塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率の検査方法
【課題】 本邦において塩酸チクロピジン投与の３つの重大な副作用（血栓性血小板減少性紫斑病、重篤な肝臓障害、無顆粒球症）のうち、特に日本人で報告件数が多い肝臓障害の発現に関する遺伝学的素因の解明を課題とする。
【解決手段】 塩酸チクロピジンによる肝臓障害を発現した日本人症例の血液試料（肝臓障害群）とチクロピジンが投与され何ら有害事象が発現しなかった日本人症例の血液試料（コントロール群）を収集し、主に薬物代謝関連遺伝子、免疫学的パラメータと肝臓障害発現との関連性を検討した。このうちＨＬＡの遺伝子型との間において統計学的に有意な相関を見出し本発明を完成した。
【解決手段】 塩酸チクロピジンによる肝臓障害を発現した日本人症例の血液試料（肝臓障害群）とチクロピジンが投与され何ら有害事象が発現しなかった日本人症例の血液試料（コントロール群）を収集し、主に薬物代謝関連遺伝子、免疫学的パラメータと肝臓障害発現との関連性を検討した。このうちＨＬＡの遺伝子型との間において統計学的に有意な相関を見出し本発明を完成した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率の検査方法に関する。本発明はまた、塩酸チクロピジン副作用である肝臓障害の関連遺伝子の遺伝子型の検出方法を用いることを手段とする肝臓障害発生危険率の検査方法に関する。より詳しくは、本発明は、ヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ、以下、ＨＬＡと略す）の特定アリル及び／又はハプロタイプが塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連であることを同定し、かつ当該特定アリル及び／又はハプロタイプを検出することを手段とする、肝臓障害発生危険率の検査方法に関する。本発明はまた、前記検査方法に用いるポリヌクレオチド及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
塩酸チクロピジンは、血栓性疾患（例えば虚血性脳血管障害等に伴う血栓・塞栓や慢性動脈閉塞症）の治療並びに血栓性疾患に伴う症状の改善等に使用されている抗血小板剤である。これまで、日本、米国、欧州各国等９０ヶ国以上で販売されている。日本では年間販売実績約３００億円の大型医薬品で、推定使用患者数は年間約１００万人である。しかしながら、塩酸チクロピジンについては、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、無顆粒球症、及び重篤な肝臓障害という重大な副作用が発現することが知られている。このため、これら副作用の早期発見、未然防止のため、医療関係者への情報提供の徹底が図られている。これらの重い副作用はその約９割が投与開始後２ヶ月以内に発現しており、本医薬品投与開始２ヶ月間、２週に１回の定期的検査（血液、肝機能）を行うことで、これら副作用の早期発見、重篤化の防止が可能であるとされている。しかしながら、平成１１年７月以降、これらの副作用報告数は明確には減少しておらず、平成１３年７月から１４年６月までに血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）１３例（うち死亡５例）、顆粒球減少（無顆粒球症を含む）３５例（うち死亡６例）、重篤な肝臓障害９７例（うち死亡６例）の報告が企業から厚生労働省に対してなされている。
【０００３】
ヒトＭＨＣ（主要組織適合性複合体又は主要組織適合抗原）分子であるＨＬＡ分子は、１９５２年に輸血患者血清中に白血球凝集試験で反応する抗体が見出され、これに対する抗原として発見された。ＨＬＡ分子は、第６染色体短腕部の６ｐ２１．３の約４，０００ｋｂｐ内に存在するＭＨＣ領域によりコードされた遺伝子群に支配される遺伝子産物である。このＭＨＣ領域は、殆どの真核細胞膜表面上に表現されるＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗原系を支配するクラスＩ遺伝子領域と、Ｂ細胞やマクロファージ等の限定された組織あるいは細胞にしか表現されていない細胞特異的なＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ抗原系を支配するクラスＩＩ遺伝子領域、及び補体成分と２１−ヒドロキシラーゼ等を支配するクラスＩＩＩ遺伝子領域より構成されている。
【０００４】
ＨＬＡクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子領域にコードされる４４ｋＤａの膜結合型蛋白α鎖と、第１５染色体の支配を受ける分子量１１ｋＤａのβ２−ミクログロブリン（β鎖）とによって構成されている。クラスＩ分子は、遺伝的多型性に富むことが知られている。
【０００５】
ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子領域にコードされる３４ｋＤａの糖蛋白（α鎖）と２９ｋＤａの糖蛋白（β鎖）が非共有結合した細胞膜抗原である。クラスＩＩ遺伝子は、α鎖遺伝子が７個、β鎖遺伝子が９〜１２個（１６種）というようにクラスターを形成し、多重遺伝子族を構成する。クラスＩＩ遺伝子領域には、セントロメア側からＤＰ−ＤＮ−ＤＭ−ＤＯ−ＤＱ−ＤＲの順に各遺伝子が位置する。ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ抗原は多数のアリル抗原タイプからなり、その多型性は主にβ鎖（Ｂ１）のアミノ酸配列の違いによって決定される。なお、ＤＲ、ＤＱ抗原はＢ細胞によって産生される抗体によって認識されるエピトープである。
【０００６】
ＨＬＡ分子はいずれも２６０−３７０個程度のアミノ酸がひとかたまりになったドメイン構造によって構成される。クラスＩ分子は、そのα鎖が、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン、膜貫通（ＴＭ）領域、細胞内（ＣＹ）領域からなり、α１ドメインとα２ドメインが多型性部位を構成する。クラスＩＩ分子は、α１（β１）ドメイン、α２（β２）ドメイン、結合ペプチド（ＣＰ）、ＴＭ領域、ＣＹ領域からなり、α１ドメインとβ１ドメインが多型性部位を構成し、α２ドメインとβ２ドメインがクラスＩＩ分子の基底部を形作っている。
【０００７】
ＨＬＡ分子の遺伝的多型性は、対応する各ＨＬＡ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の違いによって形成される。これは各遺伝子ＤＮＡの塩基配列の差の反映であり、これまでに殆ど全てのアリル抗原タイプの塩基配列が決定されている（非特許文献１）。多型性を示す領域は、クラスＩ分子ではα１、α２ドメインに集中し、α１ドメインＣ端側・α２ドメインＮ端側に各１個の共通する超可変部が存在する。クラスＩＩ分子では、超可変部がＤＱα鎖のα１ドメインとＤＲβ、ＤＱβ、ＤＰβ鎖のβ１ドメインに存在し、各ドメインの特定３ヶ所の領域に多型性が集中している（非特許文献２）。これら超可変部のアミノ酸残基の置換、あるいはアリル抗原タイプの違いは、抗原ペプチドに対するＨＬＡ分子の親和性に直接的な影響を与え、特定のＨＬＡ分子と結合できる抗原ペプチドの種類を変化させるのみならず、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との親和性にも影響して、結果として抗原提示能をも変化させる。そして、ＨＬＡ抗原型の異なる個人間では外来抗原や自己抗原に対する免疫応答能に差が出来ることとなり、免疫応答の個体差が生まれる。
【０００８】
これまでＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプと塩酸チクロピジンによる肝臓障害との相関性については一切の報告がない。
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，４６，２５８−２８０，１９９５
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８４，６２３４−６２３８，１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、本邦において塩酸チクロピジンの３つの重大な副作用（血栓性血小板減少性紫斑病、重篤な肝臓障害、無顆粒球症）のうち、特に日本人で報告件数が多い肝臓障害の発現に関する遺伝学的素因の解明を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、塩酸チクロピジンによる肝臓障害を発現した日本人症例の血液試料（肝臓障害群）と塩酸チクロピジンが投与され何ら有害事象が発現しなかった日本人症例の血液試料（コントロール群）を収集し、主に薬物代謝関連遺伝子、免疫学的パラメータと肝臓障害発現との関連性を検討した。このうちＨＬＡの遺伝子型と塩酸チクロピジンによる肝臓障害発現との間において統計学的に有意な相関を見出し本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下からなる。
【００１３】
１．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群分析をなし、肝臓障害群の患者由来の各ＨＬＡ遺伝子型について、アリル頻度及び／又はハプロタイプ頻度分析によって、肝臓障害群と特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプとの相関性を判定することを含む塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル又は／及びＨＬＡハプロタイプのスクリーニング方法で特定されたＨＬＡアリル及び／又はハプロタイプをマーカーとする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００１４】
２．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００１５】
３．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡハプロタイプとして、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２及びＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４をマーカーとする、上記２．の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００１６】
４．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとし、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られたＰＣＲ産物を直接的に同定する、得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、又は、得られたＰＣＲ産物について上記特定ＤＮＡ断片の特定部位の塩基をタイピング法で決定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００１７】
５．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせをマーカーとして設計されたプライマーを用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物を直接的に同定する、得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、又は、得られたＰＣＲ産物について上記特定ＤＮＡ断片の特定部位の塩基をタイピング法で決定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００１８】
６．少なくともＨＬＡ−Ａ＊３３０３が検出される患者への投与が制限される塩酸チクロピジンを含有する医薬。
【００１９】
７．以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１をフォワード及びリバースプライマーとして用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をＰＣＲによって増幅する、上記５．の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１）配列番号１の配列と配列番号２の配列
２）配列番号３の配列と配列番号５の配列
３）配列番号４の配列と配列番号５の配列
３）配列番号６の配列と配列番号７の配列
４）配列番号６の配列と配列番号８の配列
５）配列番号１１の配列と配列番号１２の配列
６）配列番号１３の配列と配列番号１４の配列
７）配列番号２３の配列と配列番号２４の配列
８）配列番号２５の配列と配列番号２７の配列
９）配列番号２６の配列と配列番号２７の配列
１０）配列番号２８の配列と配列番号２９の配列
１１）配列番号２８の配列と配列番号３０の配列
１２）配列番号３１の配列と配列番号３２の配列。
【００２０】
８．以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１をフォワード及びリバースプライマーとして用いてＰＣＲによって増幅し、コントロールとして使用する、上記５．又は７．の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１３）配列番号９の配列と配列番号１０の配列
１４）配列番号１５の配列と配列番号１６の配列
１５）配列番号３３の配列と配列番号３４の配列
１６）配列番号３５の配列と配列番号３６の配列。
【００２１】
９．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとし、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法により増幅し、得られた増幅産物を直接的に同定する、又は、増幅の有無を同定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００２２】
１０．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせをマーカーとして設計されたプライマーを用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法により増幅し、得られた増幅産物を直接的に同定する、又は、増幅の有無を同定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００２３】
１１．以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１又は２以上の組み合わせをプライマーとして用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をＬＡＭＰ法によって増幅する、上記１０．の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１７）配列番号３７の配列、配列番号３８の配列、配列番号３９の配列、配列番号４０の配列、配列番号４１の配列、及び配列番号４２の配列、
１８）配列番号４３の配列、配列番号４４の配列、配列番号４５の配列、配列番号４６の配列、配列番号４７の配列、及び配列番号４８の配列、
１９）配列番号４９の配列、配列番号５０の配列、配列番号５１の配列、配列番号５２の配列、配列番号５３の配列、及び配列番号５４の配列、
２０）配列番号５５の配列、配列番号５６の配列、配列番号５７の配列、配列番号５８の配列、配列番号５９の配列、及び配列番号６０の配列、
２１）配列番号６１の配列、配列番号６２の配列、配列番号６３の配列、配列番号６４の配列、配列番号６５の配列、及び配列番号６６の配列、
２２）配列番号６７の配列、配列番号６８の配列、配列番号６９の配列、配列番号７０の配列、配列番号７１の配列、及び配列番号７２の配列、
２３）配列番号７３の配列、配列番号７４の配列、配列番号７５の配列、配列番号７６の配列、配列番号７７の配列、及び配列番号７８の配列、
２４）配列番号７９の配列、配列番号８０の配列、配列番号８１の配列、配列番号８２の配列、配列番号８３の配列、及び配列番号８４の配列。
【００２４】
１２．以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせをプライマーとして用いてＬＡＭＰ法によって増幅し、コントロールとして使用する、上記１１．の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
２５）配列番号８５の配列、配列番号８６の配列、配列番号８７の配列、配列番号８８の配列、配列番号８９の配列、及び配列番号９０の配列。
【００２５】
１３．増幅産物の測定を、ＤＮＡ結合色素試薬を添加して該ＤＮＡ結合色素試薬の発色を測定することにより実施する、上記４．から７．及び９．から１２．のいずれかの塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００２６】
１４．配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド。
【００２７】
１５．配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む試薬キット。
【００２８】
１６．配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査用試薬キット。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害と相関性あるＨＬＡアリル又は／及びＨＬＡハプロタイプを同定したことにより、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発現可能性を早期に予測可能とし、塩酸チクロピジン投与の制限、該副作用の減少、さらには該副作用の重篤化の防止に効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群分析をなし、肝臓障害群の患者由来の各ＨＬＡ遺伝子型について、アリル頻度及び／又はハプロタイプ頻度分析によって、肝臓障害群と特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプとの相関性を判定することを含む塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル又は／及びＨＬＡハプロタイプのスクリーニング方法で特定されたＨＬＡアリル及び／又はハプロタイプをマーカーとする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法からなる。
【００３１】
本発明は、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害と特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプには相関性が存在することを初めて見出したものである。本発明を基礎にすれば、当業者は、さらにＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又はハプロタイプについての遺伝子分析と塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関性を分析し、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関性をもつさらなる特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプのスクリーニングが可能である。ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子の各アリルを含め配列情報はその殆どが公知になっており、各ハプロタイプについても公知になっている。当業者は、各遺伝子の塩基配列情報及び／又はアミノ酸配列情報をもとにさらなる特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプの検出法の設計が可能である。
【００３２】
本発明の好ましい態様としては、塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群分析をなし、肝臓障害群の患者由来のＨＬＡ−Ａ遺伝子について、又は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子及びＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子）についてアリル頻度分析を行い、肝臓障害群と特定のＨＬＡ遺伝子型のアリルとの相関性を判定することからなる。また、別の本発明の好ましい態様としては、塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群分析をなし、肝臓障害群の患者由来のＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子及びＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子についてハプロタイプ頻度分析がおこなわれ、肝臓障害群と特定のハプロタイプとの相関性を判定することからなる。
【００３３】
上記のスクリーニング方法で特定されたＨＬＡアリル及び／又はハプロタイプをマーカーとすれば塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法が提供される。特定されたＨＬＡアリルとは、塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群において、顕著な存在を示すＨＬＡアリルを意味し、この特定されるＨＬＡアリルの各種情報を使い、当該ＨＬＡアリルを追跡、検出して、副作用を引き起こす可能性高い患者を特定しようとするものである。特定されたＨＬＡハプロタイプとは、塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群において、顕著な存在を示すＨＬＡハプロタイプを意味し、この特定されるＨＬＡハプロタイプの各種情報を使い、当該ＨＬＡハプロタイプを追跡、検出して、副作用を引き起こす可能性高い患者を特定しようとするものである。マーカーとするとは、例えば遺伝子増幅のためのプライマー設計に使用できるであろうし、検出、追跡の際のターゲットとしても使用できることを意味する。さらに、塩基配列情報であってもよく、アミノ酸配列情報であっても良いという意味を包含する。配列は、全配列でもよいし、部分配列でも特徴部分であれば利用可能であるし、さらにポイントにおける変異であっても特徴部位であれば利用可能である。
【００３４】
本発明において具体的には、ＨＬＡアリルとして、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３（配列番号１９）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号２１）、及びＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４（配列番号２０）が挙げられ、特に、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３が、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関性が高い特定ＨＬＡアリルとして同定された。また、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関性が高いＨＬＡハプロタイプとして、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４が特定された。これらの塩基配列及び各コードするアミノ酸配列は公知である。これらの特定ＨＬＡアリル及びＨＬＡハプロタイプは、コントロール群に比して、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害群においてその頻度が有意に高いものであった。この結果、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４は、日本人における塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の危険因子と考えられた。これら５つのＨＬＡ型は互いに強い連鎖不平衡の関係にあり、日本人集団で２番目に多いＨＬＡハプロタイプとして知られている（ハプロタイプ頻度４．０７％、４．８％）。肝臓障害群ならびにコントロール群におけるこれら５つのＨＬＡ遺伝子型のアリル頻度ならびにハプロタイプ頻度を表１に示した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
塩酸チクロピジン投与の副作用として肝臓障害の患者２２例中１５例（６８％）がＨＬＡ−Ａ＊３３０３を有し、このうち１２例（５５％）は上記ハプロタイプであった（表１：１）Ａｌｌ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）。同様に塩酸チクロピジン投与の副作用として肝臓障害のうち胆汁うっ滞型肝臓障害を起こした１４例中１２例（８６％）がＨＬＡ−Ａ＊３３０３を有し、これらのうち１０例（７１％）は上記ＨＬＡハプロタイプを有していた（表１：２）Ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）。一方、肝臓障害群において、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３をもたない患者で、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４のいずれかの多型を有している患者は認められなかった。以上より最も高いオッズ比（Ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ）を示したＨＬＡ−Ａ＊３３０３が日本人における塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害、特に黄疸を伴う重篤な胆汁うっ滞型肝臓障害の最も有力な危険因子と考えられた。このＨＬＡ−Ａ＊３３０３と塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害との相関性を見つけたことによって、塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害の判定法、特に塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害の発生危険率の検査方法が確立できた。かくして、塩酸チクロピジンの副作用を予め排除するためには、少なくともＨＬＡ−Ａ＊３３０３を保有する、或いは検出された患者は、塩酸チクロピジンの投与、投薬量の減量や投薬の中止等の制限をする。このような制限された塩酸チクロピジンの投与方法であれば、当該投与による副作用は事前に排除可能であり、投与量を減少すれば、副作用の発生或いは重篤化が防止できる。かくして、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の有無を投与前に検査し、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３を検出される患者への塩酸チクロピジンの投与を避けた場合、塩酸チクロピジン投与による肝臓障害の副作用の発生は、約１／３に減少すると推定される。
【００３７】
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３のアリル頻度には人種差が報告されている。塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害は欧米人に比べ日本人で特に報告数が多いことから、薬剤反応性遺伝子の多型頻度における人種差との関連が想定されていたが、今回、発明者らが見出したＨＬＡ−Ａ＊３３０３あるいはそれを含むＨＬＡハプロタイプの頻度における人種差が、塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害の発症の人種差を説明する上で興味深い結果である。
【００３８】
本発明は、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られたＰＣＲ産物を直接的に同定する、得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、又は、得られたＰＣＲ産物について上記特定ＤＮＡ断片の特定部位の塩基をタイピング法で決定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法をその手段の一つとする。「直接的に同定する」とは、同定しようとするものの有無や量を測定することを意味する。より具体的には、例えば、増幅産物に特異的に結合するプローブを使用して、該プローブにハイブリダイゼーションする増幅産物を検出することにより、増幅産物の有無や量を測定することを意味する。あるいは、増幅産物に結合し発色する色素試薬を使用して、該色素試薬による発色の有無を測定することにより、該増幅産物の有無や量を測定することを意味する。直接的に同定する方法は、上記のようなプローブや色素試薬を使用して増幅産物の有無や量を測定する方法に限らず、増幅産物の有無や量を測定し得る公知の方法をいずれも使用できる。
【００３９】
ＰＣＲは、よく知られた技術であり、自体公知の方法を利用して実施できる。具体的には、標的遺伝子の増幅を、標的遺伝子を増幅し得るプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを使用し、３段階の温度変化を繰り返すことによって行う。すなわち、温度変化の第１段階で標的遺伝子の二本鎖ＤＮＡを熱変性させて一本鎖ＤＮＡとし（変性反応：ｄｅｎａｔｕｒｅ）、第２段階でプライマーと一本鎖ＤＮＡとの二本鎖を形成させ（アニーリング反応：ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、第３段階で形成された二本鎖のプライマー部位からＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成させ（伸張反応：ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、これら反応を繰り返すことにより、標的遺伝子を増幅させる。変性反応の温度は、一般的に９４℃−９６℃が使用されているが、これに限定されず、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡとなる温度であればいずれも使用できる。アニーリング反応の温度は、一般的に５５℃−６０℃が使用されているが、これに限定されず、プライマーと一本鎖ＤＮＡとの二本鎖が形成される温度であればいずれも使用できる。伸張反応の温度は、一般的に７２℃−７４℃が使用されているが、これに限定されず、ＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖が合成される温度であればいずれも使用できる。各反応時間は、一般的に５秒−１分間程度であるが、これに限定されず、標的遺伝子が含まれていることが明らかな試料を用いて、簡単な実験を繰り返すことにより、好適な反応時間を決定できる。
【００４０】
ＰＣＲを利用した遺伝子増幅法の中で、ＰＣＲ配列特異的プライマー法（ＰＣＲ−ＳＳＰ法）が、好ましく例示される。ＰＣＲ−ＳＳＰ法では、標的遺伝子の特徴配列部分、すなわち本発明においては各ＨＬＡアリルの特徴配列部分をマーカーとして設計されたプライマーを使用して、目的とする特徴配列部分をＰＣＲにより増幅させる。各ＨＬＡアリルの特徴配列部分とは、各ＨＬＡアリルの配列において遺伝的多型が存在する部分を意味する。遺伝的多型が存在する部分とは、他のＨＬＡアリルの配列と比較して、異なる１又は２以上のヌクレオチドが存在する部分、又はヌクレオチドの欠失若しくは挿入が認められる部分を意味する。ＰＣＲ−ＳＳＰ法では、得られたＰＣＲ産物を電気泳動等の手段で分離することにより、容易に目的アリルの存在が判定可能である。さらに、得られたＰＣＲ産物のヌクレオチドの検出及びその種類の同定を行うことにより、該ＰＣＲ産物が目的アリル由来の特定ＤＮＡ断片であるか否かを確認することもできる。
【００４１】
本発明において、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をＰＣＲにより増幅させるプライマーは、各特定されたＨＬＡアリルの塩基配列の情報（配列番号１７〜２１）を元に特定配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる。プライマーは、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）を特異的に増幅できる該ＨＬＡアリル特有の配列からなるものである限りにおいていずれも使用できる。プライマーは、塩基配列長が一般的に５個ないし５０個のヌクレオチド、より好ましくは１０個ないし３５個のヌクレオチドさらに好ましくは１５個ないし３０個のヌクレオチドからなる。
【００４２】
好適なプライマーは、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）については、フォワードプライマーとして配列番号１の配列（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の７８番目から９８番目の配列）、リバースプライマーとしては配列番号２の配列（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の２５９番目から２７８番目の相補的な配列）、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）については、フォワードプライマーとして配列番号３の配列（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の３４４番目から３５５番目の配列の５´側にイントロン２の隣接する７塩基分をつなげた配列）又は配列番号４の配列（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の５２０番目から５３９番目の配列）、リバースプライマーとしては配列番号５の配列（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の５７２番目から５９３番目の相補的な配列）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号２１）については、フォワードプライマーとして配列番号６の配列（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の１７５番目から１９６番目の配列）、リバースプライマーとしては配列番号７の配列（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の２８６番目から３０４番目の相補的な配列）又は配列番号８の配列（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の３４４番目から３６３番目の相補的な配列）、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３（配列番号１９）については、フォワードプライマーとして配列番号１１の配列（ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３の７６番目から９９番目の配列）、リバースプライマーとして配列番号１２の配列（ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３の１３３番目から１５５番目の相補的な配列）、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４（配列番号２０）については、フォワードプライマーとして配列番号１３の配列（ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の６７番目から８９番目の配列）、リバースプライマーとして配列番号１４の配列（ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の２５６番目から２７７番目の相補的な配列）が例示される。なお、本発明では、タイピングでの内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡのアリルであるＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１（配列番号２２）に関するプライマーも設計され、フォワードプライマーとして配列番号９の配列（ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の３３７番目から３６０番目の配列）及び配列番号１５の配列（ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の３６０番目から３８０番目の配列）、リバースプライマーとして配列番号１０の配列（ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の６３３番目から６５４番目の相補的な配列）及び配列番号１６の配列（ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の５５５番目から５７４番目の相補的な配列）を特定した。無論、これらの配列は、各配列の断片又は各配列の延長物を含むものであってもよい。
【００４３】
さらに、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）について、フォワードプライマーとして配列番号２３の配列、リバースプライマーとして配列番号２４の配列、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）について、フォワードプライマーとして配列番号２５の配列又は配列番号２６の配列、リバースプライマーとして配列番号２７の配列、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号２１）について、フォワードプライマーとして配列番号２８の配列、リバースプライマーとして配列番号２９の配列又は配列番号３０の配列、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４（配列番号２０）について、フォワードプライマーとして配列番号３１の配列、リバースプライマーとして配列番号３２の配列を例示できる。なお、タイピングでの内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡのアリルであるＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１（配列番号２２）について、フォワードプライマーとして配列番号３３の配列、リバースプライマーとして配列番号３４の配列を例示できる。また、本発明では、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の増幅の特異性を確認するために、ＨＬＡ−ＤＱＢ１のアリルであるＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１に関するプライマーも設計され、フォワードプライマーとして配列番号３５の配列、リバースプライマーとして配列番号３６の配列を特定した。無論、これらの配列は、各配列の断片又は各配列の延長物を含むものであってもよい。
【００４４】
上記のプライマーは、以下のような配列のヌクレオチドの組み合わせで好適に用いられる。本プライマーは、ＰＣＲ−ＳＳＰ法に好適に使用できる。
１）配列番号１の配列と配列番号２の配列
２）配列番号３の配列と配列番号５の配列
３）配列番号４の配列と配列番号５の配列
３）配列番号６の配列と配列番号７の配列
４）配列番号６の配列と配列番号８の配列
５）配列番号１１の配列と配列番号１２の配列
６）配列番号１３の配列と配列番号１４の配列
７）配列番号２３の配列と配列番号２４の配列
８）配列番号２５の配列と配列番号２７の配列
９）配列番号２６の配列と配列番号２７の配列
１０）配列番号２８の配列と配列番号２９の配列
１１）配列番号２８の配列と配列番号３０の配列
１２）配列番号３１の配列と配列番号３２の配列
１３）配列番号９の配列と配列番号１０の配列
１４）配列番号１５の配列と配列番号１６の配列
１５）配列番号３３の配列と配列番号３４の配列
１６）配列番号３５の配列と配列番号３６の配列
【００４５】
ＰＣＲによる増幅産物のヌクレオチドの検出及びその種類の同定は、自体公知の方法を使用して実施できる。例えば、得られた特定断片をシークエンス法、例えばダイレクトシークエンシング法によって目的のアリルであることの確認をすることもできる。配列決定法としてはシークエンス法以外に、ハイブリダイゼーション法及び制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法等が利用できる。ヌクレオチドの同定は、その他、公知の１塩基変異検出法を利用して実施できる。１塩基変異検出法として、例えば、ＳＮｕＰｅ法等の遺伝子タイピング法が挙げられる。
【００４６】
ヌクレオチドの検出及びその種類の同定は、その他、自体公知の１塩基変異解析方法を適用して実施できる。１塩基変異解析方法として、蛍光を用いる方法、例えばインベーダーアッセイ（リアミチェフ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１７巻、ｐ．２９２−２９６）やルミネックス法（チェン（Ｃｈｅｎ，Ｊ．）ら、「ゲノム リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．５４９−５５７）を例示できる。また、マススペクトルを用いる方法、例えばプライマー伸張法を応用した方法を用いることもできる。このような方法として、ピンポイントアッセイ（ロス（Ｒｏｓｓ，Ｐ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．１３４７−１３５１）やプローブ法（ブラウン（Ｂｒａｕｎ，Ａ．）ら、「クリニカル ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第４３巻、ｐ．１１５１−１１５８）等を例示できる。さらに、ドールアッセイ（ＤＯＬ ａｓｓａｙ、チェン（Ｃｈｅｎ，Ｘ．）ら、「プロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９７年、第９４巻、ｐ．１０７５６−１０７６１）、スナイパーアッセイ（ピアテク（Ｐｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．３５９−３６３）及びタグアレイ法（ファン（Ｆａｎ，Ｊ−Ｂ．）ら、「ゲノム リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．８５３−８６０）等も使用できる。これら方法は、これらが報告されている引用文献を参照することにより容易に実施することができる。また、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）やタックマン（Ｔａｑｍａｎ）法等、１塩基変異の検出方法としてよく知られた方法を用いることができる。
【００４７】
ヌクレオチドの検出及びその種類の同定は、また、アリル特異的核酸プローブを用いて、それぞれハイブリダイゼーション法により実施できる。核酸プローブとしては、各アリルのゲノム塩基配列において特異変異部位を含む塩基配列又はその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該特異塩基変異部位を含む塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが例示できる。「実質的に相補的な塩基配列を有する」とは、プローブとして使用したときに、調べようとする試料（以下、被検試料と称する）中において１塩基変異部位を含む塩基配列又はその相補的塩基配列を例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で検出することができることを意味する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等に従うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件として具体的には、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ及び５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイゼーションのシグナルが観察される条件を例示できる。
【００４８】
プローブとして用いるポリヌクレオチドは、好ましくは８個ないし５０個のヌクレオチド、より好ましくは１７個ないし３５個のヌクレオチド、さらに好ましくは１７個ないし３０個のヌクレオチドからなる。プローブは、各アリル遺伝子の塩基配列又はその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製できる。得られたポリヌクレオチドから、上記１塩基変異部位を含む塩基配列又は該塩基配列の相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異部位を含む塩基配列で表される遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするものを選択することにより、目的とするプローブが得られる。これらプローブは、検出のためのマーカー、例えば蛍光物質や放射性同位体等の標識体で標識されたものであってもよい。標識体はこれらに限らず、プローブとそれに対応するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが阻害されないものであればいずれも使用できる。上記１塩基変異の検出方法は例示に過ぎず、本発明において用いることのできる検出方法はこれらに限定されない。
【００４９】
ＰＣＲによる増幅産物の同定は、その他、ＤＮＡ結合色素試薬を増幅産物中に添加し、増幅産物に結合した色素による発色の有無を測定することにより実施できる。ＰＣＲにより増幅産物が生じた場合、増幅産物に結合した色素による発色が検出されるため、発色の有無及び／又は強弱を測定することにより増幅産物の有無の判定ができる。ＤＮＡ結合色素試薬として、例えばサイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ登録商標）等のＤＮＡインターカレーターを例示できる。ＤＮＡ結合色素試薬は、ＤＮＡに結合して発色し得るものである限りにおいていずれも使用できる。発色の測定は、使用する試薬の発色の測定に一般的に使用されている公知の方法により実施できる。例えば、発色の測定は、自然光下で目視により実施できるし、又は適当な励起光、例えば発光ダイオードランプ下で発色させることにより実施できる。
【００５０】
本発明はまた、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法（ノートミ（Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ．）ら、「ヌクレイック アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第２８巻、第１２号、ｐ．ｅ６３）により増幅し、得られた増幅産物を直接的に同定する、又は、増幅の有無及び／又は多寡を同定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法をその手段の一つとする。
【００５１】
ＬＡＭＰ法は、二本鎖ＤＮＡを含む試料、プライマー、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、基質（デオキシヌクレオチド三リン酸）等を同一容器に入れ、一定温度（６０℃−６５℃付近）で保温することにより、ＤＮＡの増幅から検出までを１ステップの工程で実施できる簡易な増幅技術である。ＬＡＭＰ法は増幅効率及び特異性が高く、ＤＮＡを迅速に特異に増幅することができ、さらに、増幅の有無を目視判定できる精確、簡易な増幅技術である。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲに必須なサーマルサイクラーのような特別な温度制御機器が不要であるため、安価な遺伝子検査が可能となる。このような利点から、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）を増幅し検出する手段として、ＬＡＭＰ法が好ましく使用される。
【００５２】
ＬＡＭＰ法において、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）の増幅の有無及び／又は多寡の検出は、増幅の副産物による白濁の有無及び／又は多寡を目視で判定することにより実施できる。すなわち、該ＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）が増幅された場合、増幅の副産物であるピロリン酸イオンと反応液中のマグネシウムイオンが結合して白濁するため、白濁した試料あるいは白濁が増加した試料では該ＤＮＡが増幅されたと判定できる。あるいは、該ＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）の増幅の及び／又は多寡の検出は、ＬＡＭＰ反応終了後に、ＤＮＡ結合色素試薬を反応液中に添加し、色素による発色の有無及び／又は強弱を測定することにより実施できる。該ＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）が増幅された場合、増幅産物を含む試料では色素による発色が検出されるため、発色が検出された試料では該ＤＮＡが増幅されたと判定できる。ＤＮＡ結合色素試薬を用いることにより、増幅産物の検出感度が高くなるため、増幅の有無や多寡の検出にはこのような試薬の使用が好ましい。ＤＮＡ結合色素試薬として、例えばサイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ登録商標）等のＤＮＡインターカレーターを例示できる。ＤＮＡ結合色素試薬は、ＤＮＡに結合して発色し得るものである限りにおいていずれも使用できる。発色の測定は、使用する試薬の発色の測定に一般的に使用されている公知の方法により実施できる。例えば、発色の測定は、自然光下で目視により実施できるし、又は適当な励起光、例えば発光ダイオードランプ下で発色させることにより実施できる。ＤＮＡ結合色素試薬を反応液中に添加するとき、同時に又は添加前に、ＬＡＭＰ反応に用いたＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を失活させることによりＬＡＭＰ反応を停止させることができる。ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の試薬により、あるいは高温度で処理することにより失活させることができる。ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を失活させる試薬は、ＤＮＡ結合色素試薬とは別に添加することもできるし、ＤＮＡ結合色素試薬に混合し含有させて使用することもできる。ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性失活させる高温度の条件として、９５℃で数分間、例えば２分間程度の処理といった条件を例示できる。
【００５３】
ＬＡＭＰ法に用いるプライマーは、図８に示すように、標的遺伝子の配列に対して、３´末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの３つの領域を定め、また、５´末端側からＢ１、Ｂ２、Ｂ３の３つの領域を定め、これらに対してフォワードインナープライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ：以下、ＦＩＰと略称する）、Ｆ３プライマー（Ｆ３ ｐｒｉｍｅｒ）、バックワードインナープライマー（Ｂａｃｋｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ：以下、ＢＩＰと略称する）、及びＢ３プライマー（Ｂ３ ｐｒｉｍｅｒ）の４種類のプライマーを設計し、所望によりさらにループプライマーフォワード（Ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａｒｄ：以下、ＬＦと略称する）及び／又はループプライマーバックワード（Ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ Ｂａｃｋｗａｒｄ：以下、ＬＢと略称する）を設計し、これらを組み合わせて使用する。ＦＩＰは、３´末端側に標的遺伝子のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域と同じ配列を有し、５´末端側にＦ１ｃ領域と同じ配列を有する。Ｆ３プライマーは、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域と同じ配列を有する。ＢＩＰは、３´末端側に標的遺伝子のＢ２ｃ領域と相補的な領域と同じ配列を有し、５´末端側にＢ１ｃ領域と同じ配列を有する。Ｂ３プライマーは、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域と同じ配列を有する。ＬＦは、Ｆ１領域とＦ２領域の間の配列に相補的な配列を有する。ＬＢは、Ｂ１領域とＢ２領域の間の配列に相補的な配列を有する。
【００５４】
ＬＡＭＰ法に用いる好適なプライマーは、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）については、エキソン２（ｅｘｏｎ２）を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号３７の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号３８の配列、ＦＩＰとして配列番号３９の配列、ＢＩＰとして配列番号４０の配列、ＬＦとして配列番号４１の配列、ＬＢとしては配列番号４２の配列が例示される。また、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）のｅｘｏｎ３を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号４３の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号４４の配列、ＦＩＰとして配列番号４５の配列、ＢＩＰとして配列番号４６の配列、ＬＦとして配列番号４７の配列、ＬＢとしては配列番号４８の配列が例示される。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）については、ｅｘｏｎ２を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号４９の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号５０の配列、ＦＩＰとして配列番号５１の配列、ＢＩＰとして配列番号５２の配列、ＬＦとして配列番号５３の配列、ＬＢとしては配列番号５４の配列が例示される。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）のｅｘｏｎ３を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号５５の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号５６の配列、ＦＩＰとして配列番号５７の配列、ＢＩＰとして配列番号５８の配列、ＬＦとして配列番号５９の配列、ＬＢとしては配列番号６０の配列が例示される。ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３（配列番号１７）については、ｅｘｏｎ２を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号６１の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号６２の配列、ＦＩＰとして配列番号６３の配列、ＢＩＰとして配列番号６４の配列、ＬＦとして配列番号６５の配列、ＬＢとしては配列番号６６の配列が例示される。また、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３（配列番号１７）のｅｘｏｎ３を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号６７の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号６８の配列、ＦＩＰとして配列番号６９の配列、ＢＩＰとして配列番号７０の配列、ＬＦとして配列番号７１の配列、ＬＢとしては配列番号７２の配列が例示される。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号２１）については、Ｆ３プライマーとして配列番号７３の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号７４の配列、ＦＩＰとして配列番号７５の配列、ＢＩＰとして配列番号７６の配列、ＬＦとして配列番号７７の配列、ＬＢとしては配列番号７８の配列が例示される。ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４（配列番号２０）については、Ｆ３プライマーとして配列番号７９の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号８０の配列、ＦＩＰとして配列番号８１の配列、ＢＩＰとして配列番号８２の配列、ＬＦとして配列番号８３の配列、ＬＢとしては配列番号８４の配列が例示される。なお、本発明では、タイピングでの内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡのアリルであるＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１（配列番号２２）に関するプライマーも設計され、Ｆ３プライマーとして配列番号８５の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号８６の配列、ＦＩＰとして配列番号８７の配列、ＢＩＰとして配列番号８８の配列、ＬＦとして配列番号８９の配列、ＬＢとしては配列番号９０の配列を特定した。無論、これらの配列は、各配列の断片又は各配列の延長物を含むものであってもよい。
【００５５】
上記のプライマーは、以下のような配列のヌクレオチドの組み合わせで好適に用いられる。
１７）配列番号３７の配列、配列番号３８の配列、配列番号３９の配列、配列番号４０の配列、配列番号４１の配列、及び配列番号４２の配列、
１８）配列番号４３の配列、配列番号４４の配列、配列番号４５の配列、配列番号４６の配列、配列番号４７の配列、及び配列番号４８の配列、
１９）配列番号４９の配列、配列番号５０の配列、配列番号５１の配列、配列番号５２の配列、配列番号５３の配列、及び配列番号５４の配列、
２０）配列番号５５の配列、配列番号５６の配列、配列番号５７の配列、配列番号５８の配列、配列番号５９の配列、及び配列番号６０の配列、
２１）配列番号６１の配列、配列番号６２の配列、配列番号６３の配列、配列番号６４の配列、配列番号６５の配列、及び配列番号６６の配列、
２２）配列番号６７の配列、配列番号６８の配列、配列番号６９の配列、配列番号７０の配列、配列番号７１の配列、及び配列番号７２の配列、
２３）配列番号７３の配列、配列番号７４の配列、配列番号７５の配列、配列番号７６の配列、配列番号７７の配列、及び配列番号７８の配列、
２４）配列番号７９の配列、配列番号８０の配列、配列番号８１の配列、配列番号８２の配列、配列番号８３の配列、及び配列番号８４の配列
２５）配列番号８４の配列、配列番号８６の配列、配列番号８７の配列、配列番号８８の配列、配列番号８９の配列、及び配列番号９０の配列
【００５６】
以上に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いれば、本発明はさらに、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法が提供可能となる。
【００５７】
本発明の検査方法が適用される被検試料は、ヒト由来の血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、又は他の体液、あるいは口腔粘膜等の組織等それ自体のいずれであってもよい。特に、口腔粘膜試料は、試料を採取される被検対象の負担が少ないこと、及び採取が簡便であることから、被検試料として好ましく使用される。これら被検試料は、本発明の検査方法に適用されるとき、適当な緩衝液等で適宜希釈して使用することができる。例えば、口腔粘膜を被検試料としてＬＡＭＰ法を実施する場合、ＬＡＭＰを阻害する物質の影響を避けることを目的として、適当な緩衝液で口腔粘膜試料を適宜希釈して被検試料とすることが好ましい。さらに、希釈用緩衝液中にＬＡＭＰを阻害する物質の影響を低下させる試薬を添加することもできる。このような試薬として、Ｔｗｅｅｎ２０を例示できる。緩衝液の種類やｐＨ等、希釈の程度、及びＬＡＭＰを阻害する物質の影響を低下させる試薬の濃度は、口腔粘膜試料中の適当な公知遺伝子をＬＡＭＰ法で増幅する実験系を使用して、該増幅を阻害する物質の影響を低下させるものを選択することにより決定できる。
【００５８】
本発明の検査方法が適用される被検試料としてまた、上記被検試料から調製した核酸試料を使用することもできる。核酸試料の調製は、自体公知の核酸調製法により実施できる。核酸試料として、好ましくはゲノムＤＮＡを用いる。調製した核酸は直接検出に使用してもよく、あるいは分析前に所望の領域をＰＣＲ又はその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。
【００５９】
本発明の検査方法は、本発明に係る塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を用いることを手段とする塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率の検査方法に関する。本発明に係る塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を用いることにより、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の早期診断を実施できる。
【００６０】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率の検査方法は、具体的には、被検試料中の各特定アリルを同定し、さらに必要によりハプロタイプの同定を行い実施できる。被検試料中のＨＬＡ−Ａ＊３３０３の同定及び／又はＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４が検出された場合、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率が高いと判定できる。特に、被検試料中のＨＬＡ−Ａ＊３３０３が検出された場合、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率が高いと判断し、その投与方法を制限することが好ましい。
【００６１】
プローブやプライマーは、各アリルの塩基配列又はその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成法等により作製できる。簡便には、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて製造できる。
【００６２】
本発明の別の態様は、配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む試薬キットに関する。本発明に係る試薬キットの範囲には、上記ポリヌクレオチドのうちの１種又はそれ以上を充填した、１個又はそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも包含される。本試薬キットは、本発明に係る検出方法、及び検査方法の実施に必要とされる物質、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ結合色素試薬、標識物質、緩衝液、並びに塩等を含むことができる。さらに、安定化剤及び／又は防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質、例えばポリヌクレオチドに応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。このような試薬及び試薬キットは、本発明に係る検出方法及び検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。
【００６３】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定され
ない。
【実施例１】
【００６４】
（塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生関連遺伝子の特定）
塩酸チクロピジンによる肝臓障害を発現した日本人症例の血液試料（肝臓障害群）とチクロピジンが投与され何ら有害事象が発現しなかった日本人症例の血液試料（コントロール群）を収集し、主に薬物代謝関連遺伝子、免疫学的パラメータと肝臓障害発現との関連性を検討した。肝臓障害群の血液試料は、報告された副作用・感染症症例報告を基に個々の医療機関から血液試料の提供を受けた。コントロール群の血液試料は５つの医療機関において、各々指定した期間中に塩酸チクロピジンを投与された患者のうちコントロール群に該当する全症例の血液試料の提供を受けた。
【００６５】
本検討は、「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針（平成１３年３月２９日付、文部振第２６６号、科発第１４６号、製局第３号）」に則り、会社の生命倫理審査委員会ならびに各血液試料提供医療機関の倫理審査委員会の承認を得たものである。また、血液試料の採取に先立ち、研究の内容、血液試料提供者の権利等を血液試料提供者本人に十分説明し、研究への参加について全症例から文書による同意を得た。
【００６６】
薬物代謝関連遺伝子はＣＹＰ１Ａ１、１Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳＳ）、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｐ１（ＧＳＴＰ１）、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２（ＮＦＥ２）−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ２（Ｎｒｆ２）、Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＫＥＡＰ１）、ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ １（ＨＭＯＸ１）について既知の遺伝子多型の有無と肝臓障害との関連を検討した。
【００６７】
ＣＹＰ１Ａ１、１Ａ２、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４、ＧＳＳ、ＧＳＴＰ１については、ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ Ａｌｌｅｌｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍ．ｋｉ．ｓｅ／ＣＹＰａｌｌｅｌｅｓ／）もしくはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＯＭＩＭ）のｗｅｂサイトで報告されている多型のうち酵素活性に影響を及ぼすことが報告されている多型もしくはアミノ酸変異を伴うことが報告されている多型の有無を、直接塩基配列決定法（ダイレクトシークエンス法）もしくはＰＣＲ産物の有無をアガロースゲル電気泳動にて確認する方法にて判定した。
【００６８】
ＣＹＰ２Ｂ６については、酵素の活性あるいは発現量に影響を与える可能性がｉｎ ｖｉｔｒｏで証明されている多型ならびにファルマスニップコンソーシアム（ＰＳＣ）において、日本人に認められた多型の有無をポリメラーゼ連鎖反応−制限酵素断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法もしくはダイレクトシークエンス法にて判定した。
【００６９】
Ｎｒｆ２ならびにＨＭＯＸ１については既に報告されているプロモーター領域の多型の有無を、ＫＥＡＰ１については特定コーディング領域の多型の有無をダイレクトシークエンス法にて判定した。
【００７０】
ＨＬＡについては、クラスＩのＨＬＡとしてＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの３種、クラスＩＩのＨＬＡとしてＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＤＱＢ１、ＤＰＢ１の３種の遺伝子型を判定した。ＨＬＡ遺伝子型の判定はＰＣＲ−ＳＳＰ法にて行った。１０７例から同定された各ＨＬＡの対立遺伝子（アリル）数は、ＨＬＡ−Ａが１５アリル、ＨＬＡ−Ｂが２８アリル、ＨＬＡ−Ｃが１８アリル、ＨＬＡ−ＤＲＢ１が２５アリル、ＨＬＡ−ＤＱＢ１が１５アリル、ＨＬＡ−ＤＰＢ１が１２アリルであった。
【００７１】
薬物動態関連遺伝子と塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関についてはＦｉｓｈｅｒ直接確率法を用いて検定し、Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。ＨＬＡ遺伝子型と塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関についてはχ２検定を用い、オッズ比はχ２検定に用いた２×２分割表から算出した。補正Ｐ値（Ｐｃ）はχ２検定で得られたＰ値に、各ＨＬＡ ｌｏｃｕｓで同定されたアリルの数を乗じて算出し、Ｐｃ＜０．０５を有意差ありとした。
【００７２】
分析結果は以下である。１９９７年６月から２００４年９月の間にチクロピジンが投与開始された血栓性疾患を有する日本人患者１４５例の血液試料を１０施設の医療機関から収集した。血液試料の提供を受けた１４５例中３８例は評価不能等の理由から評価から除外した。評価対象１０７例中主治医が塩酸チクロピジンとの因果関係が否定できないと判定した症例（２２例）を肝臓障害群とした。肝臓障害群の病型を、Ｄａｎｎａｎらの報告に基づき（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １９９３；４６：１３２３−１３３０）、第６回日本肝臓学会で提案された薬剤性肝臓障害の診断基準（表２）により分類したところ、胆汁うっ滞型１４例、混合型５例、肝細胞障害型３例であった。
【００７３】
【表２】
【００７４】
塩酸チクロピジン投与期間中に適正に血液検査等が実施され、塩酸チクロピジンとの因果関係が否定できない有害事象が発現しなかった症例（８５例）をコントロール群とした。これら１０７例の患者背景について表３に示す。
【００７５】
【表３】
【００７６】
薬物代謝関連遺伝子については、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害と統計学的に有意な相関を示す多型は見出されなかった。一方、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害と統計学的に有意な相関を示すＨＬＡ遺伝子型が見出された。肝臓障害群２２例ならびにコントロール群８５例のＨＬＡ遺伝子型のアリル頻度を図１及び２に、肝臓障害群のうち、特に塩酸チクロピジンで多いと報告されている胆汁うっ滞型肝臓障害１４例ならびにコントロール群のＨＬＡ遺伝子型のアリル頻度を図３及び４に示す。この分析によってコントロール群に比し、肝臓障害群においてＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の頻度が有意に高かった。以下に各ＨＬＡ遺伝子型について各群のアリル頻度、オッズ比、検定結果を示す。
【００７７】
１）ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）
コントロール群におけるＨＬＡ−Ａ＊３３０３のアリル頻度７％に対して、肝臓障害群のＨＬＡ−Ａ＊３３０３のアリル頻度は３４％（オッズ比１３．０４、９５％信頼区間４．４０〜３８．５９、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＜０．００１）であり、肝臓障害群のうち胆汁うっ滞型の病型を呈した例（１４例）におけるＨＬＡ−Ａ＊３３０３のアリル頻度は４３％（オッズ比３６．５０、９５％信頼区間７．２５〜１８３．８２、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＜０．００１）であった。
【００７８】
２）ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）
コントロール群におけるＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のアリル頻度８％に対して、肝臓障害群のＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のアリル頻度は２７％（オッズ比６．６５、９５％信頼区間２．３８〜１８．５５、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＝０．００９）、うち胆汁うっ滞型では３６％（オッズ比１３．８５、９５％信頼区間３．７７〜５０．８７、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＝０．００１）であった。
【００７９】
３）ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３（配列番号１９）
コントロール群におけるＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３のアリル頻度７％に対して、肝臓障害群のＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３のアリル頻度は２７％（オッズ比７．３０、９５％信頼区間２．５９〜２０．６１、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＝０．００３）、うち胆汁うっ滞型では３６％（オッズ比１５．２１、９５％信頼区間４．１０〜５６．３９、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＜０．００１）であった。
【００８０】
４）ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号２１）
コントロール群におけるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２のアリル頻度６％に対し、肝臓障害群のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２のアリル頻度は２７％（オッズ比９．００、９５％信頼区間３．１０〜２６．１７、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＝０．００１）、うち胆汁うっ滞型では３６％（オッズ比１８．７５、９５％信頼区間４．９４〜７１．１９、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＜０．００１）であった。
【００８１】
５）ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４（配列番号２０）
コントロール群におけるＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４のアリル頻度５％に対し、肝臓障害群のＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４のアリル頻度は２７％（オッズ比１０．１３、９５％信頼区間３．４２〜３０．０５、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＝０．００１）、うち胆汁うっ滞型では３６％（オッズ比２１．１１、９５％信頼区間５．４７〜８１．４２、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＜０．００１）であった。
【実施例２】
【００８２】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル及びＨＬＡハプロタイプが同定されたことにより患者血液試料から、各特定ＨＬＡアリル及びＨＬＡハプロタイプを同定するための検査方法を設定した。
【００８３】
方法は、血液試料より、ＤＮＡを抽出し、蛍光プローブＳＳＯ（配列特異オリゴヌクレオチド）法にて、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の各アリルを決定し、陽性コントロール（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２）と陰性コントロールに分けた。ＨＬＡ遺伝子のタイピング法は、ＰＣＲ−ＳＳＰ法を用いた。
【００８４】
手順は、公知の各アリルの塩基配列情報に基づき、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２をそれぞれ特異的に増幅させうるプライマーを設計した。また、タイピングでの内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１（配列番号２２）を用いた。各プライマーは、表４に示し、その塩基配列は、配列表の相当する配列番号に記載のとおりである。
【００８５】
【表４】
【００８６】
設計したプライマーを用いて、陽性コントロールＤＮＡ及び陰性コントロールＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲをおこなった。表５にプライマーセットの組み合わせ及び各アレルのＰＣＲ産物（Ａ３３、Ｂ４４−１、Ｂ４４−２、ＤＲ１３−１、ＤＲ１３−２及びＤＲＡ）を示した。得られたＰＣＲ産物を用いてシークエンシング解析をおこない、塩基配列を確認した。
【００８７】
【表５】
【００８８】
次いで、ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを以下の条件で行った。
反応組成は表６に示した。ＰＣＲの反応条件は表７に示した。
【００８９】
【表６】
【００９０】
【表７】
【００９１】
得られたＰＣＲ産物につき、電気泳動（ミュービッド２１、０．５ｘＴＢＥバッファー、２％アガロースゲル、約１５分展開：以下同）を行い、染色（エチジウムブロマイド １μｇ／ｍｌで約１５分）し、目的アリルの同定をした。さらにシークエンシング解析により目的のアリルであることを確認した。結果は、図５に示した。
【００９２】
次いで、保存血液を用いてＰＣＲを行い各アリルの同定をおこなった。具体的には、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ法（島津製作所社製）及びＡｍｐｌｉ Ｔａｑ（ＡＢＩ社製）によってＰＣＲを行い図６の結果を得、各アリルの増幅を確認した。反応組成は表８、反応条件は表９に示した。
【００９３】
【表８】
【００９４】
【表９】
【００９５】
次いで、保存血液を用いてＡｍｐｄｉｒｅｃｔ法（島津製作所社製）及びＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）によってＰＣＲを行い図７の陽性コントロール及び陰性コントロールの結果を得、各アリルの増幅を確認した。反応組成は表１０、反応条件は表１１に示した。
【００９６】
【表１０】
【００９７】
【表１１】
【実施例３】
【００９８】
ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３及びＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の各アリルを判定するために、公知の各アリルの塩基配列情報に基づき、設計したプライマーは以下である。コントロールとして用いるＨＬＡ−ＤＲＡプライマーは、ＰＣＲ産物のサイズを小さくするために、別途設計した。プライマー名Ｃ１４−ｅｘ２−１Ｆは、配列番号１１、プライマー名Ｃ１４−ｅｘ２−１Ｒは、配列番号１２、プライマー名ＤＱＢ０６−ｅｘ２−Ｆは、配列番号１３、プライマー名ＤＱＢ０６−ｅｘ２−Ｒは、配列番号１４、プライマー名ＤＲＡ−２Ｆは、配列番号１５、プライマー名ＤＲＡ−２Ｒは、配列番号１６に相当する。ＰＣＲ反応条件は表１２に示した。
【００９９】
【表１２】
【０１００】
上記のプライマーを用いた、ＤＮＡによるＰＣＲにおいて、目的のサイズのＰＣＲ産物が得られることが確認された。
【実施例４】
【０１０１】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル及びＨＬＡハプロタイプの被検試料における同定を、ＬＡＭＰ法により検討した。
【０１０２】
被検試料として、ヒト口腔粘膜をスワブ（ｓｗａｂ）でかき取り、希釈したものを使用した。口腔粘膜を緩衝液に懸濁したものにはＬＡＭＰを阻害する物質が存在するため、該物質の影響を避けることを目的として、希釈は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８の緩衝液に終濃度０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を加えた溶液を使用して行った。
【０１０３】
また、被検試料として、ヒト末梢血から抽出したＤＮＡを使用した。
【０１０４】
具体的には、各アリルの塩基配列情報に基づき、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３のｅｘｏｎ２又はｅｘｏｎ３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のｅｘｏｎ２又はｅｘｏｎ３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３のｅｘｏｎ２又はｅｘｏｎ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４を特異的に増幅するプライマーセットを設計した。一方、ＬＡＭＰ法における内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１を用い、ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１を特異的に増幅するプライマーセットを設計した。各プライマーは、表１３−１８に示し、その塩基配列は、配列表の相当する配列番号に記載のとおりである。
【０１０５】
【表１３】
【０１０６】
【表１４】
【０１０７】
【表１５】
【０１０８】
【表１６】
【０１０９】
【表１７】
【０１１０】
【表１８】
【０１１１】
ＬＡＭＰ反応は、以下の終濃度の組成で、６５℃で行った：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１．６Ｍ ベタイン（Ｂｅｔａｉｎ）、１．４ｍＭ 各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、１．６μＭ ＦＩＰ、１．６μＭ ＢＩＰ、０．８μＭ ＬＦ、０．８μＭ ＬＢ、０．２μＭ Ｆ３プライマー、０．２μＭ Ｂ３プライマー。
【０１１２】
ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、サイバーグリーン存在下でＬＡＭＰ反応を行い、増幅してきた二本鎖ＤＮＡにサイバーグリーンが結合することにより発する蛍光強度を測定することにより実施した。ＬＡＭＰ反応及びサイバーグリーンの蛍光の強度測定は、反応開始から６０分間経時的に行った。蛍光強度は反応時間に対するＬｏｇ表示にて図示し、指数関数的増幅領域の中央に閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｌｉｎｅ）を設定した。そして、閾値を超えた時間を図より判定した。結果を示す図においては、横軸に反応時間（図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸に蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示した。
【０１１３】
ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のｅｘｏｎ３を特異的に増幅するプライマーセット（表１４）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３アリルを含む口腔粘膜被検試料のみで増幅が観察された（図９）。同様にＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（ｅｘｏｎ２）、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（ｅｘｏｎ２及びｅｘｏｎ３）、ＨＬＡ−Ｃ＊１４０３（ｅｘｏｎ２及びｅｘｏｎ３）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４を上記プライマーセットを用いることにより口腔粘膜から各アリル特異的に増幅し検出できた。
【０１１４】
さらに、別の方法（Ｌｕｍｉｎｅｘ法）によるタイピングでＨＬＡアリル既知のヒト末梢血から抽出したＤＮＡを使用し、上記プライマーセット群を使用してＬＡＭＰを行ったところ、各アリルをもつ被検試料でのみ増幅が観察された（図１０−１５、表１９−２４）。表中、Ｃｔとは各被検試料の閾値を超えた時間を意味する。表においてＣｔがＵｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄと表示されている場合、被検試料においてＤＮＡが増幅されなかったことを示す。特定のＨＬＡアリルを増幅するプライマーセット群を用いたＬＡＭＰにおいて、標的のＨＬＡアリルの増幅のＣｔは４０以内であり、このことからＬＡＭＰ反応開始後４０分以内に標的のＨＬＡアリルが十分に増幅されることが判明した。一方、一部の被検試料において、特定のＨＬＡアリルを増幅するプライマーセット群により、別のＨＬＡアリルが増幅されており、そのＣｔはほぼ５０以上である。このことから、ＬＡＭＰ反応開始後５０分以降に増幅が観察される場合は、該増幅は非常に反応効率の悪い非特異的な反応による増幅の結果と考えることができる。
【０１１５】
【表１９】
【０１１６】
【表２０】
【０１１７】
【表２１】
【０１１８】
【表２２】
【０１１９】
【表２３】
【０１２０】
【表２４】
【０１２１】
上記結果から、表１３−１８に示したプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ方法で各ＨＬＡアリルが特的に増幅できることが明らかになった。
【実施例５】
【０１２２】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル及びＨＬＡハプロタイプの被検試料における同定を、ＰＣＲ−ＳＳＰ法により検討した。
【０１２３】
被検試料として、ＨＬＡアリル既知のヒト末梢血から抽出したＤＮＡ、又は、希釈したヒト末梢血自体を使用した。ＰＣＲ−ＳＳＰ法は、ＤＮＡを被検試料として使用する場合はＴａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を使用し、ヒト末梢血自体を使用使用する場合はＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（島津製作所社製）を使用して、それぞれ表２５及び表２６に示す条件で行った。
【０１２４】
【表２５】
【０１２５】
【表２６】
【０１２６】
ＰＣＲ−ＳＳＰ法に使用するプライマーセットを各アリルの塩基配列情報に基づいて設計した。一方、ＬＡＭＰ法における内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１を用い、ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１を特異的に増幅するプライマーセットを設計した。また、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の増幅の特異性を確認するために、ＨＬＡ−ＤＱＢ１のアリルであるＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１に関するプライマーも設計した。各プライマーは、表２７に示し、その塩基配列は、配列表の相当する配列番号に記載のとおりである。
【０１２７】
【表２７】
【０１２８】
設計したプライマーを用いて、特定のＨＬＡアリルが陽性であることが明らかになっているＤＮＡ及び該ＨＬＡアリルが陰性であることが明らかになっているＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ−ＳＳＰ法を実施した。表２８にプライマーセットの組み合わせ及び増幅産物のサイズを示した。
【０１２９】
【表２８】
【０１３０】
上記プライマーセットを用いたＰＣＲ−ＳＳＰ法において、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４、ＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１／０６０２の各アリル特異的増幅が観察された（図１６）。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の増幅は、プライマーＢ４４−Ｆ１／Ｂ４４−Ｒ１の組み合わせを用いた検討、及びプライマーＢ４４−Ｆ２／Ｂ４４Ｒ１の組み合わせを用いた検討の両方で増幅が確認された場合に陽性と判定した。同様に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の増幅は、プライマーＤＲ１３−Ｆ１／ＤＲ１３−Ｒ１の組み合わせを用いた検討、及びプライマーＤＲ１３−Ｆ１／ＤＲ１３Ｒ２の組み合わせを用いた検討の両方で増幅が確認された場合にＤＲＢ１＊１３０２陽性と判定した。
【０１３１】
また、被検試料として、末梢血から抽出・精製したＤＮＡの代わりに、希釈した末梢血自体を使用したＰＣＲ−ＳＳＰ法を実施しても、各アリル特異的増幅が観察された（図１７）。
【０１３２】
上記結果から、表２５に示したプライマーセットを使用して、ＰＣＲ−ＳＳＰ方法で各ＨＬＡアリルが特的に増幅できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明は、塩酸チクロピジンによる肝臓障害の副作用発現の早期予測を可能とし、塩酸チクロピジン治療における副作用の減少及び軽減に寄与するものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１３４】
配列番号１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３−ｅｘ２Ｆ。ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の７８番目から９８番目の配列である。
配列番号２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３−ｅｘ２Ｒ。ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の２５９番目から２７８番目の相補的な配列である。
配列番号３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−ｅｘ３−Ｆ。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の３４４番目から３５５番目の配列の５´側にイントロン２の隣接する７塩基分をつなげた配列である。
配列番号４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−ｅｘ３−２Ｆ。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の５２０番目から５３９番目の配列である。
配列番号５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−ｅｘ３−Ｒ。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の５７２番目から５９３番目の相補的な配列である。
配列番号６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−ｅｘ２−２Ｆ。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の１７５番目から１９６番目の配列である。
配列番号７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−ｅｘ２−３Ｒ。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の２８６番目から３０４番目の相補的な配列である。
配列番号８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−ｅｘ２−２Ｒ。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の３４４番目から３６３番目の相補的な配列である。
配列番号９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−Ｆ。ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の３３７番目から３６０番目の配列である。
配列番号１０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−Ｒ。ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の６３３番目から６５４番目の相補的な配列である。
配列番号１１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４−ｅｘ２−１Ｆ。ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３の７６番目から９９番目の配列である。
配列番号１２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４−ｅｘ２−１Ｒ。ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３の１３３番目から１５５番目の相補的な配列である。
配列番号１３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６−ｅｘ２−Ｆ。ＤＱＢ１＊０６０４の６７番目から８９番目の配列である。
配列番号１４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６−ｅｘ２−Ｒ。ＤＱＢ１＊０６０４の２５６番目から２７７番目の相補的な配列である。
配列番号１５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−２Ｆ。ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の３６０番目から３８０番目の配列である。
配列番号１６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−２Ｒ。ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の５５５番目から５７４番目の相補的な配列である。
配列番号１７：ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の全配列である。
配列番号１８：ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の全配列である。
配列番号１９：ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３の全配列である。
配列番号２０：ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の部分配列であり、シグナル部分が取れた成熟蛋白質成熟蛋白質をコードしている塩基配列である。
配列番号２１：ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の全配列である。
配列番号２２：ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の全配列である。
配列番号２３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３−Ｆ１。
配列番号２４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３−Ｒ１。
配列番号２５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−Ｆ１。
配列番号２６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−Ｆ２。
配列番号２７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−Ｒ１。
配列番号２８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−Ｆ１。
配列番号２９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−Ｒ１。
配列番号３０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−Ｒ２。
配列番号３１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６−Ｆ１。
配列番号３２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６−Ｒ１。
配列番号３３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−Ｆ１。
配列番号３４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−Ｒ１。
配列番号３５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０１０６０２−Ｆ１。
配列番号３６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０１０６０２−Ｒ１。
配列番号３７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿Ｆ３。
配列番号３８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿Ｂ３。
配列番号３９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿ＦＩＰ。
配列番号４０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿ＢＩＰ。
配列番号４１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿ＬＦ。
配列番号４２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿ＬＢ。
配列番号４３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿Ｆ３。
配列番号４４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿Ｂ３。
配列番号４５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿ＦＩＰ。
配列番号４６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿ＢＩＰ。
配列番号４７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿ＬＦ。
配列番号４８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿ＬＢ。
配列番号４９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿Ｆ３。
配列番号５０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿Ｂ３。
配列番号５１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿ＦＩＰ。
配列番号５２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿ＢＩＰ。
配列番号５３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿ＬＦ。
配列番号５４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿ＬＢ。
配列番号５５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿Ｆ３。
配列番号５６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿Ｂ３。
配列番号５７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿ＦＩＰ。
配列番号５８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿ＢＩＰ。
配列番号５９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿ＬＦ。
配列番号６０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿ＬＢ。
配列番号６１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿Ｆ３。
配列番号６２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿Ｂ３。
配列番号６３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿ＦＩＰ。
配列番号６４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿ＢＩＰ。
配列番号６５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿ＬＦ。
配列番号６６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿ＬＢ。
配列番号６７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿Ｆ３。
配列番号６８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿Ｂ３。
配列番号６９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿ＦＩＰ。
配列番号７０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿ＢＩＰ。
配列番号７１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿ＬＦ。
配列番号７２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿ＬＢ。
配列番号７３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿Ｆ３。
配列番号７４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿Ｂ３。
配列番号７５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿ＦＩＰ。
配列番号７６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿ＢＩＰ。
配列番号７７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿ＬＦ。
配列番号７８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿ＬＢ。
配列番号７９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿Ｆ３。
配列番号８０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿Ｂ３。
配列番号８１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿ＦＩＰ。
配列番号８２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿ＢＩＰ。
配列番号８３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿ＬＦ。
配列番号８４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿ＬＢ。
配列番号８５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿Ｆ３。
配列番号８６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿Ｂ３。
配列番号８７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿ＦＩＰ。
配列番号８８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿ＢＩＰ。
配列番号８９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿ＬＦ。
配列番号９０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿ＬＢ。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】チクロピジン投与の副作用である肝臓障害患者（日本人）におけるＨＬＡクラスＩ抗原（ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎｓ）のアリル頻度
【図２】チクロピジン投与の副作用である肝臓障害患者（日本人）におけるＨＬＡクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎｓ）のアリル頻度
【図３】チクロピジン投与の副作用である胆汁うっ滞型肝臓障害患者（日本人）におけるＨＬＡクラスＩ抗原（ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎｓ）のアリル頻度
【図４】チクロピジン投与の副作用である胆汁うっ滞型肝臓障害患者（日本人）におけるＨＬＡクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎｓ）のアリル頻度
【図５】左よりＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＡのＰＣＲ産物の電気泳動図。図中、Ｍはマーカーを、矢印は目的産物を示す。
【図６】保存血液を用いてＡｍｐｄｉｒｅｃｔ法（島津製作所社製）及びＡｍｐｌｉ Ｔａｑ法（ＡＢＩ社製）によるＰＣＲ産物の電気泳動図。プライマーは、表４に記載のプライマーを表５のように組み合わせて使用した。図中の符号はそれぞれ、Ｍ：マーカー、Ａ：Ａ３３、Ｂ１：Ｂ４４−１、Ｂ２：Ｂ４４−２、Ｄ１：ＤＲ１３−１、ＤＲ２：ＤＲ１３−２を意味する。
【図７】保存血液を用いてＡｍｐｄｉｒｅｃｔ法（島津製作所社製）及びＬＡ Ｔａｑ法（ＴａＫａＲａ社製）によってＰＣＲを行い得たＰＣＲ産物の電気泳動図。図７の上段は陽性コントロール、下段は陰性コントロールである。ＡｍｐｄｉｒｅｃｔはＡｍｐｄｉｒｅｃｔ法による結果、ＬＡ ＴａｑはＬＡ Ｔａｑ法による結果を示す。プライマーは、表４に記載のプライマーを表５のように組み合わせて使用した。図中の符号はそれぞれ、Ｍ：マーカー、Ａ：Ａ３３、Ｂ１：Ｂ４４−１、Ｂ２：Ｂ４４−２、Ｄ１：ＤＲ１３−１、ＤＲ２：ＤＲ１３−２を意味する。
【図８】ＬＡＭＰ法で用いるプライマーセットを説明する模式図である。
【図９】ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のｅｘｏｎ３を特異的に増幅するプライマーセット（表１４参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３アリルを含む口腔粘膜試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１０】ＨＬＡ−Ａ＊３３０３のｅｘｏｎ３を特異的に増幅するプライマーセット（表１３参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１１】ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のｅｘｏｎ３を特異的に増幅するプライマーセット（表１４参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１２】ＨＬＡ−Ｃ＊１４０３のｅｘｏｎ３を特異的に増幅するプライマーセット（表１５参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−Ｃ＊１４０３アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１３】ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２を特異的に増幅するプライマーセット（表１６参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１４】ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４を特異的に増幅するプライマーセット（表１７参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１５】ＨＬＡ−ＤＲＡ１を特異的に増幅するプライマーセット（表１８参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−ＤＲＡ１アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１６】ヒト末梢血由来ＤＮＡ試料において、ＰＣＲ−ＳＳＰ法によりＨＬＡアリルが特異的に検出されたことを示す図である。プライマーは、表２７に示す各プライマーを表２８のように組み合わせて使用した。図中の符号はそれぞれ、Ｍ：マーカー（５０−２５００ｂｐ ラダー）、ＤＱＢ０６０４：ＤＱＢ１＊０６０４、ＤＱＢ０６０１０６０２：ＤＱＢ１＊０６０１／０６０２、Ｎ：鋳型なし、＋：鋳型が特定ＨＬＡアリル陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のＤＮＡ、−−：鋳型が特定ＨＬＡアリル陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）のＤＮＡを意味する。
【図１７】希釈したヒト末梢血試料において、ＰＣＲ−ＳＳＰ法によりＨＬＡアリルが特異的に検出されたことを示す図である。プライマーは、表２７に示す各プライマーを表２８のように組み合わせて使用した。左パネルは、ＨＬＡハプロタイプが、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３−Ｂ＊４４０３−ＤＲＢ１＊１３０２−ＤＱＢ１＊０６０４であるヒト末梢血試料を用いた結果を示す。右パネルは、ＨＬＡハプロタイプが、ＨＬＡ−Ａ＊２６０２／３１０１−Ｂ＊１５０１／３５０１−ＤＲＢ１＊０４０３／１４０５−ＤＱＢ１＊０５０３／０６０１であるヒト末梢血試料を用いた結果を示す。図中の符号はそれぞれ、Ｍ：マーカー、ＤＱＢ１＊０６０１／０２：ＤＱＢ１＊０６０１／０６０２を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率の検査方法に関する。本発明はまた、塩酸チクロピジン副作用である肝臓障害の関連遺伝子の遺伝子型の検出方法を用いることを手段とする肝臓障害発生危険率の検査方法に関する。より詳しくは、本発明は、ヒト白血球抗原（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ、以下、ＨＬＡと略す）の特定アリル及び／又はハプロタイプが塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連であることを同定し、かつ当該特定アリル及び／又はハプロタイプを検出することを手段とする、肝臓障害発生危険率の検査方法に関する。本発明はまた、前記検査方法に用いるポリヌクレオチド及び試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
塩酸チクロピジンは、血栓性疾患（例えば虚血性脳血管障害等に伴う血栓・塞栓や慢性動脈閉塞症）の治療並びに血栓性疾患に伴う症状の改善等に使用されている抗血小板剤である。これまで、日本、米国、欧州各国等９０ヶ国以上で販売されている。日本では年間販売実績約３００億円の大型医薬品で、推定使用患者数は年間約１００万人である。しかしながら、塩酸チクロピジンについては、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、無顆粒球症、及び重篤な肝臓障害という重大な副作用が発現することが知られている。このため、これら副作用の早期発見、未然防止のため、医療関係者への情報提供の徹底が図られている。これらの重い副作用はその約９割が投与開始後２ヶ月以内に発現しており、本医薬品投与開始２ヶ月間、２週に１回の定期的検査（血液、肝機能）を行うことで、これら副作用の早期発見、重篤化の防止が可能であるとされている。しかしながら、平成１１年７月以降、これらの副作用報告数は明確には減少しておらず、平成１３年７月から１４年６月までに血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）１３例（うち死亡５例）、顆粒球減少（無顆粒球症を含む）３５例（うち死亡６例）、重篤な肝臓障害９７例（うち死亡６例）の報告が企業から厚生労働省に対してなされている。
【０００３】
ヒトＭＨＣ（主要組織適合性複合体又は主要組織適合抗原）分子であるＨＬＡ分子は、１９５２年に輸血患者血清中に白血球凝集試験で反応する抗体が見出され、これに対する抗原として発見された。ＨＬＡ分子は、第６染色体短腕部の６ｐ２１．３の約４，０００ｋｂｐ内に存在するＭＨＣ領域によりコードされた遺伝子群に支配される遺伝子産物である。このＭＨＣ領域は、殆どの真核細胞膜表面上に表現されるＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗原系を支配するクラスＩ遺伝子領域と、Ｂ細胞やマクロファージ等の限定された組織あるいは細胞にしか表現されていない細胞特異的なＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ抗原系を支配するクラスＩＩ遺伝子領域、及び補体成分と２１−ヒドロキシラーゼ等を支配するクラスＩＩＩ遺伝子領域より構成されている。
【０００４】
ＨＬＡクラスＩ分子は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子領域にコードされる４４ｋＤａの膜結合型蛋白α鎖と、第１５染色体の支配を受ける分子量１１ｋＤａのβ２−ミクログロブリン（β鎖）とによって構成されている。クラスＩ分子は、遺伝的多型性に富むことが知られている。
【０００５】
ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子領域にコードされる３４ｋＤａの糖蛋白（α鎖）と２９ｋＤａの糖蛋白（β鎖）が非共有結合した細胞膜抗原である。クラスＩＩ遺伝子は、α鎖遺伝子が７個、β鎖遺伝子が９〜１２個（１６種）というようにクラスターを形成し、多重遺伝子族を構成する。クラスＩＩ遺伝子領域には、セントロメア側からＤＰ−ＤＮ−ＤＭ−ＤＯ−ＤＱ−ＤＲの順に各遺伝子が位置する。ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、ＤＲ抗原は多数のアリル抗原タイプからなり、その多型性は主にβ鎖（Ｂ１）のアミノ酸配列の違いによって決定される。なお、ＤＲ、ＤＱ抗原はＢ細胞によって産生される抗体によって認識されるエピトープである。
【０００６】
ＨＬＡ分子はいずれも２６０−３７０個程度のアミノ酸がひとかたまりになったドメイン構造によって構成される。クラスＩ分子は、そのα鎖が、α１ドメイン、α２ドメイン、α３ドメイン、膜貫通（ＴＭ）領域、細胞内（ＣＹ）領域からなり、α１ドメインとα２ドメインが多型性部位を構成する。クラスＩＩ分子は、α１（β１）ドメイン、α２（β２）ドメイン、結合ペプチド（ＣＰ）、ＴＭ領域、ＣＹ領域からなり、α１ドメインとβ１ドメインが多型性部位を構成し、α２ドメインとβ２ドメインがクラスＩＩ分子の基底部を形作っている。
【０００７】
ＨＬＡ分子の遺伝的多型性は、対応する各ＨＬＡ遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の違いによって形成される。これは各遺伝子ＤＮＡの塩基配列の差の反映であり、これまでに殆ど全てのアリル抗原タイプの塩基配列が決定されている（非特許文献１）。多型性を示す領域は、クラスＩ分子ではα１、α２ドメインに集中し、α１ドメインＣ端側・α２ドメインＮ端側に各１個の共通する超可変部が存在する。クラスＩＩ分子では、超可変部がＤＱα鎖のα１ドメインとＤＲβ、ＤＱβ、ＤＰβ鎖のβ１ドメインに存在し、各ドメインの特定３ヶ所の領域に多型性が集中している（非特許文献２）。これら超可変部のアミノ酸残基の置換、あるいはアリル抗原タイプの違いは、抗原ペプチドに対するＨＬＡ分子の親和性に直接的な影響を与え、特定のＨＬＡ分子と結合できる抗原ペプチドの種類を変化させるのみならず、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）との親和性にも影響して、結果として抗原提示能をも変化させる。そして、ＨＬＡ抗原型の異なる個人間では外来抗原や自己抗原に対する免疫応答能に差が出来ることとなり、免疫応答の個体差が生まれる。
【０００８】
これまでＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプと塩酸チクロピジンによる肝臓障害との相関性については一切の報告がない。
【０００９】
【非特許文献１】Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，４６，２５８−２８０，１９９５
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８４，６２３４−６２３８，１９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、本邦において塩酸チクロピジンの３つの重大な副作用（血栓性血小板減少性紫斑病、重篤な肝臓障害、無顆粒球症）のうち、特に日本人で報告件数が多い肝臓障害の発現に関する遺伝学的素因の解明を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、塩酸チクロピジンによる肝臓障害を発現した日本人症例の血液試料（肝臓障害群）と塩酸チクロピジンが投与され何ら有害事象が発現しなかった日本人症例の血液試料（コントロール群）を収集し、主に薬物代謝関連遺伝子、免疫学的パラメータと肝臓障害発現との関連性を検討した。このうちＨＬＡの遺伝子型と塩酸チクロピジンによる肝臓障害発現との間において統計学的に有意な相関を見出し本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、以下からなる。
【００１３】
１．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群分析をなし、肝臓障害群の患者由来の各ＨＬＡ遺伝子型について、アリル頻度及び／又はハプロタイプ頻度分析によって、肝臓障害群と特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプとの相関性を判定することを含む塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル又は／及びＨＬＡハプロタイプのスクリーニング方法で特定されたＨＬＡアリル及び／又はハプロタイプをマーカーとする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００１４】
２．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００１５】
３．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡハプロタイプとして、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２及びＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４をマーカーとする、上記２．の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００１６】
４．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとし、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られたＰＣＲ産物を直接的に同定する、得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、又は、得られたＰＣＲ産物について上記特定ＤＮＡ断片の特定部位の塩基をタイピング法で決定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００１７】
５．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせをマーカーとして設計されたプライマーを用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ産物を直接的に同定する、得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、又は、得られたＰＣＲ産物について上記特定ＤＮＡ断片の特定部位の塩基をタイピング法で決定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００１８】
６．少なくともＨＬＡ−Ａ＊３３０３が検出される患者への投与が制限される塩酸チクロピジンを含有する医薬。
【００１９】
７．以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１をフォワード及びリバースプライマーとして用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をＰＣＲによって増幅する、上記５．の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１）配列番号１の配列と配列番号２の配列
２）配列番号３の配列と配列番号５の配列
３）配列番号４の配列と配列番号５の配列
３）配列番号６の配列と配列番号７の配列
４）配列番号６の配列と配列番号８の配列
５）配列番号１１の配列と配列番号１２の配列
６）配列番号１３の配列と配列番号１４の配列
７）配列番号２３の配列と配列番号２４の配列
８）配列番号２５の配列と配列番号２７の配列
９）配列番号２６の配列と配列番号２７の配列
１０）配列番号２８の配列と配列番号２９の配列
１１）配列番号２８の配列と配列番号３０の配列
１２）配列番号３１の配列と配列番号３２の配列。
【００２０】
８．以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１をフォワード及びリバースプライマーとして用いてＰＣＲによって増幅し、コントロールとして使用する、上記５．又は７．の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１３）配列番号９の配列と配列番号１０の配列
１４）配列番号１５の配列と配列番号１６の配列
１５）配列番号３３の配列と配列番号３４の配列
１６）配列番号３５の配列と配列番号３６の配列。
【００２１】
９．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとし、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法により増幅し、得られた増幅産物を直接的に同定する、又は、増幅の有無を同定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００２２】
１０．塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせをマーカーとして設計されたプライマーを用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法により増幅し、得られた増幅産物を直接的に同定する、又は、増幅の有無を同定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００２３】
１１．以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１又は２以上の組み合わせをプライマーとして用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をＬＡＭＰ法によって増幅する、上記１０．の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１７）配列番号３７の配列、配列番号３８の配列、配列番号３９の配列、配列番号４０の配列、配列番号４１の配列、及び配列番号４２の配列、
１８）配列番号４３の配列、配列番号４４の配列、配列番号４５の配列、配列番号４６の配列、配列番号４７の配列、及び配列番号４８の配列、
１９）配列番号４９の配列、配列番号５０の配列、配列番号５１の配列、配列番号５２の配列、配列番号５３の配列、及び配列番号５４の配列、
２０）配列番号５５の配列、配列番号５６の配列、配列番号５７の配列、配列番号５８の配列、配列番号５９の配列、及び配列番号６０の配列、
２１）配列番号６１の配列、配列番号６２の配列、配列番号６３の配列、配列番号６４の配列、配列番号６５の配列、及び配列番号６６の配列、
２２）配列番号６７の配列、配列番号６８の配列、配列番号６９の配列、配列番号７０の配列、配列番号７１の配列、及び配列番号７２の配列、
２３）配列番号７３の配列、配列番号７４の配列、配列番号７５の配列、配列番号７６の配列、配列番号７７の配列、及び配列番号７８の配列、
２４）配列番号７９の配列、配列番号８０の配列、配列番号８１の配列、配列番号８２の配列、配列番号８３の配列、及び配列番号８４の配列。
【００２４】
１２．以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせをプライマーとして用いてＬＡＭＰ法によって増幅し、コントロールとして使用する、上記１１．の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
２５）配列番号８５の配列、配列番号８６の配列、配列番号８７の配列、配列番号８８の配列、配列番号８９の配列、及び配列番号９０の配列。
【００２５】
１３．増幅産物の測定を、ＤＮＡ結合色素試薬を添加して該ＤＮＡ結合色素試薬の発色を測定することにより実施する、上記４．から７．及び９．から１２．のいずれかの塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【００２６】
１４．配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド。
【００２７】
１５．配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む試薬キット。
【００２８】
１６．配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査用試薬キット。
【発明の効果】
【００２９】
本発明は、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害と相関性あるＨＬＡアリル又は／及びＨＬＡハプロタイプを同定したことにより、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発現可能性を早期に予測可能とし、塩酸チクロピジン投与の制限、該副作用の減少、さらには該副作用の重篤化の防止に効果がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群分析をなし、肝臓障害群の患者由来の各ＨＬＡ遺伝子型について、アリル頻度及び／又はハプロタイプ頻度分析によって、肝臓障害群と特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプとの相関性を判定することを含む塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル又は／及びＨＬＡハプロタイプのスクリーニング方法で特定されたＨＬＡアリル及び／又はハプロタイプをマーカーとする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法からなる。
【００３１】
本発明は、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害と特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプには相関性が存在することを初めて見出したものである。本発明を基礎にすれば、当業者は、さらにＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又はハプロタイプについての遺伝子分析と塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関性を分析し、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関性をもつさらなる特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプのスクリーニングが可能である。ＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子の各アリルを含め配列情報はその殆どが公知になっており、各ハプロタイプについても公知になっている。当業者は、各遺伝子の塩基配列情報及び／又はアミノ酸配列情報をもとにさらなる特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプの検出法の設計が可能である。
【００３２】
本発明の好ましい態様としては、塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群分析をなし、肝臓障害群の患者由来のＨＬＡ−Ａ遺伝子について、又は、ＨＬＡ−Ａ遺伝子及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子及びＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子）についてアリル頻度分析を行い、肝臓障害群と特定のＨＬＡ遺伝子型のアリルとの相関性を判定することからなる。また、別の本発明の好ましい態様としては、塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群分析をなし、肝臓障害群の患者由来のＨＬＡ−Ａ遺伝子、ＨＬＡ−Ｂ遺伝子、ＨＬＡ−Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＢ１遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子及びＨＬＡ−ＤＰＢ１遺伝子についてハプロタイプ頻度分析がおこなわれ、肝臓障害群と特定のハプロタイプとの相関性を判定することからなる。
【００３３】
上記のスクリーニング方法で特定されたＨＬＡアリル及び／又はハプロタイプをマーカーとすれば塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法が提供される。特定されたＨＬＡアリルとは、塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群において、顕著な存在を示すＨＬＡアリルを意味し、この特定されるＨＬＡアリルの各種情報を使い、当該ＨＬＡアリルを追跡、検出して、副作用を引き起こす可能性高い患者を特定しようとするものである。特定されたＨＬＡハプロタイプとは、塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群において、顕著な存在を示すＨＬＡハプロタイプを意味し、この特定されるＨＬＡハプロタイプの各種情報を使い、当該ＨＬＡハプロタイプを追跡、検出して、副作用を引き起こす可能性高い患者を特定しようとするものである。マーカーとするとは、例えば遺伝子増幅のためのプライマー設計に使用できるであろうし、検出、追跡の際のターゲットとしても使用できることを意味する。さらに、塩基配列情報であってもよく、アミノ酸配列情報であっても良いという意味を包含する。配列は、全配列でもよいし、部分配列でも特徴部分であれば利用可能であるし、さらにポイントにおける変異であっても特徴部位であれば利用可能である。
【００３４】
本発明において具体的には、ＨＬＡアリルとして、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３（配列番号１９）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号２１）、及びＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４（配列番号２０）が挙げられ、特に、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３が、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関性が高い特定ＨＬＡアリルとして同定された。また、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関性が高いＨＬＡハプロタイプとして、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４が特定された。これらの塩基配列及び各コードするアミノ酸配列は公知である。これらの特定ＨＬＡアリル及びＨＬＡハプロタイプは、コントロール群に比して、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害群においてその頻度が有意に高いものであった。この結果、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４は、日本人における塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の危険因子と考えられた。これら５つのＨＬＡ型は互いに強い連鎖不平衡の関係にあり、日本人集団で２番目に多いＨＬＡハプロタイプとして知られている（ハプロタイプ頻度４．０７％、４．８％）。肝臓障害群ならびにコントロール群におけるこれら５つのＨＬＡ遺伝子型のアリル頻度ならびにハプロタイプ頻度を表１に示した。
【００３５】
【表１】
【００３６】
塩酸チクロピジン投与の副作用として肝臓障害の患者２２例中１５例（６８％）がＨＬＡ−Ａ＊３３０３を有し、このうち１２例（５５％）は上記ハプロタイプであった（表１：１）Ａｌｌ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）。同様に塩酸チクロピジン投与の副作用として肝臓障害のうち胆汁うっ滞型肝臓障害を起こした１４例中１２例（８６％）がＨＬＡ−Ａ＊３３０３を有し、これらのうち１０例（７１％）は上記ＨＬＡハプロタイプを有していた（表１：２）Ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ ｈｅｐａｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）。一方、肝臓障害群において、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３をもたない患者で、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４のいずれかの多型を有している患者は認められなかった。以上より最も高いオッズ比（Ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ）を示したＨＬＡ−Ａ＊３３０３が日本人における塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害、特に黄疸を伴う重篤な胆汁うっ滞型肝臓障害の最も有力な危険因子と考えられた。このＨＬＡ−Ａ＊３３０３と塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害との相関性を見つけたことによって、塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害の判定法、特に塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害の発生危険率の検査方法が確立できた。かくして、塩酸チクロピジンの副作用を予め排除するためには、少なくともＨＬＡ−Ａ＊３３０３を保有する、或いは検出された患者は、塩酸チクロピジンの投与、投薬量の減量や投薬の中止等の制限をする。このような制限された塩酸チクロピジンの投与方法であれば、当該投与による副作用は事前に排除可能であり、投与量を減少すれば、副作用の発生或いは重篤化が防止できる。かくして、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の有無を投与前に検査し、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３を検出される患者への塩酸チクロピジンの投与を避けた場合、塩酸チクロピジン投与による肝臓障害の副作用の発生は、約１／３に減少すると推定される。
【００３７】
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３のアリル頻度には人種差が報告されている。塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害は欧米人に比べ日本人で特に報告数が多いことから、薬剤反応性遺伝子の多型頻度における人種差との関連が想定されていたが、今回、発明者らが見出したＨＬＡ−Ａ＊３３０３あるいはそれを含むＨＬＡハプロタイプの頻度における人種差が、塩酸チクロピジン投与の副作用である肝臓障害の発症の人種差を説明する上で興味深い結果である。
【００３８】
本発明は、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られたＰＣＲ産物を直接的に同定する、得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、又は、得られたＰＣＲ産物について上記特定ＤＮＡ断片の特定部位の塩基をタイピング法で決定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法をその手段の一つとする。「直接的に同定する」とは、同定しようとするものの有無や量を測定することを意味する。より具体的には、例えば、増幅産物に特異的に結合するプローブを使用して、該プローブにハイブリダイゼーションする増幅産物を検出することにより、増幅産物の有無や量を測定することを意味する。あるいは、増幅産物に結合し発色する色素試薬を使用して、該色素試薬による発色の有無を測定することにより、該増幅産物の有無や量を測定することを意味する。直接的に同定する方法は、上記のようなプローブや色素試薬を使用して増幅産物の有無や量を測定する方法に限らず、増幅産物の有無や量を測定し得る公知の方法をいずれも使用できる。
【００３９】
ＰＣＲは、よく知られた技術であり、自体公知の方法を利用して実施できる。具体的には、標的遺伝子の増幅を、標的遺伝子を増幅し得るプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを使用し、３段階の温度変化を繰り返すことによって行う。すなわち、温度変化の第１段階で標的遺伝子の二本鎖ＤＮＡを熱変性させて一本鎖ＤＮＡとし（変性反応：ｄｅｎａｔｕｒｅ）、第２段階でプライマーと一本鎖ＤＮＡとの二本鎖を形成させ（アニーリング反応：ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、第３段階で形成された二本鎖のプライマー部位からＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成させ（伸張反応：ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、これら反応を繰り返すことにより、標的遺伝子を増幅させる。変性反応の温度は、一般的に９４℃−９６℃が使用されているが、これに限定されず、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡとなる温度であればいずれも使用できる。アニーリング反応の温度は、一般的に５５℃−６０℃が使用されているが、これに限定されず、プライマーと一本鎖ＤＮＡとの二本鎖が形成される温度であればいずれも使用できる。伸張反応の温度は、一般的に７２℃−７４℃が使用されているが、これに限定されず、ＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖が合成される温度であればいずれも使用できる。各反応時間は、一般的に５秒−１分間程度であるが、これに限定されず、標的遺伝子が含まれていることが明らかな試料を用いて、簡単な実験を繰り返すことにより、好適な反応時間を決定できる。
【００４０】
ＰＣＲを利用した遺伝子増幅法の中で、ＰＣＲ配列特異的プライマー法（ＰＣＲ−ＳＳＰ法）が、好ましく例示される。ＰＣＲ−ＳＳＰ法では、標的遺伝子の特徴配列部分、すなわち本発明においては各ＨＬＡアリルの特徴配列部分をマーカーとして設計されたプライマーを使用して、目的とする特徴配列部分をＰＣＲにより増幅させる。各ＨＬＡアリルの特徴配列部分とは、各ＨＬＡアリルの配列において遺伝的多型が存在する部分を意味する。遺伝的多型が存在する部分とは、他のＨＬＡアリルの配列と比較して、異なる１又は２以上のヌクレオチドが存在する部分、又はヌクレオチドの欠失若しくは挿入が認められる部分を意味する。ＰＣＲ−ＳＳＰ法では、得られたＰＣＲ産物を電気泳動等の手段で分離することにより、容易に目的アリルの存在が判定可能である。さらに、得られたＰＣＲ産物のヌクレオチドの検出及びその種類の同定を行うことにより、該ＰＣＲ産物が目的アリル由来の特定ＤＮＡ断片であるか否かを確認することもできる。
【００４１】
本発明において、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をＰＣＲにより増幅させるプライマーは、各特定されたＨＬＡアリルの塩基配列の情報（配列番号１７〜２１）を元に特定配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる。プライマーは、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）を特異的に増幅できる該ＨＬＡアリル特有の配列からなるものである限りにおいていずれも使用できる。プライマーは、塩基配列長が一般的に５個ないし５０個のヌクレオチド、より好ましくは１０個ないし３５個のヌクレオチドさらに好ましくは１５個ないし３０個のヌクレオチドからなる。
【００４２】
好適なプライマーは、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）については、フォワードプライマーとして配列番号１の配列（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の７８番目から９８番目の配列）、リバースプライマーとしては配列番号２の配列（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の２５９番目から２７８番目の相補的な配列）、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）については、フォワードプライマーとして配列番号３の配列（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の３４４番目から３５５番目の配列の５´側にイントロン２の隣接する７塩基分をつなげた配列）又は配列番号４の配列（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の５２０番目から５３９番目の配列）、リバースプライマーとしては配列番号５の配列（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の５７２番目から５９３番目の相補的な配列）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号２１）については、フォワードプライマーとして配列番号６の配列（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の１７５番目から１９６番目の配列）、リバースプライマーとしては配列番号７の配列（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の２８６番目から３０４番目の相補的な配列）又は配列番号８の配列（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の３４４番目から３６３番目の相補的な配列）、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３（配列番号１９）については、フォワードプライマーとして配列番号１１の配列（ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３の７６番目から９９番目の配列）、リバースプライマーとして配列番号１２の配列（ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３の１３３番目から１５５番目の相補的な配列）、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４（配列番号２０）については、フォワードプライマーとして配列番号１３の配列（ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の６７番目から８９番目の配列）、リバースプライマーとして配列番号１４の配列（ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の２５６番目から２７７番目の相補的な配列）が例示される。なお、本発明では、タイピングでの内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡのアリルであるＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１（配列番号２２）に関するプライマーも設計され、フォワードプライマーとして配列番号９の配列（ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の３３７番目から３６０番目の配列）及び配列番号１５の配列（ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の３６０番目から３８０番目の配列）、リバースプライマーとして配列番号１０の配列（ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の６３３番目から６５４番目の相補的な配列）及び配列番号１６の配列（ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の５５５番目から５７４番目の相補的な配列）を特定した。無論、これらの配列は、各配列の断片又は各配列の延長物を含むものであってもよい。
【００４３】
さらに、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）について、フォワードプライマーとして配列番号２３の配列、リバースプライマーとして配列番号２４の配列、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）について、フォワードプライマーとして配列番号２５の配列又は配列番号２６の配列、リバースプライマーとして配列番号２７の配列、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号２１）について、フォワードプライマーとして配列番号２８の配列、リバースプライマーとして配列番号２９の配列又は配列番号３０の配列、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４（配列番号２０）について、フォワードプライマーとして配列番号３１の配列、リバースプライマーとして配列番号３２の配列を例示できる。なお、タイピングでの内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡのアリルであるＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１（配列番号２２）について、フォワードプライマーとして配列番号３３の配列、リバースプライマーとして配列番号３４の配列を例示できる。また、本発明では、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の増幅の特異性を確認するために、ＨＬＡ−ＤＱＢ１のアリルであるＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１に関するプライマーも設計され、フォワードプライマーとして配列番号３５の配列、リバースプライマーとして配列番号３６の配列を特定した。無論、これらの配列は、各配列の断片又は各配列の延長物を含むものであってもよい。
【００４４】
上記のプライマーは、以下のような配列のヌクレオチドの組み合わせで好適に用いられる。本プライマーは、ＰＣＲ−ＳＳＰ法に好適に使用できる。
１）配列番号１の配列と配列番号２の配列
２）配列番号３の配列と配列番号５の配列
３）配列番号４の配列と配列番号５の配列
３）配列番号６の配列と配列番号７の配列
４）配列番号６の配列と配列番号８の配列
５）配列番号１１の配列と配列番号１２の配列
６）配列番号１３の配列と配列番号１４の配列
７）配列番号２３の配列と配列番号２４の配列
８）配列番号２５の配列と配列番号２７の配列
９）配列番号２６の配列と配列番号２７の配列
１０）配列番号２８の配列と配列番号２９の配列
１１）配列番号２８の配列と配列番号３０の配列
１２）配列番号３１の配列と配列番号３２の配列
１３）配列番号９の配列と配列番号１０の配列
１４）配列番号１５の配列と配列番号１６の配列
１５）配列番号３３の配列と配列番号３４の配列
１６）配列番号３５の配列と配列番号３６の配列
【００４５】
ＰＣＲによる増幅産物のヌクレオチドの検出及びその種類の同定は、自体公知の方法を使用して実施できる。例えば、得られた特定断片をシークエンス法、例えばダイレクトシークエンシング法によって目的のアリルであることの確認をすることもできる。配列決定法としてはシークエンス法以外に、ハイブリダイゼーション法及び制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）解析法等が利用できる。ヌクレオチドの同定は、その他、公知の１塩基変異検出法を利用して実施できる。１塩基変異検出法として、例えば、ＳＮｕＰｅ法等の遺伝子タイピング法が挙げられる。
【００４６】
ヌクレオチドの検出及びその種類の同定は、その他、自体公知の１塩基変異解析方法を適用して実施できる。１塩基変異解析方法として、蛍光を用いる方法、例えばインベーダーアッセイ（リアミチェフ（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９９年、第１７巻、ｐ．２９２−２９６）やルミネックス法（チェン（Ｃｈｅｎ，Ｊ．）ら、「ゲノム リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．５４９−５５７）を例示できる。また、マススペクトルを用いる方法、例えばプライマー伸張法を応用した方法を用いることもできる。このような方法として、ピンポイントアッセイ（ロス（Ｒｏｓｓ，Ｐ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．１３４７−１３５１）やプローブ法（ブラウン（Ｂｒａｕｎ，Ａ．）ら、「クリニカル ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、１９９７年、第４３巻、ｐ．１１５１−１１５８）等を例示できる。さらに、ドールアッセイ（ＤＯＬ ａｓｓａｙ、チェン（Ｃｈｅｎ，Ｘ．）ら、「プロシーディング オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユナイテッド ステーツ オブ アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ）」、１９９７年、第９４巻、ｐ．１０７５６−１０７６１）、スナイパーアッセイ（ピアテク（Ｐｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．）ら、「ネイチャー バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、１９９８年、第１６巻、ｐ．３５９−３６３）及びタグアレイ法（ファン（Ｆａｎ，Ｊ−Ｂ．）ら、「ゲノム リサーチ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第１０巻、ｐ．８５３−８６０）等も使用できる。これら方法は、これらが報告されている引用文献を参照することにより容易に実施することができる。また、蛍光共鳴エネルギー移動（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＦＲＥＴ）やタックマン（Ｔａｑｍａｎ）法等、１塩基変異の検出方法としてよく知られた方法を用いることができる。
【００４７】
ヌクレオチドの検出及びその種類の同定は、また、アリル特異的核酸プローブを用いて、それぞれハイブリダイゼーション法により実施できる。核酸プローブとしては、各アリルのゲノム塩基配列において特異変異部位を含む塩基配列又はその相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該特異塩基変異部位を含む塩基配列に実質的に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドが例示できる。「実質的に相補的な塩基配列を有する」とは、プローブとして使用したときに、調べようとする試料（以下、被検試料と称する）中において１塩基変異部位を含む塩基配列又はその相補的塩基配列を例えばストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で検出することができることを意味する。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば成書に記載の方法（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア ラボラトリーマニュアル 第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー）等に従うことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件として具体的には、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ及び５０％ホルムアミドの溶液中で４２℃にて加温した後、０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳの溶液中で６８℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイゼーションのシグナルが観察される条件を例示できる。
【００４８】
プローブとして用いるポリヌクレオチドは、好ましくは８個ないし５０個のヌクレオチド、より好ましくは１７個ないし３５個のヌクレオチド、さらに好ましくは１７個ないし３０個のヌクレオチドからなる。プローブは、各アリル遺伝子の塩基配列又はその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成等により作製できる。得られたポリヌクレオチドから、上記１塩基変異部位を含む塩基配列又は該塩基配列の相補的塩基配列で表されるポリヌクレオチドの、当該１塩基変異部位を含む塩基配列で表される遺伝子断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションするものを選択することにより、目的とするプローブが得られる。これらプローブは、検出のためのマーカー、例えば蛍光物質や放射性同位体等の標識体で標識されたものであってもよい。標識体はこれらに限らず、プローブとそれに対応するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが阻害されないものであればいずれも使用できる。上記１塩基変異の検出方法は例示に過ぎず、本発明において用いることのできる検出方法はこれらに限定されない。
【００４９】
ＰＣＲによる増幅産物の同定は、その他、ＤＮＡ結合色素試薬を増幅産物中に添加し、増幅産物に結合した色素による発色の有無を測定することにより実施できる。ＰＣＲにより増幅産物が生じた場合、増幅産物に結合した色素による発色が検出されるため、発色の有無及び／又は強弱を測定することにより増幅産物の有無の判定ができる。ＤＮＡ結合色素試薬として、例えばサイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ登録商標）等のＤＮＡインターカレーターを例示できる。ＤＮＡ結合色素試薬は、ＤＮＡに結合して発色し得るものである限りにおいていずれも使用できる。発色の測定は、使用する試薬の発色の測定に一般的に使用されている公知の方法により実施できる。例えば、発色の測定は、自然光下で目視により実施できるし、又は適当な励起光、例えば発光ダイオードランプ下で発色させることにより実施できる。
【００５０】
本発明はまた、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法（ノートミ（Ｎｏｔｏｍｉ，Ｔ．）ら、「ヌクレイック アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０００年、第２８巻、第１２号、ｐ．ｅ６３）により増幅し、得られた増幅産物を直接的に同定する、又は、増幅の有無及び／又は多寡を同定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法をその手段の一つとする。
【００５１】
ＬＡＭＰ法は、二本鎖ＤＮＡを含む試料、プライマー、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ、基質（デオキシヌクレオチド三リン酸）等を同一容器に入れ、一定温度（６０℃−６５℃付近）で保温することにより、ＤＮＡの増幅から検出までを１ステップの工程で実施できる簡易な増幅技術である。ＬＡＭＰ法は増幅効率及び特異性が高く、ＤＮＡを迅速に特異に増幅することができ、さらに、増幅の有無を目視判定できる精確、簡易な増幅技術である。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲに必須なサーマルサイクラーのような特別な温度制御機器が不要であるため、安価な遺伝子検査が可能となる。このような利点から、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）を増幅し検出する手段として、ＬＡＭＰ法が好ましく使用される。
【００５２】
ＬＡＭＰ法において、特定されたＨＬＡアリル及び／又はＨＬＡハプロタイプを判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）の増幅の有無及び／又は多寡の検出は、増幅の副産物による白濁の有無及び／又は多寡を目視で判定することにより実施できる。すなわち、該ＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）が増幅された場合、増幅の副産物であるピロリン酸イオンと反応液中のマグネシウムイオンが結合して白濁するため、白濁した試料あるいは白濁が増加した試料では該ＤＮＡが増幅されたと判定できる。あるいは、該ＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）の増幅の及び／又は多寡の検出は、ＬＡＭＰ反応終了後に、ＤＮＡ結合色素試薬を反応液中に添加し、色素による発色の有無及び／又は強弱を測定することにより実施できる。該ＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）が増幅された場合、増幅産物を含む試料では色素による発色が検出されるため、発色が検出された試料では該ＤＮＡが増幅されたと判定できる。ＤＮＡ結合色素試薬を用いることにより、増幅産物の検出感度が高くなるため、増幅の有無や多寡の検出にはこのような試薬の使用が好ましい。ＤＮＡ結合色素試薬として、例えばサイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ登録商標）等のＤＮＡインターカレーターを例示できる。ＤＮＡ結合色素試薬は、ＤＮＡに結合して発色し得るものである限りにおいていずれも使用できる。発色の測定は、使用する試薬の発色の測定に一般的に使用されている公知の方法により実施できる。例えば、発色の測定は、自然光下で目視により実施できるし、又は適当な励起光、例えば発光ダイオードランプ下で発色させることにより実施できる。ＤＮＡ結合色素試薬を反応液中に添加するとき、同時に又は添加前に、ＬＡＭＰ反応に用いたＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を失活させることによりＬＡＭＰ反応を停止させることができる。ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の試薬により、あるいは高温度で処理することにより失活させることができる。ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を失活させる試薬は、ＤＮＡ結合色素試薬とは別に添加することもできるし、ＤＮＡ結合色素試薬に混合し含有させて使用することもできる。ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性失活させる高温度の条件として、９５℃で数分間、例えば２分間程度の処理といった条件を例示できる。
【００５３】
ＬＡＭＰ法に用いるプライマーは、図８に示すように、標的遺伝子の配列に対して、３´末端側からＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃの３つの領域を定め、また、５´末端側からＢ１、Ｂ２、Ｂ３の３つの領域を定め、これらに対してフォワードインナープライマー（Ｆｏｒｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ：以下、ＦＩＰと略称する）、Ｆ３プライマー（Ｆ３ ｐｒｉｍｅｒ）、バックワードインナープライマー（Ｂａｃｋｗａｒｄ Ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ：以下、ＢＩＰと略称する）、及びＢ３プライマー（Ｂ３ ｐｒｉｍｅｒ）の４種類のプライマーを設計し、所望によりさらにループプライマーフォワード（Ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ Ｆｏｒｗａｒｄ：以下、ＬＦと略称する）及び／又はループプライマーバックワード（Ｌｏｏｐ ｐｒｉｍｅｒ Ｂａｃｋｗａｒｄ：以下、ＬＢと略称する）を設計し、これらを組み合わせて使用する。ＦＩＰは、３´末端側に標的遺伝子のＦ２ｃ領域と相補的なＦ２領域と同じ配列を有し、５´末端側にＦ１ｃ領域と同じ配列を有する。Ｆ３プライマーは、標的遺伝子のＦ３ｃ領域と相補的なＦ３領域と同じ配列を有する。ＢＩＰは、３´末端側に標的遺伝子のＢ２ｃ領域と相補的な領域と同じ配列を有し、５´末端側にＢ１ｃ領域と同じ配列を有する。Ｂ３プライマーは、標的遺伝子のＢ３ｃ領域と相補的なＢ３領域と同じ配列を有する。ＬＦは、Ｆ１領域とＦ２領域の間の配列に相補的な配列を有する。ＬＢは、Ｂ１領域とＢ２領域の間の配列に相補的な配列を有する。
【００５４】
ＬＡＭＰ法に用いる好適なプライマーは、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）については、エキソン２（ｅｘｏｎ２）を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号３７の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号３８の配列、ＦＩＰとして配列番号３９の配列、ＢＩＰとして配列番号４０の配列、ＬＦとして配列番号４１の配列、ＬＢとしては配列番号４２の配列が例示される。また、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）のｅｘｏｎ３を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号４３の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号４４の配列、ＦＩＰとして配列番号４５の配列、ＢＩＰとして配列番号４６の配列、ＬＦとして配列番号４７の配列、ＬＢとしては配列番号４８の配列が例示される。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）については、ｅｘｏｎ２を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号４９の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号５０の配列、ＦＩＰとして配列番号５１の配列、ＢＩＰとして配列番号５２の配列、ＬＦとして配列番号５３の配列、ＬＢとしては配列番号５４の配列が例示される。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）のｅｘｏｎ３を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号５５の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号５６の配列、ＦＩＰとして配列番号５７の配列、ＢＩＰとして配列番号５８の配列、ＬＦとして配列番号５９の配列、ＬＢとしては配列番号６０の配列が例示される。ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３（配列番号１７）については、ｅｘｏｎ２を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号６１の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号６２の配列、ＦＩＰとして配列番号６３の配列、ＢＩＰとして配列番号６４の配列、ＬＦとして配列番号６５の配列、ＬＢとしては配列番号６６の配列が例示される。また、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３（配列番号１７）のｅｘｏｎ３を増幅標的とする場合、Ｆ３プライマーとして配列番号６７の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号６８の配列、ＦＩＰとして配列番号６９の配列、ＢＩＰとして配列番号７０の配列、ＬＦとして配列番号７１の配列、ＬＢとしては配列番号７２の配列が例示される。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号２１）については、Ｆ３プライマーとして配列番号７３の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号７４の配列、ＦＩＰとして配列番号７５の配列、ＢＩＰとして配列番号７６の配列、ＬＦとして配列番号７７の配列、ＬＢとしては配列番号７８の配列が例示される。ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４（配列番号２０）については、Ｆ３プライマーとして配列番号７９の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号８０の配列、ＦＩＰとして配列番号８１の配列、ＢＩＰとして配列番号８２の配列、ＬＦとして配列番号８３の配列、ＬＢとしては配列番号８４の配列が例示される。なお、本発明では、タイピングでの内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡのアリルであるＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１（配列番号２２）に関するプライマーも設計され、Ｆ３プライマーとして配列番号８５の配列、Ｂ３プライマーとしては配列番号８６の配列、ＦＩＰとして配列番号８７の配列、ＢＩＰとして配列番号８８の配列、ＬＦとして配列番号８９の配列、ＬＢとしては配列番号９０の配列を特定した。無論、これらの配列は、各配列の断片又は各配列の延長物を含むものであってもよい。
【００５５】
上記のプライマーは、以下のような配列のヌクレオチドの組み合わせで好適に用いられる。
１７）配列番号３７の配列、配列番号３８の配列、配列番号３９の配列、配列番号４０の配列、配列番号４１の配列、及び配列番号４２の配列、
１８）配列番号４３の配列、配列番号４４の配列、配列番号４５の配列、配列番号４６の配列、配列番号４７の配列、及び配列番号４８の配列、
１９）配列番号４９の配列、配列番号５０の配列、配列番号５１の配列、配列番号５２の配列、配列番号５３の配列、及び配列番号５４の配列、
２０）配列番号５５の配列、配列番号５６の配列、配列番号５７の配列、配列番号５８の配列、配列番号５９の配列、及び配列番号６０の配列、
２１）配列番号６１の配列、配列番号６２の配列、配列番号６３の配列、配列番号６４の配列、配列番号６５の配列、及び配列番号６６の配列、
２２）配列番号６７の配列、配列番号６８の配列、配列番号６９の配列、配列番号７０の配列、配列番号７１の配列、及び配列番号７２の配列、
２３）配列番号７３の配列、配列番号７４の配列、配列番号７５の配列、配列番号７６の配列、配列番号７７の配列、及び配列番号７８の配列、
２４）配列番号７９の配列、配列番号８０の配列、配列番号８１の配列、配列番号８２の配列、配列番号８３の配列、及び配列番号８４の配列
２５）配列番号８４の配列、配列番号８６の配列、配列番号８７の配列、配列番号８８の配列、配列番号８９の配列、及び配列番号９０の配列
【００５６】
以上に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いれば、本発明はさらに、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法が提供可能となる。
【００５７】
本発明の検査方法が適用される被検試料は、ヒト由来の血液、髄液、気管支肺胞洗浄液、痰、又は他の体液、あるいは口腔粘膜等の組織等それ自体のいずれであってもよい。特に、口腔粘膜試料は、試料を採取される被検対象の負担が少ないこと、及び採取が簡便であることから、被検試料として好ましく使用される。これら被検試料は、本発明の検査方法に適用されるとき、適当な緩衝液等で適宜希釈して使用することができる。例えば、口腔粘膜を被検試料としてＬＡＭＰ法を実施する場合、ＬＡＭＰを阻害する物質の影響を避けることを目的として、適当な緩衝液で口腔粘膜試料を適宜希釈して被検試料とすることが好ましい。さらに、希釈用緩衝液中にＬＡＭＰを阻害する物質の影響を低下させる試薬を添加することもできる。このような試薬として、Ｔｗｅｅｎ２０を例示できる。緩衝液の種類やｐＨ等、希釈の程度、及びＬＡＭＰを阻害する物質の影響を低下させる試薬の濃度は、口腔粘膜試料中の適当な公知遺伝子をＬＡＭＰ法で増幅する実験系を使用して、該増幅を阻害する物質の影響を低下させるものを選択することにより決定できる。
【００５８】
本発明の検査方法が適用される被検試料としてまた、上記被検試料から調製した核酸試料を使用することもできる。核酸試料の調製は、自体公知の核酸調製法により実施できる。核酸試料として、好ましくはゲノムＤＮＡを用いる。調製した核酸は直接検出に使用してもよく、あるいは分析前に所望の領域をＰＣＲ又はその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。
【００５９】
本発明の検査方法は、本発明に係る塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を用いることを手段とする塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率の検査方法に関する。本発明に係る塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害を引き起こす可能性を有する遺伝子型の検出方法を用いることにより、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の早期診断を実施できる。
【００６０】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率の検査方法は、具体的には、被検試料中の各特定アリルを同定し、さらに必要によりハプロタイプの同定を行い実施できる。被検試料中のＨＬＡ−Ａ＊３３０３の同定及び／又はＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４が検出された場合、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率が高いと判定できる。特に、被検試料中のＨＬＡ−Ａ＊３３０３が検出された場合、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率が高いと判断し、その投与方法を制限することが好ましい。
【００６１】
プローブやプライマーは、各アリルの塩基配列又はその相補的塩基配列に基づいて設計し、慣用の方法、例えば化学合成法等により作製できる。簡便には、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置を用いて製造できる。
【００６２】
本発明の別の態様は、配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む試薬キットに関する。本発明に係る試薬キットの範囲には、上記ポリヌクレオチドのうちの１種又はそれ以上を充填した、１個又はそれ以上の容器を含んでなる試薬キットも包含される。本試薬キットは、本発明に係る検出方法、及び検査方法の実施に必要とされる物質、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ結合色素試薬、標識物質、緩衝液、並びに塩等を含むことができる。さらに、安定化剤及び／又は防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質、例えばポリヌクレオチドに応じた自体公知の製剤化手段を導入すればよい。このような試薬及び試薬キットは、本発明に係る検出方法及び検査方法に、検査剤並びに検査用キットとして使用できる。
【００６３】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定され
ない。
【実施例１】
【００６４】
（塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生関連遺伝子の特定）
塩酸チクロピジンによる肝臓障害を発現した日本人症例の血液試料（肝臓障害群）とチクロピジンが投与され何ら有害事象が発現しなかった日本人症例の血液試料（コントロール群）を収集し、主に薬物代謝関連遺伝子、免疫学的パラメータと肝臓障害発現との関連性を検討した。肝臓障害群の血液試料は、報告された副作用・感染症症例報告を基に個々の医療機関から血液試料の提供を受けた。コントロール群の血液試料は５つの医療機関において、各々指定した期間中に塩酸チクロピジンを投与された患者のうちコントロール群に該当する全症例の血液試料の提供を受けた。
【００６５】
本検討は、「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針（平成１３年３月２９日付、文部振第２６６号、科発第１４６号、製局第３号）」に則り、会社の生命倫理審査委員会ならびに各血液試料提供医療機関の倫理審査委員会の承認を得たものである。また、血液試料の採取に先立ち、研究の内容、血液試料提供者の権利等を血液試料提供者本人に十分説明し、研究への参加について全症例から文書による同意を得た。
【００６６】
薬物代謝関連遺伝子はＣＹＰ１Ａ１、１Ａ２、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（ＧＳＳ）、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ Ｐ１（ＧＳＴＰ１）、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ ２（ＮＦＥ２）−Ｒｅｌａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ２（Ｎｒｆ２）、Ｋｅｌｃｈ−ｌｉｋｅ ＥＣＨ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＫＥＡＰ１）、ｈｅｍｅ ｏｘｙｇｅｎａｓｅ １（ＨＭＯＸ１）について既知の遺伝子多型の有無と肝臓障害との関連を検討した。
【００６７】
ＣＹＰ１Ａ１、１Ａ２、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、３Ａ４、ＧＳＳ、ＧＳＴＰ１については、ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｐ４５０ Ａｌｌｅｌｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍ．ｋｉ．ｓｅ／ＣＹＰａｌｌｅｌｅｓ／）もしくはＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ（ＯＭＩＭ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｄｂ＝ＯＭＩＭ）のｗｅｂサイトで報告されている多型のうち酵素活性に影響を及ぼすことが報告されている多型もしくはアミノ酸変異を伴うことが報告されている多型の有無を、直接塩基配列決定法（ダイレクトシークエンス法）もしくはＰＣＲ産物の有無をアガロースゲル電気泳動にて確認する方法にて判定した。
【００６８】
ＣＹＰ２Ｂ６については、酵素の活性あるいは発現量に影響を与える可能性がｉｎ ｖｉｔｒｏで証明されている多型ならびにファルマスニップコンソーシアム（ＰＳＣ）において、日本人に認められた多型の有無をポリメラーゼ連鎖反応−制限酵素断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法もしくはダイレクトシークエンス法にて判定した。
【００６９】
Ｎｒｆ２ならびにＨＭＯＸ１については既に報告されているプロモーター領域の多型の有無を、ＫＥＡＰ１については特定コーディング領域の多型の有無をダイレクトシークエンス法にて判定した。
【００７０】
ＨＬＡについては、クラスＩのＨＬＡとしてＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの３種、クラスＩＩのＨＬＡとしてＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＤＱＢ１、ＤＰＢ１の３種の遺伝子型を判定した。ＨＬＡ遺伝子型の判定はＰＣＲ−ＳＳＰ法にて行った。１０７例から同定された各ＨＬＡの対立遺伝子（アリル）数は、ＨＬＡ−Ａが１５アリル、ＨＬＡ−Ｂが２８アリル、ＨＬＡ−Ｃが１８アリル、ＨＬＡ−ＤＲＢ１が２５アリル、ＨＬＡ−ＤＱＢ１が１５アリル、ＨＬＡ−ＤＰＢ１が１２アリルであった。
【００７１】
薬物動態関連遺伝子と塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関についてはＦｉｓｈｅｒ直接確率法を用いて検定し、Ｐ＜０．０５を有意差ありとした。ＨＬＡ遺伝子型と塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害との相関についてはχ２検定を用い、オッズ比はχ２検定に用いた２×２分割表から算出した。補正Ｐ値（Ｐｃ）はχ２検定で得られたＰ値に、各ＨＬＡ ｌｏｃｕｓで同定されたアリルの数を乗じて算出し、Ｐｃ＜０．０５を有意差ありとした。
【００７２】
分析結果は以下である。１９９７年６月から２００４年９月の間にチクロピジンが投与開始された血栓性疾患を有する日本人患者１４５例の血液試料を１０施設の医療機関から収集した。血液試料の提供を受けた１４５例中３８例は評価不能等の理由から評価から除外した。評価対象１０７例中主治医が塩酸チクロピジンとの因果関係が否定できないと判定した症例（２２例）を肝臓障害群とした。肝臓障害群の病型を、Ｄａｎｎａｎらの報告に基づき（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １９９３；４６：１３２３−１３３０）、第６回日本肝臓学会で提案された薬剤性肝臓障害の診断基準（表２）により分類したところ、胆汁うっ滞型１４例、混合型５例、肝細胞障害型３例であった。
【００７３】
【表２】
【００７４】
塩酸チクロピジン投与期間中に適正に血液検査等が実施され、塩酸チクロピジンとの因果関係が否定できない有害事象が発現しなかった症例（８５例）をコントロール群とした。これら１０７例の患者背景について表３に示す。
【００７５】
【表３】
【００７６】
薬物代謝関連遺伝子については、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害と統計学的に有意な相関を示す多型は見出されなかった。一方、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害と統計学的に有意な相関を示すＨＬＡ遺伝子型が見出された。肝臓障害群２２例ならびにコントロール群８５例のＨＬＡ遺伝子型のアリル頻度を図１及び２に、肝臓障害群のうち、特に塩酸チクロピジンで多いと報告されている胆汁うっ滞型肝臓障害１４例ならびにコントロール群のＨＬＡ遺伝子型のアリル頻度を図３及び４に示す。この分析によってコントロール群に比し、肝臓障害群においてＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の頻度が有意に高かった。以下に各ＨＬＡ遺伝子型について各群のアリル頻度、オッズ比、検定結果を示す。
【００７７】
１）ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（配列番号１７）
コントロール群におけるＨＬＡ−Ａ＊３３０３のアリル頻度７％に対して、肝臓障害群のＨＬＡ−Ａ＊３３０３のアリル頻度は３４％（オッズ比１３．０４、９５％信頼区間４．４０〜３８．５９、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＜０．００１）であり、肝臓障害群のうち胆汁うっ滞型の病型を呈した例（１４例）におけるＨＬＡ−Ａ＊３３０３のアリル頻度は４３％（オッズ比３６．５０、９５％信頼区間７．２５〜１８３．８２、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＜０．００１）であった。
【００７８】
２）ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（配列番号１８）
コントロール群におけるＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のアリル頻度８％に対して、肝臓障害群のＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のアリル頻度は２７％（オッズ比６．６５、９５％信頼区間２．３８〜１８．５５、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＝０．００９）、うち胆汁うっ滞型では３６％（オッズ比１３．８５、９５％信頼区間３．７７〜５０．８７、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＝０．００１）であった。
【００７９】
３）ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３（配列番号１９）
コントロール群におけるＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３のアリル頻度７％に対して、肝臓障害群のＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３のアリル頻度は２７％（オッズ比７．３０、９５％信頼区間２．５９〜２０．６１、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＝０．００３）、うち胆汁うっ滞型では３６％（オッズ比１５．２１、９５％信頼区間４．１０〜５６．３９、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＜０．００１）であった。
【００８０】
４）ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２（配列番号２１）
コントロール群におけるＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２のアリル頻度６％に対し、肝臓障害群のＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２のアリル頻度は２７％（オッズ比９．００、９５％信頼区間３．１０〜２６．１７、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＝０．００１）、うち胆汁うっ滞型では３６％（オッズ比１８．７５、９５％信頼区間４．９４〜７１．１９、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＜０．００１）であった。
【００８１】
５）ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４（配列番号２０）
コントロール群におけるＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４のアリル頻度５％に対し、肝臓障害群のＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４のアリル頻度は２７％（オッズ比１０．１３、９５％信頼区間３．４２〜３０．０５、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＝０．００１）、うち胆汁うっ滞型では３６％（オッズ比２１．１１、９５％信頼区間５．４７〜８１．４２、Ｐ＜０．００１、Ｐｃ＜０．００１）であった。
【実施例２】
【００８２】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル及びＨＬＡハプロタイプが同定されたことにより患者血液試料から、各特定ＨＬＡアリル及びＨＬＡハプロタイプを同定するための検査方法を設定した。
【００８３】
方法は、血液試料より、ＤＮＡを抽出し、蛍光プローブＳＳＯ（配列特異オリゴヌクレオチド）法にて、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の各アリルを決定し、陽性コントロール（ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２）と陰性コントロールに分けた。ＨＬＡ遺伝子のタイピング法は、ＰＣＲ−ＳＳＰ法を用いた。
【００８４】
手順は、公知の各アリルの塩基配列情報に基づき、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２をそれぞれ特異的に増幅させうるプライマーを設計した。また、タイピングでの内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１（配列番号２２）を用いた。各プライマーは、表４に示し、その塩基配列は、配列表の相当する配列番号に記載のとおりである。
【００８５】
【表４】
【００８６】
設計したプライマーを用いて、陽性コントロールＤＮＡ及び陰性コントロールＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲをおこなった。表５にプライマーセットの組み合わせ及び各アレルのＰＣＲ産物（Ａ３３、Ｂ４４−１、Ｂ４４−２、ＤＲ１３−１、ＤＲ１３−２及びＤＲＡ）を示した。得られたＰＣＲ産物を用いてシークエンシング解析をおこない、塩基配列を確認した。
【００８７】
【表５】
【００８８】
次いで、ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲを以下の条件で行った。
反応組成は表６に示した。ＰＣＲの反応条件は表７に示した。
【００８９】
【表６】
【００９０】
【表７】
【００９１】
得られたＰＣＲ産物につき、電気泳動（ミュービッド２１、０．５ｘＴＢＥバッファー、２％アガロースゲル、約１５分展開：以下同）を行い、染色（エチジウムブロマイド １μｇ／ｍｌで約１５分）し、目的アリルの同定をした。さらにシークエンシング解析により目的のアリルであることを確認した。結果は、図５に示した。
【００９２】
次いで、保存血液を用いてＰＣＲを行い各アリルの同定をおこなった。具体的には、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ法（島津製作所社製）及びＡｍｐｌｉ Ｔａｑ（ＡＢＩ社製）によってＰＣＲを行い図６の結果を得、各アリルの増幅を確認した。反応組成は表８、反応条件は表９に示した。
【００９３】
【表８】
【００９４】
【表９】
【００９５】
次いで、保存血液を用いてＡｍｐｄｉｒｅｃｔ法（島津製作所社製）及びＬＡ Ｔａｑ（ＴａＫａＲａ社製）によってＰＣＲを行い図７の陽性コントロール及び陰性コントロールの結果を得、各アリルの増幅を確認した。反応組成は表１０、反応条件は表１１に示した。
【００９６】
【表１０】
【００９７】
【表１１】
【実施例３】
【００９８】
ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３及びＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の各アリルを判定するために、公知の各アリルの塩基配列情報に基づき、設計したプライマーは以下である。コントロールとして用いるＨＬＡ−ＤＲＡプライマーは、ＰＣＲ産物のサイズを小さくするために、別途設計した。プライマー名Ｃ１４−ｅｘ２−１Ｆは、配列番号１１、プライマー名Ｃ１４−ｅｘ２−１Ｒは、配列番号１２、プライマー名ＤＱＢ０６−ｅｘ２−Ｆは、配列番号１３、プライマー名ＤＱＢ０６−ｅｘ２−Ｒは、配列番号１４、プライマー名ＤＲＡ−２Ｆは、配列番号１５、プライマー名ＤＲＡ−２Ｒは、配列番号１６に相当する。ＰＣＲ反応条件は表１２に示した。
【００９９】
【表１２】
【０１００】
上記のプライマーを用いた、ＤＮＡによるＰＣＲにおいて、目的のサイズのＰＣＲ産物が得られることが確認された。
【実施例４】
【０１０１】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル及びＨＬＡハプロタイプの被検試料における同定を、ＬＡＭＰ法により検討した。
【０１０２】
被検試料として、ヒト口腔粘膜をスワブ（ｓｗａｂ）でかき取り、希釈したものを使用した。口腔粘膜を緩衝液に懸濁したものにはＬＡＭＰを阻害する物質が存在するため、該物質の影響を避けることを目的として、希釈は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８の緩衝液に終濃度０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０を加えた溶液を使用して行った。
【０１０３】
また、被検試料として、ヒト末梢血から抽出したＤＮＡを使用した。
【０１０４】
具体的には、各アリルの塩基配列情報に基づき、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３のｅｘｏｎ２又はｅｘｏｎ３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のｅｘｏｎ２又はｅｘｏｎ３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３のｅｘｏｎ２又はｅｘｏｎ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４を特異的に増幅するプライマーセットを設計した。一方、ＬＡＭＰ法における内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１を用い、ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１を特異的に増幅するプライマーセットを設計した。各プライマーは、表１３−１８に示し、その塩基配列は、配列表の相当する配列番号に記載のとおりである。
【０１０５】
【表１３】
【０１０６】
【表１４】
【０１０７】
【表１５】
【０１０８】
【表１６】
【０１０９】
【表１７】
【０１１０】
【表１８】
【０１１１】
ＬＡＭＰ反応は、以下の終濃度の組成で、６５℃で行った：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ ８．８）、１０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１．６Ｍ ベタイン（Ｂｅｔａｉｎ）、１．４ｍＭ 各デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、１．６μＭ ＦＩＰ、１．６μＭ ＢＩＰ、０．８μＭ ＬＦ、０．８μＭ ＬＢ、０．２μＭ Ｆ３プライマー、０．２μＭ Ｂ３プライマー。
【０１１２】
ＬＡＭＰ反応による増幅の有無は、サイバーグリーン存在下でＬＡＭＰ反応を行い、増幅してきた二本鎖ＤＮＡにサイバーグリーンが結合することにより発する蛍光強度を測定することにより実施した。ＬＡＭＰ反応及びサイバーグリーンの蛍光の強度測定は、反応開始から６０分間経時的に行った。蛍光強度は反応時間に対するＬｏｇ表示にて図示し、指数関数的増幅領域の中央に閾値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｌｉｎｅ）を設定した。そして、閾値を超えた時間を図より判定した。結果を示す図においては、横軸に反応時間（図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸に蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示した。
【０１１３】
ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のｅｘｏｎ３を特異的に増幅するプライマーセット（表１４）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３アリルを含む口腔粘膜被検試料のみで増幅が観察された（図９）。同様にＨＬＡ−Ｂ＊４４０３（ｅｘｏｎ２）、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３（ｅｘｏｎ２及びｅｘｏｎ３）、ＨＬＡ−Ｃ＊１４０３（ｅｘｏｎ２及びｅｘｏｎ３）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４を上記プライマーセットを用いることにより口腔粘膜から各アリル特異的に増幅し検出できた。
【０１１４】
さらに、別の方法（Ｌｕｍｉｎｅｘ法）によるタイピングでＨＬＡアリル既知のヒト末梢血から抽出したＤＮＡを使用し、上記プライマーセット群を使用してＬＡＭＰを行ったところ、各アリルをもつ被検試料でのみ増幅が観察された（図１０−１５、表１９−２４）。表中、Ｃｔとは各被検試料の閾値を超えた時間を意味する。表においてＣｔがＵｎｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄと表示されている場合、被検試料においてＤＮＡが増幅されなかったことを示す。特定のＨＬＡアリルを増幅するプライマーセット群を用いたＬＡＭＰにおいて、標的のＨＬＡアリルの増幅のＣｔは４０以内であり、このことからＬＡＭＰ反応開始後４０分以内に標的のＨＬＡアリルが十分に増幅されることが判明した。一方、一部の被検試料において、特定のＨＬＡアリルを増幅するプライマーセット群により、別のＨＬＡアリルが増幅されており、そのＣｔはほぼ５０以上である。このことから、ＬＡＭＰ反応開始後５０分以降に増幅が観察される場合は、該増幅は非常に反応効率の悪い非特異的な反応による増幅の結果と考えることができる。
【０１１５】
【表１９】
【０１１６】
【表２０】
【０１１７】
【表２１】
【０１１８】
【表２２】
【０１１９】
【表２３】
【０１２０】
【表２４】
【０１２１】
上記結果から、表１３−１８に示したプライマーセットを使用して、ＬＡＭＰ方法で各ＨＬＡアリルが特的に増幅できることが明らかになった。
【実施例５】
【０１２２】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル及びＨＬＡハプロタイプの被検試料における同定を、ＰＣＲ−ＳＳＰ法により検討した。
【０１２３】
被検試料として、ＨＬＡアリル既知のヒト末梢血から抽出したＤＮＡ、又は、希釈したヒト末梢血自体を使用した。ＰＣＲ−ＳＳＰ法は、ＤＮＡを被検試料として使用する場合はＴａｑ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ（Ｔａｋａｒａ社製）を使用し、ヒト末梢血自体を使用使用する場合はＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（島津製作所社製）を使用して、それぞれ表２５及び表２６に示す条件で行った。
【０１２４】
【表２５】
【０１２５】
【表２６】
【０１２６】
ＰＣＲ−ＳＳＰ法に使用するプライマーセットを各アリルの塩基配列情報に基づいて設計した。一方、ＬＡＭＰ法における内因性陽性コントロールとしてＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１を用い、ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１を特異的に増幅するプライマーセットを設計した。また、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の増幅の特異性を確認するために、ＨＬＡ−ＤＱＢ１のアリルであるＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１に関するプライマーも設計した。各プライマーは、表２７に示し、その塩基配列は、配列表の相当する配列番号に記載のとおりである。
【０１２７】
【表２７】
【０１２８】
設計したプライマーを用いて、特定のＨＬＡアリルが陽性であることが明らかになっているＤＮＡ及び該ＨＬＡアリルが陰性であることが明らかになっているＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ−ＳＳＰ法を実施した。表２８にプライマーセットの組み合わせ及び増幅産物のサイズを示した。
【０１２９】
【表２８】
【０１３０】
上記プライマーセットを用いたＰＣＲ−ＳＳＰ法において、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４、ＨＬＡ−ＤＲＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０１／０６０２の各アリル特異的増幅が観察された（図１６）。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の増幅は、プライマーＢ４４−Ｆ１／Ｂ４４−Ｒ１の組み合わせを用いた検討、及びプライマーＢ４４−Ｆ２／Ｂ４４Ｒ１の組み合わせを用いた検討の両方で増幅が確認された場合に陽性と判定した。同様に、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の増幅は、プライマーＤＲ１３−Ｆ１／ＤＲ１３−Ｒ１の組み合わせを用いた検討、及びプライマーＤＲ１３−Ｆ１／ＤＲ１３Ｒ２の組み合わせを用いた検討の両方で増幅が確認された場合にＤＲＢ１＊１３０２陽性と判定した。
【０１３１】
また、被検試料として、末梢血から抽出・精製したＤＮＡの代わりに、希釈した末梢血自体を使用したＰＣＲ−ＳＳＰ法を実施しても、各アリル特異的増幅が観察された（図１７）。
【０１３２】
上記結果から、表２５に示したプライマーセットを使用して、ＰＣＲ−ＳＳＰ方法で各ＨＬＡアリルが特的に増幅できることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
本発明は、塩酸チクロピジンによる肝臓障害の副作用発現の早期予測を可能とし、塩酸チクロピジン治療における副作用の減少及び軽減に寄与するものである。
【配列表フリーテキスト】
【０１３４】
配列番号１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３−ｅｘ２Ｆ。ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の７８番目から９８番目の配列である。
配列番号２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３−ｅｘ２Ｒ。ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の２５９番目から２７８番目の相補的な配列である。
配列番号３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−ｅｘ３−Ｆ。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の３４４番目から３５５番目の配列の５´側にイントロン２の隣接する７塩基分をつなげた配列である。
配列番号４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−ｅｘ３−２Ｆ。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の５２０番目から５３９番目の配列である。
配列番号５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−ｅｘ３−Ｒ。ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の５７２番目から５９３番目の相補的な配列である。
配列番号６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−ｅｘ２−２Ｆ。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の１７５番目から１９６番目の配列である。
配列番号７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−ｅｘ２−３Ｒ。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の２８６番目から３０４番目の相補的な配列である。
配列番号８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−ｅｘ２−２Ｒ。ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の３４４番目から３６３番目の相補的な配列である。
配列番号９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−Ｆ。ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の３３７番目から３６０番目の配列である。
配列番号１０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−Ｒ。ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の６３３番目から６５４番目の相補的な配列である。
配列番号１１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４−ｅｘ２−１Ｆ。ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３の７６番目から９９番目の配列である。
配列番号１２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４−ｅｘ２−１Ｒ。ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３の１３３番目から１５５番目の相補的な配列である。
配列番号１３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６−ｅｘ２−Ｆ。ＤＱＢ１＊０６０４の６７番目から８９番目の配列である。
配列番号１４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６−ｅｘ２−Ｒ。ＤＱＢ１＊０６０４の２５６番目から２７７番目の相補的な配列である。
配列番号１５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−２Ｆ。ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の３６０番目から３８０番目の配列である。
配列番号１６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−２Ｒ。ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の５５５番目から５７４番目の相補的な配列である。
配列番号１７：ＨＬＡ−Ａ＊３３０３の全配列である。
配列番号１８：ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３の全配列である。
配列番号１９：ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３の全配列である。
配列番号２０：ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４の部分配列であり、シグナル部分が取れた成熟蛋白質成熟蛋白質をコードしている塩基配列である。
配列番号２１：ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２の全配列である。
配列番号２２：ＨＬＡ−ＤＲＡ＊０１０１の全配列である。
配列番号２３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３−Ｆ１。
配列番号２４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３−Ｒ１。
配列番号２５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−Ｆ１。
配列番号２６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−Ｆ２。
配列番号２７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４−Ｒ１。
配列番号２８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−Ｆ１。
配列番号２９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−Ｒ１。
配列番号３０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３−Ｒ２。
配列番号３１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６−Ｆ１。
配列番号３２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６−Ｒ１。
配列番号３３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−Ｆ１。
配列番号３４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡ−Ｒ１。
配列番号３５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０１０６０２−Ｆ１。
配列番号３６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０１０６０２−Ｒ１。
配列番号３７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿Ｆ３。
配列番号３８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿Ｂ３。
配列番号３９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿ＦＩＰ。
配列番号４０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿ＢＩＰ。
配列番号４１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿ＬＦ。
配列番号４２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ２＿Ｌ３＿ＬＢ。
配列番号４３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿Ｆ３。
配列番号４４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿Ｂ３。
配列番号４５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿ＦＩＰ。
配列番号４６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿ＢＩＰ。
配列番号４７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿ＬＦ。
配列番号４８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ａ３３０３＿Ｅｘ３＿Ｌ３＿ＬＢ。
配列番号４９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿Ｆ３。
配列番号５０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿Ｂ３。
配列番号５１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿ＦＩＰ。
配列番号５２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿ＢＩＰ。
配列番号５３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿ＬＦ。
配列番号５４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３ｅ２＿ＬＰ３＿ＬＢ。
配列番号５５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿Ｆ３。
配列番号５６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿Ｂ３。
配列番号５７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿ＦＩＰ。
配列番号５８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿ＢＩＰ。
配列番号５９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿ＬＦ。
配列番号６０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｂ４４０３＿ＬＰ２＿ＬＢ。
配列番号６１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿Ｆ３。
配列番号６２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿Ｂ３。
配列番号６３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿ＦＩＰ。
配列番号６４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿ＢＩＰ。
配列番号６５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿ＬＦ。
配列番号６６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ２＿ＬＢ。
配列番号６７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿Ｆ３。
配列番号６８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿Ｂ３。
配列番号６９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿ＦＩＰ。
配列番号７０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿ＢＩＰ。
配列番号７１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿ＬＦ。
配列番号７２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：Ｃ１４０３＿ｅｘ３＿ＬＢ。
配列番号７３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿Ｆ３。
配列番号７４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿Ｂ３。
配列番号７５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿ＦＩＰ。
配列番号７６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿ＢＩＰ。
配列番号７７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿ＬＦ。
配列番号７８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲ１３０２＿ＬＰ３＿ＬＢ。
配列番号７９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿Ｆ３。
配列番号８０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿Ｂ３。
配列番号８１：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿ＦＩＰ。
配列番号８２：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿ＢＩＰ。
配列番号８３：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿ＬＦ。
配列番号８４：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＱＢ０６０４＿ＬＰ＿ＬＢ。
配列番号８５：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿Ｆ３。
配列番号８６：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿Ｂ３。
配列番号８７：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿ＦＩＰ。
配列番号８８：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿ＢＩＰ。
配列番号８９：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿ＬＦ。
配列番号９０：プライマー用の設計されたポリヌクレオチド。プライマー名：ＤＲＡｅ３＿ＬＰ＿ＬＢ。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】チクロピジン投与の副作用である肝臓障害患者（日本人）におけるＨＬＡクラスＩ抗原（ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎｓ）のアリル頻度
【図２】チクロピジン投与の副作用である肝臓障害患者（日本人）におけるＨＬＡクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎｓ）のアリル頻度
【図３】チクロピジン投与の副作用である胆汁うっ滞型肝臓障害患者（日本人）におけるＨＬＡクラスＩ抗原（ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ ａｎｔｉｇｅｎｓ）のアリル頻度
【図４】チクロピジン投与の副作用である胆汁うっ滞型肝臓障害患者（日本人）におけるＨＬＡクラスＩＩ抗原（ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ ＩＩ ａｎｔｉｇｅｎｓ）のアリル頻度
【図５】左よりＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＲＡのＰＣＲ産物の電気泳動図。図中、Ｍはマーカーを、矢印は目的産物を示す。
【図６】保存血液を用いてＡｍｐｄｉｒｅｃｔ法（島津製作所社製）及びＡｍｐｌｉ Ｔａｑ法（ＡＢＩ社製）によるＰＣＲ産物の電気泳動図。プライマーは、表４に記載のプライマーを表５のように組み合わせて使用した。図中の符号はそれぞれ、Ｍ：マーカー、Ａ：Ａ３３、Ｂ１：Ｂ４４−１、Ｂ２：Ｂ４４−２、Ｄ１：ＤＲ１３−１、ＤＲ２：ＤＲ１３−２を意味する。
【図７】保存血液を用いてＡｍｐｄｉｒｅｃｔ法（島津製作所社製）及びＬＡ Ｔａｑ法（ＴａＫａＲａ社製）によってＰＣＲを行い得たＰＣＲ産物の電気泳動図。図７の上段は陽性コントロール、下段は陰性コントロールである。ＡｍｐｄｉｒｅｃｔはＡｍｐｄｉｒｅｃｔ法による結果、ＬＡ ＴａｑはＬＡ Ｔａｑ法による結果を示す。プライマーは、表４に記載のプライマーを表５のように組み合わせて使用した。図中の符号はそれぞれ、Ｍ：マーカー、Ａ：Ａ３３、Ｂ１：Ｂ４４−１、Ｂ２：Ｂ４４−２、Ｄ１：ＤＲ１３−１、ＤＲ２：ＤＲ１３−２を意味する。
【図８】ＬＡＭＰ法で用いるプライマーセットを説明する模式図である。
【図９】ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のｅｘｏｎ３を特異的に増幅するプライマーセット（表１４参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３アリルを含む口腔粘膜試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１０】ＨＬＡ−Ａ＊３３０３のｅｘｏｎ３を特異的に増幅するプライマーセット（表１３参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１１】ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３のｅｘｏｎ３を特異的に増幅するプライマーセット（表１４参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１２】ＨＬＡ−Ｃ＊１４０３のｅｘｏｎ３を特異的に増幅するプライマーセット（表１５参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−Ｃ＊１４０３アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１３】ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２を特異的に増幅するプライマーセット（表１６参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１４】ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４を特異的に増幅するプライマーセット（表１７参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１５】ＨＬＡ−ＤＲＡ１を特異的に増幅するプライマーセット（表１８参照）を用いてＬＡＭＰ法を行った結果、ＨＬＡ−ＤＲＡ１アリルを含むヒト末梢血由来ＤＮＡ試料のみで増幅が観察されたことを示す図である。横軸は反応時間（分：図中、ｃｙｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒと表示）、縦軸は蛍光強度（図中、Ｄｅｌｔａ Ｒｎと表示）を示す。
【図１６】ヒト末梢血由来ＤＮＡ試料において、ＰＣＲ−ＳＳＰ法によりＨＬＡアリルが特異的に検出されたことを示す図である。プライマーは、表２７に示す各プライマーを表２８のように組み合わせて使用した。図中の符号はそれぞれ、Ｍ：マーカー（５０−２５００ｂｐ ラダー）、ＤＱＢ０６０４：ＤＱＢ１＊０６０４、ＤＱＢ０６０１０６０２：ＤＱＢ１＊０６０１／０６０２、Ｎ：鋳型なし、＋：鋳型が特定ＨＬＡアリル陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）のＤＮＡ、−−：鋳型が特定ＨＬＡアリル陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）のＤＮＡを意味する。
【図１７】希釈したヒト末梢血試料において、ＰＣＲ−ＳＳＰ法によりＨＬＡアリルが特異的に検出されたことを示す図である。プライマーは、表２７に示す各プライマーを表２８のように組み合わせて使用した。左パネルは、ＨＬＡハプロタイプが、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３−Ｂ＊４４０３−ＤＲＢ１＊１３０２−ＤＱＢ１＊０６０４であるヒト末梢血試料を用いた結果を示す。右パネルは、ＨＬＡハプロタイプが、ＨＬＡ−Ａ＊２６０２／３１０１−Ｂ＊１５０１／３５０１−ＤＲＢ１＊０４０３／１４０５−ＤＱＢ１＊０５０３／０６０１であるヒト末梢血試料を用いた結果を示す。図中の符号はそれぞれ、Ｍ：マーカー、ＤＱＢ１＊０６０１／０２：ＤＱＢ１＊０６０１／０６０２を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群分析をなし、肝臓障害群の患者由来の各ＨＬＡ遺伝子型について、アリル頻度及び／又はハプロタイプ頻度分析によって、肝臓障害群と特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプとの相関性を判定することを含む塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル又は／及びＨＬＡハプロタイプのスクリーニング方法で特定されたＨＬＡアリル及び／又はハプロタイプをマーカーとする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項２】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項３】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡハプロタイプとして、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２及びＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４をマーカーとする請求項２に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項４】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとし、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られたＰＣＲ産物を直接的に同定する、得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、又は、得られたＰＣＲ産物について上記特定ＤＮＡ断片の特定部位の塩基をタイピング法で決定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項５】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせをマーカーとして設計されたプライマーを用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られたＰＣＲ産物を直接的に同定する、得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、又は、得られたＰＣＲ産物について上記特定ＤＮＡ断片の特定部位の塩基をタイピング法で決定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項６】
少なくともＨＬＡ−Ａ＊３３０３が検出される患者への投与が制限される塩酸チクロピジンを含有する医薬。
【請求項７】
以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１をフォワード及びリバースプライマーとして用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する、請求項５に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１）配列番号１の配列と配列番号２の配列
２）配列番号３の配列と配列番号５の配列
３）配列番号４の配列と配列番号５の配列
３）配列番号６の配列と配列番号７の配列
４）配列番号６の配列と配列番号８の配列
５）配列番号１１の配列と配列番号１２の配列
６）配列番号１３の配列と配列番号１４の配列
７）配列番号２３の配列と配列番号２４の配列
８）配列番号２５の配列と配列番号２７の配列
９）配列番号２６の配列と配列番号２７の配列
１０）配列番号２８の配列と配列番号２９の配列
１１）配列番号２８の配列と配列番号３０の配列
１２）配列番号３１の配列と配列番号３２の配列。
【請求項８】
以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１をフォワード及びリバースプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、コントロールとして使用する、請求項５又は７に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１３）配列番号９の配列と配列番号１０の配列
１４）配列番号１５の配列と配列番号１６の配列
１５）配列番号３３の配列と配列番号３４の配列
１６）配列番号３５の配列と配列番号３６の配列。
【請求項９】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとし、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法により増幅し、得られた増幅産物を直接的に同定する、又は、増幅の有無を同定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項１０】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせをマーカーとして設計されたプライマーを用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法により増幅し、得られた増幅産物を直接的に同定する、又は、増幅の有無を同定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項１１】
以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１又は２以上の組み合わせをプライマーとして用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法によって増幅する、請求項１０に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１７）配列番号３７の配列、配列番号３８の配列、配列番号３９の配列、配列番号４０の配列、配列番号４１の配列、及び配列番号４２の配列、
１８）配列番号４３の配列、配列番号４４の配列、配列番号４５の配列、配列番号４６の配列、配列番号４７の配列、及び配列番号４８の配列、
１９）配列番号４９の配列、配列番号５０の配列、配列番号５１の配列、配列番号５２の配列、配列番号５３の配列、及び配列番号５４の配列、
２０）配列番号５５の配列、配列番号５６の配列、配列番号５７の配列、配列番号５８の配列、配列番号５９の配列、及び配列番号６０の配列、
２１）配列番号６１の配列、配列番号６２の配列、配列番号６３の配列、配列番号６４の配列、配列番号６５の配列、及び配列番号６６の配列、
２２）配列番号６７の配列、配列番号６８の配列、配列番号６９の配列、配列番号７０の配列、配列番号７１の配列、及び配列番号７２の配列、
２３）配列番号７３の配列、配列番号７４の配列、配列番号７５の配列、配列番号７６の配列、配列番号７７の配列、及び配列番号７８の配列、
２４）配列番号７９の配列、配列番号８０の配列、配列番号８１の配列、配列番号８２の配列、配列番号８３の配列、及び配列番号８４の配列。
【請求項１２】
以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせをプライマーとして用いてループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法によって増幅し、コントロールとして使用する、請求項１１に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
２５）配列番号８５の配列、配列番号８６の配列、配列番号８７の配列、配列番号８８の配列、配列番号８９の配列、及び配列番号９０の配列。
【請求項１３】
増幅産物の測定を、ＤＮＡ結合色素試薬を添加して該ＤＮＡ結合色素試薬の発色を測定することにより実施する、請求項４から７及び９から１２のいずれか１項に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項１４】
配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査用試薬キット。
【請求項１】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
塩酸チクロピジンが投与された血栓性疾患を有する患者の肝臓障害群分析をなし、肝臓障害群の患者由来の各ＨＬＡ遺伝子型について、アリル頻度及び／又はハプロタイプ頻度分析によって、肝臓障害群と特定のＨＬＡ遺伝子型のアリル及び／又は特定ハプロタイプとの相関性を判定することを含む塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡアリル又は／及びＨＬＡハプロタイプのスクリーニング方法で特定されたＨＬＡアリル及び／又はハプロタイプをマーカーとする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項２】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項３】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害相関ＨＬＡハプロタイプとして、ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２及びＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４をマーカーとする請求項２に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項４】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとし、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られたＰＣＲ産物を直接的に同定する、得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、又は、得られたＰＣＲ産物について上記特定ＤＮＡ断片の特定部位の塩基をタイピング法で決定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項５】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせをマーカーとして設計されたプライマーを用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅し、得られたＰＣＲ産物を直接的に同定する、得られたＰＣＲ産物の配列をシークエンス法で決定する、又は、得られたＰＣＲ産物について上記特定ＤＮＡ断片の特定部位の塩基をタイピング法で決定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項６】
少なくともＨＬＡ−Ａ＊３３０３が検出される患者への投与が制限される塩酸チクロピジンを含有する医薬。
【請求項７】
以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１をフォワード及びリバースプライマーとして用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅する、請求項５に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１）配列番号１の配列と配列番号２の配列
２）配列番号３の配列と配列番号５の配列
３）配列番号４の配列と配列番号５の配列
３）配列番号６の配列と配列番号７の配列
４）配列番号６の配列と配列番号８の配列
５）配列番号１１の配列と配列番号１２の配列
６）配列番号１３の配列と配列番号１４の配列
７）配列番号２３の配列と配列番号２４の配列
８）配列番号２５の配列と配列番号２７の配列
９）配列番号２６の配列と配列番号２７の配列
１０）配列番号２８の配列と配列番号２９の配列
１１）配列番号２８の配列と配列番号３０の配列
１２）配列番号３１の配列と配列番号３２の配列。
【請求項８】
以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１をフォワード及びリバースプライマーとして用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、コントロールとして使用する、請求項５又は７に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１３）配列番号９の配列と配列番号１０の配列
１４）配列番号１５の配列と配列番号１６の配列
１５）配列番号３３の配列と配列番号３４の配列
１６）配列番号３５の配列と配列番号３６の配列。
【請求項９】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせを検査対象のマーカーとし、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法により増幅し、得られた増幅産物を直接的に同定する、又は、増幅の有無を同定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項１０】
塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害関連遺伝子の検出及び／又はハプロタイプの検出方法を用いることを手段とする、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法であって、
ＨＬＡ−Ａ＊３３０３、又は ＨＬＡ−Ａ＊３３０３及び次の少なくとも１（ＨＬＡ−Ｂ＊４４０３、ＨＬＡ−Ｃｗ＊１４０３、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１３０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０４）の組み合わせをマーカーとして設計されたプライマーを用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法により増幅し、得られた増幅産物を直接的に同定する、又は、増幅の有無を同定する、塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項１１】
以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせから選ばれる１又は２以上の組み合わせをプライマーとして用いて、判別しうるＤＮＡ断片（特定ＤＮＡ断片）をループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法によって増幅する、請求項１０に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
１７）配列番号３７の配列、配列番号３８の配列、配列番号３９の配列、配列番号４０の配列、配列番号４１の配列、及び配列番号４２の配列、
１８）配列番号４３の配列、配列番号４４の配列、配列番号４５の配列、配列番号４６の配列、配列番号４７の配列、及び配列番号４８の配列、
１９）配列番号４９の配列、配列番号５０の配列、配列番号５１の配列、配列番号５２の配列、配列番号５３の配列、及び配列番号５４の配列、
２０）配列番号５５の配列、配列番号５６の配列、配列番号５７の配列、配列番号５８の配列、配列番号５９の配列、及び配列番号６０の配列、
２１）配列番号６１の配列、配列番号６２の配列、配列番号６３の配列、配列番号６４の配列、配列番号６５の配列、及び配列番号６６の配列、
２２）配列番号６７の配列、配列番号６８の配列、配列番号６９の配列、配列番号７０の配列、配列番号７１の配列、及び配列番号７２の配列、
２３）配列番号７３の配列、配列番号７４の配列、配列番号７５の配列、配列番号７６の配列、配列番号７７の配列、及び配列番号７８の配列、
２４）配列番号７９の配列、配列番号８０の配列、配列番号８１の配列、配列番号８２の配列、配列番号８３の配列、及び配列番号８４の配列。
【請求項１２】
以下のポリヌクレオチドの各配列（各配列の断片又は各配列の延長物を含む）の組み合わせをプライマーとして用いてループ−メディエーティッド アイソサーマル アンプリフィケーション（Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＬＡＭＰ）法によって増幅し、コントロールとして使用する、請求項１１に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法：
２５）配列番号８５の配列、配列番号８６の配列、配列番号８７の配列、配列番号８８の配列、配列番号８９の配列、及び配列番号９０の配列。
【請求項１３】
増幅産物の測定を、ＤＮＡ結合色素試薬を添加して該ＤＮＡ結合色素試薬の発色を測定することにより実施する、請求項４から７及び９から１２のいずれか１項に記載の塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査方法。
【請求項１４】
配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列表の配列番号１から配列番号１６及び配列番号２３から配列番号９０のいずれか１に記載のポリヌクレオチドを含む塩酸チクロピジンの副作用である肝臓障害の発生危険率検査用試薬キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図８】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図８】
【図５】
【図６】
【図７】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【公開番号】特開２００７−１１７０８５（Ｐ２００７−１１７０８５Ａ）
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２６５７２７（Ｐ２００６−２６５７２７）
【出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５０４３８３５１９）ジェノダイブファーマ株式会社 (5)
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月１７日（２００７．５．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２８日（２００６．９．２８）
【出願人】（５０４３８３５１９）ジェノダイブファーマ株式会社 (5)
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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