【０１７０】
ＩＶ．検出抗体とのインキュベーション：
ウェルにつき２５μｌのビオチン化抗マウスＩｇＥを添加する（ラット抗ｍｕ ＩｇＥ−ビオチン、クローンＲ３５−１１８、BD Pharmingen, San Diego, CA、０．５μｇ／ｍｌ、４℃、Ｃａｔ ＃５５３４１９）。プレートを覆い、穏やか撹拌しながら３０分間ＲＴでインキューベートする。上記のように、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）でプレートを６回洗浄する。
【０１７１】
Ｖ．ストレプトアビジン−ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡｖ−ＨＲＰ）を添加する：
ストレプトアビジン−ＨＲＰ（GE Healthcare、前Amersham Biosciences, Piscataway, NJ、１ｍｇ／ｍｌ、４℃保存、Ｃａｔ ＃ＲＰＮ４４０１）を１：２０，０００に、最終濃度５０ｎｇ／ｍｌにブロッキングバッファーで希釈する。ウェルにつき２５μｌを添加し、３０分間撹拌しながらインキューベートする。［注：アビジン−ＨＲＰは、当該技術分野において言及されるように、適切に改変してストレプトアビジン−ＨＲＰの代わりに用いられてもよい。］プレートを覆い、３０分間のＲＴでインキューベートする。このプロトコルにおいて上記のように、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）でプレートを６回洗浄する。
【０１７２】
ＶＩ．基質を添加し、発色させる：
ＴＭＢ Ａの一部をＴＭＢ Ｂの一部に混合する（ＴＭＢペルオキシダーゼ溶液Ａ及びＢ（KPL, Gaithersburg, MD、それぞれＣａｔ＃ ５０−７６−０２及び５０−６５−０２）、４℃保存）。それぞれのウェルに２５μｌのＴＭＢ基質を添加し、振盪する。発色させるために室温で１５分インキューベートし消光させるために１ＭＨ３ＰＯ４を２５μｌ添加する。４５０−６５０ｎｍでプレートを読みとる。
【０１７３】
標準曲線から血清試料ＩｇＥレベルを内挿する。
【０１７４】
実施例５ 抗体アイソタイプを定量するハイブリドーマ
ハイブリドーマを当該分野の公知技術を用いて構築する。実施例４のアッセイを用いて、免疫グロブリンアイソタイプの特性を示す。
【０１７５】
結合親和性、エピトープ特性評価及び関連する経路における作用様式について抗体の特性を決定する。
【０１７６】
実施例６ 免疫化：インビボでスイッチするアイソタイプを誘導するＴＮＰ−ＯＶＡ；ＯＶＡ；フィコール
本明細書に記載されているように、この実施例は組換え動物のインビボにおける免疫化を例示する。
【０１７７】
８週間齢、性別の適合した、約２５−３０ｇの重さのＢａｌｂ／Ｃマウスを、１００μｌ無菌ＰＢＳ中のＴＮＰ−ＯＶＡ５０μｇ／ａｌｕｍ２ｍｇ又はＴＮＰ−フィコール５０μｌの腹腔内投与により免疫化し、２８日目に追加免疫した。６０μｌ試料は、実施例４に記載されるアッセイを用いて抗体アイソタイプ測定のために３、７、１４、２１、２８、３５及び４２日目に尾静脈から採取される。
【０１７８】
ＩＩ．抗原誘導腹膜炎モデルと腹水ヒスタミンの測定。
動物及び感作手法
８週齢、約２５−３０ｇのパスツール研究所（Paris, France）で飼育されたＢａｌｂ／Ｃマウスを、１．６ｍｇの水酸化アルミニウム（Andersson & Brattsand, 1982）に吸着された１００ｇＬｇオバルブミンを含む０．４ｍｌ０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ（生理食塩水）の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって、能動感作した。７日間後、動物にＡｌ（ＯＨ）３の存在下で同用量のオバルブミンを接種し、７日後に用いた。
【０１７９】
抗原誘導腹膜炎
腹膜炎は、無菌生理食塩水に希釈された２．５又は２５ｇｍ／ｍｌのオバルブミンを含む溶液０．４ｍｌを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することによって誘導する（腔につき注射された最終的な用量としてオバルブミン１又は１０μｇ）。コントロール動物には、同量の無菌生理食塩水を接種する。抗原曝露後の様々な時間間隔（３０分−１６４ｈ）で、動物を過量のエーテルによって安楽死させ、腹腔を切開し、３ｍｌのヘパリン生理食塩水（１ｍｌにつき１０Ｕ）で洗浄する。初期容積の約９０％は回収される。まれなケースにおいて、腹腔において出血がみられる場合、動物は用いられる。
【０１８０】
ヒスタミンレベルは、当該分野で公知の方法を用いて測定する。
【０１８１】
実施例７ ＩｇＥを誘導するためのブラジル鉤虫の感染
この実施例は、寄生虫、ブラジル鉤虫の感染へのＩｇＥ反応を例示する。
【０１８２】
ブラジル鉤虫の発生過程はマウスにおいて特性が明らかとされている（Love, Nippostrongylus brasiliensis infections in mice: the immunological basis of worm expulstion, (1975) Parasitiology 70:11）。マウスにおいて感染幼虫（Ｌ３）が皮膚に侵入すると、リンパ及び血管系を経て肺まで運ばれる。気管−食道への移動の後、第四期の幼虫（本来のＬ３用量の約１５−３５％）は、小腸の内腔へと運ばれ、成熟する。感染は、幼虫の播種の後の７日目までに明らかとなる。糞便の卵排出量の急低下が先行して起こり、虫の排除は、明らかとなったすぐ後に起こる（約日９及び実質的に１２日目までに完了する）。
【０１８３】
実験条件化でのブラジル鉤虫の維持、感染方法、虫の移行及び計数のための虫の回収は先に記載される（Love & Ogilvie, Nippostrongylus brasiliensis in young rats. Lymphocytes expel larval infections but not adult worms. (1975) Clin. Exp. Immunol. 21:155）。生きている虫を、虫のマウントから精製する。精製された虫を、計数し、２５００虫／ｍｌでリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁する。Ogilvieによって記載されるように（Reagin-like antibodies in animals immune to helminth parasites Nature (1964) 204:91）、マウスを５００虫／２００μｌで皮下注射により感染させる。感染させられたマウスを通常の食事で飼い、任意で抗生水（５０００ｍｌｄｄＨ２Ｏ中の０．５ｇポリミキシンＢ及び１０ｇ硫酸ネオマイシン）を５日間に提供した。肺炎症について９日目にマウスを確認し、実施例４で提供された方法を用いて９日目及び１５日目に血清ＩｇＥレベルを確認する。
【０１８４】
実施例８ ＩｇＥ（気道、皮膚）を誘導するためのアレルゲンパネルでの感作
この実施例は、様々なアレルゲンへのＩｇＥ反応を例示する。
【０１８５】
アレルゲン（臨床で用いられる）（例えば塵ダニ、コナヒョウダニ、ヤケヒョウヒダニ、ワモンゴキブリ、アルテルナリア属テニウス(Alternaria tenuis)、アスペルギルス、クロカワカビ(Cladosporidium herbarum)、ネコ、イヌ、オオバコ−スイバ類、ブタクサ(Short Ragweed)、ウエストオーク(West Oak)混合、草混合／ギョウギシバ(Bermuda)／セイバンモロコシ(Johnson)、真菌及び他のアレルゲン）のパネルを様々な用量で注射し、血清免疫グロブリンレベルを上記の通りに評価する。
【０１８６】
実施例９ 所望の治療の投与に続く血清ＩｇＥ及びメモリーＩｇＥ陽性Ｂ細胞の評価
この実施例は、様々な治療が様々な条件の下でＩｇＥ反応にどのように影響するかについて例示する。予防的及び治療的介入を、同様の方法で評価する。提案された治療剤への言及は、予防的及び治療的介入を包含することを意図している。
【０１８７】
ｎａｉｖｅ動物の血清ＩｇＥ濃度を測定する。動物をランダムに７つの群の一つに割当てた。第一の群は、治療的介入又は抗原曝露を受けない。第二の群は、ビヒクルのみを受け（すなわち抗原を受けない）、ついで提案された治療剤を受ける。第三の群は、抗原曝露を受け、ついで提案された治療剤を接種される。第四の群は、提案された治療剤を受け、ついでビヒクルのみを受ける。第五の群は、提案された治療剤を受け、ついで抗原曝露を受ける。第六の群は、ビヒクルのみを受ける（すなわち提案された治療剤を受けない）。第七の群は、抗原曝露のみを受ける（すなわち提案された治療剤を受けない）。
【０１８８】
抗原曝露と提案された治療剤の投与（又はその逆）との間隔は、最適投与時間を決定するために変化し得る。
【０１８９】
提案された治療のＩｇＥ血清レベルを調整する能力を評価するために、動物ＩｇＥレベルを長時間測定する。実施例４に記載されるアッセイを用いた抗体アイソタイプ測定のために３、７、１４、２１、２８、３５及び４２日目（抗原曝露後）に尾静脈から試料を６０μｌ採取する。
【０１９０】
本願明細書に記載されている実施例及び実施態様は、例証することのみを目的とし、その様々な改変又は変更は当業者に示唆され、本出願及び添付の請求の範囲の趣旨に含まれるべきであることはよく理解される。本願明細書に引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のためのその全てが本願明細書に出典明示により援用されるものとする。
【０１９１】
産業上の利用可能性
本願明細書に提供される胚性幹細胞は、非特異的アレルゲンへのインビボモデルＩｇＥ反応の産生を可能にする。
【０１９２】
本願明細書に記載されるインビボ動物モデルは、非特異的アレルゲンへのＩｇＥ反応の完全なレパートリーを提供する。
表１：配列の概要
【０１９３】
引用リスト
特許文献
Karasuyama et al., US 6118044 - September 12, 2000 - Transgenic non-human animal allergy models
【０１９４】
非特許文献
Gerstein et al., Isotype switching of an immunoglobulin heavy chain transgene occurs by DNA recombination between different chromosomes, Cell (1990) 63:537-548[195] Liu et al., A highly efficient recombineering-based method for generating conditional knockout mutations. Genome Research (2003) vol. 13 (3) pp. 476-84
【０１９５】
Pan et al., Characterization of Human γ4 Switch Region Polymorphisms Suggests a Meiotic Recombinational Hot Spot Within the Ig Locus: Influence of S Region Length on IgG4 Production, J. Immunol. (1998) 161:3520-3526
【０１９６】
Schmidtz, J and Radbruch, A, Immunoglobulin Class Switching in Encyclopedia of Immunology, Delves and Roitt (eds.), pages 1302-1306
【０１９７】
Szurek et al., Complete nucleotide sequence of the murine gamma-3 switch region and analysis of switch recombination in two gamma-3 expressing hybridomas, J. Immunol. 135:620-626 (1985)
【０１９８】
Warming et al., Mol. Cell. Biol. (2006) 26 (18): 6913-22) for subsequent use in embryonic stem (ES) cell targeting, resulting in "pBlight-DTA-IgE"
【０１９９】
Waterston et al., Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome, Nature. (2002) 420(6915): 520-62
【０２００】
Zarrin et al., Influence of switch region length on immunoglobulin class switch recombination, Proc Natl Acad Sci (2005) 102(7): 2466-2470
【０２０１】
Zarrin et al., Antibody Class Switching Mediated by Yeast Endonuclease-Generated DNA Breaks, Science (2007) 315:377-381
【０２０２】
Zarrin et al., Sgamma3 switch sequences function in place of endogenous Sgamma1 to mediate antibody class switching, (2008) J. Exp. Med. 205, 1567
【図１Ａ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）のヌクレオチド２５４７０６２８から２５４６８１６１（配列番号：５）に対応する少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２００ヌクレオチド及び少なくとも２４００ヌクレオチドからなる群から選択される、変更されるスイッチ領域の５’末端（５’アーム／アクセプター）に相同なＤＮＡ断片；
ｂ）選択可能な遺伝子マーカー；
ｃ）ドナースイッチ領域をコード化する、所望の／ドナーのＤＮＡ配列；及び
ｄ）ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ １系統）のヌクレオチド２５４７０６２８から２５４６８１６（配列番号：８）に対応する少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２００ヌクレオチド及び少なくとも２４００ヌクレオチドからなる群から選択される、変更されるスイッチ領域の３’末端（３’アーム／アクセプター）に相同な第二のＤＮＡ断片、
を含むターゲティングベクター。
【請求項２】
５’アームが配列番号：４又は５を含む、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項３】
５’アームが、内因性Ｉεの３’及び内因性Ｓεの５’の領域に相同である、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項４】
３’アームが配列番号：７又は８を含む、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項５】
選択可能なマーカーが、ネオマイシン及びチミジンキナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項６】
選択可能なマーカーがネオマイシンである、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項７】
選択可能なマーカーがｌｏｘｐ部位に隣接している、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項８】
所望のスイッチ領域がマウスからのものである、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項９】
所望のスイッチ領域が、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択される、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項１０】
所望のスイッチ領域が、マウスＳｍ領域の大部分を含むＨｉｎｄＩＩＩ／Ｎｈｅｌ断片である、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項１１】
所望のスイッチ領域がＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）のヌクレオチド２５６１７１７２から２５６１５７６１に対応するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項１２】
インビトロで改変された胚性幹細胞を製造するための方法であって、
ａ）以下のｉ及びｉｉから選択される、ＣＳＲがＣεを発現する確率を増強するために、前記細胞においてゲノムＤＮＡを改変する工程
ｉ．内因性のＳε領域に直列に少なくとも１つの付加的なＳεコピーを付加することによるＳε長の増加；
ｉｉ．Ｓε領域の置換；及び
ｂ）正しく改変されたゲノムＤＮＡの細胞を選択する工程、
を含む方法。
【請求項１３】
改変が、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択されるスイッチ領域のＳε領域への置換である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
改変がＳμ領域のＳε領域での置換である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
改変された胚性幹細胞をインビトロで製造する方法であって、
ａ．ＳμをＳε領域と交換するために請求項１に記載のベクターを用いる工程
ｂ．正しく改変されたゲノムＤＮＡの細胞を選択する工程
を含む方法。
【請求項１６】
改変が、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択されるスイッチ領域のＳε領域への置換である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
改変がＳμ領域のＳε領域での置換である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＳＣがＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６から選択されるマウス系統のものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ａ．ＩｇＨ遺伝子座の少なくとも１つのアレルがＩｇＥの発現／産生／分泌が非改変アレルと比較して増強されるように改変されている；及び
ｂ．以下からなる群から選択されるＩｇＥプロファイルを有する、非ヒト動物、
ｉ．全ての血清抗体のＩｇＥ画分が０．０４％以上である；
ｉｉ．ＩｇＥ血清中濃度が４，０００ｎｇ／ｍｌ以上である；
ｉｉｉ．ＩｇＧ／ＩｇＥの比率が１０未満である。
【請求項２０】
４０００ｎｇ／ｍｌ以上のレベルでＩｇＥ分子を発現するように改変されたゲノムを有する、非ヒト哺乳動物。
【請求項２１】
０．１から１０のＩｇＧ／ＩｇＥ比を有する非ヒト哺乳動物。
【請求項２２】
１００ｎｇ／ｍｌから１００００ｎｇ／ｍｌの非曝露（休止）ＩｇＥ血清濃度を有する非ヒト哺乳動物。
【請求項２３】
１０００ｎｇ／ｍｌから１００００００ｎｇ／ｍｌの曝露（活性化）ＩｇＥ血清濃度を有する非ヒト哺乳動物。
【請求項２４】
動物モデルが非ヒト脊椎動物である、請求項１９に記載の動物モデル。
【請求項２５】
動物モデルがマウス、ラット、モルモット、ウサギ又は霊長類である、請求項１９に記載の動物モデル。
【請求項２６】
非ヒト動物のゲノムがより多くのＩｇＥを発現／産生するように改変されたＩｇＨ遺伝子座のＳε領域を有している、請求項１９に記載の非ヒト動物／哺乳動物モデル。
【請求項２７】
改変が遺伝子ターゲティングによるものである、請求項１９に記載の非ヒト動物／哺乳動物モデル。
【請求項２８】
請求項１９に記載の動物モデルを用いたアレルギー治療を試験する方法であって、前記アレルギー性疾患の治療方法の投与の前、投与と同時又は投与後に、前記動物をアレルゲンに曝露すること、及びＩｇＥ反応を評価することを含む、方法。
【請求項２９】
ＩｇＥ反応がアレルギー治療なしの場合よりも小さい、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
試験動物及びコントロール動物が同腹仔である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法によりアレルギーの治療のための医薬として同定された化合物の使用。
【請求項３２】
請求項１９に記載の動物モデルから得られる細胞株。
【請求項３３】
請求項１９に記載の動物モデルから単離される細胞。
【請求項３４】
非ヒト動物モデルの作出方法であって、
ａ．断片がＣε−コード化領域の上流においてゲノムＤＮＡに組み込まれ、Ｃε−コード化領域に作動可能に連結されるように、マウスの受精卵に配列番号：６（Ｓμ）をコード化するプラスミドの直線化断片を顕微注入すること、
ｂ．前もって偽妊娠を誘導するように処理された雌マウスの卵管に前記受精卵を移植すること、及び
ｃ．雌マウスの子宮において前記卵子を発生させること、
を含む、方法。
【請求項３５】
生殖系列に改変されたゲノムを含む組換えマウスであって、前記改変がＩｇＥ産生率を増強するように変更されたＩｇＨ遺伝子座の少なくとも１つのアレルを含む、組換えマウス。
【請求項３６】
変更がＳμ又はその機能的部分でのＳεの置換を含む、請求項３５に記載の組換えマウス。
【請求項３７】
Ｓμ機能的部位が少なくとも１ｋｂから１０ｋｂ長である、請求項３５に記載の組換えマウス。
【請求項１】
ａ）ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）のヌクレオチド２５４７０６２８から２５４６８１６１（配列番号：５）に対応する少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２００ヌクレオチド及び少なくとも２４００ヌクレオチドからなる群から選択される、変更されるスイッチ領域の５’末端（５’アーム／アクセプター）に相同なＤＮＡ断片；
ｂ）選択可能な遺伝子マーカー；
ｃ）ドナースイッチ領域をコード化する、所望の／ドナーのＤＮＡ配列；及び
ｄ）ＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ １系統）のヌクレオチド２５４７０６２８から２５４６８１６（配列番号：８）に対応する少なくとも１５００ヌクレオチド、少なくとも１８００ヌクレオチド、少なくとも２０００ヌクレオチド、少なくとも２２００ヌクレオチド及び少なくとも２４００ヌクレオチドからなる群から選択される、変更されるスイッチ領域の３’末端（３’アーム／アクセプター）に相同な第二のＤＮＡ断片、
を含むターゲティングベクター。
【請求項２】
５’アームが配列番号：４又は５を含む、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項３】
５’アームが、内因性Ｉεの３’及び内因性Ｓεの５’の領域に相同である、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項４】
３’アームが配列番号：７又は８を含む、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項５】
選択可能なマーカーが、ネオマイシン及びチミジンキナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項６】
選択可能なマーカーがネオマイシンである、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項７】
選択可能なマーカーがｌｏｘｐ部位に隣接している、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項８】
所望のスイッチ領域がマウスからのものである、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項９】
所望のスイッチ領域が、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択される、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項１０】
所望のスイッチ領域が、マウスＳｍ領域の大部分を含むＨｉｎｄＩＩＩ／Ｎｈｅｌ断片である、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項１１】
所望のスイッチ領域がＮＣＢＩ受託番号ＮＴ＿１６６３１８（マウス第１２染色体ゲノムコンティグ、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統）のヌクレオチド２５６１７１７２から２５６１５７６１に対応するヌクレオチドを含む、請求項１に記載のターゲティングベクター。
【請求項１２】
インビトロで改変された胚性幹細胞を製造するための方法であって、
ａ）以下のｉ及びｉｉから選択される、ＣＳＲがＣεを発現する確率を増強するために、前記細胞においてゲノムＤＮＡを改変する工程
ｉ．内因性のＳε領域に直列に少なくとも１つの付加的なＳεコピーを付加することによるＳε長の増加；
ｉｉ．Ｓε領域の置換；及び
ｂ）正しく改変されたゲノムＤＮＡの細胞を選択する工程、
を含む方法。
【請求項１３】
改変が、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択されるスイッチ領域のＳε領域への置換である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
改変がＳμ領域のＳε領域での置換である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
改変された胚性幹細胞をインビトロで製造する方法であって、
ａ．ＳμをＳε領域と交換するために請求項１に記載のベクターを用いる工程
ｂ．正しく改変されたゲノムＤＮＡの細胞を選択する工程
を含む方法。
【請求項１６】
改変が、Ｓμ、Ｓγ１、Ｓγ２ａ、Ｓγ２ｂ及びＳγ３から選択されるスイッチ領域のＳε領域への置換である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
改変がＳμ領域のＳε領域での置換である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＳＣがＢＡＬＢ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６から選択されるマウス系統のものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ａ．ＩｇＨ遺伝子座の少なくとも１つのアレルがＩｇＥの発現／産生／分泌が非改変アレルと比較して増強されるように改変されている；及び
ｂ．以下からなる群から選択されるＩｇＥプロファイルを有する、非ヒト動物、
ｉ．全ての血清抗体のＩｇＥ画分が０．０４％以上である；
ｉｉ．ＩｇＥ血清中濃度が４，０００ｎｇ／ｍｌ以上である；
ｉｉｉ．ＩｇＧ／ＩｇＥの比率が１０未満である。
【請求項２０】
４０００ｎｇ／ｍｌ以上のレベルでＩｇＥ分子を発現するように改変されたゲノムを有する、非ヒト哺乳動物。
【請求項２１】
０．１から１０のＩｇＧ／ＩｇＥ比を有する非ヒト哺乳動物。
【請求項２２】
１００ｎｇ／ｍｌから１００００ｎｇ／ｍｌの非曝露（休止）ＩｇＥ血清濃度を有する非ヒト哺乳動物。
【請求項２３】
１０００ｎｇ／ｍｌから１００００００ｎｇ／ｍｌの曝露（活性化）ＩｇＥ血清濃度を有する非ヒト哺乳動物。
【請求項２４】
動物モデルが非ヒト脊椎動物である、請求項１９に記載の動物モデル。
【請求項２５】
動物モデルがマウス、ラット、モルモット、ウサギ又は霊長類である、請求項１９に記載の動物モデル。
【請求項２６】
非ヒト動物のゲノムがより多くのＩｇＥを発現／産生するように改変されたＩｇＨ遺伝子座のＳε領域を有している、請求項１９に記載の非ヒト動物／哺乳動物モデル。
【請求項２７】
改変が遺伝子ターゲティングによるものである、請求項１９に記載の非ヒト動物／哺乳動物モデル。
【請求項２８】
請求項１９に記載の動物モデルを用いたアレルギー治療を試験する方法であって、前記アレルギー性疾患の治療方法の投与の前、投与と同時又は投与後に、前記動物をアレルゲンに曝露すること、及びＩｇＥ反応を評価することを含む、方法。
【請求項２９】
ＩｇＥ反応がアレルギー治療なしの場合よりも小さい、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
試験動物及びコントロール動物が同腹仔である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法によりアレルギーの治療のための医薬として同定された化合物の使用。
【請求項３２】
請求項１９に記載の動物モデルから得られる細胞株。
【請求項３３】
請求項１９に記載の動物モデルから単離される細胞。
【請求項３４】
非ヒト動物モデルの作出方法であって、
ａ．断片がＣε−コード化領域の上流においてゲノムＤＮＡに組み込まれ、Ｃε−コード化領域に作動可能に連結されるように、マウスの受精卵に配列番号：６（Ｓμ）をコード化するプラスミドの直線化断片を顕微注入すること、
ｂ．前もって偽妊娠を誘導するように処理された雌マウスの卵管に前記受精卵を移植すること、及び
ｃ．雌マウスの子宮において前記卵子を発生させること、
を含む、方法。
【請求項３５】
生殖系列に改変されたゲノムを含む組換えマウスであって、前記改変がＩｇＥ産生率を増強するように変更されたＩｇＨ遺伝子座の少なくとも１つのアレルを含む、組換えマウス。
【請求項３６】
変更がＳμ又はその機能的部分でのＳεの置換を含む、請求項３５に記載の組換えマウス。
【請求項３７】
Ｓμ機能的部位が少なくとも１ｋｂから１０ｋｂ長である、請求項３５に記載の組換えマウス。
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ−１】
【図１０Ａ−２】
【図１０Ｂ−１】
【図１０Ｂ−２】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図１３】
【図１４】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図１０Ａ−１】
【図１０Ａ−２】
【図１０Ｂ−１】
【図１０Ｂ−２】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１２−３】
【図１３】
【図１４】
【公表番号】特表２０１２−５１９００１（Ｐ２０１２−５１９００１Ａ）
【公表日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５５２１７３（Ｐ２０１１−５５２１７３）
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２５５０７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９９３８４
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年８月２３日（２０１２．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年２月２６日（２０１０．２．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２５５０７
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０９９３８４
【国際公開日】平成２２年９月２日（２０１０．９．２）
【出願人】（５０９０１２６２５）ジェネンテック， インコーポレイテッド (357)
【Ｆターム（参考）】
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