微生物の多重検出方法
食品に存在する病原性大腸菌Ｏ１５７、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の汚染微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで、公定法と同等又はそれ以上の高い感度で検出することができる微生物の多重検出方法を提供するものである。
（Ａ）少なくとも、アクロモペプチダーゼ、リゾチーム等の溶菌酵素及び／又はエンテロリシン等の溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤で処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程と、（Ｂ）検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程を順次行う。また、上記（Ａ）の検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程の前に、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が１８〜４８時間培養後に１０３ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件下、例えば培養後のｐＨが５．１以上となる培養条件下で培養する工程を設けることが好ましい。
（Ａ）少なくとも、アクロモペプチダーゼ、リゾチーム等の溶菌酵素及び／又はエンテロリシン等の溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤で処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程と、（Ｂ）検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程を順次行う。また、上記（Ａ）の検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程の前に、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が１８〜４８時間培養後に１０３ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件下、例えば培養後のｐＨが５．１以上となる培養条件下で培養する工程を設けることが好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品に存在する病原性大腸菌Ｏ１５７、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで、公定法と同等又はそれ以上の高い感度で検出することができる微生物の多重検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、マルチプレックスＰＣＲを利用する微生物の多重検出方法は、よく知られている。例えば、野菜・果実を対象として病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌を多重検出する方法（例えば、非特許文献１参照）、食品中の病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌を多重検出する方法（例えば、非特許文献２参照）、牛乳を対象として病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネス、カンピロバクター属菌の各菌を多重検出する方法（例えば、非特許文献３参照）、食品中のサルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを多重検出する方法（例えば、非特許文献４参照）、食品中の病原性大腸菌Ｏ１５７等の大腸菌を多重検出する方法（例えば、非特許文献５参照）、牛乳を対象として病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌を多重検出する方法（例えば、非特許文献６参照）などが報告されている。また、マルチプレックスＰＣＲ用のプライマーとして、大腸菌の検出用プライマー（例えば、特許文献１参照）、病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原検出用プライマー（例えば、特許文献２参照）も知られている。
【０００３】
他方、微生物のＤＮＡを抽出する方法として、結核菌等のマイコバクテリウムに溶菌酵素アクロモペプチダーゼ等を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、グラム陰性、陽性菌に溶菌酵素アクロモペプチダーゼ等を用いる方法（例えば、特許文献４参照）、レジオネラ菌にプロテアーゼＫやアクロモペプチダーゼ等を用いる方法（例えば、特許文献５参照）、大腸菌などにタンパク変性剤、還元剤、界面活性剤、キレート剤等を用いる方法（例えば、特許文献６参照）などが知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−９５５７６号公報
【特許文献２】特開平１１−３３２５９９号公報
【特許文献３】特開平６−１６５６７６号公報
【特許文献４】特表平９−５００７９３号公報
【特許文献５】特開平５−３１７０３３号公報
【特許文献６】特開平６−２８９０１６号公報
【非特許文献１】Japanese Journal of Food Microbiology, Vol.19, No2, 47-55, 2002
【非特許文献２】Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 21, 92-98, 1998
【非特許文献３】Milchwissenschaft, 55 (9), 500-503, 2000
【非特許文献４】Journal of Food Protection, Vol.64, No11, 1744-1750，2001
【非特許文献５】Molecular and Cellular Probes, 13, 291-302, 1999
【非特許文献６】Food Microbiology, 20, 345-350, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
１種類の微生物をＰＣＲ法によって検出する方法は既に確立されているが、複数の微生物をＰＣＲ法で同時に検出する方法は、食品分野で検討されつつあるものの、未だ十分に信頼できる方法は確立されていないというのが現状である。本発明の課題は、食品に存在する病原性大腸菌Ｏ１５７、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の汚染微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで、公定法と同等又はそれ以上の高い感度で検出することができる微生物の多重検出方法を提供することにある。すなわち、複数の対合プライマーを組み合わせて行うＰＣＲ法として知られているマルチプレックスＰＣＲを用いて、病原性大腸菌Ｏ１５７、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の汚染微生物を簡便に、かつ高い感度で再現性よく検出することができる微生物の多重検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（培養）
危害の高い病原菌は、食品中で「陰性」（２５ｇ中に含まれていないこと）であることが定められており、その検出には、公定法と同等以上の精度が求められる。食品２５ｇ中１ＣＦＵレベルの微量に汚染した微生物を検出するためには、増菌培養が不可欠である。増菌培養する場合、通常、対象の病原菌ごとに個別に選択性のある培地を使用して培養するが、同時に数種の微生物を検出するために、増菌についても、１種の培地で複数の微生物を同時に増殖させるための検討を行った。なるべく短時間（例えば、２４時間以内）で検出できる培養条件を設定するが好ましく、そのためには、特に培地の選択が重要となる。同時に増菌することは、対象微生物同士が同科あるいは同属菌種、または発育特性が似ていれば比較的容易であるが、異種で発育特性が異なる微生物の場合は難しい。例えば、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを検出対象とした場合、これら病原菌３菌種中で、サルモネラ、Ｏ１５７に比べて、低温発育性であるリステリアは増殖が遅いという問題があった。
【０００７】
そこで、他の細菌が混在した中でも、特にリステリアが十分に増殖できるように、リステリアにとって好ましい栄養源を持つ培地で、炭水化物が少なく、緩衝能が高い培地について検討したところ、培地Ｎｏ．１７（トリプトース１０ｇ、肉エキス５ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース０．５ｇ、リン酸ニナトリウム７ｇ、リン酸一カリウム１５ｇ／１Ｌ中）は、トリプトソーヤブイヨンやＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）、ＢＰＷ（Buffered peptone Water）よりも３種混在中でリステリアの増殖が最も良く、サルモネラとＯ１５７もリステリアより増殖が早かった。このことから、３種同時に検出するためには培地Ｎｏ．１７が良いと考えられた。
【０００８】
（ＤＮＡ）
ＰＣＲ反応を行う際、ＤＮＡの抽出を行うが、ＤＮＡの抽出では溶菌操作が必要となる。グラム陽性細菌の溶解は、より厚くより高密度なペプチドグリカン層が主要細菌細胞壁成分であるため、グラム陰性細菌よりもかなり困難である。今回の技術ではサルモネラ、Ｏ１５７などのグラム陰性菌に加え、リステリアというグラム陽性菌も同時に検出する、という点で困難であった。また、食品からの抽出という点では、食品残渣は多様性なものであり、溶菌法を１種類に特定するのは困難である。特に畜肉などに代表される検体では高タンパク、高脂肪、かつ個体差があるので、溶菌が一定の効率で行われないという、ＤＮＡ抽出の上での困難性が存在した。さらに検討したところ、トリプトソーヤブイヨン、ミューラーヒントンブロスなど、培養する培地の違いによって、リゾチームだけでは細胞が壊れない（＝ＤＮＡが抽出できない）リステリアがあった。培養条件は、たとえ同じ培地を使用しても食品の種類が異なったり、損傷程度が異なることで変わってくると考えられる。また、場合によっては、より回復の良い培地を用いる必要性があるため、どのような場合でも細胞が壊れる抽出方法が必要であった。
【０００９】
一般的なＤＮＡ抽出法として、ボイル法やアルカリ−ＳＤＳ法が知られているが、ボイル法ではリステリアが高感度に抽出できないことを確認した。ＳＤＳは、ＤＮＡ抽出において使用しやすい界面活性剤として知られているが、強力なＰＣＲ阻害剤であるため、抽出に用いた後には、完全に除去しなければならない。未習熟な実験者においても熟練者と同様の効果と結果が得られるようにするためには、ＳＤＳのように低濃度の混入でも反応に影響を与える物質は好ましくなく、ＳＤＳは熟練者との抽出効率差が現われる原因になりうる危害要因と判断した。また、フェノール、クロロホルムは、危険で人体に有害な有機溶媒であり、この処理を行うことによってＤＮＡの精製度は良くなるが、抽出効率に技術的な個人差が現われることが容易に想像でき、一定の感度が保障できない。また、特別な廃液処理が必要となることから、食品製造現場での検査法には適合しない抽出法であるということもできる。そこで、未習熟・熟練者においても操作が容易であり、かつＤＮＡの抽出効率（言い換えれば検出感度）が一定であることが期待でき、さらに、食品製造現場で実行できる簡便さ・安全さを備えており、畜肉に代表される高タンパクな食品からもＤＮＡ抽出が可能な方法を開発する必要性があった。
【００１０】
培養液を５μｍのフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除き、その後溶菌酵素液（アクロモペプチターゼとリゾチームの混合液）を混合し、３７℃で１時間処理後、界面活性剤［ツィーン２０（Tween２０）］とタンパク質変性剤（グアニジンイソチオシアネート）の混合液を加えて完全に菌体を溶解できることがわかった。また、アクロモペプチダーゼの代わりにエンテロリシンのような溶菌活性を持つバクテリオシンを利用しても完全に菌体を溶解できることがわかった。遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿を行いＤＮＡを抽出した。処理の順番はアクロモペプチターゼがリゾチームより先、もしくは一緒に行い、あるいはエンテロリシンがリゾチームより先、もしくは一緒に行い、その後ツィーン２０処理後、グアニジンイソチオシアネート処理、もしくはツィーン２０とグアニジンイソチオシアネート処理を一緒に行うことが極めて好ましいことがわかった。ツィーン２０は粘性が高く、単独で加えることが難しいため混合添加することが望ましいこともわかった。
【００１１】
また、フェノール、クロロホルム処理を行わなくても、アルコール沈殿やＤＮＡ抽出液添加量（ＰＣＲ反応液５０μｌに対し２μｌ）によって、ＰＣＲで問題なく検出できる程度に可溶化したタンパク質を除くことができた。ツィーン２０はＰＣＲ反応液にも使われるもので、ＳＤＳに比べ阻害が少なく、未習熟な実験者でも扱いが容易であると考えられた。また、もちろん、この抽出法はおのおの単独菌種での抽出においても可能である。さらに、（１）アクロモペプチターゼ単独、（２）リゾチーム単独、（３）エンテロリシン単独、（４）アクロモペプチターゼ処理後グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理、（５）リゾチーム処理後グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理、（６）エンテロリシン処理後グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理、（７）プロテイナーゼＫ、（８）プロテイナーゼＫ処理後グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理、（９）グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理、（１０）グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理＋加熱処理、の各方法についても試みたが、これらいずれの方法も、アクロモペプチターゼとリゾチームで併用処理し、あるいはエンテロリシンとリゾチームで併用処理し、その後ツィーン２０とグアニジンイソチオシアネートで処理する前記方法の方が、リステリアの高感度の抽出において優れていた。
【００１２】
（ＰＣＲ反応）
数種の菌を同時に検出する方法としてマルチプレックスＰＣＲを採用した。複数の対合プライマーを組み合わせて行うＰＣＲ法であるマルチプレックスＰＣＲ法には、互いにプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりすることがなく、融解温度の近い対合プライマーを選定して用いた。プライマーの選択や混合割合により、反応のしやすさ、検出限界に差が出てくることもわかった。マルチプレックスＰＣＲを行う場合には、その後の判定に用いる電気泳動像に３菌種のバンドが同じような濃さで検出するようにプライマーの混合割合を調整する必要がある。３菌種が同じＤＮＡ濃度（２０ｐｇ）のとき、３種菌のバンドが同様の濃さで検出できるよう、調整した。例えば、プライマーとして、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡを使用した場合、６種のプライマーの混合割合は、サルモネラ用プライマー各１２０ｎＭ、リステリア用プライマー各１００ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各８０ｎＭが、配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡを使用した場合、サルモネラ用プライマー各６０ｎＭ、リステリア用プライマー各６０ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各２４０ｎＭが最も理想的な配合量であった。さらに低濃度の混合割合である、サルモネラ用プライマー各３０ｎＭ、リステリア用プライマー各２５ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各２０ｎＭ（配列番号１〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡ使用時）、あるいは、サルモネラ用プライマー各１５ｎＭ、リステリア用プライマー各１５ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各６０ｎＭ（配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡ使用時）においても検討したが、電気泳動による目視での検出が可能ではあるが困難であったことから、上記濃度が好ましいことがわかった。
【００１３】
また、ＰＣＲ反応では、最終産生量が１０−８Ｍ程度まで標的遺伝子を増幅できることが知られている。ＰＣＲ反応では通常１菌種につき２００ｎＭ程度のプライマーを加えて行うが、多重検出の場合、各菌種についてこのプライマー量を加えることは明らかに過剰であることがわかった。特にマルチプレックス反応の場合、その過剰なプライマーによる生成産物（これは非標的産物を含む）により優位な反応のみが結果として得られる可能性が高い。このため、ＰＣＲ反応においてプライマー量を制限することで最終産物量を制限することとマルチプレックス反応との関係を考慮した。もちろん、ＰＣＲ反応にはプライマーダイマーなどを代表とする非増幅産物もプライマーを消費するため、下限の濃度は存在するが、検出器の感度最低限のプライマー濃度を設定することにより、より複数のマルチプレックス反応を成功させる可能性が期待できることもわかった。言い換えれば、プライマーの下限の濃度を検出器の感度に合わせることで、より複数の検出が期待できる。電気泳動や蛍光プローブ法、キャピラリー電気泳動法などによる検出器の限界を考慮した上で、５０ｎＭ程度以上での反応を行わざるを得ず、３種類の病原菌の検出を確認したが、検出器の感度上昇によってこの濃度を低く設定することができ、より多くの標的を一度に検出できると考えられる。より高感度な増幅産物検出法が実現した際には上記の考えを踏まえた上で最終産物量を制御することにより、より多数のマルチプレックスＰＣＲによる多重同時検出を実現できることもわかった。
【００１４】
すなわち本発明は、（１）食品中の２種以上の異なる特性の微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い感度で検出する方法であって、
（Ａ）少なくとも、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程と、
（Ｂ）検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程と
を含むことを特徴とする微生物の多重検出方法や、（２）検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程の前に、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が２４時間培養後に１０3ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件下で培養する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の微生物の多重検出方法や、（３）２種以上の異なる特性の微生物が、リステリアモノサイトゲネスを含むことを特徴とする上記（１）又は（２）記載の微生物の多重検出方法や、（４）特異的なプライマーが、配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする上記（３）記載の微生物の多重検出方法や、（５）２種以上の異なる特性の微生物が、病原性大腸菌Ｏ１５７を含むことを特徴とする上記（１）又は（２）記載の微生物の多重検出方法や、（６）特異的なプライマーが、配列番号１及び２、又は配列番号７及び８に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項５記載の微生物の多重検出方法や、（７）２種以上の異なる特性の微生物が、サルモネラ属菌を含むことを特徴とする上記（１）又は（２）記載の微生物の多重検出方法や、（８）特異的なプライマーが、配列番号３及び４、又は配列番号９及び１０に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする上記（７）記載の微生物の多重検出方法に関する。
【００１５】
また本発明は、（９）培養後のｐＨが５．１以上となる培養条件下で培養することを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１０）グルコース濃度が０．１５％以下の培地、及び／又は、リン酸緩衝液の濃度が５０ｍＭ以上若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養することを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１１）溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿によりＤＮＡを析出して抽出することを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１２）溶菌酵素が、アクロモペプチダーゼ及び／又はリゾチームであることを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１３）溶菌活性を持つバクテリオシンが、エンテロリシンであることを特徴とする上記（１）〜（１２）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１４）界面活性剤が、ソルビタンモノラウラートのエチレンオキシド縮合物であることを特徴とする上記（１）〜（１３）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１５）タンパク質変性剤が、グアニジンイソチオシアネートであることを特徴とする上記（１）〜（１４）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１６）プライマーとして、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡを合計７５０ｎＭ以下の濃度で組み合わせてマルチプレックスＰＣＲを行うことを特徴とする上記（１）〜（１５）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１７）プライマーとして、配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡを合計７５０ｎＭ以下の濃度で組み合わせてマルチプレックスＰＣＲを行うことを特徴とする上記（１）〜（１５）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１８）食品が、食肉又は食肉加工品であることを特徴とする上記（１）〜（１７）のいずれか記載の微生物の多重検出方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、食品に存在する病原性大腸菌Ｏ１５７、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等又はそれ以上の高い感度で簡便に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の微生物の多重検出方法としては、食肉、食肉加工品、牛乳、野菜等の食品中の２種以上の異なる特性の微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い感度で検出する方法であって、（Ａ）少なくとも、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程と、（Ｂ）検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程とを含む方法であれば特に制限されないが、上記（Ａ）の検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程の前に、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が２４時間培養後に１０3ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件下で培養する工程を含むことが好ましい。また、検出対象の微生物としては、食品の汚染微生物であればどのようなものでもよく、リステリアモノサイトゲネス、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、カンピロバクター属菌、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、エルシニア属菌、大腸菌群、セレウス菌、コレラ菌、赤痢菌、ボツリヌス菌などを具体的に例示することができる。また、公定法としては、「食品衛生検査指針」（１９９０年 社団法人 日本食品衛生協会）に説明されている方法をいい、具体例が実施例９において説明されている。
【００１８】
本発明の微生物の多重検出方法によると、食品２５ｇ中１ＣＦＵレベルの微量に汚染した微生物を検出することが可能となるが、本発明の微生物の多重検出方法においては、食品汚染微生物の培養工程が極めて重要である。食品汚染微生物の増菌培養における培養条件としては、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が４８時間培養後、好ましくは３０時間培養後、特に好ましくは２４時間培養後、中でも１８時間培養後に１０３ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件を挙げることができるが、さらに緩衝能を有する培地を用いて培養後のｐＨが５．１以上となる培養条件下で培養することや、グルコース濃度が０．１５％以下の培地、及び／又は、リン酸緩衝液の濃度が５０ｍＭ以上若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養するのが好ましい。リン酸緩衝液以外の緩衝液としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、乳酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液を挙げることができる。
【００１９】
本発明の微生物の多重検出方法においては、培養増殖させた食品汚染微生物からのＤＮＡ抽出工程が必須とされる。かかるＤＮＡ抽出工程としては、少なくとも、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程であれば特に制限されないが、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿によりＤＮＡを析出して抽出する方法を好適に例示することができる。上記溶菌酵素としては、アクロモペプチダーゼ、リゾチーム、プロテアーゼＫ、キトサナーゼ、キチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼ、ザイモリアーゼ、セルラーゼ等を挙げることができ、溶菌活性を持つバクテリオシンとしては、エンテロリシン、ヘルベティシンを挙げることができる。これらは１種又は２種以上用いることができるが、中でもアクロモペプチダーゼ、リゾチーム、エンテロリシンやこれらの組合せ、例えば、アクロモペプチダーゼとリゾチームとの併用、エンテロリシンとリゾチームとの併用を好適に例示することができる。上記界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤を挙げることができ、中でも非イオン界面活性剤であるソルビタンモノラウラートのエチレンオキシド縮合物、より具体的には、ツィーン２０を好適に挙げることができる。上記タンパク質変性剤としては、グアニジンイソチオシアネート、尿素、塩酸グアニジン、トリクロロ酢酸、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、デオキシコール酸等を挙げることができ、これらは１種又は２種以上用いることができるが、中でも溶菌効果や取扱い易さの点でグアニジンイソチオシアネートが好ましい。溶菌物からのＤＮＡの抽出・析出は、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿を行うなど、公知の方法により行うことができる。
【００２０】
本発明の微生物の多重検出方法においては、前記抽出したＤＮＡと、検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程が必須とされる。使用するプライマーとしては、検出対象微生物特異的なプライマーであって、互いにプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりすることがなく、融解温度の近い対合プライマーを選択することが好ましい。また、その後の判定に用いられる電気泳動像に出現するバンドが同じような濃さで検出しうるようにプライマーの混合割合を調整することが好ましい。例えば、病原性大腸菌Ｏ１５７に特異的なプライマーセットとしては、配列番号１及び２、配列番号７及び８、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４などに示される塩基配列からなるＤＮＡが、サルモネラ属菌に特異的なプライマーセットとしては、配列番号３及び４、配列番号９及び１０、配列番号１５及び１６などに示される塩基配列からなるＤＮＡが、リステリアモノサイトゲネスに特異的なプライマーセットとしては、配列番号５及び６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０などに示される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができ、これらを組み合わせて用いることができるが、中でも配列番号１〜６又は配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡの組み合わせが最も好ましく、この場合、合計７５０ｎＭ以下の濃度でプライマーを混合することが好ましく、また配列番号１〜６を用いた場合、６種のプライマーの混合割合はサルモネラ用プライマー各１２０ｎＭ、リステリア用プライマー各１００ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各８０ｎＭが、配列番号５〜１０を用いた場合、サルモネラ用プライマー各６０ｎＭ、リステリア用プライマー各６０ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各２４０ｎＭが最も好ましい。
【００２１】
ＰＣＲ後の検出法としては、電気泳動法、蛍光プローブ法、キャピラリー電気泳動法、定量ＰＣＲ法などにより行うこともできる。特に、定量ＰＣＲの場合は、プライマーとして配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡを用い、蛍光プローブに配列番号２１〜２３で示される塩基配列からなるＤＮＡを用いることにより検出することができる。
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
（既存培地での同時培養）
病原性大腸菌Ｏ１５７はEscherichia coli Ｏ１５７：Ｈ７ ＡＴＣＣ４３８９４、サルモネラ属菌はSalmonella enteritidis ＩＦＯ３３１３、リステリアモノサイトゲネスはListeria monocytogenes ＡＴＣＣ４９５９４を用いた。また、肉由来菌には、シュードモナス（Pseudomonas fragi）、シトロバクター（Citrobacter freundii）、ラクトバチルス（Lactobacillus viridescens）、ロイコノストック（Leuconostoc mesenteroides）の４株を用いた。試験培地にはトリプトソーヤブイヨン（ＴＳＢ；日水製薬社製）、及び、Buffered Peptone Water（ＢＰＷ；ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、リン酸一水素ナトリウム３．５ｇ、リン酸ニ水素カリウム１．５ｇ／１Ｌ）の２つの培地を用いた。
【００２４】
病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを各１ＣＦＵ／１００ｍｌ、肉由来菌を各１０４ＣＦＵ／１００ｍｌになるように試験培地に接種した。３５℃で培養し、経時的に一般生菌数、Ｏ１５７数、サルモネラ数、リステリア数を計測した。一般生菌数は標準寒天培地（日水製薬社製）を用い、３５℃で４８時間培養後の総コロニー数、Ｏ１５７数はデソキシコレート寒天培地（日水製薬社製）を用い、３５℃で２４時間培養後の大腸菌様のコロニー数、サルモネラ数はＭＬＣＢ寒天培地（日水製薬社製）を用い、３５℃で２４時間培養後のサルモネラ様のコロニー数、リステリア数はＰＡＬＣＡＭ寒天培地（Merck社製）を用い、３５℃で４８時間培養後のリステリア様のコロニー数をそれぞれ測定した。結果を図１に示す。その結果、いずれの培地でも特にリステリアモノサイトゲネスの増殖が弱かった。培養液のｐＨを測定したところ、ｐＨの低下が認められた。
【実施例２】
【００２５】
（培地の緩衝能および糖濃度の影響）
実施例１でリステリアモノサイトゲネスの増殖が弱かったのは培養後の培地のｐＨが低下したことが原因と考えられたため、各菌の増殖に及ぼす培地の緩衝能および糖濃度の影響を調査した。基本培地（トリプトース１０ｇ、肉エキス５ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ／１Ｌ中）に、リン酸ニナトリウムおよびリン酸一カリウムを加えてリン酸濃度を１５ｍＭから２００ｍＭまで調整し（ｐＨ６．３）、グルコースの濃度を０％から０．２５％まで変化させて加えて、試験培地を作製した。実施例１で使用した、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを各１ＣＦＵ／１００ｍｌ、肉由来菌を各１０４ＣＦＵ／ｍｌになるように各試験培地に接種した。３５℃で培養し、１８、２４、３０、４８時間後の一般生菌数、Ｏ１５７数、サルモネラ数、リステリア数、ｐＨを計測した。結果を表１に示す。
【００２６】
その結果、グルコース濃度０．１５％以下の培地、またはリン酸濃度５０ｍＭ以上の培地、または培養後のｐＨを５．１以上に保持する培地を用いることによって病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスとも１８時間以上培養することで１０３ＣＦＵ／ｍｌ以上（ＰＣＲでの検出に必要な菌数）に増殖した。以降の試験には表１のＮｏ．１７の培地（トリプトース１０ｇ、肉エキス５ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース０．５ｇ、リン酸ニナトリウム７ｇ、リン酸一カリウム１５ｇ／１Ｌ中）を選定した。培地成分については、検出の目的とする細菌の存在環境や損傷程度に応じて、トリプトース、肉エキス、酵母エキス以外の窒素源、グルコース以外の炭素源、リン酸以外の緩衝能を持つ物質も有効であり、また、増殖を促進する物質として無機塩類やピルビン酸もしくはピルビン酸塩、ツィーンなどの界面活性剤を添加した方がより好ましかった。
【００２７】
【表１】
【実施例３】
【００２８】
（ＤＮＡ抽出方法１）
病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌をＮｏ．１７培地１０ｍｌに接種し、３５℃で１８時間培養した。各培養液をそれぞれ１ｍｌチューブに取り、１５，０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離を行い、菌体を回収した。その菌体回収物に溶菌酵素液｛２０ｍｇ／ｍｌのアクロモペプチダーゼ１０μｌと２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム１０μｌとＴＥバッファー［１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液、ｐＨ８］１８０μｌの混合液｝を加え、３７℃で１時間処理後、溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を３００μｌ加えて完全に菌体を溶解した。この溶液を光学顕微鏡で観察したところ、溶菌が十分に行われていることが確認できた。この溶液を１５，０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離し、上澄み４００μｌを別のチューブに移し、溶液中のＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させた後、遠心分離して目的のＤＮＡを得た。また、アクロモペプチダーゼの代わりに、エンテロリシンを用いても、同様に溶菌が十分に行われていることが確認できた。
【実施例４】
【００２９】
（ＤＮＡ抽出方法２）
同様に、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌をＮｏ．１７培地１０ｍｌに接種し、３５℃で１８時間培養した。各培養液をそれぞれ１ｍｌチューブに取り、１５，０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離を行い、菌体を回収した。その菌体回収物に溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を５００μｌ加え、回収物を溶解した。１００℃で１０分間加熱し、５分間氷冷した。この溶液を光学顕微鏡で観察したところ、病原性大腸菌Ｏ１５７やサルモネラ属菌は溶菌できていたが、実施例３のＤＮＡ抽出方法に比べるとリステリアモノサイトゲネスの溶菌の程度が少し劣っていた。また、リステリアモノサイトゲネスの溶菌を、1)菌体回収物に２０ｍｇ／ｍｌのアクロモペプチダーゼ１０μｌとＴＥバッファー１９０μｌの混合液を加え、３７℃で１時間処理した液、2)菌体回収物に２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム１０μｌとＴＥバッファー１９０μｌの混合液を加え、３７℃で１時間処理した液、3)菌体回収物にエンテロリシン１０μlとＴＥバッファー１９０μｌの混合液を加え、３７℃で１時間処理した液、 4)上記1)液に、溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を３００μｌ加え混合した液、5)上記2)液に、溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を３００μｌ加え混合した液、6)上記3)液に、溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を３００μｌ加え混合した液、7)菌体回収物に２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ１μｌとＴＥバッファー２００μｌの混合液を加え、３７℃で１時間処理した液、8)上記7)液に、溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を３００μｌ加え混合した液、9)菌体回収物に溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）５００μｌを加え混合した液をそれぞれ用いて行い、光学顕微鏡で観察を行ったが、いずれもリステリアモノサイトゲネスの溶菌の程度が実施例３のＤＮＡ抽出方法に比べると少し劣っていた。
【実施例５】
【００３０】
（ＰＣＲ反応の条件設定）
実施例３で得たＤＮＡ抽出液を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、次のプライマーから、検出対象微生物毎に特異的なプライマーを１セットずつ選択して用いた。
配列番号１：GGC GGA TTA GAC TTC GGC TA
配列番号２：CGT TTT GGC ACT ATT TGC CC
配列番号３：GGG AGT CCA GGT TGA CGG AAA ATT T
配列番号４：GTC ACG GAA GAA GAG AAA TCC GTA CG
配列番号５：CGG AGG TTC CGC AAA AGA TG
配列番号６：CCT CCA GAG TGA TCG ATG TT
配列番号７：ATC ATT GAC GAT TGT AGC ACC
配列番号８：ACA TGA GGA GCA TTA ACT TCG
配列番号９：GGG TCG TTC TAC ATT GAC AG
配列番号１０：TTC CCT TTC CAG TAC GCT TC
配列番号１１：GTA TTT GGA GAC ATG GGA GC
配列番号１２：ACT AAT GAC ACG ATT CGT TCC
配列番号１３：CGG ACA GTA GTT ATA CCA C
配列番号１４：CTG CTG TCA CAG TGA CAA A
配列番号１５：AGC TTT GGT CGT AAA ATA AGG
配列番号１６：GAT GCC CAA AGC AGA GAG AT
配列番号１７：CAA ACT GCT AAC ACA GCT ACT
配列番号１８：GCA CTT GAA TTG CTG TTA TTG
配列番号１９：ACC AAT GGG ATC CAC AAG A
配列番号２０：GAG CTG AGC TAT GTG CGA T
【００３１】
ＰＣＲ反応液は、１０×Ｂｕｆｆｅｒ５μｌ、ｄＮＴＰ溶液４μｌ、ＵＮＧ０．５μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ０．２５μｌ、ＭｇＣｌ２ １０μｌ（いずれも、アプライドバイオシステムズジャパン社製）、プライマー、ＤＮＡ抽出液２μｌに滅菌水を加えて合計５０μｌとした。反応条件は５０℃で２分保持後、９５℃で１０分反応させた後、９５℃・２０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒を４０回繰り返し、７２℃で７分保持後、４℃で保管した。ＰＣＲ産物は２．５％アガロースゲル電気泳動で確認した。配列番号１〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡを組み合わせる場合、プライマーの混合割合は病原性大腸菌Ｏ１５７用プライマー（配列番号１、２）各８０ｎＭ、サルモネラ属菌用プライマー（配列番号３、４）各１２０ｎＭ、リステリアモノサイトゲネス用プライマー（配列番号５、６）各１００ｎＭが最も理想的な配合量であった。例えば、さらに低濃度の混合割合である、病原性大腸菌Ｏ１５７用プライマー各２０ｎＭ、サルモネラ属菌用プライマー各３０ｎＭ、リステリアモノサイトゲネス用プライマー各２５ｎＭにおいても検討したが、アガロース電気泳動による目視での検出は可能ではあるが多少困難であった。また、配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡを用いた場合、プライマー混合割合は病原性大腸菌Ｏ１５７用プライマー（配列番号７、８）各２４０ｎＭ、サルモネラ属菌用プライマー（配列番号９、１０）各６０ｎＭ、リステリアモノサイトゲネス用プライマー（配列番号５、６）各６０ｎＭが最も理想的な配合量であった。その他の病原性大腸菌Ｏ１５７用プライマー（配列番号１１、１２もしくは配列番号１３、１４）、サルモネラ属菌用プライマー（配列番号１５、１６）、リステリアモノサイトゲネス用プライマー（配列番号１７、１８又は配列番号１９、２０）についてもそれぞれ混合割合を調整することにより利用できることがわかった。
【００３２】
また、配列番号５〜１０の組み合わせでは、それぞれの内部配列に特異的な配列番号２１〜２３を蛍光色素で標識したプローブを用いることによって、定量ＰＣＲもしくはハイブリダイゼーション等による検出手法において検出できることがわかった。
配列番号２１：CGG ATG ATT TGT GGC ACG AGA AA
配列番号２２：TCT GGC ATT ATC GAT CAG TAC CAG CC
配列番号２３：AGT TCA AAT CAT CGA CGG CAA CCT CGG A
【実施例６】
【００３３】
（反応特異性の確認）
表２に示した病原性大腸菌Ｏ１５７を４株、サルモネラ属菌４株、リステリアモノサイトゲネス１０株、病原性大腸菌Ｏ１５７以外のEscherichia coli４株、リステリアモノサイトゲネス以外のリステリア属４株を用いて特異性の確認を行った。各菌株をトリプトソーヤブイヨン（日水製薬社製）で３５℃１８時間培養し、方法１として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にアクロモペプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号１〜６の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法２として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にエンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号５〜１０の組み合わせを用いた方法を行った。ＰＣＲ反応の結果を２．５％アガロースゲル電気泳動で確認したところ、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスでは電気泳動像の所定の位置にバンドが検出し、陽性であることが示された。一方、病原性大腸菌Ｏ１５７以外のEscherichia coli、リステリアモノサイトゲネス以外のリステリア属では、バンドが検出せず、陰性菌であることが示され、特異性に問題がないことを確認した。結果を表２に示した。
【００３４】
【表２】
【実施例７】
【００３５】
（肉成分混在系での検出限界の確認）
実施例１記載の病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを用いた。各菌を前記Ｎｏ．１７培地１０ｍｌに接種し、３５℃で１８時間培養を行い、菌株培養液を得た。また、鶏もも挽肉２５ｇにＮｏ．１７培地２２５ｍｌを加え、３０秒間ストマッカーで粉砕し、３５℃で１８時間培養した。この時の培養液の一般生菌数は３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌであった。鶏もも挽肉の培養液を９ｍｌずつ分注し、これに各菌株培養液の１０倍段階希釈液１ｍｌをそれぞれ添加し、各菌株培養液の各希釈系列の肉試料液を作製した。それぞれの試料液を５μｍのフィルターを通し大きな食品くずを取り除いた後、方法１として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にアクロモペプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号１〜６の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法２として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にエンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号５〜１０の組み合わせを用いた方法を行った。それぞれ２．５％アガロースゲル電気泳動により確認した結果、肉試料液での病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの検出限界は、いずれも１０３ＣＦＵ／ｍｌであることを確認した。代表して方法１の結果の電気泳動図を図２に示した。
【実施例８】
【００３６】
（接種した食品からの病原菌の検出）
実施例１記載の病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを用いた。豚挽肉に各菌株が１０２ＣＦＵ／２５ｇ、１０ＣＦＵ／２５ｇ、１ＣＦＵ／２５ｇ、１０−１ＣＦＵ／２５ｇになるようそれぞれ接種した。接種した豚挽肉２５ｇにＮｏ．１７培地を２２５ｍｌ加え、ストマッカーで３０秒粉砕し、３５℃で２４時間培養した。各培養液を５μｍのフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除いた後、方法１として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にアクロモペプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号１〜６の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法２として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にエンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号５〜１０の組み合わせを用いた方法を行った。それぞれ、２．５％アガロースゲル電気泳動により確認した。代表して方法１の結果を図３に示す。その結果、いずれの菌株も１ＣＦＵ／２５ｇ存在すればいずれの方法でも検出できることを確認した。病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスなどの危害の高い病原菌は、食品中で「陰性」（２５ｇ中に含まれていないこと）であることが定められており、その検出には、公定法と同等以上の精度が求められる。本多重検出法は、公定法と同等以上の精度があることが確認された。
【実施例９】
【００３７】
（公定法と多重検出法との比較試験；市販食品からの病原菌の検出）
鶏肉や鶏肝など、２０検体をスーパーから購入し、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの検査を多重検出法により行うとともに公定法と比較した。また、公定法は、次の通りに行った。
【００３８】
病原性大腸菌Ｏ１５７については、検体２５ｇにノボビオシン加ｍＥＣブロス（極東製薬工業社製）２２５ｍｌを加え、ストマッカーで３０秒粉砕した後、４２℃で１８時間培養し、クロモアガーＯ１５７培地（関東化学社製）およびマッコンキーソルビトール寒天培地（日水製薬社製）に画線し、３５℃で１８〜２４時間培養した。クロモアガーＯ１５７培地で藤色、マッコンキーソルビトール培地で半透明のピンク色を示したものを病原性大腸菌Ｏ１５７擬陽性とし、ＣＬＩＧ寒天培地（極東製薬工業社製）に画線し、３５℃で１８〜２４時間培養した。下層が黄色く、上層がピンクでかつ紫外放射により発光しないものを病原性大腸菌Ｏ１５７擬陽性とし、インドール反応を行い、陽性（赤）のものについて凝集反応を行った。凝集反応は大腸菌Ｏ１５７検出キット「ＵＮＩ」（Oxoid社製）を用いて行った。凝集反応で疑わしいコロニーをクロモアガーＯ１５７培地、マッコンキーソルビトール寒天培地、ＴＳＩ寒天培地（日水製薬社製）、ＬＩＭ培地（日水製薬社製）に画線し、３５℃で２４時間培養した。クロモアガーＯ１５７培地で藤色、マッコンキーソルビトール寒天培地で半透明のピンク色、ＴＳＩ寒天培地で黄色、ＬＩＭ培地で無変化のものについてＰＣＲ反応により病原性大腸菌Ｏ１５７であることを確認した。
【００３９】
サルモネラ属菌については、検体２５ｇにＥＥＭブイヨン（日水製薬社製）２２５ｍｌを加え、ストマッカーで３０秒粉砕した。３５℃で１８時間培養し、セレナイトシスチン基礎培地（日水製薬社製）１０ｍｌに１ｍｌ加え、４３℃で１５〜１８時間培養した。全体あるいは沈殿が赤色を呈したものについて、１白金耳をＭＬＣＢ寒天培地（日水製薬社製）に画線し、３５℃で２４時間培養後、黒色のコロニーを生じたものをサルモネラ属菌擬陽性とし、確認試験として、ＴＳＩ寒天培地、ＬＩＭ培地に画線した。３５℃、２４〜４８時間培養し、ＴＳＩ培地で斜面が赤く高層が黒色で、ＬＩＭ培地で無変化のものをサルモネラ属菌陽性とした。
【００４０】
リステリアモノサイトゲネスについては、検体２５ｇにＵＶＭリステリア選択増菌ブイヨン（Merck社製）２２５ｍｌを加え、ストマッカーで３０秒粉砕した。３０℃で４８時間培養し、ＰＡＬＣＡＭリステリア選択寒天培地（Merck社製）に１白金耳画線した。３５℃で４８時間培養し、リステリア属陽性と判定されたものについて、馬血液寒天培地（日水製薬社製）、標準寒天培地（日水製薬社製）に画線して、３５℃、２４〜４８時間培養した。溶血性が陽性のものについてオキシダーゼ反応、カタラーゼ反応、グラム染色、顕微鏡観察、アピリステリア（日本ビオメリュー社製）を行い、リステリアモノサイトゲネスと同定されたものをリステリアモノサイトゲネス陽性とした。
【００４１】
多重検出法については次のように行った。検体２５ｇに、Ｎｏ．１７培地を２２５ｍｌ加え、ストマッカーで３０秒粉砕し、３５℃で２４時間培養した。培養液を５μｍのフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除いた後、方法１として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にアクロモペプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号１〜６の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法２として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にエンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号５〜１０の組み合わせを用いた方法を行った。それぞれ、２．５％アガロースゲル電気泳動により確認した。結果を表３に示す。
【００４２】
その結果、病原菌が検出した検体は、公定法では病原性大腸菌Ｏ１５７ ０検体、サルモネラ属菌 ３検体、リステリアモノサイトゲネス ６検体、多重検出法ではいずれの方法でも病原性大腸菌Ｏ１５７ ０検体、サルモネラ属菌 ３検体、リステリアモノサイトゲネス ８検体であり、公定法で陽性であった検体はいずれも多重検出法で陽性であった。また、公定法で陰性、多重検出法で陽性であったリステリアモノサイトゲネス２検体（表３、検体Ｎｏ．５、１５）について、Ｎｏ．１７での培養液をＰＡＬＣＡＭリステリア選択寒天培地（Ｍｅｒｃｋ）に画線培養後、形成したコロニーの同定試験を行ったところ、リステリアモノサイトゲネスであることを確認した。このことから、本多重検出法では公定法に比べて同等以上の精度があることを確認した。
【００４３】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】トリプトソーヤブイヨン（ＴＳＢ）およびBuffered Peptone Water（ＢＰＷ）培地を用いた３５℃培養での病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスおよび一般生菌数の挙動を示す図である。
【図２】病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌株を接種した肉試料液中（一般生菌数：３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）での各菌株の多重検出法による検出限界を示す電気泳動像の図である。
【００４５】
Ｍ：分子量マーカー
レーン１〜７は、病原性大腸菌Ｏ１５７接種区（一般生菌数：３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を示し、Ｏ１５７接種量は次の通り。
１：１．１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、２：１．１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、３：１．１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、４：１．１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、５：１．１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、６：１．１×１０２ＣＦＵ／ｍｌ、７：１１ＣＦＵ／ｍｌ
レーン８〜１４は、サルモネラ属菌接種区（一般生菌数：３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を示し、サルモネラ接種量は次の通り。
８：５．０×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、９：５．０×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、１０：５．０×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、１１：５．０×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、１２：５．０×１０２ＣＦＵ／ｍｌ、１３：５０ＣＦＵ／ｍｌ、１４：５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン１５〜２１は、リステリアモノサイトゲネス接種区（一般生菌数：３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を示し、リステリア接種量は次の通り。
１５：１．１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、１６：１．１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、１７：１．１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、１８：１．１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、１９：１．１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、２０：１．１×１０２ＣＦＵ／ｍｌ、２１：１１ＣＦＵ／ｍｌ
【図３】病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌株を接種した豚挽肉を用い、多重検出法により各菌株を検出した結果を示す電気泳動像の図である。
【００４６】
Ｍ：分子量マーカー
レーン１〜４は、リステリアモノサイトゲネス接種区を示し、リステリア接種量は次の通り。
１：１６ＣＦＵ／２５ｇ、２：１．６ＣＦＵ／２５ｇ、３：０．１６ＣＦＵ／２５ｇ、４：０．０２ＣＦＵ／２５ｇ
レーン５〜８は、サルモネラ属菌接種区を示し、サルモネラ属菌接種量は次の通り。
５：１１０ＣＦＵ／２５ｇ、６：１１ＣＦＵ／２５ｇ、７：１．１ＣＦＵ／２５ｇ、８：０．１１ＣＦＵ／２５ｇ
レーン９〜１２は、病原性大腸菌Ｏ１５７接種区を示し、Ｏ１５７接種量は次の通り。
９：８５０ＣＦＵ／２５ｇ、１０：８．５ＣＦＵ／２５ｇ 、１１：８．５ＣＦＵ／２５ｇ 、１２：０．８５ＣＦＵ／２５ｇ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品に存在する病原性大腸菌Ｏ１５７、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで、公定法と同等又はそれ以上の高い感度で検出することができる微生物の多重検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、マルチプレックスＰＣＲを利用する微生物の多重検出方法は、よく知られている。例えば、野菜・果実を対象として病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌を多重検出する方法（例えば、非特許文献１参照）、食品中の病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌を多重検出する方法（例えば、非特許文献２参照）、牛乳を対象として病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネス、カンピロバクター属菌の各菌を多重検出する方法（例えば、非特許文献３参照）、食品中のサルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを多重検出する方法（例えば、非特許文献４参照）、食品中の病原性大腸菌Ｏ１５７等の大腸菌を多重検出する方法（例えば、非特許文献５参照）、牛乳を対象として病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌を多重検出する方法（例えば、非特許文献６参照）などが報告されている。また、マルチプレックスＰＣＲ用のプライマーとして、大腸菌の検出用プライマー（例えば、特許文献１参照）、病原性大腸菌Ｏ１５７のＯ抗原検出用プライマー（例えば、特許文献２参照）も知られている。
【０００３】
他方、微生物のＤＮＡを抽出する方法として、結核菌等のマイコバクテリウムに溶菌酵素アクロモペプチダーゼ等を用いる方法（例えば、特許文献３参照）、グラム陰性、陽性菌に溶菌酵素アクロモペプチダーゼ等を用いる方法（例えば、特許文献４参照）、レジオネラ菌にプロテアーゼＫやアクロモペプチダーゼ等を用いる方法（例えば、特許文献５参照）、大腸菌などにタンパク変性剤、還元剤、界面活性剤、キレート剤等を用いる方法（例えば、特許文献６参照）などが知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−９５５７６号公報
【特許文献２】特開平１１−３３２５９９号公報
【特許文献３】特開平６−１６５６７６号公報
【特許文献４】特表平９−５００７９３号公報
【特許文献５】特開平５−３１７０３３号公報
【特許文献６】特開平６−２８９０１６号公報
【非特許文献１】Japanese Journal of Food Microbiology, Vol.19, No2, 47-55, 2002
【非特許文献２】Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 21, 92-98, 1998
【非特許文献３】Milchwissenschaft, 55 (9), 500-503, 2000
【非特許文献４】Journal of Food Protection, Vol.64, No11, 1744-1750，2001
【非特許文献５】Molecular and Cellular Probes, 13, 291-302, 1999
【非特許文献６】Food Microbiology, 20, 345-350, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
１種類の微生物をＰＣＲ法によって検出する方法は既に確立されているが、複数の微生物をＰＣＲ法で同時に検出する方法は、食品分野で検討されつつあるものの、未だ十分に信頼できる方法は確立されていないというのが現状である。本発明の課題は、食品に存在する病原性大腸菌Ｏ１５７、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の汚染微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで、公定法と同等又はそれ以上の高い感度で検出することができる微生物の多重検出方法を提供することにある。すなわち、複数の対合プライマーを組み合わせて行うＰＣＲ法として知られているマルチプレックスＰＣＲを用いて、病原性大腸菌Ｏ１５７、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の汚染微生物を簡便に、かつ高い感度で再現性よく検出することができる微生物の多重検出方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（培養）
危害の高い病原菌は、食品中で「陰性」（２５ｇ中に含まれていないこと）であることが定められており、その検出には、公定法と同等以上の精度が求められる。食品２５ｇ中１ＣＦＵレベルの微量に汚染した微生物を検出するためには、増菌培養が不可欠である。増菌培養する場合、通常、対象の病原菌ごとに個別に選択性のある培地を使用して培養するが、同時に数種の微生物を検出するために、増菌についても、１種の培地で複数の微生物を同時に増殖させるための検討を行った。なるべく短時間（例えば、２４時間以内）で検出できる培養条件を設定するが好ましく、そのためには、特に培地の選択が重要となる。同時に増菌することは、対象微生物同士が同科あるいは同属菌種、または発育特性が似ていれば比較的容易であるが、異種で発育特性が異なる微生物の場合は難しい。例えば、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを検出対象とした場合、これら病原菌３菌種中で、サルモネラ、Ｏ１５７に比べて、低温発育性であるリステリアは増殖が遅いという問題があった。
【０００７】
そこで、他の細菌が混在した中でも、特にリステリアが十分に増殖できるように、リステリアにとって好ましい栄養源を持つ培地で、炭水化物が少なく、緩衝能が高い培地について検討したところ、培地Ｎｏ．１７（トリプトース１０ｇ、肉エキス５ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース０．５ｇ、リン酸ニナトリウム７ｇ、リン酸一カリウム１５ｇ／１Ｌ中）は、トリプトソーヤブイヨンやＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）、ＢＰＷ（Buffered peptone Water）よりも３種混在中でリステリアの増殖が最も良く、サルモネラとＯ１５７もリステリアより増殖が早かった。このことから、３種同時に検出するためには培地Ｎｏ．１７が良いと考えられた。
【０００８】
（ＤＮＡ）
ＰＣＲ反応を行う際、ＤＮＡの抽出を行うが、ＤＮＡの抽出では溶菌操作が必要となる。グラム陽性細菌の溶解は、より厚くより高密度なペプチドグリカン層が主要細菌細胞壁成分であるため、グラム陰性細菌よりもかなり困難である。今回の技術ではサルモネラ、Ｏ１５７などのグラム陰性菌に加え、リステリアというグラム陽性菌も同時に検出する、という点で困難であった。また、食品からの抽出という点では、食品残渣は多様性なものであり、溶菌法を１種類に特定するのは困難である。特に畜肉などに代表される検体では高タンパク、高脂肪、かつ個体差があるので、溶菌が一定の効率で行われないという、ＤＮＡ抽出の上での困難性が存在した。さらに検討したところ、トリプトソーヤブイヨン、ミューラーヒントンブロスなど、培養する培地の違いによって、リゾチームだけでは細胞が壊れない（＝ＤＮＡが抽出できない）リステリアがあった。培養条件は、たとえ同じ培地を使用しても食品の種類が異なったり、損傷程度が異なることで変わってくると考えられる。また、場合によっては、より回復の良い培地を用いる必要性があるため、どのような場合でも細胞が壊れる抽出方法が必要であった。
【０００９】
一般的なＤＮＡ抽出法として、ボイル法やアルカリ−ＳＤＳ法が知られているが、ボイル法ではリステリアが高感度に抽出できないことを確認した。ＳＤＳは、ＤＮＡ抽出において使用しやすい界面活性剤として知られているが、強力なＰＣＲ阻害剤であるため、抽出に用いた後には、完全に除去しなければならない。未習熟な実験者においても熟練者と同様の効果と結果が得られるようにするためには、ＳＤＳのように低濃度の混入でも反応に影響を与える物質は好ましくなく、ＳＤＳは熟練者との抽出効率差が現われる原因になりうる危害要因と判断した。また、フェノール、クロロホルムは、危険で人体に有害な有機溶媒であり、この処理を行うことによってＤＮＡの精製度は良くなるが、抽出効率に技術的な個人差が現われることが容易に想像でき、一定の感度が保障できない。また、特別な廃液処理が必要となることから、食品製造現場での検査法には適合しない抽出法であるということもできる。そこで、未習熟・熟練者においても操作が容易であり、かつＤＮＡの抽出効率（言い換えれば検出感度）が一定であることが期待でき、さらに、食品製造現場で実行できる簡便さ・安全さを備えており、畜肉に代表される高タンパクな食品からもＤＮＡ抽出が可能な方法を開発する必要性があった。
【００１０】
培養液を５μｍのフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除き、その後溶菌酵素液（アクロモペプチターゼとリゾチームの混合液）を混合し、３７℃で１時間処理後、界面活性剤［ツィーン２０（Tween２０）］とタンパク質変性剤（グアニジンイソチオシアネート）の混合液を加えて完全に菌体を溶解できることがわかった。また、アクロモペプチダーゼの代わりにエンテロリシンのような溶菌活性を持つバクテリオシンを利用しても完全に菌体を溶解できることがわかった。遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿を行いＤＮＡを抽出した。処理の順番はアクロモペプチターゼがリゾチームより先、もしくは一緒に行い、あるいはエンテロリシンがリゾチームより先、もしくは一緒に行い、その後ツィーン２０処理後、グアニジンイソチオシアネート処理、もしくはツィーン２０とグアニジンイソチオシアネート処理を一緒に行うことが極めて好ましいことがわかった。ツィーン２０は粘性が高く、単独で加えることが難しいため混合添加することが望ましいこともわかった。
【００１１】
また、フェノール、クロロホルム処理を行わなくても、アルコール沈殿やＤＮＡ抽出液添加量（ＰＣＲ反応液５０μｌに対し２μｌ）によって、ＰＣＲで問題なく検出できる程度に可溶化したタンパク質を除くことができた。ツィーン２０はＰＣＲ反応液にも使われるもので、ＳＤＳに比べ阻害が少なく、未習熟な実験者でも扱いが容易であると考えられた。また、もちろん、この抽出法はおのおの単独菌種での抽出においても可能である。さらに、（１）アクロモペプチターゼ単独、（２）リゾチーム単独、（３）エンテロリシン単独、（４）アクロモペプチターゼ処理後グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理、（５）リゾチーム処理後グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理、（６）エンテロリシン処理後グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理、（７）プロテイナーゼＫ、（８）プロテイナーゼＫ処理後グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理、（９）グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理、（１０）グアニジンイソチオシアネート＋ツィーン２０処理＋加熱処理、の各方法についても試みたが、これらいずれの方法も、アクロモペプチターゼとリゾチームで併用処理し、あるいはエンテロリシンとリゾチームで併用処理し、その後ツィーン２０とグアニジンイソチオシアネートで処理する前記方法の方が、リステリアの高感度の抽出において優れていた。
【００１２】
（ＰＣＲ反応）
数種の菌を同時に検出する方法としてマルチプレックスＰＣＲを採用した。複数の対合プライマーを組み合わせて行うＰＣＲ法であるマルチプレックスＰＣＲ法には、互いにプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりすることがなく、融解温度の近い対合プライマーを選定して用いた。プライマーの選択や混合割合により、反応のしやすさ、検出限界に差が出てくることもわかった。マルチプレックスＰＣＲを行う場合には、その後の判定に用いる電気泳動像に３菌種のバンドが同じような濃さで検出するようにプライマーの混合割合を調整する必要がある。３菌種が同じＤＮＡ濃度（２０ｐｇ）のとき、３種菌のバンドが同様の濃さで検出できるよう、調整した。例えば、プライマーとして、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡを使用した場合、６種のプライマーの混合割合は、サルモネラ用プライマー各１２０ｎＭ、リステリア用プライマー各１００ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各８０ｎＭが、配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡを使用した場合、サルモネラ用プライマー各６０ｎＭ、リステリア用プライマー各６０ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各２４０ｎＭが最も理想的な配合量であった。さらに低濃度の混合割合である、サルモネラ用プライマー各３０ｎＭ、リステリア用プライマー各２５ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各２０ｎＭ（配列番号１〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡ使用時）、あるいは、サルモネラ用プライマー各１５ｎＭ、リステリア用プライマー各１５ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各６０ｎＭ（配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡ使用時）においても検討したが、電気泳動による目視での検出が可能ではあるが困難であったことから、上記濃度が好ましいことがわかった。
【００１３】
また、ＰＣＲ反応では、最終産生量が１０−８Ｍ程度まで標的遺伝子を増幅できることが知られている。ＰＣＲ反応では通常１菌種につき２００ｎＭ程度のプライマーを加えて行うが、多重検出の場合、各菌種についてこのプライマー量を加えることは明らかに過剰であることがわかった。特にマルチプレックス反応の場合、その過剰なプライマーによる生成産物（これは非標的産物を含む）により優位な反応のみが結果として得られる可能性が高い。このため、ＰＣＲ反応においてプライマー量を制限することで最終産物量を制限することとマルチプレックス反応との関係を考慮した。もちろん、ＰＣＲ反応にはプライマーダイマーなどを代表とする非増幅産物もプライマーを消費するため、下限の濃度は存在するが、検出器の感度最低限のプライマー濃度を設定することにより、より複数のマルチプレックス反応を成功させる可能性が期待できることもわかった。言い換えれば、プライマーの下限の濃度を検出器の感度に合わせることで、より複数の検出が期待できる。電気泳動や蛍光プローブ法、キャピラリー電気泳動法などによる検出器の限界を考慮した上で、５０ｎＭ程度以上での反応を行わざるを得ず、３種類の病原菌の検出を確認したが、検出器の感度上昇によってこの濃度を低く設定することができ、より多くの標的を一度に検出できると考えられる。より高感度な増幅産物検出法が実現した際には上記の考えを踏まえた上で最終産物量を制御することにより、より多数のマルチプレックスＰＣＲによる多重同時検出を実現できることもわかった。
【００１４】
すなわち本発明は、（１）食品中の２種以上の異なる特性の微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い感度で検出する方法であって、
（Ａ）少なくとも、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程と、
（Ｂ）検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程と
を含むことを特徴とする微生物の多重検出方法や、（２）検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程の前に、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が２４時間培養後に１０3ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件下で培養する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の微生物の多重検出方法や、（３）２種以上の異なる特性の微生物が、リステリアモノサイトゲネスを含むことを特徴とする上記（１）又は（２）記載の微生物の多重検出方法や、（４）特異的なプライマーが、配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする上記（３）記載の微生物の多重検出方法や、（５）２種以上の異なる特性の微生物が、病原性大腸菌Ｏ１５７を含むことを特徴とする上記（１）又は（２）記載の微生物の多重検出方法や、（６）特異的なプライマーが、配列番号１及び２、又は配列番号７及び８に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項５記載の微生物の多重検出方法や、（７）２種以上の異なる特性の微生物が、サルモネラ属菌を含むことを特徴とする上記（１）又は（２）記載の微生物の多重検出方法や、（８）特異的なプライマーが、配列番号３及び４、又は配列番号９及び１０に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする上記（７）記載の微生物の多重検出方法に関する。
【００１５】
また本発明は、（９）培養後のｐＨが５．１以上となる培養条件下で培養することを特徴とする上記（１）〜（８）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１０）グルコース濃度が０．１５％以下の培地、及び／又は、リン酸緩衝液の濃度が５０ｍＭ以上若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養することを特徴とする上記（１）〜（９）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１１）溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿によりＤＮＡを析出して抽出することを特徴とする上記（１）〜（１０）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１２）溶菌酵素が、アクロモペプチダーゼ及び／又はリゾチームであることを特徴とする上記（１）〜（１１）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１３）溶菌活性を持つバクテリオシンが、エンテロリシンであることを特徴とする上記（１）〜（１２）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１４）界面活性剤が、ソルビタンモノラウラートのエチレンオキシド縮合物であることを特徴とする上記（１）〜（１３）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１５）タンパク質変性剤が、グアニジンイソチオシアネートであることを特徴とする上記（１）〜（１４）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１６）プライマーとして、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡを合計７５０ｎＭ以下の濃度で組み合わせてマルチプレックスＰＣＲを行うことを特徴とする上記（１）〜（１５）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１７）プライマーとして、配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡを合計７５０ｎＭ以下の濃度で組み合わせてマルチプレックスＰＣＲを行うことを特徴とする上記（１）〜（１５）のいずれか記載の微生物の多重検出方法や、（１８）食品が、食肉又は食肉加工品であることを特徴とする上記（１）〜（１７）のいずれか記載の微生物の多重検出方法に関する。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、食品に存在する病原性大腸菌Ｏ１５７、リステリアモノサイトゲネス、サルモネラ属菌等の微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等又はそれ以上の高い感度で簡便に検出することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の微生物の多重検出方法としては、食肉、食肉加工品、牛乳、野菜等の食品中の２種以上の異なる特性の微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い感度で検出する方法であって、（Ａ）少なくとも、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程と、（Ｂ）検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程とを含む方法であれば特に制限されないが、上記（Ａ）の検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程の前に、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が２４時間培養後に１０3ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件下で培養する工程を含むことが好ましい。また、検出対象の微生物としては、食品の汚染微生物であればどのようなものでもよく、リステリアモノサイトゲネス、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、カンピロバクター属菌、腸炎ビブリオ、黄色ブドウ球菌、エルシニア属菌、大腸菌群、セレウス菌、コレラ菌、赤痢菌、ボツリヌス菌などを具体的に例示することができる。また、公定法としては、「食品衛生検査指針」（１９９０年 社団法人 日本食品衛生協会）に説明されている方法をいい、具体例が実施例９において説明されている。
【００１８】
本発明の微生物の多重検出方法によると、食品２５ｇ中１ＣＦＵレベルの微量に汚染した微生物を検出することが可能となるが、本発明の微生物の多重検出方法においては、食品汚染微生物の培養工程が極めて重要である。食品汚染微生物の増菌培養における培養条件としては、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が４８時間培養後、好ましくは３０時間培養後、特に好ましくは２４時間培養後、中でも１８時間培養後に１０３ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件を挙げることができるが、さらに緩衝能を有する培地を用いて培養後のｐＨが５．１以上となる培養条件下で培養することや、グルコース濃度が０．１５％以下の培地、及び／又は、リン酸緩衝液の濃度が５０ｍＭ以上若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養するのが好ましい。リン酸緩衝液以外の緩衝液としては、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、乳酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液を挙げることができる。
【００１９】
本発明の微生物の多重検出方法においては、培養増殖させた食品汚染微生物からのＤＮＡ抽出工程が必須とされる。かかるＤＮＡ抽出工程としては、少なくとも、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程であれば特に制限されないが、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿によりＤＮＡを析出して抽出する方法を好適に例示することができる。上記溶菌酵素としては、アクロモペプチダーゼ、リゾチーム、プロテアーゼＫ、キトサナーゼ、キチナーゼ、β−１，３−グルカナーゼ、ザイモリアーゼ、セルラーゼ等を挙げることができ、溶菌活性を持つバクテリオシンとしては、エンテロリシン、ヘルベティシンを挙げることができる。これらは１種又は２種以上用いることができるが、中でもアクロモペプチダーゼ、リゾチーム、エンテロリシンやこれらの組合せ、例えば、アクロモペプチダーゼとリゾチームとの併用、エンテロリシンとリゾチームとの併用を好適に例示することができる。上記界面活性剤としては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界面活性剤を挙げることができ、中でも非イオン界面活性剤であるソルビタンモノラウラートのエチレンオキシド縮合物、より具体的には、ツィーン２０を好適に挙げることができる。上記タンパク質変性剤としては、グアニジンイソチオシアネート、尿素、塩酸グアニジン、トリクロロ酢酸、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、デオキシコール酸等を挙げることができ、これらは１種又は２種以上用いることができるが、中でも溶菌効果や取扱い易さの点でグアニジンイソチオシアネートが好ましい。溶菌物からのＤＮＡの抽出・析出は、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿を行うなど、公知の方法により行うことができる。
【００２０】
本発明の微生物の多重検出方法においては、前記抽出したＤＮＡと、検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程が必須とされる。使用するプライマーとしては、検出対象微生物特異的なプライマーであって、互いにプライマーダイマーを生成したり、識別バンドが互いに干渉したり、重複したりすることがなく、融解温度の近い対合プライマーを選択することが好ましい。また、その後の判定に用いられる電気泳動像に出現するバンドが同じような濃さで検出しうるようにプライマーの混合割合を調整することが好ましい。例えば、病原性大腸菌Ｏ１５７に特異的なプライマーセットとしては、配列番号１及び２、配列番号７及び８、配列番号１１及び１２、配列番号１３及び１４などに示される塩基配列からなるＤＮＡが、サルモネラ属菌に特異的なプライマーセットとしては、配列番号３及び４、配列番号９及び１０、配列番号１５及び１６などに示される塩基配列からなるＤＮＡが、リステリアモノサイトゲネスに特異的なプライマーセットとしては、配列番号５及び６、配列番号１７及び１８、配列番号１９及び２０などに示される塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができ、これらを組み合わせて用いることができるが、中でも配列番号１〜６又は配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡの組み合わせが最も好ましく、この場合、合計７５０ｎＭ以下の濃度でプライマーを混合することが好ましく、また配列番号１〜６を用いた場合、６種のプライマーの混合割合はサルモネラ用プライマー各１２０ｎＭ、リステリア用プライマー各１００ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各８０ｎＭが、配列番号５〜１０を用いた場合、サルモネラ用プライマー各６０ｎＭ、リステリア用プライマー各６０ｎＭ、Ｏ１５７用プライマー各２４０ｎＭが最も好ましい。
【００２１】
ＰＣＲ後の検出法としては、電気泳動法、蛍光プローブ法、キャピラリー電気泳動法、定量ＰＣＲ法などにより行うこともできる。特に、定量ＰＣＲの場合は、プライマーとして配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡを用い、蛍光プローブに配列番号２１〜２３で示される塩基配列からなるＤＮＡを用いることにより検出することができる。
【００２２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２３】
（既存培地での同時培養）
病原性大腸菌Ｏ１５７はEscherichia coli Ｏ１５７：Ｈ７ ＡＴＣＣ４３８９４、サルモネラ属菌はSalmonella enteritidis ＩＦＯ３３１３、リステリアモノサイトゲネスはListeria monocytogenes ＡＴＣＣ４９５９４を用いた。また、肉由来菌には、シュードモナス（Pseudomonas fragi）、シトロバクター（Citrobacter freundii）、ラクトバチルス（Lactobacillus viridescens）、ロイコノストック（Leuconostoc mesenteroides）の４株を用いた。試験培地にはトリプトソーヤブイヨン（ＴＳＢ；日水製薬社製）、及び、Buffered Peptone Water（ＢＰＷ；ペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、リン酸一水素ナトリウム３．５ｇ、リン酸ニ水素カリウム１．５ｇ／１Ｌ）の２つの培地を用いた。
【００２４】
病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを各１ＣＦＵ／１００ｍｌ、肉由来菌を各１０４ＣＦＵ／１００ｍｌになるように試験培地に接種した。３５℃で培養し、経時的に一般生菌数、Ｏ１５７数、サルモネラ数、リステリア数を計測した。一般生菌数は標準寒天培地（日水製薬社製）を用い、３５℃で４８時間培養後の総コロニー数、Ｏ１５７数はデソキシコレート寒天培地（日水製薬社製）を用い、３５℃で２４時間培養後の大腸菌様のコロニー数、サルモネラ数はＭＬＣＢ寒天培地（日水製薬社製）を用い、３５℃で２４時間培養後のサルモネラ様のコロニー数、リステリア数はＰＡＬＣＡＭ寒天培地（Merck社製）を用い、３５℃で４８時間培養後のリステリア様のコロニー数をそれぞれ測定した。結果を図１に示す。その結果、いずれの培地でも特にリステリアモノサイトゲネスの増殖が弱かった。培養液のｐＨを測定したところ、ｐＨの低下が認められた。
【実施例２】
【００２５】
（培地の緩衝能および糖濃度の影響）
実施例１でリステリアモノサイトゲネスの増殖が弱かったのは培養後の培地のｐＨが低下したことが原因と考えられたため、各菌の増殖に及ぼす培地の緩衝能および糖濃度の影響を調査した。基本培地（トリプトース１０ｇ、肉エキス５ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ／１Ｌ中）に、リン酸ニナトリウムおよびリン酸一カリウムを加えてリン酸濃度を１５ｍＭから２００ｍＭまで調整し（ｐＨ６．３）、グルコースの濃度を０％から０．２５％まで変化させて加えて、試験培地を作製した。実施例１で使用した、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを各１ＣＦＵ／１００ｍｌ、肉由来菌を各１０４ＣＦＵ／ｍｌになるように各試験培地に接種した。３５℃で培養し、１８、２４、３０、４８時間後の一般生菌数、Ｏ１５７数、サルモネラ数、リステリア数、ｐＨを計測した。結果を表１に示す。
【００２６】
その結果、グルコース濃度０．１５％以下の培地、またはリン酸濃度５０ｍＭ以上の培地、または培養後のｐＨを５．１以上に保持する培地を用いることによって病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスとも１８時間以上培養することで１０３ＣＦＵ／ｍｌ以上（ＰＣＲでの検出に必要な菌数）に増殖した。以降の試験には表１のＮｏ．１７の培地（トリプトース１０ｇ、肉エキス５ｇ、酵母エキス５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、グルコース０．５ｇ、リン酸ニナトリウム７ｇ、リン酸一カリウム１５ｇ／１Ｌ中）を選定した。培地成分については、検出の目的とする細菌の存在環境や損傷程度に応じて、トリプトース、肉エキス、酵母エキス以外の窒素源、グルコース以外の炭素源、リン酸以外の緩衝能を持つ物質も有効であり、また、増殖を促進する物質として無機塩類やピルビン酸もしくはピルビン酸塩、ツィーンなどの界面活性剤を添加した方がより好ましかった。
【００２７】
【表１】
【実施例３】
【００２８】
（ＤＮＡ抽出方法１）
病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌をＮｏ．１７培地１０ｍｌに接種し、３５℃で１８時間培養した。各培養液をそれぞれ１ｍｌチューブに取り、１５，０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離を行い、菌体を回収した。その菌体回収物に溶菌酵素液｛２０ｍｇ／ｍｌのアクロモペプチダーゼ１０μｌと２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム１０μｌとＴＥバッファー［１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸緩衝液、ｐＨ８］１８０μｌの混合液｝を加え、３７℃で１時間処理後、溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を３００μｌ加えて完全に菌体を溶解した。この溶液を光学顕微鏡で観察したところ、溶菌が十分に行われていることが確認できた。この溶液を１５，０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離し、上澄み４００μｌを別のチューブに移し、溶液中のＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させた後、遠心分離して目的のＤＮＡを得た。また、アクロモペプチダーゼの代わりに、エンテロリシンを用いても、同様に溶菌が十分に行われていることが確認できた。
【実施例４】
【００２９】
（ＤＮＡ抽出方法２）
同様に、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌をＮｏ．１７培地１０ｍｌに接種し、３５℃で１８時間培養した。各培養液をそれぞれ１ｍｌチューブに取り、１５，０００ｒ．ｐ．ｍで５分間遠心分離を行い、菌体を回収した。その菌体回収物に溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を５００μｌ加え、回収物を溶解した。１００℃で１０分間加熱し、５分間氷冷した。この溶液を光学顕微鏡で観察したところ、病原性大腸菌Ｏ１５７やサルモネラ属菌は溶菌できていたが、実施例３のＤＮＡ抽出方法に比べるとリステリアモノサイトゲネスの溶菌の程度が少し劣っていた。また、リステリアモノサイトゲネスの溶菌を、1)菌体回収物に２０ｍｇ／ｍｌのアクロモペプチダーゼ１０μｌとＴＥバッファー１９０μｌの混合液を加え、３７℃で１時間処理した液、2)菌体回収物に２０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム１０μｌとＴＥバッファー１９０μｌの混合液を加え、３７℃で１時間処理した液、3)菌体回収物にエンテロリシン１０μlとＴＥバッファー１９０μｌの混合液を加え、３７℃で１時間処理した液、 4)上記1)液に、溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を３００μｌ加え混合した液、5)上記2)液に、溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を３００μｌ加え混合した液、6)上記3)液に、溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を３００μｌ加え混合した液、7)菌体回収物に２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ１μｌとＴＥバッファー２００μｌの混合液を加え、３７℃で１時間処理した液、8)上記7)液に、溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）を３００μｌ加え混合した液、9)菌体回収物に溶菌剤（ツィーン２０を１〜２％添加した４Ｍグアニジンイソチオシアネート溶液）５００μｌを加え混合した液をそれぞれ用いて行い、光学顕微鏡で観察を行ったが、いずれもリステリアモノサイトゲネスの溶菌の程度が実施例３のＤＮＡ抽出方法に比べると少し劣っていた。
【実施例５】
【００３０】
（ＰＣＲ反応の条件設定）
実施例３で得たＤＮＡ抽出液を用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、次のプライマーから、検出対象微生物毎に特異的なプライマーを１セットずつ選択して用いた。
配列番号１：GGC GGA TTA GAC TTC GGC TA
配列番号２：CGT TTT GGC ACT ATT TGC CC
配列番号３：GGG AGT CCA GGT TGA CGG AAA ATT T
配列番号４：GTC ACG GAA GAA GAG AAA TCC GTA CG
配列番号５：CGG AGG TTC CGC AAA AGA TG
配列番号６：CCT CCA GAG TGA TCG ATG TT
配列番号７：ATC ATT GAC GAT TGT AGC ACC
配列番号８：ACA TGA GGA GCA TTA ACT TCG
配列番号９：GGG TCG TTC TAC ATT GAC AG
配列番号１０：TTC CCT TTC CAG TAC GCT TC
配列番号１１：GTA TTT GGA GAC ATG GGA GC
配列番号１２：ACT AAT GAC ACG ATT CGT TCC
配列番号１３：CGG ACA GTA GTT ATA CCA C
配列番号１４：CTG CTG TCA CAG TGA CAA A
配列番号１５：AGC TTT GGT CGT AAA ATA AGG
配列番号１６：GAT GCC CAA AGC AGA GAG AT
配列番号１７：CAA ACT GCT AAC ACA GCT ACT
配列番号１８：GCA CTT GAA TTG CTG TTA TTG
配列番号１９：ACC AAT GGG ATC CAC AAG A
配列番号２０：GAG CTG AGC TAT GTG CGA T
【００３１】
ＰＣＲ反応液は、１０×Ｂｕｆｆｅｒ５μｌ、ｄＮＴＰ溶液４μｌ、ＵＮＧ０．５μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ０．２５μｌ、ＭｇＣｌ２ １０μｌ（いずれも、アプライドバイオシステムズジャパン社製）、プライマー、ＤＮＡ抽出液２μｌに滅菌水を加えて合計５０μｌとした。反応条件は５０℃で２分保持後、９５℃で１０分反応させた後、９５℃・２０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３０秒を４０回繰り返し、７２℃で７分保持後、４℃で保管した。ＰＣＲ産物は２．５％アガロースゲル電気泳動で確認した。配列番号１〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡを組み合わせる場合、プライマーの混合割合は病原性大腸菌Ｏ１５７用プライマー（配列番号１、２）各８０ｎＭ、サルモネラ属菌用プライマー（配列番号３、４）各１２０ｎＭ、リステリアモノサイトゲネス用プライマー（配列番号５、６）各１００ｎＭが最も理想的な配合量であった。例えば、さらに低濃度の混合割合である、病原性大腸菌Ｏ１５７用プライマー各２０ｎＭ、サルモネラ属菌用プライマー各３０ｎＭ、リステリアモノサイトゲネス用プライマー各２５ｎＭにおいても検討したが、アガロース電気泳動による目視での検出は可能ではあるが多少困難であった。また、配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡを用いた場合、プライマー混合割合は病原性大腸菌Ｏ１５７用プライマー（配列番号７、８）各２４０ｎＭ、サルモネラ属菌用プライマー（配列番号９、１０）各６０ｎＭ、リステリアモノサイトゲネス用プライマー（配列番号５、６）各６０ｎＭが最も理想的な配合量であった。その他の病原性大腸菌Ｏ１５７用プライマー（配列番号１１、１２もしくは配列番号１３、１４）、サルモネラ属菌用プライマー（配列番号１５、１６）、リステリアモノサイトゲネス用プライマー（配列番号１７、１８又は配列番号１９、２０）についてもそれぞれ混合割合を調整することにより利用できることがわかった。
【００３２】
また、配列番号５〜１０の組み合わせでは、それぞれの内部配列に特異的な配列番号２１〜２３を蛍光色素で標識したプローブを用いることによって、定量ＰＣＲもしくはハイブリダイゼーション等による検出手法において検出できることがわかった。
配列番号２１：CGG ATG ATT TGT GGC ACG AGA AA
配列番号２２：TCT GGC ATT ATC GAT CAG TAC CAG CC
配列番号２３：AGT TCA AAT CAT CGA CGG CAA CCT CGG A
【実施例６】
【００３３】
（反応特異性の確認）
表２に示した病原性大腸菌Ｏ１５７を４株、サルモネラ属菌４株、リステリアモノサイトゲネス１０株、病原性大腸菌Ｏ１５７以外のEscherichia coli４株、リステリアモノサイトゲネス以外のリステリア属４株を用いて特異性の確認を行った。各菌株をトリプトソーヤブイヨン（日水製薬社製）で３５℃１８時間培養し、方法１として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にアクロモペプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号１〜６の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法２として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にエンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号５〜１０の組み合わせを用いた方法を行った。ＰＣＲ反応の結果を２．５％アガロースゲル電気泳動で確認したところ、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスでは電気泳動像の所定の位置にバンドが検出し、陽性であることが示された。一方、病原性大腸菌Ｏ１５７以外のEscherichia coli、リステリアモノサイトゲネス以外のリステリア属では、バンドが検出せず、陰性菌であることが示され、特異性に問題がないことを確認した。結果を表２に示した。
【００３４】
【表２】
【実施例７】
【００３５】
（肉成分混在系での検出限界の確認）
実施例１記載の病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを用いた。各菌を前記Ｎｏ．１７培地１０ｍｌに接種し、３５℃で１８時間培養を行い、菌株培養液を得た。また、鶏もも挽肉２５ｇにＮｏ．１７培地２２５ｍｌを加え、３０秒間ストマッカーで粉砕し、３５℃で１８時間培養した。この時の培養液の一般生菌数は３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌであった。鶏もも挽肉の培養液を９ｍｌずつ分注し、これに各菌株培養液の１０倍段階希釈液１ｍｌをそれぞれ添加し、各菌株培養液の各希釈系列の肉試料液を作製した。それぞれの試料液を５μｍのフィルターを通し大きな食品くずを取り除いた後、方法１として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にアクロモペプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号１〜６の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法２として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にエンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号５〜１０の組み合わせを用いた方法を行った。それぞれ２．５％アガロースゲル電気泳動により確認した結果、肉試料液での病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの検出限界は、いずれも１０３ＣＦＵ／ｍｌであることを確認した。代表して方法１の結果の電気泳動図を図２に示した。
【実施例８】
【００３６】
（接種した食品からの病原菌の検出）
実施例１記載の病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスを用いた。豚挽肉に各菌株が１０２ＣＦＵ／２５ｇ、１０ＣＦＵ／２５ｇ、１ＣＦＵ／２５ｇ、１０−１ＣＦＵ／２５ｇになるようそれぞれ接種した。接種した豚挽肉２５ｇにＮｏ．１７培地を２２５ｍｌ加え、ストマッカーで３０秒粉砕し、３５℃で２４時間培養した。各培養液を５μｍのフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除いた後、方法１として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にアクロモペプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号１〜６の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法２として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にエンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号５〜１０の組み合わせを用いた方法を行った。それぞれ、２．５％アガロースゲル電気泳動により確認した。代表して方法１の結果を図３に示す。その結果、いずれの菌株も１ＣＦＵ／２５ｇ存在すればいずれの方法でも検出できることを確認した。病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスなどの危害の高い病原菌は、食品中で「陰性」（２５ｇ中に含まれていないこと）であることが定められており、その検出には、公定法と同等以上の精度が求められる。本多重検出法は、公定法と同等以上の精度があることが確認された。
【実施例９】
【００３７】
（公定法と多重検出法との比較試験；市販食品からの病原菌の検出）
鶏肉や鶏肝など、２０検体をスーパーから購入し、病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの検査を多重検出法により行うとともに公定法と比較した。また、公定法は、次の通りに行った。
【００３８】
病原性大腸菌Ｏ１５７については、検体２５ｇにノボビオシン加ｍＥＣブロス（極東製薬工業社製）２２５ｍｌを加え、ストマッカーで３０秒粉砕した後、４２℃で１８時間培養し、クロモアガーＯ１５７培地（関東化学社製）およびマッコンキーソルビトール寒天培地（日水製薬社製）に画線し、３５℃で１８〜２４時間培養した。クロモアガーＯ１５７培地で藤色、マッコンキーソルビトール培地で半透明のピンク色を示したものを病原性大腸菌Ｏ１５７擬陽性とし、ＣＬＩＧ寒天培地（極東製薬工業社製）に画線し、３５℃で１８〜２４時間培養した。下層が黄色く、上層がピンクでかつ紫外放射により発光しないものを病原性大腸菌Ｏ１５７擬陽性とし、インドール反応を行い、陽性（赤）のものについて凝集反応を行った。凝集反応は大腸菌Ｏ１５７検出キット「ＵＮＩ」（Oxoid社製）を用いて行った。凝集反応で疑わしいコロニーをクロモアガーＯ１５７培地、マッコンキーソルビトール寒天培地、ＴＳＩ寒天培地（日水製薬社製）、ＬＩＭ培地（日水製薬社製）に画線し、３５℃で２４時間培養した。クロモアガーＯ１５７培地で藤色、マッコンキーソルビトール寒天培地で半透明のピンク色、ＴＳＩ寒天培地で黄色、ＬＩＭ培地で無変化のものについてＰＣＲ反応により病原性大腸菌Ｏ１５７であることを確認した。
【００３９】
サルモネラ属菌については、検体２５ｇにＥＥＭブイヨン（日水製薬社製）２２５ｍｌを加え、ストマッカーで３０秒粉砕した。３５℃で１８時間培養し、セレナイトシスチン基礎培地（日水製薬社製）１０ｍｌに１ｍｌ加え、４３℃で１５〜１８時間培養した。全体あるいは沈殿が赤色を呈したものについて、１白金耳をＭＬＣＢ寒天培地（日水製薬社製）に画線し、３５℃で２４時間培養後、黒色のコロニーを生じたものをサルモネラ属菌擬陽性とし、確認試験として、ＴＳＩ寒天培地、ＬＩＭ培地に画線した。３５℃、２４〜４８時間培養し、ＴＳＩ培地で斜面が赤く高層が黒色で、ＬＩＭ培地で無変化のものをサルモネラ属菌陽性とした。
【００４０】
リステリアモノサイトゲネスについては、検体２５ｇにＵＶＭリステリア選択増菌ブイヨン（Merck社製）２２５ｍｌを加え、ストマッカーで３０秒粉砕した。３０℃で４８時間培養し、ＰＡＬＣＡＭリステリア選択寒天培地（Merck社製）に１白金耳画線した。３５℃で４８時間培養し、リステリア属陽性と判定されたものについて、馬血液寒天培地（日水製薬社製）、標準寒天培地（日水製薬社製）に画線して、３５℃、２４〜４８時間培養した。溶血性が陽性のものについてオキシダーゼ反応、カタラーゼ反応、グラム染色、顕微鏡観察、アピリステリア（日本ビオメリュー社製）を行い、リステリアモノサイトゲネスと同定されたものをリステリアモノサイトゲネス陽性とした。
【００４１】
多重検出法については次のように行った。検体２５ｇに、Ｎｏ．１７培地を２２５ｍｌ加え、ストマッカーで３０秒粉砕し、３５℃で２４時間培養した。培養液を５μｍのフィルターを通すことで大きな食品くずを取り除いた後、方法１として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にアクロモペプチダーゼとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号１〜６の組み合わせを用いた方法を行った。また、方法２として、実施例３記載のＤＮＡ抽出のうち、溶菌酵素にエンテロリシンとリゾチームを用いた抽出法を行い、実施例５記載のＰＣＲ反応のうち、配列番号５〜１０の組み合わせを用いた方法を行った。それぞれ、２．５％アガロースゲル電気泳動により確認した。結果を表３に示す。
【００４２】
その結果、病原菌が検出した検体は、公定法では病原性大腸菌Ｏ１５７ ０検体、サルモネラ属菌 ３検体、リステリアモノサイトゲネス ６検体、多重検出法ではいずれの方法でも病原性大腸菌Ｏ１５７ ０検体、サルモネラ属菌 ３検体、リステリアモノサイトゲネス ８検体であり、公定法で陽性であった検体はいずれも多重検出法で陽性であった。また、公定法で陰性、多重検出法で陽性であったリステリアモノサイトゲネス２検体（表３、検体Ｎｏ．５、１５）について、Ｎｏ．１７での培養液をＰＡＬＣＡＭリステリア選択寒天培地（Ｍｅｒｃｋ）に画線培養後、形成したコロニーの同定試験を行ったところ、リステリアモノサイトゲネスであることを確認した。このことから、本多重検出法では公定法に比べて同等以上の精度があることを確認した。
【００４３】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】トリプトソーヤブイヨン（ＴＳＢ）およびBuffered Peptone Water（ＢＰＷ）培地を用いた３５℃培養での病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスおよび一般生菌数の挙動を示す図である。
【図２】病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌株を接種した肉試料液中（一般生菌数：３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）での各菌株の多重検出法による検出限界を示す電気泳動像の図である。
【００４５】
Ｍ：分子量マーカー
レーン１〜７は、病原性大腸菌Ｏ１５７接種区（一般生菌数：３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を示し、Ｏ１５７接種量は次の通り。
１：１．１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、２：１．１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、３：１．１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、４：１．１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、５：１．１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、６：１．１×１０２ＣＦＵ／ｍｌ、７：１１ＣＦＵ／ｍｌ
レーン８〜１４は、サルモネラ属菌接種区（一般生菌数：３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を示し、サルモネラ接種量は次の通り。
８：５．０×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、９：５．０×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、１０：５．０×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、１１：５．０×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、１２：５．０×１０２ＣＦＵ／ｍｌ、１３：５０ＣＦＵ／ｍｌ、１４：５ＣＦＵ／ｍｌ
レーン１５〜２１は、リステリアモノサイトゲネス接種区（一般生菌数：３．１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を示し、リステリア接種量は次の通り。
１５：１．１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、１６：１．１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、１７：１．１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、１８：１．１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、１９：１．１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、２０：１．１×１０２ＣＦＵ／ｍｌ、２１：１１ＣＦＵ／ｍｌ
【図３】病原性大腸菌Ｏ１５７、サルモネラ属菌、リステリアモノサイトゲネスの各菌株を接種した豚挽肉を用い、多重検出法により各菌株を検出した結果を示す電気泳動像の図である。
【００４６】
Ｍ：分子量マーカー
レーン１〜４は、リステリアモノサイトゲネス接種区を示し、リステリア接種量は次の通り。
１：１６ＣＦＵ／２５ｇ、２：１．６ＣＦＵ／２５ｇ、３：０．１６ＣＦＵ／２５ｇ、４：０．０２ＣＦＵ／２５ｇ
レーン５〜８は、サルモネラ属菌接種区を示し、サルモネラ属菌接種量は次の通り。
５：１１０ＣＦＵ／２５ｇ、６：１１ＣＦＵ／２５ｇ、７：１．１ＣＦＵ／２５ｇ、８：０．１１ＣＦＵ／２５ｇ
レーン９〜１２は、病原性大腸菌Ｏ１５７接種区を示し、Ｏ１５７接種量は次の通り。
９：８５０ＣＦＵ／２５ｇ、１０：８．５ＣＦＵ／２５ｇ 、１１：８．５ＣＦＵ／２５ｇ 、１２：０．８５ＣＦＵ／２５ｇ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品中の２種以上の異なる特性の微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い感度で検出する方法であって、
（Ａ）少なくとも、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程と、
（Ｂ）検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程と
を含むことを特徴とする微生物の多重検出方法。
【請求項２】
検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程の前に、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が２４時間培養後に１０3ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件下で培養する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の微生物の多重検出方法。
【請求項３】
２種以上の異なる特性の微生物が、リステリアモノサイトゲネスを含むことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の多重検出方法。
【請求項４】
特異的なプライマーが、配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項３記載の微生物の多重検出方法。
【請求項５】
２種以上の異なる特性の微生物が、病原性大腸菌Ｏ１５７を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の多重検出方法。
【請求項６】
特異的なプライマーが、配列番号１及び２、又は配列番号７及び８に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項５記載の微生物の多重検出方法。
【請求項７】
２種以上の異なる特性の微生物が、サルモネラ属菌を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の多重検出方法。
【請求項８】
特異的なプライマーが、配列番号３及び４、又は配列番号９及び１０に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項７記載の微生物の多重検出方法。
【請求項９】
培養後のｐＨが５．１以上となる培養条件下で培養することを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１０】
グルコース濃度が０．１５％以下の培地、及び／又は、リン酸緩衝液の濃度が５０ｍＭ以上若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養することを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１１】
溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿によりＤＮＡを析出して抽出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１２】
溶菌酵素が、アクロモペプチダーゼ及び／又はリゾチームであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１３】
溶菌活性を持つバクテリオシンが、エンテロリシンであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１４】
界面活性剤が、ソルビタンモノラウラートのエチレンオキシド縮合物であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１５】
タンパク質変性剤が、グアニジンイソチオシアネートであることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１６】
プライマーとして、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡを合計７５０ｎＭ以下の濃度で組み合わせてマルチプレックスＰＣＲを行うことを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１７】
プライマーとして、配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡを合計７５０ｎＭ以下の濃度で組み合わせてマルチプレックスＰＣＲを行うことを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１８】
食品が、食肉又は食肉加工品であることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１】
食品中の２種以上の異なる特性の微生物を、１本のＰＣＲ反応チューブで複数の標的遺伝子の増幅を行い、それを解析することで公定法と同等、又はそれ以上の高い感度で検出する方法であって、
（Ａ）少なくとも、溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンと界面活性剤とタンパク質変性剤とで処理することにより、検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程と、
（Ｂ）検出対象微生物に特異的なプライマーを混合し、マルチプレックスＰＣＲを行う工程と
を含むことを特徴とする微生物の多重検出方法。
【請求項２】
検出対象微生物のＤＮＡを抽出する工程の前に、１ＣＦＵ／１００ｇの微生物が２４時間培養後に１０3ＣＦＵ／ｍｌ以上となる培養条件下で培養する工程を含むことを特徴とする請求項１記載の微生物の多重検出方法。
【請求項３】
２種以上の異なる特性の微生物が、リステリアモノサイトゲネスを含むことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の多重検出方法。
【請求項４】
特異的なプライマーが、配列番号５及び６に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項３記載の微生物の多重検出方法。
【請求項５】
２種以上の異なる特性の微生物が、病原性大腸菌Ｏ１５７を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の多重検出方法。
【請求項６】
特異的なプライマーが、配列番号１及び２、又は配列番号７及び８に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項５記載の微生物の多重検出方法。
【請求項７】
２種以上の異なる特性の微生物が、サルモネラ属菌を含むことを特徴とする請求項１又は２記載の微生物の多重検出方法。
【請求項８】
特異的なプライマーが、配列番号３及び４、又は配列番号９及び１０に示される塩基配列からなるプライマーであることを特徴とする請求項７記載の微生物の多重検出方法。
【請求項９】
培養後のｐＨが５．１以上となる培養条件下で培養することを特徴とする請求項１〜８のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１０】
グルコース濃度が０．１５％以下の培地、及び／又は、リン酸緩衝液の濃度が５０ｍＭ以上若しくはそれと同等の緩衝能を有する培地で培養することを特徴とする請求項１〜９のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１１】
溶菌酵素及び／又は溶菌活性を持つバクテリオシンを作用させた後、界面活性剤とタンパク質変性剤で処理し、遠心分離により不溶画分を取り除き、アルコール沈殿によりＤＮＡを析出して抽出することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１２】
溶菌酵素が、アクロモペプチダーゼ及び／又はリゾチームであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１３】
溶菌活性を持つバクテリオシンが、エンテロリシンであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１４】
界面活性剤が、ソルビタンモノラウラートのエチレンオキシド縮合物であることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１５】
タンパク質変性剤が、グアニジンイソチオシアネートであることを特徴とする請求項１〜１４のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１６】
プライマーとして、配列番号１〜６で示される塩基配列からなるＤＮＡを合計７５０ｎＭ以下の濃度で組み合わせてマルチプレックスＰＣＲを行うことを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１７】
プライマーとして、配列番号５〜１０で示される塩基配列からなるＤＮＡを合計７５０ｎＭ以下の濃度で組み合わせてマルチプレックスＰＣＲを行うことを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【請求項１８】
食品が、食肉又は食肉加工品であることを特徴とする請求項１〜１７のいずれか記載の微生物の多重検出方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０６４０１６
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【発行日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１６６４０（Ｐ２００５−５１６６４０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９３４０
【国際出願日】平成１６年１２月２４日（２００４．１２．２４）
【出願人】（０００１１３０６７）プリマハム株式会社 (72)
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年７月１４日（２００５．７．１４）
【発行日】平成１９年７月１９日（２００７．７．１９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１９３４０
【国際出願日】平成１６年１２月２４日（２００４．１２．２４）
【出願人】（０００１１３０６７）プリマハム株式会社 (72)
【出願人】（５０１２０３３４４）独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 (827)
【Ｆターム（参考）】
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