ヘリコバクター・ビリスの特異的抗原及びその抗体
【課題】ヘリコバクター・ビリス感染の検出ができる特異的な抗原、及び特異的な抗体を提供することにある。
【解決手段】ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原。ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体。ヘリコバクター・ビリス以外の細菌の抗原と反応しない上記モノクローナル抗体。ＢＲ５９（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９０）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。ＢＲ７１（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９１）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。ハイブリドーマＢＲ５９（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９０）。ハイブリドーマＢＲ７１（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９１）。
【解決手段】ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原。ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体。ヘリコバクター・ビリス以外の細菌の抗原と反応しない上記モノクローナル抗体。ＢＲ５９（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９０）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。ＢＲ７１（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９１）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。ハイブリドーマＢＲ５９（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９０）。ハイブリドーマＢＲ７１（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９１）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘリコバクター・ビリスの特異的抗原及びそのモノクローナル抗体及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌においてはヘリコバクター・ピロリが発癌に強く関与していることが疫学的調査から明らかになっている。スナネズミを用いたモデルにおいてもヘリコバクター・ピロリ感染が化学発癌剤による腺胃癌の発生を増強し、除菌によりその効果が減弱することが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリ感染と胃疾患に関する検討が進むにつれて、ほかのヘリコバクター属の感染と臓器の病変との関係が検討されるようになってきた。ヘリコバクター・ビリスは胆汁中で生育できることから、胆道系疾患、特に腫瘍との関係が注目されている。マウスにおいては肝炎、肝癌、炎症性腸疾患を引き起こすことが報告されている（非特許文献２−４）。
【０００４】
ヒト胆道系疾患とヘリコバクター・ビリスの関係は胆汁をサンプルとしてＰＣＲによる検出が行なわれ、胆道系悪性腫瘍に高率で検出された。ヒトの胆汁中にヘリコバクター・ビリスが検出されたことは、ヒトでも肝疾患、胆道系疾患、炎症性腸疾患に関与していることが考えられる。
【０００５】
ヘリコバクター・ビリスの検出方法としては糞便、胆汁を採取してＰＣＲや培養による確認が行われており、なかでも糞便を用いた１６Ｓ ｒＲＮＡ中の特異配列をＰＣＲにより増幅して検出する感染診断法がマウスの感染を診断するために用いられている（非特許文献５、６）。より簡便に検出する方法として蛍光ＰＣＲが報告されている（非特許文献７、８）。また、種々の動物の糞便をサンプルとしてＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による網羅的なヘリコバクター属の検出法が報告されている（非特許文献９）。
ヒトにおいては、胆汁をサンプルとして１６Ｓ ｒＲＮＡの特異領域をＰＣＲにより増幅し、検出する方法が用いられている（非特許文献１０、１１）。
【０００６】
しかし、胆汁の採取は患者への負担が大きく、糞便や血漿（あるいは血清）を用いた簡便な方法の確立が望まれている。血中の抗体価を測定する方法は、ヒトの場合、他のヘリコバクター属による感染、特にヘリコバクター・ピロリ感染者が多いため、ピロリ菌体破砕物で抗体を吸収させた後に測定している（非特許文献１２、１３）。ヘリコバクター・ビリスの外膜タンパク質をウェスタンブロッティングにより検討した結果、ヘリコバクター・ビリスの外膜タンパク質はヘリコバクター・ピロリに対する抗体と交差反応性を示さないことが報告されている。特に４６ｋＤａ付近に特徴的なタンパク質が存在していることを報告している（非特許文献１４）。外膜たんぱく質に対する抗体価はヘリコバクター・ビリス感染により引き起こされた肝炎マウスで上昇することが確認されている（非特許文献１５）。
【０００７】
抗体価を特異的に検出する抗原として、ヘリコバクター・ピロリにおいては２６ｋＤａ（非特許文献８）のタンパク質が報告されている。病態との関連ではヘリコバクター・ピロリで血中抗体によるイムノブロットで検出されるバンドの中で１２５ｋＤａ（ＣａｇＡ）、８７ｋＤａ（ＶａｃＡ）、３５ｋＤａ（ｕｎｋｎｏｗｎ）と胃潰瘍の関係が検討され、１２５ｋＤａおよび８７ｋＤａのバンドで８３．３％（ｎ＝１２）、３５ｋＤａは１００％の割合で胃潰瘍患者から検出されたと報告されている（非特許文献１６）。
しかし、ヘリコバクター・ビリスでは、どの特異抗原に対する抗体価の上昇が感染あるいは病態と一致するかは確認されていない。ヘリコバクター・ビリスはヘリコバクター・ピロリと類似した、強いウレアーゼ活性とＣａｇＡ、ＶａｃＡを有していることから、これらが疾患と関連している可能性は容易に類推されるが、他のヘリコバクター属の菌と交差反応性を示す可能性が高く、抗体価の上昇と肝疾患、胆道系疾患、炎症性腸疾患との関連性は不明である。
【０００８】
Ｉｒｙｎａ Ｋｏｒｎｉｌｏｖｓ｀ｋａ等（特許文献１）は１３種のタンパク質とそれらを認識する抗体を記載しているが、本発明の抗原及び抗体とは異なるものである。また、Ｓ．Ｆｅｎｇ、等は１６７ｋＤａのタンパク質をヘリコバクター・ビリスの特異抗原として報告している（非特許文献１７）。この抗原を用いて、抗体価を測定する感染診断がマウスで報告されているが（非特許文献１８、１９）、本発明の抗原とは異なるものである。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０２／１０２８４２号パンフレット
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｎ．ら，「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ」，２０００年，６０巻，p.１５１２−１５１４
【非特許文献２】Ｊ．Ｇ．Ｆｏｘ、等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３巻、４４５−４５４頁、１９９５年
【非特許文献３】Ｎ．Ｈ．Ｓｈｏｍｅｒ、等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５巻、４８５８−４８６４頁、１９９７年
【非特許文献４】Ｃ．Ｌ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ、等、Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ．４８巻、３３４−３３９頁、１９９８年
【非特許文献５】Ｍ． Ｍａｈｌｅｒ、等、Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ． ４８巻、８５−９１ページ、１９９８年
【非特許文献６】Ｌ． Ｚｅｎｎｅｒ、Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ２２巻、４１−６１ページ１９９９年
【非特許文献７】Ｚ．Ｇｅ、等、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３９巻、２５９８−６０２ページ、２００１年
【非特許文献８】Ｎ．Ｌ．Ｄｒａｚｅｎｏｖｉｃｈ、等 Ｃｏｍｐ． Ｍｅｄ．、５２巻、３４７−５３ページ、２００２年、
【非特許文献９】Ｗ．Ａ． Ａｌ−Ｓｏｕｄ、等、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２巻、７６５−７１ページ、２００３年
【非特許文献１０】Ｊ．Ｇ．Ｆｏｘ、等、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１４巻、７５５−７６３頁、１９９８年
【非特許文献１１】Ｎ．Ｍａｔｓｕｋｕｒａ、等、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９３巻、８４２−８４７頁、２００２年
【非特許文献１２】Ｉ．Ｎｉｌｓｓｏｎ、等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５２巻、９４９頁、２００３年
【非特許文献１３】Ｏ．Ａｎａｎｉｅｖａ、等、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻、１１６０頁、２００２年
【非特許文献１４】Ｚ．Ｇｅ、等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６９巻、３５０２頁、２００１年
【非特許文献１５】Ｊ．Ｇ．Ｆｏｘ、等、Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５４巻、５７１−７頁、２００４年
【非特許文献１６】Ｐ．Ａｕｃｈｅｒ等、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３６巻、９３１頁、１９９８年
【非特許文献１７】Ｓ．Ｆｅｎｇ、等、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻、６２７−３２頁、２００２年
【非特許文献１８】Ｌ．Ｖ．Ｋｅｎｄａｌｌ、等、Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５４巻、４４−４８頁、２００４年
【非特許文献１９】Ｓ．Ｆｅｎｇ、等、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１巻、１０９４−９頁、２００４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記現状を鑑みヘリコバクター・ピロリに代表されるヘリコバクター属の細菌を含む細菌抗原と交差反応性を有しないヘリコバクター・ビリスの抗原及びこの抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体の作製と、生体中のヘリコバクター・ビリス感染を検出するための方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ヘリコバクター・ビリスに特異的な抗原の探索のため、ヘリコバクター・ビリス菌体及びヘリコバクター・ピロリ菌体を抗原として、各々の菌体で免疫したマウス抗血清によるウエスタンブロティングを行ったところ、マウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清では２５ｋＤａ以下のバンドは検出されなかったが、マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清では検出された。このことより、ヘリコバクター・ビリスの菌体抽出物は２５ｋＤａ以下に交差反応性のない特異的な抗原があることが推測された。そこでヘリコバクター・ビリスの抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、その中から２５ｋＤａ以下の抗原と反応し、かつヘリコバクター・ビリス以外のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しないモノクローナル抗体を発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち本発明はヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原である。また第２の発明はヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体である。この抗原及び抗体は、Ｉｒｙｎａ Ｋｏｒｎｉｌｏｖｓ｀ｋａ等（特許文献１）の発表した１３種の蛋白と異なる抗原及び抗体である。さらに本発明はヘリコバクター・ビリス以外のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しないモノクローナル抗体を含むものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗原による抗体価の測定は抗ピロリ抗体に影響されない、ヘリコバクター・ビリスに特異的な検出が可能であった。
本発明の抗原を用いて製造できるモノクローナル抗体はヘリコバクター・ビリスのみと反応し、交差反応性の可能性のある他のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しなかった。
以上のことからヘリコバクター・ビリスの特異的な免疫診断法が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
上述のようにヘリコバクター・ビリス菌体及びヘリコバクター・ピロリ菌体を抗原として、各々の菌体で免疫したマウス抗血清によるウエスタンブロティングを行ったところ、マウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清では２５ｋＤａ以下のバンドは検出されなかったが、マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清では検出された。このことより、ヘリコバクター・ビリス菌体抽出物は２５ｋＤａ以下に交差反応性のない特異的な抗原があることが推測された。そこで、モノクローナル抗体を作製し、２５ｋＤａ以下の抗原を認識する抗体を選抜した。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体はヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａ、好ましくは１２ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、本発明のハイブリドーマより産生することができ、例えば本発明のハイブリドーマを培養し、その培養液から得ることが出来る。しかし本発明のモノクローナル抗体の製造方法としては特に限定されず、例えば、遺伝子工学的に得られたものであっても、ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に特異的に反応することが出来る限り本発明の範囲に含まれる。
また、本発明のモノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ビリス以外の細菌の抗原と反応しないという特徴を備えている。ここで細菌とは特に制限は無いが、好ましくはヘリコバクター属の細菌であり、より好ましくはヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ヘパティカス、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ムステラエまたはヘリコバクター・シナエディである。本発明者らは本発明のモノクローナル抗体がその他の細菌としてバクテロイデス・ブルガタス、エシェリヒア・コリ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ブレビバチルス・ブレビスまたはキャンピロバクター・ジェジュニの抗原と反応しないことも確認している。
本発明の上記モノクローナル抗体の認識するヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原の製造方法は特に限定されず、例えば遺伝子工学的に得られたものであっても分子量１０〜１６ｋＤａでヘリコバクター・ビリスを検出することが出来る限り本発明の範囲に含まれる。実施例９に示したように、本発明のモノクローナル抗体とその認識抗原を用いた抗体価測定のＥＬＩＳＡでは、マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清のみの抗体価が高かった。従ってマウス抗ヘリコバクター・ビリス血清中にこの抗原に対する抗体が存在することから、抗体価測定によりヘリコバクター・ビリス感染を診断できることが確認できた。
また、この抗原のモノクローナル抗体との反応性はアルカリ処理・熱処理には安定であり、酸処理にはやや不安定でエタノール処理には不安定であることを確認している。
【００１７】
本発明のハイブリドーマは、ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体を産生するもので、ヘリコバクター・ビリスで免疫した動物の脾細胞又はリンパ節細胞と、骨髄腫細胞を融合して得られるものである。
本発明のハイブリドーマは、公知の細胞融合法により作製できる。即ち、ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原を免疫原としてヒト以外の動物を免疫し、その脾細胞又はリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、その中からヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより、本発明のハイブリドーマを得ることができる。
上記ヒト以外の動物は特に制限は無いが、マウス・ラットが好ましい。
【００１８】
また上記被免疫動物を免疫する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、マウスを免疫する場合、1回に１〜１００μｇ、好ましくは５０〜１００μｇの免疫用抗原を同容量の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバント等で乳化して、上記被免疫動物背部、腹部の皮下又は腹腔内に２〜７週ごとに３〜６回接種する方法等を挙げることができる。
本発明においては、上記被免疫動物を免疫後、抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓又はリンパ節を摘出し、公知の細胞融合法に従って、融合促進剤（例えばポリエチレングリコール：ＰＥＧ）の存在化で、これらの組織に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることができる。
【００１９】
特に好ましいハイブリドーマは、ヘリコバクター・ビリスの菌体抽出物を投与したラットの脾細胞とミエローマ細胞Ｐ−３（Ｘ６３−Ａｇ８）の融合を行い、融合細胞のスクリーニング、限界希釈法によるクローニングを行なったハイブリドーマＢＲ５９（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９０）。
及びＢＲ７１（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９１）である。
以下に実施例を含めて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでない。
【実施例】
【００２０】
実施例１．マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清の調製
（１）菌体の培養法
ヘリコバクター・ビリス（ＡＴＣＣ５１６３０）及びヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）は、それぞれ５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地（ディフコ社製）を用いて３７℃で微好気性環境下にて３〜４日培養した。
【００２１】
（２）菌体抽出法
実施例１−（１）で得られたヘリコバクター・ビリス及びヘリコバクター・ピロリのコロニーをそれぞれ白金耳等でかきとり、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に懸濁した。懸濁液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する操作を３回繰り返して菌体を洗浄し、０．６％Ｎ−ラウロイルサルコシン−２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に懸濁した。その後、超音波破砕機（超音波破砕機 東湘電機社製、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ）を用いて氷冷下で超音波処理して菌体を破砕し１時間室温でインキュベーションした。ついで４℃１５分間１００００ｘｇで遠心分離し、上清を菌体抽出物とした。
【００２２】
（３）マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清の作製
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ビリス及びヘリコバクター・ピロリの菌体抽出物をそれぞれフロイントの完全アジュバントで乳化して、菌体タンパク濃度が２０μｇ／ｍＬになるように調製した。これをＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌマウスの腹腔内に免疫毎０．２ｍＬずつ投与した。初回免疫後１４日目と２８日目にヘリコバクター・ビリスの菌体抽出物をフロイントの不完全アジュバントで乳化して追加免疫を行った。最終免疫から３日目に心臓採血により血液を採集し、３０分静置した後４℃１５分間１００００×ｇで遠心分離し、上清を各々マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清とした。
【００２３】
実施例２．マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清を用いたヘリコバクター・ビリスに特異的な抗原の探索
（１）菌体抽出物の電気泳動
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行った。サンプルは、実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ビリス及びヘリコバクター・ピロリのそれぞれの菌体抽出物を、還元剤で処理しない常法に従い調製した。バッファ−は、ＭＥＳバッファーを、分子量マーカーはＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（インビトロジェン社製）を用いた。
【００２４】
（２）セミドライウェスタンブロッティング法
実施例２―（１）に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、セミドライウェスタンブロッティング法によりニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和した溶液に１時間浸してマスキングを行った後、一次抗体としてマウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清と２時間反応させた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで４回洗浄後、各々二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製、１：４０００）と反応させた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで５回洗浄後、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）（ダコ社製）により発色させた。
【００２５】
（３）ヘリコバクター・ビリス特異的な抗原の探索の結果
実施例２−（２）のウェスタンブロッティングの結果を図１に示した。マウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清で染色された交差反応性を示すと思われる抗原は、２５ｋＤａ以上に認められた（レーン２）。マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清では２５ｋＤａ以下にもバンドが検出された（レーン３）。このことより、ヘリコバクター・ビリス菌体抽出物は、２５ｋＤａ以下にヘリコバクター・ピロリと交差反応性のない特異的な抗原があることが推測された。
【００２６】
実施例３．ヘリコバクター・ビリスの抗原を認識するモノクローナル抗体の作製と選択
（１）ヘリコバクター・ビリスの免疫及び細胞融合（脾臓法）
実施例１―（２）にて調製した免疫原（菌体抽出物）をフロイントの完全アジュバントで乳化して、菌体タンパク濃度が２０μｇ／ｍＬになるように調製した。これをＳＤラットの腹腔内に０．２ｍＬ投与した。初回免疫後１４日目と３２日目に菌体抽出物をフロイントの不完全アジュバントで乳化して追加免疫を行った。最終免疫から１６日目にラット脾細胞を摘出し、脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞Ｐ−３（Ｘ６３−Ａｇ８）を５：１の割合で混合し、５０％ＰＥＧ４０００を用いて融合した後、ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択培養した。
【００２７】
（２）ＥＬＩＳＡ方法；
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ビリス菌体抽出物（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（パッカード社製）を、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え２時間室温で静置し、その後一次抗体として各穴に融合細胞の培養上清液１００μＬを添加し、２時間反応させた。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ（ダコ社製、１：４０００）１００μＬを添加した。室温で1時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００２８】
（３）抗ヘリコバクター・ビリスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択
細胞融合後１５日目に、実施例３−（２）のＥＬＩＳＡと同様の方法で培養上清中の抗体活性を測定した。免疫原に反応する抗体を産生するハイブリドーマクローンをＥＬＩＳＡの吸光値が０．５以上を目安として選択した。各クローンを限界希釈法により２度クローニングを行い、その都度抗体活性の有無を、ＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。陽性クローンに対して、シングルセルクローニングを行い、抗体産生が安定である抗ヘリコバクター・ビリス抗体を産生している多くのハイブリドーマクローンを得た。その後、得られたハイブリドーマを２５ｃｍ２、７５ｃｍ２フラスコに移し、培養した。継代後に安定して抗ヘリコバクター・ビリス抗体を産生するハイブリドーマは１８株であった。
【００２９】
実施例４．抗ヘリコバクター・ビリスの２５ｋＤａ以下の抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択
（１）菌体抽出物の電気泳動、セミドライウェスタンブロッティング
実施例２−（１）に従ってヘリコバクター・ビリスの菌体抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行い、 実施例２−（２）に従いセミドライウェスタンブロッティングを行なった。ハイブリドーマの培養上清と２時間反応させた後、ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで４回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ抗体（ダコ社製、１：４０００）と反応させた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで５回洗浄後、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）（ダコ社製）により発色させた。
【００３０】
（２）ハイブリドーマの選択結果
セミドライウェスタンブロッティングの結果を図２に示した。１８株の中から２５ｋＤａ以下の抗ヘリコバクター・ビリス抗原を認識するモノクローナル抗体を安定に産生しているハイブリドーマを選別した。その結果、ＢＲ５９（レーン１）及びＢＲ７１（レーン２）の２種のハイブリドーマが得られた。
【００３１】
実施例５．ＢＲ５９とＢＲ７１の認識抗原の確認
（１）ＥＬＩＳＡ方法
ＢＲ５９抗体の認識するヘリコバクター・ビリス認識抗原を捕捉し、ＢＲ７１抗体でサンドイッチＥＬＩＳＡを行なうことで、ＢＲ５９抗体とＢＲ７１抗体が同一の抗原を認識しているかの確認を行なった。ＢＲ５９を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｄｉｓｏｒｐ ヌンク社製）を、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え１時間室温で静置した。その後実施例１−（２）により調製した、ヘリコバクター・ビリス菌体抽出物を０．５μｇ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄し、ＢＲ７１ビオチン化抗体（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を添加し、室温で１時間反応させた。上記洗浄液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識アビジン（ピアス社製、１：１００００）を添加し、室温で１時間反応させた。再度上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００３２】
（２）ＢＲ５９とＢＲ７１の認識抗原の確認の結果
結果を図３に示した。ＢＲ５９抗体を固相化し、ヘリコバクター・ビリス、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ヘパティカスの菌体抽出液を反応させ抗原を捕捉後、ＢＲ７１ビオチン化抗体を反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジンで検出した。その結果、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ヘパティカスとは反応しなかった。ヘリコバクター・ビリスで高い吸光度を示し、ＢＲ５９とＢＲ７１はヘリコバクター・ビリスの同一の抗原を認識していることが確認できた。
【００３３】
実施例６．モノクローナル抗体ＢＲ５９の認識抗原における安定性
（１）ヘリコバクター・ビリス菌体抽出物の処理条件
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ビリス菌体抽出物を以下のＡ〜Ｄのように処理を行った。
Ａ．酸処理
０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ(ｐＨ ２．５)に懸濁し、１０分間反応させた後、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)にて中和させた。
Ｂ．アルカリ処理
０．０１Ｎ ＮａＯＨに懸濁し、１０分間反応させた後、１Ｎ ＨＣｌにて中和させた。
Ｃ．熱処理
沸騰水で５または１０分間放置し、氷冷した。
Ｄ．エタノール処理
５０％及び８０％ エタノールにて反応させた。その後１００００×ｇで２分間遠心分離し、上清を回収した。また沈殿物は、エタノールと同量のＰＢＳにて懸濁した。
【００３４】
（２）ＥＬＩＳＡ法
Ａ〜Ｄに従い調製した抗原を、ＰＢＳで２．０μｇ／ｍＬに調製し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（パッカード社製）に０．２μｇ／ｗｅｌｌで固相化した。マスキングは、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え１時間室温で静置した。その後ＢＲ５９抗体を添加し、室温で１時間反応させた。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、ぺルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ（ダコ社製、１：４０００）１００μＬを添加した。室温で１時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で３分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００３５】
（３）認識抗原の安定性
モノクローナル抗体ＢＲ５９の認識抗原の安定性を検討した結果を図４に示した。アルカリ処理・熱処理には安定であった。酸処理では若干吸光度の低下が見られ、やや不安定であった。しかし、エタノール処理には不安定で抗原性が失われた。
【００３６】
実施例７．他菌体との交差反応性の検討
（１） 菌体の培養法
ヘリコバクター・ヘパティカス（ＡＴＣＣ５１４４８）、ヘリコバクター・フェリス（ＡＴＣＣ ４９１７９）、ヘリコバクター・ムステラエ（ＡＴＣＣ ４３７７２）、ヘリコバクター・シナエディ（ＡＴＣＣ ３５６８３）、及びキャンピロバクター・ジェジュニ（ＡＴＣＣ ２９４２８）は５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地上で、３７℃で４日間微好気培養した。ビフィドバクテリウム・インファンティス（ＪＣＭ １２２２）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（ＪＣＭ １１９２）、バクテロイデス・ブルガタス（ＩＦＯ １４２９１）は５％馬脱繊血を添加したＢＬ寒天培地（日水製薬社製）上で、３７℃で４日間、嫌気培養した。エシェリヒア・コリ（ＡＴＣＣ２５９２２）はブレインハートインヒュージョン寒天培地上で、３７℃で３日間、好気培養した。
得られたコロニーを実施例１−（２）に従い集菌・破砕し、各菌体の抽出物を調製した。
【００３７】
（２）ＥＬＩＳＡ法
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ビリス及びヘリコバクター・ピロリ菌体抽出物、及び実施例７−（１）により調製したヘリコバクター・ヘパティカス、ヘリコバクター・シナエディ、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ムステラエ、キャンピロバクター・ジェジュニ、ビフィドバクテリウム・ブレベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、バクテロイデス・ブルガタス、エシェリヒア・コリの菌体抽出物を０．５μｇ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに固相化を行い、実施例３−（２）と同様の方法でＥＬＩＳＡを実施した。一次抗体として、ハイブリドーマＢＲ５９、ＢＲ６７、ＢＲ７１、ＢＲ７２の産生する抗体を添加した。
【００３８】
（３）結果
表１に示した。ＢＲ５９及びＢＲ７１では、ヘリコバクター・ビリス以外の菌体では発色が認められなかった。従って、ＢＲ５９及びＢＲ７１の認識する抗原は、ヘリコバクター・ピロリを含む他菌体との交差反応性がないことが確認できた。
【表１】
【００３９】
実施例８．アフィニティーカラムによる抗ヘリコバクター・ビリスモノクローナル抗体の認識する抗原の分子量と特異性の検証
（１）ＢＲ５９抗体カラムによる部分精製とセミドライウェスタンブロッティング
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムにより精製したＢＲ５９抗体を活性化セファロースに結合させ、アフィニティーカラムによるヘリコバクター・ビリス菌体抽出物から抗原の精製を行なった。この抗原を実施例２−（１）に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行い、銀染色とセミドライウェスタンブロッティングを行なった。なお、セミドライウェスタンブロッティングは実施例２−（２）に従い、一次抗体としてモノクローナル抗体ＢＲ５９の培養上清を、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ抗体（ダコ社製、１：４０００）を用いた。
【００４０】
（２）ＢＲ５９抗体の認識する抗原の分子量の検証結果
銀染色とセミドライウェスタンブロッティングの結果を図５に示した。ＢＲ５９抗体の認識する抗原であると推測されるバンドは、銀染色で１２ｋＤａ付近に検出された（レーン１）。また、セミドライウェスタンブロッティングでも同様の位置にバンドが検出された（レーン４）。
【００４１】
（３）分子量の推定
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬａｄｄｅｒとＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（共にインビトロジェン社製）の２種の分子量マーカーを実施例２−（１）に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行い、銀染色により染色した結果を図６に示した。マーカーごとに推定される分子量に違いが認められた。ウェスタンブロッティング（図２、図５）の結果からＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（レーン１）を用いた場合には分子量は約１４ｋＤａと推定され、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（レーン２）を用いたときには約１２ｋＤａと推定された。抗原の分子量は分子量マーカーのバンドの幅を考慮して１０〜１６ｋＤａと推定した。
【００４２】
実施例９．マウス血清のヘリコバクター・ビリス抗体価の測定
（１）ＥＬＩＳＡ方法（抗原固相化法）
ＢＲ５９認識抗原を固相化したプレートで、抗ヘリコバクター・ピロリ血清、抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清及び抗ヘリコバクター・ビリス血清の抗体価測定を行い、ＢＲ５９認識抗原の特異性を調べた。アフィニティーカラムを用いてヘリコバクター・ビリス菌体抽出物から精製したＢＲ５９の認識抗原を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（パッカード社製）に固相化し、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え２時間室温で静置した。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、マウス血清を１／２００で添加し室温で1時間反応させた。なお、マウス血清は、実施例１−（３）で調製したマウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清、実施例７−（１）で培養し、実施例１−（４）と同様の免疫方法で調製したマウス抗ヘリコバクター・ビリス血清を用いた。その後上記洗浄液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ（ザイメド社製、１：２０００）１００μＬを添加した。室温で1時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（スミロン社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００４３】
（２）ＥＬＩＳＡ方法（抗体固相化法）
ＢＲ５９及びＢＲ７１でヘリコバクター・ビリス認識抗原を捕捉し、その認識抗原に対する血中の抗体価を測定した。ＢＲ５９及びＢＲ７１（０．２μｇ／ｗｅｌｌ）を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（パッカード社製）を、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え２時間室温で静置した。その後実施例１−（２）により調製した、ヘリコバクター・ビリス菌体抽出物を０．５μｇ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間反応させた。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、マウス血清を１／２００で添加し室温で1時間反応させた。なお、マウス血清は、実施例９−（１）と同様の血清を用いた。その後上記洗浄液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ（ザイメド社製、１：２０００）１００μＬを添加した。室温で1時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（スミロン社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００４４】
（３）マウス血清のビリス抗体価の測定結果
実施例９−（１）の結果を図７に、実施例９−（２）の結果を図８に示した。抗原固相化、抗体固相化のどちらの測定方法も抗ヘリコバクター・ピロリ血清及び抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清は低い吸光度を示し、抗ヘリコバクター・ビリス血清のみ高い吸光度を示した。従って、ＢＲ５９の認識抗原はヘリコバクター・ビリスに特異的であること、また本モノクローナル抗体及びその認識抗原を用い上記の測定方法によりヘリコバクター・ビリス抗体価を特異的に測定することが可能であることが確認できた。このことより、この抗原は血清を用いたヘリコバクター・ビリス感染診断として有用であることが示唆された。
【００４５】
実施例１０．糞便中のヘリコバクター・ビリス抗原量の測定
（１）ＢＲ５９（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｄｉｓｏｒｐ ヌンク社製）を、１％ＢＳＡ液と１０％アマルティを１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え１時間室温で静置し、４０℃で１時間乾燥させた。その後糞便添加あり（５０倍懸濁）、なしの２種の希釈液（１％ＢＳＡ、０．１％プロクリン／ＰＢＳ）に、実施例１−（１）により調製したヘリコバクター・ビリス菌体抽出物を１．８８−５００ｎｇ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄し、ＢＲ７１ビオチン化抗体（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を添加し、室温で１時間反応させた。上記洗浄液で洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識アビジン（ピアス社製、１：１００００）を添加し、室温で１時間反応させた。再度上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００４６】
（２）糞便中のヘリコバクター・ビリス抗原量の測定結果
結果を図９に示した。濃度依存的に吸光度は上昇し、ヘリコバクター・ビリス抗原を定量的に測定することが可能であった。また、糞便を添加しても濃度依存的に吸光度は上昇し、糞便中の抗原も測定することが可能であった。従って、この方法は糞便を用いたヘリコバクター・ビリス感染診断として有用であることが示唆された。
また、抗原検査のサンプルとしては、糞便だけでなく、胆汁なども考えられ、それらへの応用も期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のヘリコバクター・ビリスの抗原及び抗体はヘリコバクター・ピロリ抗体及び抗原と反応せずヘリコバクター・ビリスに特異的に反応する。このことはヘリコバクター・ビリス感染による疾病の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清のヘリコバクター・ビリス及びヘリコバクター・ピロリに対する反応性のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２】ＢＲ５９抗体及びＢＲ７１抗体が認識する抗原のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図３】ＢＲ５９抗体とＢＲ７１抗体の認識抗原が同一であるのかを確認したＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図４】ＥＬＩＳＡにて各条件化でのＢＲ５９認識抗原の安定性を調べた結果を示すグラフである。
【図５】ヘリコバクター・ビリスの菌体抽出物から精製したＢＲ５９抗体の認識抗原を、銀染色及びウェスタンブロッティングを行なった結果を示す写真である。
【図６】２種の分子量マーカーを電気泳動後、銀染色により染色した結果を示す写真である。
【図７】マウス血清のヘリコバクター・ビリスに対する抗体価を、ＢＲ５９抗体の認識抗原を固相化したプレートによるＥＬＩＳＡにて測定した結果を示すグラフである。
【図８】マウス血清のヘリコバクター・ビリスに対する抗体価を、モノクローナル抗体を固相化したプレートによるＥＬＩＳＡにて測定した結果を示すグラフである。
【図９】糞便中に含まれるヘリコバクター・ビリスの抗原量を、モノクローナル抗体を固相化したプレートによるＥＬＩＳＡにて測定した結果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘリコバクター・ビリスの特異的抗原及びそのモノクローナル抗体及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌においてはヘリコバクター・ピロリが発癌に強く関与していることが疫学的調査から明らかになっている。スナネズミを用いたモデルにおいてもヘリコバクター・ピロリ感染が化学発癌剤による腺胃癌の発生を増強し、除菌によりその効果が減弱することが報告されている（非特許文献１）。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリ感染と胃疾患に関する検討が進むにつれて、ほかのヘリコバクター属の感染と臓器の病変との関係が検討されるようになってきた。ヘリコバクター・ビリスは胆汁中で生育できることから、胆道系疾患、特に腫瘍との関係が注目されている。マウスにおいては肝炎、肝癌、炎症性腸疾患を引き起こすことが報告されている（非特許文献２−４）。
【０００４】
ヒト胆道系疾患とヘリコバクター・ビリスの関係は胆汁をサンプルとしてＰＣＲによる検出が行なわれ、胆道系悪性腫瘍に高率で検出された。ヒトの胆汁中にヘリコバクター・ビリスが検出されたことは、ヒトでも肝疾患、胆道系疾患、炎症性腸疾患に関与していることが考えられる。
【０００５】
ヘリコバクター・ビリスの検出方法としては糞便、胆汁を採取してＰＣＲや培養による確認が行われており、なかでも糞便を用いた１６Ｓ ｒＲＮＡ中の特異配列をＰＣＲにより増幅して検出する感染診断法がマウスの感染を診断するために用いられている（非特許文献５、６）。より簡便に検出する方法として蛍光ＰＣＲが報告されている（非特許文献７、８）。また、種々の動物の糞便をサンプルとしてＰＣＲ−ＤＧＧＥ法による網羅的なヘリコバクター属の検出法が報告されている（非特許文献９）。
ヒトにおいては、胆汁をサンプルとして１６Ｓ ｒＲＮＡの特異領域をＰＣＲにより増幅し、検出する方法が用いられている（非特許文献１０、１１）。
【０００６】
しかし、胆汁の採取は患者への負担が大きく、糞便や血漿（あるいは血清）を用いた簡便な方法の確立が望まれている。血中の抗体価を測定する方法は、ヒトの場合、他のヘリコバクター属による感染、特にヘリコバクター・ピロリ感染者が多いため、ピロリ菌体破砕物で抗体を吸収させた後に測定している（非特許文献１２、１３）。ヘリコバクター・ビリスの外膜タンパク質をウェスタンブロッティングにより検討した結果、ヘリコバクター・ビリスの外膜タンパク質はヘリコバクター・ピロリに対する抗体と交差反応性を示さないことが報告されている。特に４６ｋＤａ付近に特徴的なタンパク質が存在していることを報告している（非特許文献１４）。外膜たんぱく質に対する抗体価はヘリコバクター・ビリス感染により引き起こされた肝炎マウスで上昇することが確認されている（非特許文献１５）。
【０００７】
抗体価を特異的に検出する抗原として、ヘリコバクター・ピロリにおいては２６ｋＤａ（非特許文献８）のタンパク質が報告されている。病態との関連ではヘリコバクター・ピロリで血中抗体によるイムノブロットで検出されるバンドの中で１２５ｋＤａ（ＣａｇＡ）、８７ｋＤａ（ＶａｃＡ）、３５ｋＤａ（ｕｎｋｎｏｗｎ）と胃潰瘍の関係が検討され、１２５ｋＤａおよび８７ｋＤａのバンドで８３．３％（ｎ＝１２）、３５ｋＤａは１００％の割合で胃潰瘍患者から検出されたと報告されている（非特許文献１６）。
しかし、ヘリコバクター・ビリスでは、どの特異抗原に対する抗体価の上昇が感染あるいは病態と一致するかは確認されていない。ヘリコバクター・ビリスはヘリコバクター・ピロリと類似した、強いウレアーゼ活性とＣａｇＡ、ＶａｃＡを有していることから、これらが疾患と関連している可能性は容易に類推されるが、他のヘリコバクター属の菌と交差反応性を示す可能性が高く、抗体価の上昇と肝疾患、胆道系疾患、炎症性腸疾患との関連性は不明である。
【０００８】
Ｉｒｙｎａ Ｋｏｒｎｉｌｏｖｓ｀ｋａ等（特許文献１）は１３種のタンパク質とそれらを認識する抗体を記載しているが、本発明の抗原及び抗体とは異なるものである。また、Ｓ．Ｆｅｎｇ、等は１６７ｋＤａのタンパク質をヘリコバクター・ビリスの特異抗原として報告している（非特許文献１７）。この抗原を用いて、抗体価を測定する感染診断がマウスで報告されているが（非特許文献１８、１９）、本発明の抗原とは異なるものである。
【０００９】
【特許文献１】国際公開第０２／１０２８４２号パンフレット
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｎ．ら，「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ」，２０００年，６０巻，p.１５１２−１５１４
【非特許文献２】Ｊ．Ｇ．Ｆｏｘ、等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３巻、４４５−４５４頁、１９９５年
【非特許文献３】Ｎ．Ｈ．Ｓｈｏｍｅｒ、等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５巻、４８５８−４８６４頁、１９９７年
【非特許文献４】Ｃ．Ｌ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ、等、Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ．４８巻、３３４−３３９頁、１９９８年
【非特許文献５】Ｍ． Ｍａｈｌｅｒ、等、Ｌａｂ Ａｎｉｍ Ｓｃｉ． ４８巻、８５−９１ページ、１９９８年
【非特許文献６】Ｌ． Ｚｅｎｎｅｒ、Ｃｏｍｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｄｉｓ． ２２巻、４１−６１ページ１９９９年
【非特許文献７】Ｚ．Ｇｅ、等、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３９巻、２５９８−６０２ページ、２００１年
【非特許文献８】Ｎ．Ｌ．Ｄｒａｚｅｎｏｖｉｃｈ、等 Ｃｏｍｐ． Ｍｅｄ．、５２巻、３４７−５３ページ、２００２年、
【非特許文献９】Ｗ．Ａ． Ａｌ−Ｓｏｕｄ、等、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５２巻、７６５−７１ページ、２００３年
【非特許文献１０】Ｊ．Ｇ．Ｆｏｘ、等、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１４巻、７５５−７６３頁、１９９８年
【非特許文献１１】Ｎ．Ｍａｔｓｕｋｕｒａ、等、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９３巻、８４２−８４７頁、２００２年
【非特許文献１２】Ｉ．Ｎｉｌｓｓｏｎ、等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５２巻、９４９頁、２００３年
【非特許文献１３】Ｏ．Ａｎａｎｉｅｖａ、等、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻、１１６０頁、２００２年
【非特許文献１４】Ｚ．Ｇｅ、等、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６９巻、３５０２頁、２００１年
【非特許文献１５】Ｊ．Ｇ．Ｆｏｘ、等、Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５４巻、５７１−７頁、２００４年
【非特許文献１６】Ｐ．Ａｕｃｈｅｒ等、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、３６巻、９３１頁、１９９８年
【非特許文献１７】Ｓ．Ｆｅｎｇ、等、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９巻、６２７−３２頁、２００２年
【非特許文献１８】Ｌ．Ｖ．Ｋｅｎｄａｌｌ、等、Ｃｏｍｐ．Ｍｅｄ．５４巻、４４−４８頁、２００４年
【非特許文献１９】Ｓ．Ｆｅｎｇ、等、Ｃｌｉｎ．Ｄｉａｇｎ．Ｌａｂ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１巻、１０９４−９頁、２００４年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は上記現状を鑑みヘリコバクター・ピロリに代表されるヘリコバクター属の細菌を含む細菌抗原と交差反応性を有しないヘリコバクター・ビリスの抗原及びこの抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体の作製と、生体中のヘリコバクター・ビリス感染を検出するための方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ヘリコバクター・ビリスに特異的な抗原の探索のため、ヘリコバクター・ビリス菌体及びヘリコバクター・ピロリ菌体を抗原として、各々の菌体で免疫したマウス抗血清によるウエスタンブロティングを行ったところ、マウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清では２５ｋＤａ以下のバンドは検出されなかったが、マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清では検出された。このことより、ヘリコバクター・ビリスの菌体抽出物は２５ｋＤａ以下に交差反応性のない特異的な抗原があることが推測された。そこでヘリコバクター・ビリスの抗原に対するモノクローナル抗体を作製し、その中から２５ｋＤａ以下の抗原と反応し、かつヘリコバクター・ビリス以外のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しないモノクローナル抗体を発見し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
すなわち本発明はヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原である。また第２の発明はヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体である。この抗原及び抗体は、Ｉｒｙｎａ Ｋｏｒｎｉｌｏｖｓ｀ｋａ等（特許文献１）の発表した１３種の蛋白と異なる抗原及び抗体である。さらに本発明はヘリコバクター・ビリス以外のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しないモノクローナル抗体を含むものである。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗原による抗体価の測定は抗ピロリ抗体に影響されない、ヘリコバクター・ビリスに特異的な検出が可能であった。
本発明の抗原を用いて製造できるモノクローナル抗体はヘリコバクター・ビリスのみと反応し、交差反応性の可能性のある他のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しなかった。
以上のことからヘリコバクター・ビリスの特異的な免疫診断法が可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
上述のようにヘリコバクター・ビリス菌体及びヘリコバクター・ピロリ菌体を抗原として、各々の菌体で免疫したマウス抗血清によるウエスタンブロティングを行ったところ、マウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清では２５ｋＤａ以下のバンドは検出されなかったが、マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清では検出された。このことより、ヘリコバクター・ビリス菌体抽出物は２５ｋＤａ以下に交差反応性のない特異的な抗原があることが推測された。そこで、モノクローナル抗体を作製し、２５ｋＤａ以下の抗原を認識する抗体を選抜した。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体はヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａ、好ましくは１２ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体である。本発明のモノクローナル抗体は、本発明のハイブリドーマより産生することができ、例えば本発明のハイブリドーマを培養し、その培養液から得ることが出来る。しかし本発明のモノクローナル抗体の製造方法としては特に限定されず、例えば、遺伝子工学的に得られたものであっても、ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に特異的に反応することが出来る限り本発明の範囲に含まれる。
また、本発明のモノクローナル抗体は、ヘリコバクター・ビリス以外の細菌の抗原と反応しないという特徴を備えている。ここで細菌とは特に制限は無いが、好ましくはヘリコバクター属の細菌であり、より好ましくはヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ヘパティカス、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ムステラエまたはヘリコバクター・シナエディである。本発明者らは本発明のモノクローナル抗体がその他の細菌としてバクテロイデス・ブルガタス、エシェリヒア・コリ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ブレビバチルス・ブレビスまたはキャンピロバクター・ジェジュニの抗原と反応しないことも確認している。
本発明の上記モノクローナル抗体の認識するヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原の製造方法は特に限定されず、例えば遺伝子工学的に得られたものであっても分子量１０〜１６ｋＤａでヘリコバクター・ビリスを検出することが出来る限り本発明の範囲に含まれる。実施例９に示したように、本発明のモノクローナル抗体とその認識抗原を用いた抗体価測定のＥＬＩＳＡでは、マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清のみの抗体価が高かった。従ってマウス抗ヘリコバクター・ビリス血清中にこの抗原に対する抗体が存在することから、抗体価測定によりヘリコバクター・ビリス感染を診断できることが確認できた。
また、この抗原のモノクローナル抗体との反応性はアルカリ処理・熱処理には安定であり、酸処理にはやや不安定でエタノール処理には不安定であることを確認している。
【００１７】
本発明のハイブリドーマは、ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体を産生するもので、ヘリコバクター・ビリスで免疫した動物の脾細胞又はリンパ節細胞と、骨髄腫細胞を融合して得られるものである。
本発明のハイブリドーマは、公知の細胞融合法により作製できる。即ち、ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原を免疫原としてヒト以外の動物を免疫し、その脾細胞又はリンパ節細胞と、骨髄腫細胞とを融合させてハイブリドーマを作製し、その中からヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより、本発明のハイブリドーマを得ることができる。
上記ヒト以外の動物は特に制限は無いが、マウス・ラットが好ましい。
【００１８】
また上記被免疫動物を免疫する方法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、マウスを免疫する場合、1回に１〜１００μｇ、好ましくは５０〜１００μｇの免疫用抗原を同容量の生理食塩水およびフロイントの完全アジュバント等で乳化して、上記被免疫動物背部、腹部の皮下又は腹腔内に２〜７週ごとに３〜６回接種する方法等を挙げることができる。
本発明においては、上記被免疫動物を免疫後、抗体価の高い個体を選び、最終免疫３〜５日後に脾臓又はリンパ節を摘出し、公知の細胞融合法に従って、融合促進剤（例えばポリエチレングリコール：ＰＥＧ）の存在化で、これらの組織に含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることができる。
【００１９】
特に好ましいハイブリドーマは、ヘリコバクター・ビリスの菌体抽出物を投与したラットの脾細胞とミエローマ細胞Ｐ−３（Ｘ６３−Ａｇ８）の融合を行い、融合細胞のスクリーニング、限界希釈法によるクローニングを行なったハイブリドーマＢＲ５９（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９０）。
及びＢＲ７１（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９１）である。
以下に実施例を含めて、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものでない。
【実施例】
【００２０】
実施例１．マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清の調製
（１）菌体の培養法
ヘリコバクター・ビリス（ＡＴＣＣ５１６３０）及びヘリコバクター・ピロリ（ＡＴＣＣ４３５０４）は、それぞれ５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地（ディフコ社製）を用いて３７℃で微好気性環境下にて３〜４日培養した。
【００２１】
（２）菌体抽出法
実施例１−（１）で得られたヘリコバクター・ビリス及びヘリコバクター・ピロリのコロニーをそれぞれ白金耳等でかきとり、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）に懸濁した。懸濁液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）４℃にて、１００００×ｇで１０分間遠心分離する操作を３回繰り返して菌体を洗浄し、０．６％Ｎ−ラウロイルサルコシン−２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）に懸濁した。その後、超音波破砕機（超音波破砕機 東湘電機社製、Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ）を用いて氷冷下で超音波処理して菌体を破砕し１時間室温でインキュベーションした。ついで４℃１５分間１００００ｘｇで遠心分離し、上清を菌体抽出物とした。
【００２２】
（３）マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清の作製
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ビリス及びヘリコバクター・ピロリの菌体抽出物をそれぞれフロイントの完全アジュバントで乳化して、菌体タンパク濃度が２０μｇ／ｍＬになるように調製した。これをＢＡＬＢ／ｃＡ Ｊｃｌマウスの腹腔内に免疫毎０．２ｍＬずつ投与した。初回免疫後１４日目と２８日目にヘリコバクター・ビリスの菌体抽出物をフロイントの不完全アジュバントで乳化して追加免疫を行った。最終免疫から３日目に心臓採血により血液を採集し、３０分静置した後４℃１５分間１００００×ｇで遠心分離し、上清を各々マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清とした。
【００２３】
実施例２．マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清を用いたヘリコバクター・ビリスに特異的な抗原の探索
（１）菌体抽出物の電気泳動
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行った。サンプルは、実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ビリス及びヘリコバクター・ピロリのそれぞれの菌体抽出物を、還元剤で処理しない常法に従い調製した。バッファ−は、ＭＥＳバッファーを、分子量マーカーはＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（インビトロジェン社製）を用いた。
【００２４】
（２）セミドライウェスタンブロッティング法
実施例２―（１）に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、セミドライウェスタンブロッティング法によりニトロセルロース膜にタンパク質を転写した。ニトロセルロース膜を１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和した溶液に１時間浸してマスキングを行った後、一次抗体としてマウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清と２時間反応させた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで４回洗浄後、各々二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製、１：４０００）と反応させた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで５回洗浄後、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）（ダコ社製）により発色させた。
【００２５】
（３）ヘリコバクター・ビリス特異的な抗原の探索の結果
実施例２−（２）のウェスタンブロッティングの結果を図１に示した。マウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清で染色された交差反応性を示すと思われる抗原は、２５ｋＤａ以上に認められた（レーン２）。マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清では２５ｋＤａ以下にもバンドが検出された（レーン３）。このことより、ヘリコバクター・ビリス菌体抽出物は、２５ｋＤａ以下にヘリコバクター・ピロリと交差反応性のない特異的な抗原があることが推測された。
【００２６】
実施例３．ヘリコバクター・ビリスの抗原を認識するモノクローナル抗体の作製と選択
（１）ヘリコバクター・ビリスの免疫及び細胞融合（脾臓法）
実施例１―（２）にて調製した免疫原（菌体抽出物）をフロイントの完全アジュバントで乳化して、菌体タンパク濃度が２０μｇ／ｍＬになるように調製した。これをＳＤラットの腹腔内に０．２ｍＬ投与した。初回免疫後１４日目と３２日目に菌体抽出物をフロイントの不完全アジュバントで乳化して追加免疫を行った。最終免疫から１６日目にラット脾細胞を摘出し、脾臓細胞を得た。得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞Ｐ−３（Ｘ６３−Ａｇ８）を５：１の割合で混合し、５０％ＰＥＧ４０００を用いて融合した後、ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択培養した。
【００２７】
（２）ＥＬＩＳＡ方法；
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ビリス菌体抽出物（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（パッカード社製）を、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え２時間室温で静置し、その後一次抗体として各穴に融合細胞の培養上清液１００μＬを添加し、２時間反応させた。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ（ダコ社製、１：４０００）１００μＬを添加した。室温で1時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００２８】
（３）抗ヘリコバクター・ビリスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択
細胞融合後１５日目に、実施例３−（２）のＥＬＩＳＡと同様の方法で培養上清中の抗体活性を測定した。免疫原に反応する抗体を産生するハイブリドーマクローンをＥＬＩＳＡの吸光値が０．５以上を目安として選択した。各クローンを限界希釈法により２度クローニングを行い、その都度抗体活性の有無を、ＥＬＩＳＡ法を用いて調べた。陽性クローンに対して、シングルセルクローニングを行い、抗体産生が安定である抗ヘリコバクター・ビリス抗体を産生している多くのハイブリドーマクローンを得た。その後、得られたハイブリドーマを２５ｃｍ２、７５ｃｍ２フラスコに移し、培養した。継代後に安定して抗ヘリコバクター・ビリス抗体を産生するハイブリドーマは１８株であった。
【００２９】
実施例４．抗ヘリコバクター・ビリスの２５ｋＤａ以下の抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの選択
（１）菌体抽出物の電気泳動、セミドライウェスタンブロッティング
実施例２−（１）に従ってヘリコバクター・ビリスの菌体抽出物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行い、 実施例２−（２）に従いセミドライウェスタンブロッティングを行なった。ハイブリドーマの培養上清と２時間反応させた後、ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで４回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ抗体（ダコ社製、１：４０００）と反応させた。ニトロセルロース膜を０．１％ツィーン２０−ＰＢＳで５回洗浄後、ＥＮＶＩＳＩＯＮ＋キット／ＨＲＰ（ＤＡＢ）（ダコ社製）により発色させた。
【００３０】
（２）ハイブリドーマの選択結果
セミドライウェスタンブロッティングの結果を図２に示した。１８株の中から２５ｋＤａ以下の抗ヘリコバクター・ビリス抗原を認識するモノクローナル抗体を安定に産生しているハイブリドーマを選別した。その結果、ＢＲ５９（レーン１）及びＢＲ７１（レーン２）の２種のハイブリドーマが得られた。
【００３１】
実施例５．ＢＲ５９とＢＲ７１の認識抗原の確認
（１）ＥＬＩＳＡ方法
ＢＲ５９抗体の認識するヘリコバクター・ビリス認識抗原を捕捉し、ＢＲ７１抗体でサンドイッチＥＬＩＳＡを行なうことで、ＢＲ５９抗体とＢＲ７１抗体が同一の抗原を認識しているかの確認を行なった。ＢＲ５９を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｄｉｓｏｒｐ ヌンク社製）を、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え１時間室温で静置した。その後実施例１−（２）により調製した、ヘリコバクター・ビリス菌体抽出物を０．５μｇ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄し、ＢＲ７１ビオチン化抗体（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を添加し、室温で１時間反応させた。上記洗浄液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識アビジン（ピアス社製、１：１００００）を添加し、室温で１時間反応させた。再度上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００３２】
（２）ＢＲ５９とＢＲ７１の認識抗原の確認の結果
結果を図３に示した。ＢＲ５９抗体を固相化し、ヘリコバクター・ビリス、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ヘパティカスの菌体抽出液を反応させ抗原を捕捉後、ＢＲ７１ビオチン化抗体を反応させ、ペルオキシダーゼ標識アビジンで検出した。その結果、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ヘパティカスとは反応しなかった。ヘリコバクター・ビリスで高い吸光度を示し、ＢＲ５９とＢＲ７１はヘリコバクター・ビリスの同一の抗原を認識していることが確認できた。
【００３３】
実施例６．モノクローナル抗体ＢＲ５９の認識抗原における安定性
（１）ヘリコバクター・ビリス菌体抽出物の処理条件
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ビリス菌体抽出物を以下のＡ〜Ｄのように処理を行った。
Ａ．酸処理
０．１Ｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ(ｐＨ ２．５)に懸濁し、１０分間反応させた後、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ９．０)にて中和させた。
Ｂ．アルカリ処理
０．０１Ｎ ＮａＯＨに懸濁し、１０分間反応させた後、１Ｎ ＨＣｌにて中和させた。
Ｃ．熱処理
沸騰水で５または１０分間放置し、氷冷した。
Ｄ．エタノール処理
５０％及び８０％ エタノールにて反応させた。その後１００００×ｇで２分間遠心分離し、上清を回収した。また沈殿物は、エタノールと同量のＰＢＳにて懸濁した。
【００３４】
（２）ＥＬＩＳＡ法
Ａ〜Ｄに従い調製した抗原を、ＰＢＳで２．０μｇ／ｍＬに調製し、９６穴ＥＬＩＳＡプレート（パッカード社製）に０．２μｇ／ｗｅｌｌで固相化した。マスキングは、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え１時間室温で静置した。その後ＢＲ５９抗体を添加し、室温で１時間反応させた。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、ぺルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ（ダコ社製、１：４０００）１００μＬを添加した。室温で１時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で３分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００３５】
（３）認識抗原の安定性
モノクローナル抗体ＢＲ５９の認識抗原の安定性を検討した結果を図４に示した。アルカリ処理・熱処理には安定であった。酸処理では若干吸光度の低下が見られ、やや不安定であった。しかし、エタノール処理には不安定で抗原性が失われた。
【００３６】
実施例７．他菌体との交差反応性の検討
（１） 菌体の培養法
ヘリコバクター・ヘパティカス（ＡＴＣＣ５１４４８）、ヘリコバクター・フェリス（ＡＴＣＣ ４９１７９）、ヘリコバクター・ムステラエ（ＡＴＣＣ ４３７７２）、ヘリコバクター・シナエディ（ＡＴＣＣ ３５６８３）、及びキャンピロバクター・ジェジュニ（ＡＴＣＣ ２９４２８）は５％馬脱繊血を添加したブレインハートインヒュージョン寒天培地上で、３７℃で４日間微好気培養した。ビフィドバクテリウム・インファンティス（ＪＣＭ １２２２）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（ＪＣＭ １１９２）、バクテロイデス・ブルガタス（ＩＦＯ １４２９１）は５％馬脱繊血を添加したＢＬ寒天培地（日水製薬社製）上で、３７℃で４日間、嫌気培養した。エシェリヒア・コリ（ＡＴＣＣ２５９２２）はブレインハートインヒュージョン寒天培地上で、３７℃で３日間、好気培養した。
得られたコロニーを実施例１−（２）に従い集菌・破砕し、各菌体の抽出物を調製した。
【００３７】
（２）ＥＬＩＳＡ法
実施例１−（２）により調製したヘリコバクター・ビリス及びヘリコバクター・ピロリ菌体抽出物、及び実施例７−（１）により調製したヘリコバクター・ヘパティカス、ヘリコバクター・シナエディ、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ムステラエ、キャンピロバクター・ジェジュニ、ビフィドバクテリウム・ブレベ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、バクテロイデス・ブルガタス、エシェリヒア・コリの菌体抽出物を０．５μｇ／ｗｅｌｌで９６ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに固相化を行い、実施例３−（２）と同様の方法でＥＬＩＳＡを実施した。一次抗体として、ハイブリドーマＢＲ５９、ＢＲ６７、ＢＲ７１、ＢＲ７２の産生する抗体を添加した。
【００３８】
（３）結果
表１に示した。ＢＲ５９及びＢＲ７１では、ヘリコバクター・ビリス以外の菌体では発色が認められなかった。従って、ＢＲ５９及びＢＲ７１の認識する抗原は、ヘリコバクター・ピロリを含む他菌体との交差反応性がないことが確認できた。
【表１】
【００３９】
実施例８．アフィニティーカラムによる抗ヘリコバクター・ビリスモノクローナル抗体の認識する抗原の分子量と特異性の検証
（１）ＢＲ５９抗体カラムによる部分精製とセミドライウェスタンブロッティング
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇカラムにより精製したＢＲ５９抗体を活性化セファロースに結合させ、アフィニティーカラムによるヘリコバクター・ビリス菌体抽出物から抗原の精製を行なった。この抗原を実施例２−（１）に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行い、銀染色とセミドライウェスタンブロッティングを行なった。なお、セミドライウェスタンブロッティングは実施例２−（２）に従い、一次抗体としてモノクローナル抗体ＢＲ５９の培養上清を、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラットＩｇ抗体（ダコ社製、１：４０００）を用いた。
【００４０】
（２）ＢＲ５９抗体の認識する抗原の分子量の検証結果
銀染色とセミドライウェスタンブロッティングの結果を図５に示した。ＢＲ５９抗体の認識する抗原であると推測されるバンドは、銀染色で１２ｋＤａ付近に検出された（レーン１）。また、セミドライウェスタンブロッティングでも同様の位置にバンドが検出された（レーン４）。
【００４１】
（３）分子量の推定
ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＬａｄｄｅｒとＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（共にインビトロジェン社製）の２種の分子量マーカーを実施例２−（１）に従いＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ Ｇｅｌインビトロジェン社製、１２％アクリルアミドゲル）を行い、銀染色により染色した結果を図６に示した。マーカーごとに推定される分子量に違いが認められた。ウェスタンブロッティング（図２、図５）の結果からＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（レーン１）を用いた場合には分子量は約１４ｋＤａと推定され、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（レーン２）を用いたときには約１２ｋＤａと推定された。抗原の分子量は分子量マーカーのバンドの幅を考慮して１０〜１６ｋＤａと推定した。
【００４２】
実施例９．マウス血清のヘリコバクター・ビリス抗体価の測定
（１）ＥＬＩＳＡ方法（抗原固相化法）
ＢＲ５９認識抗原を固相化したプレートで、抗ヘリコバクター・ピロリ血清、抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清及び抗ヘリコバクター・ビリス血清の抗体価測定を行い、ＢＲ５９認識抗原の特異性を調べた。アフィニティーカラムを用いてヘリコバクター・ビリス菌体抽出物から精製したＢＲ５９の認識抗原を９６穴ＥＬＩＳＡプレート（パッカード社製）に固相化し、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え２時間室温で静置した。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、マウス血清を１／２００で添加し室温で1時間反応させた。なお、マウス血清は、実施例１−（３）で調製したマウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清、実施例７−（１）で培養し、実施例１−（４）と同様の免疫方法で調製したマウス抗ヘリコバクター・ビリス血清を用いた。その後上記洗浄液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ（ザイメド社製、１：２０００）１００μＬを添加した。室温で1時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（スミロン社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００４３】
（２）ＥＬＩＳＡ方法（抗体固相化法）
ＢＲ５９及びＢＲ７１でヘリコバクター・ビリス認識抗原を捕捉し、その認識抗原に対する血中の抗体価を測定した。ＢＲ５９及びＢＲ７１（０．２μｇ／ｗｅｌｌ）を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（パッカード社製）を、１％ＢＳＡ液とＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（ピアス社製）を１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え２時間室温で静置した。その後実施例１−（２）により調製した、ヘリコバクター・ビリス菌体抽出物を０．５μｇ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間反応させた。０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄後、マウス血清を１／２００で添加し室温で1時間反応させた。なお、マウス血清は、実施例９−（１）と同様の血清を用いた。その後上記洗浄液で洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ（ザイメド社製、１：２０００）１００μＬを添加した。室温で1時間静置後、上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（スミロン社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００４４】
（３）マウス血清のビリス抗体価の測定結果
実施例９−（１）の結果を図７に、実施例９−（２）の結果を図８に示した。抗原固相化、抗体固相化のどちらの測定方法も抗ヘリコバクター・ピロリ血清及び抗ヘリコバクター・ヘパティカス血清は低い吸光度を示し、抗ヘリコバクター・ビリス血清のみ高い吸光度を示した。従って、ＢＲ５９の認識抗原はヘリコバクター・ビリスに特異的であること、また本モノクローナル抗体及びその認識抗原を用い上記の測定方法によりヘリコバクター・ビリス抗体価を特異的に測定することが可能であることが確認できた。このことより、この抗原は血清を用いたヘリコバクター・ビリス感染診断として有用であることが示唆された。
【００４５】
実施例１０．糞便中のヘリコバクター・ビリス抗原量の測定
（１）ＢＲ５９（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を固相化した９６穴ＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｄｉｓｏｒｐ ヌンク社製）を、１％ＢＳＡ液と１０％アマルティを１：１で混和したマスキング液（２００μＬ／ｗｅｌｌ）を加え１時間室温で静置し、４０℃で１時間乾燥させた。その後糞便添加あり（５０倍懸濁）、なしの２種の希釈液（１％ＢＳＡ、０．１％プロクリン／ＰＢＳ）に、実施例１−（１）により調製したヘリコバクター・ビリス菌体抽出物を１．８８−５００ｎｇ／ｗｅｌｌで添加し、室温で１時間反応させた。その後、０．０５％ツィ−ン２０含有ＰＢＳ（洗浄液）で洗浄し、ＢＲ７１ビオチン化抗体（０．５μｇ／ｗｅｌｌ）を添加し、室温で１時間反応させた。上記洗浄液で洗浄し、ぺルオキシダーゼ標識アビジン（ピアス社製、１：１００００）を添加し、室温で１時間反応させた。再度上記洗浄液で洗浄し、ＴＭＢ（バイオエフエックス社製）発色液を各穴に１００μＬずつ添加した。室温で１０分間反応させ、各穴に１Ｎ硫酸液を１００μＬずつ添加し酵素反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００４６】
（２）糞便中のヘリコバクター・ビリス抗原量の測定結果
結果を図９に示した。濃度依存的に吸光度は上昇し、ヘリコバクター・ビリス抗原を定量的に測定することが可能であった。また、糞便を添加しても濃度依存的に吸光度は上昇し、糞便中の抗原も測定することが可能であった。従って、この方法は糞便を用いたヘリコバクター・ビリス感染診断として有用であることが示唆された。
また、抗原検査のサンプルとしては、糞便だけでなく、胆汁なども考えられ、それらへの応用も期待できる。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明のヘリコバクター・ビリスの抗原及び抗体はヘリコバクター・ピロリ抗体及び抗原と反応せずヘリコバクター・ビリスに特異的に反応する。このことはヘリコバクター・ビリス感染による疾病の診断に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】マウス抗ヘリコバクター・ビリス血清及びマウス抗ヘリコバクター・ピロリ血清のヘリコバクター・ビリス及びヘリコバクター・ピロリに対する反応性のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図２】ＢＲ５９抗体及びＢＲ７１抗体が認識する抗原のウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図３】ＢＲ５９抗体とＢＲ７１抗体の認識抗原が同一であるのかを確認したＥＬＩＳＡの結果を示すグラフである。
【図４】ＥＬＩＳＡにて各条件化でのＢＲ５９認識抗原の安定性を調べた結果を示すグラフである。
【図５】ヘリコバクター・ビリスの菌体抽出物から精製したＢＲ５９抗体の認識抗原を、銀染色及びウェスタンブロッティングを行なった結果を示す写真である。
【図６】２種の分子量マーカーを電気泳動後、銀染色により染色した結果を示す写真である。
【図７】マウス血清のヘリコバクター・ビリスに対する抗体価を、ＢＲ５９抗体の認識抗原を固相化したプレートによるＥＬＩＳＡにて測定した結果を示すグラフである。
【図８】マウス血清のヘリコバクター・ビリスに対する抗体価を、モノクローナル抗体を固相化したプレートによるＥＬＩＳＡにて測定した結果を示すグラフである。
【図９】糞便中に含まれるヘリコバクター・ビリスの抗原量を、モノクローナル抗体を固相化したプレートによるＥＬＩＳＡにて測定した結果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原。
【請求項２】
ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
ヘリコバクター・ビリス以外のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しない請求項２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＢＲ５９（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９０）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＢＲ７１（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９１）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項６】
ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
ハイブリドーマＢＲ５９（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９０）。
【請求項８】
ハイブリドーマＢＲ７１（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９１）。
【請求項１】
ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原。
【請求項２】
ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体。
【請求項３】
ヘリコバクター・ビリス以外のヘリコバクター属の細菌の抗原と反応しない請求項２記載のモノクローナル抗体。
【請求項４】
ＢＲ５９（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９０）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項５】
ＢＲ７１（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９１）のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項６】
ヘリコバクター・ビリスの分子量１０〜１６ｋＤａの抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項７】
ハイブリドーマＢＲ５９（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９０）。
【請求項８】
ハイブリドーマＢＲ７１（ＦＥＲＭＡＰ−２０３９１）。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公開番号】特開２００６−２１９４５１（Ｐ２００６−２１９４５１Ａ）
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３６０１４（Ｐ２００５−３６０１４）
【出願日】平成１７年２月１４日（２００５．２．１４）
【出願人】（０００１００４９２）わかもと製薬株式会社 (22)
【出願人】（５０４０２６２３６）
【出願人】（５０５０５５９９６）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月１４日（２００５．２．１４）
【出願人】（０００１００４９２）わかもと製薬株式会社 (22)
【出願人】（５０４０２６２３６）
【出願人】（５０５０５５９９６）
【Ｆターム（参考）】
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