マイクロ流体フロー・モニタリング
本発明は、チャネルにおいて、特にマイクロ流体チャネルにおいて、速度または流量をモニターするシステムおよび方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、連続フロー・マイクロ流体システムでリアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するためのシステムおよび方法において、速度または流量をモニターするシステムおよび方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、チャネルにおいて、特にマイクロ流体チャネルにおいて、速度またはフローをモニターするシステムおよび方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、連続フロー・マイクロ流体システムでリアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するためのシステムおよび方法において、速度または流量をモニターするシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景の解説
核酸の検出は、医学、法医学、産業用加工、作物および動物育種、ならびに多くの他の分野にとって中核をなすものである。疾患状態（たとえば癌）、感染性微生物（たとえばＨＩＶ）、遺伝系統、遺伝子マーカーなどを検出する能力は、疾患の診断および予後、マーカー利用選抜、犯罪現場の特徴の正確な識別、産業用生物を増殖させる能力、ならびに多くの他の技法にユビキタスな技術である。対象となる核酸の完全性の判定は、感染または癌の病理学に関連することがある。少量の核酸を検出するための最も強力で基本的な技術の１つは、核酸配列のいくつかまたはすべてを多数回にわたって複製し、次いで増幅産物を解析することである。ＰＣＲは、おそらく、いくつかの異なる増幅技法のうちの最もよく知られたものである。
【０００３】
ＰＣＲは、ＤＮＡの短い部分を増幅するための強力な技法である。ＰＣＲにより、単一のテンプレートＤＮＡ分子から始めて、何百ものＤＮＡのコピーを素早く生み出すことができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの単一鎖への変性、プライマーの変性鎖へのアニール、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長の、３段階の温度サイクルを含む。検出され、解析されるべき十分なコピーが存在するように、このサイクルを繰り返す。原理的には、ＰＣＲの各サイクルが、コピー数を２倍にすることができる。実際には、各サイクルの後に達成される増殖は、常に２未満である。さらに、ＰＣＲサイクルが続くにつれ、必要とされる反応物質の濃度が低下するために、増幅されたＤＮＡ産物の増加は、最終的には停止する。ＰＣＲに関する一般的な詳細については、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．）、Ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁事業（２００５まで補遺）、ならびにＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を参照されたい。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲは、通常ＰＣＲサイクルごとに１回、反応の進行に従って増幅したＤＮＡ産物の増加を測定する、発展中の一連の技法を指す。産物の蓄積を経時的にモニターすることにより、反応の効率を判定すること、ならびにＤＮＡテンプレート分子の初期濃度を推定することが可能になる。リアルタイムＰＣＲに関する一般的な詳細については、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓら編、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４）を参照されたい。
【０００５】
現在、増幅したＤＮＡの存在を示すための、いくつかの異なるリアルタイム検出化学がある。これらのうち大部分が、ＰＣＲプロセスの結果として特性を変化させる蛍光指示薬に依存する。これらの検出化学の中に、２本鎖ＤＮＡとの結合時に蛍光効率を向上させるＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなど）がある。他のリアルタイム検出化学は、色素の蛍光効率が別の光吸収部分または消光剤へのその接近に強く依存する現象である、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用する。これらの色素および消光剤は、通常、ＤＮＡ配列専用プローブまたはプライマーに付加される。ＦＲＥＴベースの検出化学の中に、加水分解プローブおよび構造プローブがある。加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎプローブなど）は、ポリメラーゼ酵素を使用して、オリゴヌクレオチド・プローブに付加された消光剤色素分子からレポーター色素分子を切断する。構造プローブ（分子標識など）は、オリゴヌクレオチドに付加された色素を利用し、この色素の蛍光発光が、ターゲットＤＮＡと交雑するオリゴヌクレオチドの構造変化時に変化する。
【０００６】
リアルタイムＰＣＲを実施する市販の器具はいくつか存在する。入手可能な器具の例には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＲＩＳＭ ７５００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ、およびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０が含まれる。これらの器具用のサンプル容器は閉管であり、これは、通常、少なくとも１０μｌ体積のサンプル溶液を必要とする。特定の分析によって検出可能なテンプレートＤＮＡの最低濃度が、およそマイクロリットル当たり１分子であるとすると、入手可能な器具の検出限界は、サンプル管当たりおよそ数十ターゲットである。したがって、単一分子の感受性を達成するためには、１〜１０００ｎｌの範囲で、より小さなサンプル体積をテストすることが望ましい。
【０００７】
より最近では、ＰＣＲ、および他の増幅反応を実施するためのいくつかの高スループット手法が開発されており、それらはたとえば、マイクロ流体デバイスにおける増幅反応、ならびにデバイス中またはデバイス上で増幅核酸を検出して解析するための方法を含む。マイクロ流体システムは、流体がそこを通って流れることができる少なくとも１つのチャネルを有するシステムであり、このチャネルは、約１０００マイクロメートル未満の、少なくとも１つの内部断面寸法（たとえば、深さ、幅、長さ、直径）を有する。典型的には、マイクロチャネルは、約５ミクロンから約５００ミクロンの断面寸法、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する。増幅のためのサンプルの熱サイクルは、通常、２つの方法のうちの１つで実現される。第１の方法では、従来のＰＣＲ器具によく似て、サンプル溶液がデバイス中に充填され、温度は時間とともに変更が繰り返される。第２の方法では、サンプル溶液は、空間的にさまざまな温度ゾーンを通って、連続的にポンプで送られる。
【０００８】
たとえば、Ｌａｇａｌｌｙら（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ７３：５６５〜５７０頁（２００１））は、２８０ｎｌのＰＣＲチャンバ内で、単一のテンプレートＤＮＡの増幅および検出を実証した。産物の検出は、ＰＣＲ後にキャピラリ電気泳動法を使用して行われた。一方で、Ｋｏｐｐら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０：１０４６〜１０４８頁（１９９８））は、９５℃（変性）、７２℃（伸長）、および６０℃（アニール）の３つの一定温度ゾーンの上を通る蛇行チャネルを有するガラス基材を使用して、連続フローＰＣＲを実証した。７２℃のゾーンは中央領域に位置し、９５℃から６０℃に進む際に、短く通過される必要があった。検出は、ＰＣＲ後にゲル電気泳動法を使用して行われた。このＰＣＲ技法は、反応槽の全表面の加熱に基づくものではないため、反応速度は、加熱速度／冷却速度ではなく、流量によって決定される。これらの参照のどちらも、ＰＣＲ反応のリアルタイム・モニタリングを説明していない。
【０００９】
Ｐａｒｋら（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ７５：６０２９〜６０３３頁（２００３））は、３つの温度制御されたブロックの周りに螺旋状に巻き付けられたポリイミド被覆の溶解シリカ・キャピラリを使用する、連続フローＰＣＲデバイスを説明している。サンプル体積は２μｌであった。検出は、ＰＣＲ後にゲル電気泳動法を使用して行われた。不透明なポリイミドの代わりに、ＰＴＦＥで被覆されたキャピラリを使用することにより、その器具をリアルタイムＰＣＲに適応する可能性に言及している。Ｈａｈｎら（国際公開第２００５／０７５６８３号）も参照されたい。
【００１０】
Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒら（米国特許第６，９６０，４３７号）は、３つの温度ゾーンを有する回転式チャネルを含むマイクロ流体デバイスを説明している。サンプルを導入して、これらのゾーンを通して回転式にポンプで送るために、いくつかの一体化されたバルブとポンプが使用される。
【００１１】
Ｋｎａｐｐら（米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号）は、あるマイクロ流体デバイスを説明している。いくつかの真っすぐな並列チャネルを有する平面状のガラス・チップが開示されている。ターゲットＤＮＡとＰＣＲ試薬との混合物が、これらのチャネル中に注入される。第１の実施形態では、チャネルはこの混合物で充填され、フローが止められる。次いで、チャネルの全長が熱的に循環される。熱サイクルが完了した後、ＤＮＡが増幅されている蛍光の領域を検出するために、チャネルがイメージ化される。第２の実施形態では、温度が循環されるときに、ＰＣＲ混合物が増幅ゾーンを通って連続して流れ、蛍光が増幅ゾーンの下流で検出される。サイクルに費やされる時間を変更すること、サイクルにおいて移動する距離を変化させることなどによって、異なる度合いの増幅が達成される。この方法が、個々のサンプル要素の進行を経時的にモニターするのでなく、別個の連続するサンプル要素について条件（経験されるサイクルなど）を変化させることは、注目に値する。
【００１２】
参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｓｓｏｎら（米国特許出願公開第２００８／０００３５８８号）は、マイクロ流体チャネルにおけるリアルタイムＰＣＲのための、より詳細には、連続フロー・マイクロ流体システムにおけるリアルタイムＰＣＲのための、システムおよび方法を説明している。この公開出願において説明されたシステムおよび方法によれば、マイクロ流体チャネルにおける流体の速度を、モニターし、調整することができる。
【００１３】
Ｌｉｕら（米国特許出願公開第２００２／０１６６５９２号）は、流量モニタリングのためのチップ・システムおよび方法を説明している。気泡が、マイクロ流体システムの分離チャネル中に導入される。気泡の速度は、気泡が、固定した距離を隔てた分離チャネルの両側に位置する２つのＬＥＤ／フォトダイオードの対を通るときに、その存在を光学的に検出することによって、決定される。環境光および他の散乱した光を遮断するために、チップ上にはクロム層が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００５／０７５６８３号
【特許文献２】米国特許第６，９６０，４３７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８／０００３５８８号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００２／０１６６５９２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．）、Ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）
【非特許文献２】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁事業（２００５まで補遺）
【非特許文献３】ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）
【非特許文献４】Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓら編、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４）
【非特許文献５】Ｌａｇａｌｌｙら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ７３：５６５〜５７０頁（２００１）
【非特許文献６】Ｋｏｐｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０：１０４６〜１０４８頁（１９９８）
【非特許文献７】Ｐａｒｋら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ７５：６０２９〜６０３３頁（２００３）
【非特許文献８】Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献９】Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１０】Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１１】ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１２】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１３】Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ Ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎ．Ｙ．
【非特許文献１４】Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９８４、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ（２０００）
【非特許文献１５】Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．
【非特許文献１６】Ｂｅｒｇら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ＤＮＡ配列を検出するための、マイクロ流体のゲノム・サンプル解析システムをさらに発展させることへの関心が寄せられており、これには、反応パラメータを最大限に活用するために、マイクロ流体チャネルにおいて流速および流量をモニターするためのシステムおよび方法を発展させることへの関心が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、チャネルにおいて、詳細には、マイクロ流体チャネルにおいて、速度またはフローをモニターするシステムおよび方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、連続フロー・マイクロ流体システムでリアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するためのシステムおよび方法において、速度または流量をモニターするシステムおよび方法に関する。
【００１８】
したがって、第１の態様において、本発明は、チャネルにおいて流速および流量をモニターするシステムを提供する。いくつかの実施形態において、システムは、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含むチップと、マイクロ流体チャネルを通して流体を移動させるための流体移動システムと、マイクロ流体チャネル中にフロー・マーカーを導入するためのフロー・マーカー導入システムと、２つの測定ポイントを生成するための照射システムと、チャネル内の２つの測定ポイント間でフロー・マーカーの移動を測定するための検出システムと、フロー・マーカー速度を決定し、速度を流量と関係付けるためのフロー計算システムとを含む。いくつかの実施形態において、チャネルは、フロー測定領域を含む。他の実施形態において、流体移動システムは、ポンプまたは真空機器である。さらなる実施形態において、フロー・マーカー導入システムは、圧電ノズル、バブルジェット（登録商標）・ヘッド、またはシッパー（ｓｉｐｐｅｒ）である。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、および散乱金属粒子からなる群から選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、マイクロチャネルは、約５ミクロンから約５００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する。他の実施形態において、マイクロチャネルは、約２０ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する。追加的な実施形態において、マイクロチャネルは、約３０ミクロンから約２５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する。さらなる実施形態において、マイクロチャネルは、約１５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する。いくつかの実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルと同じ幅である。他の実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルの残り部分と比較してより狭い。いくつかの実施形態において、フロー測定領域におけるマイクロチャネルは、約５ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する。他の実施形態において、フロー測定領域におけるマイクロチャネルは、約１０ミクロンから約２００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する。追加的な実施形態において、フロー測定領域におけるマイクロチャネルは、約２０ミクロンから約１００ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する。さらなる実施形態において、フロー測定領域におけるマイクロチャネルは、約４０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、照射システムは、光源を含む。いくつかの実施形態において、照射システムは、チップからの裏面反射または内部反射により、１つの光源から２つの測定ポイントを生成する。いくつかの実施形態において、光源はレーザーである。他の実施形態において、光源はＬＥＤである。いくつかの実施形態において、検出システムは、レンズおよび検出器を含む。いくつかの実施形態において、フロー計算システムはコンピュータである。他の実施形態において、コンピュータはまた、フロー・マーカーの移動を検出するためのデータ取得速度を制御する。
【００２１】
第２の態様において、本発明は、チャネルにおいて流速および流量をモニターする方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、チップ中のマイクロ流体チャネルを通して溶液を移動させること、フロー・マーカーをチャネル中に導入すること、２つの測定ポイントにおいてチャネルを照射すること、チャネル内の２つの測定ポイント間でフロー・マーカーの移動を測定すること、および光学フロー・マーカー移動速度を流量と関係付けることを含む。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルは、上記で説明された寸法を有する。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーの移動は、チャネルのフロー測定領域において測定される。いくつかの実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルと同じ幅である。他の実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルの残り部分と比較してより狭い。いくつかの実施形態において、フロー測定領域におけるマイクロチャネルの寸法は、上記で説明された寸法を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、および散乱金属粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、注入によってチャネル中に導入されるバブルであり、バブルは、圧電ノズルによって形成される注入空気である。他の実施形態において、フロー・マーカーは、蒸気バブルを発生させるためのバブルジェット（登録商標）・ヘッドによって形成されるバブルである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、２つの測定ポイントの照射は、チップからの裏面反射または内部反射により、１つの光源から生成される。いくつかの実施形態において、光源はレーザーである。他の実施形態において、光源はＬＥＤである。いくつかの実施形態において、照射ポイントの１つは、チップからの内部反射である。いくつかの実施形態において、反射は、チップ材料と空気との屈折率の差によって引き起こされる内部反射により、チップの裏面から自然に引き起こされる。他の実施形態において、反射は、チップの片面の反射コーティングによって、引き起こされる、または増強される。追加的な実施形態において、チップの反射コーティングは、チャネル内のフロー測定領域と相互に一体化している。いくつかの実施形態において、照射の入射の角度は、約３０度から約６０度である。別の実施形態において、照射の入射の角度は、好ましくは約４５度である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、フロー・マーカーの測定は、蛍光を含む。他の実施形態において、照射は、励起信号である。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーの測定は、検出システムを含む。いくつかの実施形態において、検出システムは、レンズおよび検出器を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、速度と流量との関係付けは、コンピュータによって実行される。いくつかの実施形態において、コンピュータはまた、フロー・マーカーの移動を測定するためのデータ取得速度を制御する。他の実施形態において、流量測定は、流量を調節するためのフィードバック・ループの一部である。他の実施形態において、照射は、散乱である光学信号、および／または自然なバックグラウンド信号から分離可能な反射を含む。
【００２６】
本発明の上記および他の実施形態が、添付の図面を参照して、以下で説明される。
【００２７】
本明細書において組み込まれ、その一部を形成する添付の図面が、本発明のさまざまな実施形態を図示する。図面において、同様の参照番号は、同一の、または機能的に類似した要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施形態に従ったシステムを示す図である。
【図２】本発明に関連して使用されてもよい、マイクロ流体デバイスまたはチップを示す図である。
【図３】マイクロ流体チャネルに関して、本発明の実施形態に従ったシステムを示す図である。
【図４】レーザー照射の主線において気泡が見られる、マイクロ流体チャネルにおけるＰＣＲ実験中に記録された画像である。
【図５】マイクロ流体チャネルに関して、本発明の追加的な実施形態に従ったシステムを示す図である。
【図６】マイクロ流体チャネルに関して、本発明のさらなる実施形態に従ったシステムを示す図である。
【図７】本発明の実施形態に従ったプロセスを示す流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、いくつかの実施形態を有し、当業者に知られている詳細についての特許、特許出願、および他の参考文献に依拠する。したがって、特許、特許出願、または他の参考文献が、本明細書において引用される、または再現されるとき、それは、すべての目的のために、ならびに列挙される命題のために、その全体が参照により組み込まれることを理解されたい。
【００３０】
特に指示しない限り、本発明の実施には、当技術分野の範囲内である、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組み換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技法および説明を用いることができる。そのような従来技法には、ポリマー・アレイ合成、ハイブリダイゼーション、連結反応、および、標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適切な技法の具体的な例示は、本明細書の以下の例を参照することによって得ることができる。ただし、当然のことながら、他の同等の従来手順も使用することができる。そのような従来技法および説明は、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（すべてＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより）、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ Ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎ．Ｙ．、Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９８４、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ（２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、およびＢｅｒｇら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．などの標準的な実験室マニュアルにおいて見出すことができ、これら全部が、すべての目的のために、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
上記で説明したとおり、本発明は、チャネルにおいて、詳細には、マイクロ流体チャネルにおいて、より詳細には、連続フロー・マイクロ流体システムでリアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するためのシステムおよび方法において、速度またはフローをモニターするシステムおよび方法を提供する。
【００３２】
図１に示すように、本発明の態様は、チャネルにおいて、詳細には、マイクロ流体チャネルにおいて、流速および流量をモニターするシステムを提供する。システムは、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含むチップ１００と、マイクロ流体チャネルを通して流体を移動させるための流体移動システム１０４と、マイクロ流体チャネル中にフロー・マーカーを導入するためのフロー・マーカー導入システム１０６と、少なくとも２つの測定ポイントを生成するための照射システム１１２と、チャネル内の測定ポイント間でフロー・マーカーの移動を測定するための検出システム１１３と、フロー・マーカー速度を決定し、速度を流量と関係付けるためのフロー計算システム１１０とを含む。一実施形態では、流体移動システム１０４は、ポンプまたは真空機器である。フロー・マーカー導入システム１０６は、圧電ノズル、バブルジェット（登録商標）・ヘッド、またはシッパーである。フロー・マーカー導入システム１０６は、バルブを含む収束入口チャネルを含むことができる。フロー・マーカー導入システム１０６はまた、チャネルの内容物において測定可能な特性変化を誘導する指向性エネルギー源、たとえば、温度上昇を誘導するための熱源、または光化学反応を誘導するための光源を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、着色スラグ、および散乱金属粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、マイクロ流体チャネルは、フロー・マーカーの移動を検出するためのフロー測定領域を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、照射システム１１２は、レーザーである。他の実施形態において、照射システム１１２は、ＬＥＤである。いくつかの実施形態において、照射システム１１２は、ビーム分割デバイスを使用することなどによって、チャネル内の２つの測定ポイントにおいてフロー・マーカーの移動を測定するための２つの照射源を生成する。他の実施形態において、照射システム１１２は、レーザーまたはＬＥＤであってよい１つの光源から２つの測定ポイントを、裏面反射によって生成し、すなわち、測定ポイントのうちの１つは、チップ１００からの内部反射である。いくつかの実施形態において、反射は、チップ１００の片面の反射コーティングによって、引き起こされる、または増強される。いくつかの実施形態において、チップ１００の反射コーティングは、チャネル内のフロー測定領域と相互に一体化している。いくつかの実施形態において、検出システム１１３は、レンズおよび光検出器を含む。いくつかの実施形態において、検出システムは、たとえば、ビデオ・フレームレート・カメラなどのイメージング・システムを含む。いくつかの実施形態において、フロー計算システム１１０は、コンピュータである。他の実施形態において、コンピュータはまた、フロー・マーカーの移動を検出するためのデータ取得速度を制御する。
【００３５】
本発明と併せて使用することができるチップの一実施形態が、図２に示されている。チップ２００は、いくつかのマイクロ流体チャネル２０１を含む。示されている例では、３２のマイクロ流体チャネルがあるが、チップ２００は、３２よりも多い、または少ないチャネルを有してもよいことが企図される。チップは、必要に応じて、当業者により、フロー・マーカー導入システムを含むように変更することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体チャネル２０１は、約５ミクロンから約５００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する。他の実施形態において、マイクロ流体チャネル２０１は、約２０ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する。追加的な実施形態において、マイクロ流体チャネル２０１は、約３０ミクロンから約２５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する。さらなる実施形態において、マイクロ流体チャネル２０１は、約１５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する。
【００３７】
図３に示すように、チップ３００は、溶液の流量３０２を測定する／モニターするように所望される少なくとも１つのマイクロチャネル３０１を含む。この実施形態に示すように、マイクロチャネル３０１は、チャネルの残り部分と比較してより狭い、フロー測定領域３１４を含む。フロー測定領域３１４は、この領域の溶液の速度を上昇させるために、マイクロチャネル３１０の残り部分よりも狭く、それにより、流量／流速を計算するのに必要な測定時間を短縮することが所望されてよい。いくつかの実施形態において、マイクロ流体フローは、ある用途においては非常に遅いことがあるために、狭められたフロー測定領域３１４が所望される。この図に示すように、フロー測定領域３１４は、端部３１５ａ、３１５ｂによって、境界が定められる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、マイクロチャネル３０１は、本明細書において説明されるような幅および深さを有する。いくつかの実施形態において、フロー測定領域３１４におけるマイクロチャネル３０１は、約５ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する。他の実施形態において、フロー測定領域３１４におけるマイクロチャネル３０１は、約１０ミクロンから約２００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する。追加的な実施形態において、フロー測定領域３１４におけるマイクロチャネル３０１は、約２０ミクロンから約１００ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する。さらなる実施形態において、フロー測定領域３１４におけるマイクロチャネル３０１は、約４０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する。
【００３９】
図３にさらに示すように、システムは、フロー・マーカーとしてのバブルを、マイクロチャネル３０１に注入するためのデバイス３０６を含む。デバイス３０６は、バブル発生器であってよく、バブル発生器は、蒸気バブルを形成させる強力な熱を発生させる（ａ）圧電空気注入ノズル、または（ｂ）バブルジェット（登録商標）・ノズルのいずれかであってよい。バブルジェット（登録商標）・ノズルが使用される場合、知られている、かつ制御可能な大きさ／体積のバブルを発生させるために、たとえば、１Ｈｚから１ｋＨｚの速度で繰り返し拍出してよい。
【００４０】
一実施形態において、システムは、レーザー３１２をさらに含む。レーザーは、フロー測定領域３１４内のポイントＡを照射する。レーザーは、チップ３００の裏面から反射され、レーザー反射が、フロー測定領域３１４内のポイントＢを照射する。マイクロ流体チップ３００の裏面からの反射メカニズムは、チップ材料と空気との屈折率の差から生じる内部反射によって自然に引き起こされる。いくつかの実施形態において、反射は、たとえば、チップ３００の片面の、薄い金属層または多層の誘電体コーティングなどの反射コーティングによって、引き起こされる、または増強される。いくつかの実施形態において、チップ３００の反射コーティングは、チャネル内のフロー測定領域３１４と相互に一体化している。いくつかの実施形態において、レーザーの入射の角度（θ）は、約３０度から約６０度である。別の実施形態において、レーザーの入射の角度（θ）は、好ましくは約４５度である。レーザーの波長は、典型的には、蛍光励起に使用される波長である。
【００４１】
ポイントＡおよびＢを流れ過ぎるバブルによって引き起こされた光学信号が、レンズ３１８および検出器３１９を含むことができる検出システム３１３によって検出される。レンズ３１８および検出器３１９は、一般的に使用される蛍光イメージング・デバイスや、または、たとえば２次元のＣＣＤまたはＣＭＯＳ画像センサなどの他の知られているイメージング・デバイスであってよい。
【００４２】
流速および流量は、計算システムによって計算される。流速は、ポイントＡとＢとの間の既知の距離を考慮して、ポイントＡとＢとの間の通過時間を測定することによって計算され、流量は、流速が既知になってから計算される。流速および流量を、以下の式に従って計算することができる。
流速＝（ＡからＢの距離）／通過時間
流量＝（チャネル幅×チャネルの深さ）×（流速）
【００４３】
動作では、フロー・バブルが、デバイス３０６によって、マイクロ流体チャネル３０１中に注入される。バブルは、チャネルに流れ下り、ポイントＡにおいてレーザー３１２によって短く照射される。バブルは下流へと流れるので、フロー測定領域３１４をマイクロチャネルの残り部分の中へとバブルが出て行くポイントであるポイントＢにおいて、バブルがレーザー反射によって追って照射される。レーザー照射ポイントを流れ過ぎたバブルによって引き起こされた光学信号が、外部測定機器のレンズ３１８および検出器３１９によって検出される。流速および流量は、本明細書において説明されるように計算される。
【００４４】
図４は、本発明の実施形態からのデータの例を示す。この例においては、４８８ｎｍの固体レーザーが使用された。使用された検出器は、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって製造された、６５８×４９６ピクセルの解像度を有するＥＭＣＣＤ増幅イメージング検出器であった。画像２および画像３は、バブル・イメージング現象が観察されたこの実験からのデータを表す。画像２は、レーザー照射の主線に入るバブルを示し、マイクロ流体チャネル番号３において、明るいスポットとして見ることができる。画像２の底縁において目に見えるかすかなスポットは、内部反射スポットである。画像３は、画像２から遅延した時間（およそ１．５秒）に取得された画像であった。したがって、バブルは、マイクロ流体チャネルにおいてその距離を通過しており、入射レーザービームの内部反射エネルギーによって可視化されている。
【００４５】
画像は、プログラムされた目的領域（範囲）（ＲＯＩ）上でピクセル値を統合することができるイメージング・ソフトウェアを使用して、処理される。次いで、対時間でプロットされたＲＯＩデータが、バブルが流れ過ぎるときのピーク信号を見つけるために解析される。ピーク値は、タイミング測定を行うためのトリガ・ポイントである。通常の光揺らぎは、当技術分野でよく知られている時間バンドパス・アルゴリズムを使用して、（より速い時定数を有する）バブルから、時間フィルタにかけられる。
【００４６】
本発明の別の実施形態が、図５に示されている。チップ５００は、流量５０２を測定する／モニターするように所望される少なくとも１つのマイクロチャネル５０１を含む。この実施形態に示すように、マイクロチャネル５０１は、狭められていないフロー測定領域５１４を含む。この図に示すように、フロー測定領域５１４は、端部５１５ａ、５１５ｂによって、境界が定められる。さらに図５に示すように、システムは、フロー・マーカーとしてのバブルを、マイクロチャネル５０１中に注入するためのデバイス５０６を含む。デバイス５０６は、本明細書において説明されるようなバブル発生器であってよい。システムは、レーザー５１２をさらに含む。レーザーは、フロー測定領域５１４内のポイントＡを照射する。レーザーは、チップ５００の裏面から反射され、レーザー反射が、フロー測定領域５１４内のポイントＢを照射する。反射メカニズムは、本明細書において説明されるように引き起こされてよい。レーザーの入射の角度（θ）は、本明細書において説明されるようであってよい。ポイントＡおよびＢを流れ過ぎるバブルによって引き起こされた光学信号が、レンズ５１８および検出器５１９を含むことができる検出システム５１３によって検出される。レンズ５１８および検出器５１９は、本明細書において説明されるようであってよい。流速および流量が、本明細書において説明されるように計算される。
【００４７】
本発明の別の実施形態が、図６に示されている。チップ６００は、流量６０２を測定する／モニターするように所望される少なくとも１つのマイクロチャネル６０１を含む。この実施形態に示すように、マイクロチャネル６０１は、チャネルの残り部分よりも狭いフロー測定領域６１４を含む。この図に示すように、フロー測定領域６１４は、端部６１５ａ、６１５ｂによって、境界が定められる。さらに図６に示すように、システムは、レーザー６１２をさらに含む。レーザーは、フロー測定領域６１４内のポイントＡを照射する。レーザーは、チップ６００の裏面から反射され、レーザー反射が、フロー測定領域６１４内のポイントＢを照射する。反射メカニズムは、本明細書において説明されるように引き起こされてよい。レーザーの入射の角度（θ）は、本明細書において説明されるようであってよい。ポイントＡおよびＢを流れ過ぎるマーカーによって引き起こされた光学信号が、レンズ６１８および検出器６１９を含むことができる検出システム６１３によって検出される。レンズ６１８および検出器６１９は、本明細書において説明されるようであってよい。流速および流量が、本明細書において説明されるように計算される。この実施形態では、マーカーは、マイクロチャネル６０１中に導入される、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、および散乱金属粒子であってよい。マーカーは、たとえば、当技術分野で一般的であるようにチップ６００の一部である、または当技術分野で一般的であるようにチップ６００と組み合わせて利用される、シッパー（図示せず）によって、マイクロチャネル６０１中に導入されてよい。
【００４８】
本発明はまた、チャネルにおいて流速および流量をモニターする方法も提供する。いくつかの実施形態において、方法は、チップ中のマイクロ流体チャネルを通して溶液を移動させること、フロー・マーカーをチャネル中に導入すること、２つの測定ポイントにおいてチャネルを照射すること、チャネル内の２つの測定ポイント間でフロー・マーカーの移動を測定すること、および光学フロー・マーカー移動速度を流量と関係付けることを含む。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルは、本明細書において説明された寸法を有する。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーの移動は、チャネルのフロー測定領域において測定される。いくつかの実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルと同じ幅である。他の実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルの残り部分と比較してより狭い。いくつかの実施形態において、狭められたフロー測定領域におけるマイクロチャネルの寸法は、本明細書において説明された寸法を有する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、および散乱金属粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、注入によってチャネル中に導入されるバブルであり、バブルは、圧電ノズルによって形成される注入空気である。他の実施形態において、フロー・マーカーは、蒸気バブルを発生させるためのバブルジェット（登録商標）・ヘッドによって形成されるバブルである。さらなる実施形態では、フロー・マーカーは、シッパーによってチャネル中に導入される、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、および散乱金属粒子である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、２つの測定ポイントの照射は、裏面反射による１つの光源から生成される。いくつかの実施形態において、光源はレーザーである。他の実施形態において、光源はＬＥＤである。いくつかの実施形態において、照射ポイントの１つは、チップからの内部反射である。いくつかの実施形態において、反射は、チップ材料と空気との屈折率の差によって引き起こされる内部反射により、チップの裏面から自然に引き起こされる。他の実施形態において、反射は、チップの片面の反射コーティングによって、引き起こされる、または増強される。追加的な実施形態において、チップの反射コーティングは、チャネル内のフロー測定領域と相互に一体化している。いくつかの実施形態において、照射の入射の角度は、約３０度から約６０度である。別の実施形態において、照射の入射の角度は、好ましくは約４５度である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、チャネル内のフロー・マーカーの測定は、蛍光を含む。他の実施形態において、照射は、励起信号である。いくつかの実施形態において、光学励起信号は、チャネル内のフロー測定領域内の２つのポイントにおいてフロー・マーカーの移動を測定するための、照射の２つの源を生成するレーザーである。照射の２つの源を、ビーム分割デバイスを使用することによって、作成することができる。いくつかの実施形態において、検出システムは、レンズおよび検出器を含む。いくつかの実施形態において、光学検出は、散乱である光学信号、および／または自然なバックグラウンド信号から分離可能な反射を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、速度の計算、および速度と流量との関係付けは、コンピュータによって実行される。いくつかの実施形態において、コンピュータはまた、フロー・マーカーの移動を測定するためのデータ取得速度を制御する。他の実施形態において、流量測定は、流量を調節するためのフィードバック・ループの一部である。
【００５３】
図７は、本発明の実施形態に従ったプロセス７００を示す流れ図である。プロセス７００は、少なくとも１つのマイクロチャネルを有するチップ１００における流体フローが、流体移動システム１０４によってアクティブな状態にされた、ステップ７０２で開始することができる。ステップ７０４で、本明細書では時にフロー測定領域と呼ばれるチャネル領域をモニターするように設定される検出システム１１３から、光学データが取得され、ベースライン信号が確立される。ステップ７０６で、気泡が、フロー・マーカー導入システム１０６によってチャネル中に導入される。
【００５４】
ステップ７０８で、光学データが、検出システム１１３から取得される。ステップ７１０で、データの解析が、ロケーション１におけるバブルの特徴が検出され、第１のタイムスタンプが、この検出に関連付けられる。
【００５５】
ステップ７１２で、光学データが、検出システム１１３から取得される。ステップ７１４で、データの解析が、ロケーション２におけるバブルの特徴が検出され、第２のタイムスタンプが、この検出に関連付けられる。
【００５６】
ステップ７１６で、流体の流速が、フロー計算システム１１０によって計算され、流体の流量もまた計算されてよい。ステップ７１８で、次いで流速および／または流量が、チャネル内で実施されている反応の仕様内にあるかどうかを判定するために問い合わせられる。ステップ７１８における問い合わせの答えが肯定である場合、ステップ７２０で、適切な時間遅延の後に、開始ステップ７０６により連続して反復されるモニタリングのために、時間遅延を提供する。
【００５７】
ステップ７１８における問い合わせの答えが否定である場合、ステップ７２２が開始される。ステップ７２２で、流速値が、フロー較正アルゴリズムと比較される。ステップ７２４で、必要なフロー調整が計算される。ステップ７２６で、流体フローは、流体移動システム１０４によって、必要な調整量分だけ調整される。ステップ７２８で、流量が、開始ステップ７０６によって検証される。
【００５８】
本発明は、いくつかの利点を有する。たとえば、本発明のこれらの態様は、（１）マイクロ流体フロー・パス中に注入される、バブルなどの不活性物質を使用すること、（２）内部反射の特性を利用して第２の測定ゾーンを作成し、したがって、より単純な光学設計を有すること、（３）たとえば、リアルタイムＰＣＲで蛍光をモニターするといった別の主目的を有する同じ光学システムと共有することができるフロー測定光学システムを利用すること、および（４）バブルが使用される場合に、独立した波長であるフロー測定システムを利用することを含む。
【００５９】
本発明を説明するコンテキスト（特に以下の特許請求の範囲のコンテキスト）における、用語「ａ」および「ａｎ」、「ｔｈｅ」、ならびに同類の指示対象の使用は、本明細書において特に指示しない限り、またはコンテキストによって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包むように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「収容する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に言及しない限り、制限のない用語（すなわち、「含むが、限定はしない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において特に指示しない限り、その範囲内に入るそれぞれ分離した値に個別に言及する簡便な方法としての働きをすることを単に意図しており、それぞれの分離した値は、本明細書において個別に列挙されたかのように、本明細書に組み込まれる。たとえば、範囲１０〜１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４もまた開示される。本明細書において説明されるすべての方法は、本明細書において特に指示しない限り、またはコンテキストによって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序において実施されてよい。本明細書において提供される任意のおよびすべての例の使用、または例示的な語（たとえば「など」）は、本発明をよりよく照らすことを単に意図しており、特に主張しない限り、本発明の範囲に限定を与えるものではない。本明細書におけるいかなる語も、特許請求されないあらゆる要素を、本発明の実施に必須であるとして示さないものと解釈されるべきである。
【００６０】
本発明の方法および構成要素は、本明細書において開示されているのはそのうちのいくつかにすぎない、さまざまな実施形態の形で組み込まれてもよいことが理解されるであろう。それらの実施形態の変形形態は、前述の説明を読めば、当業者には明らかになり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を適切に利用することを期待しており、本明細書において詳細に説明したものとは別のやり方で、本発明が実施されることを意図している。さらに、そのすべての考え得る変形形態における、上記で説明した要素のいかなる組合せも、本明細書において特に指示しない限り、またはコンテキストによって明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、チャネルにおいて、特にマイクロ流体チャネルにおいて、速度またはフローをモニターするシステムおよび方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、連続フロー・マイクロ流体システムでリアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するためのシステムおよび方法において、速度または流量をモニターするシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景の解説
核酸の検出は、医学、法医学、産業用加工、作物および動物育種、ならびに多くの他の分野にとって中核をなすものである。疾患状態（たとえば癌）、感染性微生物（たとえばＨＩＶ）、遺伝系統、遺伝子マーカーなどを検出する能力は、疾患の診断および予後、マーカー利用選抜、犯罪現場の特徴の正確な識別、産業用生物を増殖させる能力、ならびに多くの他の技法にユビキタスな技術である。対象となる核酸の完全性の判定は、感染または癌の病理学に関連することがある。少量の核酸を検出するための最も強力で基本的な技術の１つは、核酸配列のいくつかまたはすべてを多数回にわたって複製し、次いで増幅産物を解析することである。ＰＣＲは、おそらく、いくつかの異なる増幅技法のうちの最もよく知られたものである。
【０００３】
ＰＣＲは、ＤＮＡの短い部分を増幅するための強力な技法である。ＰＣＲにより、単一のテンプレートＤＮＡ分子から始めて、何百ものＤＮＡのコピーを素早く生み出すことができる。ＰＣＲは、ＤＮＡの単一鎖への変性、プライマーの変性鎖へのアニール、および熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長の、３段階の温度サイクルを含む。検出され、解析されるべき十分なコピーが存在するように、このサイクルを繰り返す。原理的には、ＰＣＲの各サイクルが、コピー数を２倍にすることができる。実際には、各サイクルの後に達成される増殖は、常に２未満である。さらに、ＰＣＲサイクルが続くにつれ、必要とされる反応物質の濃度が低下するために、増幅されたＤＮＡ産物の増加は、最終的には停止する。ＰＣＲに関する一般的な詳細については、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．）、Ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁事業（２００５まで補遺）、ならびにＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を参照されたい。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲは、通常ＰＣＲサイクルごとに１回、反応の進行に従って増幅したＤＮＡ産物の増加を測定する、発展中の一連の技法を指す。産物の蓄積を経時的にモニターすることにより、反応の効率を判定すること、ならびにＤＮＡテンプレート分子の初期濃度を推定することが可能になる。リアルタイムＰＣＲに関する一般的な詳細については、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓら編、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４）を参照されたい。
【０００５】
現在、増幅したＤＮＡの存在を示すための、いくつかの異なるリアルタイム検出化学がある。これらのうち大部分が、ＰＣＲプロセスの結果として特性を変化させる蛍光指示薬に依存する。これらの検出化学の中に、２本鎖ＤＮＡとの結合時に蛍光効率を向上させるＤＮＡ結合色素（ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎなど）がある。他のリアルタイム検出化学は、色素の蛍光効率が別の光吸収部分または消光剤へのその接近に強く依存する現象である、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を利用する。これらの色素および消光剤は、通常、ＤＮＡ配列専用プローブまたはプライマーに付加される。ＦＲＥＴベースの検出化学の中に、加水分解プローブおよび構造プローブがある。加水分解プローブ（ＴａｑＭａｎプローブなど）は、ポリメラーゼ酵素を使用して、オリゴヌクレオチド・プローブに付加された消光剤色素分子からレポーター色素分子を切断する。構造プローブ（分子標識など）は、オリゴヌクレオチドに付加された色素を利用し、この色素の蛍光発光が、ターゲットＤＮＡと交雑するオリゴヌクレオチドの構造変化時に変化する。
【０００６】
リアルタイムＰＣＲを実施する市販の器具はいくつか存在する。入手可能な器具の例には、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＲＩＳＭ ７５００、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒ、およびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０が含まれる。これらの器具用のサンプル容器は閉管であり、これは、通常、少なくとも１０μｌ体積のサンプル溶液を必要とする。特定の分析によって検出可能なテンプレートＤＮＡの最低濃度が、およそマイクロリットル当たり１分子であるとすると、入手可能な器具の検出限界は、サンプル管当たりおよそ数十ターゲットである。したがって、単一分子の感受性を達成するためには、１〜１０００ｎｌの範囲で、より小さなサンプル体積をテストすることが望ましい。
【０００７】
より最近では、ＰＣＲ、および他の増幅反応を実施するためのいくつかの高スループット手法が開発されており、それらはたとえば、マイクロ流体デバイスにおける増幅反応、ならびにデバイス中またはデバイス上で増幅核酸を検出して解析するための方法を含む。マイクロ流体システムは、流体がそこを通って流れることができる少なくとも１つのチャネルを有するシステムであり、このチャネルは、約１０００マイクロメートル未満の、少なくとも１つの内部断面寸法（たとえば、深さ、幅、長さ、直径）を有する。典型的には、マイクロチャネルは、約５ミクロンから約５００ミクロンの断面寸法、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する。増幅のためのサンプルの熱サイクルは、通常、２つの方法のうちの１つで実現される。第１の方法では、従来のＰＣＲ器具によく似て、サンプル溶液がデバイス中に充填され、温度は時間とともに変更が繰り返される。第２の方法では、サンプル溶液は、空間的にさまざまな温度ゾーンを通って、連続的にポンプで送られる。
【０００８】
たとえば、Ｌａｇａｌｌｙら（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ７３：５６５〜５７０頁（２００１））は、２８０ｎｌのＰＣＲチャンバ内で、単一のテンプレートＤＮＡの増幅および検出を実証した。産物の検出は、ＰＣＲ後にキャピラリ電気泳動法を使用して行われた。一方で、Ｋｏｐｐら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０：１０４６〜１０４８頁（１９９８））は、９５℃（変性）、７２℃（伸長）、および６０℃（アニール）の３つの一定温度ゾーンの上を通る蛇行チャネルを有するガラス基材を使用して、連続フローＰＣＲを実証した。７２℃のゾーンは中央領域に位置し、９５℃から６０℃に進む際に、短く通過される必要があった。検出は、ＰＣＲ後にゲル電気泳動法を使用して行われた。このＰＣＲ技法は、反応槽の全表面の加熱に基づくものではないため、反応速度は、加熱速度／冷却速度ではなく、流量によって決定される。これらの参照のどちらも、ＰＣＲ反応のリアルタイム・モニタリングを説明していない。
【０００９】
Ｐａｒｋら（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ７５：６０２９〜６０３３頁（２００３））は、３つの温度制御されたブロックの周りに螺旋状に巻き付けられたポリイミド被覆の溶解シリカ・キャピラリを使用する、連続フローＰＣＲデバイスを説明している。サンプル体積は２μｌであった。検出は、ＰＣＲ後にゲル電気泳動法を使用して行われた。不透明なポリイミドの代わりに、ＰＴＦＥで被覆されたキャピラリを使用することにより、その器具をリアルタイムＰＣＲに適応する可能性に言及している。Ｈａｈｎら（国際公開第２００５／０７５６８３号）も参照されたい。
【００１０】
Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒら（米国特許第６，９６０，４３７号）は、３つの温度ゾーンを有する回転式チャネルを含むマイクロ流体デバイスを説明している。サンプルを導入して、これらのゾーンを通して回転式にポンプで送るために、いくつかの一体化されたバルブとポンプが使用される。
【００１１】
Ｋｎａｐｐら（米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号）は、あるマイクロ流体デバイスを説明している。いくつかの真っすぐな並列チャネルを有する平面状のガラス・チップが開示されている。ターゲットＤＮＡとＰＣＲ試薬との混合物が、これらのチャネル中に注入される。第１の実施形態では、チャネルはこの混合物で充填され、フローが止められる。次いで、チャネルの全長が熱的に循環される。熱サイクルが完了した後、ＤＮＡが増幅されている蛍光の領域を検出するために、チャネルがイメージ化される。第２の実施形態では、温度が循環されるときに、ＰＣＲ混合物が増幅ゾーンを通って連続して流れ、蛍光が増幅ゾーンの下流で検出される。サイクルに費やされる時間を変更すること、サイクルにおいて移動する距離を変化させることなどによって、異なる度合いの増幅が達成される。この方法が、個々のサンプル要素の進行を経時的にモニターするのでなく、別個の連続するサンプル要素について条件（経験されるサイクルなど）を変化させることは、注目に値する。
【００１２】
参照により本明細書に組み込まれる、Ｈａｓｓｏｎら（米国特許出願公開第２００８／０００３５８８号）は、マイクロ流体チャネルにおけるリアルタイムＰＣＲのための、より詳細には、連続フロー・マイクロ流体システムにおけるリアルタイムＰＣＲのための、システムおよび方法を説明している。この公開出願において説明されたシステムおよび方法によれば、マイクロ流体チャネルにおける流体の速度を、モニターし、調整することができる。
【００１３】
Ｌｉｕら（米国特許出願公開第２００２／０１６６５９２号）は、流量モニタリングのためのチップ・システムおよび方法を説明している。気泡が、マイクロ流体システムの分離チャネル中に導入される。気泡の速度は、気泡が、固定した距離を隔てた分離チャネルの両側に位置する２つのＬＥＤ／フォトダイオードの対を通るときに、その存在を光学的に検出することによって、決定される。環境光および他の散乱した光を遮断するために、チップ上にはクロム層が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００５／０７５６８３号
【特許文献２】米国特許第６，９６０，４３７号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００５／００４２６３９号
【特許文献４】米国特許出願公開第２００８／０００３５８８号
【特許文献５】米国特許出願公開第２００２／０１６６５９２号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ Ｅｄ．）、Ｖｏｌｓ．１−３、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２０００）
【非特許文献２】Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との間の合弁事業（２００５まで補遺）
【非特許文献３】ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍ．Ａ．Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９９０）
【非特許文献４】Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ：Ａｎ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ｋ．Ｅｄｗａｒｄｓら編、Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｏｒｗｉｃｈ、Ｕ．Ｋ．（２００４）
【非特許文献５】Ｌａｇａｌｌｙら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ７３：５６５〜５７０頁（２００１）
【非特許文献６】Ｋｏｐｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８０：１０４６〜１０４８頁（１９９８）
【非特許文献７】Ｐａｒｋら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ７５：６０２９〜６０３３頁（２００３）
【非特許文献８】Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献９】Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１０】Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１１】ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１２】Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ
【非特許文献１３】Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ Ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎ．Ｙ．
【非特許文献１４】Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９８４、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ（２０００）
【非特許文献１５】Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．
【非特許文献１６】Ｂｅｒｇら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ＤＮＡ配列を検出するための、マイクロ流体のゲノム・サンプル解析システムをさらに発展させることへの関心が寄せられており、これには、反応パラメータを最大限に活用するために、マイクロ流体チャネルにおいて流速および流量をモニターするためのシステムおよび方法を発展させることへの関心が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、チャネルにおいて、詳細には、マイクロ流体チャネルにおいて、速度またはフローをモニターするシステムおよび方法に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、連続フロー・マイクロ流体システムでリアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するためのシステムおよび方法において、速度または流量をモニターするシステムおよび方法に関する。
【００１８】
したがって、第１の態様において、本発明は、チャネルにおいて流速および流量をモニターするシステムを提供する。いくつかの実施形態において、システムは、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含むチップと、マイクロ流体チャネルを通して流体を移動させるための流体移動システムと、マイクロ流体チャネル中にフロー・マーカーを導入するためのフロー・マーカー導入システムと、２つの測定ポイントを生成するための照射システムと、チャネル内の２つの測定ポイント間でフロー・マーカーの移動を測定するための検出システムと、フロー・マーカー速度を決定し、速度を流量と関係付けるためのフロー計算システムとを含む。いくつかの実施形態において、チャネルは、フロー測定領域を含む。他の実施形態において、流体移動システムは、ポンプまたは真空機器である。さらなる実施形態において、フロー・マーカー導入システムは、圧電ノズル、バブルジェット（登録商標）・ヘッド、またはシッパー（ｓｉｐｐｅｒ）である。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、および散乱金属粒子からなる群から選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、マイクロチャネルは、約５ミクロンから約５００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する。他の実施形態において、マイクロチャネルは、約２０ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する。追加的な実施形態において、マイクロチャネルは、約３０ミクロンから約２５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する。さらなる実施形態において、マイクロチャネルは、約１５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する。いくつかの実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルと同じ幅である。他の実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルの残り部分と比較してより狭い。いくつかの実施形態において、フロー測定領域におけるマイクロチャネルは、約５ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する。他の実施形態において、フロー測定領域におけるマイクロチャネルは、約１０ミクロンから約２００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する。追加的な実施形態において、フロー測定領域におけるマイクロチャネルは、約２０ミクロンから約１００ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する。さらなる実施形態において、フロー測定領域におけるマイクロチャネルは、約４０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する。
【００２０】
いくつかの実施形態において、照射システムは、光源を含む。いくつかの実施形態において、照射システムは、チップからの裏面反射または内部反射により、１つの光源から２つの測定ポイントを生成する。いくつかの実施形態において、光源はレーザーである。他の実施形態において、光源はＬＥＤである。いくつかの実施形態において、検出システムは、レンズおよび検出器を含む。いくつかの実施形態において、フロー計算システムはコンピュータである。他の実施形態において、コンピュータはまた、フロー・マーカーの移動を検出するためのデータ取得速度を制御する。
【００２１】
第２の態様において、本発明は、チャネルにおいて流速および流量をモニターする方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、チップ中のマイクロ流体チャネルを通して溶液を移動させること、フロー・マーカーをチャネル中に導入すること、２つの測定ポイントにおいてチャネルを照射すること、チャネル内の２つの測定ポイント間でフロー・マーカーの移動を測定すること、および光学フロー・マーカー移動速度を流量と関係付けることを含む。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルは、上記で説明された寸法を有する。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーの移動は、チャネルのフロー測定領域において測定される。いくつかの実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルと同じ幅である。他の実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルの残り部分と比較してより狭い。いくつかの実施形態において、フロー測定領域におけるマイクロチャネルの寸法は、上記で説明された寸法を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、および散乱金属粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、注入によってチャネル中に導入されるバブルであり、バブルは、圧電ノズルによって形成される注入空気である。他の実施形態において、フロー・マーカーは、蒸気バブルを発生させるためのバブルジェット（登録商標）・ヘッドによって形成されるバブルである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、２つの測定ポイントの照射は、チップからの裏面反射または内部反射により、１つの光源から生成される。いくつかの実施形態において、光源はレーザーである。他の実施形態において、光源はＬＥＤである。いくつかの実施形態において、照射ポイントの１つは、チップからの内部反射である。いくつかの実施形態において、反射は、チップ材料と空気との屈折率の差によって引き起こされる内部反射により、チップの裏面から自然に引き起こされる。他の実施形態において、反射は、チップの片面の反射コーティングによって、引き起こされる、または増強される。追加的な実施形態において、チップの反射コーティングは、チャネル内のフロー測定領域と相互に一体化している。いくつかの実施形態において、照射の入射の角度は、約３０度から約６０度である。別の実施形態において、照射の入射の角度は、好ましくは約４５度である。
【００２４】
いくつかの実施形態において、フロー・マーカーの測定は、蛍光を含む。他の実施形態において、照射は、励起信号である。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーの測定は、検出システムを含む。いくつかの実施形態において、検出システムは、レンズおよび検出器を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態において、速度と流量との関係付けは、コンピュータによって実行される。いくつかの実施形態において、コンピュータはまた、フロー・マーカーの移動を測定するためのデータ取得速度を制御する。他の実施形態において、流量測定は、流量を調節するためのフィードバック・ループの一部である。他の実施形態において、照射は、散乱である光学信号、および／または自然なバックグラウンド信号から分離可能な反射を含む。
【００２６】
本発明の上記および他の実施形態が、添付の図面を参照して、以下で説明される。
【００２７】
本明細書において組み込まれ、その一部を形成する添付の図面が、本発明のさまざまな実施形態を図示する。図面において、同様の参照番号は、同一の、または機能的に類似した要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施形態に従ったシステムを示す図である。
【図２】本発明に関連して使用されてもよい、マイクロ流体デバイスまたはチップを示す図である。
【図３】マイクロ流体チャネルに関して、本発明の実施形態に従ったシステムを示す図である。
【図４】レーザー照射の主線において気泡が見られる、マイクロ流体チャネルにおけるＰＣＲ実験中に記録された画像である。
【図５】マイクロ流体チャネルに関して、本発明の追加的な実施形態に従ったシステムを示す図である。
【図６】マイクロ流体チャネルに関して、本発明のさらなる実施形態に従ったシステムを示す図である。
【図７】本発明の実施形態に従ったプロセスを示す流れ図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、いくつかの実施形態を有し、当業者に知られている詳細についての特許、特許出願、および他の参考文献に依拠する。したがって、特許、特許出願、または他の参考文献が、本明細書において引用される、または再現されるとき、それは、すべての目的のために、ならびに列挙される命題のために、その全体が参照により組み込まれることを理解されたい。
【００３０】
特に指示しない限り、本発明の実施には、当技術分野の範囲内である、有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組み換え技法を含む）、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技法および説明を用いることができる。そのような従来技法には、ポリマー・アレイ合成、ハイブリダイゼーション、連結反応、および、標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適切な技法の具体的な例示は、本明細書の以下の例を参照することによって得ることができる。ただし、当然のことながら、他の同等の従来手順も使用することができる。そのような従来技法および説明は、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（すべてＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより）、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ Ｅｄ．）Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎ．Ｙ．、Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９８４、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｘ（２０００）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、およびＢｅｒｇら（２００２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５ｔｈ Ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．などの標準的な実験室マニュアルにおいて見出すことができ、これら全部が、すべての目的のために、その全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
上記で説明したとおり、本発明は、チャネルにおいて、詳細には、マイクロ流体チャネルにおいて、より詳細には、連続フロー・マイクロ流体システムでリアルタイム・ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施するためのシステムおよび方法において、速度またはフローをモニターするシステムおよび方法を提供する。
【００３２】
図１に示すように、本発明の態様は、チャネルにおいて、詳細には、マイクロ流体チャネルにおいて、流速および流量をモニターするシステムを提供する。システムは、少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含むチップ１００と、マイクロ流体チャネルを通して流体を移動させるための流体移動システム１０４と、マイクロ流体チャネル中にフロー・マーカーを導入するためのフロー・マーカー導入システム１０６と、少なくとも２つの測定ポイントを生成するための照射システム１１２と、チャネル内の測定ポイント間でフロー・マーカーの移動を測定するための検出システム１１３と、フロー・マーカー速度を決定し、速度を流量と関係付けるためのフロー計算システム１１０とを含む。一実施形態では、流体移動システム１０４は、ポンプまたは真空機器である。フロー・マーカー導入システム１０６は、圧電ノズル、バブルジェット（登録商標）・ヘッド、またはシッパーである。フロー・マーカー導入システム１０６は、バルブを含む収束入口チャネルを含むことができる。フロー・マーカー導入システム１０６はまた、チャネルの内容物において測定可能な特性変化を誘導する指向性エネルギー源、たとえば、温度上昇を誘導するための熱源、または光化学反応を誘導するための光源を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、着色スラグ、および散乱金属粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、マイクロ流体チャネルは、フロー・マーカーの移動を検出するためのフロー測定領域を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態において、照射システム１１２は、レーザーである。他の実施形態において、照射システム１１２は、ＬＥＤである。いくつかの実施形態において、照射システム１１２は、ビーム分割デバイスを使用することなどによって、チャネル内の２つの測定ポイントにおいてフロー・マーカーの移動を測定するための２つの照射源を生成する。他の実施形態において、照射システム１１２は、レーザーまたはＬＥＤであってよい１つの光源から２つの測定ポイントを、裏面反射によって生成し、すなわち、測定ポイントのうちの１つは、チップ１００からの内部反射である。いくつかの実施形態において、反射は、チップ１００の片面の反射コーティングによって、引き起こされる、または増強される。いくつかの実施形態において、チップ１００の反射コーティングは、チャネル内のフロー測定領域と相互に一体化している。いくつかの実施形態において、検出システム１１３は、レンズおよび光検出器を含む。いくつかの実施形態において、検出システムは、たとえば、ビデオ・フレームレート・カメラなどのイメージング・システムを含む。いくつかの実施形態において、フロー計算システム１１０は、コンピュータである。他の実施形態において、コンピュータはまた、フロー・マーカーの移動を検出するためのデータ取得速度を制御する。
【００３５】
本発明と併せて使用することができるチップの一実施形態が、図２に示されている。チップ２００は、いくつかのマイクロ流体チャネル２０１を含む。示されている例では、３２のマイクロ流体チャネルがあるが、チップ２００は、３２よりも多い、または少ないチャネルを有してもよいことが企図される。チップは、必要に応じて、当業者により、フロー・マーカー導入システムを含むように変更することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体チャネル２０１は、約５ミクロンから約５００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する。他の実施形態において、マイクロ流体チャネル２０１は、約２０ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する。追加的な実施形態において、マイクロ流体チャネル２０１は、約３０ミクロンから約２５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する。さらなる実施形態において、マイクロ流体チャネル２０１は、約１５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する。
【００３７】
図３に示すように、チップ３００は、溶液の流量３０２を測定する／モニターするように所望される少なくとも１つのマイクロチャネル３０１を含む。この実施形態に示すように、マイクロチャネル３０１は、チャネルの残り部分と比較してより狭い、フロー測定領域３１４を含む。フロー測定領域３１４は、この領域の溶液の速度を上昇させるために、マイクロチャネル３１０の残り部分よりも狭く、それにより、流量／流速を計算するのに必要な測定時間を短縮することが所望されてよい。いくつかの実施形態において、マイクロ流体フローは、ある用途においては非常に遅いことがあるために、狭められたフロー測定領域３１４が所望される。この図に示すように、フロー測定領域３１４は、端部３１５ａ、３１５ｂによって、境界が定められる。
【００３８】
いくつかの実施形態において、マイクロチャネル３０１は、本明細書において説明されるような幅および深さを有する。いくつかの実施形態において、フロー測定領域３１４におけるマイクロチャネル３０１は、約５ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する。他の実施形態において、フロー測定領域３１４におけるマイクロチャネル３０１は、約１０ミクロンから約２００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する。追加的な実施形態において、フロー測定領域３１４におけるマイクロチャネル３０１は、約２０ミクロンから約１００ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する。さらなる実施形態において、フロー測定領域３１４におけるマイクロチャネル３０１は、約４０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する。
【００３９】
図３にさらに示すように、システムは、フロー・マーカーとしてのバブルを、マイクロチャネル３０１に注入するためのデバイス３０６を含む。デバイス３０６は、バブル発生器であってよく、バブル発生器は、蒸気バブルを形成させる強力な熱を発生させる（ａ）圧電空気注入ノズル、または（ｂ）バブルジェット（登録商標）・ノズルのいずれかであってよい。バブルジェット（登録商標）・ノズルが使用される場合、知られている、かつ制御可能な大きさ／体積のバブルを発生させるために、たとえば、１Ｈｚから１ｋＨｚの速度で繰り返し拍出してよい。
【００４０】
一実施形態において、システムは、レーザー３１２をさらに含む。レーザーは、フロー測定領域３１４内のポイントＡを照射する。レーザーは、チップ３００の裏面から反射され、レーザー反射が、フロー測定領域３１４内のポイントＢを照射する。マイクロ流体チップ３００の裏面からの反射メカニズムは、チップ材料と空気との屈折率の差から生じる内部反射によって自然に引き起こされる。いくつかの実施形態において、反射は、たとえば、チップ３００の片面の、薄い金属層または多層の誘電体コーティングなどの反射コーティングによって、引き起こされる、または増強される。いくつかの実施形態において、チップ３００の反射コーティングは、チャネル内のフロー測定領域３１４と相互に一体化している。いくつかの実施形態において、レーザーの入射の角度（θ）は、約３０度から約６０度である。別の実施形態において、レーザーの入射の角度（θ）は、好ましくは約４５度である。レーザーの波長は、典型的には、蛍光励起に使用される波長である。
【００４１】
ポイントＡおよびＢを流れ過ぎるバブルによって引き起こされた光学信号が、レンズ３１８および検出器３１９を含むことができる検出システム３１３によって検出される。レンズ３１８および検出器３１９は、一般的に使用される蛍光イメージング・デバイスや、または、たとえば２次元のＣＣＤまたはＣＭＯＳ画像センサなどの他の知られているイメージング・デバイスであってよい。
【００４２】
流速および流量は、計算システムによって計算される。流速は、ポイントＡとＢとの間の既知の距離を考慮して、ポイントＡとＢとの間の通過時間を測定することによって計算され、流量は、流速が既知になってから計算される。流速および流量を、以下の式に従って計算することができる。
流速＝（ＡからＢの距離）／通過時間
流量＝（チャネル幅×チャネルの深さ）×（流速）
【００４３】
動作では、フロー・バブルが、デバイス３０６によって、マイクロ流体チャネル３０１中に注入される。バブルは、チャネルに流れ下り、ポイントＡにおいてレーザー３１２によって短く照射される。バブルは下流へと流れるので、フロー測定領域３１４をマイクロチャネルの残り部分の中へとバブルが出て行くポイントであるポイントＢにおいて、バブルがレーザー反射によって追って照射される。レーザー照射ポイントを流れ過ぎたバブルによって引き起こされた光学信号が、外部測定機器のレンズ３１８および検出器３１９によって検出される。流速および流量は、本明細書において説明されるように計算される。
【００４４】
図４は、本発明の実施形態からのデータの例を示す。この例においては、４８８ｎｍの固体レーザーが使用された。使用された検出器は、Ａｎｄｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによって製造された、６５８×４９６ピクセルの解像度を有するＥＭＣＣＤ増幅イメージング検出器であった。画像２および画像３は、バブル・イメージング現象が観察されたこの実験からのデータを表す。画像２は、レーザー照射の主線に入るバブルを示し、マイクロ流体チャネル番号３において、明るいスポットとして見ることができる。画像２の底縁において目に見えるかすかなスポットは、内部反射スポットである。画像３は、画像２から遅延した時間（およそ１．５秒）に取得された画像であった。したがって、バブルは、マイクロ流体チャネルにおいてその距離を通過しており、入射レーザービームの内部反射エネルギーによって可視化されている。
【００４５】
画像は、プログラムされた目的領域（範囲）（ＲＯＩ）上でピクセル値を統合することができるイメージング・ソフトウェアを使用して、処理される。次いで、対時間でプロットされたＲＯＩデータが、バブルが流れ過ぎるときのピーク信号を見つけるために解析される。ピーク値は、タイミング測定を行うためのトリガ・ポイントである。通常の光揺らぎは、当技術分野でよく知られている時間バンドパス・アルゴリズムを使用して、（より速い時定数を有する）バブルから、時間フィルタにかけられる。
【００４６】
本発明の別の実施形態が、図５に示されている。チップ５００は、流量５０２を測定する／モニターするように所望される少なくとも１つのマイクロチャネル５０１を含む。この実施形態に示すように、マイクロチャネル５０１は、狭められていないフロー測定領域５１４を含む。この図に示すように、フロー測定領域５１４は、端部５１５ａ、５１５ｂによって、境界が定められる。さらに図５に示すように、システムは、フロー・マーカーとしてのバブルを、マイクロチャネル５０１中に注入するためのデバイス５０６を含む。デバイス５０６は、本明細書において説明されるようなバブル発生器であってよい。システムは、レーザー５１２をさらに含む。レーザーは、フロー測定領域５１４内のポイントＡを照射する。レーザーは、チップ５００の裏面から反射され、レーザー反射が、フロー測定領域５１４内のポイントＢを照射する。反射メカニズムは、本明細書において説明されるように引き起こされてよい。レーザーの入射の角度（θ）は、本明細書において説明されるようであってよい。ポイントＡおよびＢを流れ過ぎるバブルによって引き起こされた光学信号が、レンズ５１８および検出器５１９を含むことができる検出システム５１３によって検出される。レンズ５１８および検出器５１９は、本明細書において説明されるようであってよい。流速および流量が、本明細書において説明されるように計算される。
【００４７】
本発明の別の実施形態が、図６に示されている。チップ６００は、流量６０２を測定する／モニターするように所望される少なくとも１つのマイクロチャネル６０１を含む。この実施形態に示すように、マイクロチャネル６０１は、チャネルの残り部分よりも狭いフロー測定領域６１４を含む。この図に示すように、フロー測定領域６１４は、端部６１５ａ、６１５ｂによって、境界が定められる。さらに図６に示すように、システムは、レーザー６１２をさらに含む。レーザーは、フロー測定領域６１４内のポイントＡを照射する。レーザーは、チップ６００の裏面から反射され、レーザー反射が、フロー測定領域６１４内のポイントＢを照射する。反射メカニズムは、本明細書において説明されるように引き起こされてよい。レーザーの入射の角度（θ）は、本明細書において説明されるようであってよい。ポイントＡおよびＢを流れ過ぎるマーカーによって引き起こされた光学信号が、レンズ６１８および検出器６１９を含むことができる検出システム６１３によって検出される。レンズ６１８および検出器６１９は、本明細書において説明されるようであってよい。流速および流量が、本明細書において説明されるように計算される。この実施形態では、マーカーは、マイクロチャネル６０１中に導入される、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、および散乱金属粒子であってよい。マーカーは、たとえば、当技術分野で一般的であるようにチップ６００の一部である、または当技術分野で一般的であるようにチップ６００と組み合わせて利用される、シッパー（図示せず）によって、マイクロチャネル６０１中に導入されてよい。
【００４８】
本発明はまた、チャネルにおいて流速および流量をモニターする方法も提供する。いくつかの実施形態において、方法は、チップ中のマイクロ流体チャネルを通して溶液を移動させること、フロー・マーカーをチャネル中に導入すること、２つの測定ポイントにおいてチャネルを照射すること、チャネル内の２つの測定ポイント間でフロー・マーカーの移動を測定すること、および光学フロー・マーカー移動速度を流量と関係付けることを含む。いくつかの実施形態において、マイクロチャネルは、本明細書において説明された寸法を有する。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーの移動は、チャネルのフロー測定領域において測定される。いくつかの実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルと同じ幅である。他の実施形態において、チャネルのフロー測定領域は、チャネルの残り部分と比較してより狭い。いくつかの実施形態において、狭められたフロー測定領域におけるマイクロチャネルの寸法は、本明細書において説明された寸法を有する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、および散乱金属粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、フロー・マーカーは、注入によってチャネル中に導入されるバブルであり、バブルは、圧電ノズルによって形成される注入空気である。他の実施形態において、フロー・マーカーは、蒸気バブルを発生させるためのバブルジェット（登録商標）・ヘッドによって形成されるバブルである。さらなる実施形態では、フロー・マーカーは、シッパーによってチャネル中に導入される、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、および散乱金属粒子である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、２つの測定ポイントの照射は、裏面反射による１つの光源から生成される。いくつかの実施形態において、光源はレーザーである。他の実施形態において、光源はＬＥＤである。いくつかの実施形態において、照射ポイントの１つは、チップからの内部反射である。いくつかの実施形態において、反射は、チップ材料と空気との屈折率の差によって引き起こされる内部反射により、チップの裏面から自然に引き起こされる。他の実施形態において、反射は、チップの片面の反射コーティングによって、引き起こされる、または増強される。追加的な実施形態において、チップの反射コーティングは、チャネル内のフロー測定領域と相互に一体化している。いくつかの実施形態において、照射の入射の角度は、約３０度から約６０度である。別の実施形態において、照射の入射の角度は、好ましくは約４５度である。
【００５１】
いくつかの実施形態において、チャネル内のフロー・マーカーの測定は、蛍光を含む。他の実施形態において、照射は、励起信号である。いくつかの実施形態において、光学励起信号は、チャネル内のフロー測定領域内の２つのポイントにおいてフロー・マーカーの移動を測定するための、照射の２つの源を生成するレーザーである。照射の２つの源を、ビーム分割デバイスを使用することによって、作成することができる。いくつかの実施形態において、検出システムは、レンズおよび検出器を含む。いくつかの実施形態において、光学検出は、散乱である光学信号、および／または自然なバックグラウンド信号から分離可能な反射を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態において、速度の計算、および速度と流量との関係付けは、コンピュータによって実行される。いくつかの実施形態において、コンピュータはまた、フロー・マーカーの移動を測定するためのデータ取得速度を制御する。他の実施形態において、流量測定は、流量を調節するためのフィードバック・ループの一部である。
【００５３】
図７は、本発明の実施形態に従ったプロセス７００を示す流れ図である。プロセス７００は、少なくとも１つのマイクロチャネルを有するチップ１００における流体フローが、流体移動システム１０４によってアクティブな状態にされた、ステップ７０２で開始することができる。ステップ７０４で、本明細書では時にフロー測定領域と呼ばれるチャネル領域をモニターするように設定される検出システム１１３から、光学データが取得され、ベースライン信号が確立される。ステップ７０６で、気泡が、フロー・マーカー導入システム１０６によってチャネル中に導入される。
【００５４】
ステップ７０８で、光学データが、検出システム１１３から取得される。ステップ７１０で、データの解析が、ロケーション１におけるバブルの特徴が検出され、第１のタイムスタンプが、この検出に関連付けられる。
【００５５】
ステップ７１２で、光学データが、検出システム１１３から取得される。ステップ７１４で、データの解析が、ロケーション２におけるバブルの特徴が検出され、第２のタイムスタンプが、この検出に関連付けられる。
【００５６】
ステップ７１６で、流体の流速が、フロー計算システム１１０によって計算され、流体の流量もまた計算されてよい。ステップ７１８で、次いで流速および／または流量が、チャネル内で実施されている反応の仕様内にあるかどうかを判定するために問い合わせられる。ステップ７１８における問い合わせの答えが肯定である場合、ステップ７２０で、適切な時間遅延の後に、開始ステップ７０６により連続して反復されるモニタリングのために、時間遅延を提供する。
【００５７】
ステップ７１８における問い合わせの答えが否定である場合、ステップ７２２が開始される。ステップ７２２で、流速値が、フロー較正アルゴリズムと比較される。ステップ７２４で、必要なフロー調整が計算される。ステップ７２６で、流体フローは、流体移動システム１０４によって、必要な調整量分だけ調整される。ステップ７２８で、流量が、開始ステップ７０６によって検証される。
【００５８】
本発明は、いくつかの利点を有する。たとえば、本発明のこれらの態様は、（１）マイクロ流体フロー・パス中に注入される、バブルなどの不活性物質を使用すること、（２）内部反射の特性を利用して第２の測定ゾーンを作成し、したがって、より単純な光学設計を有すること、（３）たとえば、リアルタイムＰＣＲで蛍光をモニターするといった別の主目的を有する同じ光学システムと共有することができるフロー測定光学システムを利用すること、および（４）バブルが使用される場合に、独立した波長であるフロー測定システムを利用することを含む。
【００５９】
本発明を説明するコンテキスト（特に以下の特許請求の範囲のコンテキスト）における、用語「ａ」および「ａｎ」、「ｔｈｅ」、ならびに同類の指示対象の使用は、本明細書において特に指示しない限り、またはコンテキストによって明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を包むように解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「収容する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に言及しない限り、制限のない用語（すなわち、「含むが、限定はしない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において特に指示しない限り、その範囲内に入るそれぞれ分離した値に個別に言及する簡便な方法としての働きをすることを単に意図しており、それぞれの分離した値は、本明細書において個別に列挙されたかのように、本明細書に組み込まれる。たとえば、範囲１０〜１５が開示されている場合、１１、１２、１３、および１４もまた開示される。本明細書において説明されるすべての方法は、本明細書において特に指示しない限り、またはコンテキストによって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序において実施されてよい。本明細書において提供される任意のおよびすべての例の使用、または例示的な語（たとえば「など」）は、本発明をよりよく照らすことを単に意図しており、特に主張しない限り、本発明の範囲に限定を与えるものではない。本明細書におけるいかなる語も、特許請求されないあらゆる要素を、本発明の実施に必須であるとして示さないものと解釈されるべきである。
【００６０】
本発明の方法および構成要素は、本明細書において開示されているのはそのうちのいくつかにすぎない、さまざまな実施形態の形で組み込まれてもよいことが理解されるであろう。それらの実施形態の変形形態は、前述の説明を読めば、当業者には明らかになり得る。本発明者らは、当業者がそのような変形形態を適切に利用することを期待しており、本明細書において詳細に説明したものとは別のやり方で、本発明が実施されることを意図している。さらに、そのすべての考え得る変形形態における、上記で説明した要素のいかなる組合せも、本明細書において特に指示しない限り、またはコンテキストによって明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロ流体チャネルにおいて溶液の速度をモニターするためのシステムであって、
（ａ）少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含むチップと、
（ｂ）前記マイクロ流体チャネルを通して流体を移動させるための流体移動システムと、
（ｃ）前記マイクロ流体チャネル中にフロー・マーカーを導入するためのフロー・マーカー導入システムと、
（ｄ）少なくとも２つの測定ポイントを生成するための照射システムと、
（ｅ）前記マイクロ流体チャネル内の前記少なくとも２つの測定ポイント間で前記フロー・マーカーの移動を測定するための検出システムと、
（ｆ）フロー・マーカー速度を決定し、前記フロー・マーカー速度を流量と関係付けるためのフロー計算システムと
を含むシステム。
【請求項２】
前記照射システムが、裏面反射によって、１つの光源から前記少なくとも２つの測定ポイントを生成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記光源がレーザーである、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記光源がＬＥＤである、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記マイクロ流体チャネルが、フロー測定領域を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記マイクロ流体チャネルの前記フロー測定領域の少なくとも一部が、前記マイクロ流体チャネルの前記フロー測定領域以外の部分と比較してより狭い、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記流体移動システムが、ポンプまたは真空機器を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記フロー・マーカー導入システムが、圧電ノズル、バブルジェット（登録商標）・ヘッド、シッパー、バルブを含む収束入口チャネル、または指向性エネルギー源を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記フロー・マーカーが、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、着色スラグ、および散乱金属粒子からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記マイクロ流体チャネルが、約５ミクロンから約５００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記マイクロ流体チャネルが、約２０ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記マイクロ流体チャネルが、約３０ミクロンから約２５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
前記マイクロ流体チャネルが、約１５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１４】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約５ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する、請求項６に記載のシステム。
【請求項１５】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約１０ミクロンから約２００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約２０ミクロンから約１００ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約４０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】
前記フロー・マーカー速度を決定し、前記フロー・マーカー速度を前記流量と関係付けるための前記フロー計算システムが、コンピュータを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記コンピュータがまた、前記フロー・マーカーの移動を検出するためのデータ取得速度を制御する、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
マイクロ流体チャネルにおいて溶液の速度をモニターする方法であって、
（ａ）チップ中のマイクロ流体チャネルを通して溶液を移動させること、
（ｂ）フロー・マーカーを前記マイクロ流体チャネル中に導入すること、
（ｃ）２つの測定ポイントにおいて前記マイクロ流体チャネルを照射すること、
（ｄ）前記マイクロ流体チャネル内の前記２つの測定ポイント間で前記フロー・マーカーの移動を測定すること、および
（ｅ）光学フロー・マーカー移動速度を流量と関係付けること
を含む方法。
【請求項２１】
前記２つの測定ポイントが、裏面反射によって、１つの光源から生成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記光源がレーザーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記光源がＬＥＤである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記裏面反射が、前記チップの片面の反射コーティングによって引き起こされる、または増強される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記チップの前記反射コーティングが、前記マイクロ流体チャネル内のフロー測定領域と相互に一体化している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記マイクロ流体チャネルの照射の入射の角度が、約３０度から約６０度である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロ流体チャネルの照射の入射の角度が、約４５度である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記フロー・マーカーの移動が、前記マイクロ流体チャネルのフロー測定領域において測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロ流体チャネルの前記フロー測定領域が、前記マイクロ流体チャネルの前記フロー測定領域以外の部分と比較してより狭い、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記フロー・マーカーが、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、着色スラグ、および散乱金属粒子からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記フロー・マーカーが、注入によって前記マイクロ流体チャネル中に導入されるバブルであって、前記バブルが、圧電ノズルにより形成される注入空気である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記フロー・マーカーが、蒸気バブルを発生させるためのバブルジェット（登録商標）・ヘッドによって形成されるバブルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記マイクロ流体チャネルが、約５ミクロンから約５００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記マイクロ流体チャネルが、約２０ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロ流体チャネルが、約３０ミクロンから約２５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記マイクロ流体チャネルが、約１５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約５ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約１０ミクロンから約２００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約２０ミクロンから約１００ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約４０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記フロー・マーカーの移動の測定が、蛍光を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
前記マイクロ流体チャネルの照射が、励起信号である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記マイクロ流体チャネルが、光学クリア・ガラス、石英、またはプラスチックから制作される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４４】
前記光学フロー・マーカー移動速度と前記流量との関係付けが、コンピュータによって実行される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４５】
前記コンピュータがまた、前記フロー・マーカーの移動を測定するためのデータ取得速度を制御する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記流量の測定が、前記流量を調節するためのフィードバック・ループの一部である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記流量の測定が、前記流量を調節するためのフィードバック・ループの一部である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記マイクロ流体チャネルの照射が、散乱である光学信号、および／または自然なバックグラウンド信号から分離可能な反射を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項１】
マイクロ流体チャネルにおいて溶液の速度をモニターするためのシステムであって、
（ａ）少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを含むチップと、
（ｂ）前記マイクロ流体チャネルを通して流体を移動させるための流体移動システムと、
（ｃ）前記マイクロ流体チャネル中にフロー・マーカーを導入するためのフロー・マーカー導入システムと、
（ｄ）少なくとも２つの測定ポイントを生成するための照射システムと、
（ｅ）前記マイクロ流体チャネル内の前記少なくとも２つの測定ポイント間で前記フロー・マーカーの移動を測定するための検出システムと、
（ｆ）フロー・マーカー速度を決定し、前記フロー・マーカー速度を流量と関係付けるためのフロー計算システムと
を含むシステム。
【請求項２】
前記照射システムが、裏面反射によって、１つの光源から前記少なくとも２つの測定ポイントを生成する、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記光源がレーザーである、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
前記光源がＬＥＤである、請求項２に記載のシステム。
【請求項５】
前記マイクロ流体チャネルが、フロー測定領域を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記マイクロ流体チャネルの前記フロー測定領域の少なくとも一部が、前記マイクロ流体チャネルの前記フロー測定領域以外の部分と比較してより狭い、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
前記流体移動システムが、ポンプまたは真空機器を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記フロー・マーカー導入システムが、圧電ノズル、バブルジェット（登録商標）・ヘッド、シッパー、バルブを含む収束入口チャネル、または指向性エネルギー源を含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記フロー・マーカーが、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、着色スラグ、および散乱金属粒子からなる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
前記マイクロ流体チャネルが、約５ミクロンから約５００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記マイクロ流体チャネルが、約２０ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
前記マイクロ流体チャネルが、約３０ミクロンから約２５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
前記マイクロ流体チャネルが、約１５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１４】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約５ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する、請求項６に記載のシステム。
【請求項１５】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約１０ミクロンから約２００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約２０ミクロンから約１００ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１７】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約４０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１８】
前記フロー・マーカー速度を決定し、前記フロー・マーカー速度を前記流量と関係付けるための前記フロー計算システムが、コンピュータを含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
前記コンピュータがまた、前記フロー・マーカーの移動を検出するためのデータ取得速度を制御する、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
マイクロ流体チャネルにおいて溶液の速度をモニターする方法であって、
（ａ）チップ中のマイクロ流体チャネルを通して溶液を移動させること、
（ｂ）フロー・マーカーを前記マイクロ流体チャネル中に導入すること、
（ｃ）２つの測定ポイントにおいて前記マイクロ流体チャネルを照射すること、
（ｄ）前記マイクロ流体チャネル内の前記２つの測定ポイント間で前記フロー・マーカーの移動を測定すること、および
（ｅ）光学フロー・マーカー移動速度を流量と関係付けること
を含む方法。
【請求項２１】
前記２つの測定ポイントが、裏面反射によって、１つの光源から生成される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記光源がレーザーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記光源がＬＥＤである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記裏面反射が、前記チップの片面の反射コーティングによって引き起こされる、または増強される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記チップの前記反射コーティングが、前記マイクロ流体チャネル内のフロー測定領域と相互に一体化している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記マイクロ流体チャネルの照射の入射の角度が、約３０度から約６０度である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記マイクロ流体チャネルの照射の入射の角度が、約４５度である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記フロー・マーカーの移動が、前記マイクロ流体チャネルのフロー測定領域において測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロ流体チャネルの前記フロー測定領域が、前記マイクロ流体チャネルの前記フロー測定領域以外の部分と比較してより狭い、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記フロー・マーカーが、バブル、半導体量子ドット、ポリマー・マイクロビーズ、蛍光粒子、着色スラグ、および散乱金属粒子からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記フロー・マーカーが、注入によって前記マイクロ流体チャネル中に導入されるバブルであって、前記バブルが、圧電ノズルにより形成される注入空気である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記フロー・マーカーが、蒸気バブルを発生させるためのバブルジェット（登録商標）・ヘッドによって形成されるバブルである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記マイクロ流体チャネルが、約５ミクロンから約５００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
前記マイクロ流体チャネルが、約２０ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロ流体チャネルが、約３０ミクロンから約２５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記マイクロ流体チャネルが、約１５０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約５ミクロンから約４００ミクロンの幅、および約１ミクロンから約１００ミクロンの深さを有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約１０ミクロンから約２００ミクロンの幅、および約５ミクロンから約５０ミクロンの深さを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約２０ミクロンから約１００ミクロンの幅、および約１０ミクロンから約２０ミクロンの深さを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記フロー測定領域における前記マイクロ流体チャネルが、約４０ミクロンの幅、および約１０ミクロンの深さを有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記フロー・マーカーの移動の測定が、蛍光を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４２】
前記マイクロ流体チャネルの照射が、励起信号である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記マイクロ流体チャネルが、光学クリア・ガラス、石英、またはプラスチックから制作される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４４】
前記光学フロー・マーカー移動速度と前記流量との関係付けが、コンピュータによって実行される、請求項２０に記載の方法。
【請求項４５】
前記コンピュータがまた、前記フロー・マーカーの移動を測定するためのデータ取得速度を制御する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記流量の測定が、前記流量を調節するためのフィードバック・ループの一部である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記流量の測定が、前記流量を調節するためのフィードバック・ループの一部である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記マイクロ流体チャネルの照射が、散乱である光学信号、および／または自然なバックグラウンド信号から分離可能な反射を含む、請求項２０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５１５５５８（Ｐ２０１２−５１５５５８Ａ）
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５４８１７６（Ｐ２０１１−５４８１７６）
【出願日】平成２２年１月２５日（２０１０．１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２１９３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８５７２７
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５０７０２８２１７）キヤノン ユー．エス． ライフ サイエンシズ， インコーポレイテッド (22)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＯＮ Ｕ．Ｓ． ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】９８００ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ Ｓｕｉｔｅ Ａ−１００ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５０ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年７月１２日（２０１２．７．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１月２５日（２０１０．１．２５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２１９３３
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０８５７２７
【国際公開日】平成２２年７月２９日（２０１０．７．２９）
【出願人】（５０７０２８２１７）キヤノン ユー．エス． ライフ サイエンシズ， インコーポレイテッド (22)
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＮＯＮ Ｕ．Ｓ． ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ， ＩＮＣ．
【住所又は居所原語表記】９８００ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｄｒｉｖｅ Ｓｕｉｔｅ Ａ−１００ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５０ Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】
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