Ｃａｎｄｉｄａｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼ
Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ由来の新規のシトシンデアミナーゼ遺伝子およびタンパク質が、提供される。このタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ酵素と比較した場合、５−フルオロシトシンプロドラッグをその毒性形態に転換する増大した能力を有する。１つの実施形態では、この核酸は、ｃＤＮＡであってもよい。１つの実施形態では、この核酸は、ヒト細胞における発現に最適化されていてもよく、別の実施形態では、細菌細胞における発現に最適化されていてもよい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ由来のシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）のタンパク質およびｃＤＮＡ、これらの改変体ならびにそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は、シトシンをウラシルに変換する酵素である。本酵素の細菌版および真菌版はまた、５−フルオロシトシン（５ＦＣ）を５−フルオロウラシル（５ＦＵ）に変換し得る。しかし、そのヒト酵素およびマウス酵素は、５ＦＣを基質として認識しない。細菌ＣＤおよび真菌ＣＤは、５ＦＣを５ＦＵに変換し、次いで５ＦＵは、すべての種において５−フルオロ−デオキシウリジン一リン酸（５ＦｄＵＭＰ）に変換される。５ＦｄＵＭＰは、チミジル酸シンターゼの不可逆性のインヒビターであり、５ＦｄＵＭＰの蓄積は、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）欠乏によるＤＮＡ合成を阻害することで、細胞死を引き起こす。
【０００３】
ヒトＣＤ遺伝子は５ＦＣを５ＦＵに変換しないので、プロドラッグ５ＦＣは、細菌ＣＤ遺伝子または真菌ＣＤ遺伝子を発現するように操作されたヒト細胞においてのみ毒性である。このことは、腫瘍を処置する際に有利に用いられ、「自殺遺伝子」システムの１つの例である。腫瘍は、細菌ＣＤ遺伝子または真菌ＣＤ遺伝子で形質転換され、それは通常は、ＣＤ遺伝子を含んだベクターの直接注入、移植または全身投与による。次いで、患者は、５ＦＣで処置され、５ＦＵの毒性効果は、分裂を続ける形質転換細胞の死滅を引き起こす。
【０００４】
この自殺遺伝子システムは、悪性腫瘍を処置するためのアプローチとして広く研究されている。このシステムの利点の１つは、自殺遺伝子をすべての腫瘍細胞が取り込むことは効果的な治療のために必要ではないことであり、動物において、２０％未満の細胞が自殺遺伝子を発現した場合でも、完全な腫瘍応答が報告されている。この現象は、「バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）効果」として公知であり、特定の細胞が死滅し、その薬剤ロード（ｌｏａｄ）が放出された場合の近隣の細胞に対する薬剤の持続的毒性に基づく（６）。
【０００５】
この自殺遺伝子システムは、正確な標的化を必要とする。なぜなら、プロドラッグへの曝露を受けた正常細胞における遺伝子発現が、その細胞が分裂を試みたときに細胞を殺傷するためである。この問題は、自殺遺伝子が標的とされた細胞の選択された集団においてのみ発現するように、自殺遺伝子を組織特異的（または優先的に腫瘍特異的）プロモーターの制御下に配置することにより取り組まれている。α−フェトプロテインプロモーターは、肝ガン細胞において優先的に活性化され、このようなアプローチの１つの例である（８）。多くのプロモーター配列は完全に腫瘍特異的というわけではないので、この自殺遺伝子は、若干量の健康な組織においてもまた発現され得る。しかし、これは効力に対して致命的ではない。なぜなら、大部分の化学療法と同様に、この処置の前提が、活発に分裂する細胞が薬剤により優先的に標的化されるということだからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
自殺遺伝子は、腫瘍の特異的標的化についての有望なアプローチであるけれども、このシステムの大部分の局面において改善の余地がある。特に、活性が上昇した酵素は、より低用量の５ＦＣの利用を可能にし、報告された高い５ＦＣ用量の免疫抑制効果を回避する。本発明は、そのような改善の１つを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
用語「融合体」は、化学的に連結しているポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）、融合体タンパク質全体に公知の性質を与えるために利用され得る公知の性質を備えた別のペプチド（またはこれをコードする核酸）を言及するために用いられる。融合体の使用は、タンパク質精製を容易にするため、目的のタンパク質を可視化するために当該分野で一般的である。タンパク質融合体の例は、ベクターからのタンパク質の発現物であり、ここで、このタンパク質はインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）（自己切断タンパク質）に作動可能に連結しており、インテリンは結合ドメインに作動可能に連結している。結合ドメインの基質を固体表面に対して固定することによって、目的のタンパク質は、この表面に結合し得、リンスされ得、そしてインテイン切断を誘導する条件下で放出され得る。融合体の他の例としては、抗原性タグ（例えば、ＨＩＳまたはＦＬＡＧ）の使用が挙げられ、このタグはタグ化されたタンパク質を単離するかまたは可視化するために用いられ得る。
【０００８】
本明細書で用いられる場合、用語「ヒト化」は、もとのアミノ酸配列を依然として保持しながらも、コドンがヒト遺伝子においてよりしばしば利用されるコドンに変換されているタンパク質コード配列をいう。同様に、「Ｅ．ｃｏｌｉバイアス（ｂｉａｓ）」は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化されている遺伝子をいう。
【０００９】
本明細書で用いられる場合、用語「単離された」は、天然の環境から取り出された、核酸またはポリペプチドをいう。単離されたタンパク質の１つの例は、ポリクローナル抗体により結合され、細胞の残骸を除くためにリンスされ、さらなる処理なしに利用される、タンパク質である。脱塩（ｓａｌｔ−ｃｕｔ）タンパク質調製物、サイズ分画調製物、親和性吸着（ａｂｓｏｒｂｅｄ）調製物、組み換え遺伝子、組み換えタンパク質、組み換え核酸を発現した宿主細胞由来の細胞抽出物、組み換えタンパク質が分泌された培地などがまた、挙げられる。例えば、別のタンパク質を介して固体支持体に結合したタンパク質は、高くとも純度５０％であるので、用語「単離された」が用いられるが、単離されたタンパク質は、当該分野で一般的かつ信頼性高く用いられる。
【００１０】
本明細書で用いられる場合、「精製された」は、天然の環境から分離され、その結果所定のサンプルにおいて核酸またはポリペプチドの全量の少なくとも９５％である、核酸またはポリペプチドをいう。タンパク質の純度は、本明細書ではＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により評価される。核酸の純度は、アガロースゲルおよびＥｔＢｒ染色により評価される。
【００１１】
本明細書で用いられる場合、用語「実質的に精製された」は、天然の環境から取り出され、かつ少なくとも７５％の純度である核酸配列またはタンパク質配列をいう。好ましくは、少なくとも８０、８５または９０％の純度が実現される。
【００１２】
本明細書で用いられる場合、語句「核酸」または「核酸配列」は、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであり得、一本鎖または二本鎖であり得る、ポリヌクレオチドをいう。この用語はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または任意の化学的なＤＮＡ様物質もしくはＲＮＡ様物質を包含する。「ｃＤＮＡ」は、細胞において天然に存在するｍＲＮＡから作製されたコピーＤＮＡをいう。「ｇＤＮＡ」は、ゲノムのＤＮＡをいう。これらの組み合わせもまた、可能である（すなわち、部分ｇＤＮＡおよび部分ｃＤＮＡである組み換え核酸）。
【００１３】
「フラグメント」は、抗原性、構造ドメイン、または全長タンパク質の酵素活性を保持しているポリペプチド（または、そのようなポリペプチドをコードする核酸配列）をいう。ＣＤタンパク質の「酵素的活性」は、本明細書中では、５ＦＣの５ＦＵへの変換として定義される。保存されたシトシンデアミナーゼドメイン（残基３〜１０４）を含む「構造的領域」は、図５において示される。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約１５ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドおよびその間のすべての整数のヌクレオチドの核酸配列をいう。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約１８〜３０ヌクレオチドであり、最も好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドである。概して、オリゴヌクレオチドは、特異性のために２２〜２５ヌクレオチド長よりも長くなければならないが、特定の用途においてはより短いオリゴヌクレオチドで足りることもある。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、用語「作動可能に会合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」または「作動可能に連結している（ｌｉｎｋｅｄ）」は、機能的に結合した核酸配列をいう。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、ＣＤポリペプチドの「改変体」は、１つ以上のアミノ酸残基により変更されたアミノ酸配列をいう。そのような改変体は、天然に存在し得るか、または合成によって調製され得る。一般的な改変体としては、「保存的な」変化、短縮化、およびドメイン除去または同様のタンパク質での交換が挙げられる。どのアミノ酸残基が、生物学的活性または免疫学的活性を無効にすることなしに、置換され得、挿入され得、または欠失され得るかを決定することにおける指針は、当該分野に周知であるコンピュータープログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥＴＭソフトウェア）および多くの公知のＣＤ遺伝子に対しての比較を用いて見出され得る。
【００１７】
用語「天然に存在する改変体」は、該当の集団において天然に見出される、タンパク質または核酸対立遺伝子を含む。天然に存在する対立遺伝子改変体は、点変異（ｐｏｉｎｔ）型、スプライシング型、または他の型の天然に存在する改変体であり得る。
【００１８】
「高ストリンジェンシー（ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」は、６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳという洗浄条件をいう。「中程度のストリンジェンシー（ｍｅｄｉｕｍ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」は、５５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳという洗浄条件をいう。
【００１９】
「同一性％」の計算において、問合せ（ｑｕｅｒｙ）配列のうちの整列されていない末端部分は、計算中には含まれない。同一性は、参照配列の全長にわたって計算され、従って、問合せ配列との短い局所の整列は、関連がない（例えば、同一性％＝問合せ配列中の整列されていない残基の数／参照配列の長さ）。整列は、Ｔａｔｕｓｏｖａ ＴＡおよびＭａｄｄｅｎ ＴＬ（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０によって記載される通りのＢＬＡＳＴ相同性整列を用いて行われる。フィルターが外されたことを除いて、デフォルトパラメーターが用いられた。２００１年１月１日現在、デフォルトパラメーターは以下のとおりであった：必要に応じてＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰ；マトリックス＝ＢＬＡＳＴＮについてなし、ＢＬＡＳＴＰについてＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップデフォルトを空けるためのＧ Ｃｏｓｔ＝ヌクレオチドについて５、タンパク質について１１；ギャップ［整数］デフォルトを広げるためのＥ Ｃｏｓｔ＝ヌクレオチドについて２、タンパク質について１；ヌクレオチドミスマッチ[整数]デフォルトについてのｑ Ｐｅｎａｌｔｙ＝−３；ヌクレオチド一致[整数]デフォルトについてのｒ（報酬）＝１；ｅ予想値［リアル］デフォルト＝１０；Ｗ（ワードサイズ）［整数］デフォルト＝ヌクレオチドについて１１、タンパク質について３；ビットにおけるｂｌａｓｔ拡張についてｙ Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）（０の場合のデフォルト）デフォルト＝ｂｌａｓｔｎについて２０，他のプログラムについて７；（ビットにおける）ギャップを空けた（ｇａｐｐｅｄ）整列についてＸドロップオフ値、ｂｌａｓｔｎについて３０、他のプログラムについて１５；（ビットにおける）ギャップを空けた整列についてＺ最終Ｘドロップオフ値、ｂｌａｓｔｎについて５０、他のプログラムについて２５。本プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてオンラインで利用可能である。
【００２０】
Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ（別名Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＣＤは、いくつかの先行技術のシトシンデアミナーゼタンパク質を超える改善物である。Ｃ．ｋｅｆｙｒ ＣＤは、（これまで）Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＤと比較して顕著に低い発現レベルを示すが、その活性は、５ＦＣを５ＦＵへと変換する際にずっと高い。さらに、５ＦＣは、天然の基質であるシトシンよりもＣ．ｋｅｆｙｒ ＣＤについてのよりよい基質である。表１は、本明細書中に教示される配列のリストを提供する。
【００２１】
【表１−１】
【００２２】
【表１−２】
他のタンパク質改変体は、配列番号２を参照して表２に記載される。
【００２３】
【表２】
本発明は、概して、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列のＣ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのタンパク質および遺伝子またはｃＤＮＡの配列に関する。そのタンパク質をコードするｃＤＮＡの改変体が提供され、その改変体としては、Ｅ．ｃｏｌｉバイアスＣＤ ｃＤＮＡ（配列番号７）、ヒト化ＣＤ ｃＤＮＡ（配列番号８）およびヒト化されておりかつＣｐＧを含まないＣＤ ｃＤＮＡ（配列番号９）が挙げられる。融合体もまた、提供され、融合体は、特に、ＣＤ−ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合体（配列番号１０）およびＣＤ−ＦＬＡＧ融合体（表２を参照のこと）である。
【００２４】
その核酸配列は、伝統的な自殺遺伝子治療の方法論において用いられ得る。自殺遺伝子治療は、第Ｉ相臨床試験、第ＩＩ相臨床試験および第ＩＩＩ相臨床試験であり、よく確立された処置補足物または処置代替物である。Ｃ．ｋｅｆｙｒ遺伝子は、現在の自殺遺伝子配列を超える利点を提供する。なぜなら、このタンパク質の５ＦＣを５ＦＵに変換する能力が改善されるために、より少ない量の５ＦＣが治療のために必要とされるからである。この遺伝子はまた、生化学的特徴付け、抗体の調製などのために大量のタンパク質を調製する際用途を有する。
【００２５】
多くの改変体タンパク質配列が提供され、この配列は、先行技術の配列との公知の相同性およびタンパク質の予想される特性の両方に基づいており、表１〜３ならびに図５および図６において示される。提供された変異体の範囲すべては、開示される通り、野生型配列と９４％以内のアミノ酸同一性である。最も近い先行技術の配列は、Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのタンパク質と７４％のアミノ酸同一性しか有していない。
【００２６】
Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼの抗原性フラグメントもまた提供され、そのフラグメントは、本発明の抗体をうまく作製するために、既に用いられている。抗原性フラグメントは、表５に示されるように、独自であるかまたは保存されるために選択され得る。同様に、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列のフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブとして、またはいろいろな方法におけるプライマーとして用いられ得る。より大きなフラグメントもまた、プローブとして用いられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の実施形態の説明）
本発明は、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼ（ＣＫ−ＣＤ）のタンパク質およびｃＤＮＡの配列に関する。ｉ）ＣＤをコードするＥ．ｃｏｌｉバイアスＤＮＡ配列およびヒト化ＤＮＡ配列、ｉｉ）抗原性ポリペプチドフラグメントおよびこれらに対する抗体、ｉｉｉ）このファミリーにおける多くのタンパク質との比較に基づいて、機能活性を保持することが予想される改変体および不活性な変異体、ｉｖ）天然に存在する改変体、ｖ）融合タンパク質（例えば、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼおよびモノクローナル抗体融合体）もまた、含まれる。
【実施例】
【００２８】
（実施例１：ＣＤのクローニングおよび配列特性）
Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒについてのゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した。公知の真菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子ＦＣＡ１（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）およびＦＣＹ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアミノ酸配列の整列を、相同である遺伝子領域について縮重したプライマーを設計するために用いた。このオリゴヌクレオチドは、以下の通りであった：
【００２９】
【化１】
ポリメラーゼ連鎖反応を、記載のプライマーおよび０．１μｇのゲノムＤＮＡを用いて、以下の条件で行った：
【００３０】
【化２】
反応条件は、以下の通りであった：９４℃で３分間（１サイクル）、続いて９４℃で４５秒間、４０℃で４５秒間、７２℃で３０秒間の２５サイクル。１０μｌの反応物を、３％アガロースゲルに流した。公知のＣＤ遺伝子の配列の整列に基づいて、予想されるフラグメントサイズを、反応において用いたプライマーのセットに依存して６６塩基対と２００塩基対との間にあると予想した。そして、そのＣＫ ＰＣＲは予想されるフラグメントを生成した。これらのフラグメントを、アガロースゲルから切り出し、そしてｐＣＲＳｃｒｉｐｔクローニングベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）にサブクローニングした。プラスミドＤＮＡを精製し、制限消化により、正しい挿入物サイズを含んでいるクローンについて分析した。プラスミドＤＮＡを、ＲｅｓＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により配列決定した。
【００３１】
上に記載のクローンの配列に基づき、プライマーを、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨＴＭ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）における使用のために設計して合成し、Ｃ．ｋｅｆｙｒの全長ＣＤ遺伝子を単離した。このキットと共に用いたオリゴヌクレオチドは、以下の通りであった：
【００３２】
【化３】
「ライブラリー」を作製し、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒキットのプロトコルにおいて記載の通りにＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ）中にサブクローニングし、プラスミドＤＮＡを精製し、そしてクローンを、配列決定のためにＲｅｓＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送った。Ｃ．ｋｅｆｙｒ遺伝子の５’末端および３’末端についての配列を決定し、制限酵素部位（斜体）を含むオリゴヌクレオチドおよび哺乳動物のＫｏｚａｋ配列（太字）を、以下のように設計して合成した：
【００３３】
【化４】
全長ＣＤ遺伝子を、ＰＣＲによりＣ．ｋｅｆｙｒゲノムＤＮＡから以下の条件で単離した：
【００３４】
【化５】
９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の２５サイクルを、サーモサイクラーにおいて行った。ＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイド染色を用いてアガロースゲルにより分析した。フラグメントを、適切な制限酵素を用いて消化し、標準方法によりｐＣＭＶ４Ａベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭ）にサブクローニングした。シトシンデアミナーゼ遺伝子の配列を、ＲｅｓＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより確認した。
【００３５】
この遺伝子を含んだクローンを、ＡＴＣＣにＰＴＡ−４８６７として寄託した。クローニングされた挿入物を、配列決定した。これを図１に示し、翻訳産物を図２に示す。天然に存在する対立遺伝子改変体を、図３および図４において示す。配列番号２のタンパク質は、１５２アミノ酸であり、以下のように特徴付けられる：
【００３６】
【表３】
（実施例２：ＣＤの発現）
ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を、これら構築物の１つ（ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧ、ＣＫ−ＣＤ、Ｅ−ＣＤ−ＦＬＡＧ、Ｅ−ＣＤまたはベクター単独（ｐＣＭＶ−ｔａｇ４Ｃ））で一過性にトランスフェクションした。コントロール実験を行い、各構築物が比較できる効率でトランスフェクションされたことを確認した。構築物とＧＦＰ含有プラスミドとで共にトランスフェクトされた細胞は、ほぼ等しいトランスフェクションのレベルを示した。
【００３７】
この実験の詳細は、以下の通りである：１０ｃｍディッシュの２９３細胞を、ＦｕＧｅｎｅ ６（ＲＯＣＨＥＴＭ）を用いて、１０μｇまたは１５μｇのＣＤ構築物で１：３のＤＮＡ／ＦｕＧｅｎｅ比率においてトランスフェクションした。キャリアＤＮＡは用いなかった。細胞溶解産物を、１ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中に、４８時間後に３回の凍結／融解サイクル（ドライアイスを用いて１０分間および室温で１０分間）により収集した。
【００３８】
３０μｌの細胞溶解産物を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、膜にトランスファーし、次いで１：５０００希釈の抗ｆｌａｇモノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡＴＭ）を用いたウエスタンブロットを行った。その膜を、ヤギ抗マウス二次抗体（１：１００００、ＡＭＥＲＳＨＡＭＴＭ）に結合したＨＲＰと共にインキュベートし、そのシグナルを、ＥＣＬシステム（ＡＭＥＲＳＨＡＭＴＭ）を用いて可視化した。図７におけるデータは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＤ−ＦＬＡＧが、同じベクター中に構築されているにもかかわらず、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ ＣＤ−ＦＬＡＧよりもずっと効率的に発現していることを示す。同様の結果が、細胞を２μｇの各ＤＮＡ構築物でトランスフェクションした場合に得られた（データは示さず）。ヒト化Ｃ．ｋｅｆｙｒ遺伝子を試験するための実験を計画すると、ヒト化遺伝子は、発現レベルを改善することが予想される。
【００３９】
細菌のタンパク質は、酵母のタンパク質よりもより強く発現したので、２つのクローンの発現の量についてのレベルを比較する試みが、行われた。第二のウエスタンブロットにおいて、３０μｌのＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧを、増大する量のＥ−ＣＤ−ＦＬＡＧに対して比較した。図８にみられるように、３０μｌのＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧ（約１８ＫＤバンド）は、４μｌのＥ−ＣＤ−ＦＬＡＧ（約６０ＫＤバンド）とおおよそ等しく、約７．５倍よりよく発現していることを示す。次の実験においては、細胞溶解産物のこの比率を用いる。約３８ＫＤでのより薄いバンドの存在は、ＣＫ−ＣＤタンパク質のいくらかの部分が、二量体化することを示し得る。
【００４０】
（実施例３：酵素アッセイ）
変換アッセイのために、１μｌの１００μＣｉ／ｍｌの１４Ｃ−シトシンまたは１４Ｃ−５ＦＣ（ＭＯＲＡＶＥＫ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳＴＭ）のいずれかを、４５μｌの酵母ＣＤ細胞溶解産物または６μｌの細菌ＣＤ細胞溶解産物に加え、指示された温度において２時間または１６時間インキュベートした。この反応混合液を、ＴＬＣプレート（ＬＫ５ＤＦ ＳＩＬＩＣＡ ＧＥＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４８５６−８２１、ＷＨＡＴＭＡＮＴＭ）にロードし、１−ブタノール：Ｈ２Ｏ（８５：１５）で３時間分離した。次いで、プレートを乾燥させ、オートラジオグラフィーにより可視化した。しかし、ＣＤ活性はまた、Ｄｅ Ｖｉｔｏ（２）およびＭａｒｔｉｎｏ（１７）により記載の通り、１９Ｆ核磁気共鳴（ＮＭＲ）によっても、アッセイされ得る。
【００４１】
細胞溶解産物を、シトシンからウラシルへの変換について、３７℃における１６時間のアッセイにおいてアッセイした。ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧ（Ｄ３３Ｅバリエーションを有する）、ＣＫ−ＣＤ、Ｅ−ＣＤ−ＦＬＡＧ、およびＥ−ＣＤの活性を、図９に示す。ＦＬＡＧタグなしのＣＫ−ＣＤは、タグ付のタンパク質よりもずっと活性が高いことは明白である（レーン１とレーン２との比較）。このことは、増大した発現または上昇した活性またはそれらの何らかの組み合わせを表し得る。これはまた、ＣＤ−ＦＬＡＧ改変体におけるＤ３３Ｅ変異も反映し得る。このＣＫ−ＣＤタンパク質は非常に小さいので、前の形態もまた、発現がまた阻害されることを示すけれども、ＦＬＡＧがその活性を阻害し得ることが予想される。
【００４２】
このＣ．ｋｅｆｙｒのＣＤタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのＣＤタンパク質で見出されたよりも、シトシンに対してはるかに活性が低いことが見出された（レーン２とレーン４との比較）。これはおそらく、採用されたアッセイ条件が、Ｅ．ｃｏｌｉのタンパク質に最適化されたという事実を反映する。さらに、反応時間を増加させると細菌の活性が上昇するように見えるが（データは示さず）、酵母のタンパク質の活性はそうではない。このことは、独立のアッセイにおいて確認され（データは示さず）、これは、これらの条件下で酵母の酵素は、細菌の酵素よりもわずかに安定性が少ないことを示し得る。
【００４３】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質はまた、熱的に不安定であることも公知である（測定されたＴ１／２＝１時間、（１６））。しかし、構造分析は、どちらの酵母のタンパク質も、哺乳動物細胞においてより安定であるべきことを示す（計算されたＴ１／２＞３０時間、表３〜４を参照のこと）。従って、本発明者らは、安定性が、反応条件を最適化することにより改善され得ることを予測し、この研究は進行中である。
【００４４】
次の実験において、本発明者らは、５ＦＣに対する各酵素の活性を試験した。この実験を、シトシンの代わりに５ＦＣを用いたこと以外は、上に記載の通り行った。さらに、本実験を、温度最適化研究と組み合わせ、４つの異なった温度において行った。図１０において示されるように、酵母のタンパク質は、細菌のタンパク質よりもより低い最適温度を有し、これはおそらく各生物についての代表的な環境の増殖条件を反映した。しかし、Ｃ．ｋｅｆｙｒのタンパク質は、３７℃において、そのタンパク質がヒトの治療において有用であるために、十分に活性が高かった。さらに、安定性を増大させた改変体は、下の実施例において記載されている通り、３７℃において増殖させた酵母をスクリーニングすることにより単離され得る。
【００４５】
そのＣＫ−ＣＤタンパク質は、シトシンに対して、より活性が低かったが、ＣＫ−ＣＤタンパク質は、２時間においてＥ．ｃｏｌｉ ＣＤよりも、５ＦＣに対して、予想外により活性が高い。これは、図１０において示され、ここでは、酵母のタンパク質が５ＦＣの５ＦＵへのはるかによい変換を示す（レーン１とレーン３との比較またはレーン２とレーン４との比較）。１６時間の反応において、細菌のタンパク質は、酵母のタンパク質と等しいか、またはより多くの５ＦＵを生成する（データは示さず）が、上で検討された通り、これはおそらく、採用した反応条件下における細菌のタンパク質のよりよい安定性を反映する。
【００４６】
本実験は、酵母のタンパク質が、プロドラッグ５ＦＣに対して細菌のタンパク質よりもより活性が高いことを示す。従って、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子およびタンパク質は、自殺遺伝子治療において利点を提供する。なぜなら、依然として細胞傷害性を達成しながらも、減少した投与量の５ＦＣが採用され得るからである。５ＦＣに対する酵母のタンパク質の比活性が、細菌のタンパク質の比活性をはるかに超えるということを確認するための実験が、進行中である。
【００４７】
上のアッセイを用いて、この酵素をさらに特徴付け、そして既存のシトシンデアミナーゼのタンパク質と比較した。その結果は、以下の通りである：
【００４８】
【表４】
（実施例４：細胞傷害アッセイ）
ＨＴ２９細胞、ＨＴ２９／ｂＣＤ細胞、およびＨＴ２９／ｙＣＤ細胞における５ＦＣおよび５ＦＵの放射線増感作用を、標準的な試験管内腫瘍細胞感受性試験（３）を用いて決定する。細胞を、１０％の透析血清を含む培地において３７℃において照射する前に、種々の濃度における５ＦＣまたは５ＦＵで２４時間処置する。放射線生存のデータを、同じ条件下で５ＦＣまたは５ＦＵで処置した照射されていないプレートを用いて、平均培養効率について補正する。その生存している割合を、照射線量に対してプロットし、曲線を線形二次方程式を用いて適合させる。放射線感受性を、細胞生存曲線の下の面積を表すＭＩＤとして表す（１）。放射線増感をＥＲとして表した。これは、ＭＩＤｃｏｎｔｒｏｌ／ＭＩＤｔｒｅａｔｅｄとして定義される。
【００４９】
バイスタンダー細胞に対する５ＦＣおよび５ＦＵの細胞傷害性作用および放射線増感作用を決定するために、９０％のバイスタンダーハイグロマイシン耐性ＨＴ２９細胞および１０％のピューロマイシン耐性ＣＤ形質導入ＨＴ２９細胞の共存培養物を用いる。ハイグロマイシン耐性ＨＴ２９細胞およびピューロマイシン耐性ＣＤ形質導入ＨＴ２９細胞の細胞生存を、処理後、選択培地において細胞をプレーティングすることにより決定し、上に記載の通りの標準的な試験管内腫瘍細胞感受性試験を用いて評価する。
【００５０】
細胞傷害性アッセイ。トランスフェクションされた細胞を、１×１０３細胞／ウェルの密度で１００μｌの培養培地を含んだ９６ウェルマイクロタイタープレート中にまいた。１０ｍｇ／ｍｌの５ＦＣ溶液の無菌ストック希釈物のセットを、調製した。１日後、増大する濃度の５ＦＣをウェルに加え、プロドラッグを含まないコントロールのウェルを含めた。５〜７日後、細胞を新しい培地で洗浄し、そして結果を定量するための血球計数板を用いて、トリパンブルー排除により細胞傷害性を評価した。この結果は、増大した変換率に起因して、細菌と比較して、５ＦＣの単位用量あたりで増大した細胞傷害性およびバイスタンダー効果を示す（１０倍まで）ことが予想される。同様に、ＣＤ−ＦＵＲ１融合タンパク質において、上昇した活性が予想される。Ｃ．ｋｅｆｙｒのタンパク質が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質とどのように匹敵するかということは公知ではないが、このタンパク質が、５ＦＣについて、細菌のＣＤタンパク質よりも２２倍低いＫｍおよび４倍高いＶｍａｘを有することは公知である。従って、その活性は、一度アッセイがＣ．ｋｅｆｙｒに最適化されると、Ｃ．ｋｅｆｙｒにおいてほぼ等しいかまたは多分いくらか上昇することが予想される。
【００５１】
（実施例５：抗体）
この表中に記載されたペプチドフラグメントを、合成し、ウサギに注入するために用いる。ポリクローナル抗体を、そこから調製し、活性についてスクリーニングする。最もよいサンプルを、モノクローナル抗体を調製するために選択する。
【００５２】
【表５】
今までに、本発明者らは、標準的技法に従って、そのタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端に由来するペプチドに対するポリクローナル抗体を調製している。そのペプチドは、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（配列番号２３）およびＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号２４）であった。各々について、モノクローナル抗体を単離するための研究が、計画される。
【００５３】
（実施例６：改変体）
表２に記載された特異的改変体を、配列番号１または配列番号３の部位特異的変異誘発により、合成する。しかし、さらなる改変体を作製し得、図５または図６において黒いボックスで示された保存された残基は、不活性の変異体を所望しない場合を除き、変化しないことが示唆される。さらに、チミジンおよびデオキシシチジル酸デアミナーゼの亜鉛結合領域（灰色のボックス）内の変化もまた、この領域の外側の変化よりも耐えられないと予想される。Ｃ．ｋｅｆｙｒのＣＤにとって重要であり得た残基を、図６において太字で示す。これらの残基は、最も近いホモログと比較して、荷電における変化を含み、結合領域中に存在する。これらの残基における変化は、機能を変化させることが予想される。活性な改変体は、２つの酵母において保存されていない残基において（特に、結合領域の外側の残基）、保存的変化を含む改変体である可能性がある。
【００５４】
改変体を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、実施例３に記載のアッセイ、または任意の適切なアッセイを用いて、活性についてスクリーニングする。あるいは、ランダム突然変異誘発を行い、その生成物を同様にスクリーニングする。このようにして、３７℃における改善された温度安定性を有する改変体を単離すること、および本明細書に記載の活性よりもさらによい活性を有する変異体を単離することは、可能である。
【００５５】
天然に存在する改変体を、高ストリンジェンシーにおいて、配列番号１または配列番号３のｃＤＮＡでＣａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒの集団をスクリーニングすることにより、単離する。あるいは、天然の対立遺伝子は、配列番号１または配列番号３の完全な範囲を提供する、重複するオリゴヌクレオチドのアレイを用いたＡＳＯ（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド）スクリーニングにより単離され得る。さらなる第３の代替において、より高い活性の変異体は、ピリミジン源としてシトシンで増殖する酵母のＣＤ変異体のレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）スクリーニングにより、単離され得る。
【００５６】
（実施例７：ＣＤ−ＦＵＲ１融合体）
Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＲ１）の融合タンパク質を、配列番号１０に示す通りに構築する。類似の構築物を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＤ（ＦＣＹ１）で作製した（１５）。このＦＣＹｌ−ＦＵＲｌ融合体は、５ＦＣの毒性代謝産物５ＦＵおよび５−ＦｄＵＭＰへの直接変換を効率的に触媒する二機能性のキメラタンパク質をコードし、従って、特定のヒト腫瘍細胞の５ＦＵに対する天然の耐性を回避する。予想外に、その融合タンパク質のシトシンデアミナーゼ活性は、野生型よりも１００倍高く、結果として５ＦＣの濃度に対する非常に増大した感受性（１０００倍増大した感受性）となった。さらに、バイスタンダー効果もまた、ＦＣＹ１もしくはＦＵＲ１の単独のどちらか一方または組み合わせよりも、融合タンパク質でより効果的であった。Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子と７４％同一性であるので、この遺伝子は、同様に機能すると予想され、そしてこのことを確認するために実験を行う。
【００５７】
多様式治療の別の型は、複製の条件的な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）単純疱疹ウイルス１変異体で達成され得る。このウイルスのリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子は、酵母のシトシンデアミナーゼをコードする配列により分断されている。ＨＳＶｌｙＣＤ感染細胞は、ウイルス複製および腫瘍崩壊を顕著に減少させることなしに、５ＦＣを５ＦＵに変換する。ＨＳＶｌｙＣＤ感染細胞は、ウイルス複製により破壊され、そして非感染細胞は、子孫ビリオンおよび５ＦＵの細胞外拡散の両方からのバイスタンダー殺傷を受ける。これは、抗腫瘍効果を増大させることが示されている（１８）。
【００５８】
（実施例８：ＣＤ−モノクローナル抗体融合体）
ＣＤは、モノクローナル抗体に対して共有結合し得、腫瘍細胞表面上の抗原に対して結合する結合体を形成し、従って、ＣＤを特異的細胞型に対して標的化する。本実験を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＤを用いて行い、この組み合わせは、抗体の標的について特異的であった（５）。類似の効果は、ＣＤ−モノクローナル抗体融合タンパク質の発現によって達成され得る。
【００５９】
（実施例９：自殺遺伝子治療）
インビボにおける予備的な自殺遺伝子治療の結果は、ヌードマウスの腫瘍モデルを用いて得られる。ヒト結腸ガン細胞株ＨＴ２９を、１０％の熱不活化子ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ中で増殖させる。細菌のＣＤ遺伝子または種々の酵母のＣＤ遺伝子（ヒト化Ｃ．ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子を含む）のどちらかを発現する安定なＨＴ２９細胞株は、レトロウイルスベクターＬＺＲ（Ｌａｚａｒｕｓ）またはアデノウイルスに基づく遺伝子―ウイルス（ｇｅｎｅ−ｖｉｒａｌ）ベクターを用いたウイルス感染により作製される（１９）。細胞を、感染２４時間後に再びまいてシングルコロニーを形成させ、その細胞を単離し、そしてＣＤ活性について試験する。ＣＤ陽性クローンを、マウス腫瘍モデルを作製するために用いる。
【００６０】
７〜８週齢のメスのヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ ＣＤ−１、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）は、上で作製された５×１０６の生存可能なＨＴ２９−ＣＤ細胞を、脇腹に注入（皮下注射）を受ける。腫瘍を、２週間ごとにカリパスで二次元において測定する。腫瘍体積を、次の式を用いて、ｍｍ３単位で計算する：（３．１４／６）（Ｌ×Ｗ２）。腫瘍が、＞５０ｍｍ３であり、かつ１００〜１５０ｍｍ３の平均体積と測定された場合、処置を開始する。マウスは、５００ｍｇ／ｋｇの５ＦＣまたは２５ｍｇ／ｋｇの５ＦＵを、２週間の間、週に５日、毎日注入（腹腔内）を受ける。処置の間での効力における差異を、測定する。
【００６１】
自殺遺伝子治療は、いくつかの第Ｉ相臨床試験および第ＩＩ相臨床試験において、既に試験されており、安全性および適度な効力の両方が示されている。しかし、トランスフェクション効率および遺伝子発現の両方の改善の余地がある。５ＦＣを５ＦＵに変換するより活性のある酵素をコードする遺伝子の使用は、自殺遺伝子治療における利益を提供し、より低い用量の５ＦＣの使用を可能にすることが予想される。新規のＣ．ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子での臨床的な実験は、しばらくの間行われない。暫定的に、反応条件をＣ．ｋｅｆｙｒ ＣＤタンパク質に最適化するための研究が現在行われており、細胞傷害性アッセイおよび上に記載のヌードマウスの異種移植腫瘍モデル（ｘｅｎｏｇｒａｐｈｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ）において、その細胞傷害性が確認される。Ｃ．ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子は、確立された細菌の遺伝子を超える利益を提供し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子を超える改善物であると証明され得ることが予想される。
【００６２】
（実施例１１：腫瘍応答モニタリング）
Ｃ．ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子またはその改変体は、インビトロにおける自殺遺伝子治療に対する個々の腫瘍細胞の反応を試験するために、用いられ得る。候補の腫瘍細胞は、上のようにトランスフェクトされ、治療に対するそれらの応答性を、インビトロまたはマウス腫瘍モデルのどちらかにおいてアッセイする。腫瘍細胞は、確立された腫瘍細胞株または個体から生検された腫瘍細胞であり得る。このようにして、ＣＫ遺伝子を用いた自殺遺伝子治療から利益を受ける可能性の最も高い腫瘍を、同定し得る。
【００６３】
引用：すべての引用文献は、これによって明白に参考として援用され、便宜上ここに再記載される。
１．Ｆｅｒｔｉｌ Ｂら、Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．（１９８４）９９：８３−９３．
２．Ｄｉ Ｖｉｔｏ Ｍら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９８６）２９（２）：３０３−８．
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４．Ｈｕｂｅｒ ＢＥら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１９９１）８８：８０３９−８０４３．
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８．Ｓｕｔｔｏｎ ＭＡら、Ｊ Ｕｒｏｌ．（１９９６）１５５：３２１．
９．Ｅｒｂｓ Ｐら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９７）３１（１）：１−６
１０．Ｈａｙｄｅｎ ＭＳら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．（１９９８）１２（２）：１７３−８４．
１１．ＷＯ９９６０００８Ａ１：ＣＹＴＯＳＩＮＥ ＤＥＡＭＩＮＡＳＥ ＧＥＮＥ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来）．
１２．Ｂｌｏｍ Ｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２９４（５）：１３５１−１３６２．
１３．Ｈａｍｓｔｒａ ＤＡら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）１０（１２）：１９９３−２００３．
１４．Ｔａｔｕｓｏｖａ ＴＡおよびＭａｄｄｅｎ ＴＬ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４：２４７−２５０．
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１７．Ｍａｒｔｉｎｏ Ｒら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．２０００年１１月；１（３）：２７１−３０３．
１８．Ｎａｋａｍｕｒａ Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１年７月１５日；６１（１４）：５４４７−５２．
１９．Ｑｉａｎ Ｑら、Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ Ｊ（Ｅｎｇｌ）２００２年８月；１１５（８）：１２１３−１２１７；１３：Ｇａｎｌｙ Ｉら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００年３月；６（３）：７９８−８０６．
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのｃＤＮＡ配列（配列番号１）。このｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅によりクローニングされた。そのＰＣＲには、先行技術の真菌の配列の間で保存された配列部分に由来したプライマーを用いた。
【図２】Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）。このアミノ酸配列は、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に由来した。
【図３】改変体Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのｃＤＮＡ配列（７４Ｃ→Ｔ、９９Ｔ→Ｃ、１５９Ｔ→Ａ、２４３Ｔ→Ｃ、３０９Ｃ→Ｔ、３３６Ａ→Ｇ、３６５Ａ→Ｇである（配列番号３））。この改変体ＣＤタンパク質は、以前に記載されたシステムを用いて増幅された異なったクローンから得られた。
【図４】改変体Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのアミノ酸配列Ｄ３３Ｅ（配列番号４）。このアミノ酸配列は、図３におけるｃＤＮＡのヌクレオチド配列に由来した。
【図５】Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ（配列番号２）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号５）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（配列番号６）およびＣＤコンセンサス配列を用いたＣＤ複数配列の整列。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０１５３８７号から得られた。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ１５７８２号から得られた。コンセンサス配列は、タンパク質ドメインのＰｆａｍデータベースおよびＨＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）登録番号ＰＦ００３８３号から得られた。ＦＡＳＴＡ形式における配列は、Ｈｉｇｇｉｎｓ（７）に従ってデフォルトパラメーター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を用いて整列された。２００２年６月２０現在のデフォルトの設定は以下であった：ＣＰＵモード＝ｃｌｕｓｔａｌｗ＿ｍｐ；整列＝完全（ｆｕｌｌ）；出力形式＝ａｌｎ ｗ／数；出力順序＝整列順；有色整列（ｃｏｌｏｒ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）＝なし；ＫＴＵＰ＝ｄｅｆ；ウィンドウの長さ（ｗｉｎｄｏｗ ｌｅｎｇｔｈ）＝ｄｅｆ；スコア＝パーセント；トップダイアゴ（ｔｏｐｄｉａｇ）＝ｄｅｆ；ペアギャップ（ｐａｉｒｇａｐ）＝ｄｅｆ；系統樹＝なし（オフ、オフ）；マトリックス＝ｄｅｆ；ギャップオープン（ｇａｐ ｏｐｅｎ）＝ｄｅｆ；末端ギャップ＝ｄｅｆ；ギャップ拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝ｄｅｆ；ギャップ距離（ｄｉｓｔａｎｃｅ）＝ｄｅｆ；系統樹の型（ｔｒｅｅ ｔｙｐｅ）＝分岐図；系統樹のギャップ距離＝非表示。
【図６】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列との対での（ｐａｉｒｗｉｓｅ）整列。配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において整列された。
【図７】抗ＦＬＡＧを用いたウエスタンブロット。抗ＦＬＡＧ抗体は、ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧおよびＥ−ＣＤ−ＦＬＡＧを含むＣＤ構築物の発現を確認するために用いられる。この細菌のタンパク質は、酵母のタンパク質よりもずっと強く発現する。
【図８】ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧおよびＥ−ＣＤ−ＦＬＡＧの力価測定。抗ＦＬＡＧ抗体を用いるウエスタンブロットにより試験したところ、３０μｌのＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧ溶解産物は、３μｌのＥ−ＣＤ−ＦＬＡＧ溶解産物とほぼ等しい。このことは、ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧタンパク質が、Ｅ−ＣＤ−ＦＬＡＧよりも約１０倍少なく発現されることを示唆する。しかし、コントロール実験（共トランスフェクトしたＧＦＰ含有ベクターを有する、データは示さず）は、おおよそ等しいトランスフェクション効率を示す。
【図９】シトシンからウラシルへのアッセイ。等しい量の細胞溶解産物は、シトシンからウラシルへの変換について３７℃においての１６時間のアッセイにおいてアッセイされる。ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧ、ＣＫ−ＣＤ、Ｅ−ＣＤ−ＦＬＡＧ、およびＥ−ＣＤの活性が示され、ＦＬＡＧタグなしのＣＫ−ＣＤは、ＦＬＡＧ付きのタンパク質よりもずっと活性が高いことは明らかである。このことは、増大した発現もしくは上昇した活性またはそれらの何らかの組み合わせを表し得る。
【図１０】異なった温度における５ＦＣから５ＦＵへのアッセイ。等しい量の細胞溶解産物は、シトシンからウラシルへの変換について３７℃においての２時間のアッセイにおいて、指示された温度においてアッセイされる。ＣＫ−ＣＤは、ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧよりもずっと活性が高く、そして、このことは、よりよい発現、よりよい活性または両方を反映し得る。タグ化された酵母ＣＤおよびタグ化されていない酵母ＣＤの両方は、５ＦＣに対して細菌のタンパク質よりもより活性が高い。
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ由来のシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）のタンパク質およびｃＤＮＡ、これらの改変体ならびにそれらの利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は、シトシンをウラシルに変換する酵素である。本酵素の細菌版および真菌版はまた、５−フルオロシトシン（５ＦＣ）を５−フルオロウラシル（５ＦＵ）に変換し得る。しかし、そのヒト酵素およびマウス酵素は、５ＦＣを基質として認識しない。細菌ＣＤおよび真菌ＣＤは、５ＦＣを５ＦＵに変換し、次いで５ＦＵは、すべての種において５−フルオロ−デオキシウリジン一リン酸（５ＦｄＵＭＰ）に変換される。５ＦｄＵＭＰは、チミジル酸シンターゼの不可逆性のインヒビターであり、５ＦｄＵＭＰの蓄積は、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）欠乏によるＤＮＡ合成を阻害することで、細胞死を引き起こす。
【０００３】
ヒトＣＤ遺伝子は５ＦＣを５ＦＵに変換しないので、プロドラッグ５ＦＣは、細菌ＣＤ遺伝子または真菌ＣＤ遺伝子を発現するように操作されたヒト細胞においてのみ毒性である。このことは、腫瘍を処置する際に有利に用いられ、「自殺遺伝子」システムの１つの例である。腫瘍は、細菌ＣＤ遺伝子または真菌ＣＤ遺伝子で形質転換され、それは通常は、ＣＤ遺伝子を含んだベクターの直接注入、移植または全身投与による。次いで、患者は、５ＦＣで処置され、５ＦＵの毒性効果は、分裂を続ける形質転換細胞の死滅を引き起こす。
【０００４】
この自殺遺伝子システムは、悪性腫瘍を処置するためのアプローチとして広く研究されている。このシステムの利点の１つは、自殺遺伝子をすべての腫瘍細胞が取り込むことは効果的な治療のために必要ではないことであり、動物において、２０％未満の細胞が自殺遺伝子を発現した場合でも、完全な腫瘍応答が報告されている。この現象は、「バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）効果」として公知であり、特定の細胞が死滅し、その薬剤ロード（ｌｏａｄ）が放出された場合の近隣の細胞に対する薬剤の持続的毒性に基づく（６）。
【０００５】
この自殺遺伝子システムは、正確な標的化を必要とする。なぜなら、プロドラッグへの曝露を受けた正常細胞における遺伝子発現が、その細胞が分裂を試みたときに細胞を殺傷するためである。この問題は、自殺遺伝子が標的とされた細胞の選択された集団においてのみ発現するように、自殺遺伝子を組織特異的（または優先的に腫瘍特異的）プロモーターの制御下に配置することにより取り組まれている。α−フェトプロテインプロモーターは、肝ガン細胞において優先的に活性化され、このようなアプローチの１つの例である（８）。多くのプロモーター配列は完全に腫瘍特異的というわけではないので、この自殺遺伝子は、若干量の健康な組織においてもまた発現され得る。しかし、これは効力に対して致命的ではない。なぜなら、大部分の化学療法と同様に、この処置の前提が、活発に分裂する細胞が薬剤により優先的に標的化されるということだからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
自殺遺伝子は、腫瘍の特異的標的化についての有望なアプローチであるけれども、このシステムの大部分の局面において改善の余地がある。特に、活性が上昇した酵素は、より低用量の５ＦＣの利用を可能にし、報告された高い５ＦＣ用量の免疫抑制効果を回避する。本発明は、そのような改善の１つを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
用語「融合体」は、化学的に連結しているポリペプチド（またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）、融合体タンパク質全体に公知の性質を与えるために利用され得る公知の性質を備えた別のペプチド（またはこれをコードする核酸）を言及するために用いられる。融合体の使用は、タンパク質精製を容易にするため、目的のタンパク質を可視化するために当該分野で一般的である。タンパク質融合体の例は、ベクターからのタンパク質の発現物であり、ここで、このタンパク質はインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）（自己切断タンパク質）に作動可能に連結しており、インテリンは結合ドメインに作動可能に連結している。結合ドメインの基質を固体表面に対して固定することによって、目的のタンパク質は、この表面に結合し得、リンスされ得、そしてインテイン切断を誘導する条件下で放出され得る。融合体の他の例としては、抗原性タグ（例えば、ＨＩＳまたはＦＬＡＧ）の使用が挙げられ、このタグはタグ化されたタンパク質を単離するかまたは可視化するために用いられ得る。
【０００８】
本明細書で用いられる場合、用語「ヒト化」は、もとのアミノ酸配列を依然として保持しながらも、コドンがヒト遺伝子においてよりしばしば利用されるコドンに変換されているタンパク質コード配列をいう。同様に、「Ｅ．ｃｏｌｉバイアス（ｂｉａｓ）」は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現に最適化されている遺伝子をいう。
【０００９】
本明細書で用いられる場合、用語「単離された」は、天然の環境から取り出された、核酸またはポリペプチドをいう。単離されたタンパク質の１つの例は、ポリクローナル抗体により結合され、細胞の残骸を除くためにリンスされ、さらなる処理なしに利用される、タンパク質である。脱塩（ｓａｌｔ−ｃｕｔ）タンパク質調製物、サイズ分画調製物、親和性吸着（ａｂｓｏｒｂｅｄ）調製物、組み換え遺伝子、組み換えタンパク質、組み換え核酸を発現した宿主細胞由来の細胞抽出物、組み換えタンパク質が分泌された培地などがまた、挙げられる。例えば、別のタンパク質を介して固体支持体に結合したタンパク質は、高くとも純度５０％であるので、用語「単離された」が用いられるが、単離されたタンパク質は、当該分野で一般的かつ信頼性高く用いられる。
【００１０】
本明細書で用いられる場合、「精製された」は、天然の環境から分離され、その結果所定のサンプルにおいて核酸またはポリペプチドの全量の少なくとも９５％である、核酸またはポリペプチドをいう。タンパク質の純度は、本明細書ではＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により評価される。核酸の純度は、アガロースゲルおよびＥｔＢｒ染色により評価される。
【００１１】
本明細書で用いられる場合、用語「実質的に精製された」は、天然の環境から取り出され、かつ少なくとも７５％の純度である核酸配列またはタンパク質配列をいう。好ましくは、少なくとも８０、８５または９０％の純度が実現される。
【００１２】
本明細書で用いられる場合、語句「核酸」または「核酸配列」は、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであり得、一本鎖または二本鎖であり得る、ポリヌクレオチドをいう。この用語はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）または任意の化学的なＤＮＡ様物質もしくはＲＮＡ様物質を包含する。「ｃＤＮＡ」は、細胞において天然に存在するｍＲＮＡから作製されたコピーＤＮＡをいう。「ｇＤＮＡ」は、ゲノムのＤＮＡをいう。これらの組み合わせもまた、可能である（すなわち、部分ｇＤＮＡおよび部分ｃＤＮＡである組み換え核酸）。
【００１３】
「フラグメント」は、抗原性、構造ドメイン、または全長タンパク質の酵素活性を保持しているポリペプチド（または、そのようなポリペプチドをコードする核酸配列）をいう。ＣＤタンパク質の「酵素的活性」は、本明細書中では、５ＦＣの５ＦＵへの変換として定義される。保存されたシトシンデアミナーゼドメイン（残基３〜１０４）を含む「構造的領域」は、図５において示される。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも約１５ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドおよびその間のすべての整数のヌクレオチドの核酸配列をいう。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、約１８〜３０ヌクレオチドであり、最も好ましくは約２０〜２５ヌクレオチドである。概して、オリゴヌクレオチドは、特異性のために２２〜２５ヌクレオチド長よりも長くなければならないが、特定の用途においてはより短いオリゴヌクレオチドで足りることもある。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、用語「作動可能に会合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」または「作動可能に連結している（ｌｉｎｋｅｄ）」は、機能的に結合した核酸配列をいう。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、ＣＤポリペプチドの「改変体」は、１つ以上のアミノ酸残基により変更されたアミノ酸配列をいう。そのような改変体は、天然に存在し得るか、または合成によって調製され得る。一般的な改変体としては、「保存的な」変化、短縮化、およびドメイン除去または同様のタンパク質での交換が挙げられる。どのアミノ酸残基が、生物学的活性または免疫学的活性を無効にすることなしに、置換され得、挿入され得、または欠失され得るかを決定することにおける指針は、当該分野に周知であるコンピュータープログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥＴＭソフトウェア）および多くの公知のＣＤ遺伝子に対しての比較を用いて見出され得る。
【００１７】
用語「天然に存在する改変体」は、該当の集団において天然に見出される、タンパク質または核酸対立遺伝子を含む。天然に存在する対立遺伝子改変体は、点変異（ｐｏｉｎｔ）型、スプライシング型、または他の型の天然に存在する改変体であり得る。
【００１８】
「高ストリンジェンシー（ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」は、６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳという洗浄条件をいう。「中程度のストリンジェンシー（ｍｅｄｉｕｍ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）」は、５５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳという洗浄条件をいう。
【００１９】
「同一性％」の計算において、問合せ（ｑｕｅｒｙ）配列のうちの整列されていない末端部分は、計算中には含まれない。同一性は、参照配列の全長にわたって計算され、従って、問合せ配列との短い局所の整列は、関連がない（例えば、同一性％＝問合せ配列中の整列されていない残基の数／参照配列の長さ）。整列は、Ｔａｔｕｓｏｖａ ＴＡおよびＭａｄｄｅｎ ＴＬ（１９９９）ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０によって記載される通りのＢＬＡＳＴ相同性整列を用いて行われる。フィルターが外されたことを除いて、デフォルトパラメーターが用いられた。２００１年１月１日現在、デフォルトパラメーターは以下のとおりであった：必要に応じてＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰ；マトリックス＝ＢＬＡＳＴＮについてなし、ＢＬＡＳＴＰについてＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップデフォルトを空けるためのＧ Ｃｏｓｔ＝ヌクレオチドについて５、タンパク質について１１；ギャップ［整数］デフォルトを広げるためのＥ Ｃｏｓｔ＝ヌクレオチドについて２、タンパク質について１；ヌクレオチドミスマッチ[整数]デフォルトについてのｑ Ｐｅｎａｌｔｙ＝−３；ヌクレオチド一致[整数]デフォルトについてのｒ（報酬）＝１；ｅ予想値［リアル］デフォルト＝１０；Ｗ（ワードサイズ）［整数］デフォルト＝ヌクレオチドについて１１、タンパク質について３；ビットにおけるｂｌａｓｔ拡張についてｙ Ｄｒｏｐｏｆｆ（Ｘ）（０の場合のデフォルト）デフォルト＝ｂｌａｓｔｎについて２０，他のプログラムについて７；（ビットにおける）ギャップを空けた（ｇａｐｐｅｄ）整列についてＸドロップオフ値、ｂｌａｓｔｎについて３０、他のプログラムについて１５；（ビットにおける）ギャップを空けた整列についてＺ最終Ｘドロップオフ値、ｂｌａｓｔｎについて５０、他のプログラムについて２５。本プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてオンラインで利用可能である。
【００２０】
Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ（別名Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＣＤは、いくつかの先行技術のシトシンデアミナーゼタンパク質を超える改善物である。Ｃ．ｋｅｆｙｒ ＣＤは、（これまで）Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＤと比較して顕著に低い発現レベルを示すが、その活性は、５ＦＣを５ＦＵへと変換する際にずっと高い。さらに、５ＦＣは、天然の基質であるシトシンよりもＣ．ｋｅｆｙｒ ＣＤについてのよりよい基質である。表１は、本明細書中に教示される配列のリストを提供する。
【００２１】
【表１−１】
【００２２】
【表１−２】
他のタンパク質改変体は、配列番号２を参照して表２に記載される。
【００２３】
【表２】
本発明は、概して、配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列のＣ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのタンパク質および遺伝子またはｃＤＮＡの配列に関する。そのタンパク質をコードするｃＤＮＡの改変体が提供され、その改変体としては、Ｅ．ｃｏｌｉバイアスＣＤ ｃＤＮＡ（配列番号７）、ヒト化ＣＤ ｃＤＮＡ（配列番号８）およびヒト化されておりかつＣｐＧを含まないＣＤ ｃＤＮＡ（配列番号９）が挙げられる。融合体もまた、提供され、融合体は、特に、ＣＤ−ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合体（配列番号１０）およびＣＤ−ＦＬＡＧ融合体（表２を参照のこと）である。
【００２４】
その核酸配列は、伝統的な自殺遺伝子治療の方法論において用いられ得る。自殺遺伝子治療は、第Ｉ相臨床試験、第ＩＩ相臨床試験および第ＩＩＩ相臨床試験であり、よく確立された処置補足物または処置代替物である。Ｃ．ｋｅｆｙｒ遺伝子は、現在の自殺遺伝子配列を超える利点を提供する。なぜなら、このタンパク質の５ＦＣを５ＦＵに変換する能力が改善されるために、より少ない量の５ＦＣが治療のために必要とされるからである。この遺伝子はまた、生化学的特徴付け、抗体の調製などのために大量のタンパク質を調製する際用途を有する。
【００２５】
多くの改変体タンパク質配列が提供され、この配列は、先行技術の配列との公知の相同性およびタンパク質の予想される特性の両方に基づいており、表１〜３ならびに図５および図６において示される。提供された変異体の範囲すべては、開示される通り、野生型配列と９４％以内のアミノ酸同一性である。最も近い先行技術の配列は、Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのタンパク質と７４％のアミノ酸同一性しか有していない。
【００２６】
Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼの抗原性フラグメントもまた提供され、そのフラグメントは、本発明の抗体をうまく作製するために、既に用いられている。抗原性フラグメントは、表５に示されるように、独自であるかまたは保存されるために選択され得る。同様に、配列番号１または配列番号３のヌクレオチド配列のフラグメントは、オリゴヌクレオチドプローブとして、またはいろいろな方法におけるプライマーとして用いられ得る。より大きなフラグメントもまた、プローブとして用いられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の実施形態の説明）
本発明は、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼ（ＣＫ−ＣＤ）のタンパク質およびｃＤＮＡの配列に関する。ｉ）ＣＤをコードするＥ．ｃｏｌｉバイアスＤＮＡ配列およびヒト化ＤＮＡ配列、ｉｉ）抗原性ポリペプチドフラグメントおよびこれらに対する抗体、ｉｉｉ）このファミリーにおける多くのタンパク質との比較に基づいて、機能活性を保持することが予想される改変体および不活性な変異体、ｉｖ）天然に存在する改変体、ｖ）融合タンパク質（例えば、ＦＬＡＧ、ＧＦＰ、ルシフェラーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼおよびモノクローナル抗体融合体）もまた、含まれる。
【実施例】
【００２８】
（実施例１：ＣＤのクローニングおよび配列特性）
Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒについてのゲノムＤＮＡを、ＡＴＣＣから購入した。公知の真菌のシトシンデアミナーゼ遺伝子ＦＣＡ１（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）およびＦＣＹ１（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のアミノ酸配列の整列を、相同である遺伝子領域について縮重したプライマーを設計するために用いた。このオリゴヌクレオチドは、以下の通りであった：
【００２９】
【化１】
ポリメラーゼ連鎖反応を、記載のプライマーおよび０．１μｇのゲノムＤＮＡを用いて、以下の条件で行った：
【００３０】
【化２】
反応条件は、以下の通りであった：９４℃で３分間（１サイクル）、続いて９４℃で４５秒間、４０℃で４５秒間、７２℃で３０秒間の２５サイクル。１０μｌの反応物を、３％アガロースゲルに流した。公知のＣＤ遺伝子の配列の整列に基づいて、予想されるフラグメントサイズを、反応において用いたプライマーのセットに依存して６６塩基対と２００塩基対との間にあると予想した。そして、そのＣＫ ＰＣＲは予想されるフラグメントを生成した。これらのフラグメントを、アガロースゲルから切り出し、そしてｐＣＲＳｃｒｉｐｔクローニングベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａ）にサブクローニングした。プラスミドＤＮＡを精製し、制限消化により、正しい挿入物サイズを含んでいるクローンについて分析した。プラスミドＤＮＡを、ＲｅｓＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）により配列決定した。
【００３１】
上に記載のクローンの配列に基づき、プライマーを、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨＴＭ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）における使用のために設計して合成し、Ｃ．ｋｅｆｙｒの全長ＣＤ遺伝子を単離した。このキットと共に用いたオリゴヌクレオチドは、以下の通りであった：
【００３２】
【化３】
「ライブラリー」を作製し、Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒキットのプロトコルにおいて記載の通りにＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ２．１（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ）中にサブクローニングし、プラスミドＤＮＡを精製し、そしてクローンを、配列決定のためにＲｅｓＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓに送った。Ｃ．ｋｅｆｙｒ遺伝子の５’末端および３’末端についての配列を決定し、制限酵素部位（斜体）を含むオリゴヌクレオチドおよび哺乳動物のＫｏｚａｋ配列（太字）を、以下のように設計して合成した：
【００３３】
【化４】
全長ＣＤ遺伝子を、ＰＣＲによりＣ．ｋｅｆｙｒゲノムＤＮＡから以下の条件で単離した：
【００３４】
【化５】
９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、および７２℃で１分間の２５サイクルを、サーモサイクラーにおいて行った。ＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイド染色を用いてアガロースゲルにより分析した。フラグメントを、適切な制限酵素を用いて消化し、標準方法によりｐＣＭＶ４Ａベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥＴＭ）にサブクローニングした。シトシンデアミナーゼ遺伝子の配列を、ＲｅｓＧｅｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより確認した。
【００３５】
この遺伝子を含んだクローンを、ＡＴＣＣにＰＴＡ−４８６７として寄託した。クローニングされた挿入物を、配列決定した。これを図１に示し、翻訳産物を図２に示す。天然に存在する対立遺伝子改変体を、図３および図４において示す。配列番号２のタンパク質は、１５２アミノ酸であり、以下のように特徴付けられる：
【００３６】
【表３】
（実施例２：ＣＤの発現）
ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を、これら構築物の１つ（ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧ、ＣＫ−ＣＤ、Ｅ−ＣＤ−ＦＬＡＧ、Ｅ−ＣＤまたはベクター単独（ｐＣＭＶ−ｔａｇ４Ｃ））で一過性にトランスフェクションした。コントロール実験を行い、各構築物が比較できる効率でトランスフェクションされたことを確認した。構築物とＧＦＰ含有プラスミドとで共にトランスフェクトされた細胞は、ほぼ等しいトランスフェクションのレベルを示した。
【００３７】
この実験の詳細は、以下の通りである：１０ｃｍディッシュの２９３細胞を、ＦｕＧｅｎｅ ６（ＲＯＣＨＥＴＭ）を用いて、１０μｇまたは１５μｇのＣＤ構築物で１：３のＤＮＡ／ＦｕＧｅｎｅ比率においてトランスフェクションした。キャリアＤＮＡは用いなかった。細胞溶解産物を、１ｍｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中に、４８時間後に３回の凍結／融解サイクル（ドライアイスを用いて１０分間および室温で１０分間）により収集した。
【００３８】
３０μｌの細胞溶解産物を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、膜にトランスファーし、次いで１：５０００希釈の抗ｆｌａｇモノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡＴＭ）を用いたウエスタンブロットを行った。その膜を、ヤギ抗マウス二次抗体（１：１００００、ＡＭＥＲＳＨＡＭＴＭ）に結合したＨＲＰと共にインキュベートし、そのシグナルを、ＥＣＬシステム（ＡＭＥＲＳＨＡＭＴＭ）を用いて可視化した。図７におけるデータは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＤ−ＦＬＡＧが、同じベクター中に構築されているにもかかわらず、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ ＣＤ−ＦＬＡＧよりもずっと効率的に発現していることを示す。同様の結果が、細胞を２μｇの各ＤＮＡ構築物でトランスフェクションした場合に得られた（データは示さず）。ヒト化Ｃ．ｋｅｆｙｒ遺伝子を試験するための実験を計画すると、ヒト化遺伝子は、発現レベルを改善することが予想される。
【００３９】
細菌のタンパク質は、酵母のタンパク質よりもより強く発現したので、２つのクローンの発現の量についてのレベルを比較する試みが、行われた。第二のウエスタンブロットにおいて、３０μｌのＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧを、増大する量のＥ−ＣＤ−ＦＬＡＧに対して比較した。図８にみられるように、３０μｌのＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧ（約１８ＫＤバンド）は、４μｌのＥ−ＣＤ−ＦＬＡＧ（約６０ＫＤバンド）とおおよそ等しく、約７．５倍よりよく発現していることを示す。次の実験においては、細胞溶解産物のこの比率を用いる。約３８ＫＤでのより薄いバンドの存在は、ＣＫ−ＣＤタンパク質のいくらかの部分が、二量体化することを示し得る。
【００４０】
（実施例３：酵素アッセイ）
変換アッセイのために、１μｌの１００μＣｉ／ｍｌの１４Ｃ−シトシンまたは１４Ｃ−５ＦＣ（ＭＯＲＡＶＥＫ ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬＳＴＭ）のいずれかを、４５μｌの酵母ＣＤ細胞溶解産物または６μｌの細菌ＣＤ細胞溶解産物に加え、指示された温度において２時間または１６時間インキュベートした。この反応混合液を、ＴＬＣプレート（ＬＫ５ＤＦ ＳＩＬＩＣＡ ＧＥＬ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４８５６−８２１、ＷＨＡＴＭＡＮＴＭ）にロードし、１−ブタノール：Ｈ２Ｏ（８５：１５）で３時間分離した。次いで、プレートを乾燥させ、オートラジオグラフィーにより可視化した。しかし、ＣＤ活性はまた、Ｄｅ Ｖｉｔｏ（２）およびＭａｒｔｉｎｏ（１７）により記載の通り、１９Ｆ核磁気共鳴（ＮＭＲ）によっても、アッセイされ得る。
【００４１】
細胞溶解産物を、シトシンからウラシルへの変換について、３７℃における１６時間のアッセイにおいてアッセイした。ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧ（Ｄ３３Ｅバリエーションを有する）、ＣＫ−ＣＤ、Ｅ−ＣＤ−ＦＬＡＧ、およびＥ−ＣＤの活性を、図９に示す。ＦＬＡＧタグなしのＣＫ−ＣＤは、タグ付のタンパク質よりもずっと活性が高いことは明白である（レーン１とレーン２との比較）。このことは、増大した発現または上昇した活性またはそれらの何らかの組み合わせを表し得る。これはまた、ＣＤ−ＦＬＡＧ改変体におけるＤ３３Ｅ変異も反映し得る。このＣＫ−ＣＤタンパク質は非常に小さいので、前の形態もまた、発現がまた阻害されることを示すけれども、ＦＬＡＧがその活性を阻害し得ることが予想される。
【００４２】
このＣ．ｋｅｆｙｒのＣＤタンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉのＣＤタンパク質で見出されたよりも、シトシンに対してはるかに活性が低いことが見出された（レーン２とレーン４との比較）。これはおそらく、採用されたアッセイ条件が、Ｅ．ｃｏｌｉのタンパク質に最適化されたという事実を反映する。さらに、反応時間を増加させると細菌の活性が上昇するように見えるが（データは示さず）、酵母のタンパク質の活性はそうではない。このことは、独立のアッセイにおいて確認され（データは示さず）、これは、これらの条件下で酵母の酵素は、細菌の酵素よりもわずかに安定性が少ないことを示し得る。
【００４３】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質はまた、熱的に不安定であることも公知である（測定されたＴ１／２＝１時間、（１６））。しかし、構造分析は、どちらの酵母のタンパク質も、哺乳動物細胞においてより安定であるべきことを示す（計算されたＴ１／２＞３０時間、表３〜４を参照のこと）。従って、本発明者らは、安定性が、反応条件を最適化することにより改善され得ることを予測し、この研究は進行中である。
【００４４】
次の実験において、本発明者らは、５ＦＣに対する各酵素の活性を試験した。この実験を、シトシンの代わりに５ＦＣを用いたこと以外は、上に記載の通り行った。さらに、本実験を、温度最適化研究と組み合わせ、４つの異なった温度において行った。図１０において示されるように、酵母のタンパク質は、細菌のタンパク質よりもより低い最適温度を有し、これはおそらく各生物についての代表的な環境の増殖条件を反映した。しかし、Ｃ．ｋｅｆｙｒのタンパク質は、３７℃において、そのタンパク質がヒトの治療において有用であるために、十分に活性が高かった。さらに、安定性を増大させた改変体は、下の実施例において記載されている通り、３７℃において増殖させた酵母をスクリーニングすることにより単離され得る。
【００４５】
そのＣＫ−ＣＤタンパク質は、シトシンに対して、より活性が低かったが、ＣＫ−ＣＤタンパク質は、２時間においてＥ．ｃｏｌｉ ＣＤよりも、５ＦＣに対して、予想外により活性が高い。これは、図１０において示され、ここでは、酵母のタンパク質が５ＦＣの５ＦＵへのはるかによい変換を示す（レーン１とレーン３との比較またはレーン２とレーン４との比較）。１６時間の反応において、細菌のタンパク質は、酵母のタンパク質と等しいか、またはより多くの５ＦＵを生成する（データは示さず）が、上で検討された通り、これはおそらく、採用した反応条件下における細菌のタンパク質のよりよい安定性を反映する。
【００４６】
本実験は、酵母のタンパク質が、プロドラッグ５ＦＣに対して細菌のタンパク質よりもより活性が高いことを示す。従って、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子およびタンパク質は、自殺遺伝子治療において利点を提供する。なぜなら、依然として細胞傷害性を達成しながらも、減少した投与量の５ＦＣが採用され得るからである。５ＦＣに対する酵母のタンパク質の比活性が、細菌のタンパク質の比活性をはるかに超えるということを確認するための実験が、進行中である。
【００４７】
上のアッセイを用いて、この酵素をさらに特徴付け、そして既存のシトシンデアミナーゼのタンパク質と比較した。その結果は、以下の通りである：
【００４８】
【表４】
（実施例４：細胞傷害アッセイ）
ＨＴ２９細胞、ＨＴ２９／ｂＣＤ細胞、およびＨＴ２９／ｙＣＤ細胞における５ＦＣおよび５ＦＵの放射線増感作用を、標準的な試験管内腫瘍細胞感受性試験（３）を用いて決定する。細胞を、１０％の透析血清を含む培地において３７℃において照射する前に、種々の濃度における５ＦＣまたは５ＦＵで２４時間処置する。放射線生存のデータを、同じ条件下で５ＦＣまたは５ＦＵで処置した照射されていないプレートを用いて、平均培養効率について補正する。その生存している割合を、照射線量に対してプロットし、曲線を線形二次方程式を用いて適合させる。放射線感受性を、細胞生存曲線の下の面積を表すＭＩＤとして表す（１）。放射線増感をＥＲとして表した。これは、ＭＩＤｃｏｎｔｒｏｌ／ＭＩＤｔｒｅａｔｅｄとして定義される。
【００４９】
バイスタンダー細胞に対する５ＦＣおよび５ＦＵの細胞傷害性作用および放射線増感作用を決定するために、９０％のバイスタンダーハイグロマイシン耐性ＨＴ２９細胞および１０％のピューロマイシン耐性ＣＤ形質導入ＨＴ２９細胞の共存培養物を用いる。ハイグロマイシン耐性ＨＴ２９細胞およびピューロマイシン耐性ＣＤ形質導入ＨＴ２９細胞の細胞生存を、処理後、選択培地において細胞をプレーティングすることにより決定し、上に記載の通りの標準的な試験管内腫瘍細胞感受性試験を用いて評価する。
【００５０】
細胞傷害性アッセイ。トランスフェクションされた細胞を、１×１０３細胞／ウェルの密度で１００μｌの培養培地を含んだ９６ウェルマイクロタイタープレート中にまいた。１０ｍｇ／ｍｌの５ＦＣ溶液の無菌ストック希釈物のセットを、調製した。１日後、増大する濃度の５ＦＣをウェルに加え、プロドラッグを含まないコントロールのウェルを含めた。５〜７日後、細胞を新しい培地で洗浄し、そして結果を定量するための血球計数板を用いて、トリパンブルー排除により細胞傷害性を評価した。この結果は、増大した変換率に起因して、細菌と比較して、５ＦＣの単位用量あたりで増大した細胞傷害性およびバイスタンダー効果を示す（１０倍まで）ことが予想される。同様に、ＣＤ−ＦＵＲ１融合タンパク質において、上昇した活性が予想される。Ｃ．ｋｅｆｙｒのタンパク質が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質とどのように匹敵するかということは公知ではないが、このタンパク質が、５ＦＣについて、細菌のＣＤタンパク質よりも２２倍低いＫｍおよび４倍高いＶｍａｘを有することは公知である。従って、その活性は、一度アッセイがＣ．ｋｅｆｙｒに最適化されると、Ｃ．ｋｅｆｙｒにおいてほぼ等しいかまたは多分いくらか上昇することが予想される。
【００５１】
（実施例５：抗体）
この表中に記載されたペプチドフラグメントを、合成し、ウサギに注入するために用いる。ポリクローナル抗体を、そこから調製し、活性についてスクリーニングする。最もよいサンプルを、モノクローナル抗体を調製するために選択する。
【００５２】
【表５】
今までに、本発明者らは、標準的技法に従って、そのタンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端に由来するペプチドに対するポリクローナル抗体を調製している。そのペプチドは、Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ（配列番号２３）およびＣｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（配列番号２４）であった。各々について、モノクローナル抗体を単離するための研究が、計画される。
【００５３】
（実施例６：改変体）
表２に記載された特異的改変体を、配列番号１または配列番号３の部位特異的変異誘発により、合成する。しかし、さらなる改変体を作製し得、図５または図６において黒いボックスで示された保存された残基は、不活性の変異体を所望しない場合を除き、変化しないことが示唆される。さらに、チミジンおよびデオキシシチジル酸デアミナーゼの亜鉛結合領域（灰色のボックス）内の変化もまた、この領域の外側の変化よりも耐えられないと予想される。Ｃ．ｋｅｆｙｒのＣＤにとって重要であり得た残基を、図６において太字で示す。これらの残基は、最も近いホモログと比較して、荷電における変化を含み、結合領域中に存在する。これらの残基における変化は、機能を変化させることが予想される。活性な改変体は、２つの酵母において保存されていない残基において（特に、結合領域の外側の残基）、保存的変化を含む改変体である可能性がある。
【００５４】
改変体を、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、実施例３に記載のアッセイ、または任意の適切なアッセイを用いて、活性についてスクリーニングする。あるいは、ランダム突然変異誘発を行い、その生成物を同様にスクリーニングする。このようにして、３７℃における改善された温度安定性を有する改変体を単離すること、および本明細書に記載の活性よりもさらによい活性を有する変異体を単離することは、可能である。
【００５５】
天然に存在する改変体を、高ストリンジェンシーにおいて、配列番号１または配列番号３のｃＤＮＡでＣａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒの集団をスクリーニングすることにより、単離する。あるいは、天然の対立遺伝子は、配列番号１または配列番号３の完全な範囲を提供する、重複するオリゴヌクレオチドのアレイを用いたＡＳＯ（対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド）スクリーニングにより単離され得る。さらなる第３の代替において、より高い活性の変異体は、ピリミジン源としてシトシンで増殖する酵母のＣＤ変異体のレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）スクリーニングにより、単離され得る。
【００５６】
（実施例７：ＣＤ−ＦＵＲ１融合体）
Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子およびウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ＦＵＲ１）の融合タンパク質を、配列番号１０に示す通りに構築する。類似の構築物を、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＤ（ＦＣＹ１）で作製した（１５）。このＦＣＹｌ−ＦＵＲｌ融合体は、５ＦＣの毒性代謝産物５ＦＵおよび５−ＦｄＵＭＰへの直接変換を効率的に触媒する二機能性のキメラタンパク質をコードし、従って、特定のヒト腫瘍細胞の５ＦＵに対する天然の耐性を回避する。予想外に、その融合タンパク質のシトシンデアミナーゼ活性は、野生型よりも１００倍高く、結果として５ＦＣの濃度に対する非常に増大した感受性（１０００倍増大した感受性）となった。さらに、バイスタンダー効果もまた、ＦＣＹ１もしくはＦＵＲ１の単独のどちらか一方または組み合わせよりも、融合タンパク質でより効果的であった。Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ遺伝子は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子と７４％同一性であるので、この遺伝子は、同様に機能すると予想され、そしてこのことを確認するために実験を行う。
【００５７】
多様式治療の別の型は、複製の条件的な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ）単純疱疹ウイルス１変異体で達成され得る。このウイルスのリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子は、酵母のシトシンデアミナーゼをコードする配列により分断されている。ＨＳＶｌｙＣＤ感染細胞は、ウイルス複製および腫瘍崩壊を顕著に減少させることなしに、５ＦＣを５ＦＵに変換する。ＨＳＶｌｙＣＤ感染細胞は、ウイルス複製により破壊され、そして非感染細胞は、子孫ビリオンおよび５ＦＵの細胞外拡散の両方からのバイスタンダー殺傷を受ける。これは、抗腫瘍効果を増大させることが示されている（１８）。
【００５８】
（実施例８：ＣＤ−モノクローナル抗体融合体）
ＣＤは、モノクローナル抗体に対して共有結合し得、腫瘍細胞表面上の抗原に対して結合する結合体を形成し、従って、ＣＤを特異的細胞型に対して標的化する。本実験を、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＣＤを用いて行い、この組み合わせは、抗体の標的について特異的であった（５）。類似の効果は、ＣＤ−モノクローナル抗体融合タンパク質の発現によって達成され得る。
【００５９】
（実施例９：自殺遺伝子治療）
インビボにおける予備的な自殺遺伝子治療の結果は、ヌードマウスの腫瘍モデルを用いて得られる。ヒト結腸ガン細胞株ＨＴ２９を、１０％の熱不活化子ウシ血清、２ｍＭグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ中で増殖させる。細菌のＣＤ遺伝子または種々の酵母のＣＤ遺伝子（ヒト化Ｃ．ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子を含む）のどちらかを発現する安定なＨＴ２９細胞株は、レトロウイルスベクターＬＺＲ（Ｌａｚａｒｕｓ）またはアデノウイルスに基づく遺伝子―ウイルス（ｇｅｎｅ−ｖｉｒａｌ）ベクターを用いたウイルス感染により作製される（１９）。細胞を、感染２４時間後に再びまいてシングルコロニーを形成させ、その細胞を単離し、そしてＣＤ活性について試験する。ＣＤ陽性クローンを、マウス腫瘍モデルを作製するために用いる。
【００６０】
７〜８週齢のメスのヌードマウス（Ｎｕ／Ｎｕ ＣＤ−１、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）は、上で作製された５×１０６の生存可能なＨＴ２９−ＣＤ細胞を、脇腹に注入（皮下注射）を受ける。腫瘍を、２週間ごとにカリパスで二次元において測定する。腫瘍体積を、次の式を用いて、ｍｍ３単位で計算する：（３．１４／６）（Ｌ×Ｗ２）。腫瘍が、＞５０ｍｍ３であり、かつ１００〜１５０ｍｍ３の平均体積と測定された場合、処置を開始する。マウスは、５００ｍｇ／ｋｇの５ＦＣまたは２５ｍｇ／ｋｇの５ＦＵを、２週間の間、週に５日、毎日注入（腹腔内）を受ける。処置の間での効力における差異を、測定する。
【００６１】
自殺遺伝子治療は、いくつかの第Ｉ相臨床試験および第ＩＩ相臨床試験において、既に試験されており、安全性および適度な効力の両方が示されている。しかし、トランスフェクション効率および遺伝子発現の両方の改善の余地がある。５ＦＣを５ＦＵに変換するより活性のある酵素をコードする遺伝子の使用は、自殺遺伝子治療における利益を提供し、より低い用量の５ＦＣの使用を可能にすることが予想される。新規のＣ．ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子での臨床的な実験は、しばらくの間行われない。暫定的に、反応条件をＣ．ｋｅｆｙｒ ＣＤタンパク質に最適化するための研究が現在行われており、細胞傷害性アッセイおよび上に記載のヌードマウスの異種移植腫瘍モデル（ｘｅｎｏｇｒａｐｈｉｃ ｔｕｍｏｒ ｍｏｄｅｌ）において、その細胞傷害性が確認される。Ｃ．ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子は、確立された細菌の遺伝子を超える利益を提供し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ遺伝子を超える改善物であると証明され得ることが予想される。
【００６２】
（実施例１１：腫瘍応答モニタリング）
Ｃ．ｋｅｆｙｒ ＣＤ遺伝子またはその改変体は、インビトロにおける自殺遺伝子治療に対する個々の腫瘍細胞の反応を試験するために、用いられ得る。候補の腫瘍細胞は、上のようにトランスフェクトされ、治療に対するそれらの応答性を、インビトロまたはマウス腫瘍モデルのどちらかにおいてアッセイする。腫瘍細胞は、確立された腫瘍細胞株または個体から生検された腫瘍細胞であり得る。このようにして、ＣＫ遺伝子を用いた自殺遺伝子治療から利益を受ける可能性の最も高い腫瘍を、同定し得る。
【００６３】
引用：すべての引用文献は、これによって明白に参考として援用され、便宜上ここに再記載される。
１．Ｆｅｒｔｉｌ Ｂら、Ｒａｄｉａｔ．Ｒｅｓ．（１９８４）９９：８３−９３．
２．Ｄｉ Ｖｉｔｏ Ｍら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．（１９８６）２９（２）：３０３−８．
３．Ｌａｗｒｅｎｃｅ ＴＳ、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９８８）４８：７２５−７３０．
４．Ｈｕｂｅｒ ＢＥら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１９９１）８８：８０３９−８０４３．
５．Ｓｅｎｔｅｒ ＰＤら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２（６）：４４７−５１．
６．Ｆｒｅｅｍａｎ ＳＭら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９３）５３：５２７４−５２８３．
７．Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９４）２２：４６７３−８０．
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９．Ｅｒｂｓ Ｐら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９７）３１（１）：１−６
１０．Ｈａｙｄｅｎ ＭＳら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．（１９９８）１２（２）：１７３−８４．
１１．ＷＯ９９６０００８Ａ１：ＣＹＴＯＳＩＮＥ ＤＥＡＭＩＮＡＳＥ ＧＥＮＥ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ由来）．
１２．Ｂｌｏｍ Ｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２９４（５）：１３５１−１３６２．
１３．Ｈａｍｓｔｒａ ＤＡら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．（１９９９）１０（１２）：１９９３−２００３．
１４．Ｔａｔｕｓｏｖａ ＴＡおよびＭａｄｄｅｎ ＴＬ、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４：２４７−２５０．
１５．Ｅｒｂｓ Ｐら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０００）６０（１４）：３８１３−２２．
１６．Ｋｉｅｖｉｔ Ｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９，１４１７−１４２１、１９９９年４月１日
１７．Ｍａｒｔｉｎｏ Ｒら、Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．２０００年１１月；１（３）：２７１−３０３．
１８．Ｎａｋａｍｕｒａ Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１年７月１５日；６１（１４）：５４４７−５２．
１９．Ｑｉａｎ Ｑら、Ｃｈｉｎ Ｍｅｄ Ｊ（Ｅｎｇｌ）２００２年８月；１１５（８）：１２１３−１２１７；１３：Ｇａｎｌｙ Ｉら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００年３月；６（３）：７９８−８０６．
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのｃＤＮＡ配列（配列番号１）。このｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅によりクローニングされた。そのＰＣＲには、先行技術の真菌の配列の間で保存された配列部分に由来したプライマーを用いた。
【図２】Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）。このアミノ酸配列は、ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に由来した。
【図３】改変体Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのｃＤＮＡ配列（７４Ｃ→Ｔ、９９Ｔ→Ｃ、１５９Ｔ→Ａ、２４３Ｔ→Ｃ、３０９Ｃ→Ｔ、３３６Ａ→Ｇ、３６５Ａ→Ｇである（配列番号３））。この改変体ＣＤタンパク質は、以前に記載されたシステムを用いて増幅された異なったクローンから得られた。
【図４】改変体Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼのアミノ酸配列Ｄ３３Ｅ（配列番号４）。このアミノ酸配列は、図３におけるｃＤＮＡのヌクレオチド配列に由来した。
【図５】Ｃａｎｄｉｄａ ｋｅｆｙｒ（配列番号２）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号５）、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（配列番号６）およびＣＤコンセンサス配列を用いたＣＤ複数配列の整列。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０１５３８７号から得られた。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ配列はＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＣ１５７８２号から得られた。コンセンサス配列は、タンパク質ドメインのＰｆａｍデータベースおよびＨＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）登録番号ＰＦ００３８３号から得られた。ＦＡＳＴＡ形式における配列は、Ｈｉｇｇｉｎｓ（７）に従ってデフォルトパラメーター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ）を用いて整列された。２００２年６月２０現在のデフォルトの設定は以下であった：ＣＰＵモード＝ｃｌｕｓｔａｌｗ＿ｍｐ；整列＝完全（ｆｕｌｌ）；出力形式＝ａｌｎ ｗ／数；出力順序＝整列順；有色整列（ｃｏｌｏｒ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）＝なし；ＫＴＵＰ＝ｄｅｆ；ウィンドウの長さ（ｗｉｎｄｏｗ ｌｅｎｇｔｈ）＝ｄｅｆ；スコア＝パーセント；トップダイアゴ（ｔｏｐｄｉａｇ）＝ｄｅｆ；ペアギャップ（ｐａｉｒｇａｐ）＝ｄｅｆ；系統樹＝なし（オフ、オフ）；マトリックス＝ｄｅｆ；ギャップオープン（ｇａｐ ｏｐｅｎ）＝ｄｅｆ；末端ギャップ＝ｄｅｆ；ギャップ拡張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）＝ｄｅｆ；ギャップ距離（ｄｉｓｔａｎｃｅ）＝ｄｅｆ；系統樹の型（ｔｒｅｅ ｔｙｐｅ）＝分岐図；系統樹のギャップ距離＝非表示。
【図６】Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ配列との対での（ｐａｉｒｗｉｓｅ）整列。配列は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／において整列された。
【図７】抗ＦＬＡＧを用いたウエスタンブロット。抗ＦＬＡＧ抗体は、ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧおよびＥ−ＣＤ−ＦＬＡＧを含むＣＤ構築物の発現を確認するために用いられる。この細菌のタンパク質は、酵母のタンパク質よりもずっと強く発現する。
【図８】ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧおよびＥ−ＣＤ−ＦＬＡＧの力価測定。抗ＦＬＡＧ抗体を用いるウエスタンブロットにより試験したところ、３０μｌのＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧ溶解産物は、３μｌのＥ−ＣＤ−ＦＬＡＧ溶解産物とほぼ等しい。このことは、ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧタンパク質が、Ｅ−ＣＤ−ＦＬＡＧよりも約１０倍少なく発現されることを示唆する。しかし、コントロール実験（共トランスフェクトしたＧＦＰ含有ベクターを有する、データは示さず）は、おおよそ等しいトランスフェクション効率を示す。
【図９】シトシンからウラシルへのアッセイ。等しい量の細胞溶解産物は、シトシンからウラシルへの変換について３７℃においての１６時間のアッセイにおいてアッセイされる。ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧ、ＣＫ−ＣＤ、Ｅ−ＣＤ−ＦＬＡＧ、およびＥ−ＣＤの活性が示され、ＦＬＡＧタグなしのＣＫ−ＣＤは、ＦＬＡＧ付きのタンパク質よりもずっと活性が高いことは明らかである。このことは、増大した発現もしくは上昇した活性またはそれらの何らかの組み合わせを表し得る。
【図１０】異なった温度における５ＦＣから５ＦＵへのアッセイ。等しい量の細胞溶解産物は、シトシンからウラシルへの変換について３７℃においての２時間のアッセイにおいて、指示された温度においてアッセイされる。ＣＫ−ＣＤは、ＣＫ−ＣＤ−ＦＬＡＧよりもずっと活性が高く、そして、このことは、よりよい発現、よりよい活性または両方を反映し得る。タグ化された酵母ＣＤおよびタグ化されていない酵母ＣＤの両方は、５ＦＣに対して細菌のタンパク質よりもより活性が高い。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸であって、配列番号２のＣ．Ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼをコードする配列を含む、核酸。
【請求項２】
前記核酸が、ｃＤＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記核酸が、配列番号１（野生型ＣＤ ｃＤＮＡ）を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記核酸が、配列番号７（Ｅ．ｃｏｌｉバイアスＣＤ ｃＤＮＡ）を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸が、配列番号８（ヒト化ＣＤ ｃＤＮＡ）を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項６】
前記核酸が、配列番号９（ヒト化されておりかつＣｐＧを含まないＣＤ ｃＤＮＡ）を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項７】
前記核酸が、配列番号１０（ＣＤ−ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合体）を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項８】
前記核酸が、ヒト細胞における発現に最適化されている、請求項２に記載の核酸。
【請求項９】
前記核酸が、細菌細胞における発現に最適化されている、請求項２に記載の核酸。
【請求項１０】
前記核酸が、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする核酸およびプロモーターに作動可能に融合されている、請求項２に記載の核酸。
【請求項１１】
単離された核酸であって、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４８６７における挿入物の配列を含む、核酸。
【請求項１２】
単離された核酸であって、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４８６７における挿入物の配列を含むタンパク質をコードする、核酸。
【請求項１３】
単離された核酸であって、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４８６７における挿入物の配列からなるタンパク質をコードする、核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸を含むベクターであって、該核酸が、プロモーターに作動可能に連結している、ベクター。
【請求項１５】
前記作動可能に連結しているプロモーターが、ヒト組織における組織特異的発現を可能にする、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記作動可能に連結しているプロモーターが、ヒトガン組織における優先的発現を可能にする、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１７】
単離された核酸であって、該核酸は、配列番号２のＣ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼの抗原性フラグメントをコードし、該フラグメントは、長さが少なくとも１７アミノ酸でかつ長さが１５２アミノ酸未満の配列を含む、核酸。
【請求項１８】
前記フラグメントが、Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼに特有である、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
前記フラグメントが、少なくとも１つの他の真菌類のシトシンデアミナーゼにおいて保存される、請求項１７に記載の核酸。
【請求項２０】
単離された核酸であって、表２に記載のようなＣ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼの改変体をコードする、核酸。
【請求項２１】
単離された核酸であって、配列番号２の全長にわたって配列番号２と少なくとも９４％の同一性を有する、Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼの天然に存在する改変体をコードする、核酸。
【請求項２２】
単離された核酸であって、配列番号２の全長にわたって少なくとも９４％の同一性を有するタンパク質をコードする配列を含む、核酸。
【請求項２３】
単離されたタンパク質であって、配列番号２の全長にわたって少なくとも９４％の同一性を有する配列を含む、タンパク質。
【請求項２４】
前記配列が、少なくとも９５％の同一性を有する、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
前記配列が、少なくとも９８％の同一性を有する、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２６】
配列番号２を含む、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２７】
配列番号２からなる、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２８】
単離されたタンパク質であって、表２に記載の通りのＣ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼの改変体を含む、タンパク質。
【請求項２９】
実質的に精製された、請求項２３〜２８に記載のタンパク質。
【請求項３０】
精製された、請求項２３〜２８に記載のタンパク質。
【請求項３１】
配列番号２の抗原性フラグメントに特異的に結合する、抗体。
【請求項３２】
Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼタンパク質を生成する方法であって、栄養培地中で請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞を増殖させる工程および発現したＣ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼタンパク質を収集する工程、を包含する、方法。
【請求項３３】
単離されたオリゴヌクレオチドであって、長さが少なくとも２２ヌクレオチドであり、配列番号１由来の少なくとも２２個連続したヌクレオチドの配列を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
単離された核酸であって、長さが少なくとも１００ヌクレオチドであり、配列番号１由来の少なくとも１００個連続したヌクレオチドの配列を有する、核酸。
【請求項３５】
単離されたオリゴヌクレオチドであって、長さが少なくとも２２ヌクレオチドであり、配列番号３由来の少なくとも２２個連続したヌクレオチドの配列を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
単離された核酸であって、長さが少なくとも１００ヌクレオチドであり、配列番号３由来の少なくとも１００個連続したヌクレオチドの配列を有する、核酸。
【請求項１】
単離された核酸であって、配列番号２のＣ．Ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼをコードする配列を含む、核酸。
【請求項２】
前記核酸が、ｃＤＮＡである、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記核酸が、配列番号１（野生型ＣＤ ｃＤＮＡ）を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記核酸が、配列番号７（Ｅ．ｃｏｌｉバイアスＣＤ ｃＤＮＡ）を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項５】
前記核酸が、配列番号８（ヒト化ＣＤ ｃＤＮＡ）を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項６】
前記核酸が、配列番号９（ヒト化されておりかつＣｐＧを含まないＣＤ ｃＤＮＡ）を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項７】
前記核酸が、配列番号１０（ＣＤ−ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ融合体）を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項８】
前記核酸が、ヒト細胞における発現に最適化されている、請求項２に記載の核酸。
【請求項９】
前記核酸が、細菌細胞における発現に最適化されている、請求項２に記載の核酸。
【請求項１０】
前記核酸が、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする核酸およびプロモーターに作動可能に融合されている、請求項２に記載の核酸。
【請求項１１】
単離された核酸であって、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４８６７における挿入物の配列を含む、核酸。
【請求項１２】
単離された核酸であって、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４８６７における挿入物の配列を含むタンパク質をコードする、核酸。
【請求項１３】
単離された核酸であって、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４８６７における挿入物の配列からなるタンパク質をコードする、核酸。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸を含むベクターであって、該核酸が、プロモーターに作動可能に連結している、ベクター。
【請求項１５】
前記作動可能に連結しているプロモーターが、ヒト組織における組織特異的発現を可能にする、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
前記作動可能に連結しているプロモーターが、ヒトガン組織における優先的発現を可能にする、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１７】
単離された核酸であって、該核酸は、配列番号２のＣ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼの抗原性フラグメントをコードし、該フラグメントは、長さが少なくとも１７アミノ酸でかつ長さが１５２アミノ酸未満の配列を含む、核酸。
【請求項１８】
前記フラグメントが、Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼに特有である、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
前記フラグメントが、少なくとも１つの他の真菌類のシトシンデアミナーゼにおいて保存される、請求項１７に記載の核酸。
【請求項２０】
単離された核酸であって、表２に記載のようなＣ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼの改変体をコードする、核酸。
【請求項２１】
単離された核酸であって、配列番号２の全長にわたって配列番号２と少なくとも９４％の同一性を有する、Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼの天然に存在する改変体をコードする、核酸。
【請求項２２】
単離された核酸であって、配列番号２の全長にわたって少なくとも９４％の同一性を有するタンパク質をコードする配列を含む、核酸。
【請求項２３】
単離されたタンパク質であって、配列番号２の全長にわたって少なくとも９４％の同一性を有する配列を含む、タンパク質。
【請求項２４】
前記配列が、少なくとも９５％の同一性を有する、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２５】
前記配列が、少なくとも９８％の同一性を有する、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２６】
配列番号２を含む、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２７】
配列番号２からなる、請求項２３に記載のタンパク質。
【請求項２８】
単離されたタンパク質であって、表２に記載の通りのＣ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼの改変体を含む、タンパク質。
【請求項２９】
実質的に精製された、請求項２３〜２８に記載のタンパク質。
【請求項３０】
精製された、請求項２３〜２８に記載のタンパク質。
【請求項３１】
配列番号２の抗原性フラグメントに特異的に結合する、抗体。
【請求項３２】
Ｃ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼタンパク質を生成する方法であって、栄養培地中で請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞を増殖させる工程および発現したＣ．ｋｅｆｙｒシトシンデアミナーゼタンパク質を収集する工程、を包含する、方法。
【請求項３３】
単離されたオリゴヌクレオチドであって、長さが少なくとも２２ヌクレオチドであり、配列番号１由来の少なくとも２２個連続したヌクレオチドの配列を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
単離された核酸であって、長さが少なくとも１００ヌクレオチドであり、配列番号１由来の少なくとも１００個連続したヌクレオチドの配列を有する、核酸。
【請求項３５】
単離されたオリゴヌクレオチドであって、長さが少なくとも２２ヌクレオチドであり、配列番号３由来の少なくとも２２個連続したヌクレオチドの配列を有する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
単離された核酸であって、長さが少なくとも１００ヌクレオチドであり、配列番号３由来の少なくとも１００個連続したヌクレオチドの配列を有する、核酸。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００６−５１７３９４（Ｐ２００６−５１７３９４Ａ）
【公表日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５６５６５２（Ｐ２００４−５６５６５２）
【出願日】平成１５年１２月２３日（２００３．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４１０３７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１０７９
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【出願人】（５００１３２８８９）オニックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年７月２７日（２００６．７．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１２月２３日（２００３．１２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０４１０３７
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６１０７９
【国際公開日】平成１６年７月２２日（２００４．７．２２）
【出願人】（５００１３２８８９）オニックス ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド (5)
【Ｆターム（参考）】
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