DNA重合プロセスにより生成される全ゲノムおよび全トランスクリプトームライブラリーの増幅および分析
本発明は、全ゲノムまたは全トランスクリプトームの増幅のための、種々の方法および組成物に関する。本発明の特定の実施形態において、ゲノムライブラリを増幅する方法が存在し、この方法は、ゲノムライブラリー作製工程後に、ライブラリー増幅工程を包含する。特定の実施形態において、そのライブラリー生成工程は、特定のプライマー混合物およびDNAポリメラーゼを利用する。ここで、その特定のプライマー混合物は、自己に対するハイブリダイゼーション、およびその混合物中の他のプライマーに対するハイブリダイゼーションを行う能力が取り除かれるが、効率的かつ頻繁に核酸テンプレートをプライミングするように設計されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸分子を調製する方法であって、以下:
少なくとも1つの核酸分子を取得する工程;
複数のプライマーに対して該核酸分子を供して核酸分子/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが、実質的に自己非相補的でありそして該複数の中のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;ならびに
該核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に定常領域の全てまたは一部を含む複数の分子を生成する条件下である、工程、
を包含する、方法。
【請求項2】
前記核酸分子が一本鎖核酸分子である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記一本鎖核酸分子がDNA、RNA、またはDNA−RNAキメラである、請求項2に記載の方法。
【請求項4】
前記核酸分子が二本鎖核酸分子である、請求項1に記載の方法。
【請求項5】
前記二本鎖核酸分子がDNA、RNA、またはDNA−RNAキメラである、請求項4に記載の方法。
【請求項6】
前記核酸分子が一本鎖核酸分子および二本鎖核酸分子の混合物である、請求項1に記載の方法。
【請求項7】
前記一本鎖核酸分子がRNAでありそして前記二本鎖核酸分子がDNAである、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
複数のプライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的であることを意図して、該複数のプライマーを設計する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項9】
前記方法が、定常領域の全てまたは一部を含む複数の分子を増幅して、増幅された分子を生成する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項10】
前記増幅する工程がポリメラーゼ連鎖反応を包含する、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、同一の2つの非相補的なヌクレオチドからなる、請求項1に記載の方法。
【請求項12】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、グアニン、アデニンまたはその両方からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、シトシン、チミジンまたはその両方からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項14】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、アデニン、シトシンまたはその両方からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項15】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、グアニン、チミジンまたはその両方からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項16】
前記定常領域が約6〜約100ヌクレオチドを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項17】
前記可変領域が約4ヌクレオチド〜約20ヌクレオチドを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項18】
前記プライマーがさらに、その遠位3’末端の0〜約3個のランダムな塩基からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項19】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、グアニンおよびチミジンからなり、そして前記ポリヌクレオチドが遠位3’末端に0個、1個、2個または3個のランダムな塩基を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項20】
前記ヌクレオチドが塩基アナログまたは骨格アナログである、請求項11に記載の方法。
【請求項21】
前記ポリメラーゼが鎖交換性ポリメラーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項22】
請求項21に記載の方法であって、ここで、前記鎖交換性ポリメラーゼが、φ29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、9°Nmポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、Tth DNAポリメラーゼ、ヒトHIV逆転写酵素、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型T7ファージDNAポリメラーゼ、またはこれらの混合物である、方法。
【請求項23】
前記鎖交換性ポリメラーゼがクレノウ Exo−である、請求項22に記載の方法。
【請求項24】
前記鎖交換性ポリメラーゼが3’−−>5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型T7ファージDNAポリメラーゼである、請求項22に記載の方法。
【請求項25】
前記鎖交換性ポリメラーゼがMMLV逆転写酵素である、請求項22に記載の方法。
【請求項26】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物を、ポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項27】
前記化合物が一本鎖化DNA結合性タンパク質またはヘリカーゼである、請求項26に記載の方法。
【請求項28】
前記混合物をポリメラーゼに供する工程が、GC−リッチなDNAおよび/またはRNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項1に記載の方法。
【請求項29】
前記薬剤がジメチルスルホキシド(DMSO)、7−デアザ−dGTP、またはそれらの混合物を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項30】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項9に記載の方法。
【請求項31】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項32】
前記複数のプライマーの各々が同一の定常領域を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項33】
2つ以上の定常領域が複数のプライマーの混合物中に示される、請求項1に記載の方法。
【請求項34】
請求項9に記載の方法であって、ここで前記方法が以下の工程:
増幅された分子を修飾して修飾ヌクレオチド塩基を組み込み、これによって標識化分子を生成する工程であって、該増幅された分子がさらに一本鎖DNA分子、二本鎖DNA分子、またはそれらの混合物として規定される、工程;
該標識化分子から一本鎖分子を生成する工程であって、該一本鎖分子が基材上の既知の位置に整列された相補的配列にハイブリダイズし得る、工程;および
少なくとも1つのハイブリダイゼーション信号を分析する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項35】
前記修飾する工程が修飾ヌクレオチド塩基の化学的組み込み、酵素的組み込みまたは物理的組み込みを包含する、請求項34に記載の方法。
【請求項36】
前記修飾塩基が放射性または蛍光性である、請求項34に記載の方法。
【請求項37】
前記生成する工程が、前記二本鎖分子の変性を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項38】
前記基材がマイクロアレイ基材を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項39】
前記分析する工程が、少なくとも1つのハイブリダイゼーション信号のバックグラウンドを差し引いた強度を測定する工程を包含する、請求項34に記載の方法。
【請求項40】
前記分析する工程が、増幅されたライブラリーのコピー数、代表物またはその両方の測定を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項41】
前記増幅された分子の末端にタグが取り込まれ、そして該増幅された分子の各々の末端の該タグに対して前記定常領域が末端から2番目である、請求項9に記載の方法。
【請求項42】
前記タグがホモポリマー性配列である、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
前記ホモポリマー性配列がポリシステイン(ポリC)またはポリグアニン(ポリG)を含む、請求項42に記載の方法。
【請求項44】
ホモポリマー性ポリGの組み込みが末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項45】
ホモポリマー性のポリGまたはポリCの組み込みが、前記増幅された分子の末端に対する、該ホモポリマー性のポリGまたはポリCを含むアダプターのライゲーションを含む、請求項43に記載の方法。
【請求項46】
ホモポリマー性ポリCの組み込みがDNAポリメラーゼを用いて増幅された分子を複製する工程を包含し、該複製する工程が5’から3’方向において:
ホモポリマー性ポリC;および
定常領域
を含むプライマーを利用する、請求項43に記載の方法。
【請求項47】
ホモポリマー性ポリCを含む増幅された分子が、核酸分子中の所望の配列およびポリCに対して相補的なプライマーを使用してさらに増幅される、請求項43に記載の方法。
【請求項48】
少なくともいくつかの増幅されたDNAが、配列決定、ハイブリダイゼーションまたはその両方にさらに供される、請求項47に記載の方法。
【請求項49】
ホモポリマー性配列ポリCを含む増幅された分子が、核酸分子中の異なる所望の配列およびポリCプライマーに対して相補的であるプライマーの混合物を用いてさらに増幅される、請求項43に記載の方法。
【請求項50】
いくつかの増幅された所望のDNA分子の混合物が、配列決定、ハイブリダイゼーションまたはその両方にさらに供される、請求項49に記載の方法。
【請求項51】
DNA分子を増幅する方法であって、以下:
少なくとも1つの二本鎖DNA分子または一本鎖DNA分子を取得する工程;
該二本鎖DNA分子を加熱に供して、少なくとも1つの一本鎖DNA分子を生成する工程;
該一本鎖DNA分子を複数のプライマーに供してDNA分子/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該DNA分子/プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して該複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
を包含する、方法。
【請求項52】
前記DNA分子がゲノムDNAを含むようにさらに規定される、請求項51に記載の方法。
【請求項53】
前記DNA分子がヒトサンプルから取得される、請求項51に記載の方法。
【請求項54】
前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項55】
前記サンプルが生検材料を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項56】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項57】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項58】
前記ポリメラーゼが鎖交換性ポリメラーゼである、請求項51に記載の方法。
【請求項59】
請求項58に記載の方法であって、ここで、前記鎖交換性ポリメラーゼが、φ29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、9oNmポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、Tth DNAポリメラーゼ、ヒトHIV逆転写酵素、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型T7ファージDNAポリメラーゼ、またはこれらの混合物である、方法。
【請求項60】
前記鎖交換性ポリメラーゼがクレノウ Exo−である、請求項59に記載の方法。
【請求項61】
前記鎖交換性ポリメラーゼが3’−−>5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型T7ファージDNAポリメラーゼである、請求項59に記載の方法。
【請求項62】
前記鎖交換性ポリメラーゼがMMLV逆転写酵素である、請求項59に記載の方法。
【請求項63】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物を、ポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項51に記載の方法。
【請求項64】
前記化合物が一本鎖DNA分子結合タンパク質またはヘリカーゼである、請求項63に記載の方法。
【請求項65】
前記ポリメラーゼに供する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進することが公知の添加物の存在下で起こる、請求項51に記載の方法。
【請求項66】
前記添加物がDMSO、7−デアザ−dGTP、またはそれらの混合物を含む、請求項65に記載の方法。
【請求項67】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項51に記載の方法。
【請求項68】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項67に記載の方法。
【請求項69】
前記サンプルから調製された核酸分子がゲノムのコピー数情報を提供する、請求項53に記載の方法。
【請求項70】
前記サンプルから調製された核酸分子がゲノム配列情報を提供する、請求項53に記載の方法。
【請求項71】
前記サンプルから調製された核酸分子が対立遺伝子の多様性の情報を提供する、請求項53に記載の方法。
【請求項72】
前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項53に記載の方法。
【請求項73】
前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項53に記載の方法。
【請求項74】
RNA分子を増幅する方法であって、以下:
少なくとも1つのRNA分子を取得する工程;
必要に応じて、分子を加熱して、少なくとも1つの一本鎖RNA分子を生成する工程;
一本鎖RNA分子を複数のプライマーに供して、RNA分子/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該RNA分子/プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して該複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
を包含する、方法。
【請求項75】
前記RNA分子がサンプルから取得される、請求項74に記載の方法。
【請求項76】
前記サンプルが全細胞内RNA、トランスクリプトームまたはその両方を含む、請求項75に記載の方法。
【請求項77】
前記サンプルが1つ以上のウイルスから取得される、請求項75に記載の方法。
【請求項78】
前記サンプルが1つ以上の細菌から取得される、請求項75に記載の方法。
【請求項79】
前記サンプルが動物細胞、細菌および/またはウイルスの混合物から取得される、請求項75に記載の方法。
【請求項80】
前記サンプルがヒトから取得される、請求項75に記載の方法。
【請求項81】
前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、請求項80に記載の方法。
【請求項82】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項80に記載の方法。
【請求項83】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項80に記載の方法。
【請求項84】
前記サンプルがmRNAを含む、請求項80に記載の方法。
【請求項85】
前記mRNAが親和性捕捉によって取得される、請求項84に記載の方法。
【請求項86】
前記ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項74に記載の方法。
【請求項87】
前記逆転写酵素が、Tth DNAポリメラーゼ、AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、またはこれらの混合物である、請求項86に記載の方法。
【請求項88】
前記逆転写酵素がMMLV逆転写酵素である、請求項86に記載の方法。
【請求項89】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項74に記載の方法。
【請求項90】
前記化合物が一本鎖DNA結合性タンパク質もしくは一本鎖化RNA分子結合性タンパク質またはヘリカーゼである、請求項89に記載の方法。
【請求項91】
前記ポリメラーゼに混合物を供する工程が、GC−リッチなRNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項74に記載の方法。
【請求項92】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、またはそれらの混合物を含む、請求項91に記載の方法。
【請求項93】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項74に記載の方法。
【請求項94】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項95】
前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子発現情報を提供する、請求項80に記載の方法。
【請求項96】
前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子配列情報を提供する、請求項80に記載の方法。
【請求項97】
前記サンプルから調製された核酸分子がエクソン対立遺伝子の多様性の情報を提供する、請求項80に記載の方法。
【請求項98】
前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項80に記載の方法。
【請求項99】
前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項80に記載の方法。
【請求項100】
少なくとも1つのmRNA分子から生成されたDNA分子を増幅する方法であって、以下:
該mRNA分子からcDNA分子を取得する工程;
cDNA分子を改変して、少なくとも1つのssDNA分子を生成する工程;
該ssDNA分子を複数のプライマーに供してssDNA分子/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該ssDNA分子/プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
を包含する、方法。
【請求項101】
前記mRNAがヒトサンプルから取得される、請求項100に記載の方法。
【請求項102】
前記ヒトサンプルが生検材料を含む、請求項101に記載の方法。
【請求項103】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項101に記載の方法。
【請求項104】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項101に記載の方法。
【請求項105】
前記取得する工程が、逆転写酵素を用いてmRNA分子を逆転写することによるcDNA分子の生成を含むようさらに規定される、請求項100に記載の方法。
【請求項106】
前記逆転写酵素が、Tth DNAポリメラーゼ、AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素、ヒトHIV逆転写酵素、またはこれらの混合物である、請求項105に記載の方法。
【請求項107】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項100に記載の方法。
【請求項108】
前記化合物が一本鎖DNA分子結合タンパク質、ヘリカーゼまたはそれらの混合物である、請求項107に記載の方法。
【請求項109】
前記ポリメラーゼに混合物を供する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項100に記載の方法。
【請求項110】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、またはそれらの混合物を含む、請求項109に記載の方法。
【請求項111】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する薬剤の存在下で起こる、請求項100に記載の方法。
【請求項112】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項111に記載の方法。
【請求項113】
前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子発現情報を提供する、請求項101に記載の方法。
【請求項114】
前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子配列情報を提供する、請求項101に記載の方法。
【請求項115】
前記サンプルから調製された核酸分子がエクソン対立遺伝子の多様性の情報を提供する、請求項101に記載の方法。
【請求項116】
前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項101に記載の方法。
【請求項117】
前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項101に記載の方法。
【請求項118】
DNAおよびRNAの混合物を含むサンプルから総ての核酸を取得する方法であって、以下:
DNAおよびRNAの混合物を提供する工程;
必要に応じて、二本鎖核酸を変性させる温度に該混合物を加熱する工程;ならびに
一本鎖DNAおよび一本鎖RNAの両方を複製するポリメラーゼに該混合物を供する工程
を包含する、方法。
【請求項119】
前記方法が本質的に、前記提供する工程、必要に応じて加熱する工程、および供する工程からなる、請求項118に記載の方法。
【請求項120】
請求項118に記載の方法であって、ここで前記供する工程が、以下:
前記混合物を複数のプライマーに供して核酸/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該核酸/プライマー混合物をDNAおよびRNAの両方を効率的に複製するポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に一定の核酸配列を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
としてさらに規定される、方法。
【請求項121】
前記ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項118に記載の方法。
【請求項122】
前記逆転写酵素が、Tth DNAポリメラーゼ、AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、またはこれらの混合物である、請求項121に記載の方法。
【請求項123】
前記逆転写酵素がMMLV逆転写酵素である、請求項122に記載の方法。
【請求項124】
前記サンプルがヒト由来である、請求項118に記載の方法。
【請求項125】
前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、請求項124に記載の方法。
【請求項126】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項124に記載の方法。
【請求項127】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項124に記載の方法。
【請求項128】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項118に記載の方法。
【請求項129】
前記化合物が一本鎖DNA分子結合タンパク質またはRNA結合性タンパク質またはヘリカーゼである、請求項128に記載の方法。
【請求項130】
前記ポリメラーゼに混合物を供する工程が、GC−リッチなDNAまたはRNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項120に記載の方法。
【請求項131】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、またはそれらの混合物を含む、請求項130に記載の方法。
【請求項132】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項120に記載の方法。
【請求項133】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項132に記載の方法。
【請求項134】
前記サンプルから調製された核酸分子が核酸配列情報を提供する、請求項124に記載の方法。
【請求項135】
前記サンプルから調製された核酸分子が対立遺伝子の多様性の情報を提供する、請求項124に記載の方法。
【請求項136】
前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項124に記載の方法。
【請求項137】
前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項124に記載の方法。
【請求項138】
DNAおよびRNAの混合物を含むサンプルからDNAまたはRNAをそれぞれ区別して取得する方法であって、以下:
該DNAおよびRNAの混合物を提供する工程;
DNAまたはRNAに選択的に影響する温度に、該混合物を加熱する工程;ならびに
それぞれDNAまたはRNAを選択的に複製するポリメラーゼに該混合物を供する工程
を包含する、方法。
【請求項139】
請求項138に記載の方法であって、前記提供する工程が、以下:
前記混合物を複数のプライマーに供して核酸/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該核酸/プライマー混合物を、それぞれDNAまたはRNAを選択的に複製するポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に既知の核酸配列を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
としてさらに規定される、方法。
【請求項140】
前記サンプルがヒト由来である、請求項138に記載の方法。
【請求項141】
前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、請求項138に記載の方法。
【請求項142】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項138に記載の方法。
【請求項143】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項138に記載の方法。
【請求項144】
DNAおよびRNAを含むサンプルからDNAを区別して取得する方法であって、以下:
DNAおよびRNAの混合物を提供する工程;
少なくとも約94℃〜約100℃の温度に該混合物を加熱して、一本鎖核酸を生成する工程;ならびに
DNAテンプレートのみを複製するポリメラーゼに該混合物を供する工程
を包含する、方法。
【請求項145】
請求項144に記載の方法であって、以下の工程:
前記混合物を複数のプライマーに供して核酸/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該核酸/プライマー混合物を、選択的にDNAを複製するポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に一定の核酸配列を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して各々の末端に該一定の核酸配列を含む複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該一定の核酸配列に対して相補的なプライマーを利用する、工程
をさらに包含する、方法。
【請求項146】
前記ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼである、請求項145に記載の方法。
【請求項147】
請求項146に記載の方法であって、ここで、前記DNA依存性DNAポリメラーゼが、φ29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、9°Nmポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノウ Exo−フラグメント、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型T7ファージDNAポリメラーゼ、またはこれらの混合物である、方法。
【請求項148】
前記ポリメラーゼがDNAポリメラーゼIのクレノウ Exo−フラグメントである、請求項147に記載の方法。
【請求項149】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項145に記載の方法。
【請求項150】
前記化合物が一本鎖DNA分子結合タンパク質またはヘリカーゼである、請求項149に記載の方法。
【請求項151】
前記ポリメラーゼに混合物を供する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項145に記載の方法。
【請求項152】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、またはこれらの混合物を含む、請求項151に記載の方法。
【請求項153】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項145に記載の方法。
【請求項154】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはこれらの混合物を含む、請求項153に記載の方法。
【請求項155】
前記サンプルがヒト由来である、請求項144に記載の方法。
【請求項156】
前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、請求項155に記載の方法。
【請求項157】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項155に記載の方法。
【請求項158】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項155に記載の方法。
【請求項159】
前記サンプルから調製された核酸分子がゲノムのコピー数情報を提供する、請求項155に記載の方法。
【請求項160】
前記サンプルから調製された核酸分子がゲノム配列情報を提供する、請求項155に記載の方法。
【請求項161】
前記サンプルから調製された核酸分子が対立遺伝子の多様性の情報を提供する、請求項155に記載の方法。
【請求項162】
前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項155に記載の方法。
【請求項163】
前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項155に記載の方法。
【請求項164】
dsDNAおよびRNAを含むサンプルからRNAを区別して得る方法であって、該方法は、以下:
該dsDNAおよびRNAの混合物を提供する工程;
dsDNAの変性を防ぐように、該混合物を、約75℃を超えない温度まで必要に応じて加熱する工程;および
該混合物を、一本鎖RNAテンプレートのみを複製するポリメラーゼに供する工程
を包含する、方法。
【請求項165】
請求項164に記載の方法であって、ここで、前記供する工程が、以下:
前記混合物を複数のプライマーに供して核酸/プライマー混合物を形成する工程であって、該プライマーは、実質的に非自己相補的であり、かつ、該複数あるうちの他のプライマーに対して、実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、該配列は、5’→3’方向で、定常領域および可変領域を含む、工程;
該供する工程によって、該定常核酸配列を各々末端に含む複数のDNA分子が生成される条件の下、該核酸/プライマー混合物を、一本鎖RNAのみをプライミングし、かつ、複製するポリメラーゼに供する工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して、各末端の該定常領域を含む該複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応は、該定常領域に相補的なプライマーを利用する、工程
として、さらに規定される、方法。
【請求項166】
請求項165に記載の方法であって、ここで、前記ポリメラーゼが、逆転写酵素である、方法。
【請求項167】
請求項166に記載の方法であって、ここで、前記逆転写酵素は、Tth DNAポリメラーゼ、AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、またはそれらの混合物である、方法。
【請求項168】
請求項166に記載の方法であって、前記逆転写酵素が、MMLV逆転写酵素である、方法。.
【請求項169】
請求項165に記載の方法であって、ここで、該方法は、
前記核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項170】
請求項169に記載の方法であって、ここで、前記化合物が、一本鎖DNA結合タンパク質もしくは一本鎖RNA結合タンパク質、またはヘリカーゼである、方法。
【請求項171】
請求項165に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレアーゼに供する工程が、GCリッチなRNAを介する重合を促進する1以上の薬剤の存在下で生じる、方法。
【請求項172】
請求項171に記載の方法であって、ここで、前記薬剤は、DMSO、7−デアザ−dGTP、またはこれらの混合物を含む、方法。
【請求項173】
請求項165に記載の方法であって、ここで、前記増幅する工程が、GC−リッチDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、方法。
【請求項174】
請求項173に記載の方法であって、前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはこれらの混合物を含む、方法。
【請求項175】
請求項164に記載の方法であって、前記サンプルがヒト由来である、方法。
【請求項176】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、方法。
【請求項177】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、方法。
【請求項178】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルが1つの細胞を含む、方法。
【請求項179】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子発現情報を提供する、方法。
【請求項180】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子配列情報を提供する、方法。
【請求項181】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルから調製された核酸分子がエキソン対立遺伝子バリエーション情報を提供する、方法。
【請求項182】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、方法。
【請求項183】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、方法。
【請求項184】
複数のポリヌクレオチドであって、ここで、該複数であるポリヌクレオチドは、実質的に非自己相補的であり、かつ、該複数のもののうち他のポリヌクレオチドに対して実質的に非相補的である、核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項185】
請求項184に記載の複数のものであって、ここで、前記核酸配列が、前記ポリヌクレオチドを、以下:自己ハイブリダイゼーション:自己プライミング;該複数のものうちの別のポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション;複数の重合反応の開始
のうちの少なくとも1つが実質的に不可能であるものとする
としてさらに定義される、複数のもの。
【請求項186】
請求項184に記載の複数のものであって、ここで、前記ポリヌクレオチドが、5’→3’の方向を有し、可変領域に対して5’側にある定常領域を含むとしてさらに規定される、複数のもの。
【請求項187】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域は、その後の増幅のためのものである、複数のもの。
【請求項188】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記可変領域が、ランダムアニーリング、ランダムプライミングまたはそれらの両方のためのものである、複数のもの。
【請求項189】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域および可変領域は、各々、2つの非相補的ヌクレオチドから構成される、複数のもの。
【請求項190】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域および可変領域は、各々、グアニン、アデニン、または両方から構成される、複数のもの。
【請求項191】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域および可変領域は、各々、シトシン、チミジン、または両方から構成される、複数のもの。
【請求項192】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域および可変領域は、各々、アデニン、シトシンまたは両方から構成される、複数のもの。
【請求項193】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域および可変領域は、各々、グアニン、チミジンまたはその両方から構成される、複数のもの。
【請求項194】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域が、約6〜約100のヌクレオチドを含む、複数のもの。
【請求項195】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記第2の領域は、約4ヌクレオチド〜約20ヌクレオチドを含む、複数のもの。
【請求項196】
請求項186に記載の複数のものであって、前記ポリヌクレオチドが、その遠位の3’末端の約0個〜約3個のランダムな塩基からさらに構成される、複数のもの。
【請求項197】
請求項186に記載の複数のものであって、第1の領域および第2の領域は、各々、グアニンおよびチミジンから構成され、該ポリヌクレオチドは、その3’末端に、0、1、2、または3のランダムな塩基を含む、複数のもの。
【請求項198】
請求項184に記載の複数のものであって、前記核酸配列が、塩基または骨格アナログでから構成される、複数のもの。
【請求項199】
請求項184に記載の複数のものであって、ここで、前記複数のプライマーのうちのポリヌクレオチドの各々の濃度が、所定の核酸の最適なプライミングについて調節された、複数のもの。
【請求項200】
請求項199に記載の複数のものであって、ここで、前記複数のもののうちの全てのポリヌクレオチドの濃度が、等モル濃度である、複数のもの。
【請求項201】
請求項199に記載の複数のものであって、ここで、前記所定の核酸が、ゲノムの一部分または全てを含む、複数のもの。
【請求項202】
請求項199に記載の複数のものであって、前記所定の核酸が、トランススクリプトームの一部分または全てを含む、複数のもの。
【請求項203】
ゲノム、トランスクリプトーム、またはその両方を増幅する方法であって、該方法は、以下:
ゲノムDNA、RNA、または両方を取得する工程;
該ゲノムDNA、RNA、または両方を改変して、少なくとも1つの一本鎖核酸分子を生成する工程;
該一本鎖核酸分子を複数のプライマーに供して、核酸/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、該プライマーは、実質的に自己非相補的でありかつその複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、該配列は、5’→3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該核酸/プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、その供する工程が各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに、ポリメラーゼ連鎖反応を介してその複数のDNA分子を増幅する工程であって、その反応は、該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
を包含する、方法。
【請求項204】
請求項203に記載の方法であって、ここで、該方法は、以下の工程:
増幅したDNA分子を改変して、一本鎖分子を生成する工程であって、該一本鎖分子は、その5’末端および3’末端に該定常領域を含み、ここで、該DNAが、一本鎖DNA、二本鎖DNA、またはそれらの混合物としてさらに規定される、工程;
該一本鎖DNA分子のうちの少なくとも1つの領域を、支持体に固定されたオリゴヌクレオチドの3’末端にある相補的領域にハイブリダイズさせて、一本鎖DNA/オリゴヌクレオチドハイブリッドを生成する工程;および
該オリゴヌクレオチドの3’末端を伸長させて、伸長ポリヌクレオチドを生成する工程
を包含する、方法。
【請求項205】
請求項203に記載の方法であって、該方法は、前記一本鎖DNA/オリゴヌクレオチドハイブリッドから前記一本鎖DNAを取り出す工程をさらに包含する、方法。
【請求項206】
複数のポリヌクレオチドを備えるキットであって、ここで、該ポリヌクレオチドは、実質的に自己非相補的でありかつ、該複数の中の他のポリヌクレオチドに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、その複数のものが、適切な容器中に分散されている、キット。
【請求項207】
ポリメラーゼをさらに備える、請求項206に記載のキット。
【請求項208】
前記ポリメラーゼが、鎖置換ポリメラーゼである、請求項207に記載のキット。
【請求項209】
請求項208に記載のキットであって、ここで、前記鎖置換ポリメラーゼが、φ29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、9°Nmポリメラーゼ、DNA ポリメラーゼIのクレノウフラグメント、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、ヒトHIV逆転写酵素、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠くT7ファージDNAポリメラーゼの変異形態、またはそれらの混合物である、キット。
【請求項210】
DNA分子の複数の集団に含まれるあるDNA集団を増幅する方法であって、該方法は、以下の工程:
DNA分子の複数の集団を取得する工程であって、ここで、該複数あるうちの少なくとも1つの集団は、5’→3’方向に、以下:該集団に特異的な既知の同定配列および既知のプライマー増幅配列を含む、工程;ならびに、
ポリメラーゼ連鎖反応によって該DNA分子の集団を増幅する工程であって、該反応では、該同定配列についてのプライマーを利用する、工程
を包含する、方法。
【請求項211】
請求項210に記載の方法であって、前記取得工程は、
既知プライマー増幅配列を含むDNA分子の集団を得る工程;
5’→3’方向に、既知の同定配列と該既知のプライマー増幅配列とを有するプライマーを用いて該DNA分子を増幅する工程;および
該集団を、少なくとも1つの他のDNA分子の集団を混合する工程
として、さらに、規定される、方法。
【請求項212】
請求項210に記載の方法であって、ここで、DNA分子の前記集団が、ゲノムDNAを含む、方法。
【請求項213】
請求項210に記載の方法であって、ここで、DNA分子の前記集団が、ゲノムを含む、方法。
【請求項214】
請求項210に記載の方法であって、ここで、DNA分子の前記集団は、トランスクリプトームを含む、方法。
【請求項215】
DNA分子の複数の集団に含まれるあるDNA集団を増幅する方法であって、
該方法は、以下の工程:
DNA分子の複数の集団を取得する工程であって、該複数のうちの少なくとも1つの集団は、DNA分子を含み、ここで、該DNA分子のうちの5’末端が、5’→3’方向に、
以下:
該集団に特異的な既知の同定配列を含む一本鎖領域;および
既知のプライマー増幅配列
を含む、工程;
複数の該DNA分子の一本鎖既知同定配列の少なくとも一部分が表面に対して結合することを介して、該集団を単離する工程;および
該プライマー増幅配列についてのプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応によって該単離されたDNA分子を増幅する工程
を包含する、方法。
【請求項216】
請求項215に記載の方法であって、ここで前記得る工程は、以下:
DNA分子の集団を得る工程であって、該分子は、既知のプライマー増幅配列を含む、工程;
該DNA分子を、5’→3’方向で、以下を含むプライマー:
既知の同定配列;
複製不能リンカー;および
該既知のプライマー増幅配列;
で増幅する工程;ならびに
該集団を、DNA分子の少なくとも1つの他の集団と混合する工程、
としてさらに規定される、方法。
【請求項217】
請求項216に記載の方法であって、ここで前記単離する工程は、前記一本鎖の既知の同定配列の少なくとも一部を、該既知の同定配列に相補的な領域を含む固定化オリゴヌクレオチドに結合する工程としてさらに規定される、方法。
【請求項218】
増幅されたゲノム、増幅されたトランスクリプトーム、またはその両方を固定化する方法であって:
増幅したゲノム、増幅されたトランスクリプトーム、またはその両方を得る工程であって、ここで該ゲノム、トランスクリプトームまたはその両方に由来する複数の分子は、既知のプライマー増幅配列を、該分子の5’末端および3’末端の両方に含む、工程;ならびに
該複数の分子を支持体に結合する工程、
を包含する、方法。
【請求項219】
請求項218に記載の方法であって、ここで前記結合する工程は、前記複数の分子を前記支持体に、前記既知のプライマー増幅配列を介して共有結合する工程を包含するとさらに規定される、方法。
【請求項220】
請求項219に記載の方法であって、ここで前記共有結合する工程は、以下:
少なくとも一本鎖分子の領域を、前記支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドの3’末端における相補的領域にハイブリダイズさせる工程;ならびに
該オリゴヌクレオチドの3’末端を伸長して、一本鎖分子/伸長したポリヌクレオチドハイブリッドを生成する工程、
としてさらに規定される、方法。
【請求項221】
請求項220に記載の方法であって、ここで該方法は、前記一本鎖DNA分子を、前記一本鎖分子/伸長したポリヌクレオチドのハイブリッドから除去して、伸長したポリヌクレオチドを生成する工程をさらに包含する、方法。
【請求項222】
請求項220に記載の方法であって、該方法は、前記伸長したポリヌクレオチドを複製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項223】
請求項222に記載の方法であって、ここで前記複製する工程は、以下:
前記伸長したポリヌクレオチドに、ポリメラーゼと、前記既知のプライマー増幅配列に相補的なプライマーとを提供する工程;
該プライマーの3’末端を伸長させて、伸長したプライマー分子を形成する工程;ならびに
該伸長したプライマー分子を遊離させる工程、
としてさらに規定される、方法。
【請求項224】
増幅したゲノムを固定化する方法であって:
増幅したゲノムを得る工程であって、ここで該ゲノムに由来する複数のDNA分子は、以下:
タグ;ならびに
該分子の5’末端および3’末端の両方に既知のプライマー増幅配列、
を含む、工程;ならびに
複数の該DNA分子を支持体に結合する工程、
を包含する、方法。
【請求項225】
請求項224に記載の方法であって、ここで前記結合する工程は、前記複数のDNA分子を、前記タグを介して前記固体支持体に結合する工程を包含するとしてさらに規定される、方法。
【請求項226】
請求項224に記載の方法であって、ここで前記タグはビオチンを含み、前記支持体はストレプトアビジンを含む、方法。
【請求項227】
請求項224に記載の方法であって、ここで前記タグは、アミノ基またはカルボキシ基を含む、方法。
【請求項228】
請求項224に記載の方法であって、ここで前記タグは一本鎖領域を含み、前記支持体は、該タグの一領域に対する配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、方法。
【請求項229】
請求項228に記載の方法であって、ここで前記一本鎖領域は、同定配列を含むとさらに規定される、方法。
【請求項230】
請求項229に記載の方法であって、ここで前記DNA分子は、前記同定配列に対して3’側にある複製不能リンカーと、前記既知のプライマー増幅配列に対して5’側にある複製不能リンカーとを含むとさらに規定される、方法。
【請求項231】
請求項224に記載の方法であって、ここで前記方法は、前記固定化されたゲノムから夾雑物を除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項232】
ゲノムDNAを含む複数のdsDNA分子であって、ここで該分子が変性されて、第1鎖および第2鎖の分子を生成するとき、該第1鎖および該第2鎖の分子の各々は、該第1鎖および該第2鎖の分子のそれぞれの末端で第1の末端領域および第2の末端領域を含み、該第1の分子の第1の末端領域および第2の末端領域の各々は、該第1の分子における該第1の末端領域および該第2の末端領域における配列に対して実質的に非自己相補的である核酸領域を含み、そして該第2の分子の該第1の末端領域および該第2の末端領域の各々は、該第2の分子における該第1の末端領域および該第2の末端領域における配列に対して実質的に非自己相補的である核酸配列を含む、dsDNA分子。
【請求項233】
請求項232に記載の複数のものであって、ここで前記第1鎖の分子の前記第1の末端領域および前記第2の末端領域の各々は、該複数のものにおける他の分子の第1鎖の第1の末端領域および第2の末端領域に対して実質的に非自己相補的であり、そして前記第2鎖分子の第1の末端領域および第2の末端領域の各々は、該複数のものにおける他の分子の該第2鎖の第1末端領域および第2末端領域に対して実質的に非自己相補的である、複数のもの。
【請求項234】
請求項232に記載の複数のものであって、ここで前記DNA分子は、前記第1の末端領域および前記第2の末端領域においてホモポリマータグをさらに含み、そして該末端領域は、該分子上の最後から2番目から該ホモポリマータグまでである、複数のもの。
【請求項235】
請求項232に記載の複数のものであって、ゲノムライブラリーとしてさらに規定される、複数のもの。
【請求項236】
物質の限定された供給源からゲノムの配列決定を行う方法であって、該方法は、以下の工程:
物質の限定された供給源から少なくとも1つの二本鎖DNA分子または一本鎖DNA分子を得る工程;
該二本鎖DNA分子を熱に供して、少なくとも1つの一本鎖DNA分子を生成する工程;
該一本鎖DNA分子を複数のプライマーに供して、DNA分子/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、該プライマーは、非自己相補的でありかつ該複数あるうちの他のプライマーに対して実質的に非相補的である、核酸配列を含み、ここで、該配列は、5’→3’方向で、定常領域および可変領域を含む、工程;
ポリメラーゼに供する工程によって、該定常核酸配列を各々末端に含む複数のDNA分子を生成される条件の下、該DNA分子/プライマー混合物を、該供する工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して、該複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応は、該定常領域に相補的なプライマーを利用する、工程;
該複数の増幅した分子から、増幅したDNA分子の第1のサンプルおよび第2のサンプルを提供する工程;
該第1のサンプルからの該増幅した少なくともいくらかのDNA分子の配列決定を行い、少なくとも1つの特定のDNA配列を得る工程;
ホモポリマー性のポリC/ポリG配列を、該第2のサンプルからの増幅したDNA分子の末端に組み込み、ホモポリマー性増幅分子を生成する工程;
ホモポリマー性増幅分子のうち少なくともいくつかを、ポリCプライマーおよび該特定のDNA配列に相補的なプライマー用いて該第2のサンプルから増幅する工程;および
さらなる特定配列に関連して、該配列決定工程および増幅工程を反復して、それによって、該ゲノムの実質的に完全なコンティグを生じる工程
を包含する、方法。
【請求項237】
請求項236に記載の方法であって、ここで、前記ホモポリマー性配列を取り込む工程は、以下:
dGTPの存在下で、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによって、 前記増幅したDNAフラグメントの3’末端を伸長する工程;
前記ホモポリマー性ポリC/ポリG配列を含むアダプターを、前記増幅したDNAフラグメントの末端に連結させる工程;または、
該増幅したDNAフラグメントと、その5’末端にホモポリマー性ポリC配列を含みかつ該3’末端に定常領域を含むプライマーとを用いて、該増幅したDNAフラグメントを複製する工程
のうち1つを包含する、方法。
【請求項238】
請求項236に記載の方法であって、ここで、前記配列決定工程は、
ベクターに、前記第1のサンプルからの増幅されたDNAフラグメントをクローニングする工程;および該クローニングされたフラグメントのうちの少なくともいくつかを配列決定する工程として、
さらに規定される、方法。
【請求項239】
請求項236に記載の方法であって、ここで、前記増幅分子のうちの特異的配列が、前記第1のサンプルの配列決定工程によって、得られ、かつ、前記さらなる特定配列うちの1以上が、前記第2のサンプルからの増幅された分子の配列決定工程によって得られる、方法。
【請求項240】
請求項236に記載の方法であって、ここで、物質の前記限定された供給源が、培養工程に対して実質的に耐性である微生物である、方法。
【請求項241】
請求項236に記載の方法であって、ここで、物質の前記限定された供給源が、絶滅種である、方法。
【請求項242】
請求項236に記載の方法であって、ここで、前記ゲノムの配列決定工程は、最小の冗長性をもって達成される、方法。
【請求項1】
核酸分子を調製する方法であって、以下:
少なくとも1つの核酸分子を取得する工程;
複数のプライマーに対して該核酸分子を供して核酸分子/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが、実質的に自己非相補的でありそして該複数の中のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;ならびに
該核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に定常領域の全てまたは一部を含む複数の分子を生成する条件下である、工程、
を包含する、方法。
【請求項2】
前記核酸分子が一本鎖核酸分子である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
前記一本鎖核酸分子がDNA、RNA、またはDNA−RNAキメラである、請求項2に記載の方法。
【請求項4】
前記核酸分子が二本鎖核酸分子である、請求項1に記載の方法。
【請求項5】
前記二本鎖核酸分子がDNA、RNA、またはDNA−RNAキメラである、請求項4に記載の方法。
【請求項6】
前記核酸分子が一本鎖核酸分子および二本鎖核酸分子の混合物である、請求項1に記載の方法。
【請求項7】
前記一本鎖核酸分子がRNAでありそして前記二本鎖核酸分子がDNAである、請求項6に記載の方法。
【請求項8】
複数のプライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的であることを意図して、該複数のプライマーを設計する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項9】
前記方法が、定常領域の全てまたは一部を含む複数の分子を増幅して、増幅された分子を生成する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項10】
前記増幅する工程がポリメラーゼ連鎖反応を包含する、請求項9に記載の方法。
【請求項11】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、同一の2つの非相補的なヌクレオチドからなる、請求項1に記載の方法。
【請求項12】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、グアニン、アデニンまたはその両方からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項13】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、シトシン、チミジンまたはその両方からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項14】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、アデニン、シトシンまたはその両方からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項15】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、グアニン、チミジンまたはその両方からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項16】
前記定常領域が約6〜約100ヌクレオチドを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項17】
前記可変領域が約4ヌクレオチド〜約20ヌクレオチドを含む、請求項11に記載の方法。
【請求項18】
前記プライマーがさらに、その遠位3’末端の0〜約3個のランダムな塩基からなる、請求項11に記載の方法。
【請求項19】
前記定常領域および可変領域がそれぞれ、グアニンおよびチミジンからなり、そして前記ポリヌクレオチドが遠位3’末端に0個、1個、2個または3個のランダムな塩基を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項20】
前記ヌクレオチドが塩基アナログまたは骨格アナログである、請求項11に記載の方法。
【請求項21】
前記ポリメラーゼが鎖交換性ポリメラーゼである、請求項1に記載の方法。
【請求項22】
請求項21に記載の方法であって、ここで、前記鎖交換性ポリメラーゼが、φ29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、9°Nmポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、Tth DNAポリメラーゼ、ヒトHIV逆転写酵素、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型T7ファージDNAポリメラーゼ、またはこれらの混合物である、方法。
【請求項23】
前記鎖交換性ポリメラーゼがクレノウ Exo−である、請求項22に記載の方法。
【請求項24】
前記鎖交換性ポリメラーゼが3’−−>5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型T7ファージDNAポリメラーゼである、請求項22に記載の方法。
【請求項25】
前記鎖交換性ポリメラーゼがMMLV逆転写酵素である、請求項22に記載の方法。
【請求項26】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物を、ポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
【請求項27】
前記化合物が一本鎖化DNA結合性タンパク質またはヘリカーゼである、請求項26に記載の方法。
【請求項28】
前記混合物をポリメラーゼに供する工程が、GC−リッチなDNAおよび/またはRNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項1に記載の方法。
【請求項29】
前記薬剤がジメチルスルホキシド(DMSO)、7−デアザ−dGTP、またはそれらの混合物を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項30】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項9に記載の方法。
【請求項31】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項32】
前記複数のプライマーの各々が同一の定常領域を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項33】
2つ以上の定常領域が複数のプライマーの混合物中に示される、請求項1に記載の方法。
【請求項34】
請求項9に記載の方法であって、ここで前記方法が以下の工程:
増幅された分子を修飾して修飾ヌクレオチド塩基を組み込み、これによって標識化分子を生成する工程であって、該増幅された分子がさらに一本鎖DNA分子、二本鎖DNA分子、またはそれらの混合物として規定される、工程;
該標識化分子から一本鎖分子を生成する工程であって、該一本鎖分子が基材上の既知の位置に整列された相補的配列にハイブリダイズし得る、工程;および
少なくとも1つのハイブリダイゼーション信号を分析する工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項35】
前記修飾する工程が修飾ヌクレオチド塩基の化学的組み込み、酵素的組み込みまたは物理的組み込みを包含する、請求項34に記載の方法。
【請求項36】
前記修飾塩基が放射性または蛍光性である、請求項34に記載の方法。
【請求項37】
前記生成する工程が、前記二本鎖分子の変性を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項38】
前記基材がマイクロアレイ基材を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項39】
前記分析する工程が、少なくとも1つのハイブリダイゼーション信号のバックグラウンドを差し引いた強度を測定する工程を包含する、請求項34に記載の方法。
【請求項40】
前記分析する工程が、増幅されたライブラリーのコピー数、代表物またはその両方の測定を含む、請求項34に記載の方法。
【請求項41】
前記増幅された分子の末端にタグが取り込まれ、そして該増幅された分子の各々の末端の該タグに対して前記定常領域が末端から2番目である、請求項9に記載の方法。
【請求項42】
前記タグがホモポリマー性配列である、請求項41に記載の方法。
【請求項43】
前記ホモポリマー性配列がポリシステイン(ポリC)またはポリグアニン(ポリG)を含む、請求項42に記載の方法。
【請求項44】
ホモポリマー性ポリGの組み込みが末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性を含む、請求項43に記載の方法。
【請求項45】
ホモポリマー性のポリGまたはポリCの組み込みが、前記増幅された分子の末端に対する、該ホモポリマー性のポリGまたはポリCを含むアダプターのライゲーションを含む、請求項43に記載の方法。
【請求項46】
ホモポリマー性ポリCの組み込みがDNAポリメラーゼを用いて増幅された分子を複製する工程を包含し、該複製する工程が5’から3’方向において:
ホモポリマー性ポリC;および
定常領域
を含むプライマーを利用する、請求項43に記載の方法。
【請求項47】
ホモポリマー性ポリCを含む増幅された分子が、核酸分子中の所望の配列およびポリCに対して相補的なプライマーを使用してさらに増幅される、請求項43に記載の方法。
【請求項48】
少なくともいくつかの増幅されたDNAが、配列決定、ハイブリダイゼーションまたはその両方にさらに供される、請求項47に記載の方法。
【請求項49】
ホモポリマー性配列ポリCを含む増幅された分子が、核酸分子中の異なる所望の配列およびポリCプライマーに対して相補的であるプライマーの混合物を用いてさらに増幅される、請求項43に記載の方法。
【請求項50】
いくつかの増幅された所望のDNA分子の混合物が、配列決定、ハイブリダイゼーションまたはその両方にさらに供される、請求項49に記載の方法。
【請求項51】
DNA分子を増幅する方法であって、以下:
少なくとも1つの二本鎖DNA分子または一本鎖DNA分子を取得する工程;
該二本鎖DNA分子を加熱に供して、少なくとも1つの一本鎖DNA分子を生成する工程;
該一本鎖DNA分子を複数のプライマーに供してDNA分子/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該DNA分子/プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して該複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
を包含する、方法。
【請求項52】
前記DNA分子がゲノムDNAを含むようにさらに規定される、請求項51に記載の方法。
【請求項53】
前記DNA分子がヒトサンプルから取得される、請求項51に記載の方法。
【請求項54】
前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項55】
前記サンプルが生検材料を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項56】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項57】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項53に記載の方法。
【請求項58】
前記ポリメラーゼが鎖交換性ポリメラーゼである、請求項51に記載の方法。
【請求項59】
請求項58に記載の方法であって、ここで、前記鎖交換性ポリメラーゼが、φ29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、9oNmポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、Tth DNAポリメラーゼ、ヒトHIV逆転写酵素、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型T7ファージDNAポリメラーゼ、またはこれらの混合物である、方法。
【請求項60】
前記鎖交換性ポリメラーゼがクレノウ Exo−である、請求項59に記載の方法。
【請求項61】
前記鎖交換性ポリメラーゼが3’−−>5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型T7ファージDNAポリメラーゼである、請求項59に記載の方法。
【請求項62】
前記鎖交換性ポリメラーゼがMMLV逆転写酵素である、請求項59に記載の方法。
【請求項63】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物を、ポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項51に記載の方法。
【請求項64】
前記化合物が一本鎖DNA分子結合タンパク質またはヘリカーゼである、請求項63に記載の方法。
【請求項65】
前記ポリメラーゼに供する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進することが公知の添加物の存在下で起こる、請求項51に記載の方法。
【請求項66】
前記添加物がDMSO、7−デアザ−dGTP、またはそれらの混合物を含む、請求項65に記載の方法。
【請求項67】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項51に記載の方法。
【請求項68】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項67に記載の方法。
【請求項69】
前記サンプルから調製された核酸分子がゲノムのコピー数情報を提供する、請求項53に記載の方法。
【請求項70】
前記サンプルから調製された核酸分子がゲノム配列情報を提供する、請求項53に記載の方法。
【請求項71】
前記サンプルから調製された核酸分子が対立遺伝子の多様性の情報を提供する、請求項53に記載の方法。
【請求項72】
前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項53に記載の方法。
【請求項73】
前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項53に記載の方法。
【請求項74】
RNA分子を増幅する方法であって、以下:
少なくとも1つのRNA分子を取得する工程;
必要に応じて、分子を加熱して、少なくとも1つの一本鎖RNA分子を生成する工程;
一本鎖RNA分子を複数のプライマーに供して、RNA分子/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該RNA分子/プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して該複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
を包含する、方法。
【請求項75】
前記RNA分子がサンプルから取得される、請求項74に記載の方法。
【請求項76】
前記サンプルが全細胞内RNA、トランスクリプトームまたはその両方を含む、請求項75に記載の方法。
【請求項77】
前記サンプルが1つ以上のウイルスから取得される、請求項75に記載の方法。
【請求項78】
前記サンプルが1つ以上の細菌から取得される、請求項75に記載の方法。
【請求項79】
前記サンプルが動物細胞、細菌および/またはウイルスの混合物から取得される、請求項75に記載の方法。
【請求項80】
前記サンプルがヒトから取得される、請求項75に記載の方法。
【請求項81】
前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、請求項80に記載の方法。
【請求項82】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項80に記載の方法。
【請求項83】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項80に記載の方法。
【請求項84】
前記サンプルがmRNAを含む、請求項80に記載の方法。
【請求項85】
前記mRNAが親和性捕捉によって取得される、請求項84に記載の方法。
【請求項86】
前記ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項74に記載の方法。
【請求項87】
前記逆転写酵素が、Tth DNAポリメラーゼ、AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、またはこれらの混合物である、請求項86に記載の方法。
【請求項88】
前記逆転写酵素がMMLV逆転写酵素である、請求項86に記載の方法。
【請求項89】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項74に記載の方法。
【請求項90】
前記化合物が一本鎖DNA結合性タンパク質もしくは一本鎖化RNA分子結合性タンパク質またはヘリカーゼである、請求項89に記載の方法。
【請求項91】
前記ポリメラーゼに混合物を供する工程が、GC−リッチなRNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項74に記載の方法。
【請求項92】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、またはそれらの混合物を含む、請求項91に記載の方法。
【請求項93】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項74に記載の方法。
【請求項94】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項93に記載の方法。
【請求項95】
前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子発現情報を提供する、請求項80に記載の方法。
【請求項96】
前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子配列情報を提供する、請求項80に記載の方法。
【請求項97】
前記サンプルから調製された核酸分子がエクソン対立遺伝子の多様性の情報を提供する、請求項80に記載の方法。
【請求項98】
前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項80に記載の方法。
【請求項99】
前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項80に記載の方法。
【請求項100】
少なくとも1つのmRNA分子から生成されたDNA分子を増幅する方法であって、以下:
該mRNA分子からcDNA分子を取得する工程;
cDNA分子を改変して、少なくとも1つのssDNA分子を生成する工程;
該ssDNA分子を複数のプライマーに供してssDNA分子/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該ssDNA分子/プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
を包含する、方法。
【請求項101】
前記mRNAがヒトサンプルから取得される、請求項100に記載の方法。
【請求項102】
前記ヒトサンプルが生検材料を含む、請求項101に記載の方法。
【請求項103】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項101に記載の方法。
【請求項104】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項101に記載の方法。
【請求項105】
前記取得する工程が、逆転写酵素を用いてmRNA分子を逆転写することによるcDNA分子の生成を含むようさらに規定される、請求項100に記載の方法。
【請求項106】
前記逆転写酵素が、Tth DNAポリメラーゼ、AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素、ヒトHIV逆転写酵素、またはこれらの混合物である、請求項105に記載の方法。
【請求項107】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項100に記載の方法。
【請求項108】
前記化合物が一本鎖DNA分子結合タンパク質、ヘリカーゼまたはそれらの混合物である、請求項107に記載の方法。
【請求項109】
前記ポリメラーゼに混合物を供する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項100に記載の方法。
【請求項110】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、またはそれらの混合物を含む、請求項109に記載の方法。
【請求項111】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する薬剤の存在下で起こる、請求項100に記載の方法。
【請求項112】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項111に記載の方法。
【請求項113】
前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子発現情報を提供する、請求項101に記載の方法。
【請求項114】
前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子配列情報を提供する、請求項101に記載の方法。
【請求項115】
前記サンプルから調製された核酸分子がエクソン対立遺伝子の多様性の情報を提供する、請求項101に記載の方法。
【請求項116】
前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項101に記載の方法。
【請求項117】
前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項101に記載の方法。
【請求項118】
DNAおよびRNAの混合物を含むサンプルから総ての核酸を取得する方法であって、以下:
DNAおよびRNAの混合物を提供する工程;
必要に応じて、二本鎖核酸を変性させる温度に該混合物を加熱する工程;ならびに
一本鎖DNAおよび一本鎖RNAの両方を複製するポリメラーゼに該混合物を供する工程
を包含する、方法。
【請求項119】
前記方法が本質的に、前記提供する工程、必要に応じて加熱する工程、および供する工程からなる、請求項118に記載の方法。
【請求項120】
請求項118に記載の方法であって、ここで前記供する工程が、以下:
前記混合物を複数のプライマーに供して核酸/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該核酸/プライマー混合物をDNAおよびRNAの両方を効率的に複製するポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に一定の核酸配列を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
としてさらに規定される、方法。
【請求項121】
前記ポリメラーゼが逆転写酵素である、請求項118に記載の方法。
【請求項122】
前記逆転写酵素が、Tth DNAポリメラーゼ、AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、またはこれらの混合物である、請求項121に記載の方法。
【請求項123】
前記逆転写酵素がMMLV逆転写酵素である、請求項122に記載の方法。
【請求項124】
前記サンプルがヒト由来である、請求項118に記載の方法。
【請求項125】
前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、請求項124に記載の方法。
【請求項126】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項124に記載の方法。
【請求項127】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項124に記載の方法。
【請求項128】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項118に記載の方法。
【請求項129】
前記化合物が一本鎖DNA分子結合タンパク質またはRNA結合性タンパク質またはヘリカーゼである、請求項128に記載の方法。
【請求項130】
前記ポリメラーゼに混合物を供する工程が、GC−リッチなDNAまたはRNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項120に記載の方法。
【請求項131】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、またはそれらの混合物を含む、請求項130に記載の方法。
【請求項132】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項120に記載の方法。
【請求項133】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはそれらの混合物を含む、請求項132に記載の方法。
【請求項134】
前記サンプルから調製された核酸分子が核酸配列情報を提供する、請求項124に記載の方法。
【請求項135】
前記サンプルから調製された核酸分子が対立遺伝子の多様性の情報を提供する、請求項124に記載の方法。
【請求項136】
前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項124に記載の方法。
【請求項137】
前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項124に記載の方法。
【請求項138】
DNAおよびRNAの混合物を含むサンプルからDNAまたはRNAをそれぞれ区別して取得する方法であって、以下:
該DNAおよびRNAの混合物を提供する工程;
DNAまたはRNAに選択的に影響する温度に、該混合物を加熱する工程;ならびに
それぞれDNAまたはRNAを選択的に複製するポリメラーゼに該混合物を供する工程
を包含する、方法。
【請求項139】
請求項138に記載の方法であって、前記提供する工程が、以下:
前記混合物を複数のプライマーに供して核酸/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該核酸/プライマー混合物を、それぞれDNAまたはRNAを選択的に複製するポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に既知の核酸配列を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
としてさらに規定される、方法。
【請求項140】
前記サンプルがヒト由来である、請求項138に記載の方法。
【請求項141】
前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、請求項138に記載の方法。
【請求項142】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項138に記載の方法。
【請求項143】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項138に記載の方法。
【請求項144】
DNAおよびRNAを含むサンプルからDNAを区別して取得する方法であって、以下:
DNAおよびRNAの混合物を提供する工程;
少なくとも約94℃〜約100℃の温度に該混合物を加熱して、一本鎖核酸を生成する工程;ならびに
DNAテンプレートのみを複製するポリメラーゼに該混合物を供する工程
を包含する、方法。
【請求項145】
請求項144に記載の方法であって、以下の工程:
前記混合物を複数のプライマーに供して核酸/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで該プライマーが実質的に自己非相補的でありそして該複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで該配列が5’から3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該核酸/プライマー混合物を、選択的にDNAを複製するポリメラーゼに供する工程であって、該供する工程が各々の末端に一定の核酸配列を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して各々の末端に該一定の核酸配列を含む複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応が該一定の核酸配列に対して相補的なプライマーを利用する、工程
をさらに包含する、方法。
【請求項146】
前記ポリメラーゼがDNA依存性DNAポリメラーゼである、請求項145に記載の方法。
【請求項147】
請求項146に記載の方法であって、ここで、前記DNA依存性DNAポリメラーゼが、φ29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、9°Nmポリメラーゼ、DNAポリメラーゼIのクレノウ Exo−フラグメント、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠損した変異型T7ファージDNAポリメラーゼ、またはこれらの混合物である、方法。
【請求項148】
前記ポリメラーゼがDNAポリメラーゼIのクレノウ Exo−フラグメントである、請求項147に記載の方法。
【請求項149】
前記方法が、前記核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、請求項145に記載の方法。
【請求項150】
前記化合物が一本鎖DNA分子結合タンパク質またはヘリカーゼである、請求項149に記載の方法。
【請求項151】
前記ポリメラーゼに混合物を供する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項145に記載の方法。
【請求項152】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、またはこれらの混合物を含む、請求項151に記載の方法。
【請求項153】
前記増幅する工程が、GC−リッチなDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、請求項145に記載の方法。
【請求項154】
前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはこれらの混合物を含む、請求項153に記載の方法。
【請求項155】
前記サンプルがヒト由来である、請求項144に記載の方法。
【請求項156】
前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、請求項155に記載の方法。
【請求項157】
前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、請求項155に記載の方法。
【請求項158】
前記サンプルが1つの細胞を含む、請求項155に記載の方法。
【請求項159】
前記サンプルから調製された核酸分子がゲノムのコピー数情報を提供する、請求項155に記載の方法。
【請求項160】
前記サンプルから調製された核酸分子がゲノム配列情報を提供する、請求項155に記載の方法。
【請求項161】
前記サンプルから調製された核酸分子が対立遺伝子の多様性の情報を提供する、請求項155に記載の方法。
【請求項162】
前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項155に記載の方法。
【請求項163】
前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、請求項155に記載の方法。
【請求項164】
dsDNAおよびRNAを含むサンプルからRNAを区別して得る方法であって、該方法は、以下:
該dsDNAおよびRNAの混合物を提供する工程;
dsDNAの変性を防ぐように、該混合物を、約75℃を超えない温度まで必要に応じて加熱する工程;および
該混合物を、一本鎖RNAテンプレートのみを複製するポリメラーゼに供する工程
を包含する、方法。
【請求項165】
請求項164に記載の方法であって、ここで、前記供する工程が、以下:
前記混合物を複数のプライマーに供して核酸/プライマー混合物を形成する工程であって、該プライマーは、実質的に非自己相補的であり、かつ、該複数あるうちの他のプライマーに対して、実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、該配列は、5’→3’方向で、定常領域および可変領域を含む、工程;
該供する工程によって、該定常核酸配列を各々末端に含む複数のDNA分子が生成される条件の下、該核酸/プライマー混合物を、一本鎖RNAのみをプライミングし、かつ、複製するポリメラーゼに供する工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して、各末端の該定常領域を含む該複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応は、該定常領域に相補的なプライマーを利用する、工程
として、さらに規定される、方法。
【請求項166】
請求項165に記載の方法であって、ここで、前記ポリメラーゼが、逆転写酵素である、方法。
【請求項167】
請求項166に記載の方法であって、ここで、前記逆転写酵素は、Tth DNAポリメラーゼ、AMV逆転写酵素、MMLV逆転写酵素、HIV逆転写酵素、またはそれらの混合物である、方法。
【請求項168】
請求項166に記載の方法であって、前記逆転写酵素が、MMLV逆転写酵素である、方法。.
【請求項169】
請求項165に記載の方法であって、ここで、該方法は、
前記核酸分子/プライマー混合物をポリメラーゼ連続移動性増強化合物に供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項170】
請求項169に記載の方法であって、ここで、前記化合物が、一本鎖DNA結合タンパク質もしくは一本鎖RNA結合タンパク質、またはヘリカーゼである、方法。
【請求項171】
請求項165に記載の方法であって、ここで、前記ポリヌクレアーゼに供する工程が、GCリッチなRNAを介する重合を促進する1以上の薬剤の存在下で生じる、方法。
【請求項172】
請求項171に記載の方法であって、ここで、前記薬剤は、DMSO、7−デアザ−dGTP、またはこれらの混合物を含む、方法。
【請求項173】
請求項165に記載の方法であって、ここで、前記増幅する工程が、GC−リッチDNAを介した重合反応を促進する1つ以上の薬剤の存在下で起こる、方法。
【請求項174】
請求項173に記載の方法であって、前記薬剤がDMSO、7−デアザ−dGTP、ベタイン、またはこれらの混合物を含む、方法。
【請求項175】
請求項164に記載の方法であって、前記サンプルがヒト由来である、方法。
【請求項176】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルが血液、血清または血漿を含む、方法。
【請求項177】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルが、毛包、乳頭吸引物、精液、脳脊髄液、尿、痰、唾液、気管洗浄物、子宮洗浄物、便、汗、頬擦過標本、免疫沈降されたクロマチン、物理的に単離されたクロマチン、またはホルマリン固定化組織を含む、方法。
【請求項178】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルが1つの細胞を含む、方法。
【請求項179】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子発現情報を提供する、方法。
【請求項180】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルから調製された核酸分子が遺伝子配列情報を提供する、方法。
【請求項181】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルから調製された核酸分子がエキソン対立遺伝子バリエーション情報を提供する、方法。
【請求項182】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルから調製された核酸分子が、疾患の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、方法。
【請求項183】
請求項175に記載の方法であって、前記サンプルから調製された核酸分子が、癌の検出、モニタリングおよび/または処置のための情報を提供する、方法。
【請求項184】
複数のポリヌクレオチドであって、ここで、該複数であるポリヌクレオチドは、実質的に非自己相補的であり、かつ、該複数のもののうち他のポリヌクレオチドに対して実質的に非相補的である、核酸配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項185】
請求項184に記載の複数のものであって、ここで、前記核酸配列が、前記ポリヌクレオチドを、以下:自己ハイブリダイゼーション:自己プライミング;該複数のものうちの別のポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーション;複数の重合反応の開始
のうちの少なくとも1つが実質的に不可能であるものとする
としてさらに定義される、複数のもの。
【請求項186】
請求項184に記載の複数のものであって、ここで、前記ポリヌクレオチドが、5’→3’の方向を有し、可変領域に対して5’側にある定常領域を含むとしてさらに規定される、複数のもの。
【請求項187】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域は、その後の増幅のためのものである、複数のもの。
【請求項188】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記可変領域が、ランダムアニーリング、ランダムプライミングまたはそれらの両方のためのものである、複数のもの。
【請求項189】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域および可変領域は、各々、2つの非相補的ヌクレオチドから構成される、複数のもの。
【請求項190】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域および可変領域は、各々、グアニン、アデニン、または両方から構成される、複数のもの。
【請求項191】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域および可変領域は、各々、シトシン、チミジン、または両方から構成される、複数のもの。
【請求項192】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域および可変領域は、各々、アデニン、シトシンまたは両方から構成される、複数のもの。
【請求項193】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域および可変領域は、各々、グアニン、チミジンまたはその両方から構成される、複数のもの。
【請求項194】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記定常領域が、約6〜約100のヌクレオチドを含む、複数のもの。
【請求項195】
請求項186に記載の複数のものであって、ここで、前記第2の領域は、約4ヌクレオチド〜約20ヌクレオチドを含む、複数のもの。
【請求項196】
請求項186に記載の複数のものであって、前記ポリヌクレオチドが、その遠位の3’末端の約0個〜約3個のランダムな塩基からさらに構成される、複数のもの。
【請求項197】
請求項186に記載の複数のものであって、第1の領域および第2の領域は、各々、グアニンおよびチミジンから構成され、該ポリヌクレオチドは、その3’末端に、0、1、2、または3のランダムな塩基を含む、複数のもの。
【請求項198】
請求項184に記載の複数のものであって、前記核酸配列が、塩基または骨格アナログでから構成される、複数のもの。
【請求項199】
請求項184に記載の複数のものであって、ここで、前記複数のプライマーのうちのポリヌクレオチドの各々の濃度が、所定の核酸の最適なプライミングについて調節された、複数のもの。
【請求項200】
請求項199に記載の複数のものであって、ここで、前記複数のもののうちの全てのポリヌクレオチドの濃度が、等モル濃度である、複数のもの。
【請求項201】
請求項199に記載の複数のものであって、ここで、前記所定の核酸が、ゲノムの一部分または全てを含む、複数のもの。
【請求項202】
請求項199に記載の複数のものであって、前記所定の核酸が、トランススクリプトームの一部分または全てを含む、複数のもの。
【請求項203】
ゲノム、トランスクリプトーム、またはその両方を増幅する方法であって、該方法は、以下:
ゲノムDNA、RNA、または両方を取得する工程;
該ゲノムDNA、RNA、または両方を改変して、少なくとも1つの一本鎖核酸分子を生成する工程;
該一本鎖核酸分子を複数のプライマーに供して、核酸/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、該プライマーは、実質的に自己非相補的でありかつその複数の中の他のプライマーに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、該配列は、5’→3’方向に定常領域および可変領域を含む、工程;
該核酸/プライマー混合物をポリメラーゼに供する工程であって、その供する工程が各々の末端に該定常領域を含む複数のDNA分子を生成する条件下である、工程;ならびに、ポリメラーゼ連鎖反応を介してその複数のDNA分子を増幅する工程であって、その反応は、該定常領域に対して相補的なプライマーを利用する、工程
を包含する、方法。
【請求項204】
請求項203に記載の方法であって、ここで、該方法は、以下の工程:
増幅したDNA分子を改変して、一本鎖分子を生成する工程であって、該一本鎖分子は、その5’末端および3’末端に該定常領域を含み、ここで、該DNAが、一本鎖DNA、二本鎖DNA、またはそれらの混合物としてさらに規定される、工程;
該一本鎖DNA分子のうちの少なくとも1つの領域を、支持体に固定されたオリゴヌクレオチドの3’末端にある相補的領域にハイブリダイズさせて、一本鎖DNA/オリゴヌクレオチドハイブリッドを生成する工程;および
該オリゴヌクレオチドの3’末端を伸長させて、伸長ポリヌクレオチドを生成する工程
を包含する、方法。
【請求項205】
請求項203に記載の方法であって、該方法は、前記一本鎖DNA/オリゴヌクレオチドハイブリッドから前記一本鎖DNAを取り出す工程をさらに包含する、方法。
【請求項206】
複数のポリヌクレオチドを備えるキットであって、ここで、該ポリヌクレオチドは、実質的に自己非相補的でありかつ、該複数の中の他のポリヌクレオチドに対して実質的に非相補的である核酸配列を含み、ここで、その複数のものが、適切な容器中に分散されている、キット。
【請求項207】
ポリメラーゼをさらに備える、請求項206に記載のキット。
【請求項208】
前記ポリメラーゼが、鎖置換ポリメラーゼである、請求項207に記載のキット。
【請求項209】
請求項208に記載のキットであって、ここで、前記鎖置換ポリメラーゼが、φ29ポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Ventポリメラーゼ、9°Nmポリメラーゼ、DNA ポリメラーゼIのクレノウフラグメント、MMLV逆転写酵素、AMV逆転写酵素、ヒトHIV逆転写酵素、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を欠くT7ファージDNAポリメラーゼの変異形態、またはそれらの混合物である、キット。
【請求項210】
DNA分子の複数の集団に含まれるあるDNA集団を増幅する方法であって、該方法は、以下の工程:
DNA分子の複数の集団を取得する工程であって、ここで、該複数あるうちの少なくとも1つの集団は、5’→3’方向に、以下:該集団に特異的な既知の同定配列および既知のプライマー増幅配列を含む、工程;ならびに、
ポリメラーゼ連鎖反応によって該DNA分子の集団を増幅する工程であって、該反応では、該同定配列についてのプライマーを利用する、工程
を包含する、方法。
【請求項211】
請求項210に記載の方法であって、前記取得工程は、
既知プライマー増幅配列を含むDNA分子の集団を得る工程;
5’→3’方向に、既知の同定配列と該既知のプライマー増幅配列とを有するプライマーを用いて該DNA分子を増幅する工程;および
該集団を、少なくとも1つの他のDNA分子の集団を混合する工程
として、さらに、規定される、方法。
【請求項212】
請求項210に記載の方法であって、ここで、DNA分子の前記集団が、ゲノムDNAを含む、方法。
【請求項213】
請求項210に記載の方法であって、ここで、DNA分子の前記集団が、ゲノムを含む、方法。
【請求項214】
請求項210に記載の方法であって、ここで、DNA分子の前記集団は、トランスクリプトームを含む、方法。
【請求項215】
DNA分子の複数の集団に含まれるあるDNA集団を増幅する方法であって、
該方法は、以下の工程:
DNA分子の複数の集団を取得する工程であって、該複数のうちの少なくとも1つの集団は、DNA分子を含み、ここで、該DNA分子のうちの5’末端が、5’→3’方向に、
以下:
該集団に特異的な既知の同定配列を含む一本鎖領域;および
既知のプライマー増幅配列
を含む、工程;
複数の該DNA分子の一本鎖既知同定配列の少なくとも一部分が表面に対して結合することを介して、該集団を単離する工程;および
該プライマー増幅配列についてのプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応によって該単離されたDNA分子を増幅する工程
を包含する、方法。
【請求項216】
請求項215に記載の方法であって、ここで前記得る工程は、以下:
DNA分子の集団を得る工程であって、該分子は、既知のプライマー増幅配列を含む、工程;
該DNA分子を、5’→3’方向で、以下を含むプライマー:
既知の同定配列;
複製不能リンカー;および
該既知のプライマー増幅配列;
で増幅する工程;ならびに
該集団を、DNA分子の少なくとも1つの他の集団と混合する工程、
としてさらに規定される、方法。
【請求項217】
請求項216に記載の方法であって、ここで前記単離する工程は、前記一本鎖の既知の同定配列の少なくとも一部を、該既知の同定配列に相補的な領域を含む固定化オリゴヌクレオチドに結合する工程としてさらに規定される、方法。
【請求項218】
増幅されたゲノム、増幅されたトランスクリプトーム、またはその両方を固定化する方法であって:
増幅したゲノム、増幅されたトランスクリプトーム、またはその両方を得る工程であって、ここで該ゲノム、トランスクリプトームまたはその両方に由来する複数の分子は、既知のプライマー増幅配列を、該分子の5’末端および3’末端の両方に含む、工程;ならびに
該複数の分子を支持体に結合する工程、
を包含する、方法。
【請求項219】
請求項218に記載の方法であって、ここで前記結合する工程は、前記複数の分子を前記支持体に、前記既知のプライマー増幅配列を介して共有結合する工程を包含するとさらに規定される、方法。
【請求項220】
請求項219に記載の方法であって、ここで前記共有結合する工程は、以下:
少なくとも一本鎖分子の領域を、前記支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドの3’末端における相補的領域にハイブリダイズさせる工程;ならびに
該オリゴヌクレオチドの3’末端を伸長して、一本鎖分子/伸長したポリヌクレオチドハイブリッドを生成する工程、
としてさらに規定される、方法。
【請求項221】
請求項220に記載の方法であって、ここで該方法は、前記一本鎖DNA分子を、前記一本鎖分子/伸長したポリヌクレオチドのハイブリッドから除去して、伸長したポリヌクレオチドを生成する工程をさらに包含する、方法。
【請求項222】
請求項220に記載の方法であって、該方法は、前記伸長したポリヌクレオチドを複製する工程をさらに包含する、方法。
【請求項223】
請求項222に記載の方法であって、ここで前記複製する工程は、以下:
前記伸長したポリヌクレオチドに、ポリメラーゼと、前記既知のプライマー増幅配列に相補的なプライマーとを提供する工程;
該プライマーの3’末端を伸長させて、伸長したプライマー分子を形成する工程;ならびに
該伸長したプライマー分子を遊離させる工程、
としてさらに規定される、方法。
【請求項224】
増幅したゲノムを固定化する方法であって:
増幅したゲノムを得る工程であって、ここで該ゲノムに由来する複数のDNA分子は、以下:
タグ;ならびに
該分子の5’末端および3’末端の両方に既知のプライマー増幅配列、
を含む、工程;ならびに
複数の該DNA分子を支持体に結合する工程、
を包含する、方法。
【請求項225】
請求項224に記載の方法であって、ここで前記結合する工程は、前記複数のDNA分子を、前記タグを介して前記固体支持体に結合する工程を包含するとしてさらに規定される、方法。
【請求項226】
請求項224に記載の方法であって、ここで前記タグはビオチンを含み、前記支持体はストレプトアビジンを含む、方法。
【請求項227】
請求項224に記載の方法であって、ここで前記タグは、アミノ基またはカルボキシ基を含む、方法。
【請求項228】
請求項224に記載の方法であって、ここで前記タグは一本鎖領域を含み、前記支持体は、該タグの一領域に対する配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、方法。
【請求項229】
請求項228に記載の方法であって、ここで前記一本鎖領域は、同定配列を含むとさらに規定される、方法。
【請求項230】
請求項229に記載の方法であって、ここで前記DNA分子は、前記同定配列に対して3’側にある複製不能リンカーと、前記既知のプライマー増幅配列に対して5’側にある複製不能リンカーとを含むとさらに規定される、方法。
【請求項231】
請求項224に記載の方法であって、ここで前記方法は、前記固定化されたゲノムから夾雑物を除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項232】
ゲノムDNAを含む複数のdsDNA分子であって、ここで該分子が変性されて、第1鎖および第2鎖の分子を生成するとき、該第1鎖および該第2鎖の分子の各々は、該第1鎖および該第2鎖の分子のそれぞれの末端で第1の末端領域および第2の末端領域を含み、該第1の分子の第1の末端領域および第2の末端領域の各々は、該第1の分子における該第1の末端領域および該第2の末端領域における配列に対して実質的に非自己相補的である核酸領域を含み、そして該第2の分子の該第1の末端領域および該第2の末端領域の各々は、該第2の分子における該第1の末端領域および該第2の末端領域における配列に対して実質的に非自己相補的である核酸配列を含む、dsDNA分子。
【請求項233】
請求項232に記載の複数のものであって、ここで前記第1鎖の分子の前記第1の末端領域および前記第2の末端領域の各々は、該複数のものにおける他の分子の第1鎖の第1の末端領域および第2の末端領域に対して実質的に非自己相補的であり、そして前記第2鎖分子の第1の末端領域および第2の末端領域の各々は、該複数のものにおける他の分子の該第2鎖の第1末端領域および第2末端領域に対して実質的に非自己相補的である、複数のもの。
【請求項234】
請求項232に記載の複数のものであって、ここで前記DNA分子は、前記第1の末端領域および前記第2の末端領域においてホモポリマータグをさらに含み、そして該末端領域は、該分子上の最後から2番目から該ホモポリマータグまでである、複数のもの。
【請求項235】
請求項232に記載の複数のものであって、ゲノムライブラリーとしてさらに規定される、複数のもの。
【請求項236】
物質の限定された供給源からゲノムの配列決定を行う方法であって、該方法は、以下の工程:
物質の限定された供給源から少なくとも1つの二本鎖DNA分子または一本鎖DNA分子を得る工程;
該二本鎖DNA分子を熱に供して、少なくとも1つの一本鎖DNA分子を生成する工程;
該一本鎖DNA分子を複数のプライマーに供して、DNA分子/プライマー混合物を形成する工程であって、ここで、該プライマーは、非自己相補的でありかつ該複数あるうちの他のプライマーに対して実質的に非相補的である、核酸配列を含み、ここで、該配列は、5’→3’方向で、定常領域および可変領域を含む、工程;
ポリメラーゼに供する工程によって、該定常核酸配列を各々末端に含む複数のDNA分子を生成される条件の下、該DNA分子/プライマー混合物を、該供する工程;ならびに
ポリメラーゼ連鎖反応を介して、該複数のDNA分子を増幅する工程であって、該反応は、該定常領域に相補的なプライマーを利用する、工程;
該複数の増幅した分子から、増幅したDNA分子の第1のサンプルおよび第2のサンプルを提供する工程;
該第1のサンプルからの該増幅した少なくともいくらかのDNA分子の配列決定を行い、少なくとも1つの特定のDNA配列を得る工程;
ホモポリマー性のポリC/ポリG配列を、該第2のサンプルからの増幅したDNA分子の末端に組み込み、ホモポリマー性増幅分子を生成する工程;
ホモポリマー性増幅分子のうち少なくともいくつかを、ポリCプライマーおよび該特定のDNA配列に相補的なプライマー用いて該第2のサンプルから増幅する工程;および
さらなる特定配列に関連して、該配列決定工程および増幅工程を反復して、それによって、該ゲノムの実質的に完全なコンティグを生じる工程
を包含する、方法。
【請求項237】
請求項236に記載の方法であって、ここで、前記ホモポリマー性配列を取り込む工程は、以下:
dGTPの存在下で、末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼによって、 前記増幅したDNAフラグメントの3’末端を伸長する工程;
前記ホモポリマー性ポリC/ポリG配列を含むアダプターを、前記増幅したDNAフラグメントの末端に連結させる工程;または、
該増幅したDNAフラグメントと、その5’末端にホモポリマー性ポリC配列を含みかつ該3’末端に定常領域を含むプライマーとを用いて、該増幅したDNAフラグメントを複製する工程
のうち1つを包含する、方法。
【請求項238】
請求項236に記載の方法であって、ここで、前記配列決定工程は、
ベクターに、前記第1のサンプルからの増幅されたDNAフラグメントをクローニングする工程;および該クローニングされたフラグメントのうちの少なくともいくつかを配列決定する工程として、
さらに規定される、方法。
【請求項239】
請求項236に記載の方法であって、ここで、前記増幅分子のうちの特異的配列が、前記第1のサンプルの配列決定工程によって、得られ、かつ、前記さらなる特定配列うちの1以上が、前記第2のサンプルからの増幅された分子の配列決定工程によって得られる、方法。
【請求項240】
請求項236に記載の方法であって、ここで、物質の前記限定された供給源が、培養工程に対して実質的に耐性である微生物である、方法。
【請求項241】
請求項236に記載の方法であって、ここで、物質の前記限定された供給源が、絶滅種である、方法。
【請求項242】
請求項236に記載の方法であって、ここで、前記ゲノムの配列決定工程は、最小の冗長性をもって達成される、方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図14】
【図15】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図47】
【図6A】
【図6B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図16】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図33】
【図39】
【図45】
【図46】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図14】
【図15】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図47】
【図6A】
【図6B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図16】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図33】
【図39】
【図45】
【図46】
【図48】
【図49】
【図50】
【図51】
【公表番号】特表2006−519621(P2006−519621A)
【公表日】平成18年8月31日(2006.8.31)
【国際特許分類】
【出願番号】特願2006−509236(P2006−509236)
【出願日】平成16年3月8日(2004.3.8)
【国際出願番号】PCT/US2004/006983
【国際公開番号】WO2004/081225
【国際公開日】平成16年9月23日(2004.9.23)
【出願人】(505337755)ルビコン ゲノミクス, インコーポレイテッド (1)
【Fターム(参考)】
【公表日】平成18年8月31日(2006.8.31)
【国際特許分類】
【出願日】平成16年3月8日(2004.3.8)
【国際出願番号】PCT/US2004/006983
【国際公開番号】WO2004/081225
【国際公開日】平成16年9月23日(2004.9.23)
【出願人】(505337755)ルビコン ゲノミクス, インコーポレイテッド (1)
【Fターム(参考)】
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