Ｔｈ２介在性状態の治療のためのＫＩＭ−１抗体
【課題】Ｔｈ２介在性疾患およびＴｈ１介在性疾患を治療するための組成物および方法の提供。
【解決手段】本発明は、ＫＩＭ−１の特定領域と結合する抗体などの作用物質が、Ｔｈ１および／またはＴｈ２介在性免疫を差次的に調節することができるという発見に少なくとも一部基づく。例えば、ＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合領域と結合する作用物質は、Ｔｈ２サイトカインの発現を調節することができ、Ｔｈ２介在性障害、例えば喘息を治療するために使用することができ、ＫＩＭ−１のムチン領域内の特定エピトープと結合する作用物質は、病原性Ｔｈ１応答を低減することができ、Ｔｈ１介在性障害、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、多発性硬化症、糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植、膵炎、遅延型過敏症（ＤＴＨ）などの炎症障害または自己免疫性障害を治療するために使用できる。
【解決手段】本発明は、ＫＩＭ−１の特定領域と結合する抗体などの作用物質が、Ｔｈ１および／またはＴｈ２介在性免疫を差次的に調節することができるという発見に少なくとも一部基づく。例えば、ＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合領域と結合する作用物質は、Ｔｈ２サイトカインの発現を調節することができ、Ｔｈ２介在性障害、例えば喘息を治療するために使用することができ、ＫＩＭ−１のムチン領域内の特定エピトープと結合する作用物質は、病原性Ｔｈ１応答を低減することができ、Ｔｈ１介在性障害、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、多発性硬化症、糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植、膵炎、遅延型過敏症（ＤＴＨ）などの炎症障害または自己免疫性障害を治療するために使用できる。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
アレルギー性喘息およびアトピー性皮膚炎などのアトピー性疾患は、Ｔｈ２免疫優性への病原性シフトを伴うと考えられている（Ｕｍｅｔｓｕら、２００２年、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻：７１５〜２０頁）。
【０００２】
喘息状態では、Ｔｈ２サイトカイン生成は肺への好酸球流入、好酸球活性化、ＩｇＥ生成、ＩｇＥ介在性マスト細胞活性化および脱顆粒、ならびに肺間質腔での単核細胞蓄積を駆動する。肺間質腔ではＴ細胞および活性化顆粒球がＴｈ２サイトカイン、ケモカイン、およびエフェクター分子を分泌し続けることによって、肺炎の継続を促進する。ＫＩＭ遺伝子ファミリーを有するＴＡＰＲ遺伝子座は、マウスにおけるアトピー性炎症発生に関係付けられており、ＫＩＭ−１の対立遺伝子変異は、患者のポピュレーション解析においてアトピーの発生率と関連している（非特許文献１；非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ＭｃＩｎｔｉｒｅら、２００１年、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２巻：１１０９〜１６頁
【非特許文献２】ＭｃＩｎｔｉｒｅら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ、４２５巻：５７６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、ＫＩＭ−１の特定領域と結合する抗体などの作用物質が、Ｔｈ１および／またはＴｈ２介在性免疫を差次的に調節することができるという発見に少なくとも一部基づくものである。例えば、ＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合領域と結合する作用物質は、Ｔｈ２サイトカインの発現を調節することができ、Ｔｈ２介在性障害、例えば喘息を治療するために使用することができ、ＫＩＭ−１のムチン領域内の特定エピトープと結合する作用物質は、病原性Ｔｈ１応答を低減することができ、Ｔｈ１介在性障害、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、多発性硬化症、糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植、膵炎、遅延型過敏症（ＤＴＨ）などの炎症障害または自己免疫性障害を治療するために使用することができる。Ｔｈ２介在性障害およびＴｈ１介在性障害の治療に有用な組成物および方法が提供される。
【０００５】
一態様では、本発明は、Ｔｈ２介在性状態、例えば喘息（特にアレルギー性喘息）、アレルギー性鼻炎、アレルギー、湿疹、およびその他のアトピー性状態を治療する方法を提供する。この方法は、Ｔｈ２介在性状態を有する哺乳動物、好ましくはヒトに、ＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフと結合する作用物質を投与することを含む。例えば、この方法は、ＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフと結合する単一特異性抗体、例えばモノクローナル抗体（またはその抗原結合断片）を含有する医薬組成物を、その状態を治療するために十分な量および時間投与することを含みうる。ＫＩＭ−１のストーク領域は、本明細書においてＫＩＭ−１のムチンドメインおよび膜貫通ドメインの間に存在する高度に保存されたＮ−結合グリコシル化部位を含有する荷電ドメインであると同定されている。ヒトＫＩＭ−１のストーク領域およびシアル酸結合モチーフを図１に示す。本明細書に規定されたこれらの領域のＮ末端およびＣ末端はおおよそであり、ＫＩＭ−１配列由来の連続する残基を数個（例えば１、２、または３個）多くまたは少なく有しうる。
【０００６】
一実施形態では、その作用物質は、ヒトＫＩＭ−１ストーク領域に結合する抗体である。例えば、その抗体は、配列
【０００７】
【化１４】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）を有するペプチドと結合する。一実施形態では、その抗体は、配列
【０００８】
【化１５】
（配列番号１のアミノ酸２６２〜２７０）、
【０００９】
【化１６】
（配列番号１のアミノ酸２６０〜２６９）、
【００１０】
【化１７】
（配列番号１のアミノ酸２５７〜２７０）、または
【００１１】
【化１８】
（配列番号１のアミノ酸２５２〜２７０）を有するペプチドに結合する。他の実施形態では、その抗体は、配列番号１のアミノ酸２３６〜２５０または２３６〜２５８の配列を有するペプチドに結合する。
【００１２】
一実施形態では、その抗体はＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフに結合する。例えばその抗体は、配列
【００１３】
【化１９】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【００１４】
【化２０】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）を有するペプチドに含まれるか、またはそれと重複するエピトープに少なくとも部分的に結合する。一実施形態では、その抗体は、還元タンパク質および非還元タンパク質と結合する。すなわち、その抗体は、
【００１５】
【化２１】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【００１６】
【化２２】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０個の連続するアミノ酸残基の直鎖状エピトープと結合する。
【００１７】
別の実施形態では、その抗体は、配列
【００１８】
【化２３】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）および
【００１９】
【化２４】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の一方または両方が寄与する構造エピトープと結合する。一実施形態では、そのエピトープは、組換えマウスＫＩＭ−１ ＩｇＶ−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合体の８ｋＤａのＴＰＣＫトリプシン断片に対応するヒトＫＩＭ−１配列に含まれる構造エピトープでありうる。
【００２０】
一実施形態では、その抗体は、シアル酸の結合に必要な、配列番号１の残基Ｒ８６、Ｗ９２、およびＦ９３のうち１つまたは複数を妨害する。
【００２１】
本明細書に記載した方法が任意の特定のメカニズムにも理論にも拘束されないことが了解されているが、その抗体は１つまたは複数の以下の性質を有しうる：（ａ）その抗体はＫＩＭ−１のＩｇＶドメイン上のシアル酸結合モチーフと、ＫＩＭ−１のストーク領域の１つまたは複数のＮ−グリコシル化部位上に提示された糖質との相互作用を妨害する、（ｂ）その抗体は、ストーク領域の１つまたは複数のＮ−結合グリコシル化部位と結合するか、またはそれを立体的に妨害する、（ｃ）その抗体は、ＫＩＭ−１のシグナル伝達のダウンレギュレーションを阻害する、（ｄ）その抗体はアゴニスト抗体であり、例えばその抗体は、結合時にＫＩＭ−１を経由した下流のシグナル伝達を促進または増大させる、（ｅ）その抗体はＫＩＭ−１の多量体化を遮断する、（ｆ）その抗体は結合するか、ストーク領域と補助受容体もしくはリガンドとの相互作用を立体的に妨害して正常な機能を破壊する、（ｇ）その抗体は、ＫＩＭ−１のＩｇＶドメイン上のシアル酸結合モチーフと、ＫＩＭ−１のストーク領域に隣接するムチン領域の１つまたは複数のＯ−グリコシル化部位上に提示された糖質との相互作用を妨害する、（ｈ）その抗体は、例えばジスルフィド結合または水素結合を変更または妨害することによって、タンパク質のコンホメーションを変えるようにＩｇドメインの構造の特徴を変更する、（ｉ）その抗体はＫＩＭ−１リガンドなどの他のタンパク質との結合を変えるようにＫＩＭ−１のＩｇドメインの構造の特徴または機能的特徴を変更する。
【００２２】
一実施形態では、その抗体は細胞表面からのＫＩＭ−１の分断を阻害しない。例えば、その抗体は培養２９３Ｅｂｎａ（Ｅ２９３）細胞からのＫＩＭ−１の分断を阻害しない。
【００２３】
好ましい実施形態では、その抗体は単一特異性である。例えば、その抗体はモノクローナル抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体もしくは完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【００２４】
一実施形態では、その状態はアレルギー性喘息である。この実施形態では、その方法は場合によりアレルギー性喘息のリスクがあるか、またはアレルギー性喘息を有する対象を同定することも含む。場合により、その方法は、対象における喘息の症状、例えばＩｇＥレベル、気道過敏性、咳、喘鳴、胸部絞扼感、呼吸困難、気道平滑筋収縮、気管支粘液分泌、炎症、血管拡張、炎症細胞（例えば好中球、単球、マクロファージ、リンパ球、好酸球）の動員、杯細胞過形成、マスト細胞または遊走性炎症細胞による炎症メディエータ放出を評価することも含む。その評価のステップは、投与のステップの前、途中、および／または後に行うことができる。その評価は、医師、その他の医療提供者、または対象により行われることがある。その評価は、１回または複数回、例えば投与後に１回または複数回、例えば投与から１週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、またはそれよりも長い期間に少なくとも２回行われることがある。
【００２５】
好ましい実施形態では、その方法は、その作用物質の投与（または多回投与）が対象における気道疾患の１つまたは複数の症状の重症度または開始を低減したかどうか判定することを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、その抗体は、対象における喘息の治療に有効な第２の作用物質、例えばコルチコステロイド、気管支拡張薬、ロイコトリエン修飾因子、抗炎症剤、抗ＩｇＥ剤（例えば抗ＩｇＥ抗体、例えばオマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））と同時投与される。「同時投与」または「組合せ投与」は、患者に及ぼす物質の効果が重複するように、同時またはある間隔以内、例えば１週間以内に投与することを意味する。
【００２７】
別の実施形態では、その状態はアレルギー、例えば食物アレルギーまたは季節性アレルギー（例えば花粉アレルギー）である。アレルギーの診断は、アレルゲン皮膚試験の適用、血清中ＩｇＥ濃度の決定（例えばＩｇＥ＞３００ｎｇ／ｍｌ）、および血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体またはＩｇＧ抗体の決定のうち１つまたは複数により行われる。
【００２８】
その抗体は、１つまたは複数の以下の期間に投与されることがある：アトピーの対象がアレルゲンに曝露される前、アレルゲンへの曝露後であるが症状の発生前、症状の発生時、症状の発生後。
【００２９】
一実施形態では、その作用物質は一連の治療として、例えば所定の回数の定期投与の形で、例えば毎日、毎週、隔週、または毎月投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、喘鳴、咳、息切れ、または胸部絞扼感の発症の回数または重症度を、例えばある期間、例えば３カ月、６カ月、１年、またはそれを超えて低減（例えば実質的に低減）するために十分な期間および／または量で投与されうる。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ＫＩＭ−１のストーク領域と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。その抗体は、培養Ｅ２９３細胞からのＫＩＭ−１の分断を阻害しない。一実施形態では、その抗体はヒトＫＩＭ−１のストーク領域に結合する。例えば、その抗体は、配列
【００３１】
【化２５】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）を有するペプチドと結合する。一実施形態では、その抗体は配列
【００３２】
【化２６】
（配列番号１のアミノ酸２６２〜２７０）、
【００３３】
【化２７】
（配列番号１のアミノ酸２６０〜２７０）、
【００３４】
【化２８】
（配列番号１のアミノ酸２５７〜２７０）、または
【００３５】
【化２９】
（配列番号１のアミノ酸２５２〜２７０）を有するペプチドに結合する。他の実施形態では、その抗体は、配列番号１のアミノ酸２４１〜２５４、２４２〜２５８、および２４２〜２５５の配列を有するペプチドに結合する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、ＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、その抗体は、配列
【００３７】
【化３０】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【００３８】
【化３１】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）を有するペプチドに含まれるか、またはそれと重複するエピトープに少なくとも部分的に結合する。一実施形態では、その抗体は還元タンパク質および非還元タンパク質と結合し、すなわちその抗体は、
【００３９】
【化３２】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【００４０】
【化３３】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０個の連続するアミノ酸残基の直鎖状エピトープと結合する。別の実施形態では、その抗体は、配列
【００４１】
【化３４】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）および
【００４２】
【化３５】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の一方または両方が寄与する構造エピトープと結合する。いくつかの実施形態では、そのエピトープは組換えマウスＫＩＭ−１ ＩｇＶ−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合体の８ｋＤａのＴＰＣＫトリプシン断片に対応するヒトＫＩＭ−１領域に含まれる構造エピトープである。一実施形態では、その抗体はシアル酸の結合に必要な、配列番号１の残基Ｒ８６、Ｗ９２、およびＦ９３の１つまたは複数を妨害する。
【００４３】
単離された抗体は、１つまたは複数の以下の特徴を有しうる：（ａ）その抗体は、ＫＩＭ−１のＩｇＶドメイン上のシアル酸結合モチーフと、ＫＩＭ−１のストーク領域の１つまたは複数のＮ−グリコシル化部位上に提示された糖質との相互作用を妨害する、（ｂ）その抗体は、ストーク領域のＮ−結合グリコシル化部位のうち一方または両方と結合するか、またはそれを立体的に妨害する、（ｃ）その抗体は、ＫＩＭ−１のシグナル伝達のダウンレギュレーションを阻害する、（ｄ）その抗体はアゴニスト抗体であり、例えばその抗体は、結合時にＫＩＭ−１を経由した下流のシグナル伝達を促進または増大させる、（ｅ）その抗体はＫＩＭ−１の多量体化を遮断する、（ｆ）その抗体は、結合するか、またはストーク領域と補助受容体もしくはリガンドとの相互作用を立体的に妨害して正常な機能を破壊する、（ｇ）その抗体は、ＫＩＭ−１のＩｇＶドメイン上のシアル酸結合モチーフと、ＫＩＭ−１のストーク領域に隣接するムチン領域の１つまたは複数のＯ−グリコシル化部位上に提示された糖質との相互作用を妨害する、（ｈ）その抗体は、例えばジスルフィド結合または水素結合を変更または妨害することによって、タンパク質のコンホメーションを変えるようにＩｇドメインの構造特徴を変更する、（ｉ）その抗体は、ＫＩＭ−１リガンドなどの他のタンパク質への結合を変えるようにＫＩＭ−１のＩｇドメインの構造または機能特徴を変更する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、Ｔｈ１介在性状態、例えば病原性または増加したＴｈ１応答を特徴とする状態を治療する方法を特徴とする。そのような状態には、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、多発性硬化症、糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植、膵炎、遅延型過敏症（ＤＴＨ）などの炎症障害および／またはニコ免疫性障害が挙げられる。この方法は、Ｔｈ１介在性状態を有する哺乳動物、好ましくはヒトに、配列
【００４５】
【化３６】
（配列番号１の残基２００〜２３５）に含まれるエピトープと結合する作用物質、例えば抗体を投与することを含む。例えば、この方法は、ＫＩＭ−１の特定の領域と結合する単一特異性抗体、例えばモノクローナル抗体（またはその抗原結合断片）を含有する医薬組成物を、その状態を治療するために十分な量および時間で投与することを含みうる。そのＫＩＭ−１の特定の領域はマウスにおいて選択的スプライシングされたＫＩＭ−１変異体に見出される。本明細書に定義されたこの領域のＮ末端およびＣ末端はおおよそであり、ＫＩＭ−１配列由来の連続する残基を少数（例えば１個または２個）多く、または少なく含有しうる。
【００４６】
一実施形態では、その抗体は還元タンパク質および非還元タンパク質と結合する。
【００４７】
好ましい実施形態では、その抗体は単一特異性であり、例えばその抗体はモノクローナル抗体、例えばヒト化もしくは完全ヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である。
【００４８】
一実施形態では、その状態は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、リウマチ性関節炎、乾癬、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植、膵炎、または遅延型過敏症（ＤＴＨ）である。場合によりその方法は、挙げられた任意の状態のリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定することも含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、その方法は、その作用物質の投与（または多回投与）が対象の状態の１つまたは複数の症状の重症度または開始を低減するかどうかを判定することを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、その抗体は対象における状態を治療するために有効な第２の作用物質、例えばコルチコステロイドまたは他の抗炎症剤、ＤＭＡＲＤ、抗ＴＮＦ療法、または抗ＣＤ２０療法と同時投与される。「同時投与」または「組合せ投与」は、患者に及ぼす物質の効果が重複するように、同時またはある間隔以内、例えば１週間以内に投与することを意味する。
【００５１】
一実施形態では、その作用物質は一連の治療として、例えば所定の回数の定期投与の形で、例えば毎日、毎週、隔週、または毎月投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、症状の回数または重症度を、例えばある期間、例えば３カ月、６カ月、１年、またはそれを超えて低減（例えば実質的に低減）するために十分な期間および／または量で投与されうる。
【００５２】
本明細書に使用する用語「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、病理学的状態を特徴付ける症状またはパラメータを改善または回復させるために；病理学的状態を特徴付ける症状またはパラメータの重症度を低減するために；病理学的状態の進行を防止、減速、もしくは逆転するために；または病理学的状態の１つもしくは複数の症状もしくはパラメータを防止するために有効な量、方法、および／または様式で治療を施すことを表す。
【００５３】
本明細書に使用する、ＫＩＭ−１の特定ドメインと「結合する作用物質」は、その特定のドメインに１０−６Ｍ未満のＫｄで結合する任意の化合物を表す。ＫＩＭ−１結合剤の例は、ＫＩＭ−１結合タンパク質、例えばＫＩＭ−１結合抗体、好ましくは単一特異性抗体である。
【００５４】
本明細書に使用する用語「シアル酸結合領域」、「シアル酸結合モチーフ」、および「シアル酸結合に必要な」、ならびにこれらの用語の変形は、糖質の結合に必要なシアル酸結合Ｉｇ様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）ファミリーで同定されたアミノ酸残基、アミノ酸配列、ならびにアミノ酸二次構造および三次構造に類似した、または相同なアミノ酸残基、アミノ酸配列、ならびにアミノ酸二次構造および三次構造を表す。
【００５５】
用語「抗体またはその抗原結合断片」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域を含むタンパク質、例えば抗原と特異的に結合するために十分な免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を提供するアミノ酸配列を含むタンパク質を包含する。例えばこの用語は、１つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および１つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）を有する抗原結合タンパク質を含む。別の例では、この用語は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質を含む。この用語は、抗体の抗原結合断片（例えば単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、およびｄＡｂ断片）ならびに完全抗体、例えばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭタイプ（およびそのサブタイプ）の無傷免疫グロブリンを包含する。免疫グロブリン軽鎖は、κまたはλタイプでありうる。一実施形態では、その抗体はグリコシル化されている。抗体は抗体依存性細胞傷害作用および／または補体介在性細胞傷害作用について機能的でありうるし、これらの活性の一方または両方について非機能的でありうる。ＶＨおよびＶＬ領域を、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と名付けられた超可変領域にさらに細分することができる。その超可変領域には、それよりも保存性の高い「フレームワーク領域」（ＦＲ）と名付けられた領域が分散している。ＦＲおよびＣＤＲの程度が精密に定義されている（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版」、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第９１−３２４２号、およびＣｈｏｔｈｉａ， Ｃ．ら（１９８７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁参照）。Ｋａｂａｔの定義を本明細書に使用する。各ＶＨおよびＶＬは、通常、以下の順序でアミノ末端からカルボキシル末端に配列した３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００５６】
前述の概要および後述の説明は、請求される発明を限定するものではない。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳動物におけるＴｈ２介在性障害を治療する方法であって、該哺乳動物にＫＩＭ−１のストーク領域と結合する抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
（項目２）
前記哺乳動物がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記障害がアトピーである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記障害が喘息である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記抗体が、ペプチド
【化１】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目６）
前記抗体がヒト化または完全ヒト単一特異性抗体である、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目７）
前記抗体がヒト化または完全ヒト単一特異性抗体であり、ペプチド
【化２】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目８）
全長抗体が投与される、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目９）
全長抗体が投与され、該抗体が、ペプチド
【化３】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１０）
抗体の抗原結合断片が投与される、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１１）
抗体の抗原結合断片が投与され、前記抗体が、ペプチド
【化４】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１２）
前記抗原結合断片が、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、およびｄＡｂ断片からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記抗原結合断片が、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、およびｄＡｂ断片からなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記障害についての第２の治療剤と組み合わせて投与される、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１５）
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記障害についての第２の治療剤と組み合わせて投与され、該抗体が、ペプチド
【化５】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１６）
前記抗体またはその抗原結合断片が、０．０５ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与される、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１７）
前記抗体またはその抗原結合断片が、０．０５ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与され、該抗体が、ペプチド
【化６】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１８）
ＫＩＭ−１のストーク領域と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体は、培養物においてＥ２９３細胞からのＫＩＭ−１の分断を阻害しない、抗体またはその抗原結合断片。
（項目１９）
前記抗体が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸２６２〜２７０、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸２６０〜２６９、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２５７〜２７０、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２５２〜２７０、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸２３６〜２５０、および
（ｆ）配列番号１のアミノ酸２３６〜２５８
からなる群から選択される配列を有するペプチドに結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目２０）
前記抗体はヒト化または完全ヒト単一特異性抗体である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
全長抗体が投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記抗体の抗原結合断片が投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記障害についての第２の治療剤と組み合わせて投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記抗体またはその抗原結合断片が０．０５ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
哺乳動物におけるＴｈ１介在性障害を治療する方法または病原性Ｔｈ１応答を低減する方法であって、該哺乳動物に、ヒトＫＩＭ−１の配列
【化７】
（配列番号１のアミノ酸２００〜２３５）または該配列と重複するエピトープと結合する抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
（項目２６）
前記哺乳動物がヒトである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記抗体がヒト化または完全ヒト単一特異性抗体である、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
全長抗体が投与される、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記抗体の抗原結合断片が投与される、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記障害についての第２の治療剤と組み合わせて投与される、項目２５に記載の方法。
（項目３１）
前記抗体またはその抗原結合断片が、０．０５ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与される、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
哺乳動物におけるＴｈ２介在性障害を治療する方法であって、該哺乳動物に、ＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフと結合する抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
（項目３３）
前記抗体が、配列
【化８】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【化９】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）を有するペプチドに含まれるか、またはそれと重複するエピトープに少なくとも部分的に結合する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記抗体が、
【化１０】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【化１１】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の連続するアミノ酸残基の直鎖状エピトープと結合する、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記抗体が、配列
【化１２】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）および
【化１３】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の一方または両方が寄与する構造エピトープと結合する、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸８１〜１０７を保護する、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
前記抗体が、配列番号１の残基Ｒ８６、Ｗ９２、およびＦ９３のうち１つまたはそれより多くを妨害する、項目３２に記載の方法。
（項目３８）
前記哺乳動物がヒトである、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記障害がアトピーである、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目４０）
前記障害が喘息である、項目１に記載の方法。
（項目４１）
前記抗体がヒト化または完全ヒト単一特異性抗体である、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目４２）
全長抗体が投与される、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目４３）
前記抗体の抗原結合断片が投与される、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目４４）
前記抗原結合断片が、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、およびｄＡｂ断片からなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記障害についての第２の治療剤と組み合わせて投与される、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目４６）
前記抗体またはその抗原結合断片が、０．０５ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与される、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本明細書に記載した様々なドメインを示す（シグナル配列および挿入多型ＭＴＴＶＰを有さない）ヒトＫＩＭ−１の注釈付きポリペプチド配列（配列番号１）である。
【図２】図２は、ＯＶＡを用いたエアロゾル誘発および３Ａ２を用いた処置後の気管支洗浄液（ＢＡＬ）中に存在する好酸球の率（ｙ軸）を示すグラフである。
【図３】図３は、ＯＶＡ抗原を用いたｅｘ ｖｉｖｏ刺激および３Ａ２を用いた処置後の所属（気管支）リンパ節細胞の増殖を示すグラフである。ｙ軸はトリチウムチミジンの取込みをｃｐｍ単位で表したものである。
【図４】図４は、ＯＶＡ抗原を用いたｅｘ ｖｉｖｏ刺激に対する所属（気管支）リンパ節細胞の応答を示すグラフである。ＬＮをＯＶＡのエアロゾル誘発後に採取し、次にＯＶＡと共にｅｘ ｖｉｖｏ培養し、３Ａ２で処理した。これらの培養物から上清を採り、ＴＨ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０）生成について分析した。ｙ軸はピコグラム／ｍｌである。
【図５】図５は、３Ａ２と固定化タンパク質との相互作用について作成した結合曲線を示す。ＭＡｂ ３Ａ２は、ｍＫＩＭ−１−ＥＣＤ−Ｆｃ（丸）、ｍＫＩＭ−１−１３７〜２１６−Ｆｃ（三角）、およびｍＫＩＭ−１−１９６〜２１６−Ｆｃ（菱形）と等価的に結合したが、ｍＫＩＭ−１−ＩｇＶ−Ｆｃ（四角）とは結合しなかった。
【図６】図６は、ＯＶＡを用いたエアロゾル誘発および４Ａ２を用いた処置後に気管支洗浄液（ＢＡＬ）に存在する好酸球およびリンパ球の率（ｙ軸）を示すグラフである。
【図７】図７は、ＯＶＡ抗原を用いたｅｘ ｖｉｖｏ刺激および４Ａ２を用いた処置に対する所属（気管支）リンパ節細胞の応答を示すグラフである。ＬＮをＯＶＡのエアロゾル誘発後に採取し、次にＯＶＡと共にｅｘ ｖｉｖｏ培養した。これらの培養物から上清を採り、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３）生成について分析した。ｙ軸はピコグラム／ｍｌである。
【図８】図８は、ＯＶＡを用いたエアロゾル誘発および４Ａ２を用いた治療的処置後に気管支洗浄液（ＢＡＬ）に存在する好酸球の率（ｙ軸）を示すグラフである。
【図９】図９は、精製ＫＩＭ−１タンパク質に対するｍＡｂ ４Ａ２の結合曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載するように、抗体療法を用いたＫＩＭ−１の特定領域のターゲティングは、Ｔｈ２およびＴｈ１サイトカインの発現に対して重大な制御を及ぼし、Ｔｈ２介在性疾患およびその他のアトピー性障害を治療するための、そしてＴｈ１介在性疾患のための治療戦略を提供する。
【００５９】
抗体の作成
本明細書に記載する抗体（例えばＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフに結合する抗体）を、例えば動物を使用した免疫処置によって、またはファージディスプレイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって作成することができる。ＫＩＭ−１の標的エピトープ（例えばＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフ）を含むポリペプチドを免疫原として使用することができる。他の実施形態では、ＫＩＭ−１ポリペプチドのより大きな部分、例えば細胞外ドメインを免疫原として使用することができ、結果として生じた抗体を、所望のＫＩＭ−１領域またはドメインとの反応性についてスクリーニングすることができる。
【００６０】
一実施形態では、免疫処置された動物は、天然、ヒト、または部分的ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有する免疫グロブリン生成細胞を含む。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を有し、マウス抗体生成を欠損したマウス系統を操作することが可能である。ハイブリドーマ技法を使用して、それらの遺伝子由来の所望の特異性を有する抗原特異的モノクローナル抗体を生成させて選択することができる。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７巻：１３〜２１頁（１９９４年）、ＵＳ２００３−００７０１８５、米国特許第５７８９６５０号、およびＷＯ９６／３４０９６を参照されたい。
【００６１】
ＫＩＭ−１に対する非ヒト抗体を例えば齧歯動物において生成させることもできる。その非ヒト抗体を、例えば米国特許第６６０２５０３号、ＥＰ２３９４００、米国特許第５６９３７６１号、および米国特許第６４０７２１３号に記載されたようにヒト化することができる。
【００６２】
ＥＰ２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒら）は、ある種についての相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の種由来のＣＤＲに（与えられた可変領域内で）置換することにより、抗体を変更することを記載している。ＣＤＲを置換された抗体は、非ヒト構成要素をあまり含まないので、ＣＤＲを置換された抗体は、真のキメラ抗体に比べてヒトに免疫応答を誘発する見込みが少なくなりうる。（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻、１５３４〜１５３６頁）。組換え核酸技法を使用することによりマウス抗体のＣＤＲがヒト抗体の対応する領域に代わって入り、所望の置換された抗体をコードしている配列が生成した。所望のアイソタイプ（通常はＣＨについてγＩであり、ＣＬについてκ）のヒト定常領域遺伝子セグメントを付加することができ、ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞に同時発現させて可溶性ヒト化抗体を生成することができる。
【００６３】
Ｑｕｅｅｎら、１９８９年およびＷＯ９０／０７８６１は、本来のマウス抗体のＶ領域フレームワークに最適なタンパク質配列相同性についてコンピュータ解析することにより、ヒトＶフレームワーク領域を選択すること、およびマウスＣＤＲと相互作用する見込みの高いフレームワークアミノ酸残基を可視化するためにマウスＶ領域の三次構造をモデル化することを含む方法を記載している。次に、これらのマウスアミノ酸残基を相同なヒトフレームワークと重ね合わす。米国特許第５６９３７６２号、第５６９３７６１号、第５５８５０８９号、および第５５３０１０１号も参照されたい。Ｔｅｍｐｅｓｔら、１９９１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、２６６〜２７１頁は、マウス残基の根本的な導入なしにＣＤＲを接合するためにＮＥＷＭおよびＲＥＩの重鎖および軽鎖由来のＶ領域フレームワークをそれぞれ標準として利用している。ＮＥＷＭおよびＲＥＩに基づくヒト化抗体を構築するためにＴｅｍｐｅｓｔらの取組みを使用する利点は、ＮＥＷＭおよびＲＥＩの可変領域の三次元構造がＸ線結晶学から公知であり、よってＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基との間の特異的相互作用をモデル化できることである。
【００６４】
非ヒト抗体を修飾して、ヒト免疫グロブリン配列を挿入する置換を、例えば特定の位置でのコンセンサスヒトアミノ酸残基を例えば１つまたは複数（好ましくは少なくとも５、１０、１２個、または全て）の以下の位置で含ませることができる：（軽鎖可変ドメインＦＲ中の） ４Ｌ、３５Ｌ、３６Ｌ、３８Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、５８Ｌ、４６Ｌ、６２Ｌ、６３Ｌ、６４Ｌ、６５Ｌ、６６Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、６９Ｌ、７０Ｌ、７１Ｌ、７３Ｌ、８５Ｌ、８７Ｌ、９８Ｌ、および／または（重鎖可変ドメインＦＲ中の）２Ｈ、４Ｈ、２４Ｈ、３６Ｈ、３７Ｈ、３９Ｈ、４３Ｈ、４５Ｈ、４９Ｈ、５８Ｈ、６０Ｈ、６７Ｈ、６８Ｈ、６９Ｈ、７０Ｈ、７３Ｈ、７４Ｈ、７５Ｈ、７８Ｈ、９１Ｈ、９２Ｈ、９３Ｈ、および／または１０３Ｈ（Ｋａｂａｔの番号付けによる）。例えば、米国特許第６４０７２１３号を参照されたい。
【００６５】
ＫＩＭ−１の所望の領域に結合する完全ヒトモノクローナル抗体は、例えばＢｏｅｒｎｅｒら、１９９１年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻、８６〜９５頁に記載されているようにｉｎ ｖｉｔｒｏで初回免疫を受けたヒト脾臓細胞を使用して生成することができる。Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：２４３２〜２４３６頁、またはＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ、１９９１年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４１巻、２２７〜２３６頁、または米国特許第５７９８２３０号により記載されたレパートリークローニングによりそのモノクローナル抗体を調製することができる。大規模な非免疫処置ヒトファージディスプレイライブラリーを使用して、標準的なファージ技法を使用してヒト治療薬として開発することのできる高親和性抗体を単離することもできる（例えばＶａｕｇｈａｎら、１９９６年； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４巻：１〜２０頁；およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、２巻：３７１〜８頁；ＵＳ２００３−０２３２３３３参照）。
【００６６】
本明細書に使用する「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することのできるアミノ酸配列を表す。例えば、その配列は、天然可変ドメインのアミノ酸配列の全てまたは一部を含みうる。例えば、その配列から１個、２個、またはそれを超えるＮ末端またはＣ末端アミノ酸が取り除かれることがあり、内部のアミノ酸は、１つまたは複数の挿入または追加の末端アミノ酸を含むことがあるし、他の変更を含むことがある。一実施形態では、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と関連して標的結合構造（すなわち「抗原結合部位」）、例えばＫＩＭ−１の特定の領域と相互作用する構造を形成することがある。
【００６７】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は、重鎖または軽鎖定常領域の全てまたは一部をさらに含むことによって、それぞれ免疫グロブリン重鎖または軽鎖を形成することがある。一実施形態では、その抗体は、２本の免疫グロブリン軽鎖および２本の免疫グロブリン重鎖の四量体である。免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、ジスルフィド結合により繋がっていることがある。重鎖定常領域は、典型的には３つの定常ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、典型的にはＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた、宿主の組織または作用物質へのその抗体の結合を仲介する。
【００６８】
抗体の１つまたは複数の領域は、ヒト、事実上のヒト、またはヒト化でありうる。例えば１つまたは複数の可変領域はヒトまたは事実上のヒトでありうる。例えば、１つまたは複数のＣＤＲ、例えばＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３はヒトでありうる。軽鎖ＣＤＲのそれぞれはヒトでありうる。ＨＣ ＣＤＲ３はヒトでありうる。１つまたは複数のフレームワーク領域は、ヒト、例えばＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４でありうる。一実施形態では、全てのフレームワーク領域はヒトであり、例えばヒト体細胞、例えば免疫グロブリンを生成する造血細胞または非造血細胞由来である。一実施形態では、ヒト配列は、例えば生殖細胞系核酸にコードされている生殖細胞系配列である。１つまたは複数の定常領域は、ヒト、事実上のヒト、またはヒト化でありうる。別の実施形態では、フレームワーク領域（例えばＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３をまとめて、またはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４をまとめて）の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、もしくは９８％、またはその抗体全体は、ヒト、事実上のヒト、またはヒト化でありうる。例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３はまとめてヒト生殖細胞系セグメントによりコードされているヒト配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８、または９９％同一でありうる。
【００６９】
「事実上のヒト」免疫グロブリン可変領域は、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む結果、その免疫グロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しない免疫グロブリン可変領域である。「事実上のヒト」抗体は、十分な数のヒトアミノ酸位置を含む結果、その抗体は正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しない。
【００７０】
「ヒト化」免疫グロブリン可変領域は、修飾されている結果、その修飾された形態がヒトにおいて非修飾形態よりも小さい免疫応答を誘発する免疫グロブリン可変領域であり、例えば修飾されて十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む結果、その免疫グロブリン可変領域は正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しない。「ヒト化」免疫グロブリンの記載には、例えば米国特許第６４０７２１３号および米国特許第５６９３７６２号が挙げられる。一部の例では、ヒト化免疫グロブリンは、１つまたは複数のフレームワークアミノ酸位置に非ヒトアミノ酸を含むことがある。
【００７１】
抗体の全てまたは一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによりコードされうる。ヒト免疫グロブリン遺伝子の例には、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）が可変領域遺伝子により、そしてＣＯＯＨ末端がκまたはλ定常領域遺伝子によりコードされている。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）およびその他の前述の定常領域遺伝子の１つ、例えばγ（約３３０アミノ酸をコードしている）により同様にコードされている。
【００７２】
全長抗体の「抗原結合断片」という用語は、対象となる標的に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の１つまたは複数の断片を表す。全長抗体の「抗原結合断片」という用語の中に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる１価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのＦａｂ断片を含む２価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁）；および（ｖｉ）機能性を保持する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、組換え法を使用して、それらのドメインをタンパク質１本鎖として作製できるようにする合成リンカーによりそれらを繋ぐことができる。そのタンパク質１本鎖では、ＶＬおよびＶＨ領域の対が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である１価分子を形成する。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻：５８７９〜５８８３頁を参照されたい。
【００７３】
抗体の生産
原核細胞および真核細胞において抗体を生産することができる。一実施形態では、抗体（例えばｓｃＦｖ）はピキア（例えば Ｐｏｗｅｒｓら（２００１年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２５１巻：１２３〜３５頁参照）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｕｌａ）、またはサッカロミセスなどの酵母細胞において発現される。
【００７４】
一実施形態では、抗体、特に全長抗体、例えばＩｇＧの全長抗体は哺乳動物細胞において生産される。組換え発現用の哺乳動物宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ（１９８２年）、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１５９巻：６０１〜６２１頁に記載されたＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７巻：４２１６〜４２２０頁に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、リンパ細胞系、例えばＮＳ０骨髄腫細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２、ならびにトランスジェニック動物由来の細胞、例えばトランスジェニック哺乳動物由来の細胞が挙げられる。例えば、その細胞は哺乳動物上皮細胞である。
【００７５】
免疫グロブリンドメインをコードしている核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択マーカー遺伝子などの追加の核酸配列を有することがある。選択マーカー遺伝子は、そのベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば米国特許第４３９９２１６号、第４６３４６６５号、および第５１７９０１７号参照）。選択マーカー遺伝子の例には、（ｄｈｆｒ−宿主細胞においてメトトレキサート選択／増幅と共に使用するための）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８選択用の）ｎｅｏ遺伝子が挙げられる。
【００７６】
抗体（例えば全長抗体またはその抗原結合部分）の組換え発現用の系の例では、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードしている組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム介在性トランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖および軽鎖遺伝子は、それぞれ（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなど由来のＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなどの）エンハンサー／プロモーター調節エレメントと作動可能に連結して高レベルの遺伝子転写を駆動する。組換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も有し、ＤＨＦＲ遺伝子は、メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体宿主細胞を培養して、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にし、無傷抗体を培養液から回収する。標準的な分子生物学の技法を使用して組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養液から抗体を回収する。例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより一部の抗体を単離することができる。
【００７７】
抗体は、修飾、例えばＦｃの機能を変更する修飾を含み、例えばＦｃ受容体もしくはＣ１ｑとの、またはその両方との相互作用が減少または除去されることもある。例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を１つまたは複数の残基で、例えば米国特許第５６４８２６０号の番号付けによる、例えば残基２３４および３４７の１つまたは複数で突然変異させることができる。その他の修飾の例には、米国特許第５６４８２６０号に記載された修飾が挙げられる。
【００７８】
Ｆｃドメインを含む一部の抗体について抗体生産系を設計して、Ｆｃ領域がグリコシル化されている抗体を合成することができる。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインをＣＨ２ドメインのアスパラギン２９７でグリコシル化する。このアスパラギンは、２分岐型オリゴ糖を用いた修飾のための部位である。このグリコシル化は、Ｆｃγ受容体および補体Ｃ１ｑによって仲介されるエフェクター機能に関与する（ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ（１９９２年）Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５１巻：１〜８４頁；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．、１６３巻：５９〜７６頁）。アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系でこのＦｃドメインを生産することができる。このＦｃドメインは他の真核生物の翻訳後修飾も含むことがある。
【００７９】
トランスジェニック動物により抗体を生産することもできる。例えば、米国特許第５８４９９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺に抗体を発現させる方法を記載している。乳汁特異的プロモーターと、対象となる抗体、例えば本明細書に記載した抗体、および分泌のためのシグナル配列をコードしている核酸配列とを含む導入遺伝子を構築する。当該トランスジェニック哺乳動物の雌により生産される乳汁は、その中に分泌された対象となる抗体、例えば本明細書に記載した抗体を含む。その抗体を乳汁から精製することができるし、一部の適用には直接使用することができる。
【００８０】
例えば抗体の安定化および／または循環、例えば血液、血清、リンパ液、気管支洗浄液、もしくは他の組織における貯留を、例えば少なくとも１．５、２、５、１０、または５０倍高める部分を用いて、抗体を修飾することができる。
【００８１】
一例では、ＫＩＭ−１結合抗体は、ポリマー、例えばポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドなどの実質的に非抗原性のポリマーと関連していることがある。適切なポリマーは、重量により実質的に変動するものである。平均分子量が約２００から約３５０００ダルトン（または約１０００から約１５０００、および２０００から約１２５００）の範囲を有するポリマーを使用することができる。
【００８２】
別の例では、ＫＩＭ−１結合抗体は、水溶性ポリマー、例えば親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンと複合していることがある。当該ポリマーの非限定的な一覧表には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマーおよび（そのブロックコポリマーの水溶性が維持されるという条件で）そのブロックコポリマーが挙げられる。追加的に有用なポリマーには、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）などのポリオキシアルキレン；ポリメタクリル酸エステル；カルボマー；糖単量体であるＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコース、およびノイラミン酸を含む分岐または非分岐多糖であって、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸性ムコ多糖の多糖サブユニット、例えばヒアルロン酸を含めた分岐または非分岐多糖；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマー；ヘパリンまたはヘパラン（ｈｅｐａｒｏｎ）が挙げられる。
【００８３】
用途および投与方法
本明細書に記載した方法では、Ｔｈ２介在性状態またはＴｈ１介在性状態を治療するために、対象にＫＩＭ−１の特定領域と結合する抗体などの作用物質を投与する。治療される対象は哺乳動物、例えばヒトである。
【００８４】
「投与」は、いかなる特定の製剤、送達系、および経路にも限定されず、例えば気管支内、非経口（皮下、静脈内、脊髄内、関節内、筋肉内、または腹腔内注射を含む）、直腸内、局所、経皮、または経口（例えばカプセル剤、懸濁剤、または錠剤の形）を含みうる。投与は、単回投与または繰り返しで、生理学的に許容できる塩の形態を含有する多様な医薬組成物のうち任意のものとして、および／または許容できる医薬賦形剤と共に提供されうる。生理学的に許容できる塩の形態および医薬製剤および賦形剤は公知である（例えば２００４ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）（ＰＤＲ）（２００３年）Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、第５８版；Ｇｅｎｎａｄｏら（２０００年）、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ参照。
【００８５】
喘息の管理および治療に多数の治療剤が有用である。これらには、気管支拡張薬、例えば気道を弛緩させる抗コリン作用性気管支拡張薬（例えば臭化イプラトロピウム、アルブテロール／臭化イプラトロピウム）；気道筋を弛緩させるベータ作動薬（例えばエピネフリン、メタプロテレノール、テルブタリン、メシル酸イソエタリン、イソエタリン、イスプレル、ピルブテロール、アルブテロール、サルメテロール、ビトルテロール）；炎症を軽減する経口または吸入コルチコステロイド（例えばヒドロコルチゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フルニソリド、トリアムシノロン、ベクロメタゾン（ｂｅｃｌｏｍｅｔｈｏｓｏｎｅ）、デキサメタゾン、フルチカソン、ブデソニド）；気道の腫脹および気流遮断を防止して粘液産生を減少させるロイコトリエン調節因子（例えばザフィルルカスト、モンテルカストナトリウム、ジロイトン）；およびとりわけ気道開放を助け、痰の放出を減らすテオフィリンが挙げられるが、それに限定されるわけではない。抗喘息薬には、抗ＩｇＥ、抗ＩＬ−９、抗ＩＬ−３、抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−１３、抗ＶＬＡタンパク質、および抗遊走阻止因子（ＭＩＦ）を非限定的に含めた治療用抗体（またはその機能的断片）も含まれる。本明細書に記載した抗体を、１つまたは複数の前述の作用物質と組み合わせて投与してアレルギー性喘息を治療することができる。
【００８６】
Ｔｈ１介在性炎症状態の管理および治療に有用な治療剤には、抗炎症化合物、例えばステロイドおよびＮＳＡＩＤが挙げられる。
【００８７】
公知の変換係数を使用して、ある動物モデルで実現された治療有効投薬量を、ヒトを含めた別の動物での使用のために変換することができる（例えばＦｒｅｉｒｅｉｃｈら（１９６６年） Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｒｅｐｏｒｔｓ、５０巻（４）：２１９〜２４４頁参照。
【００８８】
以下の実施例は例示的な実施形態を提供するものである。この実施例は、本発明を決して限定するものではない。当業者は、本発明の範囲内で行うことができる多数の修飾および変更を認識しているであろう。したがって、そのような修飾および変更は本発明に包含される。
【実施例】
【００８９】
（実施例１：マウスＫＩＭ−１に対するラットモノクローナル抗体の特徴付け）
標準的なＰＣＲおよびクローニング技法を使用して、全長細胞外ドメインのマウスＫＩＭ−１発現構築物およびＩｇＶドメインのみのマウスＫＩＭ−１発現構築物を作成し、ＣＨＯ細胞にそれを安定的にトランスフェクトした。これらの融合タンパク質をＣＨＯ細胞系の上清からプロテインＡおよびＳＥＣクロマトグラフィーにより精製した。ヒトＩｇＧ１−Ｆｃドメインに融合した全長ＫＩＭ−１は、グリコシル化の差に一致したダブレットとして出現した。細胞外ドメイン全体からなる全長マウスＫＩＭ−１−Ｉｇ融合蛋白質を用いてラットに免疫処置を行った。ｍＫＩＭ−１に対する１集団のラットモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡアッセイおよびＦＡＣＳスクリーニングにより同定し、これらのセットをＢｉａｃｏｒｅにより、ならびにドメイン特異的ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析によりさらに特徴付けた。これにより、別個のエピトープに結合する多数の抗体がこの集団中に提示されることを実証した。このように、７個の抗体がＢｉａｃｏｒｅおよびＥＬＩＳＡ分析で全長タンパク質と結合したが、これら７個のうち４個はＩｇＶドメインのみをコードしているタンパク質に結合しなかった（表１）。Ｂｉａｃｏｒｅ形式で結合するムチンストークドメインの存在を必要とすると思われる４個の抗体のうち、３個がムチンドメイン内で結合することがＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析でさらに確定されたが、１個はストークドメインで結合した（表１）。いくつかの抗体は、ムチンドメイン内でエキソン４によりコードされている別個の領域を認識した（表１）。このように、ＩｇＶドメイン、ムチンドメイン、およびストークドメインを認識する抗体が同定された。表１に、ラット抗ｍＫＩＭ−１ ｍＡｂの概略のエピトープマッピングの結果を示す。表１のデータを、完全なＥＣＤのＫＩＭ−１−Ｉｇ、ＫＩＭ−１−ＩｇＶ−Ｉｇ、およびＫＩＭ−１−Ｉｇタンパク質のタンパク質分解断片を使用した多数のアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、およびＦＡＣＳ）から編集した。
【００９０】
【表１】
（実施例２：機能亢進肺におけるＫＩＭ−１発現の誘導）
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＯＶＡ／ミョウバンで２回感作し、次に３週間休ませ、その期間に噴霧器を使用してマウスにＯＶＡエアロゾルの３日間の曝露を受けさせた。肺組織、所属（気管支）リンパ節、および脾臓を採取し、ＲＴ−ＰＣＲによりＫＩＭ−１の発現誘導について調べた。ＫＩＭ−１のメッセージは、噴霧の２４時間後までに気管支ＬＮおよび肺組織の両方に誘導された。ＫＩＭ−１のｍＲＮＡレベルとは対照的に、ＫＩＭ−３のｍＲＮＡレベルはＯＶＡエアロゾルを用いた攻撃誘発後に調節されなかった。ＫＩＭ−２レベルはＫＩＭ−１に同様の様式でアップレギュレーションされた。
【００９１】
（実施例３：ＯＶＡ誘導過反応性に及ぼす抗ＫＩＭ−１抗体の作用）
ＯＶＡエアロゾルモデルを使用して、そして予防投薬方式および治療投薬方式の両方を使用して、肺炎の発生に影響する能力について、異なるエピトープ特異性を有する抗ＫＩＭ−１抗体を試験した。
【００９２】
予防的研究に関して、ＯＶＡにより誘導された肺炎のアッセイおよびリコールアッセイを以下のように行った。１日目および７日目にＢａｌｂ／ｃマウスに、ＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州、米国）１００μｌと混合した０．５ｍｇ／ｍｌ ＯＶＡ（グレードＶ、Ｓｉｇｍａ）１００μｌのｉｐ注射を与えた。２回目の注射の３週間後に超音波噴霧器（Ｄｅｖｉｌｂｉｓｓ、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）を使用してＰＢＳ中の１％ＯＶＡのアエロゾルにマウスを１日２０分間、３日間にわたり曝露した。ｍＡｂの投与を以下のように行った。１、３、６、および９日目に２００μｇを与え、次に噴霧を開始した日に５００μｇをｉｐ投与した。
【００９３】
治療的研究に関して、マウスを上記のようにミョウバン中のＯＶＡで免疫処置したが、一連の噴霧の直前までｍＡｂは投与しなかった。このように２５０μｇのｍＡｂ ４Ａ２を初回噴霧の前日に与え、２５０μｇのｍＡｂ ４Ａ２を２回目の噴霧の朝に与えた。
【００９４】
予防的研究および治療的研究の両方で、最終噴霧セッションの２日後にマウスを屠殺して分析に供した。気管切開によって、０．１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで３回洗浄することを採用して気管支洗浄液（ＢＡＬ）を収集した。サイトスピンおよび被覆スライド（Ｓｈａｎｄｏｎ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）を使用してＢＡＬ細胞をペレットにして、次に風乾し、異なる細胞集団を同定するためにＨｅｍａ３色素（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）で染色した。日常的な組織観察のために肺組織を中性緩衝ホルマリンの中に採取するか、後でＲＮＡを単離するためにトリゾール中で急速凍結した。所属（気管支）リンパ節および脾臓を単核細胞の単離のために採取し、様々な濃度のＯＶＡを有するＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳの中でそれを培養状態に置いた。７２時間後に上清を採取し、細胞を１μＣｉトリチウムチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）で８時間パルスし、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａｊｅｔシステム（Ｗａｌｌａｃ、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、米国）を使用してプレートを計数した。Ｔｈ１／Ｔｈ２および炎症のＣＢＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ならびにＩＬ−１３ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を使用して上清を分析した。
【００９５】
結果：
ＯＶＡ初回免疫期および攻撃誘発期の間に抗体をマウスに投与した。攻撃誘発後に気管支洗浄液（ＢＡＬ）、気管支リンパ節、脾臓、および肺組織を採取した。ＢＡＬに存在する好酸球、好中球、およびリンパ球の率を計算した。ｍＡｂ １Ｈ８は処置されたマウスのＢＡＬ中に好酸球数を強く誘導した結果、存在する好酸球の率は対照の２倍を超えた。ＢＡＬの細胞性のわずかな部分を構成する好中球およびリンパ球の率の中程度の増加も認められた。この結果に一致して、１Ｈ８で処置されたマウスから単離され、ＯＶＡでｅｘ
ｖｉｖｏ攻撃誘発された気管支ＬＮ細胞は対照培養物よりも大きく増殖し、高レベルのＴｈ２関連サイトカインを発現した。特に、対照に比べて非常に高レベルのＩＬ−５およびＩＬ−１３が生成した。もっとも、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０のレベルも上昇した。興味深いことにＩＦＮ−γレベルも増加した。もっとも、全般的にこのサイトカインのレベルは低かった。Ｔｈ２サイトカインの選択的誘導は、ＭＳ、ＲＡ、クローン病などのＴｈ１サイトカイン依存性病理の背景において有効であろう。
【００９６】
１Ｈ８と対照的に、ｍＡｂ ３Ａ２は、ＢＡＬ中の好酸球の率を低減し、気管支リンパ節リコールアッセイでＴｈ２関連サイトカインの生成を低減した（図２）。このように、抗体１Ｈ８および３Ａ２はこのアッセイにおいて相反する作用を有する。ＩｇＶドメイン内のエピトープを認識する、１Ｈ９を含めたいくつかの他の抗体は、このモデルにおける肺炎にもサイトカイン生成にも作用を及ぼさなかった。３Ａ２と共にＯＶＡ抗原を用いたｅｘ ｖｉｖｏ刺激に対する所属（気管支）リンパ節細胞の応答の分析は、抗原刺激に対する細胞増殖の低減を示した（図３）。さらに、これらの培養物の上清の分析は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０を含めたＴｈ２サイトカインの発現に顕著な低減を示した（図４）。ＩＬ−１３のレベルもこのアッセイで低減した。
【００９７】
抗ＩｇドメインｍＡｂ ４Ａ２を用いた処置は、ＯＶＡを用いた感作および噴霧処置後にＢＡＬへの好酸球およびリンパ球流入の顕著な低減を招いた（図６）。ＢＡＬ中の好酸球の平均減少率は、対照に比べて８４％（ｐ＜０．０００１、平均の同等性の検定）であり、リンパ球の平均減少率は対照に比べて９０％（ｐ＜０．００１、平均の同等性の検定）であった。気管支リンパ節細胞をＯＶＡでｅｘ ｖｉｖｏ再刺激したとき、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を含めたＴｈ２サイトカイン生成に劇的な減少が存在した（図７）。したがって、ｍＡｂ ４Ａ２を用いた処置は肺炎および喘息応答に関連するサイトカイン生成を低減した。
【００９８】
ｍＡｂ ４Ａ２の臨床有効性をさらに特徴付けるために治療用投与実験を行った。このモデルでは、マウスを免疫処置してＯＶＡ抗原に対する感受性を発生させ、ｍＡｂ処置を全く施さなかった。次に、これも処置を全く行わずにマウスを３週間休ませ、次に１％ＯＶＡを噴霧する３回のセッションのうち初回の前日に４Ａ２ ｍＡｂを投与した。２回目のセッション前にｍＡｂ投与を繰り返した。この処置プロトコールの結果として、ＢＡＬへの好酸球流入により測定される肺炎の軽減が生じた（図８）。好酸球の率は平均７０％減少した（ｐ＜０．００１、平均の同等性の検定）。したがって、ｍＡｂ ４Ａ２はＯＶＡ誘導肺炎モデルにおいて予防的投与方式および治療的投与方式の両方で有効であった。これは、４Ａ２により認識されるエピトープがＴｈ２介在性障害の処置のための治療に関連する標的であることを示唆している。
【００９９】
例えばｍＡｂ ２Ａ７およびｍＡｂ ２Ｂ３を含めた他の抗ＫＩＭ−１ ｍＡｂも、ＯＶＡ誘導肺炎モデルにおいて治療活性を有することが実証された。ｍＡｂ ２Ａ７は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイでの固定化ＫＩＭ−１への結合について４Ａ２と競合することが示された。これは、これらの抗体が共有されたエピトープまたは重複するエピトープを有することを示唆している。
【０１００】
（実施例４：抗原に対するＣＤ４ Ｔ細胞応答に及ぼすＫＩＭ−１抗体の作用）
ＫＬＨ抗原リコールアッセイを使用して抗ＫＩＭ−１ ｍＡｂの活性を評価した。マウスを抗ＫＩＭ−１ ｍＡｂ、対照ｍＡｂ、またはＰＢＳで処置し、次にＫＬＨで免疫処置し、６日後に所属ＬＮを切除した。ＬＮ ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、未処置マウスから単離して放射線照射した脾臓細胞全体の存在下で精製ＯＶＡを用いてｅｘ ｖｉｖｏ再刺激した。ｅｘ ｖｉｖｏ刺激の４８時間後に細胞増殖およびサイトカイン生成をアッセイした。このアッセイでは、いくつかの抗ＫＩＭ−１ ｍＡｂが顕著な作用を有した。ｍＡｂ
１Ｈ８はｅｘ ｖｉｖｏでのＫＬＨ攻撃誘発に応答してＴ細胞増殖を劇的に増大させた。対照的に、このアッセイでは、ｍＡｂ ３Ａ２はＴ細胞増殖を低減した。ｍＡｂ １Ｈ８で処置された細胞から生成した培養物中のサイトカインを測定した。処置された培養物は、対照よりも多量のＩＦＮ−γおよびＴＨ２関連サイトカインを含有することが見出された。対照的に、ＴＮＦおよびＩＬ−２のレベルは対照と同様であった。
【０１０１】
このデータは、１Ｈ８が病原性Ｔｈ１応答を低減することができることを示している。このデータは、１Ｈ８について本明細書に規定したように、ＫＩＭ−１領域に結合する１Ｈ８および他の抗体が、免疫応答を増加させることによりアジュバントとして作用できることも示している。本発明は、例えばワクチンの有効性を増大させるために、免疫応答を増大する方法にも及ぶ。そのようなアジュバント活性は、ワクチン接種、免疫不全、および抗腫瘍免疫にも用途を有しうる。
【０１０２】
１Ｈ８は、ウエスタンブロットにおいてＤｂａ／２配列ではなく、Ｂａｌｂ／Ｃ配列のＫＩＭ−１のＥＣＤと結合する。これは、この抗体が配列
【０１０３】
【化３７】
（配列番号２）を含む選択的スプライシングされたマウス対立遺伝子変異体に結合することを示している。この配列は、ヒトＫＩＭ−１の配列
【０１０４】
【化３８】
（配列番号１のアミノ酸２００〜２３５）に対応する。
【０１０５】
（実施例５：ｍＡｂ ３Ａ２の特徴付け）
３Ａ２ ｍＡｂはＯＶＡモデルにおいて治療効果を有したが、このｍＡｂとＫＩＭ−１との結合をさらに詳細に特徴付けた。
【０１０６】
多様な精製タンパク質をＥＬＩＳＡアッセイに使用して、ｍＡｂ ３Ａ２のエピトープを決定した（表２）。３Ａ２と固定化タンパク質との相互作用についての全結合曲線を作成した（図５）。ＭＡｂ ３Ａ２は、以下のマウスタンパク質と等価に結合した：マウスＫＩＭ−１細胞外ドメイン（ＫＩＭ−１−ＥＣＤ−１〜２１６）、ｍＫＩＭ−１−１３７〜２１６、およびｍＫＩＭ−１−１９６〜２１６−Ｆｃ。対照的に、ｍＡｂ ３Ａ２は、ムチンおよびストークドメイン全体を欠如しているｍＫＩＭ−１−ＩｇＶドメイン単独と結合できなかった。このデータは、３Ａ２に関するエピトープがｍＫＩＭ−１由来の１９６から２１６までの２１アミノ酸残基内に存在することを示している。その残基は、ＫＩＭ−１のストーク領域の部分に位置する。このエピトープは、図１に示すようにヒトＫＩＭ−１の残基２４７〜２７２に等しい。
【０１０７】
【表２】
マウスＫＩＭ−１のアミノ酸１９６から２１６（ヒトＫＩＭ−１のアミノ酸２４７〜２７２に対応する）を含むストーク領域がＮ−グリコシル化部位を有することから、Ｎ−グリコシル化部位に結合した糖部分が３Ａ２の結合に必要であるかどうかを判定することが関心対象であった。グリコシル化および脱グリコシル化ＫＩＭ−１−１９６〜２１６−Ｆｃのウエスタンブロット分析を行った（図２）。脱グリコシル化は、３Ａ２がＫＩＭ−１−１９６〜２１６−Ｆｃに結合する能力に影響しなかったことをこの分析は示した。したがって、糖部分は３Ａ２がそのエピトープを認識するために必要ではない。
【０１０８】
３Ａ２が細胞表面からのＫＩＭ−１の分断を阻害するかどうか判定するために、ＫＩＭ−１をトランスフェクトされたＥ２９３細胞を５ｕｇ／ｍＬの３Ａ２、２５ｕｇ／ｍＬの３Ａ２、または３Ａ２なし（対照）で処理した。ビオチン化１Ｈ８抗体を用いて探査したウエスタンブロットを行ったとき、両セットの３Ａ２処理細胞の上清は、ＫＩＭ−１染色で対照との差を示さなかった。これは、３Ａ２がＫＩＭ−１の分断を阻止しないことを示唆している。
【０１０９】
（実施例６． ４Ａ２ｍＡｂの特徴付け）
ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ分析を使用して、ｍＡｂ ４Ａ２がマウスＫＩＭ−１のＩｇドメインを認識したと判定した（図９、表１）。ｍＡｂ ４Ａ２により認識されたエピトープをさらに特徴付けるために、単独および４Ａ２と複合体を形成した組換えマウスＫＩＭ−１ ＩｇＶ−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合体をＴＰＣＫトリプシンで消化した。ＫＩＭ−１単独から８ｋＤａのバンドが生成し、４Ａ２が結合しているときには生成しない。これは、ＫＩＭ−１への４Ａ２の結合がこのバンドの生成に必要な切断部位へのトリプシンの接近を遮断することを示している。非還元状態での８Ｋｄａのバンドへの消化は、４Ａ２がヒトＫＩＭ−１配列
【０１１０】
【化３９】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）に対応する断片を保護することを明らかにした。このように、４Ａ２抗体は、少なくとも部分的に配列番号１のアミノ酸８１〜１０７内の、またはそのアミノ酸と重複するＴＰＣＫトリプシン部位を保護する。
【０１１１】
２Ａ７を用いて同様のＴＰＣＫトリプシン消化実験を行い、ほぼ同じサイズのバンドを得た。同様の実験を（喘息モデルにおける無効ｍＡｂであり、Ｉｇドメインにも結合する）１Ｈ９で行ったとき、このバンドは得らなかった。これは、エピトープが喘息での有効性と一致することを示している。
【０１１２】
この明細書は、この明細書の中で引用される参照の教示に照らして最も完全に理解される。この明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものとみなしてはならない。当業者は、多数の他の実施形態が本発明により包含されることを容易に認識している。本開示に引用される全ての刊行物、特許、および生物学的配列は、その全体が参照により組み込まれている。参照により組み込まれている資料が本明細書と矛盾するか、または一致しない範囲で、本明細書はそのような任意の資料に優先するであろう。本明細書における任意の参照の引用は、そのような参照が本発明の従来技術であるという承認ではない。
【０１１３】
別に示さない限り、特許請求の範囲を含めて本明細書に使用された成分、細胞培養、処置条件などの量を表現する全ての数字は、全ての例において用語「約」により修飾されていると了解されたい。
【０１１４】
したがって、それとは反対に別に示さない限り、数値パラメータは近似であり、本発明により得ようと努めた所望の性質に応じて変動しうる。別に示さない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その連なりにおける全ての要素を表すことを了解されたい。当業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識しているであろうし、また日常的な実験だけを使用してそれを確かめることができる。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
【数１】
【数２】
【数３】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
アレルギー性喘息およびアトピー性皮膚炎などのアトピー性疾患は、Ｔｈ２免疫優性への病原性シフトを伴うと考えられている（Ｕｍｅｔｓｕら、２００２年、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３巻：７１５〜２０頁）。
【０００２】
喘息状態では、Ｔｈ２サイトカイン生成は肺への好酸球流入、好酸球活性化、ＩｇＥ生成、ＩｇＥ介在性マスト細胞活性化および脱顆粒、ならびに肺間質腔での単核細胞蓄積を駆動する。肺間質腔ではＴ細胞および活性化顆粒球がＴｈ２サイトカイン、ケモカイン、およびエフェクター分子を分泌し続けることによって、肺炎の継続を促進する。ＫＩＭ遺伝子ファミリーを有するＴＡＰＲ遺伝子座は、マウスにおけるアトピー性炎症発生に関係付けられており、ＫＩＭ−１の対立遺伝子変異は、患者のポピュレーション解析においてアトピーの発生率と関連している（非特許文献１；非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】ＭｃＩｎｔｉｒｅら、２００１年、Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２巻：１１０９〜１６頁
【非特許文献２】ＭｃＩｎｔｉｒｅら、２００３年、Ｎａｔｕｒｅ、４２５巻：５７６頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、ＫＩＭ−１の特定領域と結合する抗体などの作用物質が、Ｔｈ１および／またはＴｈ２介在性免疫を差次的に調節することができるという発見に少なくとも一部基づくものである。例えば、ＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合領域と結合する作用物質は、Ｔｈ２サイトカインの発現を調節することができ、Ｔｈ２介在性障害、例えば喘息を治療するために使用することができ、ＫＩＭ−１のムチン領域内の特定エピトープと結合する作用物質は、病原性Ｔｈ１応答を低減することができ、Ｔｈ１介在性障害、例えば炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、多発性硬化症、糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植、膵炎、遅延型過敏症（ＤＴＨ）などの炎症障害または自己免疫性障害を治療するために使用することができる。Ｔｈ２介在性障害およびＴｈ１介在性障害の治療に有用な組成物および方法が提供される。
【０００５】
一態様では、本発明は、Ｔｈ２介在性状態、例えば喘息（特にアレルギー性喘息）、アレルギー性鼻炎、アレルギー、湿疹、およびその他のアトピー性状態を治療する方法を提供する。この方法は、Ｔｈ２介在性状態を有する哺乳動物、好ましくはヒトに、ＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフと結合する作用物質を投与することを含む。例えば、この方法は、ＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフと結合する単一特異性抗体、例えばモノクローナル抗体（またはその抗原結合断片）を含有する医薬組成物を、その状態を治療するために十分な量および時間投与することを含みうる。ＫＩＭ−１のストーク領域は、本明細書においてＫＩＭ−１のムチンドメインおよび膜貫通ドメインの間に存在する高度に保存されたＮ−結合グリコシル化部位を含有する荷電ドメインであると同定されている。ヒトＫＩＭ−１のストーク領域およびシアル酸結合モチーフを図１に示す。本明細書に規定されたこれらの領域のＮ末端およびＣ末端はおおよそであり、ＫＩＭ−１配列由来の連続する残基を数個（例えば１、２、または３個）多くまたは少なく有しうる。
【０００６】
一実施形態では、その作用物質は、ヒトＫＩＭ−１ストーク領域に結合する抗体である。例えば、その抗体は、配列
【０００７】
【化１４】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）を有するペプチドと結合する。一実施形態では、その抗体は、配列
【０００８】
【化１５】
（配列番号１のアミノ酸２６２〜２７０）、
【０００９】
【化１６】
（配列番号１のアミノ酸２６０〜２６９）、
【００１０】
【化１７】
（配列番号１のアミノ酸２５７〜２７０）、または
【００１１】
【化１８】
（配列番号１のアミノ酸２５２〜２７０）を有するペプチドに結合する。他の実施形態では、その抗体は、配列番号１のアミノ酸２３６〜２５０または２３６〜２５８の配列を有するペプチドに結合する。
【００１２】
一実施形態では、その抗体はＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフに結合する。例えばその抗体は、配列
【００１３】
【化１９】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【００１４】
【化２０】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）を有するペプチドに含まれるか、またはそれと重複するエピトープに少なくとも部分的に結合する。一実施形態では、その抗体は、還元タンパク質および非還元タンパク質と結合する。すなわち、その抗体は、
【００１５】
【化２１】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【００１６】
【化２２】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０個の連続するアミノ酸残基の直鎖状エピトープと結合する。
【００１７】
別の実施形態では、その抗体は、配列
【００１８】
【化２３】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）および
【００１９】
【化２４】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の一方または両方が寄与する構造エピトープと結合する。一実施形態では、そのエピトープは、組換えマウスＫＩＭ−１ ＩｇＶ−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合体の８ｋＤａのＴＰＣＫトリプシン断片に対応するヒトＫＩＭ−１配列に含まれる構造エピトープでありうる。
【００２０】
一実施形態では、その抗体は、シアル酸の結合に必要な、配列番号１の残基Ｒ８６、Ｗ９２、およびＦ９３のうち１つまたは複数を妨害する。
【００２１】
本明細書に記載した方法が任意の特定のメカニズムにも理論にも拘束されないことが了解されているが、その抗体は１つまたは複数の以下の性質を有しうる：（ａ）その抗体はＫＩＭ−１のＩｇＶドメイン上のシアル酸結合モチーフと、ＫＩＭ−１のストーク領域の１つまたは複数のＮ−グリコシル化部位上に提示された糖質との相互作用を妨害する、（ｂ）その抗体は、ストーク領域の１つまたは複数のＮ−結合グリコシル化部位と結合するか、またはそれを立体的に妨害する、（ｃ）その抗体は、ＫＩＭ−１のシグナル伝達のダウンレギュレーションを阻害する、（ｄ）その抗体はアゴニスト抗体であり、例えばその抗体は、結合時にＫＩＭ−１を経由した下流のシグナル伝達を促進または増大させる、（ｅ）その抗体はＫＩＭ−１の多量体化を遮断する、（ｆ）その抗体は結合するか、ストーク領域と補助受容体もしくはリガンドとの相互作用を立体的に妨害して正常な機能を破壊する、（ｇ）その抗体は、ＫＩＭ−１のＩｇＶドメイン上のシアル酸結合モチーフと、ＫＩＭ−１のストーク領域に隣接するムチン領域の１つまたは複数のＯ−グリコシル化部位上に提示された糖質との相互作用を妨害する、（ｈ）その抗体は、例えばジスルフィド結合または水素結合を変更または妨害することによって、タンパク質のコンホメーションを変えるようにＩｇドメインの構造の特徴を変更する、（ｉ）その抗体はＫＩＭ−１リガンドなどの他のタンパク質との結合を変えるようにＫＩＭ−１のＩｇドメインの構造の特徴または機能的特徴を変更する。
【００２２】
一実施形態では、その抗体は細胞表面からのＫＩＭ−１の分断を阻害しない。例えば、その抗体は培養２９３Ｅｂｎａ（Ｅ２９３）細胞からのＫＩＭ−１の分断を阻害しない。
【００２３】
好ましい実施形態では、その抗体は単一特異性である。例えば、その抗体はモノクローナル抗体、例えばヒト化モノクローナル抗体もしくは完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。
【００２４】
一実施形態では、その状態はアレルギー性喘息である。この実施形態では、その方法は場合によりアレルギー性喘息のリスクがあるか、またはアレルギー性喘息を有する対象を同定することも含む。場合により、その方法は、対象における喘息の症状、例えばＩｇＥレベル、気道過敏性、咳、喘鳴、胸部絞扼感、呼吸困難、気道平滑筋収縮、気管支粘液分泌、炎症、血管拡張、炎症細胞（例えば好中球、単球、マクロファージ、リンパ球、好酸球）の動員、杯細胞過形成、マスト細胞または遊走性炎症細胞による炎症メディエータ放出を評価することも含む。その評価のステップは、投与のステップの前、途中、および／または後に行うことができる。その評価は、医師、その他の医療提供者、または対象により行われることがある。その評価は、１回または複数回、例えば投与後に１回または複数回、例えば投与から１週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、またはそれよりも長い期間に少なくとも２回行われることがある。
【００２５】
好ましい実施形態では、その方法は、その作用物質の投与（または多回投与）が対象における気道疾患の１つまたは複数の症状の重症度または開始を低減したかどうか判定することを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、その抗体は、対象における喘息の治療に有効な第２の作用物質、例えばコルチコステロイド、気管支拡張薬、ロイコトリエン修飾因子、抗炎症剤、抗ＩｇＥ剤（例えば抗ＩｇＥ抗体、例えばオマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））と同時投与される。「同時投与」または「組合せ投与」は、患者に及ぼす物質の効果が重複するように、同時またはある間隔以内、例えば１週間以内に投与することを意味する。
【００２７】
別の実施形態では、その状態はアレルギー、例えば食物アレルギーまたは季節性アレルギー（例えば花粉アレルギー）である。アレルギーの診断は、アレルゲン皮膚試験の適用、血清中ＩｇＥ濃度の決定（例えばＩｇＥ＞３００ｎｇ／ｍｌ）、および血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体またはＩｇＧ抗体の決定のうち１つまたは複数により行われる。
【００２８】
その抗体は、１つまたは複数の以下の期間に投与されることがある：アトピーの対象がアレルゲンに曝露される前、アレルゲンへの曝露後であるが症状の発生前、症状の発生時、症状の発生後。
【００２９】
一実施形態では、その作用物質は一連の治療として、例えば所定の回数の定期投与の形で、例えば毎日、毎週、隔週、または毎月投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、喘鳴、咳、息切れ、または胸部絞扼感の発症の回数または重症度を、例えばある期間、例えば３カ月、６カ月、１年、またはそれを超えて低減（例えば実質的に低減）するために十分な期間および／または量で投与されうる。
【００３０】
別の態様では、本発明は、ＫＩＭ−１のストーク領域と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。その抗体は、培養Ｅ２９３細胞からのＫＩＭ−１の分断を阻害しない。一実施形態では、その抗体はヒトＫＩＭ−１のストーク領域に結合する。例えば、その抗体は、配列
【００３１】
【化２５】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）を有するペプチドと結合する。一実施形態では、その抗体は配列
【００３２】
【化２６】
（配列番号１のアミノ酸２６２〜２７０）、
【００３３】
【化２７】
（配列番号１のアミノ酸２６０〜２７０）、
【００３４】
【化２８】
（配列番号１のアミノ酸２５７〜２７０）、または
【００３５】
【化２９】
（配列番号１のアミノ酸２５２〜２７０）を有するペプチドに結合する。他の実施形態では、その抗体は、配列番号１のアミノ酸２４１〜２５４、２４２〜２５８、および２４２〜２５５の配列を有するペプチドに結合する。
【００３６】
別の態様では、本発明は、ＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフに特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、その抗体は、配列
【００３７】
【化３０】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【００３８】
【化３１】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）を有するペプチドに含まれるか、またはそれと重複するエピトープに少なくとも部分的に結合する。一実施形態では、その抗体は還元タンパク質および非還元タンパク質と結合し、すなわちその抗体は、
【００３９】
【化３２】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【００４０】
【化３３】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の少なくとも４、５、６、７、８、９、または１０個の連続するアミノ酸残基の直鎖状エピトープと結合する。別の実施形態では、その抗体は、配列
【００４１】
【化３４】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）および
【００４２】
【化３５】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の一方または両方が寄与する構造エピトープと結合する。いくつかの実施形態では、そのエピトープは組換えマウスＫＩＭ−１ ＩｇＶ−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合体の８ｋＤａのＴＰＣＫトリプシン断片に対応するヒトＫＩＭ−１領域に含まれる構造エピトープである。一実施形態では、その抗体はシアル酸の結合に必要な、配列番号１の残基Ｒ８６、Ｗ９２、およびＦ９３の１つまたは複数を妨害する。
【００４３】
単離された抗体は、１つまたは複数の以下の特徴を有しうる：（ａ）その抗体は、ＫＩＭ−１のＩｇＶドメイン上のシアル酸結合モチーフと、ＫＩＭ−１のストーク領域の１つまたは複数のＮ−グリコシル化部位上に提示された糖質との相互作用を妨害する、（ｂ）その抗体は、ストーク領域のＮ−結合グリコシル化部位のうち一方または両方と結合するか、またはそれを立体的に妨害する、（ｃ）その抗体は、ＫＩＭ−１のシグナル伝達のダウンレギュレーションを阻害する、（ｄ）その抗体はアゴニスト抗体であり、例えばその抗体は、結合時にＫＩＭ−１を経由した下流のシグナル伝達を促進または増大させる、（ｅ）その抗体はＫＩＭ−１の多量体化を遮断する、（ｆ）その抗体は、結合するか、またはストーク領域と補助受容体もしくはリガンドとの相互作用を立体的に妨害して正常な機能を破壊する、（ｇ）その抗体は、ＫＩＭ−１のＩｇＶドメイン上のシアル酸結合モチーフと、ＫＩＭ−１のストーク領域に隣接するムチン領域の１つまたは複数のＯ−グリコシル化部位上に提示された糖質との相互作用を妨害する、（ｈ）その抗体は、例えばジスルフィド結合または水素結合を変更または妨害することによって、タンパク質のコンホメーションを変えるようにＩｇドメインの構造特徴を変更する、（ｉ）その抗体は、ＫＩＭ−１リガンドなどの他のタンパク質への結合を変えるようにＫＩＭ−１のＩｇドメインの構造または機能特徴を変更する。
【００４４】
別の態様では、本発明は、Ｔｈ１介在性状態、例えば病原性または増加したＴｈ１応答を特徴とする状態を治療する方法を特徴とする。そのような状態には、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、多発性硬化症、糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植、膵炎、遅延型過敏症（ＤＴＨ）などの炎症障害および／またはニコ免疫性障害が挙げられる。この方法は、Ｔｈ１介在性状態を有する哺乳動物、好ましくはヒトに、配列
【００４５】
【化３６】
（配列番号１の残基２００〜２３５）に含まれるエピトープと結合する作用物質、例えば抗体を投与することを含む。例えば、この方法は、ＫＩＭ−１の特定の領域と結合する単一特異性抗体、例えばモノクローナル抗体（またはその抗原結合断片）を含有する医薬組成物を、その状態を治療するために十分な量および時間で投与することを含みうる。そのＫＩＭ−１の特定の領域はマウスにおいて選択的スプライシングされたＫＩＭ−１変異体に見出される。本明細書に定義されたこの領域のＮ末端およびＣ末端はおおよそであり、ＫＩＭ−１配列由来の連続する残基を少数（例えば１個または２個）多く、または少なく含有しうる。
【００４６】
一実施形態では、その抗体は還元タンパク質および非還元タンパク質と結合する。
【００４７】
好ましい実施形態では、その抗体は単一特異性であり、例えばその抗体はモノクローナル抗体、例えばヒト化もしくは完全ヒトモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である。
【００４８】
一実施形態では、その状態は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、リウマチ性関節炎、乾癬、急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、移植、膵炎、または遅延型過敏症（ＤＴＨ）である。場合によりその方法は、挙げられた任意の状態のリスクがあるか、またはそれを有する対象を同定することも含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、その方法は、その作用物質の投与（または多回投与）が対象の状態の１つまたは複数の症状の重症度または開始を低減するかどうかを判定することを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、その抗体は対象における状態を治療するために有効な第２の作用物質、例えばコルチコステロイドまたは他の抗炎症剤、ＤＭＡＲＤ、抗ＴＮＦ療法、または抗ＣＤ２０療法と同時投与される。「同時投与」または「組合せ投与」は、患者に及ぼす物質の効果が重複するように、同時またはある間隔以内、例えば１週間以内に投与することを意味する。
【００５１】
一実施形態では、その作用物質は一連の治療として、例えば所定の回数の定期投与の形で、例えば毎日、毎週、隔週、または毎月投与される。いくつかの実施形態では、抗体は、症状の回数または重症度を、例えばある期間、例えば３カ月、６カ月、１年、またはそれを超えて低減（例えば実質的に低減）するために十分な期間および／または量で投与されうる。
【００５２】
本明細書に使用する用語「治療する」、「治療すること」、および「治療」は、病理学的状態を特徴付ける症状またはパラメータを改善または回復させるために；病理学的状態を特徴付ける症状またはパラメータの重症度を低減するために；病理学的状態の進行を防止、減速、もしくは逆転するために；または病理学的状態の１つもしくは複数の症状もしくはパラメータを防止するために有効な量、方法、および／または様式で治療を施すことを表す。
【００５３】
本明細書に使用する、ＫＩＭ−１の特定ドメインと「結合する作用物質」は、その特定のドメインに１０−６Ｍ未満のＫｄで結合する任意の化合物を表す。ＫＩＭ−１結合剤の例は、ＫＩＭ−１結合タンパク質、例えばＫＩＭ−１結合抗体、好ましくは単一特異性抗体である。
【００５４】
本明細書に使用する用語「シアル酸結合領域」、「シアル酸結合モチーフ」、および「シアル酸結合に必要な」、ならびにこれらの用語の変形は、糖質の結合に必要なシアル酸結合Ｉｇ様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）ファミリーで同定されたアミノ酸残基、アミノ酸配列、ならびにアミノ酸二次構造および三次構造に類似した、または相同なアミノ酸残基、アミノ酸配列、ならびにアミノ酸二次構造および三次構造を表す。
【００５５】
用語「抗体またはその抗原結合断片」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域を含むタンパク質、例えば抗原と特異的に結合するために十分な免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を提供するアミノ酸配列を含むタンパク質を包含する。例えばこの用語は、１つの重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）および１つの軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）を有する抗原結合タンパク質を含む。別の例では、この用語は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域および２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質を含む。この用語は、抗体の抗原結合断片（例えば単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、およびｄＡｂ断片）ならびに完全抗体、例えばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭタイプ（およびそのサブタイプ）の無傷免疫グロブリンを包含する。免疫グロブリン軽鎖は、κまたはλタイプでありうる。一実施形態では、その抗体はグリコシル化されている。抗体は抗体依存性細胞傷害作用および／または補体介在性細胞傷害作用について機能的でありうるし、これらの活性の一方または両方について非機能的でありうる。ＶＨおよびＶＬ領域を、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と名付けられた超可変領域にさらに細分することができる。その超可変領域には、それよりも保存性の高い「フレームワーク領域」（ＦＲ）と名付けられた領域が分散している。ＦＲおよびＣＤＲの程度が精密に定義されている（Ｋａｂａｔ， Ｅ．Ａ．ら（１９９１年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版」、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、第９１−３２４２号、およびＣｈｏｔｈｉａ， Ｃ．ら（１９８７年）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁参照）。Ｋａｂａｔの定義を本明細書に使用する。各ＶＨおよびＶＬは、通常、以下の順序でアミノ末端からカルボキシル末端に配列した３個のＣＤＲおよび４個のＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００５６】
前述の概要および後述の説明は、請求される発明を限定するものではない。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
哺乳動物におけるＴｈ２介在性障害を治療する方法であって、該哺乳動物にＫＩＭ−１のストーク領域と結合する抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
（項目２）
前記哺乳動物がヒトである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記障害がアトピーである、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記障害が喘息である、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記抗体が、ペプチド
【化１】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目６）
前記抗体がヒト化または完全ヒト単一特異性抗体である、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目７）
前記抗体がヒト化または完全ヒト単一特異性抗体であり、ペプチド
【化２】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目８）
全長抗体が投与される、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目９）
全長抗体が投与され、該抗体が、ペプチド
【化３】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１０）
抗体の抗原結合断片が投与される、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１１）
抗体の抗原結合断片が投与され、前記抗体が、ペプチド
【化４】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１２）
前記抗原結合断片が、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、およびｄＡｂ断片からなる群から選択される、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
前記抗原結合断片が、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、およびｄＡｂ断片からなる群から選択される、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記障害についての第２の治療剤と組み合わせて投与される、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１５）
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記障害についての第２の治療剤と組み合わせて投与され、該抗体が、ペプチド
【化５】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１６）
前記抗体またはその抗原結合断片が、０．０５ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与される、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１７）
前記抗体またはその抗原結合断片が、０．０５ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与され、該抗体が、ペプチド
【化６】
（配列番号１のアミノ酸２３６〜２６９）に少なくとも部分的に含まれるエピトープと結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目１８）
ＫＩＭ−１のストーク領域と特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合断片であって、該抗体は、培養物においてＥ２９３細胞からのＫＩＭ−１の分断を阻害しない、抗体またはその抗原結合断片。
（項目１９）
前記抗体が、
（ａ）配列番号１のアミノ酸２６２〜２７０、
（ｂ）配列番号１のアミノ酸２６０〜２６９、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸２５７〜２７０、
（ｄ）配列番号１のアミノ酸２５２〜２７０、
（ｅ）配列番号１のアミノ酸２３６〜２５０、および
（ｆ）配列番号１のアミノ酸２３６〜２５８
からなる群から選択される配列を有するペプチドに結合する、項目１、２、３、または４に記載の方法。
（項目２０）
前記抗体はヒト化または完全ヒト単一特異性抗体である、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
全長抗体が投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記抗体の抗原結合断片が投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２３）
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記障害についての第２の治療剤と組み合わせて投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２４）
前記抗体またはその抗原結合断片が０．０５ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
哺乳動物におけるＴｈ１介在性障害を治療する方法または病原性Ｔｈ１応答を低減する方法であって、該哺乳動物に、ヒトＫＩＭ−１の配列
【化７】
（配列番号１のアミノ酸２００〜２３５）または該配列と重複するエピトープと結合する抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
（項目２６）
前記哺乳動物がヒトである、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記抗体がヒト化または完全ヒト単一特異性抗体である、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
全長抗体が投与される、項目２５に記載の方法。
（項目２９）
前記抗体の抗原結合断片が投与される、項目２５に記載の方法。
（項目３０）
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記障害についての第２の治療剤と組み合わせて投与される、項目２５に記載の方法。
（項目３１）
前記抗体またはその抗原結合断片が、０．０５ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与される、項目２５に記載の方法。
（項目３２）
哺乳動物におけるＴｈ２介在性障害を治療する方法であって、該哺乳動物に、ＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフと結合する抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
（項目３３）
前記抗体が、配列
【化８】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【化９】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）を有するペプチドに含まれるか、またはそれと重複するエピトープに少なくとも部分的に結合する、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記抗体が、
【化１０】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）または
【化１１】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の連続するアミノ酸残基の直鎖状エピトープと結合する、項目３２に記載の方法。
（項目３５）
前記抗体が、配列
【化１２】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）および
【化１３】
（配列番号１のアミノ酸２９〜４２）の一方または両方が寄与する構造エピトープと結合する、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記抗体が、配列番号１のアミノ酸８１〜１０７を保護する、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
前記抗体が、配列番号１の残基Ｒ８６、Ｗ９２、およびＦ９３のうち１つまたはそれより多くを妨害する、項目３２に記載の方法。
（項目３８）
前記哺乳動物がヒトである、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目３９）
前記障害がアトピーである、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目４０）
前記障害が喘息である、項目１に記載の方法。
（項目４１）
前記抗体がヒト化または完全ヒト単一特異性抗体である、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目４２）
全長抗体が投与される、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目４３）
前記抗体の抗原結合断片が投与される、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目４４）
前記抗原結合断片が、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、およびｄＡｂ断片からなる群から選択される、項目４３に記載の方法。
（項目４５）
前記抗体またはその抗原結合断片が、前記障害についての第２の治療剤と組み合わせて投与される、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
（項目４６）
前記抗体またはその抗原結合断片が、０．０５ｍｇ／ｋｇと２０ｍｇ／ｋｇとの間の投薬量で投与される、項目３２、３３、３４、３５、３６、または３７に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本明細書に記載した様々なドメインを示す（シグナル配列および挿入多型ＭＴＴＶＰを有さない）ヒトＫＩＭ−１の注釈付きポリペプチド配列（配列番号１）である。
【図２】図２は、ＯＶＡを用いたエアロゾル誘発および３Ａ２を用いた処置後の気管支洗浄液（ＢＡＬ）中に存在する好酸球の率（ｙ軸）を示すグラフである。
【図３】図３は、ＯＶＡ抗原を用いたｅｘ ｖｉｖｏ刺激および３Ａ２を用いた処置後の所属（気管支）リンパ節細胞の増殖を示すグラフである。ｙ軸はトリチウムチミジンの取込みをｃｐｍ単位で表したものである。
【図４】図４は、ＯＶＡ抗原を用いたｅｘ ｖｉｖｏ刺激に対する所属（気管支）リンパ節細胞の応答を示すグラフである。ＬＮをＯＶＡのエアロゾル誘発後に採取し、次にＯＶＡと共にｅｘ ｖｉｖｏ培養し、３Ａ２で処理した。これらの培養物から上清を採り、ＴＨ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０）生成について分析した。ｙ軸はピコグラム／ｍｌである。
【図５】図５は、３Ａ２と固定化タンパク質との相互作用について作成した結合曲線を示す。ＭＡｂ ３Ａ２は、ｍＫＩＭ−１−ＥＣＤ−Ｆｃ（丸）、ｍＫＩＭ−１−１３７〜２１６−Ｆｃ（三角）、およびｍＫＩＭ−１−１９６〜２１６−Ｆｃ（菱形）と等価的に結合したが、ｍＫＩＭ−１−ＩｇＶ−Ｆｃ（四角）とは結合しなかった。
【図６】図６は、ＯＶＡを用いたエアロゾル誘発および４Ａ２を用いた処置後に気管支洗浄液（ＢＡＬ）に存在する好酸球およびリンパ球の率（ｙ軸）を示すグラフである。
【図７】図７は、ＯＶＡ抗原を用いたｅｘ ｖｉｖｏ刺激および４Ａ２を用いた処置に対する所属（気管支）リンパ節細胞の応答を示すグラフである。ＬＮをＯＶＡのエアロゾル誘発後に採取し、次にＯＶＡと共にｅｘ ｖｉｖｏ培養した。これらの培養物から上清を採り、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３）生成について分析した。ｙ軸はピコグラム／ｍｌである。
【図８】図８は、ＯＶＡを用いたエアロゾル誘発および４Ａ２を用いた治療的処置後に気管支洗浄液（ＢＡＬ）に存在する好酸球の率（ｙ軸）を示すグラフである。
【図９】図９は、精製ＫＩＭ−１タンパク質に対するｍＡｂ ４Ａ２の結合曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
（発明の詳細な説明）
本明細書に記載するように、抗体療法を用いたＫＩＭ−１の特定領域のターゲティングは、Ｔｈ２およびＴｈ１サイトカインの発現に対して重大な制御を及ぼし、Ｔｈ２介在性疾患およびその他のアトピー性障害を治療するための、そしてＴｈ１介在性疾患のための治療戦略を提供する。
【００５９】
抗体の作成
本明細書に記載する抗体（例えばＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフに結合する抗体）を、例えば動物を使用した免疫処置によって、またはファージディスプレイなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって作成することができる。ＫＩＭ−１の標的エピトープ（例えばＫＩＭ−１のストーク領域またはＫＩＭ−１のシアル酸結合モチーフ）を含むポリペプチドを免疫原として使用することができる。他の実施形態では、ＫＩＭ−１ポリペプチドのより大きな部分、例えば細胞外ドメインを免疫原として使用することができ、結果として生じた抗体を、所望のＫＩＭ−１領域またはドメインとの反応性についてスクリーニングすることができる。
【００６０】
一実施形態では、免疫処置された動物は、天然、ヒト、または部分的ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有する免疫グロブリン生成細胞を含む。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大きな断片を有し、マウス抗体生成を欠損したマウス系統を操作することが可能である。ハイブリドーマ技法を使用して、それらの遺伝子由来の所望の特異性を有する抗原特異的モノクローナル抗体を生成させて選択することができる。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）、Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、７巻：１３〜２１頁（１９９４年）、ＵＳ２００３−００７０１８５、米国特許第５７８９６５０号、およびＷＯ９６／３４０９６を参照されたい。
【００６１】
ＫＩＭ−１に対する非ヒト抗体を例えば齧歯動物において生成させることもできる。その非ヒト抗体を、例えば米国特許第６６０２５０３号、ＥＰ２３９４００、米国特許第５６９３７６１号、および米国特許第６４０７２１３号に記載されたようにヒト化することができる。
【００６２】
ＥＰ２３９４００（Ｗｉｎｔｅｒら）は、ある種についての相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の種由来のＣＤＲに（与えられた可変領域内で）置換することにより、抗体を変更することを記載している。ＣＤＲを置換された抗体は、非ヒト構成要素をあまり含まないので、ＣＤＲを置換された抗体は、真のキメラ抗体に比べてヒトに免疫応答を誘発する見込みが少なくなりうる。（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻、３２３〜３２７頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻、１５３４〜１５３６頁）。組換え核酸技法を使用することによりマウス抗体のＣＤＲがヒト抗体の対応する領域に代わって入り、所望の置換された抗体をコードしている配列が生成した。所望のアイソタイプ（通常はＣＨについてγＩであり、ＣＬについてκ）のヒト定常領域遺伝子セグメントを付加することができ、ヒト化重鎖および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞に同時発現させて可溶性ヒト化抗体を生成することができる。
【００６３】
Ｑｕｅｅｎら、１９８９年およびＷＯ９０／０７８６１は、本来のマウス抗体のＶ領域フレームワークに最適なタンパク質配列相同性についてコンピュータ解析することにより、ヒトＶフレームワーク領域を選択すること、およびマウスＣＤＲと相互作用する見込みの高いフレームワークアミノ酸残基を可視化するためにマウスＶ領域の三次構造をモデル化することを含む方法を記載している。次に、これらのマウスアミノ酸残基を相同なヒトフレームワークと重ね合わす。米国特許第５６９３７６２号、第５６９３７６１号、第５５８５０８９号、および第５５３０１０１号も参照されたい。Ｔｅｍｐｅｓｔら、１９９１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻、２６６〜２７１頁は、マウス残基の根本的な導入なしにＣＤＲを接合するためにＮＥＷＭおよびＲＥＩの重鎖および軽鎖由来のＶ領域フレームワークをそれぞれ標準として利用している。ＮＥＷＭおよびＲＥＩに基づくヒト化抗体を構築するためにＴｅｍｐｅｓｔらの取組みを使用する利点は、ＮＥＷＭおよびＲＥＩの可変領域の三次元構造がＸ線結晶学から公知であり、よってＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基との間の特異的相互作用をモデル化できることである。
【００６４】
非ヒト抗体を修飾して、ヒト免疫グロブリン配列を挿入する置換を、例えば特定の位置でのコンセンサスヒトアミノ酸残基を例えば１つまたは複数（好ましくは少なくとも５、１０、１２個、または全て）の以下の位置で含ませることができる：（軽鎖可変ドメインＦＲ中の） ４Ｌ、３５Ｌ、３６Ｌ、３８Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、５８Ｌ、４６Ｌ、６２Ｌ、６３Ｌ、６４Ｌ、６５Ｌ、６６Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、６９Ｌ、７０Ｌ、７１Ｌ、７３Ｌ、８５Ｌ、８７Ｌ、９８Ｌ、および／または（重鎖可変ドメインＦＲ中の）２Ｈ、４Ｈ、２４Ｈ、３６Ｈ、３７Ｈ、３９Ｈ、４３Ｈ、４５Ｈ、４９Ｈ、５８Ｈ、６０Ｈ、６７Ｈ、６８Ｈ、６９Ｈ、７０Ｈ、７３Ｈ、７４Ｈ、７５Ｈ、７８Ｈ、９１Ｈ、９２Ｈ、９３Ｈ、および／または１０３Ｈ（Ｋａｂａｔの番号付けによる）。例えば、米国特許第６４０７２１３号を参照されたい。
【００６５】
ＫＩＭ−１の所望の領域に結合する完全ヒトモノクローナル抗体は、例えばＢｏｅｒｎｅｒら、１９９１年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻、８６〜９５頁に記載されているようにｉｎ ｖｉｔｒｏで初回免疫を受けたヒト脾臓細胞を使用して生成することができる。Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８巻：２４３２〜２４３６頁、またはＨｕａｎｇおよびＳｔｏｌｌａｒ、１９９１年、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４１巻、２２７〜２３６頁、または米国特許第５７９８２３０号により記載されたレパートリークローニングによりそのモノクローナル抗体を調製することができる。大規模な非免疫処置ヒトファージディスプレイライブラリーを使用して、標準的なファージ技法を使用してヒト治療薬として開発することのできる高親和性抗体を単離することもできる（例えばＶａｕｇｈａｎら、１９９６年； Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４巻：１〜２０頁；およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ、２巻：３７１〜８頁；ＵＳ２００３−０２３２３３３参照）。
【００６６】
本明細書に使用する「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することのできるアミノ酸配列を表す。例えば、その配列は、天然可変ドメインのアミノ酸配列の全てまたは一部を含みうる。例えば、その配列から１個、２個、またはそれを超えるＮ末端またはＣ末端アミノ酸が取り除かれることがあり、内部のアミノ酸は、１つまたは複数の挿入または追加の末端アミノ酸を含むことがあるし、他の変更を含むことがある。一実施形態では、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と関連して標的結合構造（すなわち「抗原結合部位」）、例えばＫＩＭ−１の特定の領域と相互作用する構造を形成することがある。
【００６７】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は、重鎖または軽鎖定常領域の全てまたは一部をさらに含むことによって、それぞれ免疫グロブリン重鎖または軽鎖を形成することがある。一実施形態では、その抗体は、２本の免疫グロブリン軽鎖および２本の免疫グロブリン重鎖の四量体である。免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、ジスルフィド結合により繋がっていることがある。重鎖定常領域は、典型的には３つの定常ドメインであるＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、典型的にはＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含めた、宿主の組織または作用物質へのその抗体の結合を仲介する。
【００６８】
抗体の１つまたは複数の領域は、ヒト、事実上のヒト、またはヒト化でありうる。例えば１つまたは複数の可変領域はヒトまたは事実上のヒトでありうる。例えば、１つまたは複数のＣＤＲ、例えばＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、ＨＣ ＣＤＲ３、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３はヒトでありうる。軽鎖ＣＤＲのそれぞれはヒトでありうる。ＨＣ ＣＤＲ３はヒトでありうる。１つまたは複数のフレームワーク領域は、ヒト、例えばＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４でありうる。一実施形態では、全てのフレームワーク領域はヒトであり、例えばヒト体細胞、例えば免疫グロブリンを生成する造血細胞または非造血細胞由来である。一実施形態では、ヒト配列は、例えば生殖細胞系核酸にコードされている生殖細胞系配列である。１つまたは複数の定常領域は、ヒト、事実上のヒト、またはヒト化でありうる。別の実施形態では、フレームワーク領域（例えばＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３をまとめて、またはＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４をまとめて）の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、もしくは９８％、またはその抗体全体は、ヒト、事実上のヒト、またはヒト化でありうる。例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、およびＦＲ３はまとめてヒト生殖細胞系セグメントによりコードされているヒト配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８、または９９％同一でありうる。
【００６９】
「事実上のヒト」免疫グロブリン可変領域は、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む結果、その免疫グロブリン可変領域が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しない免疫グロブリン可変領域である。「事実上のヒト」抗体は、十分な数のヒトアミノ酸位置を含む結果、その抗体は正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しない。
【００７０】
「ヒト化」免疫グロブリン可変領域は、修飾されている結果、その修飾された形態がヒトにおいて非修飾形態よりも小さい免疫応答を誘発する免疫グロブリン可変領域であり、例えば修飾されて十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む結果、その免疫グロブリン可変領域は正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しない。「ヒト化」免疫グロブリンの記載には、例えば米国特許第６４０７２１３号および米国特許第５６９３７６２号が挙げられる。一部の例では、ヒト化免疫グロブリンは、１つまたは複数のフレームワークアミノ酸位置に非ヒトアミノ酸を含むことがある。
【００７１】
抗体の全てまたは一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによりコードされうる。ヒト免疫グロブリン遺伝子の例には、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）が可変領域遺伝子により、そしてＣＯＯＨ末端がκまたはλ定常領域遺伝子によりコードされている。全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）およびその他の前述の定常領域遺伝子の１つ、例えばγ（約３３０アミノ酸をコードしている）により同様にコードされている。
【００７２】
全長抗体の「抗原結合断片」という用語は、対象となる標的に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の１つまたは複数の断片を表す。全長抗体の「抗原結合断片」という用語の中に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる１価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのＦａｂ断片を含む２価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁）；および（ｖｉ）機能性を保持する単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、組換え法を使用して、それらのドメインをタンパク質１本鎖として作製できるようにする合成リンカーによりそれらを繋ぐことができる。そのタンパク質１本鎖では、ＶＬおよびＶＨ領域の対が単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知である１価分子を形成する。例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２巻：４２３〜４２６頁およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５巻：５８７９〜５８８３頁を参照されたい。
【００７３】
抗体の生産
原核細胞および真核細胞において抗体を生産することができる。一実施形態では、抗体（例えばｓｃＦｖ）はピキア（例えば Ｐｏｗｅｒｓら（２００１年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２５１巻：１２３〜３５頁参照）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｕｌａ）、またはサッカロミセスなどの酵母細胞において発現される。
【００７４】
一実施形態では、抗体、特に全長抗体、例えばＩｇＧの全長抗体は哺乳動物細胞において生産される。組換え発現用の哺乳動物宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えばＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ（１９８２年）、Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１５９巻：６０１〜６２１頁に記載されたＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ（１９８０年） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、７７巻：４２１６〜４２２０頁に記載されたｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、リンパ細胞系、例えばＮＳ０骨髄腫細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２、ならびにトランスジェニック動物由来の細胞、例えばトランスジェニック哺乳動物由来の細胞が挙げられる。例えば、その細胞は哺乳動物上皮細胞である。
【００７５】
免疫グロブリンドメインをコードしている核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば複製起点）および選択マーカー遺伝子などの追加の核酸配列を有することがある。選択マーカー遺伝子は、そのベクターが導入された宿主細胞の選択を促進する（例えば米国特許第４３９９２１６号、第４６３４６６５号、および第５１７９０１７号参照）。選択マーカー遺伝子の例には、（ｄｈｆｒ−宿主細胞においてメトトレキサート選択／増幅と共に使用するための）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子および（Ｇ４１８選択用の）ｎｅｏ遺伝子が挙げられる。
【００７６】
抗体（例えば全長抗体またはその抗原結合部分）の組換え発現用の系の例では、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードしている組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム介在性トランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内では、抗体重鎖および軽鎖遺伝子は、それぞれ（例えばＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルスなど由来のＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなどの）エンハンサー／プロモーター調節エレメントと作動可能に連結して高レベルの遺伝子転写を駆動する。組換え発現ベクターはＤＨＦＲ遺伝子も有し、ＤＨＦＲ遺伝子は、メトトレキサート選択／増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にする。選択された形質転換体宿主細胞を培養して、抗体重鎖および軽鎖の発現を可能にし、無傷抗体を培養液から回収する。標準的な分子生物学の技法を使用して組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養液から抗体を回収する。例えば、プロテインＡまたはプロテインＧを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより一部の抗体を単離することができる。
【００７７】
抗体は、修飾、例えばＦｃの機能を変更する修飾を含み、例えばＦｃ受容体もしくはＣ１ｑとの、またはその両方との相互作用が減少または除去されることもある。例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を１つまたは複数の残基で、例えば米国特許第５６４８２６０号の番号付けによる、例えば残基２３４および３４７の１つまたは複数で突然変異させることができる。その他の修飾の例には、米国特許第５６４８２６０号に記載された修飾が挙げられる。
【００７８】
Ｆｃドメインを含む一部の抗体について抗体生産系を設計して、Ｆｃ領域がグリコシル化されている抗体を合成することができる。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインをＣＨ２ドメインのアスパラギン２９７でグリコシル化する。このアスパラギンは、２分岐型オリゴ糖を用いた修飾のための部位である。このグリコシル化は、Ｆｃγ受容体および補体Ｃ１ｑによって仲介されるエフェクター機能に関与する（ＢｕｒｔｏｎおよびＷｏｏｆ（１９９２年）Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５１巻：１〜８４頁；Ｊｅｆｆｅｒｉｓら（１９９８年）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．、１６３巻：５９〜７６頁）。アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系でこのＦｃドメインを生産することができる。このＦｃドメインは他の真核生物の翻訳後修飾も含むことがある。
【００７９】
トランスジェニック動物により抗体を生産することもできる。例えば、米国特許第５８４９９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺に抗体を発現させる方法を記載している。乳汁特異的プロモーターと、対象となる抗体、例えば本明細書に記載した抗体、および分泌のためのシグナル配列をコードしている核酸配列とを含む導入遺伝子を構築する。当該トランスジェニック哺乳動物の雌により生産される乳汁は、その中に分泌された対象となる抗体、例えば本明細書に記載した抗体を含む。その抗体を乳汁から精製することができるし、一部の適用には直接使用することができる。
【００８０】
例えば抗体の安定化および／または循環、例えば血液、血清、リンパ液、気管支洗浄液、もしくは他の組織における貯留を、例えば少なくとも１．５、２、５、１０、または５０倍高める部分を用いて、抗体を修飾することができる。
【００８１】
一例では、ＫＩＭ−１結合抗体は、ポリマー、例えばポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドなどの実質的に非抗原性のポリマーと関連していることがある。適切なポリマーは、重量により実質的に変動するものである。平均分子量が約２００から約３５０００ダルトン（または約１０００から約１５０００、および２０００から約１２５００）の範囲を有するポリマーを使用することができる。
【００８２】
別の例では、ＫＩＭ−１結合抗体は、水溶性ポリマー、例えば親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンと複合していることがある。当該ポリマーの非限定的な一覧表には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、そのコポリマーおよび（そのブロックコポリマーの水溶性が維持されるという条件で）そのブロックコポリマーが挙げられる。追加的に有用なポリマーには、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）などのポリオキシアルキレン；ポリメタクリル酸エステル；カルボマー；糖単量体であるＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコース、およびノイラミン酸を含む分岐または非分岐多糖であって、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸性ムコ多糖の多糖サブユニット、例えばヒアルロン酸を含めた分岐または非分岐多糖；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマー；ヘパリンまたはヘパラン（ｈｅｐａｒｏｎ）が挙げられる。
【００８３】
用途および投与方法
本明細書に記載した方法では、Ｔｈ２介在性状態またはＴｈ１介在性状態を治療するために、対象にＫＩＭ−１の特定領域と結合する抗体などの作用物質を投与する。治療される対象は哺乳動物、例えばヒトである。
【００８４】
「投与」は、いかなる特定の製剤、送達系、および経路にも限定されず、例えば気管支内、非経口（皮下、静脈内、脊髄内、関節内、筋肉内、または腹腔内注射を含む）、直腸内、局所、経皮、または経口（例えばカプセル剤、懸濁剤、または錠剤の形）を含みうる。投与は、単回投与または繰り返しで、生理学的に許容できる塩の形態を含有する多様な医薬組成物のうち任意のものとして、および／または許容できる医薬賦形剤と共に提供されうる。生理学的に許容できる塩の形態および医薬製剤および賦形剤は公知である（例えば２００４ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）（ＰＤＲ）（２００３年）Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、第５８版；Ｇｅｎｎａｄｏら（２０００年）、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ参照。
【００８５】
喘息の管理および治療に多数の治療剤が有用である。これらには、気管支拡張薬、例えば気道を弛緩させる抗コリン作用性気管支拡張薬（例えば臭化イプラトロピウム、アルブテロール／臭化イプラトロピウム）；気道筋を弛緩させるベータ作動薬（例えばエピネフリン、メタプロテレノール、テルブタリン、メシル酸イソエタリン、イソエタリン、イスプレル、ピルブテロール、アルブテロール、サルメテロール、ビトルテロール）；炎症を軽減する経口または吸入コルチコステロイド（例えばヒドロコルチゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、フルニソリド、トリアムシノロン、ベクロメタゾン（ｂｅｃｌｏｍｅｔｈｏｓｏｎｅ）、デキサメタゾン、フルチカソン、ブデソニド）；気道の腫脹および気流遮断を防止して粘液産生を減少させるロイコトリエン調節因子（例えばザフィルルカスト、モンテルカストナトリウム、ジロイトン）；およびとりわけ気道開放を助け、痰の放出を減らすテオフィリンが挙げられるが、それに限定されるわけではない。抗喘息薬には、抗ＩｇＥ、抗ＩＬ−９、抗ＩＬ−３、抗ＩＬ−４、抗ＩＬ−５、抗ＩＬ−１３、抗ＶＬＡタンパク質、および抗遊走阻止因子（ＭＩＦ）を非限定的に含めた治療用抗体（またはその機能的断片）も含まれる。本明細書に記載した抗体を、１つまたは複数の前述の作用物質と組み合わせて投与してアレルギー性喘息を治療することができる。
【００８６】
Ｔｈ１介在性炎症状態の管理および治療に有用な治療剤には、抗炎症化合物、例えばステロイドおよびＮＳＡＩＤが挙げられる。
【００８７】
公知の変換係数を使用して、ある動物モデルで実現された治療有効投薬量を、ヒトを含めた別の動物での使用のために変換することができる（例えばＦｒｅｉｒｅｉｃｈら（１９６６年） Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｒｅｐｏｒｔｓ、５０巻（４）：２１９〜２４４頁参照。
【００８８】
以下の実施例は例示的な実施形態を提供するものである。この実施例は、本発明を決して限定するものではない。当業者は、本発明の範囲内で行うことができる多数の修飾および変更を認識しているであろう。したがって、そのような修飾および変更は本発明に包含される。
【実施例】
【００８９】
（実施例１：マウスＫＩＭ−１に対するラットモノクローナル抗体の特徴付け）
標準的なＰＣＲおよびクローニング技法を使用して、全長細胞外ドメインのマウスＫＩＭ−１発現構築物およびＩｇＶドメインのみのマウスＫＩＭ−１発現構築物を作成し、ＣＨＯ細胞にそれを安定的にトランスフェクトした。これらの融合タンパク質をＣＨＯ細胞系の上清からプロテインＡおよびＳＥＣクロマトグラフィーにより精製した。ヒトＩｇＧ１−Ｆｃドメインに融合した全長ＫＩＭ−１は、グリコシル化の差に一致したダブレットとして出現した。細胞外ドメイン全体からなる全長マウスＫＩＭ−１−Ｉｇ融合蛋白質を用いてラットに免疫処置を行った。ｍＫＩＭ−１に対する１集団のラットモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡアッセイおよびＦＡＣＳスクリーニングにより同定し、これらのセットをＢｉａｃｏｒｅにより、ならびにドメイン特異的ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析によりさらに特徴付けた。これにより、別個のエピトープに結合する多数の抗体がこの集団中に提示されることを実証した。このように、７個の抗体がＢｉａｃｏｒｅおよびＥＬＩＳＡ分析で全長タンパク質と結合したが、これら７個のうち４個はＩｇＶドメインのみをコードしているタンパク質に結合しなかった（表１）。Ｂｉａｃｏｒｅ形式で結合するムチンストークドメインの存在を必要とすると思われる４個の抗体のうち、３個がムチンドメイン内で結合することがＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析でさらに確定されたが、１個はストークドメインで結合した（表１）。いくつかの抗体は、ムチンドメイン内でエキソン４によりコードされている別個の領域を認識した（表１）。このように、ＩｇＶドメイン、ムチンドメイン、およびストークドメインを認識する抗体が同定された。表１に、ラット抗ｍＫＩＭ−１ ｍＡｂの概略のエピトープマッピングの結果を示す。表１のデータを、完全なＥＣＤのＫＩＭ−１−Ｉｇ、ＫＩＭ−１−ＩｇＶ−Ｉｇ、およびＫＩＭ−１−Ｉｇタンパク質のタンパク質分解断片を使用した多数のアッセイ（Ｂｉａｃｏｒｅ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、およびＦＡＣＳ）から編集した。
【００９０】
【表１】
（実施例２：機能亢進肺におけるＫＩＭ−１発現の誘導）
Ｂａｌｂ／ｃマウスをＯＶＡ／ミョウバンで２回感作し、次に３週間休ませ、その期間に噴霧器を使用してマウスにＯＶＡエアロゾルの３日間の曝露を受けさせた。肺組織、所属（気管支）リンパ節、および脾臓を採取し、ＲＴ−ＰＣＲによりＫＩＭ−１の発現誘導について調べた。ＫＩＭ−１のメッセージは、噴霧の２４時間後までに気管支ＬＮおよび肺組織の両方に誘導された。ＫＩＭ−１のｍＲＮＡレベルとは対照的に、ＫＩＭ−３のｍＲＮＡレベルはＯＶＡエアロゾルを用いた攻撃誘発後に調節されなかった。ＫＩＭ−２レベルはＫＩＭ−１に同様の様式でアップレギュレーションされた。
【００９１】
（実施例３：ＯＶＡ誘導過反応性に及ぼす抗ＫＩＭ−１抗体の作用）
ＯＶＡエアロゾルモデルを使用して、そして予防投薬方式および治療投薬方式の両方を使用して、肺炎の発生に影響する能力について、異なるエピトープ特異性を有する抗ＫＩＭ−１抗体を試験した。
【００９２】
予防的研究に関して、ＯＶＡにより誘導された肺炎のアッセイおよびリコールアッセイを以下のように行った。１日目および７日目にＢａｌｂ／ｃマウスに、ＩｍｊｅｃｔＡｌｕｍ（Ｐｉｅｒｃｅ、ロックフォード、イリノイ州、米国）１００μｌと混合した０．５ｍｇ／ｍｌ ＯＶＡ（グレードＶ、Ｓｉｇｍａ）１００μｌのｉｐ注射を与えた。２回目の注射の３週間後に超音波噴霧器（Ｄｅｖｉｌｂｉｓｓ、カールズバッド、カリフォルニア州、米国）を使用してＰＢＳ中の１％ＯＶＡのアエロゾルにマウスを１日２０分間、３日間にわたり曝露した。ｍＡｂの投与を以下のように行った。１、３、６、および９日目に２００μｇを与え、次に噴霧を開始した日に５００μｇをｉｐ投与した。
【００９３】
治療的研究に関して、マウスを上記のようにミョウバン中のＯＶＡで免疫処置したが、一連の噴霧の直前までｍＡｂは投与しなかった。このように２５０μｇのｍＡｂ ４Ａ２を初回噴霧の前日に与え、２５０μｇのｍＡｂ ４Ａ２を２回目の噴霧の朝に与えた。
【００９４】
予防的研究および治療的研究の両方で、最終噴霧セッションの２日後にマウスを屠殺して分析に供した。気管切開によって、０．１％ＢＳＡおよび０．０２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで３回洗浄することを採用して気管支洗浄液（ＢＡＬ）を収集した。サイトスピンおよび被覆スライド（Ｓｈａｎｄｏｎ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）を使用してＢＡＬ細胞をペレットにして、次に風乾し、異なる細胞集団を同定するためにＨｅｍａ３色素（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）で染色した。日常的な組織観察のために肺組織を中性緩衝ホルマリンの中に採取するか、後でＲＮＡを単離するためにトリゾール中で急速凍結した。所属（気管支）リンパ節および脾臓を単核細胞の単離のために採取し、様々な濃度のＯＶＡを有するＲＰＭＩ／１０％ＦＢＳの中でそれを培養状態に置いた。７２時間後に上清を採取し、細胞を１μＣｉトリチウムチミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）で８時間パルスし、Ｍｉｃｒｏｂｅｔａｊｅｔシステム（Ｗａｌｌａｃ、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、米国）を使用してプレートを計数した。Ｔｈ１／Ｔｈ２および炎症のＣＢＡキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）ならびにＩＬ−１３ ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ミネソタ州、米国）を使用して上清を分析した。
【００９５】
結果：
ＯＶＡ初回免疫期および攻撃誘発期の間に抗体をマウスに投与した。攻撃誘発後に気管支洗浄液（ＢＡＬ）、気管支リンパ節、脾臓、および肺組織を採取した。ＢＡＬに存在する好酸球、好中球、およびリンパ球の率を計算した。ｍＡｂ １Ｈ８は処置されたマウスのＢＡＬ中に好酸球数を強く誘導した結果、存在する好酸球の率は対照の２倍を超えた。ＢＡＬの細胞性のわずかな部分を構成する好中球およびリンパ球の率の中程度の増加も認められた。この結果に一致して、１Ｈ８で処置されたマウスから単離され、ＯＶＡでｅｘ
ｖｉｖｏ攻撃誘発された気管支ＬＮ細胞は対照培養物よりも大きく増殖し、高レベルのＴｈ２関連サイトカインを発現した。特に、対照に比べて非常に高レベルのＩＬ−５およびＩＬ−１３が生成した。もっとも、ＩＬ−４、ＩＬ−６、およびＩＬ−１０のレベルも上昇した。興味深いことにＩＦＮ−γレベルも増加した。もっとも、全般的にこのサイトカインのレベルは低かった。Ｔｈ２サイトカインの選択的誘導は、ＭＳ、ＲＡ、クローン病などのＴｈ１サイトカイン依存性病理の背景において有効であろう。
【００９６】
１Ｈ８と対照的に、ｍＡｂ ３Ａ２は、ＢＡＬ中の好酸球の率を低減し、気管支リンパ節リコールアッセイでＴｈ２関連サイトカインの生成を低減した（図２）。このように、抗体１Ｈ８および３Ａ２はこのアッセイにおいて相反する作用を有する。ＩｇＶドメイン内のエピトープを認識する、１Ｈ９を含めたいくつかの他の抗体は、このモデルにおける肺炎にもサイトカイン生成にも作用を及ぼさなかった。３Ａ２と共にＯＶＡ抗原を用いたｅｘ ｖｉｖｏ刺激に対する所属（気管支）リンパ節細胞の応答の分析は、抗原刺激に対する細胞増殖の低減を示した（図３）。さらに、これらの培養物の上清の分析は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１０を含めたＴｈ２サイトカインの発現に顕著な低減を示した（図４）。ＩＬ−１３のレベルもこのアッセイで低減した。
【００９７】
抗ＩｇドメインｍＡｂ ４Ａ２を用いた処置は、ＯＶＡを用いた感作および噴霧処置後にＢＡＬへの好酸球およびリンパ球流入の顕著な低減を招いた（図６）。ＢＡＬ中の好酸球の平均減少率は、対照に比べて８４％（ｐ＜０．０００１、平均の同等性の検定）であり、リンパ球の平均減少率は対照に比べて９０％（ｐ＜０．００１、平均の同等性の検定）であった。気管支リンパ節細胞をＯＶＡでｅｘ ｖｉｖｏ再刺激したとき、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３を含めたＴｈ２サイトカイン生成に劇的な減少が存在した（図７）。したがって、ｍＡｂ ４Ａ２を用いた処置は肺炎および喘息応答に関連するサイトカイン生成を低減した。
【００９８】
ｍＡｂ ４Ａ２の臨床有効性をさらに特徴付けるために治療用投与実験を行った。このモデルでは、マウスを免疫処置してＯＶＡ抗原に対する感受性を発生させ、ｍＡｂ処置を全く施さなかった。次に、これも処置を全く行わずにマウスを３週間休ませ、次に１％ＯＶＡを噴霧する３回のセッションのうち初回の前日に４Ａ２ ｍＡｂを投与した。２回目のセッション前にｍＡｂ投与を繰り返した。この処置プロトコールの結果として、ＢＡＬへの好酸球流入により測定される肺炎の軽減が生じた（図８）。好酸球の率は平均７０％減少した（ｐ＜０．００１、平均の同等性の検定）。したがって、ｍＡｂ ４Ａ２はＯＶＡ誘導肺炎モデルにおいて予防的投与方式および治療的投与方式の両方で有効であった。これは、４Ａ２により認識されるエピトープがＴｈ２介在性障害の処置のための治療に関連する標的であることを示唆している。
【００９９】
例えばｍＡｂ ２Ａ７およびｍＡｂ ２Ｂ３を含めた他の抗ＫＩＭ−１ ｍＡｂも、ＯＶＡ誘導肺炎モデルにおいて治療活性を有することが実証された。ｍＡｂ ２Ａ７は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイでの固定化ＫＩＭ−１への結合について４Ａ２と競合することが示された。これは、これらの抗体が共有されたエピトープまたは重複するエピトープを有することを示唆している。
【０１００】
（実施例４：抗原に対するＣＤ４ Ｔ細胞応答に及ぼすＫＩＭ−１抗体の作用）
ＫＬＨ抗原リコールアッセイを使用して抗ＫＩＭ−１ ｍＡｂの活性を評価した。マウスを抗ＫＩＭ−１ ｍＡｂ、対照ｍＡｂ、またはＰＢＳで処置し、次にＫＬＨで免疫処置し、６日後に所属ＬＮを切除した。ＬＮ ＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、未処置マウスから単離して放射線照射した脾臓細胞全体の存在下で精製ＯＶＡを用いてｅｘ ｖｉｖｏ再刺激した。ｅｘ ｖｉｖｏ刺激の４８時間後に細胞増殖およびサイトカイン生成をアッセイした。このアッセイでは、いくつかの抗ＫＩＭ−１ ｍＡｂが顕著な作用を有した。ｍＡｂ
１Ｈ８はｅｘ ｖｉｖｏでのＫＬＨ攻撃誘発に応答してＴ細胞増殖を劇的に増大させた。対照的に、このアッセイでは、ｍＡｂ ３Ａ２はＴ細胞増殖を低減した。ｍＡｂ １Ｈ８で処置された細胞から生成した培養物中のサイトカインを測定した。処置された培養物は、対照よりも多量のＩＦＮ−γおよびＴＨ２関連サイトカインを含有することが見出された。対照的に、ＴＮＦおよびＩＬ−２のレベルは対照と同様であった。
【０１０１】
このデータは、１Ｈ８が病原性Ｔｈ１応答を低減することができることを示している。このデータは、１Ｈ８について本明細書に規定したように、ＫＩＭ−１領域に結合する１Ｈ８および他の抗体が、免疫応答を増加させることによりアジュバントとして作用できることも示している。本発明は、例えばワクチンの有効性を増大させるために、免疫応答を増大する方法にも及ぶ。そのようなアジュバント活性は、ワクチン接種、免疫不全、および抗腫瘍免疫にも用途を有しうる。
【０１０２】
１Ｈ８は、ウエスタンブロットにおいてＤｂａ／２配列ではなく、Ｂａｌｂ／Ｃ配列のＫＩＭ−１のＥＣＤと結合する。これは、この抗体が配列
【０１０３】
【化３７】
（配列番号２）を含む選択的スプライシングされたマウス対立遺伝子変異体に結合することを示している。この配列は、ヒトＫＩＭ−１の配列
【０１０４】
【化３８】
（配列番号１のアミノ酸２００〜２３５）に対応する。
【０１０５】
（実施例５：ｍＡｂ ３Ａ２の特徴付け）
３Ａ２ ｍＡｂはＯＶＡモデルにおいて治療効果を有したが、このｍＡｂとＫＩＭ−１との結合をさらに詳細に特徴付けた。
【０１０６】
多様な精製タンパク質をＥＬＩＳＡアッセイに使用して、ｍＡｂ ３Ａ２のエピトープを決定した（表２）。３Ａ２と固定化タンパク質との相互作用についての全結合曲線を作成した（図５）。ＭＡｂ ３Ａ２は、以下のマウスタンパク質と等価に結合した：マウスＫＩＭ−１細胞外ドメイン（ＫＩＭ−１−ＥＣＤ−１〜２１６）、ｍＫＩＭ−１−１３７〜２１６、およびｍＫＩＭ−１−１９６〜２１６−Ｆｃ。対照的に、ｍＡｂ ３Ａ２は、ムチンおよびストークドメイン全体を欠如しているｍＫＩＭ−１−ＩｇＶドメイン単独と結合できなかった。このデータは、３Ａ２に関するエピトープがｍＫＩＭ−１由来の１９６から２１６までの２１アミノ酸残基内に存在することを示している。その残基は、ＫＩＭ−１のストーク領域の部分に位置する。このエピトープは、図１に示すようにヒトＫＩＭ−１の残基２４７〜２７２に等しい。
【０１０７】
【表２】
マウスＫＩＭ−１のアミノ酸１９６から２１６（ヒトＫＩＭ−１のアミノ酸２４７〜２７２に対応する）を含むストーク領域がＮ−グリコシル化部位を有することから、Ｎ−グリコシル化部位に結合した糖部分が３Ａ２の結合に必要であるかどうかを判定することが関心対象であった。グリコシル化および脱グリコシル化ＫＩＭ−１−１９６〜２１６−Ｆｃのウエスタンブロット分析を行った（図２）。脱グリコシル化は、３Ａ２がＫＩＭ−１−１９６〜２１６−Ｆｃに結合する能力に影響しなかったことをこの分析は示した。したがって、糖部分は３Ａ２がそのエピトープを認識するために必要ではない。
【０１０８】
３Ａ２が細胞表面からのＫＩＭ−１の分断を阻害するかどうか判定するために、ＫＩＭ−１をトランスフェクトされたＥ２９３細胞を５ｕｇ／ｍＬの３Ａ２、２５ｕｇ／ｍＬの３Ａ２、または３Ａ２なし（対照）で処理した。ビオチン化１Ｈ８抗体を用いて探査したウエスタンブロットを行ったとき、両セットの３Ａ２処理細胞の上清は、ＫＩＭ−１染色で対照との差を示さなかった。これは、３Ａ２がＫＩＭ−１の分断を阻止しないことを示唆している。
【０１０９】
（実施例６． ４Ａ２ｍＡｂの特徴付け）
ＥＬＩＳＡおよびＢｉａｃｏｒｅ分析を使用して、ｍＡｂ ４Ａ２がマウスＫＩＭ−１のＩｇドメインを認識したと判定した（図９、表１）。ｍＡｂ ４Ａ２により認識されたエピトープをさらに特徴付けるために、単独および４Ａ２と複合体を形成した組換えマウスＫＩＭ−１ ＩｇＶ−ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合体をＴＰＣＫトリプシンで消化した。ＫＩＭ−１単独から８ｋＤａのバンドが生成し、４Ａ２が結合しているときには生成しない。これは、ＫＩＭ−１への４Ａ２の結合がこのバンドの生成に必要な切断部位へのトリプシンの接近を遮断することを示している。非還元状態での８Ｋｄａのバンドへの消化は、４Ａ２がヒトＫＩＭ−１配列
【０１１０】
【化３９】
（配列番号１のアミノ酸８１〜１０７）に対応する断片を保護することを明らかにした。このように、４Ａ２抗体は、少なくとも部分的に配列番号１のアミノ酸８１〜１０７内の、またはそのアミノ酸と重複するＴＰＣＫトリプシン部位を保護する。
【０１１１】
２Ａ７を用いて同様のＴＰＣＫトリプシン消化実験を行い、ほぼ同じサイズのバンドを得た。同様の実験を（喘息モデルにおける無効ｍＡｂであり、Ｉｇドメインにも結合する）１Ｈ９で行ったとき、このバンドは得らなかった。これは、エピトープが喘息での有効性と一致することを示している。
【０１１２】
この明細書は、この明細書の中で引用される参照の教示に照らして最も完全に理解される。この明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供するものであり、本発明の範囲を限定するものとみなしてはならない。当業者は、多数の他の実施形態が本発明により包含されることを容易に認識している。本開示に引用される全ての刊行物、特許、および生物学的配列は、その全体が参照により組み込まれている。参照により組み込まれている資料が本明細書と矛盾するか、または一致しない範囲で、本明細書はそのような任意の資料に優先するであろう。本明細書における任意の参照の引用は、そのような参照が本発明の従来技術であるという承認ではない。
【０１１３】
別に示さない限り、特許請求の範囲を含めて本明細書に使用された成分、細胞培養、処置条件などの量を表現する全ての数字は、全ての例において用語「約」により修飾されていると了解されたい。
【０１１４】
したがって、それとは反対に別に示さない限り、数値パラメータは近似であり、本発明により得ようと努めた所望の性質に応じて変動しうる。別に示さない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、その連なりにおける全ての要素を表すことを了解されたい。当業者は、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態の多数の等価物を認識しているであろうし、また日常的な実験だけを使用してそれを確かめることができる。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲により包含されることが意図される。
【数１】
【数２】
【数３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【請求項１】
本願明細書に記載された発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２０１２−１３１８２５（Ｐ２０１２−１３１８２５Ａ）
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【外国語出願】
【出願番号】特願２０１２−７３８５２（Ｐ２０１２−７３８５２）
【出願日】平成２４年３月２８日（２０１２．３．２８）
【分割の表示】特願２００７−５５８２２３（Ｐ２００７−５５８２２３）の分割
【原出願日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−７３８５２（Ｐ２０１２−７３８５２）
【出願日】平成２４年３月２８日（２０１２．３．２８）
【分割の表示】特願２００７−５５８２２３（Ｐ２００７−５５８２２３）の分割
【原出願日】平成１８年３月２日（２００６．３．２）
【出願人】（５９２２２１５２８）バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド (224)
【Ｆターム（参考）】
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