コロイド剤およびイムノクロマトグラフキット
【課題】検出感度および安定性に優れ、かつ取り扱いが簡便な標識用のコロイド剤および当該コロイド剤を含むキットを提供する。
【解決手段】レーザーアブレーション法によって作製することにより粒度分布が異なる複数の粒子群を有し、粒度分布のピークを少なくとも２〜４０ｎｍ未満、および、４０ｎｍ以上〜１００ｎｍの範囲のそれぞれに有するコロイド用粒子と、分散媒としての水と、のみからなる、分析対象物を標識するコロイド剤、および、当該コロイド剤と、少なくとも分析対象物およびコロイド剤を毛管現象により展開させて分析対象物を免疫学的に分析する分析手段と、を有するイムノクロマトグラフキット。
【解決手段】レーザーアブレーション法によって作製することにより粒度分布が異なる複数の粒子群を有し、粒度分布のピークを少なくとも２〜４０ｎｍ未満、および、４０ｎｍ以上〜１００ｎｍの範囲のそれぞれに有するコロイド用粒子と、分散媒としての水と、のみからなる、分析対象物を標識するコロイド剤、および、当該コロイド剤と、少なくとも分析対象物およびコロイド剤を毛管現象により展開させて分析対象物を免疫学的に分析する分析手段と、を有するイムノクロマトグラフキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色調観察や発光や蛍光の強度等を測定して標識の存在を検出することにより、分析対象物の定量あるいは定性を行なう標識用のコロイド剤およびイムノクロマトグラフキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的測定方法の一つの手法としてイムノクロマト法が知られており、簡易で迅速な臨床診断法として実用化されている。
イムノクロマト法は、その判定・測定に重厚な設備・機器を必要とせず、操作が簡便であり、例えば分析対象物を含む可能性のある検体溶液を滴下した後、約５分〜１０分間静置するだけで測定結果が得られる。そのため、簡便・迅速・特異性の高い判定・測定手法として、多くの場面、例えば病院における臨床検査、研究室における検定試験等に広く使われている。
イムノクロマト法では、細菌やウイルスを特異的に検出して患者の感染を迅速・簡便に特定することができ、その後の診断、治療を素早く的確に行うことができる。例えば、サンドイッチ法を利用したイムノクロマトグラフ法では、分析対象物（例えば、抗原）に特異的に結合する第１抗体を特定の領域に固定した不溶性の薄膜状支持体（例えば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜など）中に、分析対象物と特異的に結合する標識化第２抗体と、分析対象物を含む可能性のある検体溶液とを展開し、当該薄膜状支持体の第１抗体を固定した領域上で、分析対象物との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色などのシグナルを検出し、分析対象物を測定することができる。当該標識としては、例えば、金属コロイド、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子および炭素粒子などを使用することができる。
【０００３】
特許文献１〜４には、標識として金属コロイドを使用するイムノクロマト法が記載してある。
【０００４】
特許文献１には、不溶性粒状マーカーを用いるバイオセンサにおいて、当該不溶性粒状マーカーが１または複数の粒子群よりなる金属コロイドであり、その粒子群の主ピークが平均粒径１５から１００ｎｍの範囲にあることが記載してある。
不溶性粒状マーカーのサイズを大きくすることにより、低濃度領域の測定が可能となること、当該不溶性粒状マーカーは短時間で容易に作製可能であることが記載してある。
【０００５】
特許文献２には、被検査液を展開する展開層に、前記被検査液中の検査対象物質を標識する標識試薬を保持した標識試薬部を設けたバイオセンサについて開示してある。標識試薬は不溶性粒状マーカーを含んでおり、当該不溶性粒状マーカーは、別途に作成され粒度分布の異なる少なくとも２つの粒子群が混合されたものである。例えば、混合金コロイド標識抗体として、３０ｎｍ金コロイド標識抗体と４０ｎｍ金コロイド標識抗体とを液量にて１：１になるように混合し、よく攪拌して作製することが開示してある。
当該不溶性粒状マーカーの各粒子群における粒度分布の主ピークは、平均粒径１から１００ｎｍの範囲となっている。
【０００６】
特許文献３には、金コロイド粒子の表面に、白金コロイド粒子を担持してなる白金微粒子を含有する金属コロイド粒子であって、該白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下であることが記載してある。
【０００７】
特許文献４には、無機銀塩もしくは銀錯体、銀イオンの為の還元剤、および金属コロイド標識または金属カルコゲニド標識を含有するイムノクロマトグラフキットが記載してある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−９１３５３号公報
【特許文献２】特開２０１０−３２３９６号公報
【特許文献３】特許第４１８０５３１号公報
【特許文献４】特開２００８−１３９２９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
市販の金コロイドなどの金属コロイドは界面活性剤等の添加剤を含み、当該界面活性剤がナノ粒子表面を覆うことで、安定にコロイド化されている。
一般に、同属の金属コロイドでも、粒子径が異なるとコロイドの安定性が異なる。そのため、同一の粒子径の金属コロイド粒子に抗体を結合させてタンパク質等でコーティングを行って安定させた後、粒子径が異なるコロイド群を混合する必要がある。即ち、特許文献１，２のように、別々の粒子径の金属コロイドを混合して使用するには手間を要する。
【００１０】
特許文献３に記載のように、金コロイドに白金コロイドを結合するには、金コロイドを安定な状態で白金と反応させる必要があり、手間がかかる。また、特許文献４では銀を使用しているが、銀は還元力が強く、同時に自身が酸化する為に発色しやすく高い感度が得られるが、逆に安定性に乏しく、扱いが難しい。
【００１１】
一般に、血液や唾液のように粘性が高く薄膜状支持体中を流れにくい検体に対して、イムノクロマト法では詰まり現象が起こることがある。通常、当該詰まり現象が起こる場合には、界面活性剤を添加して流動性を向上させ、詰まり防止策をとる。しかし、界面活性剤は測定物に対しても作用するため、多量の界面活性剤は感度低下を招く。特に競合免疫測定法のように分子量の小さな物質を測定する場合は致命的となり、少量の界面活性剤を添加した場合でも感度の低下を招く。そのため、検出感度を考慮しながら界面活性剤の添加量を決定する必要があり、煩雑である。
【００１２】
詰まり現象が起こる場合、金属コロイドなどの標識物質の粒子径を小さくすることにより回避することも考えられる。しかし、一般に当該標識物質の粒子径を小さくすると発色が弱くなり、検出感度の低下を招く。
【００１３】
また、界面活性剤を添加すれば、金属コロイド粒子が凝集する虞がある。このような不都合を避けるため、さらにコロイド粒子を分散させる分散剤を添加するなど、付加的な作業を行なう場合もある。
【００１４】
従って、本発明の目的は、検出感度および安定性に優れ、かつ取り扱いが簡便な標識用のコロイド剤および当該コロイド剤を含むキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［４］に示す発明を提供する。
［１］ レーザーアブレーション法によって作製することにより粒度分布が異なる複数の粒子群を有し、前記粒度分布のピークを少なくとも２〜４０ｎｍ未満、および、４０ｎｍ以上〜１００ｎｍの範囲のそれぞれに有するコロイド用粒子と、分散媒としての水と、のみからなる、分析対象物を標識するコロイド剤。
［２］ 前記コロイド用粒子が金属コロイド粒子および非金属コロイド粒子および樹脂コロイド粒子の何れか１つである上記［１］に記載のコロイド剤。
［３］ 前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である上記［２］に記載のコロイド剤。
【００１６】
上記［１］〜［３］の構成によれば、レーザーアブレーション法を適用することによって粒度分布が異なる複数の粒子群を有するコロイド用粒子を作製することができるため、別々の粒子径のコロイド用粒子を混合して使用する必要がない。本明細書における「コロイド用粒子」とは、溶媒と混合してコロイド状態にすることができる粒子のことをいう。分散媒としての水には、レーザーアブレーション法によって作製された粒度分布が異なる複数の粒子群を有するコロイド用粒子のみが含まれるため、界面活性剤等の添加剤を入れなくてもコロイド用粒子そのもののゼータ電位を高い状態に維持することが可能となる。「ゼータ電位」とは、分散された粒子の分散安定性の指標として用いられており、ゼータ電位の絶対値が増加すれば、粒子間の反発力が強くなり粒子の安定性は高くなり、ゼータ電位がゼロに近くなると、粒子は凝集しやすくなる。そのため、本発明のコロイド剤は、粒度分布が異なる複数の粒子群を有していても凝集し難く、安定なコロイド状態を得ることができる。
また、分散媒中においてはコロイド用粒子の他は何れの物質も含まないため、当該コロイド用粒子は分析対象物に対してほぼ理論通りの標識やコーティングを容易に行なえる。さらに、コロイド用粒子の表面が界面活性剤などで覆われていないため抗体などの生体物質との結合力が強くなり、分析反応中に当該生体物質の剥離などが起きないため、強いシグナルを得やすい。
【００１７】
本発明では、コロイド粒子が２〜１００ｎｍの範囲に複数の粒度分布を有している。即ち、粒子径の小さい群は粒度分布のピークを少なくとも４０ｎｍ未満までに有する群であり、大きい粒子径を有する群は粒度分布のピークを少なくとも４０ｎｍ以上の範囲に有する群とする。
【００１８】
このようなコロイド用粒子において、小さい粒子径を有する群（４０ｎｍ未満）は、その小ささ故にコロイド剤が毛管現象によってメンブレン中を展開する際の流動性を向上させることができ、大きい粒子径を有する群（４０ｎｍ以上）は、その大きさ故に標識としての感度を向上させることができる。そのため、本発明のコロイド剤は、界面活性剤などの添加剤を追加せずとも、流動性および検出感度に優れるため、血液や唾液に代表される粘性の高い検体に対して有効である。さらに、粒子径が小さくとも強く発色する金属コロイドや、非金属コロイド粒子および樹脂コロイド粒子を使えば優れた検出感度が得られる。
また、金属コロイドが金コロイドのような直接標識であれば、分析結果を目視で直接観察できるため、検出機器を使用せずともオンサイトで簡便に分析を行なうことができる。
【００１９】
［４］ 上記［１］〜［３］の何れか一項に記載のコロイド剤と、少なくとも前記分析対象物および前記コロイド剤を毛管現象により展開させて前記分析対象物を免疫学的に分析する分析手段と、を有するイムノクロマトグラフキット。
【００２０】
本構成では、検出感度および安定性に優れ、かつ取り扱いが簡便な標識用のコロイド剤を含むイムノクロマトグラフキットを供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】液体中でナノ粒子（コロイド用粒子）を生成するためのレーザー系システムを概略的に示す図である。
【図２】１ヶ月の間隔に亘って測定した金コロイド粒子の波長に対する吸光度（吸収スペクトル）のプロットを示す図である（２つの曲線は、共鳴ピーク付近でほぼ一致し、それはコロイドの高安定性を示す）。
【図３】液体中の２つの小粒子の間の相互作用ポテンシャルを概略的に示すプロットを示す図である（図３（ａ）：実線の曲線は、粒子間の引力ポテンシャルを示す。破線の曲線は、例えばクーロン反発力による推定の反発ポテンシャルを示す。図３（ｂ）：引力ポテンシャル及び反発ポテンシャルの合計は、２つの粒子の間の最近接距離を増大させ得る一定の距離（ｘ0）での反発ポテンシャル障壁を形成する）。
【図４】透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）試料採取グリッド上のコロイドの滴を乾燥させることにより試料採取された金コロイド粒子のＴＥＭ像を示す写真図である。
【図５】銀、金及び銅コロイド粒子の吸収スペクトルを示す波長に対する吸光度のプロットを示す図である。
【図６】０（純粋なＡｇ）、３０、４５、８０及び１００（純粋なＡｕ）パーセントの５つのＡｕ含有率を有するＡｕＡｇ合金コロイド粒子の吸収スペクトルを示す波長に対する吸光度のプロットを示す図である。
【図７】一連の合金コロイド粒子像を示す写真図である（各種の色は、種々のプラズモン共鳴波長から生じる）。
【図８】レーザーアブレーション法によって作製した金コロイド粒子のＴＥＭ像を示す写真図および粒度分布を示すグラフである。
【図９】レーザーアブレーション法によって作製した金コロイド粒子のＴＥＭ像を示す写真図および粒度分布を示すグラフである。
【図１０】レーザーアブレーション法によって作製した金コロイド粒子のＴＥＭ像を示す写真図である。
【図１１】市販の金コロイド粒子のＴＥＭ像を示す写真図である。
【図１２】レーザーアブレーション法により作製した金コロイド粒子および市販の金コロイド粒子の感度比較（検量線）を示すグラフである。
【図１３】レーザーアブレーション法により作製した金コロイド粒子および市販の金コロイド粒子の感度比較（検量線）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
本発明の分析対象物を標識するコロイド剤は、色調観察や発光や蛍光の強度等を測定して標識の存在を検出することにより、分析対象物の定量あるいは定性を行なう標識物質である。
例えば標識した抗体を使用した場合における免疫反応の結果、生成する特異的複合体中の被検出物質の量に応じて標識物質が存在することになる。未反応物を除去した後、標識物質の量を測定することで「分析対象物」を定量することができる。標識物質の定量は、標識物質の種類と共に種々の方法をとりうる。測定された標識強度を、既知量の「分析対象物」を測定した場合の標識強度と比較することにより、液体試料中の被検出物質量を決定できる。
【００２３】
本発明のコロイド剤は、レーザーアブレーション法によって作製することにより粒度分布が異なる複数の粒子群を有し、粒度分布のピークを少なくとも２〜４０ｎｍ未満、および、４０ｎｍ以上〜１００ｎｍの範囲のそれぞれに有するコロイド用粒子と、分散媒としての水と、のみからなる。
【００２４】
コロイド用粒子はレーザーアブレーション法によって作製される。レーザーアブレーションとは、強力なレーザー光を固体に照射して、表面から原子、分子、クラスターを蒸発させて固体表面を削り取る現象のことである。レーザーアブレーション法による具体的なコロイド用粒子の作製方法は後述する。本発明のコロイド剤は、レーザーアブレーション法によって作製することにより粒度分布が異なる複数の粒子群を有している。「粒度分布が異なる複数の粒子群」とは、例えば後述するサンプルＣのように５〜１０ｎｍおよび４０〜６０ｎｍの二つ（複数）の粒度分布を有する粒子群をいう。即ち、本発明のコロイド剤は、単一のピークを有する粒度分布を有するのではなく、粒度分布のピークを少なくとも４０ｎｍまで、および、４０ｎｍより大きい範囲のそれぞれに有する。粒子径の範囲は、上述した範囲に限られるものではなく、例えば全粒子が概ね２〜１００ｎｍの範囲に存在する状態で、複数の粒度分布を有していればよい。
【００２５】
本発明のコロイド剤は、コロイド用粒子を分散させる溶液が例えば純水であり、界面活性剤・ｐＨ安定剤・分散安定剤などを必要としない。即ち、本発明のコロイド剤は、コロイド用粒子とその分散媒のみからなる組成物である。
【００２６】
当該コロイド剤は、界面活性剤等を入れなくてもコロイド用粒子そのもののゼータ電位を高い状態で維持しており、そのために粒度分布が異なる複数の粒子群を有していても凝集し難く、安定なコロイド状態を得ることができる。
【００２７】
コロイド用粒子において、二つの粒度分布を有する、即ち粒度分布のピークを少なくとも４０ｎｍまで、および、４０ｎｍより大きい範囲のそれぞれに有するように構成した場合、小さい粒子径を有する群は、その小ささ故にコロイド剤が毛管現象によってメンブレン中を展開する際の流動性を向上させる成分となり、大きい粒子径を有する群は、その大きさ故に標識としての感度を向上させる成分となる。
【００２８】
また、当該粒度分布のピークは三つ以上有するように構成することが可能である。この場合、後述するコロイド用粒子の作製方法において、レーザーパラメータ（パルス幅、パルスエネルギー、パルス繰返し率、ビーム移動量）を制御することによって粒度分布のピークを調製することが可能となる。
【００２９】
コロイド用粒子は、金属コロイド粒子または非金属コロイド粒子を使用するとよい。当該コロイド粒子に適用できる金属または非金属は、例えば、金、銀、銅、プラチナ、セレニウム、アルミニウム、マグネシウム、ケイ素、カルシウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、亜鉛、ガリウム、セレン、ストロンチウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、インジウム、スズ、アンチモン、テルル、ヨウ素、セシウム、バリウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガトリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、タリウム、鉛、ビスマス、ポロニウム、アスタチンやこれらを含有する合金を使用することができる。
【００３０】
また、上述した金属に替えて樹脂を使用することができる。当該樹脂は、例えばラテックス、フッ素、ナイロン、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリ乳酸、アクリル、メタクリルなどを使用できる。
【００３１】
本発明のコロイド剤を使用して分析対象物を分析する場合は、例えば「免疫化学的手法」によって行なうとよい。例えば固相法によるイムノアッセイの手法を適用することにより液体試料中の分析対象物の存在を検出あるいは定量的測定ができる。イムノアッセイの形態は、競合法、サンドイッチ型の抗原抗体反応（サンドイッチ法）の何れを利用してもよい。サンドイッチ法では、例えば抗原のような標的となる分析対象物を、標識化抗体と固定化物質表面に固定化された抗体との間に挟むことにより特異的複合体を形成させ、分析対象物を捕捉することができる。
【００３２】
このような免疫化学的手法は、少なくとも分析対象物およびコロイド剤を毛管現象により展開させて分析対象物を免疫学的に分析する分析手段を用いて行なわれる。
【００３３】
当該分析手段は、例えば、分析対象物およびコロイド剤を毛管現象により展開させるメンブレンに、分析対象物およびコロイド剤が結合した結合物質と免疫特異的に反応する反応物質を、あらかじめ特定の領域に固相化した分析部位を形成したものである。当該メンブレンは、例えばポアの直径が１０〜２００μｍ、厚さ１００〜３０００μｍのニトロセルロースメンブレン・アセテート混ニトロセルロースメンブレン・ナイロンメンブレン・ポリエーテルスルホンメンブレン・ポリビニリデンジフルオライドメンブレンが好適に用いられる。
【００３４】
当該分析手段は、上述したコロイド剤とセットにしたイムノクロマトグラフキットとして提供される。
【００３５】
（レーザーアブレーション法によるコロイド用粒子の作製）
図１に、液体中でナノ粒子（コロイド用粒子）を生成するためのレーザー系システムの一部を概略的に示す。一実施態様において、レーザービーム１は、超短パルス源（図示せず）から受光され、レンズ２によって焦束され、ターゲット４にビームの急速移動用機構、例えば振動ミラー３により誘導される。ターゲット４は、容器６に含まれる液体５の表面の下に数ミリメートル浸水され、好ましくは１ｃｍ未満浸水される。容器６は、運動ステージ７、例えば移動ステージ上に配置される。コロイド用粒子８が押し流されて他の場所で回収されるように、液体の流れが容器に導入される。また、液体の流れは、レーザー焦点体積をも冷却する。前記液体は、好ましくは１Ｍオーム・ｃｍ超の比抵抗を有する脱イオン水であることが好ましい。幾つかの実施態様において、前記液体は、蒸留水又は別の適切な液体であってよい。制御装置（図示せず）は、パルス線源、運動システム及び／又は循環システムに動作可能なように連結される。制御装置は、ビームの発出、液体の流れ及び運動を調整する。また、制御装置は、システムコンピュータ、ユーザーインターフェース、電気通信機器及び／又は他の標準装置に連結され、遠隔地からプログラムされるように構成される。
【００３６】
ナノ粒子生成用レーザーは、約１．０３μｍの波長（数ミリメートルの水の層は、この波長で無視し得る吸光度を有する）、約１〜２０マイクロジュールの範囲、好ましくは約１０マイクロジュール未満のパルスエネルギーを有してよい。約５００ｆｓ、最高約１０ｐｓのパルス幅が、ナノ粒子の形成に著しい影響を及ぼすことなく用いられ得る。パルス繰返し率は、約１００ｋＨｚ〜５ＭＨｚの範囲であってよい。好ましいレーザーシステムは、更に後述される。水流、ビーム移動、又はその両方が、高繰返し率での蓄熱を回避するために用いられ得る。
【００３７】
例えば、振動ミラー３は、ターゲット表面上へのレーザービームの急速なラスター又は他の移動のために構成される。幾つかの実施態様において、ミラー振動数は１０Ｈｚより大きいことが好ましく、角度振幅は１ｍｒａｄより大きいことが好ましい。０．０１ｍ／ｓ超のターゲット表面上のラスター速度が提供され得る。かかるミラーは、圧電駆動ミラー（piezo-driven mirror）、ガルバノメーターミラー、又はビーム移動のための他の適切な装置であり得る。
【００３８】
水流は、循環システムにより容器に導入することが可能であり、流速は１０ｍＬ／ｓ超であることが好ましい。循環システムが利用可能でない場合は、横振動移動を導入することによってアブレーションスポット全体に亘る水流を局所的に引き起こすこともできる。例えば、運動ステージ７は、図１に示すようにレーザービームに対して垂直な方向に移動させることができる。振動ステージは、数Ｈｚの振動数と数ミリメートルの振幅とを有することが好ましい。
【００３９】
各種実施態様において、安定で且つ化学的に純粋なコロイド用粒子は、レーザーパラメータ及び液流量の両方を制御することによって製造される。レーザーパラメータとしては、パルス幅、パルスエネルギー、パルス繰返し率、ビーム移動量が挙げられる。
【００４０】
超短パルス幅が好ましい。多くのレーザー加工用途において、例えば数ピコ秒〜数百フェムト秒の範囲の超短パルス幅は、非常に高い最大出力及び小さな熱影響部の結果としてアブレーション効率を高める。
【００４１】
ナノ粒子生成における適用のために、特に本発明者らにより行なわれた研究（文献１：B. Liu, Z. D. Hu, Y. Che, Y. B. Chen, X. Q. Pan, "Nanoparticle generation in ultrafast pulsed laser ablation of nickel", Applied Physics Letters, Vol. 90, 044103 (2007), 文献２：B. Liu, Z. D. Hu, Y. Che, "Ultrafast sources: ultrafast lasers produce nanoparticles", Laser Focus World, Vol. 43, 74 (2007)）において、アブレーション閾値に近い低パルスエネルギー（より正確には低フルエンス）がコロイド用粒子生成に好ましいことが分かった。アブレート材料は、主に粒度分布が狭いナノ粒子の形態で存在する。また、米国特許出願第２００８／０００６５２４号は、これらの研究に基づく真空中及び雰囲気ガス中におけるコロイド用粒子の生成方法をも教示する。
【００４２】
好ましくは、例えば少なくとも約１０ｋＨｚ、より好ましくは少なくとも約１００ＫＨｚの高パルス繰返し率が、少なくとも３つの理由のために用いられる。第１は、高繰返し率パルスレーザーアブレーションにおけるマルチパルス効果である。１０マイクロ秒未満のパルス間隔（即ち、１００ｋＨｚ超の高繰返し率）により、アブレート材料は、レーザー焦点体積から離れる前に、多数のレーザー発射を受け、高く帯電する。本発明者らは、安定なコロイド用粒子が、更なる化学的安定剤を添加することなくかかる高繰返し率で作製され得ることを見出した。第２の理由は、マルチパルスによるアブレーションの際、大粒子の断片化が起きる可能性があり、それによってコロイド用粒子の粒度分布が生じる結果となる。第３の理由は、高繰返し率から恩恵を受ける高生成率である。
【００４３】
また、本発明者らは、アブレーションの間のレーザービームの急速なラスターが、高繰返し率の操作と共に有益であるということをも見出した。例えば、レーザービームのかかる急速なラスターなしでは、先行するレーザーパルスにより生成したコロイド用粒子の流れが、散乱及び吸収によってその後のレーザーパルスを最終的には遮断することになる。更に重要なことに、高繰返し率による水に対する蓄積した加熱はまた、コロイド用粒子の凝集を誘発する可能性もある。
【００４４】
本発明者らは、レーザーパラメータの他に、液体運動も安定なコロイド用粒子の作製に有用であることを見出した。水におけるコロイド用粒子の分散懸濁液は、本質的に準安定状態、即ち、熱力学的に安定な状態ではなく動力学的に安定な状態にある。生成中に液体を流すことにより、凝集の動力学的障壁を克服し得るコロイド用粒子の熱的移動の低下が促進される。更に、レーザービームの急速なラスターはまた、コロイド用粒子の熱運動を低下させるためにも有益である。
【００４５】
幾つかの実施態様は、各種のプラズモン共鳴波長を有するコロイド用粒子を提供するものである。これは、金属合金ターゲットを用いることにより達成され得る。文献２は、ＮｉＦｅ等の二元合金について、アブレーション閾値付近の低フルエンスアブレーションによって、新規の合金ターゲットと同じ合金組成を有するコロイド用粒子が生成されることを示した。これらの研究に基づいて、各種実施態様は、二元合金ターゲットを用いて、各種組成を有し、従って各種プラズモン共鳴周波数を有する合金コロイド用粒子を作製する方法を提供する。
【００４６】
以下の実施例において、ＩＢ族元素Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ及びそれらの合金は、実証例として使用される。しかし、実施例は非限定的であり、各種実施態様において他の金属及び金属合金を利用してよい。例えば、貴金属を利用してよい。かかる金属としては、白金、パラジウム、白金又はパラジウムを含む合金が挙げられるが、これらに限定されない。適切な金属又は金属合金ターゲットは、超短パルスによって改質される。最も好ましくは、ターゲット材料は、液体と非反応性であり、レーザー加工の間に水又は他の液体により酸化されない。他の金属をアブレートするためのアブレーション閾値及び他のレーザーパラメータが、本明細書において考察されるようにＡｕとは多少異なり、これらの金属のコロイド又はそれらの金属合金が本発明の範囲内であることは、当業者によって認識されるであろう。
【００４７】
図２は、上記で開示された通りの高繰返し率、超短レーザーアブレーションで作製され、１ヵ月後に測定されて安定性を決定した金コロイド粒子の２つの吸収スペクトルを示す。２つのスペクトルは共鳴ピーク付近でほとんど同一であり、このことはコロイドの高安定性を示す。実際、本発明者らはまた、約８ヵ月の延長期間の間凝集することなく安定であった金コロイド粒子をも製造した。
【００４８】
その中で働くメカニズムを理解することは、実施態様の実施に必要でないにもかかわらず、凝集に対する金コロイドの安定性を調べた。金コロイドに数滴の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を意図的に添加することによって簡単な試験を行った。元々赤色の金コロイドは、ＮａＣｌ溶液を添加した際に即座に黒紫色になった。１時間未満で、暗色は消失し、金コロイドは無色透明になり、可視の沈降物が容器下部に沈んだ。この簡単な試験は、金コロイド粒子が帯電し、添加されたＮａ+イオン及びＣｌ-イオンがクーロン反発力を遮蔽し、ナノ粒子凝集を引き起こしたことを示唆した。
【００４９】
図３は、液体中の２つの小粒子の間の距離ｘの関数としての相互作用ポテンシャルＷの２つの場合を概略的に示す。図３（ａ）における実線の曲線は、引力ポテンシャルを示すが、前記引力ポテンシャルは、水中の金コロイド粒子の場合、（ｉ）金コロイド粒子間のファンデルワールス引力、及び（ｉｉ）界面エネルギーを減少させるために粒子凝集を選好する金の表面と水の間の疎水性相互作用による可能性がある。コロイド粒子が帯電している場合、破線の曲線で示されるクーロン反発力が粒子間に存在する。２つの逆のポテンシャルの合計は、図３（ｂ）に示されるが、ここで一定の距離ｘ0付近の正の（即ち反発）障壁は、粒子凝集を防止する役割を果たす。
【００５０】
ナノ粒子電荷は、高繰返し率パルスレーザーアブレーションにおけるマルチパルス効果から生じる可能性がある。一般に、各単一のレーザー発射は、十分に強力である場合、イオン、電子、中性物及び粒子の混合物を生成するが、前記混合物は、多くの場合「プルーム」と呼ばれる。かかる混合物は、レーザー強度がアブレーション閾値を越える場合に生成され得る。しかし、単一のレーザー発射により生成されたプルームについては、電荷は大部分が蒸気部分にあり、一方で固体部分、特にナノ粒子は、大部分が中性のままである。１０マイクロ秒未満のパルス間隔を有する高繰返し率レーザーを用いる場合、固体部分、特にプルームのナノ粒子は、焦点体積から離れる前に多数のレーザー発射を受ける。この時間の間、粒子が強力レーザー場によって帯電する。
【００５１】
かかるコロイドにおいて、粒子は凝集に対して準安定に分散し続ける。図３（ｂ）に示されるように、粒子が障壁の高さより大きいＫＴに相当する十分な熱エネルギーを得る場合、粒子は、引力トラップ及び凝集体に落ち込む。このメカニズムは、図３（ｂ）において上方の破線の横線により示され、長パルス幅及び高パルスエネルギーを使用する場合に水中におけるパルスレーザーアブレーションにより生成する金属コロイド用粒子が凝集する傾向がある理由を部分的に説明することができる。例えば、水破壊閾値は、約１×１０13Ｗ／ｃｍ2であり、１ｎｓのパルスについての約１０4Ｊ／ｃｍ2のフルエンスに相当する。水破壊閾値を下回るフルエンスによっても、かかる長いレーザーパルスの照射下での水は、容易にその沸点を超えた高温に加熱され得る。その加熱は、アブレーションの間に視覚的に観察され得る泡によって明らかにされる。従って、コロイド用粒子は、反発障壁を克服するように十分な熱エネルギーを得ることができる。コロイド用粒子は、引力トラップ及び凝集体に落ち込む。同じ理由のため、高繰返し率レーザー、例えば１０ｋＨｚ以上でのレーザービームの急速なラスターは、水中の蓄熱を減少させることができる。また、水流は、レーザーの焦点体積に新鮮で且つ冷たい水を送り込むことにも役立つ可能性がある。
【００５２】
幾つかの実施態様において、アブレーションは、相対的に低いフルエンスで行われる。１ｐｓのパルスで約１０Ｊ／ｃｍ2のフルエンスは、過度であり得る。例えば、かかる過度のフルエンスは、アブレーション閾値（例えば、ほとんどの金属について１ｐｓのパルスで約１Ｊ／ｃｍ2）よりも数倍大きくてよい。過度のフルエンスにより、アブレート材料は大部分が蒸発し、その後、蒸気は、液体の静水圧下で再核生成される。換言すれば、相展開の経路は、固体バルクから蒸気へ、次いで固体粒子へというものである。その結果、核生成の際にコロイド用粒子の詰まったネットワークが形成し、それが凝集に対する安定性を低下させる。
【００５３】
真空中及び低圧雰囲気ガス中における超短パルスレーザーアブレーションの研究（文献１）において、アブレーション閾値付近の低レーザーフルエンス、典型的にはほとんどの金属について約３Ｊ／ｃｍ2未満で、アブレートされた材料は、外的に印加された高圧によって強制的核生成が生じることなく自動的にコロイド用粒子の集合として存在することが分かった。この所見は、臨界点相爆発に基づいて後で説明されるが（文献３：T. E. Itina, M. E. Povarnitsyn, K. Gouriet, S. Noel, J. Hermann, "Mechanisms of nanoparticle formation by short laser pulses", Proceedings of SPIE, Vol. 6458, 64581U-1, (2007)）、その場合、固体バルクが材料の臨界点付近でナノ粒子に崩壊する。このメカニズムは、相展開経路が固体バルクから固体ナノ粒子へというものであるナノ粒子生成用途のための好ましい低フルエンスを部分的に説明することができる。
【００５４】
例えば、金属又は金属合金コロイド用粒子を作製するための各種実施態様において、パルス強度は、約１０11〜１０13Ｗ／ｃｍ2、好ましくは約１０12〜低１０13Ｗ／ｃｍ2、最も好ましくは約０．５×１０12〜３×１０12Ｗ／ｃｍ2の範囲であってよい。更に、上記のフルエンス値では、少なくとも約１０ｍＬ／秒の表面及び液体流量での０．０１〜１ｍ／ｓの速度によるラスター操作が適切である。例えば、１ｐｓパルスでの最小フルエンスは、約０．１Ｊ／ｃｍ2であってよい。
【００５５】
図４は、金コロイド粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。試料は、ＴＥＭ試料採取グリッド上のコロイドの滴を乾燥させることにより得られる。集合は大部分が４〜５ｎｍのナノ粒子であり、且つ、約３０〜５０ｎｍの直径を有する顕著により大きなナノ粒子があることが観察される。この二峰性粒度分布は、真空中におけるＮｉ等の他の材料の超短パルスレーザーアブレーションによって生成したナノ粒子において観察されたものと一致する（文献１）。粒度分布は、例えばガウスビームプロファイル（Gaussian beam profile）の代わりにフラットな横方向のビームプロファイルを用いることにより改善され得る。しかし、多くの用途について、二峰性粒度分布は性能に影響を及ぼす。
【００５６】
低フルエンスによる粒子の低生成率を補償するため、高繰返し率レーザーもまた好ましい。これは、高繰返し率の源、例えば約０．１μ秒以下の時間間隔を有する少なくとも２つのパルスを生成する源の使用の更に別の理由である。
【００５７】
ＩＭＲＡ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．は、幾つかのファイバ型チャープパルス（chirped pulse）増幅システムを開示した。例えば、かかるシステムは、１００ｋＨｚ〜１ＭＨｚ超の高繰返し率と、５００フェムト秒〜数ピコ秒の超短パルス幅と、１０Ｗ超の平均電力とを提供する。例えば、ファイバ型チャープパルス増幅システム（ＦＣＰＡ）が、各種実施態様において使用され得る。ＩＭＲＡ Ａｍｅｒｉｃａから市販されているＤ−１０００は、１Ｗの平均電力で、マイクロジュールパルス及び１００ＫＨｚ〜５ＭＨｚの範囲に亘る調整可能な繰返し率を提供する。出力パルス幅は、１ｐｓ未満である。これらのレーザーは、特に現行の用途に適している。標準固体レーザーの典型的な１０Ｈｚ〜１ｋＨｚの繰返し率と比較して、ファイバ型システムは、粒子の生成率を１桁改善させることができる。２００ｋＨｚの繰返し率、１パルスにつき１０マイクロジュールのパルスエネルギー（２Ｗの平均電力）、及び５００ｆｓのパルス幅により、１センチメートル当たりの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を有する金コロイド粒子の２０ｍＬのコロイドが３０分間で生成され得る。これは、文献４（S. Barcikowski, A. Hahn, A. V. Kabashin, B. N. Chichkov, "Properties of nanoparticles generated during femtosecond laser machining in air and water", Applied Physics A, Vol. 87, 47, 2007）におけるもの等の報告されたレーザーアブレーションに基づく方法よりも非常に速い速度である。１０Ｗの典型的な平均電力によって、且つ、スプリットビームによって、生成速度を５倍増加させることが可能である。
【００５８】
本明細書に開示される方法は、銀及び銅に適用され得る。図５は、ＩＢ族の３種全ての元素のナノ粒子の吸収スペクトルを示しているが、全ては、顕著なプラズモン共鳴ピークを示す。
【００５９】
各種実施態様の別の一態様は、各種のプラズモン共鳴波長を有する金属合金コロイド用粒子を提供することである。真空中におけるＮｉＦｅ合金の超短パルスレーザーアブレーションの以前の研究（文献２）において、アブレーション閾値の近くの低いフルエンスによって、生成物ナノ粒子が新規の合金ターゲットと同じ合金組成を有することが見出された。これは、固体バルクのその臨界点付近のナノ粒子への崩壊としても理解されるが、その間、合金相分離が阻害される。この知見が水中におけるアブレーションに適用される場合、各種合金組成と各種プラズモン共鳴波長とを有するＩＢ族金属の合金ナノ粒子のコロイドが得られる。
【００６０】
図６は、０（即ち、純粋なＡｇ）から１００（即ち、純粋なＡｕ）パーセントまで変化する５つのＡｕ組成を有する一連のＡｕＡｇ合金コロイドの吸収スペクトルを示す。その合金組成を有するプラズモン共鳴波長のシフトは明らかである。図７は、ＡｕＡｇ及びＡｕＣｕを含む幾つかのかかるＩＢ族合金コロイド粒子の像である。各種の色は、種々のプラズモン共鳴波長から生じる。
【００６１】
コロイド状ナノ粒子は、コロイド用粒子粉末として回収することができ、コロイド用粒子ペースト又はコロイド用粒子インクに濃縮することができ、固体保持体に分散させることができ、薄膜又は三次元構造に集めることもできる。コロイド状ナノ粒子のこれらの集合又は改変の用途としては、導電ペースト、インク、触媒、フォトニック結晶、化学的及び生物学的センサ、医療及びライフサイエンス製品、環境的製品（例えば、抗バクテリア剤、脱臭剤、浄水剤）が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００６２】
レーザーアブレーション法によって作製した金コロイド粒子と市販の金コロイド粒子との比較を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）にて行なった。レーザーアブレーション法によって作製した金コロイド粒子のＴＥＭ像を図８（サンプルＡ），図９（サンプルＢ）、図１０（サンプルＣ）に示し、市販の金コロイド粒子のＴＥＭ像を図１１に示した。
【００６３】
サンプルＡの金コロイド粒子は、平均粒子径（ａｖｇ）１２．５ｎｍ、標準偏差（ｓｄｅｖ）６．３であった。粒度分布は約２〜６０ｎｍおよび６５ｎｍにて認められた。
サンプルＢの金コロイド粒子は、平均粒子径２１．９ｎｍ、標準偏差６．３であった。粒度分布は約１０〜３８ｎｍおよび６６ｎｍにて認められた。
サンプルＣでは、図１０に示したように、１０〜２６ｎｍ，４１〜６８ｎｍの金コロイド粒子の分布が認められた。
これらサンプルＡ〜Ｃは、粒度分布の範囲が不連続な種々の粒度を有する金コロイド、即ち「粒度分布が異なる複数の粒子群」を有する金コロイドであると認められた。
【００６４】
一方、市販の金コロイド粒子は、図１１に示したように、２６．３〜３７．５ｎｍの粒子が確認でき、凡その粒度分布は２５〜４０ｎｍの範囲のみであると認められた。また、当該金コロイド粒子は、界面活性剤のような高分子の中に存在しているものと認められた。当該高分子が存在することで、当該金コロイド粒子は凝集し易くなると考えられる。本発明のコロイド剤（サンプルＡ〜Ｃ）では、分散媒中における金コロイド粒子の他は何れの物質を含まないため、凝集し難くなっていることが判る（図８〜１０）。
【００６５】
〔実施例１〕
本実施例では、当該ライフサイエンス製品として、分析対象物を定量するための標識としてのコロイド剤として使用する場合について説明する。
【００６６】
マウス由来の抗テストステロン抗体(Acris Antibodies社)を、上述したレーザーアブレーション法により作製した金コロイド（実施例１−１，１−２）へ修飾した。
（１−１）ポリプロピレン（ＰＰ）製の遠心管に適量の金コロイド液を投入し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加えて１分間攪拌した。
（１−２）蒸留水で希釈し、抗テストステロン抗体溶液を上記遠心管に攪拌しながら添加した。
（１−３）室温で１０分間静置した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を加え軽く攪拌した。
（１−４）８０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿させた後、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させ、トリス緩衝液を２０ｍＬ加えた。
（１−５）８０００ｒｐｍで１０分間遠心し沈殿させた後、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。
（１−６）分光光度計でλ520の吸光度を測定し回収量を確認した。
【００６７】
同様にマウス由来の抗テストステロン抗体(Acris Antibodies社)を市販の直径４０ｎｍの金コロイド（比較例１）（British BioCell International社）へ修飾した。
（２−１）ＰＰ製の遠心管に適量の金コロイド液を入れ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加えて１分間攪拌した。
（２−２）蒸留水で希釈し、抗テストステロン抗体溶液を、上記遠心管に攪拌しながら添加した。
（２−３）室温で１０分間静置した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を加え軽く攪拌した。
（２−４）５０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿させた後、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させ、保存用トリス緩衝液を２０ｍＬ加えた。
（２−５）５０００ｒｐｍで１０分間遠心し沈殿させた後、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。
（２−６）分光光度計でλ520の吸光度を測定し回収量を確認した。
【００６８】
上記の金コロイド修飾済み抗テストステロン抗体をグラスファイバーコンジュゲートパッド（ミリポア社）へ塗布し、風乾した。
【００６９】
テストステロン-ＢＳＡ複合体２．０ｍｇ/ｍＬをニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）に塗布して風乾し、ラインＡ（テストライン）とした。また、ウサギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体０．５ｍｇ/ｍＬを同一のニトロセルロースメンブレンに塗布して風乾し、ラインＢ（コントロールライン）とした。このニトロセルロースメンブレン，グラスファイバーアプライパッド，コンジュゲートパッド，セルロース吸収パッドを台紙に貼り合わせ、５ｍｍ幅に切断した後、専用のハウジング内に収納して、イムノクロマトグラフィー試験片（分析手段）を作製した。
【００７０】
テストステロン（関東化学社）を２％エタノール含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、０．１ｍＭ，１０μＭ，１μＭ，０．１μＭ，１０ｎＭ，１ｎＭ，０．１ｎＭ，１０ｐＭ濃度の標準溶液を作製した。
【００７１】
当該標準溶液を５％濃度で展開液（トリス緩衝液，ｐＨ７．５、塩化ナトリウム，ショ糖，界面活性剤，ブロッキング剤を含む）に加え攪拌した後、上記のイムノクロマトグラフィー試験片のアプライパットへ１００μＬ滴下し、ニトロセルロースメンブレンへ展開した。
【００７２】
発色量を専用の読取機（イムノメジャーＰＣＢ−ＳＫ１００（アイシン精機株式会社製））にて測定し、読取値をグラフにプロットし、最小二乗法により４パラメータロジスティック曲線に近似しこれを検量線とした。
【００７３】
レーザーアブレーション法により作製した金コロイド（実施例１−１，１−２）および市販の金コロイド（比較例１）において、それぞれから得られた検量線の違いを比較した。検量線を図１２に示す。尚、検量線式を以下に示す。
【００７４】
〔数１〕
シグモイド曲線ｙ（sigmoidal）＝ｄ＋（（ａ−ｄ）/（１＋（ｘ/ｃ））＾ｂ）
（ｘは試料中の被験物質濃度、ｙはシグナル相対比を示す）
【００７５】
【表１】
【００７６】
この結果、レーザーアブレーション法により作製した本発明の金コロイドは、界面活性剤を同じ条件で添加した市販の粒子径サイズの大きな金コロイドと同等の感度を示すことが判明した。
【００７７】
（実施例２）
実施例１と同様にマウス由来の抗テストステロン抗体（Acris Antibodies社）を市販の直径２０ｎｍの金コロイド（比較例２）（British BioCell International社）へ修飾した。
【００７８】
実施例１で使用したレーザーアブレーション法により作製した金コロイド（実施例１−１，１−２）で作成した金コロイド修飾済み抗テストステロン抗体と、比較例２の金コロイド修飾済み抗テストステロン抗体とを実施例１同様にニトロセルロースメンブレンに塗布し、イムノクロマトグラフィー試験片を作製した。
【００７９】
テストステロン（関東化学社）を２％エタノール含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、１０００ｎｇ／ｍＬ，１００ｎｇ／ｍＬ，１０ｎｇ／ｍＬ，１ｎｇ／ｍＬ，１００ｐｇ／ｍＬ，１０ｐｇ／ｍＬ，０．１ｐｇ／ｍＬ濃度の標準溶液を作製した。
【００８０】
当該標準溶液をイムノクロマトグラフィー試験片のアプライパットへ１００μＬ滴下し、ニトロセルロースメンブレンへ展開した。
【００８１】
発色量をイムノメジャーにて測定し、読取値をグラフにプロットし、最小二乗法により４パラメータロジスティック曲線に近似しこれを検量線とした。
レーザーアブレーション法により作製した金コロイド（実施例１−１，１−２）および市販の金コロイド（比較例１）において、それぞれから得られた検量線の違いを比較した。検量線を図１３に示す。尚、検量線式は数１と同様である。
【００８２】
【表２】
【００８３】
この結果、レーザーアブレーション法により作製した本発明の金コロイドは、比較例２の小さな粒子径サイズの金コロイドと比べ、ＩＣ50比較で６．７〜４．９倍の高い感度を示すことが判明した。つまり一般に検出反応の分散を良くしようと粒子径を小さくすると検出感度の低下が起こるが、レーザーアブレーション法により作成した本発明の金コロイドは検出感度の低下を起こさずに分散を高め、反応時間、反応安定性の向上につながることが分かった。
【００８４】
（実施例３）
比較例１，２の金コロイドをMalvernsya社Zetasizer Ver.6.01にて粒子径およびゼータ電位を測定した。
【００８５】
また、レーザーアブレーション法により作製した金コロイド（実施例１−１（粒子径１３．９ｎｍ），実施例１−２（粒子径２２．８ｎｍ））をＴＥＭ（JEOL 2010F analytical electron microscope：日本電子（株））にて撮影した。この画像を画像解析ソフトIGOR Proにて粒子径を測定した。RMS（Root Mean Square）の値を下表に示す。さらに、ゼータ電位を比較例１，２の金コロイドと同様の手法で測定した。
【００８６】
【表３】
【００８７】
この結果、実施例１の金コロイドのゼータ電位の絶対値は、比較例１，２の金コロイドのゼータ電位の絶対値と同等であることが判明した。即ち、本発明の金コロイドは、界面活性剤などの添加剤を含有しない状態で、市販の金コロイドと同等のゼータ電位を有するものと認められる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明のコロイド剤およびイムノクロマトグラフキットは、色調観察や発光や蛍光の強度等を測定して標識の存在を検出することにより、標識した分析対象物の定量あるいは定性を行なうことに利用できる。
【符号の説明】
【００８９】
１ レーザービーム
２ レンズ
３ 振動ミラー
４ ターゲット
５ 液体
６ 容器
７ 運動ステージ
８ コロイド用粒子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色調観察や発光や蛍光の強度等を測定して標識の存在を検出することにより、分析対象物の定量あるいは定性を行なう標識用のコロイド剤およびイムノクロマトグラフキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫学的測定方法の一つの手法としてイムノクロマト法が知られており、簡易で迅速な臨床診断法として実用化されている。
イムノクロマト法は、その判定・測定に重厚な設備・機器を必要とせず、操作が簡便であり、例えば分析対象物を含む可能性のある検体溶液を滴下した後、約５分〜１０分間静置するだけで測定結果が得られる。そのため、簡便・迅速・特異性の高い判定・測定手法として、多くの場面、例えば病院における臨床検査、研究室における検定試験等に広く使われている。
イムノクロマト法では、細菌やウイルスを特異的に検出して患者の感染を迅速・簡便に特定することができ、その後の診断、治療を素早く的確に行うことができる。例えば、サンドイッチ法を利用したイムノクロマトグラフ法では、分析対象物（例えば、抗原）に特異的に結合する第１抗体を特定の領域に固定した不溶性の薄膜状支持体（例えば、ガラス繊維膜、ナイロン膜、又はセルロ−ス膜など）中に、分析対象物と特異的に結合する標識化第２抗体と、分析対象物を含む可能性のある検体溶液とを展開し、当該薄膜状支持体の第１抗体を固定した領域上で、分析対象物との免疫複合体を形成させ、標識の着色又は発色などのシグナルを検出し、分析対象物を測定することができる。当該標識としては、例えば、金属コロイド、酵素を含むタンパク質、着色ラテックス粒子および炭素粒子などを使用することができる。
【０００３】
特許文献１〜４には、標識として金属コロイドを使用するイムノクロマト法が記載してある。
【０００４】
特許文献１には、不溶性粒状マーカーを用いるバイオセンサにおいて、当該不溶性粒状マーカーが１または複数の粒子群よりなる金属コロイドであり、その粒子群の主ピークが平均粒径１５から１００ｎｍの範囲にあることが記載してある。
不溶性粒状マーカーのサイズを大きくすることにより、低濃度領域の測定が可能となること、当該不溶性粒状マーカーは短時間で容易に作製可能であることが記載してある。
【０００５】
特許文献２には、被検査液を展開する展開層に、前記被検査液中の検査対象物質を標識する標識試薬を保持した標識試薬部を設けたバイオセンサについて開示してある。標識試薬は不溶性粒状マーカーを含んでおり、当該不溶性粒状マーカーは、別途に作成され粒度分布の異なる少なくとも２つの粒子群が混合されたものである。例えば、混合金コロイド標識抗体として、３０ｎｍ金コロイド標識抗体と４０ｎｍ金コロイド標識抗体とを液量にて１：１になるように混合し、よく攪拌して作製することが開示してある。
当該不溶性粒状マーカーの各粒子群における粒度分布の主ピークは、平均粒径１から１００ｎｍの範囲となっている。
【０００６】
特許文献３には、金コロイド粒子の表面に、白金コロイド粒子を担持してなる白金微粒子を含有する金属コロイド粒子であって、該白金微粒子の平均粒径が５ｎｍ以下であることが記載してある。
【０００７】
特許文献４には、無機銀塩もしくは銀錯体、銀イオンの為の還元剤、および金属コロイド標識または金属カルコゲニド標識を含有するイムノクロマトグラフキットが記載してある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１０−９１３５３号公報
【特許文献２】特開２０１０−３２３９６号公報
【特許文献３】特許第４１８０５３１号公報
【特許文献４】特開２００８−１３９２９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
市販の金コロイドなどの金属コロイドは界面活性剤等の添加剤を含み、当該界面活性剤がナノ粒子表面を覆うことで、安定にコロイド化されている。
一般に、同属の金属コロイドでも、粒子径が異なるとコロイドの安定性が異なる。そのため、同一の粒子径の金属コロイド粒子に抗体を結合させてタンパク質等でコーティングを行って安定させた後、粒子径が異なるコロイド群を混合する必要がある。即ち、特許文献１，２のように、別々の粒子径の金属コロイドを混合して使用するには手間を要する。
【００１０】
特許文献３に記載のように、金コロイドに白金コロイドを結合するには、金コロイドを安定な状態で白金と反応させる必要があり、手間がかかる。また、特許文献４では銀を使用しているが、銀は還元力が強く、同時に自身が酸化する為に発色しやすく高い感度が得られるが、逆に安定性に乏しく、扱いが難しい。
【００１１】
一般に、血液や唾液のように粘性が高く薄膜状支持体中を流れにくい検体に対して、イムノクロマト法では詰まり現象が起こることがある。通常、当該詰まり現象が起こる場合には、界面活性剤を添加して流動性を向上させ、詰まり防止策をとる。しかし、界面活性剤は測定物に対しても作用するため、多量の界面活性剤は感度低下を招く。特に競合免疫測定法のように分子量の小さな物質を測定する場合は致命的となり、少量の界面活性剤を添加した場合でも感度の低下を招く。そのため、検出感度を考慮しながら界面活性剤の添加量を決定する必要があり、煩雑である。
【００１２】
詰まり現象が起こる場合、金属コロイドなどの標識物質の粒子径を小さくすることにより回避することも考えられる。しかし、一般に当該標識物質の粒子径を小さくすると発色が弱くなり、検出感度の低下を招く。
【００１３】
また、界面活性剤を添加すれば、金属コロイド粒子が凝集する虞がある。このような不都合を避けるため、さらにコロイド粒子を分散させる分散剤を添加するなど、付加的な作業を行なう場合もある。
【００１４】
従って、本発明の目的は、検出感度および安定性に優れ、かつ取り扱いが簡便な標識用のコロイド剤および当該コロイド剤を含むキットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
即ち、上記目的を達成するため、以下の［１］〜［４］に示す発明を提供する。
［１］ レーザーアブレーション法によって作製することにより粒度分布が異なる複数の粒子群を有し、前記粒度分布のピークを少なくとも２〜４０ｎｍ未満、および、４０ｎｍ以上〜１００ｎｍの範囲のそれぞれに有するコロイド用粒子と、分散媒としての水と、のみからなる、分析対象物を標識するコロイド剤。
［２］ 前記コロイド用粒子が金属コロイド粒子および非金属コロイド粒子および樹脂コロイド粒子の何れか１つである上記［１］に記載のコロイド剤。
［３］ 前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である上記［２］に記載のコロイド剤。
【００１６】
上記［１］〜［３］の構成によれば、レーザーアブレーション法を適用することによって粒度分布が異なる複数の粒子群を有するコロイド用粒子を作製することができるため、別々の粒子径のコロイド用粒子を混合して使用する必要がない。本明細書における「コロイド用粒子」とは、溶媒と混合してコロイド状態にすることができる粒子のことをいう。分散媒としての水には、レーザーアブレーション法によって作製された粒度分布が異なる複数の粒子群を有するコロイド用粒子のみが含まれるため、界面活性剤等の添加剤を入れなくてもコロイド用粒子そのもののゼータ電位を高い状態に維持することが可能となる。「ゼータ電位」とは、分散された粒子の分散安定性の指標として用いられており、ゼータ電位の絶対値が増加すれば、粒子間の反発力が強くなり粒子の安定性は高くなり、ゼータ電位がゼロに近くなると、粒子は凝集しやすくなる。そのため、本発明のコロイド剤は、粒度分布が異なる複数の粒子群を有していても凝集し難く、安定なコロイド状態を得ることができる。
また、分散媒中においてはコロイド用粒子の他は何れの物質も含まないため、当該コロイド用粒子は分析対象物に対してほぼ理論通りの標識やコーティングを容易に行なえる。さらに、コロイド用粒子の表面が界面活性剤などで覆われていないため抗体などの生体物質との結合力が強くなり、分析反応中に当該生体物質の剥離などが起きないため、強いシグナルを得やすい。
【００１７】
本発明では、コロイド粒子が２〜１００ｎｍの範囲に複数の粒度分布を有している。即ち、粒子径の小さい群は粒度分布のピークを少なくとも４０ｎｍ未満までに有する群であり、大きい粒子径を有する群は粒度分布のピークを少なくとも４０ｎｍ以上の範囲に有する群とする。
【００１８】
このようなコロイド用粒子において、小さい粒子径を有する群（４０ｎｍ未満）は、その小ささ故にコロイド剤が毛管現象によってメンブレン中を展開する際の流動性を向上させることができ、大きい粒子径を有する群（４０ｎｍ以上）は、その大きさ故に標識としての感度を向上させることができる。そのため、本発明のコロイド剤は、界面活性剤などの添加剤を追加せずとも、流動性および検出感度に優れるため、血液や唾液に代表される粘性の高い検体に対して有効である。さらに、粒子径が小さくとも強く発色する金属コロイドや、非金属コロイド粒子および樹脂コロイド粒子を使えば優れた検出感度が得られる。
また、金属コロイドが金コロイドのような直接標識であれば、分析結果を目視で直接観察できるため、検出機器を使用せずともオンサイトで簡便に分析を行なうことができる。
【００１９】
［４］ 上記［１］〜［３］の何れか一項に記載のコロイド剤と、少なくとも前記分析対象物および前記コロイド剤を毛管現象により展開させて前記分析対象物を免疫学的に分析する分析手段と、を有するイムノクロマトグラフキット。
【００２０】
本構成では、検出感度および安定性に優れ、かつ取り扱いが簡便な標識用のコロイド剤を含むイムノクロマトグラフキットを供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】液体中でナノ粒子（コロイド用粒子）を生成するためのレーザー系システムを概略的に示す図である。
【図２】１ヶ月の間隔に亘って測定した金コロイド粒子の波長に対する吸光度（吸収スペクトル）のプロットを示す図である（２つの曲線は、共鳴ピーク付近でほぼ一致し、それはコロイドの高安定性を示す）。
【図３】液体中の２つの小粒子の間の相互作用ポテンシャルを概略的に示すプロットを示す図である（図３（ａ）：実線の曲線は、粒子間の引力ポテンシャルを示す。破線の曲線は、例えばクーロン反発力による推定の反発ポテンシャルを示す。図３（ｂ）：引力ポテンシャル及び反発ポテンシャルの合計は、２つの粒子の間の最近接距離を増大させ得る一定の距離（ｘ0）での反発ポテンシャル障壁を形成する）。
【図４】透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）試料採取グリッド上のコロイドの滴を乾燥させることにより試料採取された金コロイド粒子のＴＥＭ像を示す写真図である。
【図５】銀、金及び銅コロイド粒子の吸収スペクトルを示す波長に対する吸光度のプロットを示す図である。
【図６】０（純粋なＡｇ）、３０、４５、８０及び１００（純粋なＡｕ）パーセントの５つのＡｕ含有率を有するＡｕＡｇ合金コロイド粒子の吸収スペクトルを示す波長に対する吸光度のプロットを示す図である。
【図７】一連の合金コロイド粒子像を示す写真図である（各種の色は、種々のプラズモン共鳴波長から生じる）。
【図８】レーザーアブレーション法によって作製した金コロイド粒子のＴＥＭ像を示す写真図および粒度分布を示すグラフである。
【図９】レーザーアブレーション法によって作製した金コロイド粒子のＴＥＭ像を示す写真図および粒度分布を示すグラフである。
【図１０】レーザーアブレーション法によって作製した金コロイド粒子のＴＥＭ像を示す写真図である。
【図１１】市販の金コロイド粒子のＴＥＭ像を示す写真図である。
【図１２】レーザーアブレーション法により作製した金コロイド粒子および市販の金コロイド粒子の感度比較（検量線）を示すグラフである。
【図１３】レーザーアブレーション法により作製した金コロイド粒子および市販の金コロイド粒子の感度比較（検量線）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施例を図面に基づいて説明する。
本発明の分析対象物を標識するコロイド剤は、色調観察や発光や蛍光の強度等を測定して標識の存在を検出することにより、分析対象物の定量あるいは定性を行なう標識物質である。
例えば標識した抗体を使用した場合における免疫反応の結果、生成する特異的複合体中の被検出物質の量に応じて標識物質が存在することになる。未反応物を除去した後、標識物質の量を測定することで「分析対象物」を定量することができる。標識物質の定量は、標識物質の種類と共に種々の方法をとりうる。測定された標識強度を、既知量の「分析対象物」を測定した場合の標識強度と比較することにより、液体試料中の被検出物質量を決定できる。
【００２３】
本発明のコロイド剤は、レーザーアブレーション法によって作製することにより粒度分布が異なる複数の粒子群を有し、粒度分布のピークを少なくとも２〜４０ｎｍ未満、および、４０ｎｍ以上〜１００ｎｍの範囲のそれぞれに有するコロイド用粒子と、分散媒としての水と、のみからなる。
【００２４】
コロイド用粒子はレーザーアブレーション法によって作製される。レーザーアブレーションとは、強力なレーザー光を固体に照射して、表面から原子、分子、クラスターを蒸発させて固体表面を削り取る現象のことである。レーザーアブレーション法による具体的なコロイド用粒子の作製方法は後述する。本発明のコロイド剤は、レーザーアブレーション法によって作製することにより粒度分布が異なる複数の粒子群を有している。「粒度分布が異なる複数の粒子群」とは、例えば後述するサンプルＣのように５〜１０ｎｍおよび４０〜６０ｎｍの二つ（複数）の粒度分布を有する粒子群をいう。即ち、本発明のコロイド剤は、単一のピークを有する粒度分布を有するのではなく、粒度分布のピークを少なくとも４０ｎｍまで、および、４０ｎｍより大きい範囲のそれぞれに有する。粒子径の範囲は、上述した範囲に限られるものではなく、例えば全粒子が概ね２〜１００ｎｍの範囲に存在する状態で、複数の粒度分布を有していればよい。
【００２５】
本発明のコロイド剤は、コロイド用粒子を分散させる溶液が例えば純水であり、界面活性剤・ｐＨ安定剤・分散安定剤などを必要としない。即ち、本発明のコロイド剤は、コロイド用粒子とその分散媒のみからなる組成物である。
【００２６】
当該コロイド剤は、界面活性剤等を入れなくてもコロイド用粒子そのもののゼータ電位を高い状態で維持しており、そのために粒度分布が異なる複数の粒子群を有していても凝集し難く、安定なコロイド状態を得ることができる。
【００２７】
コロイド用粒子において、二つの粒度分布を有する、即ち粒度分布のピークを少なくとも４０ｎｍまで、および、４０ｎｍより大きい範囲のそれぞれに有するように構成した場合、小さい粒子径を有する群は、その小ささ故にコロイド剤が毛管現象によってメンブレン中を展開する際の流動性を向上させる成分となり、大きい粒子径を有する群は、その大きさ故に標識としての感度を向上させる成分となる。
【００２８】
また、当該粒度分布のピークは三つ以上有するように構成することが可能である。この場合、後述するコロイド用粒子の作製方法において、レーザーパラメータ（パルス幅、パルスエネルギー、パルス繰返し率、ビーム移動量）を制御することによって粒度分布のピークを調製することが可能となる。
【００２９】
コロイド用粒子は、金属コロイド粒子または非金属コロイド粒子を使用するとよい。当該コロイド粒子に適用できる金属または非金属は、例えば、金、銀、銅、プラチナ、セレニウム、アルミニウム、マグネシウム、ケイ素、カルシウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、亜鉛、ガリウム、セレン、ストロンチウム、イットリウム、ジルコニウム、ニオブ、モリブデン、テクネチウム、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、インジウム、スズ、アンチモン、テルル、ヨウ素、セシウム、バリウム、ランタン、セリウム、プラセオジム、ネオジム、プロメチウム、サマリウム、ユウロピウム、ガトリニウム、テルビウム、ジスプロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム、イッテルビウム、ルテチウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、タリウム、鉛、ビスマス、ポロニウム、アスタチンやこれらを含有する合金を使用することができる。
【００３０】
また、上述した金属に替えて樹脂を使用することができる。当該樹脂は、例えばラテックス、フッ素、ナイロン、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリエチレン、塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリエチレンテレフタレート、ポリスチレン、ポリ乳酸、アクリル、メタクリルなどを使用できる。
【００３１】
本発明のコロイド剤を使用して分析対象物を分析する場合は、例えば「免疫化学的手法」によって行なうとよい。例えば固相法によるイムノアッセイの手法を適用することにより液体試料中の分析対象物の存在を検出あるいは定量的測定ができる。イムノアッセイの形態は、競合法、サンドイッチ型の抗原抗体反応（サンドイッチ法）の何れを利用してもよい。サンドイッチ法では、例えば抗原のような標的となる分析対象物を、標識化抗体と固定化物質表面に固定化された抗体との間に挟むことにより特異的複合体を形成させ、分析対象物を捕捉することができる。
【００３２】
このような免疫化学的手法は、少なくとも分析対象物およびコロイド剤を毛管現象により展開させて分析対象物を免疫学的に分析する分析手段を用いて行なわれる。
【００３３】
当該分析手段は、例えば、分析対象物およびコロイド剤を毛管現象により展開させるメンブレンに、分析対象物およびコロイド剤が結合した結合物質と免疫特異的に反応する反応物質を、あらかじめ特定の領域に固相化した分析部位を形成したものである。当該メンブレンは、例えばポアの直径が１０〜２００μｍ、厚さ１００〜３０００μｍのニトロセルロースメンブレン・アセテート混ニトロセルロースメンブレン・ナイロンメンブレン・ポリエーテルスルホンメンブレン・ポリビニリデンジフルオライドメンブレンが好適に用いられる。
【００３４】
当該分析手段は、上述したコロイド剤とセットにしたイムノクロマトグラフキットとして提供される。
【００３５】
（レーザーアブレーション法によるコロイド用粒子の作製）
図１に、液体中でナノ粒子（コロイド用粒子）を生成するためのレーザー系システムの一部を概略的に示す。一実施態様において、レーザービーム１は、超短パルス源（図示せず）から受光され、レンズ２によって焦束され、ターゲット４にビームの急速移動用機構、例えば振動ミラー３により誘導される。ターゲット４は、容器６に含まれる液体５の表面の下に数ミリメートル浸水され、好ましくは１ｃｍ未満浸水される。容器６は、運動ステージ７、例えば移動ステージ上に配置される。コロイド用粒子８が押し流されて他の場所で回収されるように、液体の流れが容器に導入される。また、液体の流れは、レーザー焦点体積をも冷却する。前記液体は、好ましくは１Ｍオーム・ｃｍ超の比抵抗を有する脱イオン水であることが好ましい。幾つかの実施態様において、前記液体は、蒸留水又は別の適切な液体であってよい。制御装置（図示せず）は、パルス線源、運動システム及び／又は循環システムに動作可能なように連結される。制御装置は、ビームの発出、液体の流れ及び運動を調整する。また、制御装置は、システムコンピュータ、ユーザーインターフェース、電気通信機器及び／又は他の標準装置に連結され、遠隔地からプログラムされるように構成される。
【００３６】
ナノ粒子生成用レーザーは、約１．０３μｍの波長（数ミリメートルの水の層は、この波長で無視し得る吸光度を有する）、約１〜２０マイクロジュールの範囲、好ましくは約１０マイクロジュール未満のパルスエネルギーを有してよい。約５００ｆｓ、最高約１０ｐｓのパルス幅が、ナノ粒子の形成に著しい影響を及ぼすことなく用いられ得る。パルス繰返し率は、約１００ｋＨｚ〜５ＭＨｚの範囲であってよい。好ましいレーザーシステムは、更に後述される。水流、ビーム移動、又はその両方が、高繰返し率での蓄熱を回避するために用いられ得る。
【００３７】
例えば、振動ミラー３は、ターゲット表面上へのレーザービームの急速なラスター又は他の移動のために構成される。幾つかの実施態様において、ミラー振動数は１０Ｈｚより大きいことが好ましく、角度振幅は１ｍｒａｄより大きいことが好ましい。０．０１ｍ／ｓ超のターゲット表面上のラスター速度が提供され得る。かかるミラーは、圧電駆動ミラー（piezo-driven mirror）、ガルバノメーターミラー、又はビーム移動のための他の適切な装置であり得る。
【００３８】
水流は、循環システムにより容器に導入することが可能であり、流速は１０ｍＬ／ｓ超であることが好ましい。循環システムが利用可能でない場合は、横振動移動を導入することによってアブレーションスポット全体に亘る水流を局所的に引き起こすこともできる。例えば、運動ステージ７は、図１に示すようにレーザービームに対して垂直な方向に移動させることができる。振動ステージは、数Ｈｚの振動数と数ミリメートルの振幅とを有することが好ましい。
【００３９】
各種実施態様において、安定で且つ化学的に純粋なコロイド用粒子は、レーザーパラメータ及び液流量の両方を制御することによって製造される。レーザーパラメータとしては、パルス幅、パルスエネルギー、パルス繰返し率、ビーム移動量が挙げられる。
【００４０】
超短パルス幅が好ましい。多くのレーザー加工用途において、例えば数ピコ秒〜数百フェムト秒の範囲の超短パルス幅は、非常に高い最大出力及び小さな熱影響部の結果としてアブレーション効率を高める。
【００４１】
ナノ粒子生成における適用のために、特に本発明者らにより行なわれた研究（文献１：B. Liu, Z. D. Hu, Y. Che, Y. B. Chen, X. Q. Pan, "Nanoparticle generation in ultrafast pulsed laser ablation of nickel", Applied Physics Letters, Vol. 90, 044103 (2007), 文献２：B. Liu, Z. D. Hu, Y. Che, "Ultrafast sources: ultrafast lasers produce nanoparticles", Laser Focus World, Vol. 43, 74 (2007)）において、アブレーション閾値に近い低パルスエネルギー（より正確には低フルエンス）がコロイド用粒子生成に好ましいことが分かった。アブレート材料は、主に粒度分布が狭いナノ粒子の形態で存在する。また、米国特許出願第２００８／０００６５２４号は、これらの研究に基づく真空中及び雰囲気ガス中におけるコロイド用粒子の生成方法をも教示する。
【００４２】
好ましくは、例えば少なくとも約１０ｋＨｚ、より好ましくは少なくとも約１００ＫＨｚの高パルス繰返し率が、少なくとも３つの理由のために用いられる。第１は、高繰返し率パルスレーザーアブレーションにおけるマルチパルス効果である。１０マイクロ秒未満のパルス間隔（即ち、１００ｋＨｚ超の高繰返し率）により、アブレート材料は、レーザー焦点体積から離れる前に、多数のレーザー発射を受け、高く帯電する。本発明者らは、安定なコロイド用粒子が、更なる化学的安定剤を添加することなくかかる高繰返し率で作製され得ることを見出した。第２の理由は、マルチパルスによるアブレーションの際、大粒子の断片化が起きる可能性があり、それによってコロイド用粒子の粒度分布が生じる結果となる。第３の理由は、高繰返し率から恩恵を受ける高生成率である。
【００４３】
また、本発明者らは、アブレーションの間のレーザービームの急速なラスターが、高繰返し率の操作と共に有益であるということをも見出した。例えば、レーザービームのかかる急速なラスターなしでは、先行するレーザーパルスにより生成したコロイド用粒子の流れが、散乱及び吸収によってその後のレーザーパルスを最終的には遮断することになる。更に重要なことに、高繰返し率による水に対する蓄積した加熱はまた、コロイド用粒子の凝集を誘発する可能性もある。
【００４４】
本発明者らは、レーザーパラメータの他に、液体運動も安定なコロイド用粒子の作製に有用であることを見出した。水におけるコロイド用粒子の分散懸濁液は、本質的に準安定状態、即ち、熱力学的に安定な状態ではなく動力学的に安定な状態にある。生成中に液体を流すことにより、凝集の動力学的障壁を克服し得るコロイド用粒子の熱的移動の低下が促進される。更に、レーザービームの急速なラスターはまた、コロイド用粒子の熱運動を低下させるためにも有益である。
【００４５】
幾つかの実施態様は、各種のプラズモン共鳴波長を有するコロイド用粒子を提供するものである。これは、金属合金ターゲットを用いることにより達成され得る。文献２は、ＮｉＦｅ等の二元合金について、アブレーション閾値付近の低フルエンスアブレーションによって、新規の合金ターゲットと同じ合金組成を有するコロイド用粒子が生成されることを示した。これらの研究に基づいて、各種実施態様は、二元合金ターゲットを用いて、各種組成を有し、従って各種プラズモン共鳴周波数を有する合金コロイド用粒子を作製する方法を提供する。
【００４６】
以下の実施例において、ＩＢ族元素Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ及びそれらの合金は、実証例として使用される。しかし、実施例は非限定的であり、各種実施態様において他の金属及び金属合金を利用してよい。例えば、貴金属を利用してよい。かかる金属としては、白金、パラジウム、白金又はパラジウムを含む合金が挙げられるが、これらに限定されない。適切な金属又は金属合金ターゲットは、超短パルスによって改質される。最も好ましくは、ターゲット材料は、液体と非反応性であり、レーザー加工の間に水又は他の液体により酸化されない。他の金属をアブレートするためのアブレーション閾値及び他のレーザーパラメータが、本明細書において考察されるようにＡｕとは多少異なり、これらの金属のコロイド又はそれらの金属合金が本発明の範囲内であることは、当業者によって認識されるであろう。
【００４７】
図２は、上記で開示された通りの高繰返し率、超短レーザーアブレーションで作製され、１ヵ月後に測定されて安定性を決定した金コロイド粒子の２つの吸収スペクトルを示す。２つのスペクトルは共鳴ピーク付近でほとんど同一であり、このことはコロイドの高安定性を示す。実際、本発明者らはまた、約８ヵ月の延長期間の間凝集することなく安定であった金コロイド粒子をも製造した。
【００４８】
その中で働くメカニズムを理解することは、実施態様の実施に必要でないにもかかわらず、凝集に対する金コロイドの安定性を調べた。金コロイドに数滴の１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を意図的に添加することによって簡単な試験を行った。元々赤色の金コロイドは、ＮａＣｌ溶液を添加した際に即座に黒紫色になった。１時間未満で、暗色は消失し、金コロイドは無色透明になり、可視の沈降物が容器下部に沈んだ。この簡単な試験は、金コロイド粒子が帯電し、添加されたＮａ+イオン及びＣｌ-イオンがクーロン反発力を遮蔽し、ナノ粒子凝集を引き起こしたことを示唆した。
【００４９】
図３は、液体中の２つの小粒子の間の距離ｘの関数としての相互作用ポテンシャルＷの２つの場合を概略的に示す。図３（ａ）における実線の曲線は、引力ポテンシャルを示すが、前記引力ポテンシャルは、水中の金コロイド粒子の場合、（ｉ）金コロイド粒子間のファンデルワールス引力、及び（ｉｉ）界面エネルギーを減少させるために粒子凝集を選好する金の表面と水の間の疎水性相互作用による可能性がある。コロイド粒子が帯電している場合、破線の曲線で示されるクーロン反発力が粒子間に存在する。２つの逆のポテンシャルの合計は、図３（ｂ）に示されるが、ここで一定の距離ｘ0付近の正の（即ち反発）障壁は、粒子凝集を防止する役割を果たす。
【００５０】
ナノ粒子電荷は、高繰返し率パルスレーザーアブレーションにおけるマルチパルス効果から生じる可能性がある。一般に、各単一のレーザー発射は、十分に強力である場合、イオン、電子、中性物及び粒子の混合物を生成するが、前記混合物は、多くの場合「プルーム」と呼ばれる。かかる混合物は、レーザー強度がアブレーション閾値を越える場合に生成され得る。しかし、単一のレーザー発射により生成されたプルームについては、電荷は大部分が蒸気部分にあり、一方で固体部分、特にナノ粒子は、大部分が中性のままである。１０マイクロ秒未満のパルス間隔を有する高繰返し率レーザーを用いる場合、固体部分、特にプルームのナノ粒子は、焦点体積から離れる前に多数のレーザー発射を受ける。この時間の間、粒子が強力レーザー場によって帯電する。
【００５１】
かかるコロイドにおいて、粒子は凝集に対して準安定に分散し続ける。図３（ｂ）に示されるように、粒子が障壁の高さより大きいＫＴに相当する十分な熱エネルギーを得る場合、粒子は、引力トラップ及び凝集体に落ち込む。このメカニズムは、図３（ｂ）において上方の破線の横線により示され、長パルス幅及び高パルスエネルギーを使用する場合に水中におけるパルスレーザーアブレーションにより生成する金属コロイド用粒子が凝集する傾向がある理由を部分的に説明することができる。例えば、水破壊閾値は、約１×１０13Ｗ／ｃｍ2であり、１ｎｓのパルスについての約１０4Ｊ／ｃｍ2のフルエンスに相当する。水破壊閾値を下回るフルエンスによっても、かかる長いレーザーパルスの照射下での水は、容易にその沸点を超えた高温に加熱され得る。その加熱は、アブレーションの間に視覚的に観察され得る泡によって明らかにされる。従って、コロイド用粒子は、反発障壁を克服するように十分な熱エネルギーを得ることができる。コロイド用粒子は、引力トラップ及び凝集体に落ち込む。同じ理由のため、高繰返し率レーザー、例えば１０ｋＨｚ以上でのレーザービームの急速なラスターは、水中の蓄熱を減少させることができる。また、水流は、レーザーの焦点体積に新鮮で且つ冷たい水を送り込むことにも役立つ可能性がある。
【００５２】
幾つかの実施態様において、アブレーションは、相対的に低いフルエンスで行われる。１ｐｓのパルスで約１０Ｊ／ｃｍ2のフルエンスは、過度であり得る。例えば、かかる過度のフルエンスは、アブレーション閾値（例えば、ほとんどの金属について１ｐｓのパルスで約１Ｊ／ｃｍ2）よりも数倍大きくてよい。過度のフルエンスにより、アブレート材料は大部分が蒸発し、その後、蒸気は、液体の静水圧下で再核生成される。換言すれば、相展開の経路は、固体バルクから蒸気へ、次いで固体粒子へというものである。その結果、核生成の際にコロイド用粒子の詰まったネットワークが形成し、それが凝集に対する安定性を低下させる。
【００５３】
真空中及び低圧雰囲気ガス中における超短パルスレーザーアブレーションの研究（文献１）において、アブレーション閾値付近の低レーザーフルエンス、典型的にはほとんどの金属について約３Ｊ／ｃｍ2未満で、アブレートされた材料は、外的に印加された高圧によって強制的核生成が生じることなく自動的にコロイド用粒子の集合として存在することが分かった。この所見は、臨界点相爆発に基づいて後で説明されるが（文献３：T. E. Itina, M. E. Povarnitsyn, K. Gouriet, S. Noel, J. Hermann, "Mechanisms of nanoparticle formation by short laser pulses", Proceedings of SPIE, Vol. 6458, 64581U-1, (2007)）、その場合、固体バルクが材料の臨界点付近でナノ粒子に崩壊する。このメカニズムは、相展開経路が固体バルクから固体ナノ粒子へというものであるナノ粒子生成用途のための好ましい低フルエンスを部分的に説明することができる。
【００５４】
例えば、金属又は金属合金コロイド用粒子を作製するための各種実施態様において、パルス強度は、約１０11〜１０13Ｗ／ｃｍ2、好ましくは約１０12〜低１０13Ｗ／ｃｍ2、最も好ましくは約０．５×１０12〜３×１０12Ｗ／ｃｍ2の範囲であってよい。更に、上記のフルエンス値では、少なくとも約１０ｍＬ／秒の表面及び液体流量での０．０１〜１ｍ／ｓの速度によるラスター操作が適切である。例えば、１ｐｓパルスでの最小フルエンスは、約０．１Ｊ／ｃｍ2であってよい。
【００５５】
図４は、金コロイド粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像である。試料は、ＴＥＭ試料採取グリッド上のコロイドの滴を乾燥させることにより得られる。集合は大部分が４〜５ｎｍのナノ粒子であり、且つ、約３０〜５０ｎｍの直径を有する顕著により大きなナノ粒子があることが観察される。この二峰性粒度分布は、真空中におけるＮｉ等の他の材料の超短パルスレーザーアブレーションによって生成したナノ粒子において観察されたものと一致する（文献１）。粒度分布は、例えばガウスビームプロファイル（Gaussian beam profile）の代わりにフラットな横方向のビームプロファイルを用いることにより改善され得る。しかし、多くの用途について、二峰性粒度分布は性能に影響を及ぼす。
【００５６】
低フルエンスによる粒子の低生成率を補償するため、高繰返し率レーザーもまた好ましい。これは、高繰返し率の源、例えば約０．１μ秒以下の時間間隔を有する少なくとも２つのパルスを生成する源の使用の更に別の理由である。
【００５７】
ＩＭＲＡ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．は、幾つかのファイバ型チャープパルス（chirped pulse）増幅システムを開示した。例えば、かかるシステムは、１００ｋＨｚ〜１ＭＨｚ超の高繰返し率と、５００フェムト秒〜数ピコ秒の超短パルス幅と、１０Ｗ超の平均電力とを提供する。例えば、ファイバ型チャープパルス増幅システム（ＦＣＰＡ）が、各種実施態様において使用され得る。ＩＭＲＡ Ａｍｅｒｉｃａから市販されているＤ−１０００は、１Ｗの平均電力で、マイクロジュールパルス及び１００ＫＨｚ〜５ＭＨｚの範囲に亘る調整可能な繰返し率を提供する。出力パルス幅は、１ｐｓ未満である。これらのレーザーは、特に現行の用途に適している。標準固体レーザーの典型的な１０Ｈｚ〜１ｋＨｚの繰返し率と比較して、ファイバ型システムは、粒子の生成率を１桁改善させることができる。２００ｋＨｚの繰返し率、１パルスにつき１０マイクロジュールのパルスエネルギー（２Ｗの平均電力）、及び５００ｆｓのパルス幅により、１センチメートル当たりの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を有する金コロイド粒子の２０ｍＬのコロイドが３０分間で生成され得る。これは、文献４（S. Barcikowski, A. Hahn, A. V. Kabashin, B. N. Chichkov, "Properties of nanoparticles generated during femtosecond laser machining in air and water", Applied Physics A, Vol. 87, 47, 2007）におけるもの等の報告されたレーザーアブレーションに基づく方法よりも非常に速い速度である。１０Ｗの典型的な平均電力によって、且つ、スプリットビームによって、生成速度を５倍増加させることが可能である。
【００５８】
本明細書に開示される方法は、銀及び銅に適用され得る。図５は、ＩＢ族の３種全ての元素のナノ粒子の吸収スペクトルを示しているが、全ては、顕著なプラズモン共鳴ピークを示す。
【００５９】
各種実施態様の別の一態様は、各種のプラズモン共鳴波長を有する金属合金コロイド用粒子を提供することである。真空中におけるＮｉＦｅ合金の超短パルスレーザーアブレーションの以前の研究（文献２）において、アブレーション閾値の近くの低いフルエンスによって、生成物ナノ粒子が新規の合金ターゲットと同じ合金組成を有することが見出された。これは、固体バルクのその臨界点付近のナノ粒子への崩壊としても理解されるが、その間、合金相分離が阻害される。この知見が水中におけるアブレーションに適用される場合、各種合金組成と各種プラズモン共鳴波長とを有するＩＢ族金属の合金ナノ粒子のコロイドが得られる。
【００６０】
図６は、０（即ち、純粋なＡｇ）から１００（即ち、純粋なＡｕ）パーセントまで変化する５つのＡｕ組成を有する一連のＡｕＡｇ合金コロイドの吸収スペクトルを示す。その合金組成を有するプラズモン共鳴波長のシフトは明らかである。図７は、ＡｕＡｇ及びＡｕＣｕを含む幾つかのかかるＩＢ族合金コロイド粒子の像である。各種の色は、種々のプラズモン共鳴波長から生じる。
【００６１】
コロイド状ナノ粒子は、コロイド用粒子粉末として回収することができ、コロイド用粒子ペースト又はコロイド用粒子インクに濃縮することができ、固体保持体に分散させることができ、薄膜又は三次元構造に集めることもできる。コロイド状ナノ粒子のこれらの集合又は改変の用途としては、導電ペースト、インク、触媒、フォトニック結晶、化学的及び生物学的センサ、医療及びライフサイエンス製品、環境的製品（例えば、抗バクテリア剤、脱臭剤、浄水剤）が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００６２】
レーザーアブレーション法によって作製した金コロイド粒子と市販の金コロイド粒子との比較を透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）にて行なった。レーザーアブレーション法によって作製した金コロイド粒子のＴＥＭ像を図８（サンプルＡ），図９（サンプルＢ）、図１０（サンプルＣ）に示し、市販の金コロイド粒子のＴＥＭ像を図１１に示した。
【００６３】
サンプルＡの金コロイド粒子は、平均粒子径（ａｖｇ）１２．５ｎｍ、標準偏差（ｓｄｅｖ）６．３であった。粒度分布は約２〜６０ｎｍおよび６５ｎｍにて認められた。
サンプルＢの金コロイド粒子は、平均粒子径２１．９ｎｍ、標準偏差６．３であった。粒度分布は約１０〜３８ｎｍおよび６６ｎｍにて認められた。
サンプルＣでは、図１０に示したように、１０〜２６ｎｍ，４１〜６８ｎｍの金コロイド粒子の分布が認められた。
これらサンプルＡ〜Ｃは、粒度分布の範囲が不連続な種々の粒度を有する金コロイド、即ち「粒度分布が異なる複数の粒子群」を有する金コロイドであると認められた。
【００６４】
一方、市販の金コロイド粒子は、図１１に示したように、２６．３〜３７．５ｎｍの粒子が確認でき、凡その粒度分布は２５〜４０ｎｍの範囲のみであると認められた。また、当該金コロイド粒子は、界面活性剤のような高分子の中に存在しているものと認められた。当該高分子が存在することで、当該金コロイド粒子は凝集し易くなると考えられる。本発明のコロイド剤（サンプルＡ〜Ｃ）では、分散媒中における金コロイド粒子の他は何れの物質を含まないため、凝集し難くなっていることが判る（図８〜１０）。
【００６５】
〔実施例１〕
本実施例では、当該ライフサイエンス製品として、分析対象物を定量するための標識としてのコロイド剤として使用する場合について説明する。
【００６６】
マウス由来の抗テストステロン抗体(Acris Antibodies社)を、上述したレーザーアブレーション法により作製した金コロイド（実施例１−１，１−２）へ修飾した。
（１−１）ポリプロピレン（ＰＰ）製の遠心管に適量の金コロイド液を投入し、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加えて１分間攪拌した。
（１−２）蒸留水で希釈し、抗テストステロン抗体溶液を上記遠心管に攪拌しながら添加した。
（１−３）室温で１０分間静置した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を加え軽く攪拌した。
（１−４）８０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿させた後、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させ、トリス緩衝液を２０ｍＬ加えた。
（１−５）８０００ｒｐｍで１０分間遠心し沈殿させた後、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。
（１−６）分光光度計でλ520の吸光度を測定し回収量を確認した。
【００６７】
同様にマウス由来の抗テストステロン抗体(Acris Antibodies社)を市販の直径４０ｎｍの金コロイド（比較例１）（British BioCell International社）へ修飾した。
（２−１）ＰＰ製の遠心管に適量の金コロイド液を入れ、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ８．５）を加えて１分間攪拌した。
（２−２）蒸留水で希釈し、抗テストステロン抗体溶液を、上記遠心管に攪拌しながら添加した。
（２−３）室温で１０分間静置した後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を加え軽く攪拌した。
（２−４）５０００ｒｐｍで１０分間遠心して沈殿させた後、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させ、保存用トリス緩衝液を２０ｍＬ加えた。
（２−５）５０００ｒｐｍで１０分間遠心し沈殿させた後、上清を１ｍＬ程度残して取り除き、残した上清に沈殿を分散させた。
（２−６）分光光度計でλ520の吸光度を測定し回収量を確認した。
【００６８】
上記の金コロイド修飾済み抗テストステロン抗体をグラスファイバーコンジュゲートパッド（ミリポア社）へ塗布し、風乾した。
【００６９】
テストステロン-ＢＳＡ複合体２．０ｍｇ/ｍＬをニトロセルロースメンブレン（ミリポア社）に塗布して風乾し、ラインＡ（テストライン）とした。また、ウサギ由来の抗マウスＩｇＧ抗体０．５ｍｇ/ｍＬを同一のニトロセルロースメンブレンに塗布して風乾し、ラインＢ（コントロールライン）とした。このニトロセルロースメンブレン，グラスファイバーアプライパッド，コンジュゲートパッド，セルロース吸収パッドを台紙に貼り合わせ、５ｍｍ幅に切断した後、専用のハウジング内に収納して、イムノクロマトグラフィー試験片（分析手段）を作製した。
【００７０】
テストステロン（関東化学社）を２％エタノール含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、０．１ｍＭ，１０μＭ，１μＭ，０．１μＭ，１０ｎＭ，１ｎＭ，０．１ｎＭ，１０ｐＭ濃度の標準溶液を作製した。
【００７１】
当該標準溶液を５％濃度で展開液（トリス緩衝液，ｐＨ７．５、塩化ナトリウム，ショ糖，界面活性剤，ブロッキング剤を含む）に加え攪拌した後、上記のイムノクロマトグラフィー試験片のアプライパットへ１００μＬ滴下し、ニトロセルロースメンブレンへ展開した。
【００７２】
発色量を専用の読取機（イムノメジャーＰＣＢ−ＳＫ１００（アイシン精機株式会社製））にて測定し、読取値をグラフにプロットし、最小二乗法により４パラメータロジスティック曲線に近似しこれを検量線とした。
【００７３】
レーザーアブレーション法により作製した金コロイド（実施例１−１，１−２）および市販の金コロイド（比較例１）において、それぞれから得られた検量線の違いを比較した。検量線を図１２に示す。尚、検量線式を以下に示す。
【００７４】
〔数１〕
シグモイド曲線ｙ（sigmoidal）＝ｄ＋（（ａ−ｄ）/（１＋（ｘ/ｃ））＾ｂ）
（ｘは試料中の被験物質濃度、ｙはシグナル相対比を示す）
【００７５】
【表１】
【００７６】
この結果、レーザーアブレーション法により作製した本発明の金コロイドは、界面活性剤を同じ条件で添加した市販の粒子径サイズの大きな金コロイドと同等の感度を示すことが判明した。
【００７７】
（実施例２）
実施例１と同様にマウス由来の抗テストステロン抗体（Acris Antibodies社）を市販の直径２０ｎｍの金コロイド（比較例２）（British BioCell International社）へ修飾した。
【００７８】
実施例１で使用したレーザーアブレーション法により作製した金コロイド（実施例１−１，１−２）で作成した金コロイド修飾済み抗テストステロン抗体と、比較例２の金コロイド修飾済み抗テストステロン抗体とを実施例１同様にニトロセルロースメンブレンに塗布し、イムノクロマトグラフィー試験片を作製した。
【００７９】
テストステロン（関東化学社）を２％エタノール含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、１０００ｎｇ／ｍＬ，１００ｎｇ／ｍＬ，１０ｎｇ／ｍＬ，１ｎｇ／ｍＬ，１００ｐｇ／ｍＬ，１０ｐｇ／ｍＬ，０．１ｐｇ／ｍＬ濃度の標準溶液を作製した。
【００８０】
当該標準溶液をイムノクロマトグラフィー試験片のアプライパットへ１００μＬ滴下し、ニトロセルロースメンブレンへ展開した。
【００８１】
発色量をイムノメジャーにて測定し、読取値をグラフにプロットし、最小二乗法により４パラメータロジスティック曲線に近似しこれを検量線とした。
レーザーアブレーション法により作製した金コロイド（実施例１−１，１−２）および市販の金コロイド（比較例１）において、それぞれから得られた検量線の違いを比較した。検量線を図１３に示す。尚、検量線式は数１と同様である。
【００８２】
【表２】
【００８３】
この結果、レーザーアブレーション法により作製した本発明の金コロイドは、比較例２の小さな粒子径サイズの金コロイドと比べ、ＩＣ50比較で６．７〜４．９倍の高い感度を示すことが判明した。つまり一般に検出反応の分散を良くしようと粒子径を小さくすると検出感度の低下が起こるが、レーザーアブレーション法により作成した本発明の金コロイドは検出感度の低下を起こさずに分散を高め、反応時間、反応安定性の向上につながることが分かった。
【００８４】
（実施例３）
比較例１，２の金コロイドをMalvernsya社Zetasizer Ver.6.01にて粒子径およびゼータ電位を測定した。
【００８５】
また、レーザーアブレーション法により作製した金コロイド（実施例１−１（粒子径１３．９ｎｍ），実施例１−２（粒子径２２．８ｎｍ））をＴＥＭ（JEOL 2010F analytical electron microscope：日本電子（株））にて撮影した。この画像を画像解析ソフトIGOR Proにて粒子径を測定した。RMS（Root Mean Square）の値を下表に示す。さらに、ゼータ電位を比較例１，２の金コロイドと同様の手法で測定した。
【００８６】
【表３】
【００８７】
この結果、実施例１の金コロイドのゼータ電位の絶対値は、比較例１，２の金コロイドのゼータ電位の絶対値と同等であることが判明した。即ち、本発明の金コロイドは、界面活性剤などの添加剤を含有しない状態で、市販の金コロイドと同等のゼータ電位を有するものと認められる。
【産業上の利用可能性】
【００８８】
本発明のコロイド剤およびイムノクロマトグラフキットは、色調観察や発光や蛍光の強度等を測定して標識の存在を検出することにより、標識した分析対象物の定量あるいは定性を行なうことに利用できる。
【符号の説明】
【００８９】
１ レーザービーム
２ レンズ
３ 振動ミラー
４ ターゲット
５ 液体
６ 容器
７ 運動ステージ
８ コロイド用粒子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザーアブレーション法によって作製することにより粒度分布が異なる複数の粒子群を有し、前記粒度分布のピークを少なくとも２〜４０ｎｍ未満、および、４０ｎｍ以上〜１００ｎｍの範囲のそれぞれに有するコロイド用粒子と、分散媒としての水と、のみからなる、分析対象物を標識するコロイド剤。
【請求項２】
前記コロイド用粒子が金属コロイド粒子および非金属コロイド粒子および樹脂コロイド粒子の何れか１つである請求項１に記載のコロイド剤。
【請求項３】
前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である請求項２に記載のコロイド剤。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載のコロイド剤と、少なくとも前記分析対象物および前記コロイド剤を毛管現象により展開させて前記分析対象物を免疫学的に分析する分析手段と、を有するイムノクロマトグラフキット。
【請求項１】
レーザーアブレーション法によって作製することにより粒度分布が異なる複数の粒子群を有し、前記粒度分布のピークを少なくとも２〜４０ｎｍ未満、および、４０ｎｍ以上〜１００ｎｍの範囲のそれぞれに有するコロイド用粒子と、分散媒としての水と、のみからなる、分析対象物を標識するコロイド剤。
【請求項２】
前記コロイド用粒子が金属コロイド粒子および非金属コロイド粒子および樹脂コロイド粒子の何れか１つである請求項１に記載のコロイド剤。
【請求項３】
前記金属コロイド粒子が金コロイド粒子である請求項２に記載のコロイド剤。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか一項に記載のコロイド剤と、少なくとも前記分析対象物および前記コロイド剤を毛管現象により展開させて前記分析対象物を免疫学的に分析する分析手段と、を有するイムノクロマトグラフキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図１２】
【図１３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図１２】
【図１３】
【図４】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公開番号】特開２０１２−１３６６８（Ｐ２０１２−１３６６８Ａ）
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２２０８２２（Ｐ２０１０−２２０８２２）
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（０００００００１１）アイシン精機株式会社 (5,421)
【公開日】平成２４年１月１９日（２０１２．１．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（０００００００１１）アイシン精機株式会社 (5,421)
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