外来ＤＮＡを挿入しない酢酸菌の遺伝子欠損法
【課題】酢酸菌のゲノムＤＮＡに外来ＤＮＡを挿入することなしに作製された遺伝子欠損酢酸菌株を、より高効率で取得できる遺伝子欠損酢酸菌株作製法を提供すること。
【解決手段】酢酸菌ゲノム中の標的遺伝子を欠損させるために、該標的遺伝子又はその一部を挟む２領域の相同配列を、タンデムに連結した配列を含むＤＮＡ断片を調製する工程（ａ）；前記ＤＮＡ断片を、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を有し、且つ酢酸菌の複製起点を有さないベクターに導入し、環状化ＤＮＡを調製する工程（ｂ）；前記環状化ＤＮＡを、前記標的遺伝子を有する酢酸菌に導入する工程（ｃ）；前記環状化ＤＮＡを導入した酢酸菌のうち、相同組換えにより環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌ゲノムに組み込まれた酢酸菌を、前記薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤が含まれる培地で培養することにより選択する工程（ｄ）；工程（ｄ）で選択された薬剤耐性が付与された酢酸菌を、前記薬剤を含まない培地で培養する工程（ｅ）を備える。
【解決手段】酢酸菌ゲノム中の標的遺伝子を欠損させるために、該標的遺伝子又はその一部を挟む２領域の相同配列を、タンデムに連結した配列を含むＤＮＡ断片を調製する工程（ａ）；前記ＤＮＡ断片を、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を有し、且つ酢酸菌の複製起点を有さないベクターに導入し、環状化ＤＮＡを調製する工程（ｂ）；前記環状化ＤＮＡを、前記標的遺伝子を有する酢酸菌に導入する工程（ｃ）；前記環状化ＤＮＡを導入した酢酸菌のうち、相同組換えにより環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌ゲノムに組み込まれた酢酸菌を、前記薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤が含まれる培地で培養することにより選択する工程（ｄ）；工程（ｄ）で選択された薬剤耐性が付与された酢酸菌を、前記薬剤を含まない培地で培養する工程（ｅ）を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法、詳しくは、標的遺伝子を欠損させるために選択された任意の２領域の相同配列をタンデムに連結した配列、薬剤耐性遺伝子、及びマーカー遺伝子を有する環状化ＤＮＡを酢酸菌に導入し、相同組換えを生じさせることにより、外来ＤＮＡを挿入しない酢酸菌の遺伝子欠損株及び多重遺伝子欠損株を、高効率で取得することを目的とした外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は、食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な食酢製造に用いられている。また、グルコノバクター属に属する酢酸菌は、食酢製造だけでなく、ビタミンＣの製造、Ｄ−アラビトールからのＤ−キシルロース及びキシリトールの製造等、食品製造に広く用いられている、産業上有用な微生物である。
【０００３】
酢酸菌からさらに優良な菌株の育種を行うためには、特定の遺伝子を欠損させることが一つの有効な手段である。例えば、特開２００８−２０６４１３号公報には、酢酸菌において、クォーラムセンシンングに関わる遺伝子としてアシルホモセリンラクトン合成酵素遺伝子を見い出し、該遺伝子に薬剤耐性遺伝子を挿入することで遺伝子を欠損或いは機能低下させ、高酢酸濃度の食酢を効率良く製造できる酢酸菌を作製したことが開示されている。
【０００４】
また、酢酸菌の遺伝子欠損法としては、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を保持したベクターを酢酸菌に導入し、相同組換えにより薬剤耐性遺伝子を標的遺伝子中に導入することで標的遺伝子を破壊する手法が広く用いられている。この手法は、前記薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培地で酢酸菌を培養することで、遺伝子欠損株を効率良く取得できる。一方で、この手法では、外来ＤＮＡが酢酸菌のゲノムＤＮＡ中に挿入されるため、得られた遺伝子欠損株は遺伝子組換え体に該当し、食品製造への利用が制限されるという問題点がある。
【０００５】
前記問題点を解決するため、特開２０１０−５７４０６号公報には、外来遺伝子を導入しない遺伝子欠損細菌株の作製方法が開示されている。しかしながら、前記手法は、遺伝子欠損細菌株の選抜方法が、個々のコロニーに対するNested-PCR法のみであり、選抜の効率が非常に悪い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２０６４１３号公報
【特許文献２】特開２０１０−５７４０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
背景技術で述べた通り、従来の酢酸菌遺伝子欠損法には、（ｉ）外来遺伝子が酢酸菌のゲノムＤＮＡ中に挿入されるため、遺伝子組換え体として判断されること；及び、（ii）外来遺伝子を挿入しない遺伝子欠損細菌株の作製方法においては、遺伝子欠損株の簡便な選抜方法が存在しないこと、という問題点が存在する。本発明の課題は、酢酸菌のゲノムＤＮＡに外来ＤＮＡを挿入することなしに作製された遺伝子欠損酢酸菌株を、より高効率で取得できる遺伝子欠損酢酸菌株作製法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、酢酸菌ＤＮＡ中の、標的遺伝子を欠損させるために選択された任意の２点の相同配列をタンデムに連結した配列を有するＤＮＡ断片を、薬剤耐性遺伝子、マーカー遺伝子を含み、酢酸菌の菌体内では複製されないベクターに挿入することにより、環状化ＤＮＡを作製した。前記環状化ＤＮＡを酢酸菌に導入し、前記薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を含む培地で培養することにより、酢酸菌のゲノムＤＮＡと環状化ＤＮＡとの間で相同組換えが起こり、環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌のゲノムＤＮＡに挿入された酢酸菌株が得られる。さらに、前記環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌のゲノムＤＮＡに挿入された酢酸菌株を、前記薬剤を含まない平板培地で培養した。本発明者らは、環状化ＤＮＡに由来する配列を含む酢酸菌ＤＮＡ内で、再度相同組換えが起こった結果、標的遺伝子が環状化ＤＮＡと共に脱落した酢酸菌株を、前記平板培養で生じたコロニーのうち、マーカー遺伝子を欠損した酢酸菌株を選択することで高効率に選抜できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は（１）以下のステップ（ａ）〜（ｆ）を備えたことを特徴とする外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法に関する。
（ａ）酢酸菌ゲノム中の標的遺伝子を欠損させるために、該標的遺伝子又はその一部を挟む２領域の相同配列を、タンデムに連結した配列を含むＤＮＡ断片を調製するステップ；
（ｂ）前記ＤＮＡ断片を、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を有し、且つ酢酸菌の複製起点を有さないベクターに導入し、環状化ＤＮＡを調製するステップ；
（ｃ）前記環状化ＤＮＡを、前記標的遺伝子を有する酢酸菌に導入するステップ；
（ｄ）前記環状化ＤＮＡを導入した酢酸菌のうち、相同組換えにより環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌ゲノムに組み込まれた酢酸菌を、前記薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤が含まれる培地で培養することにより選択するステップ；
（ｅ）工程（ｄ）で選択された薬剤耐性が付与された酢酸菌を、前記薬剤を含まない培地で培養するステップ；
（ｆ）前記薬剤を含まない培地で得られたコロニーのうち、マーカー遺伝子が脱落したものを選択するステップ；
【００１０】
また、本発明は、（２）工程（ｆ）の後に、さらに以下の工程（ｇ）を備えたことを特徴とする上記（１）に記載の作製方法に関する。
（ｇ）ＰＣＲによって標的遺伝子欠損を確認するステップ；
【００１１】
さらに、本発明は、（３）酢酸菌が、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属することを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の作製方法や、（４）マーカー遺伝子が、β−グルクロニダーゼ遺伝子であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の作製方法や、（５）薬剤耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の作製方法や、（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法を、異なる標的遺伝子について複数回繰り返すことにより、２以上の遺伝子を欠損させることを特徴とする酢酸菌多重遺伝子欠損株の作製方法や、（７）上記（６）に記載の方法によって作製されることを特徴とする多重遺伝子欠損酢酸菌株に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の遺伝子欠損酢酸菌株作製法によると、高効率で、外来ＤＮＡを挿入することなしに遺伝子欠損酢酸菌株を取得できる。本発明を用いて作製された遺伝子欠損酢酸菌株は、遺伝子組換え体に該当しないため、前記菌株は非遺伝子組換え体として、高付加価値の食品製造に用いることができる。
【００１３】
また、従来技術に基づく、外来ＤＮＡが挿入されない遺伝子欠損細菌株作製法（特開２０１０−５７４０６号公報）は、遺伝子欠損株の選抜効率が極度に低いため、複数の遺伝子を欠損させるのは困難であるのに対し、本発明は、複数の遺伝子を欠損させる際に優れた手法である。すなわち、従来の外来ＤＮＡを標的遺伝子に挿入する方法では、異なる選択方法を有するマーカー遺伝子を、欠損させたい遺伝子数と同数必要としたのに対し、本発明では外来ＤＮＡは酢酸菌のゲノムＤＮＡ中には残らないため、単一のマーカー遺伝子により複数の遺伝子を欠損させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ、ｐＪ２００、及びｐΔｍｏｔＢ１の作製手順を示した図である。
【図１Ｂ】ｐΔｍｏｔＢ１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に供した図である。２．１ｋｂのバンドが生じたプラスミドをｐΔｍｏｔＢ１とした。
【図２】酢酸菌の一次組換えの様子を示した図である。
【図３】酢酸菌の二次組換えの様子を示した図である。
【図４】ＰＣＲによる酢酸菌の二次組換え体の確認方法を示した図である。
【図５Ａ】ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐ、ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ、及びｐΔｍｏｔＢ２の作製手順を示した図である。
【図５Ｂ】ｐΔｍｏｔＢ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に供した図である。２．３ｋｂのバンドが生じたプラスミドをｐΔｍｏｔＢ２とした。
【図６】ＰＣＲによる酢酸菌の二次組換え体の確認方法を示した図である。
【図７Ａ】ｐＴＫ１、ｐＴＫ２、及びｐＴＫ８の作製手順を示した図である。
【図７Ｂ】ｐＴＫ８を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ、又は、ＥｃｏＲＩ単独で消化し、アガロースゲル電気泳動に供した図である。ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化したときに２．２ｋｂ、ＥｃｏＲＩで消化したときに１．１ｋｂのバンドが生じたプラスミドをｐＴＫ８とした。
【図８】ＰＣＲによる酢酸菌の二次組換え体の確認方法を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法としては、酢酸菌ゲノム中の標的遺伝子を欠損させるために、該標的遺伝子又はその一部を挟む２領域の相同配列を、タンデムに連結した配列を含むＤＮＡ断片を調製する工程（ａ）；前記ＤＮＡ断片を、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を有し、且つ酢酸菌の複製起点を有さないベクターに導入し、環状化ＤＮＡを調製する工程（ｂ）；前記環状化ＤＮＡを、前記標的遺伝子を有する酢酸菌に導入する工程（ｃ）；前記環状化ＤＮＡを導入した酢酸菌のうち、相同組換えにより環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌ゲノムに組み込まれた酢酸菌を、前記薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤が含まれる培地で培養することにより選択する工程（ｄ）；工程（ｄ）で選択された薬剤耐性が付与された酢酸菌を、前記薬剤を含まない培地で培養する工程（ｅ）；前記薬剤を含まない培地で得られたコロニーのうち、マーカー遺伝子が脱落したものを選択する工程（ｆ）；を備えていれば特に制限されない。また、工程（ｆ）の後に、さらにＰＣＲによって標的遺伝子欠損を確認する工程（ｇ）を含んでいても良い。
【００１６】
本発明で用いられる酢酸菌としては、エタノールを酸化して酢酸を生産する細菌であれば特に制限されないが、具体的にはアセトバクター属、アシディフィリウム属、アシディスフェラ属、アシドセラ属、アシドモナス属、アサイア属、クラウロコッカス属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、コザキア属、ムリコッカス属、パラクラウロコッカス属、ロドピラ属、ロゼオコッカス属、ルブリテピダ属、ステラ属、テイココッカス属、ザヴァルジニア属等に属する酢酸菌を挙げることができ、好ましくはアセトバクター属及びグルコノバクター属に属する酢酸菌、さらに好ましくはアセトバクター・パスチュリアヌスＳＫＵ１１０８株及びグルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ株を例示することができる。
【００１７】
本発明において外来ＤＮＡとは、ある生物には本来含まれないＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片をいい、外部から導入されるＤＮＡであっても、前記生物に含まれる配列を有するＤＮＡであれば、外来ＤＮＡとはしない。したがって、本発明によって作製された外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株は、遺伝子組換え体には該当しない。
【００１８】
上記工程（ａ）において、酢酸菌ゲノム中の標的遺伝子は、単一の遺伝子であっても隣接する２以上の遺伝子であってもよく、該標的遺伝子を欠損させるために選択される「該標的遺伝子又はその一部」は、該標的遺伝子を欠損させるために十分な長さを有していれば特に制限されず、また、前記標的遺伝子を欠損させるために選択される「該標的遺伝子又はその一部を挟む２領域の相同配列」は、それぞれ酢酸菌において効率良く相同組換えが起こりうる長さであればよく、例えば長さ１００ｂｐ〜１００００ｂｐ、好ましくは長さ５００ｂｐ〜１５００ｂｐ、より好ましくは１０００〜１３００ｂｐである。また、前記２領域の相同配列（ＤＮＡ断片）を調製する方法としては、染色体ＤＮＡからのショットガンクローニング、化学合成法や、酢酸菌ゲノム中の相同配列を鋳型としたＰＣＲ法等を例示することができる。前記２領域の相同配列（ＤＮＡ断片）は、ＰＣＲ等により合成後それぞれを任意のクローニング用ベクターに挿入してクローニング用大腸菌等により増幅させ、配列シークエンシングにより塩基配列を確認した後に制限酵素で切り出すことにより調製してもよい。また、前記２領域の相同配列を、タンデムに連結した配列を含むＤＮＡ断片を調製する方法は、公知の方法を用いて行うことができるが、具体的には前記２領域の相同配列の連結部位が、前記２領域のいずれかに含まれる制限酵素認識配列になるように設計し、制限酵素処理とＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションを行うことで、効率よく前記ＤＮＡ断片を調製することができる。
【００１９】
上記工程（ｂ）において、環状化ＤＮＡを調製する方法は、公知のどのような調製方法を用いてもよく、具体的には前記ベクターの５’末端及び前記ＤＮＡ断片３’末端、並びに、前記ベクターの３’末端及び前記ＤＮＡ断片５’末端を、それぞれ相補的な粘着末端が生じるように選択された制限酵素により切断して混合し、ＤＮＡリガーゼによりライゲーション反応を行った後に任意のクローニング用大腸菌により増幅させる方法を用いることができる。なお、前記２領域の相同配列の連結及び環状化は、順次行っても同時に行ってもよい。
【００２０】
上記工程（ｂ）において、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を有し、且つ酢酸菌の複製起点を有さないベクターは、さらに大腸菌の複製起点を含んでいてもよく、ＰＣＲ法又は任意のクローニング用大腸菌等を用いて増幅させることができる。前記ベクターは酢酸菌の複製起点を有さないため、酢酸菌に導入しても増幅されることはないが、相同組換えによって酢酸菌ゲノムに組み込まれた場合には、酢酸菌ゲノムとともに複製することができる。また、前記薬剤耐性遺伝子としては、酢酸菌が耐性を有さない薬剤に対する耐性遺伝子であれば特に制限されず、カナマイシン耐性遺伝子を好適に例示することができる。また、マーカー遺伝子としては、酢酸菌に該遺伝子を導入しても該酢酸菌の増殖を妨げず、且つマーカー遺伝子の導入の有無が容易に検出できるものであればよく、具体的にはβ−グルクロニダーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等を挙げることができ、特にβ−グルクロニダーゼ遺伝子を好適に例示することができる。
【００２１】
上記工程（ｃ）において、前記環状化ＤＮＡを、前記標的遺伝子を有する酢酸菌に導入する方法としては、公知の酢酸菌形質転換方法であれば特に制限されず、具体的には供与菌（大腸菌）から受容菌（酢酸菌）へのプラスミドの移行を補助する役割を有するｔｒａ遺伝子の発現プラスミドｐＲＫ２０１３を保持する大腸菌と、工程（ｂ）で作製した環状化ＤＮＡを保持した大腸菌、及び、前記標的遺伝子を有する酢酸菌とを混合する方法を好適に例示することができる（Inoue, T. et al. Efficient introduction of vector plasmids into acetic acid bacteria. J. Ferment. Technol. 63, 1-4（1985）参考）。さらに、上記工程（ｄ）において、前記環状化ＤＮＡを導入した酢酸菌を、前記ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む公知の酢酸菌用平板培地で２５〜３５℃で１〜５日間、好ましくは３０℃で２日間培養することで、一部の酢酸菌において前記環状化ＤＮＡに含まれる２ヶ所の相同配列のうち一方で相同組換えが生じ、その結果前記環状化ＤＮＡが染色体ＤＮＡに挿入された酢酸菌株（一次組換え体）のみが選択される（図２参照）。
【００２２】
上記工程（ｄ）で選択された薬剤耐性が付与された酢酸菌には、酢酸菌ゲノム中に２対の相同配列が含まれている。したがって、上記工程（ｅ）において、上記工程（ｄ）で選択された酢酸菌を、前記薬剤を含まない公知の酢酸菌用液体培地で２５〜３５℃で１２〜７２時間、好ましくは３０℃で２４時間振盪培養することにより、酢酸菌ゲノム中に前記環状化ＤＮＡを含む酢酸菌だけでなく、酢酸菌ゲノム中の２対の相同配列のうち１対で相同組換えが生じ、上記薬剤耐性遺伝子及び上記マーカー遺伝子が環状化ＤＮＡの形で酢酸菌ゲノムから脱落した酢酸菌（二次組換え体）も増殖することができる（図３参照）。なお、前記２対の相同配列のうち、上記工程（ｃ）において環状化ＤＮＡが酢酸菌ゲノムに導入される際に相同組換えを起こした相同配列と同一の対で相同組換えが生じた場合は、酢酸菌ゲノムは環状化ＤＮＡ導入前と同一の配列を有するが、他方の対で相同組換えが起こる場合、上記標的遺伝子とそれを挟む相同配列は、上記工程（ａ）で調製したＤＮＡ断片と置換され、該標的遺伝子が欠損した酢酸菌が得られる。その後、前記マーカー遺伝子による選択に供するために、前記薬剤を含まない公知の酢酸菌用平板培地に播種し、シングルコロニーを形成させてもよい。
【００２３】
上記工程（ｆ）において、前記薬剤を含まない培地で得られたコロニーのうち、マーカー遺伝子が脱落したものを選択する方法は、上記環状ＤＮＡに含まれるマーカー遺伝子によって決定される。具体的には、マーカー遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ遺伝子を選択した場合、工程（ｅ）においてＸ−グルクロニドを含む酢酸菌用平板培地を用いることにより、β−グルクロニダーゼ遺伝子がゲノム中に含まれる酢酸菌は青色、β−グルクロニダーゼ遺伝子がゲノムから脱落した酢酸菌は白色のコロニーを形成するために、目視により選別することができる。また、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子を用いた場合には、工程（ｅ）で形成したコロニーに、該蛍光タンパク質の励起波長の光を照射した場合に、蛍光を発しないコロニーを選別することにより、マーカー遺伝子が脱落したものを選択することができる。さらに、選別されたコロニーが前記薬剤を含む培地では生育しないことを確認することにより、二次組換え体の二次選抜を行うこともできる。
【００２４】
上記工程（ｆ）により選択されたコロニーは、前記環状化ＤＮＡの酢酸菌ゲノムへの挿入と脱落が同一の相同配列で行われたことにより、酢酸菌ゲノムに変化を生じなかった酢酸菌、及び、前記環状化ＤＮＡの酢酸菌ゲノムへの挿入と脱落がそれぞれ異なる相同配列で行われたことにより、上記標的遺伝子が欠損した酢酸菌が、ほぼ同数ずつであると期待される。
【００２５】
上記工程（ｆ）で得られたコロニーのうち、目的の遺伝子欠損酢酸菌株を選別する方法は、公知の方法であれば特に制限されず、具体的には目的の表現型を有しているか否か、標的遺伝子産物を発現しているか否か、等により選別することができる。また、上記工程（ｇ）により、公知のＰＣＲ法を用いて前記２領域を含む配列を増幅させ、増幅核酸断片の長さを比較することにより、目的の遺伝子欠損を判定しても良い。
【００２６】
本発明の遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法においては、欠損させるＤＮＡ配列は欠損させたい遺伝子の全長であっても一部であってもよい。欠損させたい遺伝子の一部を欠損させる場合には、翻訳の読み枠が合うようにＤＮＡ配列を欠損させても、翻訳の読み枠が合わなくなるようにＤＮＡ配列を欠損させてもよい。例えば、遺伝子の特定の部位以降のアミノ酸配列を破壊する場合は「翻訳の読み枠が合わなくなるように」ＤＮＡ配列を欠損させても「翻訳の読み枠が合うように」ＤＮＡ配列を欠損させてもよいが、遺伝子内の一部のアミノ酸配列を欠損させる場合は「翻訳の読み枠が合うように」ＤＮＡ配列を欠損させる必要がある。
【００２７】
本発明に特徴的な点は、従来の手法では酢酸菌ゲノム中に挿入されてしまうマーカー遺伝子を挿入せずに、遺伝子欠損株を作製できる点である。
【００２８】
従来の手法では、遺伝子欠損株の選抜に用いられたマーカー遺伝子がそのまま酢酸菌ゲノム中に残存するため、二遺伝子以上の欠損株作製のためには欠損させたい遺伝子数と同数のマーカー遺伝子が必要であった。しかしながら、本発明においてマーカー遺伝子は遺伝子欠損株作製後に該遺伝子欠損株から脱落するため、複数遺伝子の欠損株を単一のマーカー遺伝子で行うことができる。したがって、本発明は多重遺伝子欠損株の作製に特に適している。
【００２９】
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により制限されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ株のｍｏｔＢ１遺伝子欠損株の作製
【００３１】
１．ＰＣＲクローニング（ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐとｐＪ２００ の構築）
酢酸菌グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ由来のＤＮＡを鋳型として、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を用いたＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーの配列を以下に示す。
Ａ．ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ＿Ｅｃｏ（＋）（5'-cggaattcaaaccgcgcgccgctcttc-3'；配列番号１）
Ｂ．ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ＿Ｍｒｏ（−）（5'-tttccggagcttctttgccgttctgg-3'；配列番号２）
Ｃ．Ｇｏ＿ｍｏｔＡＢ１＿１（＋）（5'-ggaattcccaagcgttcttaaacc-3'；配列番号３）
Ｄ．Ｇｏ＿ｍｏｔＡＢ１＿２（−）（5'-gctctagagagacaggcacagtgctc-3'；配列番号４）
ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ構築用としてはフォワードプライマーとしてＡ、リバースプライマーとしてＢを、ｐＪ２００構築用としてはフォワードプライマーとしてＣ、リバースプライマーとしてＤをそれぞれ用いた。ＰＣＲ反応に先立って、全てのプライマーは、ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡社製）を用いて５’−リン酸化した。方法は同社の推奨プロトコールに従った。
【００３２】
ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長反応を１５サイクル行った。その後、さらに６８℃で５分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Herculase 用反応液（Stratagene社製）、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００３３】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的のＰＣＲ産物を精製した。
【００３４】
次いで、ｐＳＵ１８（Bartolome, B., Y. Jubete, E. Martinez, and F. de la Cruz. 1991. Construction and properties of a family of pACYC184-derived cloning vectors compatible with pBR322 and its derivatives. Gene. 102:75-78）を制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡社製）で消化後、Antarctic Phosphatase（ＮＥＢ社製）で脱リン酸化した。脱リン酸化の方法は同社の推奨プロトコールに従った。その後、ＳｍａＩで消化したｐＳＵ１８と前記精製したｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ作製用ＰＣＲ産物、及び、ＳｍａＩで消化したｐＳＵ１８と前記精製したｐＪ２００作製用ＰＣＲ産物とを、それぞれモル比で１：５となるように混合し、Ligation Highキット（東洋紡社製）を用いて同社の推奨プロトコールに従って連結した（図１Ａ）。
【００３５】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法（Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96:23-28）に従って形質転換し、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地（０．５％酵母エキス、１％ポリペプトン、０．５％ＮａＣｌ、１．２％寒天）に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００３６】
生育したコロニーをＬＢ液体培地（０．５％酵母エキス、１％ポリペプトン、０．５％ＮａＣｌ）で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）とＭｒｏＩ（東洋紡社製）で消化して２．０ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐとし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。ｐＪ２００作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＭｒｏＩとＸｂａＩ（東洋紡社製）で消化して１．１ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＪ２００とし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。
【００３７】
２．ｐΔｍｏｔＢ１の構築
ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ（Katzen, F., A. Becker, M.V. Ielmini, C.G. Oddo, and L. Ielpi. 1999. New mobilizable vectors suitable for gene replacement in gram-negative bacteria and their use in mapping of the 3' end of the Xanthomonas campestris pv. campestris gum operon. Appl Environ Microbiol. 65:278-282）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、５．９ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐを制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｒｏＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＪ２００を制限酵素ＭｒｏＩとＸｂａＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。得られた５．９ｋｂ、１．０ｋｂ、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を、モル比が１：５：５になるように混合し、Ligation Highキットを用いて上記と同様に連結した（図１Ａ）。
【００３８】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００３９】
生育したコロニーをＬＢ液体培地で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化して２．１ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐΔｍｏｔＢ１とし、該ｐΔｍｏｔＢ１を保持した大腸菌ＤＨ５α株を酢酸菌の一次組換え体の作製に用いた（図１Ｂ）。
【００４０】
３．酢酸菌の一次組換え体の作製
上記ｐΔｍｏｔＢ１を保持した大腸菌ＤＨ５α株、及び、プラスミドｐＲＫ２０１３を保持した大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるように５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。一方、酢酸菌グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ株を、ＹＰＧＤ液体培地（０．５％酵母エキス、０．５％ポリペプトン、０．５％グリセロール、０．５％グルコース）で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるようにＹＰＧＤ液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。３つの培養液それぞれから１ｍｌ分取し、室温で８０００ｒｐｍ、２分間遠心分離して沈殿させた菌体を、１００μｌの培地で再懸濁した。
【００４１】
この３つの細胞懸濁液を１０μｌずつ混合した。０．３％ＣａＣＯ３を含むＹＰＧＤ寒天培地（０．５％酵母エキス、０．５％ポリペプトン、０．５％グリセロール、０．５％グルコース、１．２％寒天）に、マイクロピペッターを用いて菌混合液を５μlずつ乗せ、３０℃で一晩培養した。培養した菌体を０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＹＰＧＤ寒天培地に広げ、３０℃で二晩培養した。生じたコロニーをもう一度，０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＹＰＧＤ寒天培地に広げ、３０℃でさらに二晩培養することで二次選抜とし、ここで生じたコロニーを一次組み換え体とした（図２）。
【００４２】
４．酢酸菌の二次組換え体の作製
上記酢酸菌の一次組み換え体を、２ｍｌＹＰＧＤ液体培地に植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した後に、生育を確認して新たな２ｍｌＹＰＧＤ液体培地に終濃度０．１％となるように植菌した。３０℃、２４時間振盪培養後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で１０−５希釈し、０．３％ＣａＣＯ３及び２０μｇ／ｍｌ Ｘ−グルクロニドを含むＹＰＧＤ寒天培地に１００μｌずつスプレッドした。２日間３０℃で培養し、コロニーがある程度大きくなったら４℃に移し、青白の色の区別が付くまで約１週間保存した。その後、β−グルクロニダーゼ活性がないと期待できる白色コロニーを爪楊枝で拾い、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＹＰＧＤ寒天培地に植菌し、さらに同じ爪楊枝で０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＹＰＧＤ寒天培地に植菌した。その結果、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＹＰＧＤ寒天培地では生育せず、０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＹＰＧＤ寒天培地では生育する株、すなわちβ−グルクロニダーゼ陰性かつカナマイシン感受性を示す株を二次組み換え体とした（図３）。
【００４３】
５．酢酸菌の二次組換え体のＰＣＲによる確認
酢酸菌の二次組換え体をＹＰＧＤ液体培地で３０℃、一晩振盪培養し、染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型、フォワードプライマーとして上記Ｃ、リバースプライマーとして上記Ｄをそれぞれ用い、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ反応を、同社の推奨プロトコールに従って行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応を２５サイクル行った。その後、さらに７２℃で１０分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Ｔａｑ用反応液（東洋紡社製）、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００４４】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、２．０ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株を野生型、１．２ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株を酢酸菌ΔｍｏｔＢ１株とした（図４）。
【実施例２】
【００４５】
グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ株のｍｏｔＢ２遺伝子欠損株の作製
【００４６】
１．ＰＣＲクローニング（ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐとｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎの構築）
酢酸菌グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ由来のＤＮＡを鋳型として、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を用いたＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーの配列を以下に示す。
Ｅ．Ｇｏ＿ｍｏｔＡＢ１＿２（＋）（5'-cccaagcttgtcatcgagagacaaatcccac-3'；配列番号５）
Ｆ．ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐ＿Ｍｒｏ（−）（5'-tttccggacagggcgtccacatagcc-3'；配列番号６）
Ｇ．ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ＿Ｍｒｏ（＋）（5'-tttccggatttgccgactaccagcctc-3'；配列番号７）
Ｈ．ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ＿Ｘｂａ（−）（5'-gctctagatggcggcgttgatatagc-3'；配列番号８）
ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐ構築用としてはフォワードプライマーとしてＥ、リバースプライマーとしてＦを、ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ構築用としてはフォワードプライマーとしてＧ、リバースプライマーとしてＨをそれぞれ用いた。ＰＣＲ反応に先立って、全てのプライマーは、ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡社製）を用いて５’−リン酸化した。方法は同社の推奨プロトコールに従った。
【００４７】
ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で１分間の伸長反応を１５サイクル行った。その後、さらに６８℃で５分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Herculase 用反応液（Stratagene社製）、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００４８】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的のＰＣＲ産物を精製した。
【００４９】
次いで、ｐＳＵ１８を制限酵素ＳｍａＩで消化後、Antarctic Phosphatase（ＮＥＢ社製）で脱リン酸化した。脱リン酸化の方法は同社の推奨プロトコールに従った。その後、ＳｍａＩで消化したｐＳＵ１８と前記精製したｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐ作製用ＰＣＲ産物、及び、ＳｍａＩで消化したｐＳＵ１８と前記精製したｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ作製用ＰＣＲ産物とを、それぞれモル比で１：５となるように混合し、LigationHighキット（東洋紡社製）を用いて同社の推奨プロトコールに従って連結した（図５Ａ）。
【００５０】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法に従って形質転換し、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００５１】
生育したコロニーをＬＢ液体培地で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐ作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡社製）とＭｒｏＩで消化して１．３ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐとし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＭｒｏＩとＸｂａＩで消化して１．０ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎとし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。
【００５２】
２．ｐΔｍｏｔＢ２の構築
ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、５．９ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｒｏＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎを制限酵素ＭｒｏＩとＸｂａＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。得られた５．９ｋｂ、１．３ｋｂ、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を、モル比が１：５：５になるように混合し、Ligation Highキットを用いて上記と同様に連結した（図５Ａ）。
【００５３】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００５４】
生育したコロニーをＬＢ液体培地で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化して２．３ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐΔｍｏｔＢ２とし、該ｐΔｍｏｔＢ２を保持した大腸菌ＤＨ５α株を酢酸菌の一次組換え体の作製に用いた（図５Ｂ）。
【００５５】
３．酢酸菌の一次組換え体の作製
上記ｐΔｍｏｔＢ２を保持した大腸菌ＤＨ５α株、及び、プラスミドｐＲＫ２０１３を保持した大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるように５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。一方、酢酸菌グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ株を、ＹＰＧＤ液体培地で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるようにＹＰＧＤ液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。３つの培養液それぞれから１ｍｌ分取し、室温で８０００ｒｐｍ、２分間遠心分離して沈殿させた菌体を、１００μｌの培地で再懸濁した。
【００５６】
この３つの細胞懸濁液を１０μｌずつ混合した。０．３％ＣａＣＯ３を含むＹＰＧＤ寒天培地に、マイクロピペッターを用いて菌混合液を５μlずつ乗せ、３０℃で一晩培養した。培養した菌体を０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＹＰＧＤ寒天培地に広げ、３０℃で二晩培養した。生じたコロニーをもう一度，０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＹＰＧＤ寒天培地に広げ、３０℃でさらに二晩培養することで二次選抜とし、ここで生じたコロニーを一次組み換え体とした。
【００５７】
４．酢酸菌の二次組換え体の作製
上記酢酸菌の一次組み換え体を、２ｍｌＹＰＧＤ液体培地に植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した後に、生育を確認して新たな２ｍｌＹＰＧＤ液体培地に終濃度０．１％となるように植菌した。３０℃、２４時間振盪培養後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で１０−５希釈し、０．３％ＣａＣＯ３及び２０μｇ／ｍｌ Ｘ−グルクロニドを含むＹＰＧＤ寒天培地に１００μｌずつスプレッドした。２日間３０℃で培養し、コロニーがある程度大きくなったら４℃に移し、青白の色の区別が付くまで約１週間保存した。その後、β−グルクロニダーゼ活性がないと期待できる白色コロニーを爪楊枝で拾い、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＹＰＧＤ寒天培地に植菌し、さらに同じ爪楊枝で０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＹＰＧＤ寒天培地に植菌した。その結果、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＹＰＧＤ寒天培地では生育せず、０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＹＰＧＤ寒天培地では生育する株、すなわちβ−グルクロニダーゼ陰性かつカナマイシン感受性を示す株を二次組み換え体とした。
【００５８】
５．酢酸菌の二次組換え体のＰＣＲによる確認
酢酸菌の二次組換え体をＹＰＧＤ液体培地で３０℃、一晩振盪培養し、染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型、フォワードプライマーとして上記Ｅ、リバースプライマーとしてＩ．Ｇｏ＿ｍｏｔＡＢ２−４（−）（5'-gctctagattatcgcagaaatgtcagtag-3'；配列番号９）をそれぞれ用い、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ反応を、同社の推奨プロトコールに従って行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応を２５サイクル行った。その後、さらに７２℃で１０分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Ｔａｑ用反応液（東洋紡社製）、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００５９】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、２．３ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株を野生型、１．５ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株を酢酸菌ΔｍｏｔＢ２株とした（図６）。
【実施例３】
【００６０】
アセトバクター・パスチュリアヌスＳＫＵ１１０８株のａｌｄＨ遺伝子欠損株の作製
【００６１】
１．ＰＣＲクローニング（ｐＴＫ１とｐＴＫ２の構築）
酢酸菌アセトバクター・パスチュリアヌスＳＫＵ１１０８由来のＤＮＡを鋳型として、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を用いたＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーの配列を以下に示す。
Ａ．１１０８−Ｈｉｎ−ａｌｄＦ（＋）（5'-aagcttgtgcacgccattgcgcattac-3'；配列番号１０）
Ｂ．１１０８−ａｌｄＨ−Ｅｃｏ（−）（5'-gaattccatggccgtaagcagaaaac-3'；配列番号１１）
Ｃ．１１０８−ａｌｄＧ−２９２３（＋）（5'-tgcgtgatgatctggaccag-3'；配列番号１２）
Ｄ．１１０８−ａｌｄＨ−３−Ｂａｍ（−）（5'-ggatccagagcattctttgctc-3'；配列番号１３）
ｐＴＫ１構築用としてはフォワードプライマーとしてＡ、リバースプライマーとしてＢを、ｐＴＫ２構築用としてはフォワードプライマーとしてＣ、リバースプライマーとしてＤをそれぞれ用いた。ＰＣＲ反応に先立って、全てのプライマーは、ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡）を用いて５’−リン酸化した。方法は同社の推奨プロトコールに従った。
【００６２】
ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長反応を１５サイクル行った。その後、さらに６８℃で５分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Herculase 用反応液（Stratagene社製）、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００６３】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的のＰＣＲ産物を精製した。
【００６４】
次いで、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Novagen社製）を制限酵素ＥｃｏＲＶＩ（東洋紡社製）で消化後、Antarctic Phosphatase（ＮＥＢ社製）で脱リン酸化した。脱リン酸化の方法は同社の推奨プロトコールに従った。その後、ＥｃｏＲＶＩで消化したｐＴ７Ｂｌｕｅと前記精製したｐＴＫ１作製用ＰＣＲ産物、及び、ＥｃｏＲＶＩで消化したｐＴ７Ｂｌｕｅと前記精製したｐＴＫ２作製用ＰＣＲ産物とを、それぞれモル比で１：５となるように混合し、Ligation Highキット（東洋紡社製）を用いて同社の推奨プロトコールに従って連結した（図７Ａ）。
【００６５】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００６６】
生育したコロニーをＬＢ液体培地で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。ｐＴＫ１作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して１．１ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＴＫ１とし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。ｐＴＫ２作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（東洋紡）で消化して１．１ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＴＫ２とし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。
【００６７】
２．ｐＴＫ８の構築
ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、５．９ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＴＫ１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＴＫ２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。得られた５．９ｋｂ、１．１ｋｂ、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を、モル比が１：５：５になるように混合し、Ligation Highキットを用いて上記と同様に連結した（図７Ａ）。
【００６８】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００６９】
生育したコロニーをＬＢ液体培地で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化したときに２．２ｋｂのＤＮＡ断片を生じ、ＥｃｏＲＩで消化したときに１．１ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＴＫ８とし、該ｐＴＫ８を保持した大腸菌ＤＨ５α株を酢酸菌の一次組換え体の作製に用いた（図７Ｂ）。
【００７０】
３．酢酸菌の一次組換え体の作製
上記ｐＴＫ８を保持した大腸菌ＤＨ５α株、及び、プラスミドｐＲＫ２０１３を保持した大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるように５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。一方、酢酸菌アセトバクター・パスチュリアヌスＳＫＵ１１０８株を、Ｐ’液体培地（１．０％酵母エキス、１．０％ポリペプトン、２．０％グリセロール、０．５％グルコース）で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるようにＰ’液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。３つの培養液それぞれから１ｍｌ分取し、室温で８０００ｒｐｍ、２分間遠心分離して沈殿させた菌体を、１００μｌの培地で再懸濁した。
【００７１】
この３つの細胞懸濁液を１０μｌずつ混合した。０．３％ＣａＣＯ３を含むＰ’寒天培地（１．０％酵母エキス、１．０％ポリペプトン、２．０％グリセロール、０．５％グルコース、１．２％寒天）に、マイクロピペッターを用いて菌混合液を５μlずつ乗せ、３０℃で一晩培養した。培養した菌体を０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＰ’寒天培地に広げ、３０℃で二晩培養した。生じたコロニーをもう一度，０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＰ’寒天培地に広げ、３０℃でさらに二晩培養することで二次選抜とし、ここで生じたコロニーを一次組み換え体とした。
【００７２】
４．酢酸菌の二次組換え体の作製
上記酢酸菌の一次組み換え体を、２ｍｌＰ’液体培地に植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した後に、生育を確認して新たな２ｍｌＰ’液体培地に終濃度０．１％となるように植菌した。３０℃、２４時間振盪培養後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で１０−５希釈し、０．３％ＣａＣＯ３及び４０μｇ／ｍｌ Ｘ−グルクロニドを含むＰ’寒天培地に１００μｌずつスプレッドし、青白の色の区別が付くまで３０℃で５日間培養した。その後、β−グルクロニダーゼ活性がないと期待できる白色コロニーを爪楊枝で拾い、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＰ’寒天培地に植菌し、さらに同じ爪楊枝で０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＰ’寒天培地に植菌した。その結果、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＰ’寒天培地では生育せず、０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＰ’寒天培地では生育する株、すなわちβ−グルクロニダーゼ陰性かつカナマイシン感受性を示す株を二次組み換え体とした。
【００７３】
５．酢酸菌の二次組換え体のＰＣＲによる確認
酢酸菌の二次組換え体をＰ’液体培地で３０℃、一晩振盪培養し、染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型、フォワードプライマーとして上記Ｋ、リバースプライマーとしてＥ．１１０８−ａｌｄＨ−３−Ｘｂａ（−）（5'-tctagatcccaagttcctgcgtg-3' ；配列番号１４）をそれぞれ用い、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ反応を、同社の推奨プロトコールに従って行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応を２５サイクル行った。その後、さらに７２℃で１０分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Ｔａｑ用反応液（東洋紡社製）、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００７４】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、３．０ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株を野生型、０．９ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株をアセトバクター・パスチュリアヌスＳＫＵ１１０８ΔａｌｄＨ株とした（図８）。
【００７５】
以上の結果から、本発明を用いることで外来ＤＮＡを挿入しない酢酸菌の遺伝子欠損株を高効率で取得できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、従来は外来ＤＮＡを残すことでしかなされていなかった酢酸菌の遺伝子破壊が、外来ＤＮＡを残さずにできるようになった。本手法を用いて作製した酢酸菌は遺伝子組換え体ではないために、消費者イメージを損なうことなしに食品や食品添加物の作製に用いることができる。また、従来は多重遺伝子変異体作製のためには欠損させたい遺伝子数と同数のマーカー遺伝子が必要だったが、本手法を用いることで単一のマーカー遺伝子のみで多重遺伝子変異体を作製できるようになるため、任意の数の遺伝子を欠損させることが可能になる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法、詳しくは、標的遺伝子を欠損させるために選択された任意の２領域の相同配列をタンデムに連結した配列、薬剤耐性遺伝子、及びマーカー遺伝子を有する環状化ＤＮＡを酢酸菌に導入し、相同組換えを生じさせることにより、外来ＤＮＡを挿入しない酢酸菌の遺伝子欠損株及び多重遺伝子欠損株を、高効率で取得することを目的とした外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酢酸菌は、食酢製造に広く利用されている微生物であり、特にアセトバクター属及びグルコンアセトバクター属に属する酢酸菌が工業的な食酢製造に用いられている。また、グルコノバクター属に属する酢酸菌は、食酢製造だけでなく、ビタミンＣの製造、Ｄ−アラビトールからのＤ−キシルロース及びキシリトールの製造等、食品製造に広く用いられている、産業上有用な微生物である。
【０００３】
酢酸菌からさらに優良な菌株の育種を行うためには、特定の遺伝子を欠損させることが一つの有効な手段である。例えば、特開２００８−２０６４１３号公報には、酢酸菌において、クォーラムセンシンングに関わる遺伝子としてアシルホモセリンラクトン合成酵素遺伝子を見い出し、該遺伝子に薬剤耐性遺伝子を挿入することで遺伝子を欠損或いは機能低下させ、高酢酸濃度の食酢を効率良く製造できる酢酸菌を作製したことが開示されている。
【０００４】
また、酢酸菌の遺伝子欠損法としては、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を保持したベクターを酢酸菌に導入し、相同組換えにより薬剤耐性遺伝子を標的遺伝子中に導入することで標的遺伝子を破壊する手法が広く用いられている。この手法は、前記薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培地で酢酸菌を培養することで、遺伝子欠損株を効率良く取得できる。一方で、この手法では、外来ＤＮＡが酢酸菌のゲノムＤＮＡ中に挿入されるため、得られた遺伝子欠損株は遺伝子組換え体に該当し、食品製造への利用が制限されるという問題点がある。
【０００５】
前記問題点を解決するため、特開２０１０−５７４０６号公報には、外来遺伝子を導入しない遺伝子欠損細菌株の作製方法が開示されている。しかしながら、前記手法は、遺伝子欠損細菌株の選抜方法が、個々のコロニーに対するNested-PCR法のみであり、選抜の効率が非常に悪い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００８−２０６４１３号公報
【特許文献２】特開２０１０−５７４０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
背景技術で述べた通り、従来の酢酸菌遺伝子欠損法には、（ｉ）外来遺伝子が酢酸菌のゲノムＤＮＡ中に挿入されるため、遺伝子組換え体として判断されること；及び、（ii）外来遺伝子を挿入しない遺伝子欠損細菌株の作製方法においては、遺伝子欠損株の簡便な選抜方法が存在しないこと、という問題点が存在する。本発明の課題は、酢酸菌のゲノムＤＮＡに外来ＤＮＡを挿入することなしに作製された遺伝子欠損酢酸菌株を、より高効率で取得できる遺伝子欠損酢酸菌株作製法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、酢酸菌ＤＮＡ中の、標的遺伝子を欠損させるために選択された任意の２点の相同配列をタンデムに連結した配列を有するＤＮＡ断片を、薬剤耐性遺伝子、マーカー遺伝子を含み、酢酸菌の菌体内では複製されないベクターに挿入することにより、環状化ＤＮＡを作製した。前記環状化ＤＮＡを酢酸菌に導入し、前記薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を含む培地で培養することにより、酢酸菌のゲノムＤＮＡと環状化ＤＮＡとの間で相同組換えが起こり、環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌のゲノムＤＮＡに挿入された酢酸菌株が得られる。さらに、前記環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌のゲノムＤＮＡに挿入された酢酸菌株を、前記薬剤を含まない平板培地で培養した。本発明者らは、環状化ＤＮＡに由来する配列を含む酢酸菌ＤＮＡ内で、再度相同組換えが起こった結果、標的遺伝子が環状化ＤＮＡと共に脱落した酢酸菌株を、前記平板培養で生じたコロニーのうち、マーカー遺伝子を欠損した酢酸菌株を選択することで高効率に選抜できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は（１）以下のステップ（ａ）〜（ｆ）を備えたことを特徴とする外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法に関する。
（ａ）酢酸菌ゲノム中の標的遺伝子を欠損させるために、該標的遺伝子又はその一部を挟む２領域の相同配列を、タンデムに連結した配列を含むＤＮＡ断片を調製するステップ；
（ｂ）前記ＤＮＡ断片を、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を有し、且つ酢酸菌の複製起点を有さないベクターに導入し、環状化ＤＮＡを調製するステップ；
（ｃ）前記環状化ＤＮＡを、前記標的遺伝子を有する酢酸菌に導入するステップ；
（ｄ）前記環状化ＤＮＡを導入した酢酸菌のうち、相同組換えにより環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌ゲノムに組み込まれた酢酸菌を、前記薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤が含まれる培地で培養することにより選択するステップ；
（ｅ）工程（ｄ）で選択された薬剤耐性が付与された酢酸菌を、前記薬剤を含まない培地で培養するステップ；
（ｆ）前記薬剤を含まない培地で得られたコロニーのうち、マーカー遺伝子が脱落したものを選択するステップ；
【００１０】
また、本発明は、（２）工程（ｆ）の後に、さらに以下の工程（ｇ）を備えたことを特徴とする上記（１）に記載の作製方法に関する。
（ｇ）ＰＣＲによって標的遺伝子欠損を確認するステップ；
【００１１】
さらに、本発明は、（３）酢酸菌が、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属することを特徴とする上記（１）又は（２）に記載の作製方法や、（４）マーカー遺伝子が、β−グルクロニダーゼ遺伝子であることを特徴とする上記（１）〜（３）のいずれかに記載の作製方法や、（５）薬剤耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の作製方法や、（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法を、異なる標的遺伝子について複数回繰り返すことにより、２以上の遺伝子を欠損させることを特徴とする酢酸菌多重遺伝子欠損株の作製方法や、（７）上記（６）に記載の方法によって作製されることを特徴とする多重遺伝子欠損酢酸菌株に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の遺伝子欠損酢酸菌株作製法によると、高効率で、外来ＤＮＡを挿入することなしに遺伝子欠損酢酸菌株を取得できる。本発明を用いて作製された遺伝子欠損酢酸菌株は、遺伝子組換え体に該当しないため、前記菌株は非遺伝子組換え体として、高付加価値の食品製造に用いることができる。
【００１３】
また、従来技術に基づく、外来ＤＮＡが挿入されない遺伝子欠損細菌株作製法（特開２０１０−５７４０６号公報）は、遺伝子欠損株の選抜効率が極度に低いため、複数の遺伝子を欠損させるのは困難であるのに対し、本発明は、複数の遺伝子を欠損させる際に優れた手法である。すなわち、従来の外来ＤＮＡを標的遺伝子に挿入する方法では、異なる選択方法を有するマーカー遺伝子を、欠損させたい遺伝子数と同数必要としたのに対し、本発明では外来ＤＮＡは酢酸菌のゲノムＤＮＡ中には残らないため、単一のマーカー遺伝子により複数の遺伝子を欠損させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ、ｐＪ２００、及びｐΔｍｏｔＢ１の作製手順を示した図である。
【図１Ｂ】ｐΔｍｏｔＢ１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に供した図である。２．１ｋｂのバンドが生じたプラスミドをｐΔｍｏｔＢ１とした。
【図２】酢酸菌の一次組換えの様子を示した図である。
【図３】酢酸菌の二次組換えの様子を示した図である。
【図４】ＰＣＲによる酢酸菌の二次組換え体の確認方法を示した図である。
【図５Ａ】ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐ、ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ、及びｐΔｍｏｔＢ２の作製手順を示した図である。
【図５Ｂ】ｐΔｍｏｔＢ２を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動に供した図である。２．３ｋｂのバンドが生じたプラスミドをｐΔｍｏｔＢ２とした。
【図６】ＰＣＲによる酢酸菌の二次組換え体の確認方法を示した図である。
【図７Ａ】ｐＴＫ１、ｐＴＫ２、及びｐＴＫ８の作製手順を示した図である。
【図７Ｂ】ｐＴＫ８を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ、又は、ＥｃｏＲＩ単独で消化し、アガロースゲル電気泳動に供した図である。ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化したときに２．２ｋｂ、ＥｃｏＲＩで消化したときに１．１ｋｂのバンドが生じたプラスミドをｐＴＫ８とした。
【図８】ＰＣＲによる酢酸菌の二次組換え体の確認方法を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法としては、酢酸菌ゲノム中の標的遺伝子を欠損させるために、該標的遺伝子又はその一部を挟む２領域の相同配列を、タンデムに連結した配列を含むＤＮＡ断片を調製する工程（ａ）；前記ＤＮＡ断片を、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を有し、且つ酢酸菌の複製起点を有さないベクターに導入し、環状化ＤＮＡを調製する工程（ｂ）；前記環状化ＤＮＡを、前記標的遺伝子を有する酢酸菌に導入する工程（ｃ）；前記環状化ＤＮＡを導入した酢酸菌のうち、相同組換えにより環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌ゲノムに組み込まれた酢酸菌を、前記薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤が含まれる培地で培養することにより選択する工程（ｄ）；工程（ｄ）で選択された薬剤耐性が付与された酢酸菌を、前記薬剤を含まない培地で培養する工程（ｅ）；前記薬剤を含まない培地で得られたコロニーのうち、マーカー遺伝子が脱落したものを選択する工程（ｆ）；を備えていれば特に制限されない。また、工程（ｆ）の後に、さらにＰＣＲによって標的遺伝子欠損を確認する工程（ｇ）を含んでいても良い。
【００１６】
本発明で用いられる酢酸菌としては、エタノールを酸化して酢酸を生産する細菌であれば特に制限されないが、具体的にはアセトバクター属、アシディフィリウム属、アシディスフェラ属、アシドセラ属、アシドモナス属、アサイア属、クラウロコッカス属、グルコンアセトバクター属、グルコノバクター属、コザキア属、ムリコッカス属、パラクラウロコッカス属、ロドピラ属、ロゼオコッカス属、ルブリテピダ属、ステラ属、テイココッカス属、ザヴァルジニア属等に属する酢酸菌を挙げることができ、好ましくはアセトバクター属及びグルコノバクター属に属する酢酸菌、さらに好ましくはアセトバクター・パスチュリアヌスＳＫＵ１１０８株及びグルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ株を例示することができる。
【００１７】
本発明において外来ＤＮＡとは、ある生物には本来含まれないＤＮＡ配列を有するＤＮＡ断片をいい、外部から導入されるＤＮＡであっても、前記生物に含まれる配列を有するＤＮＡであれば、外来ＤＮＡとはしない。したがって、本発明によって作製された外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株は、遺伝子組換え体には該当しない。
【００１８】
上記工程（ａ）において、酢酸菌ゲノム中の標的遺伝子は、単一の遺伝子であっても隣接する２以上の遺伝子であってもよく、該標的遺伝子を欠損させるために選択される「該標的遺伝子又はその一部」は、該標的遺伝子を欠損させるために十分な長さを有していれば特に制限されず、また、前記標的遺伝子を欠損させるために選択される「該標的遺伝子又はその一部を挟む２領域の相同配列」は、それぞれ酢酸菌において効率良く相同組換えが起こりうる長さであればよく、例えば長さ１００ｂｐ〜１００００ｂｐ、好ましくは長さ５００ｂｐ〜１５００ｂｐ、より好ましくは１０００〜１３００ｂｐである。また、前記２領域の相同配列（ＤＮＡ断片）を調製する方法としては、染色体ＤＮＡからのショットガンクローニング、化学合成法や、酢酸菌ゲノム中の相同配列を鋳型としたＰＣＲ法等を例示することができる。前記２領域の相同配列（ＤＮＡ断片）は、ＰＣＲ等により合成後それぞれを任意のクローニング用ベクターに挿入してクローニング用大腸菌等により増幅させ、配列シークエンシングにより塩基配列を確認した後に制限酵素で切り出すことにより調製してもよい。また、前記２領域の相同配列を、タンデムに連結した配列を含むＤＮＡ断片を調製する方法は、公知の方法を用いて行うことができるが、具体的には前記２領域の相同配列の連結部位が、前記２領域のいずれかに含まれる制限酵素認識配列になるように設計し、制限酵素処理とＤＮＡリガーゼを用いたライゲーションを行うことで、効率よく前記ＤＮＡ断片を調製することができる。
【００１９】
上記工程（ｂ）において、環状化ＤＮＡを調製する方法は、公知のどのような調製方法を用いてもよく、具体的には前記ベクターの５’末端及び前記ＤＮＡ断片３’末端、並びに、前記ベクターの３’末端及び前記ＤＮＡ断片５’末端を、それぞれ相補的な粘着末端が生じるように選択された制限酵素により切断して混合し、ＤＮＡリガーゼによりライゲーション反応を行った後に任意のクローニング用大腸菌により増幅させる方法を用いることができる。なお、前記２領域の相同配列の連結及び環状化は、順次行っても同時に行ってもよい。
【００２０】
上記工程（ｂ）において、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を有し、且つ酢酸菌の複製起点を有さないベクターは、さらに大腸菌の複製起点を含んでいてもよく、ＰＣＲ法又は任意のクローニング用大腸菌等を用いて増幅させることができる。前記ベクターは酢酸菌の複製起点を有さないため、酢酸菌に導入しても増幅されることはないが、相同組換えによって酢酸菌ゲノムに組み込まれた場合には、酢酸菌ゲノムとともに複製することができる。また、前記薬剤耐性遺伝子としては、酢酸菌が耐性を有さない薬剤に対する耐性遺伝子であれば特に制限されず、カナマイシン耐性遺伝子を好適に例示することができる。また、マーカー遺伝子としては、酢酸菌に該遺伝子を導入しても該酢酸菌の増殖を妨げず、且つマーカー遺伝子の導入の有無が容易に検出できるものであればよく、具体的にはβ−グルクロニダーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子等を挙げることができ、特にβ−グルクロニダーゼ遺伝子を好適に例示することができる。
【００２１】
上記工程（ｃ）において、前記環状化ＤＮＡを、前記標的遺伝子を有する酢酸菌に導入する方法としては、公知の酢酸菌形質転換方法であれば特に制限されず、具体的には供与菌（大腸菌）から受容菌（酢酸菌）へのプラスミドの移行を補助する役割を有するｔｒａ遺伝子の発現プラスミドｐＲＫ２０１３を保持する大腸菌と、工程（ｂ）で作製した環状化ＤＮＡを保持した大腸菌、及び、前記標的遺伝子を有する酢酸菌とを混合する方法を好適に例示することができる（Inoue, T. et al. Efficient introduction of vector plasmids into acetic acid bacteria. J. Ferment. Technol. 63, 1-4（1985）参考）。さらに、上記工程（ｄ）において、前記環状化ＤＮＡを導入した酢酸菌を、前記ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む公知の酢酸菌用平板培地で２５〜３５℃で１〜５日間、好ましくは３０℃で２日間培養することで、一部の酢酸菌において前記環状化ＤＮＡに含まれる２ヶ所の相同配列のうち一方で相同組換えが生じ、その結果前記環状化ＤＮＡが染色体ＤＮＡに挿入された酢酸菌株（一次組換え体）のみが選択される（図２参照）。
【００２２】
上記工程（ｄ）で選択された薬剤耐性が付与された酢酸菌には、酢酸菌ゲノム中に２対の相同配列が含まれている。したがって、上記工程（ｅ）において、上記工程（ｄ）で選択された酢酸菌を、前記薬剤を含まない公知の酢酸菌用液体培地で２５〜３５℃で１２〜７２時間、好ましくは３０℃で２４時間振盪培養することにより、酢酸菌ゲノム中に前記環状化ＤＮＡを含む酢酸菌だけでなく、酢酸菌ゲノム中の２対の相同配列のうち１対で相同組換えが生じ、上記薬剤耐性遺伝子及び上記マーカー遺伝子が環状化ＤＮＡの形で酢酸菌ゲノムから脱落した酢酸菌（二次組換え体）も増殖することができる（図３参照）。なお、前記２対の相同配列のうち、上記工程（ｃ）において環状化ＤＮＡが酢酸菌ゲノムに導入される際に相同組換えを起こした相同配列と同一の対で相同組換えが生じた場合は、酢酸菌ゲノムは環状化ＤＮＡ導入前と同一の配列を有するが、他方の対で相同組換えが起こる場合、上記標的遺伝子とそれを挟む相同配列は、上記工程（ａ）で調製したＤＮＡ断片と置換され、該標的遺伝子が欠損した酢酸菌が得られる。その後、前記マーカー遺伝子による選択に供するために、前記薬剤を含まない公知の酢酸菌用平板培地に播種し、シングルコロニーを形成させてもよい。
【００２３】
上記工程（ｆ）において、前記薬剤を含まない培地で得られたコロニーのうち、マーカー遺伝子が脱落したものを選択する方法は、上記環状ＤＮＡに含まれるマーカー遺伝子によって決定される。具体的には、マーカー遺伝子としてβ−グルクロニダーゼ遺伝子を選択した場合、工程（ｅ）においてＸ−グルクロニドを含む酢酸菌用平板培地を用いることにより、β−グルクロニダーゼ遺伝子がゲノム中に含まれる酢酸菌は青色、β−グルクロニダーゼ遺伝子がゲノムから脱落した酢酸菌は白色のコロニーを形成するために、目視により選別することができる。また、マーカー遺伝子として蛍光タンパク質遺伝子を用いた場合には、工程（ｅ）で形成したコロニーに、該蛍光タンパク質の励起波長の光を照射した場合に、蛍光を発しないコロニーを選別することにより、マーカー遺伝子が脱落したものを選択することができる。さらに、選別されたコロニーが前記薬剤を含む培地では生育しないことを確認することにより、二次組換え体の二次選抜を行うこともできる。
【００２４】
上記工程（ｆ）により選択されたコロニーは、前記環状化ＤＮＡの酢酸菌ゲノムへの挿入と脱落が同一の相同配列で行われたことにより、酢酸菌ゲノムに変化を生じなかった酢酸菌、及び、前記環状化ＤＮＡの酢酸菌ゲノムへの挿入と脱落がそれぞれ異なる相同配列で行われたことにより、上記標的遺伝子が欠損した酢酸菌が、ほぼ同数ずつであると期待される。
【００２５】
上記工程（ｆ）で得られたコロニーのうち、目的の遺伝子欠損酢酸菌株を選別する方法は、公知の方法であれば特に制限されず、具体的には目的の表現型を有しているか否か、標的遺伝子産物を発現しているか否か、等により選別することができる。また、上記工程（ｇ）により、公知のＰＣＲ法を用いて前記２領域を含む配列を増幅させ、増幅核酸断片の長さを比較することにより、目的の遺伝子欠損を判定しても良い。
【００２６】
本発明の遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法においては、欠損させるＤＮＡ配列は欠損させたい遺伝子の全長であっても一部であってもよい。欠損させたい遺伝子の一部を欠損させる場合には、翻訳の読み枠が合うようにＤＮＡ配列を欠損させても、翻訳の読み枠が合わなくなるようにＤＮＡ配列を欠損させてもよい。例えば、遺伝子の特定の部位以降のアミノ酸配列を破壊する場合は「翻訳の読み枠が合わなくなるように」ＤＮＡ配列を欠損させても「翻訳の読み枠が合うように」ＤＮＡ配列を欠損させてもよいが、遺伝子内の一部のアミノ酸配列を欠損させる場合は「翻訳の読み枠が合うように」ＤＮＡ配列を欠損させる必要がある。
【００２７】
本発明に特徴的な点は、従来の手法では酢酸菌ゲノム中に挿入されてしまうマーカー遺伝子を挿入せずに、遺伝子欠損株を作製できる点である。
【００２８】
従来の手法では、遺伝子欠損株の選抜に用いられたマーカー遺伝子がそのまま酢酸菌ゲノム中に残存するため、二遺伝子以上の欠損株作製のためには欠損させたい遺伝子数と同数のマーカー遺伝子が必要であった。しかしながら、本発明においてマーカー遺伝子は遺伝子欠損株作製後に該遺伝子欠損株から脱落するため、複数遺伝子の欠損株を単一のマーカー遺伝子で行うことができる。したがって、本発明は多重遺伝子欠損株の作製に特に適している。
【００２９】
以下実施例により、本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はかかる実施例により制限されるものではない。
【実施例１】
【００３０】
グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ株のｍｏｔＢ１遺伝子欠損株の作製
【００３１】
１．ＰＣＲクローニング（ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐとｐＪ２００ の構築）
酢酸菌グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ由来のＤＮＡを鋳型として、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を用いたＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーの配列を以下に示す。
Ａ．ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ＿Ｅｃｏ（＋）（5'-cggaattcaaaccgcgcgccgctcttc-3'；配列番号１）
Ｂ．ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ＿Ｍｒｏ（−）（5'-tttccggagcttctttgccgttctgg-3'；配列番号２）
Ｃ．Ｇｏ＿ｍｏｔＡＢ１＿１（＋）（5'-ggaattcccaagcgttcttaaacc-3'；配列番号３）
Ｄ．Ｇｏ＿ｍｏｔＡＢ１＿２（−）（5'-gctctagagagacaggcacagtgctc-3'；配列番号４）
ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ構築用としてはフォワードプライマーとしてＡ、リバースプライマーとしてＢを、ｐＪ２００構築用としてはフォワードプライマーとしてＣ、リバースプライマーとしてＤをそれぞれ用いた。ＰＣＲ反応に先立って、全てのプライマーは、ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡社製）を用いて５’−リン酸化した。方法は同社の推奨プロトコールに従った。
【００３２】
ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長反応を１５サイクル行った。その後、さらに６８℃で５分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Herculase 用反応液（Stratagene社製）、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００３３】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的のＰＣＲ産物を精製した。
【００３４】
次いで、ｐＳＵ１８（Bartolome, B., Y. Jubete, E. Martinez, and F. de la Cruz. 1991. Construction and properties of a family of pACYC184-derived cloning vectors compatible with pBR322 and its derivatives. Gene. 102:75-78）を制限酵素ＳｍａＩ（東洋紡社製）で消化後、Antarctic Phosphatase（ＮＥＢ社製）で脱リン酸化した。脱リン酸化の方法は同社の推奨プロトコールに従った。その後、ＳｍａＩで消化したｐＳＵ１８と前記精製したｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ作製用ＰＣＲ産物、及び、ＳｍａＩで消化したｐＳＵ１８と前記精製したｐＪ２００作製用ＰＣＲ産物とを、それぞれモル比で１：５となるように混合し、Ligation Highキット（東洋紡社製）を用いて同社の推奨プロトコールに従って連結した（図１Ａ）。
【００３５】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法（Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96:23-28）に従って形質転換し、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地（０．５％酵母エキス、１％ポリペプトン、０．５％ＮａＣｌ、１．２％寒天）に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００３６】
生育したコロニーをＬＢ液体培地（０．５％酵母エキス、１％ポリペプトン、０．５％ＮａＣｌ）で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐ作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡社製）とＭｒｏＩ（東洋紡社製）で消化して２．０ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐとし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。ｐＪ２００作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＭｒｏＩとＸｂａＩ（東洋紡社製）で消化して１．１ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＪ２００とし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。
【００３７】
２．ｐΔｍｏｔＢ１の構築
ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩ（Katzen, F., A. Becker, M.V. Ielmini, C.G. Oddo, and L. Ielpi. 1999. New mobilizable vectors suitable for gene replacement in gram-negative bacteria and their use in mapping of the 3' end of the Xanthomonas campestris pv. campestris gum operon. Appl Environ Microbiol. 65:278-282）を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、５．９ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ１＿ｕｐを制限酵素ＥｃｏＲＩとＭｒｏＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＪ２００を制限酵素ＭｒｏＩとＸｂａＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。得られた５．９ｋｂ、１．０ｋｂ、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を、モル比が１：５：５になるように混合し、Ligation Highキットを用いて上記と同様に連結した（図１Ａ）。
【００３８】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００３９】
生育したコロニーをＬＢ液体培地で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化して２．１ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐΔｍｏｔＢ１とし、該ｐΔｍｏｔＢ１を保持した大腸菌ＤＨ５α株を酢酸菌の一次組換え体の作製に用いた（図１Ｂ）。
【００４０】
３．酢酸菌の一次組換え体の作製
上記ｐΔｍｏｔＢ１を保持した大腸菌ＤＨ５α株、及び、プラスミドｐＲＫ２０１３を保持した大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるように５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。一方、酢酸菌グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ株を、ＹＰＧＤ液体培地（０．５％酵母エキス、０．５％ポリペプトン、０．５％グリセロール、０．５％グルコース）で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるようにＹＰＧＤ液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。３つの培養液それぞれから１ｍｌ分取し、室温で８０００ｒｐｍ、２分間遠心分離して沈殿させた菌体を、１００μｌの培地で再懸濁した。
【００４１】
この３つの細胞懸濁液を１０μｌずつ混合した。０．３％ＣａＣＯ３を含むＹＰＧＤ寒天培地（０．５％酵母エキス、０．５％ポリペプトン、０．５％グリセロール、０．５％グルコース、１．２％寒天）に、マイクロピペッターを用いて菌混合液を５μlずつ乗せ、３０℃で一晩培養した。培養した菌体を０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＹＰＧＤ寒天培地に広げ、３０℃で二晩培養した。生じたコロニーをもう一度，０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＹＰＧＤ寒天培地に広げ、３０℃でさらに二晩培養することで二次選抜とし、ここで生じたコロニーを一次組み換え体とした（図２）。
【００４２】
４．酢酸菌の二次組換え体の作製
上記酢酸菌の一次組み換え体を、２ｍｌＹＰＧＤ液体培地に植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した後に、生育を確認して新たな２ｍｌＹＰＧＤ液体培地に終濃度０．１％となるように植菌した。３０℃、２４時間振盪培養後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で１０−５希釈し、０．３％ＣａＣＯ３及び２０μｇ／ｍｌ Ｘ−グルクロニドを含むＹＰＧＤ寒天培地に１００μｌずつスプレッドした。２日間３０℃で培養し、コロニーがある程度大きくなったら４℃に移し、青白の色の区別が付くまで約１週間保存した。その後、β−グルクロニダーゼ活性がないと期待できる白色コロニーを爪楊枝で拾い、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＹＰＧＤ寒天培地に植菌し、さらに同じ爪楊枝で０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＹＰＧＤ寒天培地に植菌した。その結果、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＹＰＧＤ寒天培地では生育せず、０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＹＰＧＤ寒天培地では生育する株、すなわちβ−グルクロニダーゼ陰性かつカナマイシン感受性を示す株を二次組み換え体とした（図３）。
【００４３】
５．酢酸菌の二次組換え体のＰＣＲによる確認
酢酸菌の二次組換え体をＹＰＧＤ液体培地で３０℃、一晩振盪培養し、染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型、フォワードプライマーとして上記Ｃ、リバースプライマーとして上記Ｄをそれぞれ用い、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ反応を、同社の推奨プロトコールに従って行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応を２５サイクル行った。その後、さらに７２℃で１０分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Ｔａｑ用反応液（東洋紡社製）、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００４４】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、２．０ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株を野生型、１．２ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株を酢酸菌ΔｍｏｔＢ１株とした（図４）。
【実施例２】
【００４５】
グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ株のｍｏｔＢ２遺伝子欠損株の作製
【００４６】
１．ＰＣＲクローニング（ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐとｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎの構築）
酢酸菌グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ由来のＤＮＡを鋳型として、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を用いたＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーの配列を以下に示す。
Ｅ．Ｇｏ＿ｍｏｔＡＢ１＿２（＋）（5'-cccaagcttgtcatcgagagacaaatcccac-3'；配列番号５）
Ｆ．ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐ＿Ｍｒｏ（−）（5'-tttccggacagggcgtccacatagcc-3'；配列番号６）
Ｇ．ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ＿Ｍｒｏ（＋）（5'-tttccggatttgccgactaccagcctc-3'；配列番号７）
Ｈ．ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ＿Ｘｂａ（−）（5'-gctctagatggcggcgttgatatagc-3'；配列番号８）
ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐ構築用としてはフォワードプライマーとしてＥ、リバースプライマーとしてＦを、ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ構築用としてはフォワードプライマーとしてＧ、リバースプライマーとしてＨをそれぞれ用いた。ＰＣＲ反応に先立って、全てのプライマーは、ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡社製）を用いて５’−リン酸化した。方法は同社の推奨プロトコールに従った。
【００４７】
ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で１分間の伸長反応を１５サイクル行った。その後、さらに６８℃で５分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Herculase 用反応液（Stratagene社製）、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００４８】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的のＰＣＲ産物を精製した。
【００４９】
次いで、ｐＳＵ１８を制限酵素ＳｍａＩで消化後、Antarctic Phosphatase（ＮＥＢ社製）で脱リン酸化した。脱リン酸化の方法は同社の推奨プロトコールに従った。その後、ＳｍａＩで消化したｐＳＵ１８と前記精製したｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐ作製用ＰＣＲ産物、及び、ＳｍａＩで消化したｐＳＵ１８と前記精製したｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ作製用ＰＣＲ産物とを、それぞれモル比で１：５となるように混合し、LigationHighキット（東洋紡社製）を用いて同社の推奨プロトコールに従って連結した（図５Ａ）。
【００５０】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法に従って形質転換し、２５μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００５１】
生育したコロニーをＬＢ液体培地で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐ作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（東洋紡社製）とＭｒｏＩで消化して１．３ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐとし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎ作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＭｒｏＩとＸｂａＩで消化して１．０ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎとし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。
【００５２】
２．ｐΔｍｏｔＢ２の構築
ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、５．９ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｕｐを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｒｏＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．３ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＳＵ１８＿ΔｍｏｔＢ２＿ｄｏｗｎを制限酵素ＭｒｏＩとＸｂａＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。得られた５．９ｋｂ、１．３ｋｂ、１．０ｋｂのＤＮＡ断片を、モル比が１：５：５になるように混合し、Ligation Highキットを用いて上記と同様に連結した（図５Ａ）。
【００５３】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００５４】
生育したコロニーをＬＢ液体培地で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化して２．３ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐΔｍｏｔＢ２とし、該ｐΔｍｏｔＢ２を保持した大腸菌ＤＨ５α株を酢酸菌の一次組換え体の作製に用いた（図５Ｂ）。
【００５５】
３．酢酸菌の一次組換え体の作製
上記ｐΔｍｏｔＢ２を保持した大腸菌ＤＨ５α株、及び、プラスミドｐＲＫ２０１３を保持した大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるように５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。一方、酢酸菌グルコノバクター・オキシダンスＡＴＣＣ６２１Ｈ株を、ＹＰＧＤ液体培地で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるようにＹＰＧＤ液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。３つの培養液それぞれから１ｍｌ分取し、室温で８０００ｒｐｍ、２分間遠心分離して沈殿させた菌体を、１００μｌの培地で再懸濁した。
【００５６】
この３つの細胞懸濁液を１０μｌずつ混合した。０．３％ＣａＣＯ３を含むＹＰＧＤ寒天培地に、マイクロピペッターを用いて菌混合液を５μlずつ乗せ、３０℃で一晩培養した。培養した菌体を０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＹＰＧＤ寒天培地に広げ、３０℃で二晩培養した。生じたコロニーをもう一度，０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＹＰＧＤ寒天培地に広げ、３０℃でさらに二晩培養することで二次選抜とし、ここで生じたコロニーを一次組み換え体とした。
【００５７】
４．酢酸菌の二次組換え体の作製
上記酢酸菌の一次組み換え体を、２ｍｌＹＰＧＤ液体培地に植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した後に、生育を確認して新たな２ｍｌＹＰＧＤ液体培地に終濃度０．１％となるように植菌した。３０℃、２４時間振盪培養後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で１０−５希釈し、０．３％ＣａＣＯ３及び２０μｇ／ｍｌ Ｘ−グルクロニドを含むＹＰＧＤ寒天培地に１００μｌずつスプレッドした。２日間３０℃で培養し、コロニーがある程度大きくなったら４℃に移し、青白の色の区別が付くまで約１週間保存した。その後、β−グルクロニダーゼ活性がないと期待できる白色コロニーを爪楊枝で拾い、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＹＰＧＤ寒天培地に植菌し、さらに同じ爪楊枝で０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＹＰＧＤ寒天培地に植菌した。その結果、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＹＰＧＤ寒天培地では生育せず、０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＹＰＧＤ寒天培地では生育する株、すなわちβ−グルクロニダーゼ陰性かつカナマイシン感受性を示す株を二次組み換え体とした。
【００５８】
５．酢酸菌の二次組換え体のＰＣＲによる確認
酢酸菌の二次組換え体をＹＰＧＤ液体培地で３０℃、一晩振盪培養し、染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型、フォワードプライマーとして上記Ｅ、リバースプライマーとしてＩ．Ｇｏ＿ｍｏｔＡＢ２−４（−）（5'-gctctagattatcgcagaaatgtcagtag-3'；配列番号９）をそれぞれ用い、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ反応を、同社の推奨プロトコールに従って行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応を２５サイクル行った。その後、さらに７２℃で１０分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Ｔａｑ用反応液（東洋紡社製）、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００５９】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、２．３ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株を野生型、１．５ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株を酢酸菌ΔｍｏｔＢ２株とした（図６）。
【実施例３】
【００６０】
アセトバクター・パスチュリアヌスＳＫＵ１１０８株のａｌｄＨ遺伝子欠損株の作製
【００６１】
１．ＰＣＲクローニング（ｐＴＫ１とｐＴＫ２の構築）
酢酸菌アセトバクター・パスチュリアヌスＳＫＵ１１０８由来のＤＮＡを鋳型として、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）を用いたＰＣＲ反応を行った。用いたプライマーの配列を以下に示す。
Ａ．１１０８−Ｈｉｎ−ａｌｄＦ（＋）（5'-aagcttgtgcacgccattgcgcattac-3'；配列番号１０）
Ｂ．１１０８−ａｌｄＨ−Ｅｃｏ（−）（5'-gaattccatggccgtaagcagaaaac-3'；配列番号１１）
Ｃ．１１０８−ａｌｄＧ−２９２３（＋）（5'-tgcgtgatgatctggaccag-3'；配列番号１２）
Ｄ．１１０８−ａｌｄＨ−３−Ｂａｍ（−）（5'-ggatccagagcattctttgctc-3'；配列番号１３）
ｐＴＫ１構築用としてはフォワードプライマーとしてＡ、リバースプライマーとしてＢを、ｐＴＫ２構築用としてはフォワードプライマーとしてＣ、リバースプライマーとしてＤをそれぞれ用いた。ＰＣＲ反応に先立って、全てのプライマーは、ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡）を用いて５’−リン酸化した。方法は同社の推奨プロトコールに従った。
【００６２】
ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、６８℃で３分間の伸長反応を１５サイクル行った。その後、さらに６８℃で５分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Herculase 用反応液（Stratagene社製）、１×HerculaseＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００６３】
ＰＣＲ反応後、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、目的のＰＣＲ産物を精製した。
【００６４】
次いで、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Novagen社製）を制限酵素ＥｃｏＲＶＩ（東洋紡社製）で消化後、Antarctic Phosphatase（ＮＥＢ社製）で脱リン酸化した。脱リン酸化の方法は同社の推奨プロトコールに従った。その後、ＥｃｏＲＶＩで消化したｐＴ７Ｂｌｕｅと前記精製したｐＴＫ１作製用ＰＣＲ産物、及び、ＥｃｏＲＶＩで消化したｐＴ７Ｂｌｕｅと前記精製したｐＴＫ２作製用ＰＣＲ産物とを、それぞれモル比で１：５となるように混合し、Ligation Highキット（東洋紡社製）を用いて同社の推奨プロトコールに従って連結した（図７Ａ）。
【００６５】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００６６】
生育したコロニーをＬＢ液体培地で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。ｐＴＫ１作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化して１．１ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＴＫ１とし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。ｐＴＫ２作製の場合、プラスミドＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ（東洋紡）で消化して１．１ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＴＫ２とし、挿入配列の塩基配列を決定し、変異が入っていないことを確認した。
【００６７】
２．ｐＴＫ８の構築
ｐＫ１８ｍｏｂＧＩＩを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、５．９ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＴＫ１を制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。ｐＴＫ２を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化後にアガロースゲル電気泳動で分離し、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を精製した。得られた５．９ｋｂ、１．１ｋｂ、１．１ｋｂのＤＮＡ断片を、モル比が１：５：５になるように混合し、Ligation Highキットを用いて上記と同様に連結した（図７Ａ）。
【００６８】
連結したＤＮＡ断片を用いて、大腸菌ＤＨ５α株をInoueらの方法に従って形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシン、１０μｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地に播種し、３０℃で一晩培養した。
【００６９】
生育したコロニーをＬＢ液体培地で３０℃、一晩培養し、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出した。プラスミドＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩで消化したときに２．２ｋｂのＤＮＡ断片を生じ、ＥｃｏＲＩで消化したときに１．１ｋｂのＤＮＡ断片を生じるものをｐＴＫ８とし、該ｐＴＫ８を保持した大腸菌ＤＨ５α株を酢酸菌の一次組換え体の作製に用いた（図７Ｂ）。
【００７０】
３．酢酸菌の一次組換え体の作製
上記ｐＴＫ８を保持した大腸菌ＤＨ５α株、及び、プラスミドｐＲＫ２０１３を保持した大腸菌ＨＢ１０１株を、それぞれ５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるように５０μg／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。一方、酢酸菌アセトバクター・パスチュリアヌスＳＫＵ１１０８株を、Ｐ’液体培地（１．０％酵母エキス、１．０％ポリペプトン、２．０％グリセロール、０．５％グルコース）で３０℃、一晩前培養した。前培養液を終濃度１％になるようにＰ’液体培地に継代植菌し、３０℃で９．５時間培養した。３つの培養液それぞれから１ｍｌ分取し、室温で８０００ｒｐｍ、２分間遠心分離して沈殿させた菌体を、１００μｌの培地で再懸濁した。
【００７１】
この３つの細胞懸濁液を１０μｌずつ混合した。０．３％ＣａＣＯ３を含むＰ’寒天培地（１．０％酵母エキス、１．０％ポリペプトン、２．０％グリセロール、０．５％グルコース、１．２％寒天）に、マイクロピペッターを用いて菌混合液を５μlずつ乗せ、３０℃で一晩培養した。培養した菌体を０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＰ’寒天培地に広げ、３０℃で二晩培養した。生じたコロニーをもう一度，０．１％（ｖ／ｖ）酢酸と５０μg／ｍｌのカナマイシンとを含むＰ’寒天培地に広げ、３０℃でさらに二晩培養することで二次選抜とし、ここで生じたコロニーを一次組み換え体とした。
【００７２】
４．酢酸菌の二次組換え体の作製
上記酢酸菌の一次組み換え体を、２ｍｌＰ’液体培地に植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した後に、生育を確認して新たな２ｍｌＰ’液体培地に終濃度０．１％となるように植菌した。３０℃、２４時間振盪培養後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で１０−５希釈し、０．３％ＣａＣＯ３及び４０μｇ／ｍｌ Ｘ−グルクロニドを含むＰ’寒天培地に１００μｌずつスプレッドし、青白の色の区別が付くまで３０℃で５日間培養した。その後、β−グルクロニダーゼ活性がないと期待できる白色コロニーを爪楊枝で拾い、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＰ’寒天培地に植菌し、さらに同じ爪楊枝で０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＰ’寒天培地に植菌した。その結果、０．３％ＣａＣＯ３及び５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＰ’寒天培地では生育せず、０．３％ＣａＣＯ３のみを含むＰ’寒天培地では生育する株、すなわちβ−グルクロニダーゼ陰性かつカナマイシン感受性を示す株を二次組み換え体とした。
【００７３】
５．酢酸菌の二次組換え体のＰＣＲによる確認
酢酸菌の二次組換え体をＰ’液体培地で３０℃、一晩振盪培養し、染色体ＤＮＡを調製した。得られた染色体ＤＮＡを鋳型、フォワードプライマーとして上記Ｋ、リバースプライマーとしてＥ．１１０８−ａｌｄＨ−３−Ｘｂａ（−）（5'-tctagatcccaagttcctgcgtg-3' ；配列番号１４）をそれぞれ用い、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いたＰＣＲ反応を、同社の推奨プロトコールに従って行った。ＰＣＲ反応は、９４℃で２分間の初期変性を行い、その後、９４℃で３０秒間の熱変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で２分間の伸長反応を２５サイクル行った。その後、さらに７２℃で１０分間の伸長反応を行った。また、ＰＣＲ反応液は以下の通りに調製した。
（反応液組成）
１×Ｔａｑ用反応液（東洋紡社製）、１×Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）、１ｎｇ／μｌ染色体ＤＮＡ、２５０μＭ ｄＮＴＰ、３２０ｎＭフォワードプライマー、３２０ｎＭリバースプライマー
【００７４】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動で分離し、３．０ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株を野生型、０．９ｋｂのＤＮＡ断片が得られた株をアセトバクター・パスチュリアヌスＳＫＵ１１０８ΔａｌｄＨ株とした（図８）。
【００７５】
以上の結果から、本発明を用いることで外来ＤＮＡを挿入しない酢酸菌の遺伝子欠損株を高効率で取得できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明により、従来は外来ＤＮＡを残すことでしかなされていなかった酢酸菌の遺伝子破壊が、外来ＤＮＡを残さずにできるようになった。本手法を用いて作製した酢酸菌は遺伝子組換え体ではないために、消費者イメージを損なうことなしに食品や食品添加物の作製に用いることができる。また、従来は多重遺伝子変異体作製のためには欠損させたい遺伝子数と同数のマーカー遺伝子が必要だったが、本手法を用いることで単一のマーカー遺伝子のみで多重遺伝子変異体を作製できるようになるため、任意の数の遺伝子を欠損させることが可能になる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ（ａ）〜（ｆ）を備えたことを特徴とする外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法。
（ａ）酢酸菌ゲノム中の標的遺伝子を欠損させるために、該標的遺伝子又はその一部を挟む２領域の相同配列を、タンデムに連結した配列を含むＤＮＡ断片を調製するステップ；
（ｂ）前記ＤＮＡ断片を、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を有し、且つ酢酸菌の複製起点を有さないベクターに導入し、環状化ＤＮＡを調製するステップ；
（ｃ）前記環状化ＤＮＡを、前記標的遺伝子を有する酢酸菌に導入するステップ；
（ｄ）前記環状化ＤＮＡを導入した酢酸菌のうち、相同組換えにより環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌ゲノムに組み込まれた酢酸菌を、前記薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤が含まれる培地で培養することにより選択するステップ；
（ｅ）工程（ｄ）で選択された薬剤耐性が付与された酢酸菌を、前記薬剤を含まない培地で培養するステップ；
（ｆ）前記薬剤を含まない培地で得られたコロニーのうち、マーカー遺伝子が脱落したものを選択するステップ；
【請求項２】
工程（ｆ）の後に、さらに以下の工程（ｇ）を備えたことを特徴とする請求項１に記載の作製方法。
（ｇ）ＰＣＲによって標的遺伝子欠損を確認するステップ；
【請求項３】
酢酸菌が、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属することを特徴とする請求項１又は２に記載の作製方法。
【請求項４】
マーカー遺伝子が、β−グルクロニダーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の作製方法。
【請求項５】
薬剤耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の作製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法を、異なる標的遺伝子について複数回繰り返すことにより、２以上の遺伝子を欠損させることを特徴とする酢酸菌多重遺伝子欠損株の作製方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって作製されることを特徴とする多重遺伝子欠損酢酸菌株。
【請求項１】
以下のステップ（ａ）〜（ｆ）を備えたことを特徴とする外来ＤＮＡがゲノムに挿入されていない遺伝子欠損酢酸菌株の作製方法。
（ａ）酢酸菌ゲノム中の標的遺伝子を欠損させるために、該標的遺伝子又はその一部を挟む２領域の相同配列を、タンデムに連結した配列を含むＤＮＡ断片を調製するステップ；
（ｂ）前記ＤＮＡ断片を、薬剤耐性遺伝子及びマーカー遺伝子を有し、且つ酢酸菌の複製起点を有さないベクターに導入し、環状化ＤＮＡを調製するステップ；
（ｃ）前記環状化ＤＮＡを、前記標的遺伝子を有する酢酸菌に導入するステップ；
（ｄ）前記環状化ＤＮＡを導入した酢酸菌のうち、相同組換えにより環状化ＤＮＡ全長が酢酸菌ゲノムに組み込まれた酢酸菌を、前記薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤が含まれる培地で培養することにより選択するステップ；
（ｅ）工程（ｄ）で選択された薬剤耐性が付与された酢酸菌を、前記薬剤を含まない培地で培養するステップ；
（ｆ）前記薬剤を含まない培地で得られたコロニーのうち、マーカー遺伝子が脱落したものを選択するステップ；
【請求項２】
工程（ｆ）の後に、さらに以下の工程（ｇ）を備えたことを特徴とする請求項１に記載の作製方法。
（ｇ）ＰＣＲによって標的遺伝子欠損を確認するステップ；
【請求項３】
酢酸菌が、グルコノバクター属又はアセトバクター属に属することを特徴とする請求項１又は２に記載の作製方法。
【請求項４】
マーカー遺伝子が、β−グルクロニダーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の作製方法。
【請求項５】
薬剤耐性遺伝子が、カナマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の作製方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法を、異なる標的遺伝子について複数回繰り返すことにより、２以上の遺伝子を欠損させることを特徴とする酢酸菌多重遺伝子欠損株の作製方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法によって作製されることを特徴とする多重遺伝子欠損酢酸菌株。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【公開番号】特開２０１２−１２５１６４（Ｐ２０１２−１２５１６４Ａ）
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７７４７７（Ｐ２０１０−２７７４７７）
【出願日】平成２２年１２月１３日（２０１０．１２．１３）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年７月５日（２０１２．７．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１３日（２０１０．１２．１３）
【出願人】（３０４０２０１７７）国立大学法人山口大学 (579)
【Ｆターム（参考）】
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