キク科植物の葉緑体の形質転換方法
【課 題】 本発明の課題は、有害な二次代謝物を生産することなく、キク科植物葉緑体に医療用タンパク質などの有用タンパク質を効率よく発現させることができる形質転換方法を提供するものである。
【解決手段】 キク科植物葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子の間に、キク科植物葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターおよびｐｓｂＡ遺伝子のターミネーターを有し、さらに前記プロモーターおよびターミネーターとの間に発現タンパク質をコードする塩基配列を有するベクターをキク科植物の葉緑体に導入する。
【解決手段】 キク科植物葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子の間に、キク科植物葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターおよびｐｓｂＡ遺伝子のターミネーターを有し、さらに前記プロモーターおよびターミネーターとの間に発現タンパク質をコードする塩基配列を有するベクターをキク科植物の葉緑体に導入する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キク科植物の葉緑体の形質転換方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、タンパク質の工業的な生産方法については、既に、医薬として有用なタンパク質などを発現する遺伝子を大腸菌や植物の核染色体へ導入し、該遺伝子を発現させることによって医療用タンパク質などを製造する研究が各国で進んでいる。しかし、大腸菌など細菌を使った場合、最終製品への毒素の混入を防ぎきれない。また、植物の核ゲノムに遺伝子導入した形質転換植物によるタンパク質の生産方法が開発されてきたが、タンパク質の生産量が低いなど課題点が残されていた。また、植物の核への遺伝子導入の場合、花粉の飛散による自然界への遺伝子の伝播が問題視されている。そのような中、植物葉緑体ゲノムへの形質転換法がＭａｌｉｇａらによってタバコで実用化された。葉緑体形質転換はこれまで行われてきた植物の核ゲノムへの形質転換と比較して葉緑体が大量のタンパク質を生産、蓄積する能力を有することが大きな特徴となっている。葉緑体形質転換のその他の特徴として葉緑体の遺伝情報が一般に母性遺伝で、花粉を介した導入遺伝子の水平伝播の可能性が低いことや、葉緑体のポリシストロニックな制御を活かした多重遺伝子発現などの利点が挙げられる。このような利点から、形質転換した葉緑体はタンパク質などの物質生産を行うのに有用な系として注目され始めている。例えば、目的タンパク質をタバコ葉緑体において高度に発現させることができるベクターが知られている。このベクターは、ｐｓｂＡプロモーターと、タンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有することを特徴としている（特許文献１参照。）。本方法は、薬理活性を有するタンパク質、医薬品工業用材料などとして有用なタンパク質を、微生物による製造にかえて、タバコを使用して製造することを目的としたものである。しかし、この方法は、形質転換される植物がタバコであるため、タバコの二次代謝産物として体に有害な物質も生産することから医療用などの高度な精製が要求されるタンパク質生産には不向きであると言える。
【０００３】
キク科植物の形質転換としては、例えば、レタスビッグベインウイルスタンパク質の産生や機能を抑制するＤＮＡをレタス細胞に導入することによって得られるレタスビッグベインウイルス抵抗性レタス（特許文献１参照。）や、レタス感染性黄化ウイルス蛋白質の遺伝子または遺伝子の一部分を含む植物形質転換ベクターを用いて形質転換したレタス（特許文献２）などが知られている。しかし、これらいずれの形質転換レタスの場合も、遺伝子を用いて構築されたプラスミドをアグロバクテリウムに導入し、葉ディスクに感染させることによって、各遺伝子を葉の核ゲノムに導入されるものであり、葉緑体に直接遺伝子が導入されるものではなかった。
【特許文献１】特開２００２−２７２４７６号公報
【特許文献２】国際公開第０１／０９０３６２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９５／０２０５６号パンフレット
【非特許文献１】ゾラ・スバブ（Ｚｏｒａ Ｓｖａｂ）他２名、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９０年、第８７巻、ｐ．８５２６−８５３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、有害な二次代謝物を生産することなく、キク科植物葉緑体に医療用タンパク質などの有用タンパク質を効率よく発現させることができる形質転換方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、生育が早く、有害な二次代謝物を生産する可能性の低い植物としてキク科植物のレタスに注目した。またレタスは水耕栽培を利用した植物工場での栽培も可能であることから、レタスを用いて天候や病虫害に左右されない安定したタンパク質の生産システムを構築することを試みた。このようなことから、本発明者らは、レタス葉緑体でのタンパク質の生産方法につき鋭意研究をおこなった。まずレタス葉緑体由来の塩基配列の取得および外来遺伝子を導入する位置の検討を行うためにレタス葉緑体の全塩基配列を決定した。決定したレタス葉緑体の塩基配列からレタス葉緑体ゲノムと効率的な相同組み換えを可能にする相同配列（リブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子）と、レタス葉緑体において確実に導入遺伝子を発現させるためのレタス葉緑体ゲノム由来発現調節配列（ｒＲＮＡオペロンのプロモーターとｐｓｂＡ遺伝子のターミネーター）を有するベクターを構築した。本発明者らは、さらに構築したベクターを使用して、レタス葉緑体ゲノムへの遺伝子導入法についても検討を重ねた。また、本発明者らは、レタス葉緑体ゲノムへ遺伝子が導入されたレタスの葉細胞が植物個体へと再生するステップの重要性にも注目し、レタス葉緑体ゲノムへ遺伝子を導入したレタスの葉切片の再分化条件についても研究を進め、さらにこのようにして得られた植物固体の栽培方法についても検討し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１） キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡを含有することを特徴とするキク科植物の葉緑体形質転換用ベクター、
（２） キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡが、レタス葉緑体由来のＤＮＡであることを特徴とする前記（１）に記載のベクター、
（３） キク科植物が、レタスであることを特徴とする前記（１）または（２）に記載のベクター、
（４） キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡを複数含有する前記（１）〜（３）のいずれかに記載のベクター、
（５） レタス葉緑体ゲノム由来のＤＮＡが、リブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子であることを特徴とする前記（４）に記載のベクター、
（６） キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡの間に少なくとも１種の制限酵素切断部位を有することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載のベクター、
（７） キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡ配列の間に葉緑体で機能するプロモーター、ターミネーターを有し、さらに前記プロモーターとターミネーターとの間に発現タンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかに記載のベクター、
（８） プロモーターが、レタス葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターであることを特徴とする前記（７）に記載のベクター、
（９） レタス葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子の間に、レタス葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターおよびｐｓｂＡ遺伝子のターミネーターを有し、さらに前記プロモーターおよびターミネーターとの間に発現タンパク質をコードする塩基配列を有するベクター、
（１０） 前記（１）〜（９）のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されたキク科植物、
（１１） 前記（１）〜（９）のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されたレタス、
（１２） 前記（１）〜（９）のいずれかに記載のベクターを、キク科植物の葉細胞に導入することを特徴とするキク科植物葉緑体の形質転換方法、
（１３） ベクターの導入が、パーティクルガンを用いることを特徴とする前記（１２）に記載の形質転換方法、
（１４） 前記（１）〜（９）のいずれかに記載のベクターを、キク科植物の葉細胞に導入し、前記キク科植物の葉細胞を植物培養用培地で培養することを特徴とする形質転換植物体の製造方法、
（１５） 植物培養用培地が、ナフタレン酢酸、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸から選択されるオーキシン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ０．０１〜１ｍｇ／Ｌ並びにカイネチン、ゼアチンまたはベンジルアデニンおよびイソペンテニルアデニンから選択されるサイトカイニン０．０１〜１ｍｇ／Ｌを含有することを特徴とする前記（１４）に記載の形質転換植物体の製造方法、
（１６） オーキシンに対するサイトカイニンの重量比が１：０．８〜１．２であることを特徴とする前記（１５）に記載の形質転換植物体の製造方法、
（１７） 植物培養用培地が、さらにポリビニルピロリドンを１００〜１０００ｐｐｍ含有することを特徴とする前記（１５）または（１６）に記載の形質転換植物体の製造方法、
（１８） ナフタレン酢酸、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸から選択されるオーキシン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ、カイネチン、ゼアチンまたはベンジルアデニンおよびイソペンテニルアデニンから選択されるサイトカイニン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ、およびポリビニルピロリドン１００〜１０００ｐｐｍを含有することを特徴とする形質転換キク科植物の葉培養用培地、
（１９） オーキシンに対するサイトカイニンの重量比が１：０．８〜１．２であることを特徴とする前記（１８）に記載の培地、および
（２０） キク科植物がレタスであることを特徴とする前記（１８）または（１９）に記載の培地、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のベクターは、確実にキク科植物の葉緑体へ、発現タンパク質をコードする遺伝子を導入できる。
キク科植物の葉緑体のうち特にレタス葉緑体の形質転換技術は、有害な二次代謝産物の含有量が少ないことなどからこれまでに作出されてきたタバコなどの葉緑体形質転換植物と比較して、これまでよりも安全に有用なタンパク質を生産できるシステムの構築が可能となる。また、レタスは水耕栽培法が確立されていることから、本発明により形質転換されるレタスは、植物工場を利用して工業的に大量生産ができるので、安全かつ安価にタンパク質を生産でき、かつ天候や病虫害に左右されないので、安定したタンパク質の生産システムを構築できる。
また、本発明の形質転換技術により、葉緑体にメタロチオネイン遺伝子（例．ｍｅｒＡ遺伝子など）を導入し形質転換されたキク科植物は、土壌などの環境中の有害重金属や水銀などを無害化または無毒化し得るので、ファイトレメディエーション（Ｐｈｙｔｏ Ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ；植物を利用した環境浄化技術）に利用できる。また、本発明の形質転換技術により、葉緑体に病中害耐性遺伝子や除草剤耐性遺伝子などを導入することにより、害虫抵抗性や除草剤耐性のキク科植物を製造することができる。さらに、本発明の形質転換技術により、葉緑体に抗酸化作用を有するカロテノイドやビタミンＥなどの生合成に関る遺伝子を導入することにより、キク科植物の例えばヒマワリや紅花などにおいて、該ヒマワリや紅花などが生成する油脂類中のカロテノイドやビタミンＥなどの有用成分の含有量を上げることが可能となる。また、本発明のベクターを用いて光合成に関与する例えばフルクトース１，６−ビスホスファターゼ遺伝子やセドヘプツロース１，７−ビスホスファターゼ遺伝子を導入することにより、該遺伝子が導入されたキク科植物は、野生株に比べて、背丈が大きく、また葉の面積も大きく、早く生育し、かつ糖やデンプンの合成能力が増大し得る。
本発明によって形質転換されるキク科植物は、発現タンパク質をコードする遺伝子が核ゲノムではなく、葉緑体ゲノムに直接導入されるため、導入された遺伝子の花粉による拡散の予防が可能である。すなわち、例えば核に遺伝子が導入された植物のように、花粉が風や昆虫により広範囲に撒き散らされ、動植物界への悪影響を与えるなどの環境汚染を防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に用いられるキク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡとしては、例えばリブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子（以下、ｒｂｃＬ遺伝子と略記する。）またはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子（以下、ａｃｃＤ遺伝子と略記する。）などが挙げられる。
ｒｂｃＬ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているＲｕｂｉｓｃｏの遺伝子である。Ｒｕｂｉｓｃｏは、光合成ＣＯ２固定反応回路（カルビンサイクル）において，初発段階であるＣＯ２固定反応（カルボキシラーゼ反応）を触媒し、前記回路における代謝回転の律速となる鍵酵素である。また、該酵素は酸素（Ｏ２）を固定する反応（オキシゲナーゼ反応）も触媒する。ｒｂｃＬ遺伝子は、とりわけレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子が好ましい。
レタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子は、例えばレタス葉緑体全ゲノム塩基配列から、既に明らかになっているタバコ葉緑体ゲノムのｒｂｃＬの塩基配列との相同性から決定される。このようにして決定されたレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子とその近傍の塩基配列は、配列表の配列番号１（１６４０ｂｐ）で示される。前記配列番号１の塩基配列中の１個または複数個の塩基、例えば、１〜１５０個の塩基が欠失されるか、または別の塩基に置換されるか、または１〜１５０個の別の塩基を付加されるかして改変されたＤＮＡがｒｂｃＬ遺伝子と相同的組換えし得る配列であれば好ましく用いることができる。
【０００９】
ａｃｃＤ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの遺伝子である。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、植物において脂肪酸合成に関与している酵素である。ａｃｃＤ遺伝子としては、レタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ遺伝子が好ましい。
レタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ遺伝子は、例えばレタス葉緑体全ゲノム塩基配列から、すでに明らかになっているタバコ葉緑体ゲノムのａｃｃＤの塩基配列との相同性から決定される。このようにして決定されたレタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ遺伝子とその近傍の塩基配列は、配列表の配列番号２（１０５７ｂｐ）で示される。前記配列番号２の塩基配列中の１個または複数個の塩基、例えば、１〜１００個の塩基が欠失されるか、または別の塩基に置換されるか、または１〜１００個の別の塩基を付加されるかして改変されたＤＮＡがａｃｃＤ遺伝子と相同的組換えし得る配列であれば好ましく用いることができる。
【００１０】
本発明において、例えばレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子とを用いることにより、ベクターに導入される発現タンパク質をコードする遺伝子が、相同組換えによりレタス葉緑体ゲノムに組み込まれやすくなり、さらにレタス葉緑体での発現タンパク質の発現量が多くなるという利点がある。
また、本発明において、葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子はそれらの全長を使う必要はない。例えばｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子との間の非コード領域の、被導入遺伝子の導入位置からｒｂｃＬ遺伝子側またはａｃｃＤ遺伝子側にそれぞれ約１０００〜１５００程度の塩基対の長さを有し、ｒｂｃＬ遺伝子またはａｃｃＤ遺伝子とそれぞれ相同的組換えし得る配列であればよい。
【００１１】
上記ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子の間には、少なくとも１種、好ましくは２種以上の制限酵素切断部位（以下、制限酵素サイトとも言う。）を有することが好ましい。制限酵素サイトは、制限酵素で認識され切断される部位を含む配列であればいずれの配列も好ましく用いることができる。制限酵素サイトとしては、例えばＰｓｔＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、またはＥｃｏ４７ＩＩＩサイトなどが好ましく挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、またはＥｃｏ４７ＩＩＩで切断され得る。
【００１２】
また、上記ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子の間には、キク科植物（好ましくはレタス）葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーター（以下、Ｐｒｒｎと略記する。）およびｐｓｂＡ遺伝子のターミネーター（以下、ＴｐｓｂＡと略記する。）を有する。
上記したキク科植物（好ましくはレタス）のＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡは、例えばレタス葉緑体全ゲノム塩基配列から、すでに明らかになっているタバコ葉緑体ゲノムのＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡの塩基配列との相同性から決定される。このようにして決定された例えばレタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎは配列表の配列番号３（１１３ｂｐ）で示され、レタス葉緑体ゲノム由来のＴｐｓｂＡは、配列表の配列番号４（３３９ｂｐ）で示される。前記配列番号３または４の塩基配列のうち、１個または複数個の塩基、例えば、１〜１０個の塩基が欠失されるか、または別の塩基に置換されるか、または１〜１０個の別の塩基を付加されるかして改変されたＤＮＡであって、それぞれ発現タンパク質をコードする遺伝子の転写開始および転写終結を認識できる配列であればいずれも好ましく用いることができる。
【００１３】
また、上記プロモーターおよびターミネーターは、発現タンパク質をコードする遺伝子の転写開始および転写終結を認識できるものであれば、上記プロモーターおよびターミネーターに限定されず、他のプロモーターおよびターミネーターであってもよい。このようなプロモーターとしては、例えばｐｓｂＡプロモーター、ｒｂｃＬプロモーター、ｐｓｂＤプロモーターまたはａｔｐＢプロモーター等が挙げられる。これらプロモーターも、葉緑体ゲノム由来のプロモーターが好ましく、レタス葉緑体ゲノム由来のプロモーターがより好ましい。また該ターミネーターとしては、例えばｒｐｓ１６ターミネーターが挙げられる。
【００１４】
本発明において発現タンパク質とは、本発明に係る発現系を用いて発現させたいタンパク質であり、本発現系を用いて発現できるタンパク質であればその種類は特に限定されず、キク科植物固有のタンパク質でも、また外来遺伝子由来のタンパク質でもよい。このような発現タンパク質としては、例えば薬理活性を有する医療用タンパク質（例．インスリン、インターフェロン、エリスロポエチン、インターロイキン、ヒトソマトスタチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーターなど）または工業用材料などとして有用なタンパク質を製造するのに必要な酵素（例．セルラーゼ、ニトリルヒドラターゼなど）等が挙げられる。
また上記発現タンパク質としては、植物自体が有する酵素、例えば光合成に関与する酵素（例．フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ、トランスケトラーゼなど）や植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素（例．カロテノイド生合成酵素など）、あるいは病虫害耐性タンパク質（例．バチルス・チューリンゲス毒素など）や除草剤耐性タンパク質（例．５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素など）等も挙げられる。
また、上記発現タンパク質としては、ファイトレメディエーションのための例えば有害重金属イオンと結合するメタロチオネインなども挙げることができる。
【００１５】
本発明におけるベクターは、特開２００２−２７２４７６号公報に記載のｐＬＤ６（配列番号１７；４５９１ｂｐ）プラスミドおよびｐＬＤ２００（配列番号１８；５５８１ｂｐ）プラスミドを利用することにより構築できる。すなわち、ｐＬＤ６プラスミドおよびｐＬＤ２００プラスミドに導入されているタバコ葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ、ＴｐｓｂＡ、ｒｂｃＬ遺伝子およびａｃｃＤ遺伝子をキク科植物（好ましくはレタス）葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ、ＴｐｓｂＡ、ｒｂｃＬ遺伝子およびａｃｃＤ遺伝子に置き換えることにより作成することができる。遺伝子の置き換えは制限酵素でタバコ葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ、ＴｐｓｂＡ、ｒｂｃＬ遺伝子またはａｃｃＤ遺伝子を切り出し、その代わりにキク科植物（好ましくはレタス）葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ、ＴｐｓｂＡ、ｒｂｃＬ遺伝子またはａｃｃＤ遺伝子を導入することにより行われる。
【００１６】
まず、ｐＬＤ６のＮｏｔＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩサイトが制限酵素ＮｏｔＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを用いて切断される。次いで前記制限酵素切断部位で挟まれている領域（配列番号１７に記載された配列のヌクレオチド２２２０〜２３４５の領域；タバコ葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎを含む領域）が例えばレタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ（配列番号３；１１３ｂｐ）に置き換えられる。
また、ｐＬＤ６のＰｓｔＩおよびＳａｌＩサイトは制限酵素ＰｓｔＩおよびＳａｌＩを用いて切断され、該制限酵素切断部位で挟まれている領域（配列番号１７に記載された配列のヌクレオチド３１７４〜３９１３の領域；タバコ葉緑体ゲノム由来のＴｐｓｂＡを含む領域）が、例えばレタス葉緑体ゲノム由来のＴｐｓｂＡ（配列番号４；３３９ｂｐ）に置き換えられる。このようにしてｐＬＤ６のタバコ葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡ配列を除去し、レタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡの塩基配列に置き換えられたプラスミドを作成することができる。発現タンパク質をコードする塩基配列は上記レタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡの間に配される。
【００１７】
一方、ｐＬＤ２００のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩサイトは制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断され、該制限酵素切断部位で挟まれている領域（配列番号１８に記載された配列のヌクレオチド３９６〜２１２６の領域；タバコ葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬを含む領域）が、例えばレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ（配列番号１；１６４０ｂｐ）に置き換えられる。また、ｐＬＤ２００のＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトは制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断され、該制限酵素切断部位で挟まれている領域（配列番号１８に記載された配列のヌクレオチド２１４１〜３３４２の領域；タバコ葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤを含む領域）が、例えばレタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ（配列番号２；１０５７ｂｐ）に置き換えられる。このようにしてｐＬＤ２００のタバコ葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬおよびａｃｃＤ配列を除去し、レタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡの塩基配列に置き換えたプラスミドを作成することができる。
【００１８】
次いで、レタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎとＴｐｓｂＡ配列に置き換えられたｐＬＤ６から制限酵素ＮｏｔＩ、ＳａｌＩを用いて発現タンパク質の発現に必要な塩基配列（配列番号１７に記載された配列ではヌクレオチド２２２０〜３９１３に相当する領域）を切り出し、レタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬおよびａｃｃＤ遺伝子に置き換えられたｐＬＤ２００のＮｏｔＩ、ＳａｌＩサイトに制限酵素ＮｏｔＩ、ＳａｌＩを用いて導入される。該導入される領域は、配列番号１８に記載された配列ではヌクレオチド２１２７〜２１４１に相当する領域である。このようにして発現タンパク質の発現とレタス葉緑体ゲノムのｒｂｃＬとａｃｃＤ遺伝子の領域での相同組み換えを生じさせるベクターを作成できる。
【００１９】
また、上記ベクターには、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子を有することが好ましい。遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。例えば、各種薬剤耐性遺伝子があげられる。より具体的には、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ）、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ａａｄＡ）、ベタインアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＢＡＤＨ）等が挙げられる。また、該遺伝子の上流、下流には、それぞれ該遺伝子を発現制御するためのプロモーターおよびターミネーター配列を配することが好ましい。例えば、ａａｄＡ遺伝子を葉緑体で発現させるためには、上記した植物由来のプロモーター及びターミネーターを好ましく使用できるが、ｒｒｎプロモーターおよびｐｓｂＡターミネーターが特に好適である。
【００２０】
このようにして作製されたベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する。このとき、宿主細胞としては、キク科植物細胞が好ましく、キク科植物葉細胞がより好ましく、キク科植物の葉緑体がさらに好ましく、レタス葉緑体が特に好ましい。本発明のベクターを宿主細胞、特に葉緑体へ導入して形質転換する方法としては、公知の方法、例えばパーティクルガン法（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０年，第８７巻，ｐ．８５２６−８５３０）やＰＥＧ法（Ｇｏｌｄｓ，Ｔ．，Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｋｏｏｐ，Ｈ．−Ｕ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３年，第１１巻，ｐ．９５−９７）等を好ましく用いることができる。例えば、パーティクルガン法は、ベクターを金またはタングステンの極めて細かい粒子にまぶし、この該ベクターの付着した粒子を火薬または高圧ガスで宿主細胞に打ち込むことにより、ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００２１】
ベクターが導入されたキク科植物の葉細胞、例えばレタス葉細胞は、植物培養用培地で培養し植物体とすることができる。植物培養用培地は、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ；ＭＳ）、ニッチ・ニッチ（Ｎｉｔｃｈ＆Ｎｉｔｃｈ）などのような無機塩、ビタミン類を含有する基礎培地に、植物ホルモンを加えたものが好ましい。基礎培地としては特にＭＳ培地が好ましい。植物ホルモンとしては、オーキシンおよびサイトカイニンを組み合わせるのがよい。オーキシンとしては、ナフタレン酢酸（以下、ＮＡＡと略記する。）、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸または２，４−ジクロロフェノキシ酢酸などが挙げられ、ＮＡＡが特に好ましい。サイトカイニンとしては、カイネチン，ゼアチンまたはベンジルアデニン（以下、ＢＡと略記する。）、イソペンテニルアデニンなどが挙げられ、ＢＡが特に好ましい。基礎培地に添加するオーキシンおよびサイトカイニンの濃度は、使用するオーキシンおよびサイトカイニンにより異なるが、オーキシンは約０．０１〜１．０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０５〜０．２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約０．１ｍｇ／Ｌ、サイトカイニンは約０．０１〜１．０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０５〜０．２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約０．１ｍｇ／Ｌとなるよう添加される。オーキシンに対するサイトカイニンの割合（重量比）は、約１：０．８〜１．２が好ましい。培地にはさらに、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を約１００〜１０００ｐｐｍ、好ましくは約３００〜７００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約４００〜６００ｐｐｍを添加するのがよい。培地にオーキシンやサイトカイニンを加えることにより、形質転換されたキク科植物、とりわけレタスの再分化を促進するようになり、またＰＶＰの添加によって培養時の褐変による枯死が防止できる。
【００２２】
また、上記培地には、炭素源としての糖類や、ビタミン類、培地を固めるための支持体などを添加するのがよい。糖類としては、例えばショ糖などが挙げられる。糖類の添加量は、約１〜１０重量％、好ましくは約２〜５重量％程度である。ビタミン類としては、例えば塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸またはイノシトールなどが挙げられる。支持体としては、例えば寒天、ゲランガムまたはペーパーブリッジなどが挙げられる。支持体の濃度は、培地のｐＨなどにより異なるが、例えばゲランガムの場合、約０．２〜０．３重量％程度が好ましい。
また、上記培地には、アミノ酸（例．グリシンなど）、アデニンおよび／またはココナツウォーターなどを添加してもよい。
培地は、通常水酸化カリウムなどでｐＨ約４〜８、好ましくはｐＨ約５〜７に調整される。
【００２３】
本発明により形質転換されるキク科植物はいずれの種類であってもよく、例えばレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｓ）、アーティチョーク（Ｃｙｎａｒａ ｓｃｏｌｙｍｕｓ）、ゴボウ（Ａｒｃｔｉｕｍ ｌａｐｐａ）、キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）、コスモス（Ｃｏｓｍｏｓ ｂｉｐｉｎｎａｔｕｓ）、キバナノコギリソウ（Ａｃｈｉｌｌａ ｆｉｌｐｅｎｄｕｌｉｎａ）、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ａｒｖｅｎｓｉｓ）、デージー（Ｒｕｄｂｅｃｋｉａ ｈｉｒｔａ）、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｊａｃｑ．）などが挙げられる。
形質転換されたキク科植物、中でもレタスは自体公知の条件の下、路地または水耕栽培で生育させることができる。このようにして作製された形質転換されたキク科植物、特にレタスは、ベクターに導入された遺伝子がコードするタンパク質を高度に発現させることができる。また、本発明の形質転換体は導入した遺伝子の花粉を介した環境への飛散を防ぐことができるなどの利点がある。
【００２４】
なお、上記の遺伝子工学または生物工学の操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）などに記載された方法に従って容易に行うことができる。
【００２５】
以下に具体的実施例を挙げ、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに特に限定されることはない。
【実施例１】
【００２６】
レタス葉緑体ゲノム塩基配列の決定と解析
レタス生葉から常法に従いｐｅｒｃｏｌ密度勾配遠心によりレタス葉緑体を単離する。単離した葉緑体からＣＴＡＢを用いたＤＮＡ精製法によりレタス葉緑体のゲノムＤＮＡを精製する。精製ＤＮＡから約２ｋｂの葉緑体ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を持つレタス葉緑体ゲノムライブラリーを作成する。ゲノムライブラリーのクローン５，４２８個の塩基配列を解読してレタス葉緑体全ゲノム塩基配列（１５２，７６５ｂｐ）を決定した。すでに明らかになっているタバコ葉緑体ゲノム塩基配列との相同性からレタス葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ（配列表の配列番号１）とａｃｃＤ（配列表の配列番号２）の塩基配列およびＰｒｒｎ（配列表の配列番号３）、ＴｐｓｂＡ（配列表の配列番号４）の塩基配列情報を取得した。
【実施例２】
【００２７】
レタス葉緑体形質転換用プラスミドベクターの構築
（１）レタス葉緑体ゲノムＰｒｒｎ、ＴｐｓｂＡの単離
レタス葉緑体ゲノムのＰｒｒｎはｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＴＴＧＣＴＡＣＣＣ−３’ （配列表の配列番号５）、
とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＣＣＡＧＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＣＧＧＡＧＴＴＣＧＣＴＣＣ−３’（配列表の配列番号６）
を用いて増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは５’端にＮｏｔＩサイトを含み、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは５’端にＥｃｏ４７ＩＩＩサイトを含む。増幅断片はｐＬＤ６（配列表の配列番号１７）のＮｏｔＩ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩサイトに制限酵素ＮｏｔＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを用いて導入した。本操作により、ｐＬＤ６の配列番号１７に記載された配列のヌクレオチド２２２０〜２３４５の領域がレタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ（配列表の配列番号３；１１３ｂｐ）に置き換えられた。
レタス葉緑体ゲノムのｐｓｂＡのターミネーターＴｐｓｂＡはｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＡＴＴＧＴＡＡＴ−３’（配列表の配列番号７）
とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＡＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴ−３’（配列表の配列番号８）
を用いて増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは５’端にＰｓｔＩサイトを含み、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは５’端にＳａｌＩサイトを含む。増幅断片はｐＬＤ６のＰｓｔＩ、ＳａｌＩサイトに制限酵素ＰｓｔＩおよびＳａｌＩを用いて導入した。本操作により、ｐＬＤ６の配列番号１７に記載された配列のヌクレオチド３１７４〜３９１３の領域がレタス葉緑体ゲノム由来のＴｐｓｂＡ（配列表の配列番号４；３３９ｂｐ）に置き換えられた。
このようにしてｐＬＤ６のタバコ由来のプロモーター、ターミネーター配列を除去し、レタス葉緑体ゲノム由来の塩基配列に置き換えたプラスミドｐＲＬ６を作成した。
発現タンパク質としては、当初ｐＬＤ６に導入されていたスペクチノマイシン耐性遺伝子（以下、ａａｄＡと略記する：配列表の配列番号１９）をそのまま残すことにより、本発明における発現タンパク質とした。
【００２８】
（２）ｒｂｃＬ遺伝子、ａｃｃＤ遺伝子の単離
レタス葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子を含む１６４０ｂｐの領域はｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＴＧＴＡＧＧＧＡＧ−３’（配列表の配列番号９）
とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴ−３’（配列表の配列番号１０）
を用いて増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは５’端にＥｃｏＲＩサイトを含み、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは５’端にＮｏｔＩサイトを含む。増幅断片はｐＬＤ２００（配列表の配列番号１８）のＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて導入した。本操作により、ｐＬＤ２００の配列番号１８に記載された配列のヌクレオチド３９６〜２１２６の領域がレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ（配列表の配列番号１；１６４０ｂｐ）に置き換えられた。
レタス葉緑体ゲノムのａｃｃＤ遺伝子を含む１０５７ｂｐの領域はｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＴＡＴ−３’（配列表の配列番号１１）とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＡＧＡＡＣＴＴＴＣ−３’（配列表の配列番号１２）を用いて増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは５’端にＳａｌＩサイトを含み、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは５’端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む。増幅断片はｐＬＤ２００のＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて導入した。本操作により、ｐＬＤ２００の配列番号１８に記載された配列のヌクレオチド２１４１〜３３４２の領域がレタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ（配列表の配列番号２；１０５７ｂｐ）に置き換えられた。
このようにしてｐＬＤ２００のタバコ由来のｒｂｃＬ、ａｃｃＤをコードする配列を除去し、レタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ、ａｃｃＤをコードする塩基配列に置き換えたプラスミドｐＲＬ２００を作成した。
【００２９】
（３）レタス葉緑体形質転換用ベクターの作成
レタス葉緑体ゲノム由来のプロモーターとターミネーター配列を導入した上記（１）のプラスミドから制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いてａａｄＡ遺伝子発現に必要なＤＮＡ断片（配列番号１７に記載された配列のヌクレオチド２２２０〜３９１３に相当する領域）を切り出した。切り出したＤＮＡ断片は、レタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ、ａｃｃＤ遺伝子を導入した上記（２）のプラスミドのＮｏｔＩ、ＳａｌＩサイトに制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いて導入した。該ＤＮＡ断片が導入される領域は、配列番号１８に記載された配列のヌクレオチド２１２７〜２１４１に相当する領域である。
このようにしてａａｄＡ遺伝子の発現とレタス葉緑体ゲノムのｒｂｃＬとａｃｃＤ遺伝子の領域での相同組み換えを生じさせるレタス葉緑体形質転換用ベクターｐＲＬ１０００を作成した（図１）。
【実施例３】
【００３０】
レタス葉緑体の形質転換と再分化
ＭＳ培地に播種後、約３〜４週間の無菌栽培したレタスの生葉を遺伝子導入に用いる。ＭＳ培地は、ＭＳ塩、イノシトール（１００ｍｇ／Ｌ）、塩酸チアミン（０．１ｍｇ／Ｌ）、塩酸ピリドキシン（０．５ｍｇ／Ｌ）、ニコチン酸（０．５ｍｇ／Ｌ）、グリシン（２ｍｇ／Ｌ）、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）、ゲランガム（２ｇ／Ｌ）から構成され、ＫＯＨでｐＨ５．８に調整した。レタスの生葉６〜７枚をＲＭＯＰ培地に置床したプレートを５枚作成し、培地上で１日間前培養する。ＲＭＯＰ培地の組成は、ＭＳ培地にＢＡ（０．１ｍｇ／Ｌ），ＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）を添加したものである。直径０．６ミクロンの金粒子２．３ｍｇ、レタス葉緑体形質転換用ベクター２５μｇ、２．５Ｍ塩化カルシウム、０．１Ｍスペルミジンとを混ぜ、４℃で１０分間、１分毎に懸濁する。エタノールで２回洗浄後、６０μＬのエタノールに懸濁する。これは１０回分の打ち込み実験に使用できる量に相当する。前培養したレタス葉に対してパーティクルガン（型式ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてレタスの葉細胞に金粒子を打ち込む。１回の実験当たり５回の打ち込みを行う。打ち込み圧力は９００ｐｓｉで行う。打ち込みをして２日後、ベクターを打ち込んだ生葉を４ｍｍ四方の切片にメスで刻み、スペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）とポリビニルピロリドン（５００ｍｇ／Ｌ）を含むＲＭＯＰ培地に置床する。約３〜４週間で白色化した葉切片から緑色のカルスが生じ、その後再分化して植物個体を再生した。
【実施例４】
【００３１】
ＰＣＲによるレタス葉緑体形質転換体の解析
実施例３で再生したレタス植物体の葉組織を約５０ｍｇ採取し、液体窒素下で破砕する。破砕したサンプルにＤＮＡ抽出バッファー（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、５Ｍ尿素、５％フェノール）を加えて混合した。フェノール／クロロホルム〔１／１（Ｖ／Ｖ）〕で抽出し、エタノールで沈澱させた後、風乾した。１００μＬのＴＥ溶液〔１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕に抽出ＤＮＡを溶かした。
ａａｄＡ配列の有無を確認するＰＣＲではレタス植物体から抽出したＤＮＡ溶液を鋳型にｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧＴＴＡＴ−３’（配列表の配列番号１３）
とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＴＴＡＴＴＴＧＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＡＧ−３’（配列表の配列番号１４）
を用いてＰＣＲ反応を行い、アガロースゲル電気泳動により確認した。対照として、実施例２で作成したｐＲＬ１０００ベクターおよび野生株のレタスの葉組織を同様に処理した。その結果を図２に示した。ｐＲＬ１０００ベクターおよび形質転換されたレタスにおいてａａｄＡ遺伝子の存在を示す０．８ｋｂのバンドが認められた。
また、形質転換レタスの組織中における遺伝子導入された葉緑体ゲノムと遺伝子導入されずに野生型のままで残っている葉緑体ゲノムのの存在比率の検討には各サンプルからの抽出ＤＮＡ溶液を鋳型にｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＡＧＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＡＴＣＣＡＡＣ−３’（配列表の配列番号１５）
とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＡＧＧＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＡＣＧ−３’（配列表の配列番号１６）
を使用してＰＣＲを行った。対照として、実施例２で作成したｐＲＬ２００ベクターおよび野生株のレタスの葉組織から抽出したゲノムＤＮＡを同様に処理した。その結果を図３に示した。ｐＲＬ１０００ベクター（レーンＡ）および形質転換レタスより抽出したゲノムＤＮＡ（レーンＣ）を鋳型にＰＣＲした産物を電気泳動したレーンにおいて、１．６ｋｂの葉緑体ゲノムへの遺伝子の導入を示すバンドが確認できた。また僅かではあるが、野生型葉緑体ゲノムの存在を示す０．３ｋｂのバンドがレーンＣにおてい認めらたことから、形質転換レタスにおいてＰＣＲで検出できる程度の微量の野生型葉緑体ゲノムＤＮＡも含まれていることが認められた（図３）。
【実施例５】
【００３２】
形質転換されたレタスのスペクチノマイシン耐性の評価
実施例４によりａａｄＡ遺伝子の導入が確認されたレタス植物体においてａａｄＡ遺伝子が発現して機能しているかどうかを調べるために形質転換されたレタス（図４）より４ｍｍ四方の葉切片を切り出し、スペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むＲＭＯＰ培地に置床した。同様に野生株レタスの葉切片も置床し２５℃、長日条件下（１６時間明期、８時間暗期）において再分化の様子を４週間観察した（図５）。Ａ，Ｂ，Ｃは野生株レタスの葉切片を、スペクチノマイシンを含むＲＭＯＰ培地上で培養したものである。Ａは置床直後、Ｂは置床して２週間後、Ｃは置床して４週間後の葉切片の様子を示すが、いずれも葉および根の分化は観察されなかった。同様に形質転換されたレタスの葉切片の培養を示したのがＤ，Ｅ，Ｆである。ＥおよびＦでは、葉切片からの葉および根の分化が確認された。これは、ａａｄＡ遺伝子がレタスの葉緑体ゲノムに導入され、葉で発現したａａｄＡ産物が、スペクチノマイシンに対する耐性を示したものである。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
医療用などの高付加価値タンパク質を、キク科植物、特にレタスの葉緑体で安全かつ安価に生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１はベクターの模式図を示す図である。
【図２】図２は実施例４におけるａａｄＡ遺伝子が導入されたことを確認するＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。図中ＡはｐＲＬ１０００ベクターから抽出したＤＮＡを、Ｂは野生株レタスの葉から抽出したＤＮＡを、Ｃは形質転換されたレタスの葉から抽出したＤＮＡをそれぞれ鋳型に用いてＰＣＲしたものを電気泳動した結果を示す。
【図３】図３は実施例４におけるレタス葉緑体ゲノムへの導入遺伝子の組み換え率の検討を行ったＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。図中ＡはｐＲＬ１０００ベクターから抽出したＤＮＡを、Ｂは野生株レタスの葉から抽出したＤＮＡを、Ｃは形質転換されたレタスの葉から抽出したＤＮＡををそれぞれ鋳型に用いてＰＣＲしたものを電気泳動した結果を示す。
【図４】図４は形質転換されたレタスの葉である。
【図５】図５は、実施例５の結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キク科植物の葉緑体の形質転換方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在、タンパク質の工業的な生産方法については、既に、医薬として有用なタンパク質などを発現する遺伝子を大腸菌や植物の核染色体へ導入し、該遺伝子を発現させることによって医療用タンパク質などを製造する研究が各国で進んでいる。しかし、大腸菌など細菌を使った場合、最終製品への毒素の混入を防ぎきれない。また、植物の核ゲノムに遺伝子導入した形質転換植物によるタンパク質の生産方法が開発されてきたが、タンパク質の生産量が低いなど課題点が残されていた。また、植物の核への遺伝子導入の場合、花粉の飛散による自然界への遺伝子の伝播が問題視されている。そのような中、植物葉緑体ゲノムへの形質転換法がＭａｌｉｇａらによってタバコで実用化された。葉緑体形質転換はこれまで行われてきた植物の核ゲノムへの形質転換と比較して葉緑体が大量のタンパク質を生産、蓄積する能力を有することが大きな特徴となっている。葉緑体形質転換のその他の特徴として葉緑体の遺伝情報が一般に母性遺伝で、花粉を介した導入遺伝子の水平伝播の可能性が低いことや、葉緑体のポリシストロニックな制御を活かした多重遺伝子発現などの利点が挙げられる。このような利点から、形質転換した葉緑体はタンパク質などの物質生産を行うのに有用な系として注目され始めている。例えば、目的タンパク質をタバコ葉緑体において高度に発現させることができるベクターが知られている。このベクターは、ｐｓｂＡプロモーターと、タンパク質をコードする遺伝子の翻訳開始点の上流にリボゾーム結合部位を有することを特徴としている（特許文献１参照。）。本方法は、薬理活性を有するタンパク質、医薬品工業用材料などとして有用なタンパク質を、微生物による製造にかえて、タバコを使用して製造することを目的としたものである。しかし、この方法は、形質転換される植物がタバコであるため、タバコの二次代謝産物として体に有害な物質も生産することから医療用などの高度な精製が要求されるタンパク質生産には不向きであると言える。
【０００３】
キク科植物の形質転換としては、例えば、レタスビッグベインウイルスタンパク質の産生や機能を抑制するＤＮＡをレタス細胞に導入することによって得られるレタスビッグベインウイルス抵抗性レタス（特許文献１参照。）や、レタス感染性黄化ウイルス蛋白質の遺伝子または遺伝子の一部分を含む植物形質転換ベクターを用いて形質転換したレタス（特許文献２）などが知られている。しかし、これらいずれの形質転換レタスの場合も、遺伝子を用いて構築されたプラスミドをアグロバクテリウムに導入し、葉ディスクに感染させることによって、各遺伝子を葉の核ゲノムに導入されるものであり、葉緑体に直接遺伝子が導入されるものではなかった。
【特許文献１】特開２００２−２７２４７６号公報
【特許文献２】国際公開第０１／０９０３６２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第９５／０２０５６号パンフレット
【非特許文献１】ゾラ・スバブ（Ｚｏｒａ Ｓｖａｂ）他２名、プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステート・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、１９９０年、第８７巻、ｐ．８５２６−８５３０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、有害な二次代謝物を生産することなく、キク科植物葉緑体に医療用タンパク質などの有用タンパク質を効率よく発現させることができる形質転換方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、生育が早く、有害な二次代謝物を生産する可能性の低い植物としてキク科植物のレタスに注目した。またレタスは水耕栽培を利用した植物工場での栽培も可能であることから、レタスを用いて天候や病虫害に左右されない安定したタンパク質の生産システムを構築することを試みた。このようなことから、本発明者らは、レタス葉緑体でのタンパク質の生産方法につき鋭意研究をおこなった。まずレタス葉緑体由来の塩基配列の取得および外来遺伝子を導入する位置の検討を行うためにレタス葉緑体の全塩基配列を決定した。決定したレタス葉緑体の塩基配列からレタス葉緑体ゲノムと効率的な相同組み換えを可能にする相同配列（リブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子）と、レタス葉緑体において確実に導入遺伝子を発現させるためのレタス葉緑体ゲノム由来発現調節配列（ｒＲＮＡオペロンのプロモーターとｐｓｂＡ遺伝子のターミネーター）を有するベクターを構築した。本発明者らは、さらに構築したベクターを使用して、レタス葉緑体ゲノムへの遺伝子導入法についても検討を重ねた。また、本発明者らは、レタス葉緑体ゲノムへ遺伝子が導入されたレタスの葉細胞が植物個体へと再生するステップの重要性にも注目し、レタス葉緑体ゲノムへ遺伝子を導入したレタスの葉切片の再分化条件についても研究を進め、さらにこのようにして得られた植物固体の栽培方法についても検討し、本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は、
（１） キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡを含有することを特徴とするキク科植物の葉緑体形質転換用ベクター、
（２） キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡが、レタス葉緑体由来のＤＮＡであることを特徴とする前記（１）に記載のベクター、
（３） キク科植物が、レタスであることを特徴とする前記（１）または（２）に記載のベクター、
（４） キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡを複数含有する前記（１）〜（３）のいずれかに記載のベクター、
（５） レタス葉緑体ゲノム由来のＤＮＡが、リブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子であることを特徴とする前記（４）に記載のベクター、
（６） キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡの間に少なくとも１種の制限酵素切断部位を有することを特徴とする前記（１）〜（５）のいずれかに記載のベクター、
（７） キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡ配列の間に葉緑体で機能するプロモーター、ターミネーターを有し、さらに前記プロモーターとターミネーターとの間に発現タンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とする前記（１）〜（６）のいずれかに記載のベクター、
（８） プロモーターが、レタス葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターであることを特徴とする前記（７）に記載のベクター、
（９） レタス葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子の間に、レタス葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターおよびｐｓｂＡ遺伝子のターミネーターを有し、さらに前記プロモーターおよびターミネーターとの間に発現タンパク質をコードする塩基配列を有するベクター、
（１０） 前記（１）〜（９）のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されたキク科植物、
（１１） 前記（１）〜（９）のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されたレタス、
（１２） 前記（１）〜（９）のいずれかに記載のベクターを、キク科植物の葉細胞に導入することを特徴とするキク科植物葉緑体の形質転換方法、
（１３） ベクターの導入が、パーティクルガンを用いることを特徴とする前記（１２）に記載の形質転換方法、
（１４） 前記（１）〜（９）のいずれかに記載のベクターを、キク科植物の葉細胞に導入し、前記キク科植物の葉細胞を植物培養用培地で培養することを特徴とする形質転換植物体の製造方法、
（１５） 植物培養用培地が、ナフタレン酢酸、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸から選択されるオーキシン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ０．０１〜１ｍｇ／Ｌ並びにカイネチン、ゼアチンまたはベンジルアデニンおよびイソペンテニルアデニンから選択されるサイトカイニン０．０１〜１ｍｇ／Ｌを含有することを特徴とする前記（１４）に記載の形質転換植物体の製造方法、
（１６） オーキシンに対するサイトカイニンの重量比が１：０．８〜１．２であることを特徴とする前記（１５）に記載の形質転換植物体の製造方法、
（１７） 植物培養用培地が、さらにポリビニルピロリドンを１００〜１０００ｐｐｍ含有することを特徴とする前記（１５）または（１６）に記載の形質転換植物体の製造方法、
（１８） ナフタレン酢酸、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸から選択されるオーキシン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ、カイネチン、ゼアチンまたはベンジルアデニンおよびイソペンテニルアデニンから選択されるサイトカイニン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ、およびポリビニルピロリドン１００〜１０００ｐｐｍを含有することを特徴とする形質転換キク科植物の葉培養用培地、
（１９） オーキシンに対するサイトカイニンの重量比が１：０．８〜１．２であることを特徴とする前記（１８）に記載の培地、および
（２０） キク科植物がレタスであることを特徴とする前記（１８）または（１９）に記載の培地、
に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のベクターは、確実にキク科植物の葉緑体へ、発現タンパク質をコードする遺伝子を導入できる。
キク科植物の葉緑体のうち特にレタス葉緑体の形質転換技術は、有害な二次代謝産物の含有量が少ないことなどからこれまでに作出されてきたタバコなどの葉緑体形質転換植物と比較して、これまでよりも安全に有用なタンパク質を生産できるシステムの構築が可能となる。また、レタスは水耕栽培法が確立されていることから、本発明により形質転換されるレタスは、植物工場を利用して工業的に大量生産ができるので、安全かつ安価にタンパク質を生産でき、かつ天候や病虫害に左右されないので、安定したタンパク質の生産システムを構築できる。
また、本発明の形質転換技術により、葉緑体にメタロチオネイン遺伝子（例．ｍｅｒＡ遺伝子など）を導入し形質転換されたキク科植物は、土壌などの環境中の有害重金属や水銀などを無害化または無毒化し得るので、ファイトレメディエーション（Ｐｈｙｔｏ Ｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ；植物を利用した環境浄化技術）に利用できる。また、本発明の形質転換技術により、葉緑体に病中害耐性遺伝子や除草剤耐性遺伝子などを導入することにより、害虫抵抗性や除草剤耐性のキク科植物を製造することができる。さらに、本発明の形質転換技術により、葉緑体に抗酸化作用を有するカロテノイドやビタミンＥなどの生合成に関る遺伝子を導入することにより、キク科植物の例えばヒマワリや紅花などにおいて、該ヒマワリや紅花などが生成する油脂類中のカロテノイドやビタミンＥなどの有用成分の含有量を上げることが可能となる。また、本発明のベクターを用いて光合成に関与する例えばフルクトース１，６−ビスホスファターゼ遺伝子やセドヘプツロース１，７−ビスホスファターゼ遺伝子を導入することにより、該遺伝子が導入されたキク科植物は、野生株に比べて、背丈が大きく、また葉の面積も大きく、早く生育し、かつ糖やデンプンの合成能力が増大し得る。
本発明によって形質転換されるキク科植物は、発現タンパク質をコードする遺伝子が核ゲノムではなく、葉緑体ゲノムに直接導入されるため、導入された遺伝子の花粉による拡散の予防が可能である。すなわち、例えば核に遺伝子が導入された植物のように、花粉が風や昆虫により広範囲に撒き散らされ、動植物界への悪影響を与えるなどの環境汚染を防止できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明に用いられるキク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡとしては、例えばリブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子（以下、ｒｂｃＬ遺伝子と略記する。）またはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子（以下、ａｃｃＤ遺伝子と略記する。）などが挙げられる。
ｒｂｃＬ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているＲｕｂｉｓｃｏの遺伝子である。Ｒｕｂｉｓｃｏは、光合成ＣＯ２固定反応回路（カルビンサイクル）において，初発段階であるＣＯ２固定反応（カルボキシラーゼ反応）を触媒し、前記回路における代謝回転の律速となる鍵酵素である。また、該酵素は酸素（Ｏ２）を固定する反応（オキシゲナーゼ反応）も触媒する。ｒｂｃＬ遺伝子は、とりわけレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子が好ましい。
レタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子は、例えばレタス葉緑体全ゲノム塩基配列から、既に明らかになっているタバコ葉緑体ゲノムのｒｂｃＬの塩基配列との相同性から決定される。このようにして決定されたレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子とその近傍の塩基配列は、配列表の配列番号１（１６４０ｂｐ）で示される。前記配列番号１の塩基配列中の１個または複数個の塩基、例えば、１〜１５０個の塩基が欠失されるか、または別の塩基に置換されるか、または１〜１５０個の別の塩基を付加されるかして改変されたＤＮＡがｒｂｃＬ遺伝子と相同的組換えし得る配列であれば好ましく用いることができる。
【０００９】
ａｃｃＤ遺伝子は、葉緑体ゲノムにコードされているアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの遺伝子である。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、植物において脂肪酸合成に関与している酵素である。ａｃｃＤ遺伝子としては、レタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ遺伝子が好ましい。
レタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ遺伝子は、例えばレタス葉緑体全ゲノム塩基配列から、すでに明らかになっているタバコ葉緑体ゲノムのａｃｃＤの塩基配列との相同性から決定される。このようにして決定されたレタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ遺伝子とその近傍の塩基配列は、配列表の配列番号２（１０５７ｂｐ）で示される。前記配列番号２の塩基配列中の１個または複数個の塩基、例えば、１〜１００個の塩基が欠失されるか、または別の塩基に置換されるか、または１〜１００個の別の塩基を付加されるかして改変されたＤＮＡがａｃｃＤ遺伝子と相同的組換えし得る配列であれば好ましく用いることができる。
【００１０】
本発明において、例えばレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子とを用いることにより、ベクターに導入される発現タンパク質をコードする遺伝子が、相同組換えによりレタス葉緑体ゲノムに組み込まれやすくなり、さらにレタス葉緑体での発現タンパク質の発現量が多くなるという利点がある。
また、本発明において、葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子はそれらの全長を使う必要はない。例えばｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子との間の非コード領域の、被導入遺伝子の導入位置からｒｂｃＬ遺伝子側またはａｃｃＤ遺伝子側にそれぞれ約１０００〜１５００程度の塩基対の長さを有し、ｒｂｃＬ遺伝子またはａｃｃＤ遺伝子とそれぞれ相同的組換えし得る配列であればよい。
【００１１】
上記ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子の間には、少なくとも１種、好ましくは２種以上の制限酵素切断部位（以下、制限酵素サイトとも言う。）を有することが好ましい。制限酵素サイトは、制限酵素で認識され切断される部位を含む配列であればいずれの配列も好ましく用いることができる。制限酵素サイトとしては、例えばＰｓｔＩサイト、ＮｏｔＩサイト、ＳａｌＩサイト、またはＥｃｏ４７ＩＩＩサイトなどが好ましく挙げられる。これら制限酵素サイトは、各々制限酵素ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＳａｌＩ、またはＥｃｏ４７ＩＩＩで切断され得る。
【００１２】
また、上記ｒｂｃＬ遺伝子とａｃｃＤ遺伝子の間には、キク科植物（好ましくはレタス）葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーター（以下、Ｐｒｒｎと略記する。）およびｐｓｂＡ遺伝子のターミネーター（以下、ＴｐｓｂＡと略記する。）を有する。
上記したキク科植物（好ましくはレタス）のＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡは、例えばレタス葉緑体全ゲノム塩基配列から、すでに明らかになっているタバコ葉緑体ゲノムのＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡの塩基配列との相同性から決定される。このようにして決定された例えばレタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎは配列表の配列番号３（１１３ｂｐ）で示され、レタス葉緑体ゲノム由来のＴｐｓｂＡは、配列表の配列番号４（３３９ｂｐ）で示される。前記配列番号３または４の塩基配列のうち、１個または複数個の塩基、例えば、１〜１０個の塩基が欠失されるか、または別の塩基に置換されるか、または１〜１０個の別の塩基を付加されるかして改変されたＤＮＡであって、それぞれ発現タンパク質をコードする遺伝子の転写開始および転写終結を認識できる配列であればいずれも好ましく用いることができる。
【００１３】
また、上記プロモーターおよびターミネーターは、発現タンパク質をコードする遺伝子の転写開始および転写終結を認識できるものであれば、上記プロモーターおよびターミネーターに限定されず、他のプロモーターおよびターミネーターであってもよい。このようなプロモーターとしては、例えばｐｓｂＡプロモーター、ｒｂｃＬプロモーター、ｐｓｂＤプロモーターまたはａｔｐＢプロモーター等が挙げられる。これらプロモーターも、葉緑体ゲノム由来のプロモーターが好ましく、レタス葉緑体ゲノム由来のプロモーターがより好ましい。また該ターミネーターとしては、例えばｒｐｓ１６ターミネーターが挙げられる。
【００１４】
本発明において発現タンパク質とは、本発明に係る発現系を用いて発現させたいタンパク質であり、本発現系を用いて発現できるタンパク質であればその種類は特に限定されず、キク科植物固有のタンパク質でも、また外来遺伝子由来のタンパク質でもよい。このような発現タンパク質としては、例えば薬理活性を有する医療用タンパク質（例．インスリン、インターフェロン、エリスロポエチン、インターロイキン、ヒトソマトスタチン、ティッシュプラスミノーゲンアクチベーターなど）または工業用材料などとして有用なタンパク質を製造するのに必要な酵素（例．セルラーゼ、ニトリルヒドラターゼなど）等が挙げられる。
また上記発現タンパク質としては、植物自体が有する酵素、例えば光合成に関与する酵素（例．フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ、トランスケトラーゼなど）や植物体で生産される有用成分の生合成に関わる酵素（例．カロテノイド生合成酵素など）、あるいは病虫害耐性タンパク質（例．バチルス・チューリンゲス毒素など）や除草剤耐性タンパク質（例．５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸合成酵素など）等も挙げられる。
また、上記発現タンパク質としては、ファイトレメディエーションのための例えば有害重金属イオンと結合するメタロチオネインなども挙げることができる。
【００１５】
本発明におけるベクターは、特開２００２−２７２４７６号公報に記載のｐＬＤ６（配列番号１７；４５９１ｂｐ）プラスミドおよびｐＬＤ２００（配列番号１８；５５８１ｂｐ）プラスミドを利用することにより構築できる。すなわち、ｐＬＤ６プラスミドおよびｐＬＤ２００プラスミドに導入されているタバコ葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ、ＴｐｓｂＡ、ｒｂｃＬ遺伝子およびａｃｃＤ遺伝子をキク科植物（好ましくはレタス）葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ、ＴｐｓｂＡ、ｒｂｃＬ遺伝子およびａｃｃＤ遺伝子に置き換えることにより作成することができる。遺伝子の置き換えは制限酵素でタバコ葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ、ＴｐｓｂＡ、ｒｂｃＬ遺伝子またはａｃｃＤ遺伝子を切り出し、その代わりにキク科植物（好ましくはレタス）葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ、ＴｐｓｂＡ、ｒｂｃＬ遺伝子またはａｃｃＤ遺伝子を導入することにより行われる。
【００１６】
まず、ｐＬＤ６のＮｏｔＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩサイトが制限酵素ＮｏｔＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを用いて切断される。次いで前記制限酵素切断部位で挟まれている領域（配列番号１７に記載された配列のヌクレオチド２２２０〜２３４５の領域；タバコ葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎを含む領域）が例えばレタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ（配列番号３；１１３ｂｐ）に置き換えられる。
また、ｐＬＤ６のＰｓｔＩおよびＳａｌＩサイトは制限酵素ＰｓｔＩおよびＳａｌＩを用いて切断され、該制限酵素切断部位で挟まれている領域（配列番号１７に記載された配列のヌクレオチド３１７４〜３９１３の領域；タバコ葉緑体ゲノム由来のＴｐｓｂＡを含む領域）が、例えばレタス葉緑体ゲノム由来のＴｐｓｂＡ（配列番号４；３３９ｂｐ）に置き換えられる。このようにしてｐＬＤ６のタバコ葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡ配列を除去し、レタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡの塩基配列に置き換えられたプラスミドを作成することができる。発現タンパク質をコードする塩基配列は上記レタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡの間に配される。
【００１７】
一方、ｐＬＤ２００のＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩサイトは制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで切断され、該制限酵素切断部位で挟まれている領域（配列番号１８に記載された配列のヌクレオチド３９６〜２１２６の領域；タバコ葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬを含む領域）が、例えばレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ（配列番号１；１６４０ｂｐ）に置き換えられる。また、ｐＬＤ２００のＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩサイトは制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断され、該制限酵素切断部位で挟まれている領域（配列番号１８に記載された配列のヌクレオチド２１４１〜３３４２の領域；タバコ葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤを含む領域）が、例えばレタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ（配列番号２；１０５７ｂｐ）に置き換えられる。このようにしてｐＬＤ２００のタバコ葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬおよびａｃｃＤ配列を除去し、レタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎおよびＴｐｓｂＡの塩基配列に置き換えたプラスミドを作成することができる。
【００１８】
次いで、レタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎとＴｐｓｂＡ配列に置き換えられたｐＬＤ６から制限酵素ＮｏｔＩ、ＳａｌＩを用いて発現タンパク質の発現に必要な塩基配列（配列番号１７に記載された配列ではヌクレオチド２２２０〜３９１３に相当する領域）を切り出し、レタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬおよびａｃｃＤ遺伝子に置き換えられたｐＬＤ２００のＮｏｔＩ、ＳａｌＩサイトに制限酵素ＮｏｔＩ、ＳａｌＩを用いて導入される。該導入される領域は、配列番号１８に記載された配列ではヌクレオチド２１２７〜２１４１に相当する領域である。このようにして発現タンパク質の発現とレタス葉緑体ゲノムのｒｂｃＬとａｃｃＤ遺伝子の領域での相同組み換えを生じさせるベクターを作成できる。
【００１９】
また、上記ベクターには、遺伝子組換え体を識別するための遺伝子を有することが好ましい。遺伝子組換え体を識別するための遺伝子としては、特に限定されず、自体公知のものを用いてよい。例えば、各種薬剤耐性遺伝子があげられる。より具体的には、カナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴ）、スペクチノマイシン耐性遺伝子（ａａｄＡ）、ベタインアルデヒド脱水素酵素遺伝子（ＢＡＤＨ）等が挙げられる。また、該遺伝子の上流、下流には、それぞれ該遺伝子を発現制御するためのプロモーターおよびターミネーター配列を配することが好ましい。例えば、ａａｄＡ遺伝子を葉緑体で発現させるためには、上記した植物由来のプロモーター及びターミネーターを好ましく使用できるが、ｒｒｎプロモーターおよびｐｓｂＡターミネーターが特に好適である。
【００２０】
このようにして作製されたベクターを宿主細胞に導入し、形質転換体を作製する。このとき、宿主細胞としては、キク科植物細胞が好ましく、キク科植物葉細胞がより好ましく、キク科植物の葉緑体がさらに好ましく、レタス葉緑体が特に好ましい。本発明のベクターを宿主細胞、特に葉緑体へ導入して形質転換する方法としては、公知の方法、例えばパーティクルガン法（Ｓｖａｂ，Ｚ．，Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．，ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０年，第８７巻，ｐ．８５２６−８５３０）やＰＥＧ法（Ｇｏｌｄｓ，Ｔ．，Ｍａｌｉｇａ，Ｐ．，ａｎｄ Ｋｏｏｐ，Ｈ．−Ｕ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９３年，第１１巻，ｐ．９５−９７）等を好ましく用いることができる。例えば、パーティクルガン法は、ベクターを金またはタングステンの極めて細かい粒子にまぶし、この該ベクターの付着した粒子を火薬または高圧ガスで宿主細胞に打ち込むことにより、ベクターを宿主細胞に導入することができる。
【００２１】
ベクターが導入されたキク科植物の葉細胞、例えばレタス葉細胞は、植物培養用培地で培養し植物体とすることができる。植物培養用培地は、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５、ムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ；ＭＳ）、ニッチ・ニッチ（Ｎｉｔｃｈ＆Ｎｉｔｃｈ）などのような無機塩、ビタミン類を含有する基礎培地に、植物ホルモンを加えたものが好ましい。基礎培地としては特にＭＳ培地が好ましい。植物ホルモンとしては、オーキシンおよびサイトカイニンを組み合わせるのがよい。オーキシンとしては、ナフタレン酢酸（以下、ＮＡＡと略記する。）、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸または２，４−ジクロロフェノキシ酢酸などが挙げられ、ＮＡＡが特に好ましい。サイトカイニンとしては、カイネチン，ゼアチンまたはベンジルアデニン（以下、ＢＡと略記する。）、イソペンテニルアデニンなどが挙げられ、ＢＡが特に好ましい。基礎培地に添加するオーキシンおよびサイトカイニンの濃度は、使用するオーキシンおよびサイトカイニンにより異なるが、オーキシンは約０．０１〜１．０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０５〜０．２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約０．１ｍｇ／Ｌ、サイトカイニンは約０．０１〜１．０ｍｇ／Ｌ、好ましくは約０．０５〜０．２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約０．１ｍｇ／Ｌとなるよう添加される。オーキシンに対するサイトカイニンの割合（重量比）は、約１：０．８〜１．２が好ましい。培地にはさらに、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を約１００〜１０００ｐｐｍ、好ましくは約３００〜７００ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは約４００〜６００ｐｐｍを添加するのがよい。培地にオーキシンやサイトカイニンを加えることにより、形質転換されたキク科植物、とりわけレタスの再分化を促進するようになり、またＰＶＰの添加によって培養時の褐変による枯死が防止できる。
【００２２】
また、上記培地には、炭素源としての糖類や、ビタミン類、培地を固めるための支持体などを添加するのがよい。糖類としては、例えばショ糖などが挙げられる。糖類の添加量は、約１〜１０重量％、好ましくは約２〜５重量％程度である。ビタミン類としては、例えば塩酸チアミン、塩酸ピリドキシン、ニコチン酸またはイノシトールなどが挙げられる。支持体としては、例えば寒天、ゲランガムまたはペーパーブリッジなどが挙げられる。支持体の濃度は、培地のｐＨなどにより異なるが、例えばゲランガムの場合、約０．２〜０．３重量％程度が好ましい。
また、上記培地には、アミノ酸（例．グリシンなど）、アデニンおよび／またはココナツウォーターなどを添加してもよい。
培地は、通常水酸化カリウムなどでｐＨ約４〜８、好ましくはｐＨ約５〜７に調整される。
【００２３】
本発明により形質転換されるキク科植物はいずれの種類であってもよく、例えばレタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｓ）、アーティチョーク（Ｃｙｎａｒａ ｓｃｏｌｙｍｕｓ）、ゴボウ（Ａｒｃｔｉｕｍ ｌａｐｐａ）、キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）、コスモス（Ｃｏｓｍｏｓ ｂｉｐｉｎｎａｔｕｓ）、キバナノコギリソウ（Ａｃｈｉｌｌａ ｆｉｌｐｅｎｄｕｌｉｎａ）、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ａｒｖｅｎｓｉｓ）、デージー（Ｒｕｄｂｅｃｋｉａ ｈｉｒｔａ）、ヒャクニチソウ（Ｚｉｎｎｉａ ｅｌｅｇａｎｓ Ｊａｃｑ．）などが挙げられる。
形質転換されたキク科植物、中でもレタスは自体公知の条件の下、路地または水耕栽培で生育させることができる。このようにして作製された形質転換されたキク科植物、特にレタスは、ベクターに導入された遺伝子がコードするタンパク質を高度に発現させることができる。また、本発明の形質転換体は導入した遺伝子の花粉を介した環境への飛散を防ぐことができるなどの利点がある。
【００２４】
なお、上記の遺伝子工学または生物工学の操作については、市販の実験書、例えば、１９８２年発行のモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年発行のモレキュラー・クローニング第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ ｅｄ．）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）などに記載された方法に従って容易に行うことができる。
【００２５】
以下に具体的実施例を挙げ、さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに特に限定されることはない。
【実施例１】
【００２６】
レタス葉緑体ゲノム塩基配列の決定と解析
レタス生葉から常法に従いｐｅｒｃｏｌ密度勾配遠心によりレタス葉緑体を単離する。単離した葉緑体からＣＴＡＢを用いたＤＮＡ精製法によりレタス葉緑体のゲノムＤＮＡを精製する。精製ＤＮＡから約２ｋｂの葉緑体ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を持つレタス葉緑体ゲノムライブラリーを作成する。ゲノムライブラリーのクローン５，４２８個の塩基配列を解読してレタス葉緑体全ゲノム塩基配列（１５２，７６５ｂｐ）を決定した。すでに明らかになっているタバコ葉緑体ゲノム塩基配列との相同性からレタス葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ（配列表の配列番号１）とａｃｃＤ（配列表の配列番号２）の塩基配列およびＰｒｒｎ（配列表の配列番号３）、ＴｐｓｂＡ（配列表の配列番号４）の塩基配列情報を取得した。
【実施例２】
【００２７】
レタス葉緑体形質転換用プラスミドベクターの構築
（１）レタス葉緑体ゲノムＰｒｒｎ、ＴｐｓｂＡの単離
レタス葉緑体ゲノムのＰｒｒｎはｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＡＴＴＴＴＧＡＴＴＴＧＣＴＡＣＣＣ−３’ （配列表の配列番号５）、
とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＣＣＡＧＣＧＣＴＡＴＴＣＧＣＣＣＧＧＡＧＴＴＣＧＣＴＣＣ−３’（配列表の配列番号６）
を用いて増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは５’端にＮｏｔＩサイトを含み、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは５’端にＥｃｏ４７ＩＩＩサイトを含む。増幅断片はｐＬＤ６（配列表の配列番号１７）のＮｏｔＩ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩサイトに制限酵素ＮｏｔＩおよびＥｃｏ４７ＩＩＩを用いて導入した。本操作により、ｐＬＤ６の配列番号１７に記載された配列のヌクレオチド２２２０〜２３４５の領域がレタス葉緑体ゲノム由来のＰｒｒｎ（配列表の配列番号３；１１３ｂｐ）に置き換えられた。
レタス葉緑体ゲノムのｐｓｂＡのターミネーターＴｐｓｂＡはｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＴＴＧＧＴＣＴＴＡＴＴＧＴＡＡＴ−３’（配列表の配列番号７）
とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＡＴＡＴＴＡＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴ−３’（配列表の配列番号８）
を用いて増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは５’端にＰｓｔＩサイトを含み、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは５’端にＳａｌＩサイトを含む。増幅断片はｐＬＤ６のＰｓｔＩ、ＳａｌＩサイトに制限酵素ＰｓｔＩおよびＳａｌＩを用いて導入した。本操作により、ｐＬＤ６の配列番号１７に記載された配列のヌクレオチド３１７４〜３９１３の領域がレタス葉緑体ゲノム由来のＴｐｓｂＡ（配列表の配列番号４；３３９ｂｐ）に置き換えられた。
このようにしてｐＬＤ６のタバコ由来のプロモーター、ターミネーター配列を除去し、レタス葉緑体ゲノム由来の塩基配列に置き換えたプラスミドｐＲＬ６を作成した。
発現タンパク質としては、当初ｐＬＤ６に導入されていたスペクチノマイシン耐性遺伝子（以下、ａａｄＡと略記する：配列表の配列番号１９）をそのまま残すことにより、本発明における発現タンパク質とした。
【００２８】
（２）ｒｂｃＬ遺伝子、ａｃｃＤ遺伝子の単離
レタス葉緑体ゲノムのｒｂｃＬ遺伝子を含む１６４０ｂｐの領域はｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＴＧＴＡＧＧＧＡＧ−３’（配列表の配列番号９）
とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＣＣＡＡＣＣＡＡＣＡＣＡＡＡＡＡＴ−３’（配列表の配列番号１０）
を用いて増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは５’端にＥｃｏＲＩサイトを含み、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは５’端にＮｏｔＩサイトを含む。増幅断片はｐＬＤ２００（配列表の配列番号１８）のＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩサイトに制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを用いて導入した。本操作により、ｐＬＤ２００の配列番号１８に記載された配列のヌクレオチド３９６〜２１２６の領域がレタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ（配列表の配列番号１；１６４０ｂｐ）に置き換えられた。
レタス葉緑体ゲノムのａｃｃＤ遺伝子を含む１０５７ｂｐの領域はｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＣＣＴＴＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＴＡＴ−３’（配列表の配列番号１１）とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣＡＴＡＴＧＡＧＴＡＧＡＡＣＴＴＴＣ−３’（配列表の配列番号１２）を用いて増幅した。
Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは５’端にＳａｌＩサイトを含み、ｒｅｖｅｒｓｅプライマーは５’端にＨｉｎｄＩＩＩサイトを含む。増幅断片はｐＬＤ２００のＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトに制限酵素ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いて導入した。本操作により、ｐＬＤ２００の配列番号１８に記載された配列のヌクレオチド２１４１〜３３４２の領域がレタス葉緑体ゲノム由来のａｃｃＤ（配列表の配列番号２；１０５７ｂｐ）に置き換えられた。
このようにしてｐＬＤ２００のタバコ由来のｒｂｃＬ、ａｃｃＤをコードする配列を除去し、レタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ、ａｃｃＤをコードする塩基配列に置き換えたプラスミドｐＲＬ２００を作成した。
【００２９】
（３）レタス葉緑体形質転換用ベクターの作成
レタス葉緑体ゲノム由来のプロモーターとターミネーター配列を導入した上記（１）のプラスミドから制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いてａａｄＡ遺伝子発現に必要なＤＮＡ断片（配列番号１７に記載された配列のヌクレオチド２２２０〜３９１３に相当する領域）を切り出した。切り出したＤＮＡ断片は、レタス葉緑体ゲノム由来のｒｂｃＬ、ａｃｃＤ遺伝子を導入した上記（２）のプラスミドのＮｏｔＩ、ＳａｌＩサイトに制限酵素ＮｏｔＩおよびＳａｌＩを用いて導入した。該ＤＮＡ断片が導入される領域は、配列番号１８に記載された配列のヌクレオチド２１２７〜２１４１に相当する領域である。
このようにしてａａｄＡ遺伝子の発現とレタス葉緑体ゲノムのｒｂｃＬとａｃｃＤ遺伝子の領域での相同組み換えを生じさせるレタス葉緑体形質転換用ベクターｐＲＬ１０００を作成した（図１）。
【実施例３】
【００３０】
レタス葉緑体の形質転換と再分化
ＭＳ培地に播種後、約３〜４週間の無菌栽培したレタスの生葉を遺伝子導入に用いる。ＭＳ培地は、ＭＳ塩、イノシトール（１００ｍｇ／Ｌ）、塩酸チアミン（０．１ｍｇ／Ｌ）、塩酸ピリドキシン（０．５ｍｇ／Ｌ）、ニコチン酸（０．５ｍｇ／Ｌ）、グリシン（２ｍｇ／Ｌ）、ショ糖（３０ｇ／Ｌ）、ゲランガム（２ｇ／Ｌ）から構成され、ＫＯＨでｐＨ５．８に調整した。レタスの生葉６〜７枚をＲＭＯＰ培地に置床したプレートを５枚作成し、培地上で１日間前培養する。ＲＭＯＰ培地の組成は、ＭＳ培地にＢＡ（０．１ｍｇ／Ｌ），ＮＡＡ（０．１ｍｇ／Ｌ）を添加したものである。直径０．６ミクロンの金粒子２．３ｍｇ、レタス葉緑体形質転換用ベクター２５μｇ、２．５Ｍ塩化カルシウム、０．１Ｍスペルミジンとを混ぜ、４℃で１０分間、１分毎に懸濁する。エタノールで２回洗浄後、６０μＬのエタノールに懸濁する。これは１０回分の打ち込み実験に使用できる量に相当する。前培養したレタス葉に対してパーティクルガン（型式ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）を用いてレタスの葉細胞に金粒子を打ち込む。１回の実験当たり５回の打ち込みを行う。打ち込み圧力は９００ｐｓｉで行う。打ち込みをして２日後、ベクターを打ち込んだ生葉を４ｍｍ四方の切片にメスで刻み、スペクチノマイシン（５０ｍｇ／Ｌ）とポリビニルピロリドン（５００ｍｇ／Ｌ）を含むＲＭＯＰ培地に置床する。約３〜４週間で白色化した葉切片から緑色のカルスが生じ、その後再分化して植物個体を再生した。
【実施例４】
【００３１】
ＰＣＲによるレタス葉緑体形質転換体の解析
実施例３で再生したレタス植物体の葉組織を約５０ｍｇ採取し、液体窒素下で破砕する。破砕したサンプルにＤＮＡ抽出バッファー（０．３Ｍ塩化ナトリウム、０．０５Ｍトリス−塩酸、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、５Ｍ尿素、５％フェノール）を加えて混合した。フェノール／クロロホルム〔１／１（Ｖ／Ｖ）〕で抽出し、エタノールで沈澱させた後、風乾した。１００μＬのＴＥ溶液〔１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕に抽出ＤＮＡを溶かした。
ａａｄＡ配列の有無を確認するＰＣＲではレタス植物体から抽出したＤＮＡ溶液を鋳型にｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＡＡＧＣＧＧＴＴＡＴ−３’（配列表の配列番号１３）
とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＴＴＡＴＴＴＧＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴＴＡＧ−３’（配列表の配列番号１４）
を用いてＰＣＲ反応を行い、アガロースゲル電気泳動により確認した。対照として、実施例２で作成したｐＲＬ１０００ベクターおよび野生株のレタスの葉組織を同様に処理した。その結果を図２に示した。ｐＲＬ１０００ベクターおよび形質転換されたレタスにおいてａａｄＡ遺伝子の存在を示す０．８ｋｂのバンドが認められた。
また、形質転換レタスの組織中における遺伝子導入された葉緑体ゲノムと遺伝子導入されずに野生型のままで残っている葉緑体ゲノムのの存在比率の検討には各サンプルからの抽出ＤＮＡ溶液を鋳型にｆｏｒｗａｒｄプライマー：
５’−ＡＧＧＡＴＴＧＡＧＣＣＧＡＡＴＣＣＡＡＣ−３’（配列表の配列番号１５）
とｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
５’−ＡＧＧＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＣＴＡＣＧ−３’（配列表の配列番号１６）
を使用してＰＣＲを行った。対照として、実施例２で作成したｐＲＬ２００ベクターおよび野生株のレタスの葉組織から抽出したゲノムＤＮＡを同様に処理した。その結果を図３に示した。ｐＲＬ１０００ベクター（レーンＡ）および形質転換レタスより抽出したゲノムＤＮＡ（レーンＣ）を鋳型にＰＣＲした産物を電気泳動したレーンにおいて、１．６ｋｂの葉緑体ゲノムへの遺伝子の導入を示すバンドが確認できた。また僅かではあるが、野生型葉緑体ゲノムの存在を示す０．３ｋｂのバンドがレーンＣにおてい認めらたことから、形質転換レタスにおいてＰＣＲで検出できる程度の微量の野生型葉緑体ゲノムＤＮＡも含まれていることが認められた（図３）。
【実施例５】
【００３２】
形質転換されたレタスのスペクチノマイシン耐性の評価
実施例４によりａａｄＡ遺伝子の導入が確認されたレタス植物体においてａａｄＡ遺伝子が発現して機能しているかどうかを調べるために形質転換されたレタス（図４）より４ｍｍ四方の葉切片を切り出し、スペクチノマイシン５０ｍｇ／Ｌを含むＲＭＯＰ培地に置床した。同様に野生株レタスの葉切片も置床し２５℃、長日条件下（１６時間明期、８時間暗期）において再分化の様子を４週間観察した（図５）。Ａ，Ｂ，Ｃは野生株レタスの葉切片を、スペクチノマイシンを含むＲＭＯＰ培地上で培養したものである。Ａは置床直後、Ｂは置床して２週間後、Ｃは置床して４週間後の葉切片の様子を示すが、いずれも葉および根の分化は観察されなかった。同様に形質転換されたレタスの葉切片の培養を示したのがＤ，Ｅ，Ｆである。ＥおよびＦでは、葉切片からの葉および根の分化が確認された。これは、ａａｄＡ遺伝子がレタスの葉緑体ゲノムに導入され、葉で発現したａａｄＡ産物が、スペクチノマイシンに対する耐性を示したものである。
【産業上の利用可能性】
【００３３】
医療用などの高付加価値タンパク質を、キク科植物、特にレタスの葉緑体で安全かつ安価に生産できる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１はベクターの模式図を示す図である。
【図２】図２は実施例４におけるａａｄＡ遺伝子が導入されたことを確認するＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。図中ＡはｐＲＬ１０００ベクターから抽出したＤＮＡを、Ｂは野生株レタスの葉から抽出したＤＮＡを、Ｃは形質転換されたレタスの葉から抽出したＤＮＡをそれぞれ鋳型に用いてＰＣＲしたものを電気泳動した結果を示す。
【図３】図３は実施例４におけるレタス葉緑体ゲノムへの導入遺伝子の組み換え率の検討を行ったＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。図中ＡはｐＲＬ１０００ベクターから抽出したＤＮＡを、Ｂは野生株レタスの葉から抽出したＤＮＡを、Ｃは形質転換されたレタスの葉から抽出したＤＮＡををそれぞれ鋳型に用いてＰＣＲしたものを電気泳動した結果を示す。
【図４】図４は形質転換されたレタスの葉である。
【図５】図５は、実施例５の結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡを含有することを特徴とするキク科植物の葉緑体形質転換用ベクター。
【請求項２】
キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡが、レタス葉緑体由来のＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
キク科植物が、レタスであることを特徴とする請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡを複数含有する請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
レタス葉緑体ゲノム由来のＤＮＡが、リブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子であることを特徴とする請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡの間に少なくとも１種の制限酵素切断部位を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のベクター。
【請求項７】
キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡ配列の間に葉緑体で機能するプロモーター、ターミネーターを有し、さらに前記プロモーターとターミネーターとの間に発現タンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
プロモーターが、レタス葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターであることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
レタス葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子の間に、レタス葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターおよびｐｓｂＡ遺伝子のターミネーターを有し、さらに前記プロモーターおよびターミネーターとの間に発現タンパク質をコードする塩基配列を有するベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されたキク科植物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されたレタス。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載のベクターを、キク科植物の葉細胞に導入することを特徴とするキク科植物葉緑体の形質転換方法。
【請求項１３】
ベクターの導入が、パーティクルガンを用いることを特徴とする請求項１２に記載の形質転換方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載のベクターを、キク科植物の葉細胞に導入し、前記キク科植物の葉細胞を植物培養用培地で培養することを特徴とする形質転換植物体の製造方法。
【請求項１５】
植物培養用培地が、ナフタレン酢酸、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸から選択されるオーキシン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ０．０１〜１ｍｇ／Ｌ並びにカイネチン、ゼアチンまたはベンジルアデニンおよびイソペンテニルアデニンから選択されるサイトカイニン０．０１〜１ｍｇ／Ｌを含有することを特徴とする請求項１４に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１６】
オーキシンに対するサイトカイニンの重量比が１：０．８〜１．２であることを特徴とする請求項１５に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１７】
植物培養用培地が、さらにポリビニルピロリドンを１００〜１０００ｐｐｍ含有することを特徴とする請求項１５または１６に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１８】
ナフタレン酢酸、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸から選択されるオーキシン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ、カイネチン、ゼアチンまたはベンジルアデニンおよびイソペンテニルアデニンから選択されるサイトカイニン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ、およびポリビニルピロリドン１００〜１０００ｐｐｍを含有することを特徴とする形質転換キク科植物の葉培養用培地。
【請求項１９】
オーキシンに対するサイトカイニンの重量比が１：０．８〜１．２であることを特徴とする請求項１８に記載の培地。
【請求項２０】
キク科植物がレタスであることを特徴とする請求項１８または１９に記載の培地。
【請求項１】
キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡを含有することを特徴とするキク科植物の葉緑体形質転換用ベクター。
【請求項２】
キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡが、レタス葉緑体由来のＤＮＡであることを特徴とする請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
キク科植物が、レタスであることを特徴とする請求項１または２に記載のベクター。
【請求項４】
キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡを複数含有する請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。
【請求項５】
レタス葉緑体ゲノム由来のＤＮＡが、リブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子およびアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子であることを特徴とする請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡの間に少なくとも１種の制限酵素切断部位を有することを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載のベクター。
【請求項７】
キク科植物葉緑体ゲノム由来のＤＮＡ配列の間に葉緑体で機能するプロモーター、ターミネーターを有し、さらに前記プロモーターとターミネーターとの間に発現タンパク質をコードする塩基配列を有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のベクター。
【請求項８】
プロモーターが、レタス葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターであることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
レタス葉緑体ゲノム由来のリブロース−１，５−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ大サブユニット遺伝子とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼサブユニット遺伝子の間に、レタス葉緑体ゲノム由来のｒＲＮＡオペロンのプロモーターおよびｐｓｂＡ遺伝子のターミネーターを有し、さらに前記プロモーターおよびターミネーターとの間に発現タンパク質をコードする塩基配列を有するベクター。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されたキク科植物。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載のベクターを用いて形質転換されたレタス。
【請求項１２】
請求項１〜９のいずれかに記載のベクターを、キク科植物の葉細胞に導入することを特徴とするキク科植物葉緑体の形質転換方法。
【請求項１３】
ベクターの導入が、パーティクルガンを用いることを特徴とする請求項１２に記載の形質転換方法。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれかに記載のベクターを、キク科植物の葉細胞に導入し、前記キク科植物の葉細胞を植物培養用培地で培養することを特徴とする形質転換植物体の製造方法。
【請求項１５】
植物培養用培地が、ナフタレン酢酸、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸から選択されるオーキシン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ０．０１〜１ｍｇ／Ｌ並びにカイネチン、ゼアチンまたはベンジルアデニンおよびイソペンテニルアデニンから選択されるサイトカイニン０．０１〜１ｍｇ／Ｌを含有することを特徴とする請求項１４に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１６】
オーキシンに対するサイトカイニンの重量比が１：０．８〜１．２であることを特徴とする請求項１５に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１７】
植物培養用培地が、さらにポリビニルピロリドンを１００〜１０００ｐｐｍ含有することを特徴とする請求項１５または１６に記載の形質転換植物体の製造方法。
【請求項１８】
ナフタレン酢酸、２−ナフトキシ酢酸、インドール酢酸、４−クロロインドール酢酸、インドール酪酸および２，４−ジクロロフェノキシ酢酸から選択されるオーキシン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ、カイネチン、ゼアチンまたはベンジルアデニンおよびイソペンテニルアデニンから選択されるサイトカイニン０．０１〜１ｍｇ／Ｌ、およびポリビニルピロリドン１００〜１０００ｐｐｍを含有することを特徴とする形質転換キク科植物の葉培養用培地。
【請求項１９】
オーキシンに対するサイトカイニンの重量比が１：０．８〜１．２であることを特徴とする請求項１８に記載の培地。
【請求項２０】
キク科植物がレタスであることを特徴とする請求項１８または１９に記載の培地。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００６−７５０７８（Ｐ２００６−７５０７８Ａ）
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−２６２６３２（Ｐ２００４−２６２６３２）
【出願日】平成１６年９月９日（２００４．９．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年３月１５日 日本植物生理学会発行の「Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００４年 Ｖｏｌ．４５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年８月８日 第２２回日本植物細胞分子生物学会（秋田）大会準備委員会発行の「第２２回 日本植物細胞分子生物学会秋田大会・シンポジウム講演要旨集」に発表
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【出願人】（０００２２５１４２）奈良県 (42)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年３月２３日（２００６．３．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月９日（２００４．９．９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年３月１５日 日本植物生理学会発行の「Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２００４年 Ｖｏｌ．４５ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ」に発表
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り ２００４年８月８日 第２２回日本植物細胞分子生物学会（秋田）大会準備委員会発行の「第２２回 日本植物細胞分子生物学会秋田大会・シンポジウム講演要旨集」に発表
【出願人】（５９１１７８０１２）財団法人地球環境産業技術研究機構 (153)
【出願人】（５０４１４３４４１）国立大学法人 奈良先端科学技術大学院大学 (226)
【出願人】（０００２２５１４２）奈良県 (42)
【Ｆターム（参考）】
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