抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体
抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体などの抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を例えば該脂質膜構造体の構成成分として含有する含有する脂質膜構造体。細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）が発現した腫瘍細胞及び新生血管などに対して薬効成分及び／又は遺伝子を効率的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして利用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を含有する新規な脂質膜構造体に関する。
【背景技術】
マトリックスメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）は、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）と基底膜成分のさまざまな構成タンパク質を分解し、細胞外マトリックス代謝に必須であると考えられている亜鉛依存性のエンドペプチダーゼのファミリーである。これらの酵素群は、正常な胚の発生、骨の成長あるいは創傷の治癒など、結合組織の再構成に関連しており、また、アテローム性動脈硬化症、肺気腫、リウマチ性関節炎、癌の浸潤・転移などの各種の病的な過程にも関与することが明らかにされてきている。これまでに、数多くの哺乳類ＭＭＰｓがｃＤＮＡクローニングによりアミノ酸レベルまで解析されている。
例えば、哺乳類ＭＭＰｓとして、ＭＭＰ−１（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）；ＭＭＰ−２（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａ）；ＭＭＰ−３（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１）；ＭＭＰ−７（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）；ＭＭＰ−８（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）；ＭＭＰ−９（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ｂ）；ＭＭＰ−１０（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−２）；ＭＭＰ−１１（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−３）；ＭＭＰ−１２（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｅｌａｓｔａｓｅ）；ＭＭＰ−１３（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−３）；ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１６（ＭＴ３−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１７（ＭＴ４−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１９；ＭＭＰ−２０（ｅｎａｍｅｌｙｓｉｎ）；ＭＭＰ−２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−２５（ＭＴ６−ＭＭＰ）などが知られている。これらのＭＭＰｓは、１次構造、基質特異性及び細胞分布により、少なくとも４種のサブファミリー：コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン及び細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼ類（ＭＴ−ＭＭＰｓ）に分類されているが、このうちＭＴ−ＭＭＰｓサブファミリーは、最も新しくＭＭＰｓのサブクラスとして報告されたものであり、ＭＭＰｓに保存された領域に対するディジェネレートプライマーとＲＴ−ＰＣＲによって、これまでＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ，ＭＴ６−ＭＭＰなどが単離同定されている（Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４）；Ｗｉｌｌ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３１，６０２−６０８（１９９５）；Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２３０１３−２３０２０（１９９５）；Ｐｕｅｎｔｅ Ｘ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，９４４−９４９（１９９６）；特開２０００−２７０８７４号公報；Ｐｅｉ，Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，８９２５−８９３２（１９９９）；Ｋａｊｉｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４５７，３５３−３５６（１９９９））。
ＭＴ−ＭＭＰｓは、多くのＭＭＰｓに特徴的なヘモペキシンドメインの後方に、単一の膜貫通領域と短い細胞内テールを持つＩ型の膜タンパク質である。さらに、これらには、プロペプチドと活性ドメインの間に塩基性アミノ酸の挿入が共通して存在しており、フィウリン（ｆｕｒｉｎ）あるいはフィウリン様酵素による切断でこれらの膜タンパク質の活性化がおきる（Ｐｅｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，９１３５−９１４０（１９９６）；Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９３，１０１−１０４（１９９６）；Ｃａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３０１７４−３０１８０（１９９６））。
細胞が組織内を移動・浸潤・転移する際には、その周りを取り囲む細胞外基質（ＥＣＭ）の分解が必須のステップである。そのステップに中心的な役割を担っているのがＭＭＰと呼ばれる酵素群であり、なかでも細胞膜表面に発現するＭＴ１−ＭＭＰは癌の移動・浸潤・転移及び血管新生においてその役割が重要視されている。ＭＴ１−ＭＭＰは、細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ １ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ＭＴ１−ＭＭＰ）あるいはＭＭＰ−１４とも呼ばれる酵素（ＭＥＲＯＰＳ ＩＤ：Ｍ１０．０１４）で、ヒトにおいてはその染色体遺伝子座１４ｑ１１−ｑ１２を占める遺伝子（Ｍｉｇｎｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２８，３６０−３６１（１９９５））の産物であると報告されている。この酵素については、ＤＮＡクローニング並びに組換えタンパク質の発現によりその存在が確認されるとともに詳細な構造及び特性が明らかにされている（Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４）；Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５５，２９３−２９８（１９９５）；特開平７−２０３９６１号公報；特開平７−３０３４８２号公報；ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｄ２６５１２）。ＭＴ１−ＭＭＰは、ヒトの他、イヌ、ヤギ、ウサギ、イノシシ、ネズミなどでもその存在が確認されている。ヒトＭＴ１−ＭＭＰのｃＤＮＡは、５８２個のアミノ酸残基をコードし（ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ２６５１２，Ｅ０９７２０ ＆Ｅ １０２９７；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ５０２８１）、その構造はシグナルペプチドに続くプロペプチドドメイン、ストロメライシン−３（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−３）に類似した特異な１０個のアミノ酸残基からなる挿入配列（フィウリン（ｆｕｒｉｎ）−様酵素認識部位の可能性のある配列）、亜鉛結合サイトの可能性を持つ部位を有するコア酵素ドメイン、ヒンジドメイン、ヘモペキシン様ドメイン、膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ：ＴＭ）ドメインからなっている。
これまでに、ＭＴ１−ＭＭＰが同じＭＭＰメンバーであり基底膜分解酵素であるゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）の潜在型（プロゼラチナーゼＡ／７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ：ｐｒｏＭＭＰ−２）を活性化すること、及び、ＭＴ１−ＭＭＰ自身もＩ，ＩＩ及びＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン及びａｇｇｒｅｃａｎなど様々なＥＣＭ分子を分解することが解明されている。また、ＭＴ１−ＭＭＰが腫瘍浸潤や転移の過程を促進することも示されている（Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，Ａｐｍｉｓ，１０７，１３７−１４３（１９９９）；Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４））。さらに、ＭＴ１−ＭＭＰはｐｒｏＭＭＰ−２（Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４））やプロコラゲナーゼ−３（ｐｒｏＭＭＰ−１３）（Ｋｎａｕｐｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１７１２４−１７１３１（１９９６））のような他のＭＭＰｓを活性化することも知られている。このように、ＭＴ１−ＭＭＰの発現は細胞表面での多様なタンパク分解酵素カスケードの開始に関与する可能性があり、ＭＴ１−ＭＭＰは癌細胞浸潤や転移（Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，Ａｐｍｉｓ，１０７，１３７−１４３（１９９９）；Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４））だけでなく脈管形成（Ｈｉｒａｏｋａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９５，３６５−７７（１９９８）；Ｚｈｏｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，４０５２−４０５７（２０００））や骨格発育（Ｚｈｏｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，４０５２−４０５７（２０００）；Ｈｏｌｍｂｅｃｋ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９９，８１−９２（１９９９））のような他の生理的プロセスにも関与していることが示されている。このようにＭＴ１−ＭＭＰは組織における生理的、病理学的細胞浸潤に対する必要な道具であると考えられる。
一方、従来より、ドラッグデリバリーシステムとしてモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体が種々提案されてきたが、十分に満足すべき性能を有している脂質膜構造体は未だ提供されていない。また、抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体は従来知られていなかった。
【発明の開示】
本発明の課題は、抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体（以下、本明細書において、細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼを「ＭＴ−ＭＭＰ」、抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を「抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体」と略す場合がある）を含有する脂質膜構造体を提供することにある。より具体的には、ＭＴ−ＭＭＰが発現した腫瘍細胞などに対して薬効成分及び／又は遺伝子を効率的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体を提供することが本発明の課題である。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体を提供することに成功し、この脂質膜構造体が、ＭＴ−ＭＭＰが発現した腫瘍細胞に効率的に薬効成分及び／又は遺伝子を送達できることを見出した。また、本発明者らは、上記の脂質膜構造体が、腫瘍内部における血管新生先端部位に対しても効率よく薬効成分及び／又は遺伝子を送達できることを見出した。つまり、本発明の脂質膜構造体は、ＭＴ−ＭＭＰを発現している腫瘍細胞と新生血管を同時にターゲットにし、効率的に薬効成分及び／又は遺伝子を送達できるものである。従来の脂質膜構造体は、腫瘍細胞又は新生血管のどちらか一方のみをターゲットとしているものであり、本発明により、初めて腫瘍細胞と新生血管の両方を同時にターゲットとしうる脂質膜構造体を見出した。従来は、腫瘍がある程度大きくなったような固形癌しかターゲットにできなかったが、本発明の脂質膜構造体によれば、新生血管ができ始めた小さな腫瘍の段階からでも薬効成分及び／又は遺伝子を送達することができ、治療が可能になる。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明により、抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体が提供される。この発明の好ましい態様によれば、該モノクローナル抗体が脂質膜構造体の脂質膜の中、表面、内部、脂質層中、及び／又は脂質層の表面に存在する上記の脂質膜構造体、該モノクローナル抗体を該脂質膜構造体の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体、及び該モノクローナル抗体が該脂質膜構造体の膜表面に結合した上記の脂質膜構造体が提供される。
さらに好ましい態様によれば、該モノクローナル抗体が、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ２−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ３−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ５−ＭＭＰモノクローナル抗体、及び抗ＭＴ６−ＭＭＰモノクローナル抗体から選ばれる１種又は２種以上のモノクローナル抗体である上記の脂質膜構造体；該モノクローナル抗体がヒト型又はマウス型のモノクローナル抗体である上記の脂質膜構造体；該モノクローナル抗体がＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、又はＦａｂ’フラグメントである上記の脂質膜構造体；該モノクローナル抗体を脂質膜構造体に結合させるための物質を含有する上記の脂質膜構造体；該モノクローナル抗体を脂質膜構造体に結合させるための物質が抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体又はそのフラグメント中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体である上記の脂質膜構造体が提供される。
また、本発明により、リン脂質及び／又はリン脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体；リン脂質及び／又はリン脂質誘導体が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファリジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１，２−ジミリストイル−１，２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン及びホスファチジン酸からなる群より選ばれる１種又は２種以上のリン脂質及び／又はリン脂質誘導体である上記の脂質膜構造体；さらにステロール類を脂質膜構造体の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体；ステロール類がコレステロール及び／又はコレスタノールである上記の脂質膜構造体が提供される。
さらに、本発明により、血中滞留性機能を有する上記の脂質膜構造体；血中滞留性脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体；血中滞留性脂質誘導体がポリエチレングリコール脂質誘導体又はポリグリセリンリン脂質誘導体である上記の脂質膜構造体；ポリエチレングリコール脂質誘導体が、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、及びＮ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンからなる群から選ばれる１種又は２種以上のポリエチレングリコール脂質誘導体である上記の脂質膜構造体；温度変化感受性機能を有する上記の脂質膜構造体；温度感受性脂質誘導体を脂質膜構造体中の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体；温度感受性脂質誘導体がジパルミトイルホスファチジルコリンである上記の脂質膜構造体；ｐＨ感受性機能を有する上記の脂質膜構造体；ｐＨ感受性脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体；ｐＨ感受性脂質誘導体がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである上記の脂質膜構造体が提供される。
また、腫瘍細胞膜上の細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼと反応する上記の脂質膜構造体；腫瘍細胞がＭＴ−ＭＭＰ発現細胞である上記の脂質膜構造体；腫瘍細胞が線維肉腫、扁平上皮癌、神経芽細胞腫、乳癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、甲状腺腫瘍、尿路上皮癌、グリア芽細胞腫、急性骨髄性白血病、膵管癌、又は前立腺癌の細胞である上記の脂質膜構造体；新生血管の細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼと反応する上記の脂質膜構造体；脂質膜構造体がミセル、エマルション、リポソーム、又はこれらの混合物の形態である上記の脂質膜構造体；水系溶媒分散形態、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、又は凍結形態のいずれかの形態である上記の脂質膜構造体が本発明により提供される。
別の観点からは、上記の脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とを含有する医薬組成物が本発明により提供される。この発明の好ましい態様によれば、薬効成分及び／又は遺伝子が、脂質膜構造体の膜中、表面、内部、脂質層中及び／又は脂質層の表面に存在するものである上記の医薬組成物；及び水系溶媒分散形態、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、又は凍結形態のいずれかの形態である上記の医薬組成物が提供される。
抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体から公知の方法により作製した酵素標識モノクローナル抗体と上記の脂質膜構造体の双方が抗原物質に対して起こす競合反応を酵素免疫学的方法により検出することを特徴とする該脂質膜構造体に含有される抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体の量を推定する方法が本発明により提供される。
さらに別の観点からは、ＭＴ−ＭＭＰが関わる種々の疾病、例えば、腫瘍の予防及び／又は治療方法であって、上記の脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とを含有する医薬組成物をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；薬効成分及び／又は遺伝子を腫瘍細胞及び／又は新生血管に送達する方法であって、薬効成分及び／又は遺伝子を上記の脂質膜構造体に保持させた形態でヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、リコンビナントプロテインＡセファロースＦＦゲルカラムを用いて、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（ＩｇＧ）を含む腹水からＩｇＧをアフィニティー精製した結果を示した図である。
第２図は、精製したＩｇＧをペプシン消化した後のゲル濾過の結果を示した図である。
第３図は、Ｆ（ａｂ’）２画分を還元処理した後のゲル濾過の結果を示した図である。
第４図は、Ｆａｂ’画分とマレインイミド基導入抗癌剤（ＤＯＸ）封入リポソームをマレインイミドモル比が１：１となるように混合し、低温、遮光下２０時間反応させた後のゲル濾過の結果を示した図である。
第５図は、Ｆａｂ’画分とマレインイミド基導入抗癌剤（ＤＯＸ）封入リポソームをマレインイミドモル比が１：３となるように混合し、低温、遮光下２０時間反応させた後のゲル濾過の結果を示した図である。
第６図は、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソーム及びマレインイミド基導入リポソームの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す写真である。リポソームに結合したＦａｂ’と予想される大きさのバンドの位置を矢印で示した。レーン１，３，５はＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例（１０）、▲２▼及び▲３▼）、レーン２，４，６はＦａｂ’−ＬＰ（調製例▲９▼、▲６▼及び▲７▼）、レーン７はＬＰ−ｍａｌ、レーン８はＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ、Ｍは分子量マーカーを示す。
第７図は、各リポソームの細胞増殖抑制作用を示した図である。図左半分は、ＭＴ１−ＭＭＰの発現細胞であるＨＴ１０８０細胞を用いた場合、図右半分は、ＭＴ１−ＭＭＰを発現しないＭＣＦ−７細胞を用いた場合の結果である。右表には、Ｃｏｎｔｒｏｌ群のｓｔａｒｔ（細胞洗浄直後）から２４時間の培養の間に増殖した細胞数に対する試験群の細胞増殖抑制率を示した。
第８図は、細胞増殖抑制試験の結果を示した図である。Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰの細胞増殖抑制作用の用量依存性を示した。
第９図は、マウス腹膜播種（ＨＴ１０８０）モデルにおける細胞接着試験の模式図である。ＬＰ（上図）又はＦａｂ’−ＬＰ（下図）を腹腔内投与したモデルの腹膜腫瘍の様子を模式化して示した。□の部分、すなわち腫瘍内部から一部と腫瘍表層から２部の割面について写真撮影を行った。
第１０図は、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−２Ｄ１２）結合リポソームおよびＦ（ａｂ’）２（クローン番号２２２−２Ｄ１２）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す写真である。リポソームに結合したＦａｂ’と予想される大きさのバンドの位置を矢印で示した。
第１１図は、ＨＴ１０８０細胞を用いた細胞増殖抑制試験の結果を示した図である。凡例記載の数値は、各検体のドキソルビシン濃度を表す。
第１２図は、第１１図と同様に細胞増殖抑制試験の結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の脂質膜構造体は、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を含有することを特徴としている。本発明の脂質膜構造体は、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体以外の成分として、脂質膜構造体を構成する膜構成成分を含んでいる。上記の膜構成成分としては、例えば、リン脂質及び／又はリン脂質誘導体を用いることが好ましい。リン脂質及びリン脂質誘導体としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１，２−ジミリストイル−１，２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチン等の天然物由来のリン脂質を用いることもできる。
本発明の脂質膜構造体は、リン脂質及び／又はリン脂質以外の膜構成成分として、コレステロール、コレスタノール等のステロール類、炭素数８〜２２の飽和又は不飽和のアシル基を有する脂肪酸類、α−トコフェロール等の酸化防止剤を含有してもよい。もっとも、膜構成成分はこれらに限定されることはない。
本発明の脂質膜構造体には、例えば、血中滞留性機能、温度変化感受性機能、及びｐＨ感受性機能などのいずれか１つ又は２つ以上の機能を付与することができ、こ（れら）の機能を付加することによって、例えば、薬効成分及び／又は遺伝子を含む脂質膜構造体からなる本発明の医薬組成物の血液中での滞留性を向上させ、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織（ＲＥＴＩＣＵＬＯＥＮＤＯＴＨＥＬＩＡＬ ＳＹＳＴＥＭ）による捕捉率を低下させることができ、あるいは薬効成分及び／又は遺伝子の放出性を高めることができる。
血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン等のポリエチレングリコール誘導体等を挙げることができる。
温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等を挙げることができる。また、ｐＨ感受性機能を付与することができるｐＨ感受性脂質誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等を挙げることができる。
本発明の脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、脂質膜構造体の膜構成成分であるリン脂質等とともに抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体が脂質膜構造体を形成している形態が好ましい。より具体的には、例えば、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体がリン脂質等から構成される脂質膜構造体の脂質膜中、脂質膜表面、脂質膜構造体内部、脂質層中、及び脂質層表面からなる群から選ばれる１以上の部分に存在（結合）している形態を挙げることができる。さらに好ましくは、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体がリン脂質等とともに膜構成成分となって脂質膜構造体を形成した形態、又は抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体が脂質膜構造体の脂質膜表面に結合した形態を挙げることができる。
本発明の脂質膜構造体の形態及びその製造方法は特に限定されないが、形態としては、例えば、乾燥した混合物の形態、あるいは水系溶媒に分散された形態又はこれを乾燥させた形態若しくは凍結させた形態等を挙げることができる。以下に、これらの形態の脂質膜構造体を製造する方法を説明するが、本発明の脂質膜構造体の形態及びその製造方法は上記の形態又は下記に説明する製造方法に限定されることはない。
（１）脂質膜構造体の構成成分全てを用いて製造する方法
乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の構成成分全てを一旦クロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができる。本発明の脂質膜構造体の好ましい形態としてリポソームを挙げることができる。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されるべきものではないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には粒子径が５０ｎｍから５μｍであり、５０ｎｍから４００ｎｍが好ましく、５０ｎｍから２００ｎｍが好ましく、５０ｎｍから１５０ｎｍのものがより好ましい。球状ミセルの場合は、粒子径が５ｎｍから１００ｎｍである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その１層あたりの厚みが５ｎｍから１０ｎｍでこれらが層を形成しているものが好ましい。なお、粒子径は、準弾性光散乱法による重量平抱粒子径を意味するものである。
水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されるべきものではなく、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）等を加えてもよい。この水系溶媒（分散媒）に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）中の電解質を極力なくすことが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０から８．０）に設定することや窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが望ましい。
さらに脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態を乾燥・凍結させた形態は、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体を通常の凍結乾燥や噴霧乾燥による乾燥・凍結方法等により製造することができる。水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に薬効成分含有水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために薬効成分を効率よく脂質膜構造体に保持させることができる長所がある。
凍結乾燥や噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定に長期間保存することができる。また、凍結する場合には、例えば、前記した糖（水溶液）やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール（水溶液）をそれぞれ用いると安定に長期間保存することができる。糖と多価アルコールとを組み合わせて用いてもよい。脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態における糖又は多価アルコールの濃度は特に限定されるべきものではないが、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した状態において、例えば、糖は、２〜２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５〜１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコールは、１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２〜２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）として、緩衝液を用いる場合には、緩衝剤の濃度が５〜５０ｍＭが好ましく、１０〜２０ｍＭがさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）における脂質膜構造体の濃度は特に限定されるべきものではないが、脂質膜構造体における脂質総量の濃度は、０．１ｍＭ〜５００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１００ｍＭがさらに好ましい。
（２）段階的に製造する方法（抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体以外の構成成分の一部又は全部を用いて脂質膜構造体を製造した後に、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜表面に結合させる方法）
乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体は、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体以外の脂質膜構造体の構成成分の一部又は全部をいったんクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体と、場合により脂質膜構造体の構成成分の残余とを添加した後に、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体以外の構成成分の一部又は全部からなる上記の乾燥した混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化し、次いで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体と、場合により脂質膜構造体の構成成分の残余とを添加することで製造することができる。また、乳化操作の代わりに、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。また、得られた脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態のものを通常の方法で、乾燥（凍結乾燥や噴霧乾燥）や凍結することができる。
本発明においては、薬効成分及び／又は遺伝子の送達の効率性から、上記（２）で示した製造方法で製した抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体が好ましい。抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜の表面に存在又は結合させる方法としては、公知の方法（ＳＴＥＡＬＴＨ ＬＩＰＯＳＯＭＥ，第２３３−２４４頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．発行，Ｄａｎｉｌｏ Ｌａｓｉｃ及びＦｒａｎｋ Ｍａｒｔｉｎ編）又はこれに準じた方法を挙げることができる。例えば、脂質膜構造体の構成成分として、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦａｂ’フラグメント等）中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体、具体的にはポリ（エチレングリコール）−α−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ω−マレインイミド、α−［Ｎ−（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォリル−エチル）カルバミル］−ω−｛３−［２−（２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エタンカルボキサミド］プロピル｝−ポリ（オキシ−１，２−エタンジル）等のマレインイミド構造を有する脂質誘導体を含有させることで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜の表面に存在又は結合させることができる。
抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体は、所望のＭＴ−ＭＭＰの細胞外ドメイン領域及び／又は関連ペプチド断片などを認識可能な単一のモノクローナル抗体、あるいは各種エピトープに対する特異性を持つ２種以上のモノクローナル抗体を含む組成物であってもよい。また、１価抗体又は多価抗体のいずれでもよく、天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子又はそのフラグメント若しくは誘導体を用いてもよい。例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦａｂといったフラグメントを用いてもよく、少なくとも二つの抗原又はエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、クワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ），トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるものを用いることもできる。公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用し、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用し、ＤＮＡ組換え技術を用いて調製される抗体、ＭＴ−ＭＭＰあるいは標的エピトープに関して中和特性を有する抗体又は結合特性を有する抗体を用いてもよい。
ＭＴ−ＭＭＰを特異的に認識するモノクローナル抗体は任意の方法により産生することができる。「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団であることを意味しており、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があると限定的に解釈してはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生じ得る変異体を僅かな量含む可能性があるが、実質的に同一の抗体の集団を含んでいる。上記のように、本発明で用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むが、それらは、所望の生物活性を有する限り、その由来、イムノグロブリンクラス、サブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり（例えば、ヒト化抗体）、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合することが可能である。このような修飾を施したモノクローナル抗体を本発明で用いることもできる。これらの技術については、例えば、米国特許第４８１６５６７号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，７９−９７，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５（１９８４）などに記載されている。
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４，７２−７９（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；トリオーマ法；ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））（ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法）；米国特許第４９４６７７８号（単鎖抗体の産生のための技術）が挙げられる。抗体に関しては、Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，９，１０１−１０８（１９９０）；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８）；Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，３７９１−３８０６（１９８４）；Ｂｕｋｏｖｓｋｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，２１９−２２８（１９８７）；Ｄａｉｎｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，２２３−２２９（１９８７）；Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３（１９８８）；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｌａｎｇｏｎｅ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．），″Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ″，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５（１９８４）；Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，２１４−２２１（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７（１９８８）；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，６７３６−６７４０（１９８６）；Ｗｏｏｄ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４４６−４４９（１９８５）；Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４５２−４５４（１９８５）あるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）を挙げることができる。
本発明における抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体としては、ＭＴ−ＭＭＰを特異的に認識できるモノクローナル抗体であればいかなるものを用いてもよい。抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体の製造のために用いる抗原としてのＭＴ−ＭＭＰとしては、従来、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＴ４−ＭＭＰ、ＭＴ５−ＭＭＰ、及びＭＴ６−ＭＭＰの６種類が知られているが、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体はこれらのうちの少なくとも１種、好ましくは１種のみを特異的に認識できることが必要である。また、上記の６種類のＭＴ−ＭＭＰ以外にも、ＭＴ−ＭＭＰに属する抗原が存在する可能性があるが、そのような抗原を認識できるモノクローナル抗体を用いることもできる。
抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）など）を利用して得られたモノクローナル抗体を用いることができる。例えば、ＭＴ−ＭＭＰｓのうちの少なくとも１種、好ましくは特定のＭＴ−ＭＭＰ又はその抗原決定基を含む断片を抗原として公知の方法で製造された抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ２−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ３−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ５−ＭＭＰモノクローナル抗体、及び抗ＭＴ６−ＭＭＰモノクローナル抗体からなる群から選ばれる１種又は２種以上の抗体を用いることができる。より好ましくは抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体である。これらの抗体は、市販されているものもあり、容易に入手することができる。また、脂質膜構造体と結合させる抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体としては、好ましくは抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、又はＦａｂフラグメントを用いることができ、より好ましくはＦａｂ’フラグメントを用いることができる。また、ヒト化したＦａｂ’フラグメントが好ましい。抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体の配合量は、脂質膜構造体の脂質総量に対してモル比が１：０．００００１〜１：０．２５が好ましく、１：０．０００１〜１：０．２がより好ましく、１：０．０００１〜１：０．０１がさらに好ましい。また、脂質膜構造体中にマレインイミド構造を有する脂質誘導体が含まれる場合には、マレインイミド基に対してモル比（抗体：マレインイミド基）が１：０．０１〜１：２０であることが好ましく、１：０．２５〜１：４．５がより好ましく、１：１〜１：３がさらに好ましい。上述の範囲は一例と示したのみであり、必ずしもこの範囲に限定されるべきものではない。
本発明の抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体がその優れた効果を示すには、該脂質膜構造体が凝集しないこと、及び血中滞留性を有することが望ましい。凝集を防止するためには、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体の配合量及び／又は抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜の表面に存在又は結合させるための脂質誘導体（例えば、マレインイミド構造を有する脂質誘導体）の含有量を適宜検討すればよい。なお、脂質膜構造体中にマレインイミド構造を有する脂質誘導体を含む場合の当該脂質誘導体の配合量は、上述したとおりである。
抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とを含有する本発明の医薬組成物では、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体に含まれる抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体がＭＴ−ＭＭＰと特異的かつ選択的に反応する。ＭＴ−ＭＭＰは、ある種の腫瘍細胞において発現していることが知られており、また、血管新生に関与することが知られている。しかし、ＭＴ−ＭＭＰが新生血管において発現しているか否かについては、よく分かっていなかった。本発明の医薬組成物をヒト等の動物や実験用細胞に投与すると、薬効成分及び／又は遺伝子を効率的に該腫瘍細胞に送達することができる。ＭＴ−ＭＭＰが発現している腫瘍細胞としては、例えば、線維肉腫、扁平上皮癌、神経芽細胞腫、乳癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、甲状腺腫瘍、尿路上皮癌、グリア芽細胞腫、急性骨髄性白血病、膵管癌及び前立腺癌等の細胞を挙げることができるが、これらの細胞に限定されることはない。また、この医薬組成物をヒト等の動物や実験用細胞に投与すると、腫瘍内部における血管新生先端部位に薬効成分及び／又は遺伝子を効率的に送達することができる。腫瘍内部における血管新生先端部位としては、ｒｕｆｆｌｉｎｇ ｅｄｇｅの内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）などを挙げることができるが、これに限定されることはない。
本発明の医薬組成物は、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子を含有するものであるが、その形態は特に限定されることはない。例えば、上記の脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とが単に混合された形態のほか、上記の脂質膜構造体に薬効成分及び／又は遺伝子が保持された形態でもよい。「保持」とは、薬効成分及び／又は遺伝子が、上記の脂質膜構造体の脂質膜の中、表面、内部、脂質層中、及び／又は脂質層の表面に存在することを意味する。ヒト等の動物に投与することを考慮すると、本発明の医薬組成物は、上記脂質膜構造体に薬効成分及び／又は遺伝子が保持された形態が好ましい。本発明の医薬組成物において、薬効成分及び／又は遺伝子の量は特に限定されず、そ（れら）の薬効を生体（細胞）内で有効に発揮させるのに充分な量であればよい。薬効成分及び／又は遺伝子の種類も特に限定されず、治療及び／又は予防すべき疾患の種類、治療又は予防の目的、脂質膜構造体の形態などにより適宜決定すればよい。
本発明の医薬組成物中に含まれる薬効成分の種類は特に限定されるべきものではないが、例えば、抗腫瘍剤、免疫賦活剤、抗腫瘍効果を有するサイトカイン、造影剤等を挙げることができる。抗腫瘍剤としては、例えば、塩酸イリノテカン、塩酸ノギテカン、エキサテカン、ＲＦＳ−２０００、Ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ、ＢＮＰ−１３５０、Ｂａｙ−３８３４４１、ＰＮＵ−１６６１４８、ＩＤＥＣ−１３２、ＢＮ−８０９１５、ＤＢ−３８、ＤＢ−８１、ＤＢ−９０、ＤＢ−９１、ＣＫＤ−６２０、Ｔ−０１２８、ＳＴ−１４８０、ＳＴ−１４８１、ＤＲＦ−１０４２、ＤＥ−３１０等のカンプトテシン誘導体、ドセタキセル水和物、パクリタキセル、ＩＮＤ−５１０９、ＢＭＳ−１８４４７６、ＢＭＳ−１８８７９７、Ｔ−３７８２、ＴＡＸ−１０１１、ＳＢ−ＲＡ−３１０１２、ＳＢＴ−１５１４、ＤＪ−９２７等のタキサン誘導体、イホスファミド、塩酸ニムスチン、カルボコン、シクロホスファミド、ダカルバジン、チオテパ、ブスルファン、メルファラン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、６−メルカプトプリンリボシド、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、アクチノマイシンＤ、塩酸アクラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸エビルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ブレオマイシン、ジノスタチンスチマラマー、ネオカルチノスタチン、マイトマイシンＣ、硫酸プレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、エトポシド、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、塩酸アムルビシン、ゲフィニチブ、エキセメスタン、カペシタビン、ＴＮＰ−４７０、ＴＡＫ−１６５、ＫＷ−２４０１、ＫＷ−２１７０、ＫＷ−２８７１、ＫＴ−５５５５、ＫＴ−８３９１、ＴＺＴ−１０２７、Ｓ−３３０４、ＣＳ−６８２、ＹＭ−５１１、ＹＭ−５９８、ＴＡＴ−５９、ＴＡＳ−１０１、ＴＡＳ−１０２、ＴＡ−１０６、ＦＫ−２２８、ＦＫ−３１７、Ｅ７０７０、Ｅ７３８９、ＫＲＮ−７００、ＫＲＮ−５５００、Ｊ−１０７０８８、ＨＭＮ−２１４、ＳＭ−１１３５５、ＺＤ−０４７３等を挙げることができ、造影剤としては、例えば、アミドトリゾ酸ナトリウムメグルミン、アミドトリゾ酸メグルミン、イオキサグル酸、イオキシラン、イオジキサノール、イオラクタム酸ナトリウム、イオトロクス酸メグルミン、イオトロラン、イオパノ酸、イオパミドール、イオプロミド、イオヘキソール、イオベルソール、イオメプロール等を挙げることができる。
また、本発明の医薬組成物中に含まれる遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、又はＲＮＡのいずれでもよく、特に形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子等を挙げることができる。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子等を挙げることができ、これらのうち遺伝子産物が抗腫瘍効果を有する遺伝子が好ましい。
本発明の医薬組成物において、遺伝子を含む場合、細胞へ遺伝子を効率的に導入するために、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体の構成成分として、遺伝子導入機能を有する化合物を加えることが好ましい。このような化合物としては、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジドデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジヘキサデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジオクタデセノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’，Ｏ’’−トリデカノイル−Ｎ−（ω−トリメチルアンモニオデカノイル）アミノメタンブロミド及びＮ−［α−トリメチルアンモニオアセチル］−ジドデシル−Ｄ−グルタメート、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、３−β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール等を挙げることができる。これらの遺伝子導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の膜の中、表面、内部、脂質層中及び／又は脂質層の表面に存在（結合）している形態が好ましい。
本発明の医薬組成物は、脂質膜構造体に薬効成分及び／又は遺伝子を添加することにより製造することができ、ＭＴ−ＭＭＰが関わる種々の疾病、好ましくは腫瘍や癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物として用いることができる。遺伝子を含む場合には、遺伝子導入用キットとしても用いることができる。本発明の医薬組成物の存在形態及びその製造方法は特に限定されず、上記の脂質膜構造体と同様の形態として調製することが可能である。例えば、形態としては、混合乾燥物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態を挙げることができる。
混合乾燥物形態は、例えば、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体の構成成分と薬効成分及び／又は遺伝子とを一旦クロロホルム等の有機溶媒で溶解させ、次にこれをエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことにより製造することができる。水系溶媒に分散した形態としては、多重層リポソーム、一枚膜リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定形の層状構造物などを挙げることができるが、特に限定されるべきものではない。混合物としての大きさ（粒子径）や水系溶媒の組成なども特に限定されることはないが、例えばリポソームの場合には５０ｎｍ〜５μｍ、５０〜４００ｎｍが好ましく、５０〜２００ｎｍが好ましく、５０〜１５０ｎｍのものがより好ましい。球状ミセルの場合は５〜１００ｎｍ、エマルジョンを形成する場合は５０ｎｍ〜５μｍである。なお、粒子径は、準弾性光散乱法による重量平均粒子径を意味するものである。混合物としての水系溶媒における濃度も特に限定されることはない。なお、脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とを含む混合物が水系溶媒に分散した形態の製造方法としてはいくつかの方法が知られており、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子との混合物の存在様式に応じて、下記のように適当な製造方法を選択することができる。
製造方法１
上述の混合乾燥物に水系溶媒を添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等による乳化を行い製造する方法である。大きさ（粒子径）を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。この方法の場合、まず抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体の構成成分と薬効成分及び／又は遺伝子との混合乾燥物を作るために、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体、薬効成分及び／又は遺伝子を有機溶媒に溶解する必要があるが、薬効成分及び／又は遺伝子と脂質膜構造体の構成成分との相互作用を最大限に利用できる長所がある。すなわち、脂質膜構造体が層状構造を有する場合にも、薬効成分及び／又は遺伝子は多重層の内部にまで入り込むことが可能であり、この製造方法を用いると薬効成分及び／又は遺伝子の脂質膜構造体への保持率を高くできる長所がある。
製造方法２
抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体の構成成分を有機溶媒で一旦溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物に、さらに薬効成分及び／又は遺伝子を含む水系溶媒を添加して乳化を行い製造する方法である。大きさ（粒子径）を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。有機溶媒には溶解しにくいが、水系溶媒には溶解し得る薬効成分及び／又は遺伝子に適用できる。脂質膜構造体がリポソームの場合、内水相部分にも薬効成分及び／又は遺伝子を保持できる長所がある。
製造方法３
水系溶媒に既に分散したリポソーム、エマルション、ミセル、又は層状構造物などの抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体に、さらに薬効成分及び／又は遺伝子を含む水系溶媒を添加して製造する方法である。対象となる薬効成分及び／又は遺伝子としては、水溶性のものを利用できる。既にでき上がっている脂質膜構造体に外部から薬効成分及び／又は遺伝子を添加する方法であることから、薬効成分及び／又は遺伝子が高分子の場合には、薬効成分及び／又は遺伝子は脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に存在（結合）した存在様式をとる可能性がある。脂質膜構造体としてリポソームを用いた場合、この製造方法３を用いると、薬効成分及び／又は遺伝子がリポソーム粒子同士の間に挟まったサンドイッチ構造（一般的には複合体あるいはコンプレックスと呼ばれている。）を形成することが知られている。この製造方法では、脂質膜構造体単独の水分散液をあらかじめ製造するため、乳化時における薬効成分及び／又は遺伝子の分解等を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もし易い。したがって、製造方法１や製造方法２に比べて比較的容易に製造することができる。
製造方法４
水系溶媒に分散した抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体を製造して乾燥することにより得られた乾燥物に、さらに薬効成分及び／又は遺伝子を含む水系溶媒を添加して製造する方法である。製造方法３と同様に対象となる薬効成分及び／又は遺伝子としては、水溶性のものを利用できる。製造方法３との相違点は、脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子との存在様式にあり、この製造方法４では、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥させた乾燥物を製造することから、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状態で存在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるためには、前記したように水系溶媒に、さらに糖（水溶液）、好ましくはショ糖（水溶液）や乳糖（水溶液）を添加した溶媒を用いることが好ましい。ここで、薬効成分及び／又は遺伝子を含む水系溶媒を添加すると、固体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに速やかに水和し始め、脂質膜構造体を再構築することができる。この時、薬効成分及び／又は遺伝子が脂質膜構造体内部に保持された形態の構造体が製造できる。
製造方法３では、薬効成分及び／又は遺伝子が高分子の場合には、薬効成分及び／又は遺伝子は脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとるが、製造方法４はこの点で大きく異なる。すなわち、この製造方法４は、脂質膜構造体単独の分散液をあらかじめ製造するため、乳化時の薬効成分及び／又は遺伝子の分解を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もし易い。従って、製造方法１や製造方法２に比べて比較的製造が容易である。また、この他に、一旦凍結乾燥又は噴霧乾燥を行うため、製剤（医薬組成物）としての保存安定性を保証し易く、乾燥製剤を薬効成分及び／又は遺伝子の水溶液で再水和しても大きさ（粒子径）を元に戻せること、高分子の薬効成分及び／又は遺伝子であっても、脂質膜構造体内部に薬効成分及び／又は遺伝子を保持させ易いことなどの長所がある。
脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子との混合物が水系溶媒に分散した形態を製造するための他の方法としては、リポソームを製造する方法としてよく知られた方法、例えば逆相蒸発法などを採用できる。大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。また、上記の脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに乾燥させる方法としては、凍結乾燥や噴霧乾燥等を挙げることができる。この時の水系溶媒としては、上述の糖（水溶液）、好ましくはショ糖（水溶液）や乳糖（水溶液）を添加した溶媒を用いることが好ましい。脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに凍結させる方法としては、通常の凍結方法が挙げられるが、この場合の水系溶媒としては、糖（水溶液）や多価アルコール（水溶液）を添加した溶媒を用いるのが好ましい。
製造方法５
上記の製造方法１〜４に準じて、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体以外の脂質膜構造体の構成成分（抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体（好ましくは、抗体のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦａｂ’フラグメント等）中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体を含む）と薬効成分及び／又は遺伝子とを用いて脂質膜構造体を製造し、次いで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を添加することで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体が脂質膜構造体の膜の表面に存在（結合）する形態の組成物を製造することができる。
製造方法６
上記の製造方法１〜４に準じて、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体、及び抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体（好ましくは、抗体のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦａｂ’フラグメント等）中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体以外の脂質膜構造体の構成成分と薬効成分及び／又は遺伝子とを用いて脂質膜構造体を製造し、次いで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体及び抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体中のメルカプト基と反応し得る脂質膜誘導体を添加することで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体が脂質膜構造体の膜の表面に存在（結合）する形態の組成物を製造することができる。
本発明の医薬組成物において配合し得る脂質は、使用する薬効成分及び／又は遺伝子の種類などに応じて適宜選択すればよいが、例えば、薬効成分を用いる場合には、薬効成分１質量部に対して、総脂質として０．１〜１０００質量部が好ましく、０．５〜２００質量部がより好ましい。また、遺伝子を用いる場合には、遺伝子１μｇに対して、総脂質として１から５００ｎｍｏｌが好ましく、１０から２００ｎｍｏｌがより好ましい。
本発明の脂質膜構造体を含む医薬組成物の投与方法は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれも選択可能である。経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、カプセル剤、内服液剤等を挙げることができ、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、点眼剤、軟膏剤、座剤、懸濁剤、パップ剤、ローション剤、エアゾール剤、プラスター剤等を挙げることができる。これらのうち注射剤又は点滴剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、動脈注射、皮下注射、皮内注射などのほか、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射を挙げることができる。
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
実施例１：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの測定
１．抗体不含リポソームの調製
表１に示す４処方のリポソームを調製した。全ての処方において、リポソームマーカーとして、蛍光脂質（２−（６−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサノイル−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン：ＮＢＤ−Ｃ６−ＨＰＣ）を添加した。
空リポソームの癌細胞への吸着（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）や移行（ｉｎ ｖｉｖｏ）を確認するための抗癌剤（ドキソルビシン：ＤＯＸ）未封入群（処方１、２）と薬理実験のための抗癌剤封入群（処方３、４）とに分け、各々抗体結合脂質（ポリ（エチレングリコール）−α−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ｍ−マレインイミド：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）を含まない、ネガティブコントロールサンプル（処方１、３）を対照として調製した。
水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）を秤取し、クロロホルム・メタノール混液（３：１）適当量に溶解させた後、５ｍｇ／ｍｌでメタノールに溶解させたＮＢＤ−Ｃ６−ＨＰＣを添加した。エバポレーターにより有機溶媒を留去し、更に１時間減圧乾固させた。この脂質乾燥物（リピドフィルム）に、予め６５℃に加温しておいた１５５ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液（ｐＨ５．５）を加え、ボルテックスミキサーにて軽く撹拌した（ナスフラスコから脂質が剥がれる程度まで）。この時点において、蛍光脂質を含めた各脂質濃度は、ＨＳＰＣ ２８．２ｍＭ、Ｃｈｏｌ １９．２ｍＭ、ＮＢＤ−Ｃ６−ＨＰＣ ０．２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。次に、この脂質分散液をホモジナイザーに移して、１０ｓｔｒｏｋｅホモジナイズした後、種々孔径のポリカーボネートメンブレンフィルターを用いてサイジング（０．２μｍ×２回、０．１μｍ×２回、０．０５μｍ×２回）を行い、粒子径１００ｎｍ前後の空リポソーム分散液を調製した。
この空リポソーム分散液を生理食塩水で５倍希釈し、超遠心用チューブに入れ、６５０００ｒｐｍで１時間遠心分離した後、上清を捨て生理食塩水で希釈前のリポソーム分散液量になるように再懸濁させた。このように外水相を生理食塩水に置換した空リポソーム分散液を、空リポソーム用と薬物封入用との２群に分けた。
次に薬物封入方法を示す。空リポソーム分散液及びＤＯＸ溶液（薬物濃度：３．３ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）は、予め６５℃に加温しておき、容量比で空リポソーム分散液４に対しＤＯＸ溶液６を加えた後（即ち、最終薬物濃度は２．０ｍｇ／ｍｌ）、１時間６５℃でインキュベートした。
空リポソーム群及び薬物封入リポソーム群を各々二分し、一方に対しては、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）のみを表１に示す膜組成となるよう添加し（処方１、３）、もう一方に対しては、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬを表１に示す膜組成となるよう添加した（処方２、４）。これらは、各々粉末状態で添加し、１０分間６５℃でインキュベートした。
２．リポソームの物性の測定
（１）ドキソルビシンのリポソームへの保持率
上記リポソーム分散液（処方３、４）の一部を取ってゲル濾過（セファデックスＧ−５０；移動相は生理食塩水）を行い、ボイドボリュームに溶出したリポソーム分画中のドキソルビシンを蛍光検出器にて定量することにより求めた。各処方の薬物封入率は、ほぼ１００％であった。
（２）粒子径
上記リポソーム分散液（処方１〜４）の一部を取って準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）法にて粒子径を測定した結果、いずれもほぼ１００ｎｍ前後であった。また、抗体を付加したリポソームについても確認した結果、その粒子径はほぼ１００ｎｍ前後であった。
以下に、実施例２以降に用いる略語の意味を示す。
Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合抗癌剤封入リポソーム
Ｆａｂ’−ＬＰ：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソーム
ＤＯＸ−ＬＰ：抗癌剤封入リポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）
ＬＰ：リポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）
ＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ：マレインイミド基導入抗癌剤封入リポソーム
ＬＰ−ｍａｌ：マレインイミド基導入リポソーム
実施例２：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの調製
１）ＩｇＧの生産と精製
ＷＯ ０２／０４１０００ Ａ１記載の方法にしたがって得た抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、１．０×１０８個の細胞を得た。細胞を培地で１．０×１０７個／０．５ｍｌに懸濁し、予め１週間前にプリスタンを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ系、雌、６週令）に腹腔内投与した。７日目及び９日目に１０匹のマウスより腹水採取を行い１８ｍｌの腹水を得た。
得られた腹水を遠心して、不溶物、沈殿物を取り除き、固形硫酸アンモニウムを４０％飽和となるように徐々に添加した。添加後、２時間攪拌を継続した。遠心で沈殿物を回収し、少量の０．５Ｍ ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）で溶解した。これを透析チューブにとり、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）に透析した。透析後、遠心で沈殿物を取り除き、体積とＡ２８０を測定して含有するタンパク質量を１４０ｍｇ／１２．５ｍｌと見積もった。
遠心上清を０．５Ｍ ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）で平衡化したリコンビナントプロテインＡセファロースＦＦゲルカラム（直径２．５ｃｍ×長さ５．９ｃｍ）に供し、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）で洗浄した。カラムを通過した遠心上清、洗浄液を４ｍｌづつ分画し、フラクション番号１から２３番までのＡ２８０を測定した。Ａ２８０が０．０５以下になったことを確認した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で吸着タンパク質の溶出を行った。溶出液は、予め０．５ｍｌの３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を添加した試験管に４ｍｌづつ分画し、フラクション番号２６から４１番までのＡ２８０を継続して測定した。第１図はＩｇＧのアフィニティー精製の様子を示したものである。ＩｇＧとしてフラクション番号２９から３６番を回収、プールした。得られたＩｇＧ画分を透析チューブにとり、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析した。Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ ＵＫ−５０を用いて透析画分を濃縮した。濃縮画分のＡ２８０測定からＩｇＧ画分を６２ｍｇ／６ｍｌと見積もった。ＩｇＧ濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整し、１ｍｌづつに分けて凍結保存した。
２）ＩｇＧのＦａｂ’断片化
上記１）で精製し、１０ｍｇ／ｍｌに調整した精製ＩｇＧを１ｍｌとり、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４．２）で透析、抗体量の２％（ｗ／ｗ）のペプシンを加え、３７℃で２０時間消化した。消化物に３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を０．２ｍｌ添加し、反応を停止した。消化物の全量を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４ゲル濾過カラム（直径１．５ｃｍ×長さ４７ｃｍ）に供し、１ｍｌづつ分画しフラクション番号１１から３０番までのＡ２８０を測定した。第２図はＦ（ａｂ’）２画分のゲル濾過の様子を示したものである。Ｆ（ａｂ’）２画分としてフラクション番号１３から１８番を回収、プールした。得られたＦ（ａｂ’）２画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で０．４６ｍｌに濃縮した。濃縮画分のＡ２８０を測定し、得られたＦ（ａｂ’）２を３．４ｍｇと見積もった。
得られたＦ（ａｂ’）２を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で０．９ｍｌに調整し、０．１ｍｌの０．１Ｍシステアミン塩酸塩を添加（最終濃度０．０１Ｍ）、３７℃で１．５時間還元した。これを５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４ゲル濾過カラム（直径１．５ｃｍ×長さ４７ｃｍ）に供し、１ｍｌづつ分画しフラクション番号１１から３０番までのＡ２８０を測定した。第３図はＦａｂ’画分のゲル濾過の様子を示したものである。Ｆａｂ’画分としてフラクション番号１９から２３番を回収、プールした。得られたＦａｂ’画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で０．５６ｍｌに濃縮した。濃縮画分のＡ２８０を測定し、得られたＦａｂ’を１．５ｍｇと見積もった。
３）抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの調製（調製例▲１▼〜▲７▼）
上記２）で作製したＦａｂ’画分（１．９６ｍｇ／０．３７ｍｌ）に表１の処方４のマレインイミド基導入抗癌剤（ドキソルビシン（ＤＯＸ））封入リポソーム（ＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ）（マレインイミド濃度：１０４ｎｍｏｌ／ｍｌ）をマレインイミドモル比が１：１となるように０．４１ｍｌ加えて混合した。低温室で遮光下、２０時間反応させた後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレインイミド（０．１Ｍ水溶液を４．２６μｌ添加）で未反応のメルカプト基をブロックした。これをＰＢＳで平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径１．５ｃｍ×長さ４７ｃｍ）に供し、２ｍｌづつ分画しフラクション番号１１から４２番までのＡ２８０（タンパク濃度を反映）を、１１から２０番までのＡ６１０（濁度すなわち脂質濃度を反映）を測定した。第４図はこのときのゲル濾過溶出の様子を示したものである。抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体結合抗癌剤封入リポソーム（Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ）画分としてフラクション番号１３から１４番を回収、プールし、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲１▼（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率１０％）を得た。未反応Ｆａｂ’は、フラクション番号２９から３５番に溶出し、リポソーム画分と未反応Ｆａｂ’画分がゲル濾過にて分離されたことを確認した。
同様な方法で、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲２▼（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率９．２％）、調製例▲３▼（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率１２％）及び調整例▲４▼（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率３．９％）を調製した。また、表１の処方２のマレインイミド基導入リポソーム（ＬＰ−ｍａｌ）（マレインイミド濃度：２６０ｎｍｏｌ／ｍｌ）より、抗癌剤を封入しない抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体結合リポソーム（Ｆａｂ’−ＬＰ）（調製例▲５▼（ＨＳＰＣを基準にした時の希釈率３．７％）、調製例▲６▼（ＨＳＰＣを基準にした時の希釈率４．４％）、及び調製例▲７▼（ＨＳＰＣを基準にした時の希釈率２．１％）を上記と同様の方法で調製した。
なお、調製例のリポソーム原料からの希釈割合は、前記抗体結合後のゲル濾過時のＡ６１０値より算出した抗体結合リポソームとしてプールした画分のＡ６１０積算値／ボイド画分のＡ６１０積算値に各原料仕込みボリューム／調製例ボリュームを乗じて算出した。また、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体結合リポソームのリン脂質濃度は、表１の処方２のＬＰ−ｍａｌ若しくは表１の処方４のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌのリン脂質濃度（リン脂質Ｂ−テストワコー（和光純薬工業）にて測定し、ＤＯＸ単体による測定系への影響分を差し引いた。）に、上記希釈率を乗じて算出した。
また、以後の試験例において抗体を結合しないリポソームとして使用したリポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）（ＬＰ）若しくは抗癌剤封入リポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）（ＤＯＸ−ＬＰ）については、上記と同様に表１の処方１若しくは表１の処方３のマレインイミド基非導入リポソームのリン脂質濃度を測定し、対応する抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのリン脂質濃度に合わせてＰＢＳで希釈し使用した。
実施例３：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの調製（調製例▲８▼）
Ｆａｂ’画分とマレインイミド基導入リポソームのマレインイミドモル比を１：３となるようにした以外は、実施例２と同様の方法で、表１処方４のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ（マレインイミド濃度：１００ｎｍｏｌ／ｍｌ）よりＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲８▼（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率１４％）を得た。第５図はこのときのゲル濾過溶出の様子を示したものである。Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ画分はフラクション番号１４から１５番に溶出し、フラクション番号２９から３５番に溶出する未反応Ｆａｂ’量が前記実施例２と比較し減少した。
実施例４：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの調製（調製例▲９▼及び（１０））
Ｆａｂ’画分とマレインイミド基導入リポソームのマレインイミドモル比を１：０．２５、１：１．６、１：２及び１：４．５とした以外は、実施例２と同様の方法でＦａｂ’−ＬＰ及びＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰを得た。表１の処方２のＬＰ−ｍａｌよりマレインイミドモル比を１：１．６として作製されたＦａｂ’−ＬＰ（ＨＳＰＣを基準にした時の希釈率６．０％）を調製例▲９▼、表１の処方４のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌよりマレインイミドモル比を１：２として作製されたＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率２１％）を調製例（１０）とした。
試験例１：リポソームへの抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体の結合の確認
表１の処方２のＬＰ−ｍａｌ、表１の処方４のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ、実施例２及び４にて作製したＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲２▼、▲３▼及び（１０））並びにＦａｂ’−ＬＰ（調製例▲６▼、▲７▼及び▲９▼）を６ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（還元）にてリン脂質濃度が約３μｇ／ｌａｎｅとなるように希釈し、９５℃で５分間置いた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（「マルチゲル４／２０」、第一化学薬品）に供した。Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ又はＦａｂ’−ＬＰを供したレーン１〜６には約３０ｋＤａのＦａｂ’バンドが認められた。一方、ＬＰ−ｍａｌ又はＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌを供したレーン７及び８では認められなかった。全ての抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームに抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体が結合していることが確認された（第６図）。
試験例２：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞接合性評価
１）細胞増殖抑制試験
培地：ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）に、ペニシリンＧカリウム（ＳＩＧＭＡ）、硫酸ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）を各５０Ｕ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、さらに非働化したウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を１０％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加えた。ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔのヒト繊維肉腫細胞ＨＴ１０８０若しくはヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７を０．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて２回洗浄後、少量残した０．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳをなじませ、約５分間静置することにより細胞を剥離した。培地を適当量加え細胞を懸濁後、室温下１０００ｒ．ｐ．ｍ、３分間遠心した。上清を吸引後、１〜２ｍｌの培地に懸濁した細胞懸濁液の一部に等量のトリパンブルー溶液を加え染色後、血球計数板にてカウントした。必要な細胞密度となるように培地を加え希釈した。
この細胞懸濁液を９６穴マイクロプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターにて約２４時間培養し、細胞をプレートに接着させた。一方、ＤＯＸ−ＬＰ（表１処方３）及びＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲２▼及び▲３▼）を必要なリン脂質濃度となるように培地にて希釈しサンプルとした。このサンプルを先の細胞に５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、さらに１時間培養した。未反応サンプルを除去する目的で、培地を吸引除去後、ＰＢＳを２００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、細胞を洗浄した。洗浄操作は２回繰り返した。洗浄後直ちに新たな培地を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、さらに２４時間培養し、以下のＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｓｓａｙを行った。一部のプレート（ｓｔａｒｔ値確認用）は、洗浄後の２４時間の培養を行わず、培地添加後直ちにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｓｓａｙを行った。
Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｓｓａｙ：「Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ」（和光純薬工業）の添付文書に従い調製しフィルター濾過滅菌したＷＳＴ−１溶液を１０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、攪拌後さらに４時間培養した後、Ａ４５０を測定した。このＡ４５０値は、生細胞数に比例し上昇する。
試験群は、Ｂｌａｎｋ（培地のみ）、Ｃｏｎｔｒｏｌ（細胞に培地を添加）及び各Ｓａｍｐｌｅ（細胞にＤＯＸ−ＬＰ又はＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰを添加）群を設定し、各群ｎ＝４にて試験した。各サンプルのリン脂質濃度（Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｎ．（μｇ／ｍｌ））は、細胞にサンプルを添加した時の濃度を記した。細胞増殖抑制率（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、以下の式に各試験群のＡ４５０の平均値を代入して算出した。
Ｉｎｈｂｉｔｉｏｎ＝１−｛（Ｓａｍｐｌｅ ａｔ ２４ｈｒ−Ｂｌａｎｋ ａｔ ２４ｈｒ）−（Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔ ｓｔａｒｔ−Ｂｌａｎｋ ａｔ ｓｔａｒｔ）｝／｛（Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔ ２４ｈｒ−Ｂｌａｎｋ ａｔ ２４ｈｒ）−（Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔ ｓｔａｒｔ−Ｂｌａｎｋ ａｔ ｓｔａｒｔ）｝（％）
有意差検定は、バートレットの等分散検定にて各群が等分散であることを確認後、Ｔｕｋｅｙタイプ多重比較検定を行い、ＤＯＸ−ＬＰ群とＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ群間の有意差を検定した。
ｓｔａｒｔ値にＤＯＸ−ＬＰ若しくはＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰの影響は認められなかった（第７図及び第８図）。
一方、細胞洗浄後２４時間培養においては、ＨＴ１０８０細胞の場合、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ群は、ＤＯＸ−ＬＰ群より有意に低い吸光度を示し、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を結合させることにより細胞増殖をより強く抑制することが確認され（第７図）、その細胞増殖の抑制作用は用量依存的であった（第８図）。また、ＭＴ１−ＭＭＰを発現しないＭＣＦ−７細胞の場合、抗体結合の有無による顕著な差は認められなかった（第７図及び第８図）。抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を結合している抗癌剤封入リポソームのみがＭＴ１−ＭＭＰを発現しているＨＴ１０８０細胞の細胞増殖を用量依存的に抑制することが確認された。
２）蛍光抗体法
前記１）の試験と同様に継代した約１．５ｘ１０５ｃｅｌｌ／ｍｌのＨＴ１０８０細胞懸濁液をチェンバースライド（ＮＵＮＣ）に１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、一晩培養した。培養上清を吸引除去後、チェンバーとスライドを分離し、ＰＢＳを満たした洗浄瓶にスライドを入れ、７回タッピングし、非接着細胞を除去した。このスライドを湿潤箱に静置し、ＬＰ（表１の処方１を調製例▲７▼のリン脂質濃度に合わせてＰＢＳにて希釈したもの）或いはＦａｂ’−ＬＰ（調製例▲７▼）を２０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、低温室にて遮光下約１時間反応させた。反応後、未反応のリポソームサンプルを除去するために、ＰＢＳ洗浄（１５回タッピング）を行い、直ちに落射蛍光顕微鏡装置（オリンパス）にて観察し、冷却ＣＣＤカメラ（キーエンス）にて撮影した。Ｆａｂ’−ＬＰをリポソームサンプルとした場合には、ほとんどすべての細胞（主として細胞膜）に強い緑色の蛍光が認められた。一方、同抗体を結合しないＬＰの場合は蛍光が認められなかった。抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を結合しているリポソームのみがＭＴ１−ＭＭＰを発現しているＨＴ１０８０細胞の細胞膜上に接合することが確認された。
試験例３：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのｉｎ ｖｉｖｏ細胞接合性評価（腹膜播種モデル）
１）ｉｎ ｖｉｖｏ細胞接着試験
Ｂａｌｂ−ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス、６週令）にＨＴ１０８０細胞を１×１０６個／マウス腹腔内投与後、１４日目にＬＰ（表１の処方１を調製例▲５▼のリン脂質濃度に合わせてＰＢＳにて希釈した）或いはＦａｂ’−ＬＰ（調製例▲５▼）を５０μｌ／マウス腹腔内投与した。２日後、腹膜腫瘍を摘出し、その割面を蛍光顕微鏡冷却ＣＣＤカメラで観察した。腫瘍表層には、ＬＰ或いはＦａｂ’−ＬＰ投与マウスのいずれにおいてもリポソームの接着（蛍光シグナル）を認めた。腫瘍内部においては、Ｆａｂ’−ＬＰ投与マウスのみにおいてリポソームの接着（蛍光シグナル）を認めた（第９図）。
２）ｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性試験
Ｂａｌｂ−ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス、６週令）にＨＴ１０８０細胞を１×１０６個／マウス腹腔内投与後、２１日目にＤＯＸ−ＬＰ（表１の処方３を調製例▲４▼のリン脂質濃度に合わせてＰＢＳにて希釈した）又はＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲４▼）を５０μｌ／マウス腹腔内投与した。対照としてリポソームの代わりにＰＢＳを使用した。７日後、腹膜腫瘍を摘出し、その割面を肉眼で観察した。また、その病理像をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により観察した。ＨＥ染色は通常の方法に従い、以下のように行った。ホルマリン固定後パラフィン包埋し、ミクロトームにて薄切した切片をキシレンにて脱パラフィンし（６５℃、５分×３系列に浸漬）、アルコール系列にて脱水（１００％エタノールに５分×３系列浸漬後、９５％エタノールに５分間浸漬）後、２〜５分間ヘマトキシリン液に浸漬、水道水にて５〜１０分間水洗し発色後、９５％エタノールに５分間浸漬し、１０〜３０秒間エオジン液に浸漬した。染色後、アルコール系列にて脱水（１００％エタノールに５分×３系列浸漬）後、キシレンにて透徹し（５分×３系列浸漬）、マウントし、ＨＥ染色標本とした。
腫瘍表層と割面の肉眼所見においては、対照に比べてＤＯＸ−ＬＰ又はＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ投与マウスにおいて広く充実性腫瘍の表層に出血壊死部が認められた。またＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ投与マウスでは、内部にも出血班が点在した。ＨＥ染色による各腫瘍の病理像は、対照において血管を伴った充実性、髄様の腫瘍細胞を認めた。ＤＯＸ−ＬＰ投与マウスにおいて表層部に出血性壊死部を認めるが深部腫瘍組織は対照と変わらず健常な腫瘍組織を形成していた。他方、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ投与マウスにおいては、肉眼所見では、ＤＯＸ−ＬＰ投与マウスの腫瘍に比べ、腫瘍表面の凹凸不正が非常に著しく、腫瘍組織そのものが脆かった。さらに病理学的には、表層に続く壊死巣は深部へ広がり、斑状の壊死部が深部腫瘍内に散見された。
試験例４：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのｉｎ ｖｉｖｏ細胞接合性評価（皮下腫瘍モデル）
１）ｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性試験
Ｂａｌｂ−ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス、６週令）背部の左右２箇所にＨＴ１０８０細胞を１×１０６個／マウス皮下投与後、投与部位（左右２箇所）に腫瘍形成を確認し１０日目にＤＯＸ−ＬＰ（表１処方３を調製例▲８▼のリン脂質濃度に合わせてＰＢＳにて希釈したもの）或いはＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲８▼）を２５μｌ腫瘍形成部位（右）皮下及び尾静脈投与した。右側の腫瘍は皮下（局所）投与したリポソームの効果が反映された腫瘍、左側の腫瘍が尾静脈（全身）投与したリポソームの効果が反映された腫瘍と仮定した。また、対照として、ＬＰ（表１の処方１をＰＢＳにてリン脂質濃度０．４６ｍｇ／ｍＬに希釈したもの）を使用した。
７日後、皮下腫瘍を摘出し、その割面を肉眼で観察した。また、その病理像及び血管新生をラット由来抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：５５７３５５）を用いた免疫染色（対比染色：ヘマトキシリン染色）により観察した。免疫染色は以下のように行った。クリオスタットにて厚さ８〜１０μｍの凍結切片を作製した。この凍結切片を冷アセトンにて１０分間固定し、ＰＢＳ洗浄後、０．３％ Ｈ２Ｏ２含有メタノールに浸し、組織内パーオキシダーゼ活性を失活させた。この切片をブロッキング後（０．１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳに２０分間浸漬）、１００倍希釈した抗ＣＤ３１抗体を滴下し、湿潤箱内で２時間、抗原抗体反応を行った。反応後、ＰＢＳ洗浄（１０分×３回）にて未反応の抗ＣＤ３１抗体を除去した後、２００倍希釈したＨＲＰ標識抗ラット抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を滴下し、湿潤箱内で３０分間、抗原抗体反応を行った。反応後、ＰＢＳ洗浄（１０分×２回）にて未反応の２次抗体を除去した後、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．４に約１０分浸漬し、さらに約１０〜２０分間ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンチジンテトラヒドロクロライド）発色した。ＤＡＢ発色後、ヘマトキシリンによる対比染色を行い、マウントし、ＣＤ３１染色標本とした。
腫瘍割面の肉眼所見においては、ＬＰやＤＯＸ−ＬＰに比べ、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰを投与したマウスにおいて腫瘍中心部に潰瘍を認めた。また、その潰瘍は尾静脈投与を反映する腫瘍（左）においても認められたが、皮下投与を反映する腫瘍（右）においてより顕著であった。尾静脈投与を反映する腫瘍の病理所見において、ＤＯＸ−ＬＰに比べ、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰを投与したマウスにおいて抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体特異的な抗腫瘍効果（中心部壊死）が認められ、ＣＤ３１染色結果から、腫瘍内新生血管の走行及び形成の乱れが認められた。さらに、ＤＯＸ−ＬＰ尾静脈投与を反映する腫瘍においては血管走行が比較的保たれているのに比べ、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ尾静脈投与を反映する腫瘍においては血管走行が乏しく、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰによる新生血管へのダメージが先行して生じる可能性が示唆された。
実施例５以降に用いる略語の意味を示す。
Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰ：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−１Ｄ８）結合抗癌剤封入リポソーム
Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰ：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−１Ｄ８）結合蛍光剤封入リポソーム
Ｆａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−２Ｄ１２）結合蛍光剤封入リポソーム
ＤＯＸ−ＬＰ：抗癌剤封入リポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）
ＮＢＤ−ＬＰ：蛍光剤封入リポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）
ＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ：マレインイミド基導入抗癌剤封入リポソーム
ＮＢＤ−ＬＰ−ｍａｌ：マレインイミド基導入蛍光剤封入リポソーム
実施例５：種々抗体結合率を示す抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（２２２−１Ｄ８）結合リポソームの調製（調製例▲１１▼〜▲１６▼）
ＷＯ０２／０４１０００Ａ１記載の方法に従って得た抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞（クローン番号２２２−１Ｄ８）を用い、実施例２−１）および２）と同様の方法で得たＦａｂ’画分（これをａとする）にＮＢＤ−Ｃ６−ＨＰＣを添加せず、ＤＳＰＥ−ＰＥＧおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬを溶液状態で添加した以外は実施例１−１）と同様の方法で得た表２処方５〜１０の各種マレインイミド基導入抗癌剤（ドキソルビシン（ＤＯＸ））封入リポソーム（ＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ）（マレインイミド濃度：０、２．６、５．２、２６、５２、１０４ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率：０、０．５、１、５、１０、２０％）（これをｂとする）をａとｂとがマレインイミドモル比で１：１となるように加えて混合した。
低温室で遮光下、２０時間反応させた後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレインイミド（０．１Ｍ水溶液を添加）で未反応のチオール基をブロックした。これをＰＢＳで平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径１．５または３．０ｃｍ×長さ４７ｃｍ）に供し、２または８ｍｌづつ分画し、実施例２−３）と同様な方法で、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−１Ｄ８）結合抗癌剤封入リポソーム（Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰ）画分をボイドボリュームから回収、プールし、Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲１１▼〜▲１６▼）を得た。一方、未反応Ｆａｂ’は、フラクション番号２９から３５番前後に溶出し、リポソーム画分と未反応Ｆａｂ’画分がゲル濾過にて分離されたことを確認した。
また、リポソームもしくは抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの脂質濃度は、コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業）にて測定したコレステロール濃度を脂質濃度として使用した。なお、ＤＯＸ単体による測定系への影響は認められず、このコレステロール濃度とＨＰＬＣによるＤＯＸ濃度との間には良好な相関関係が認められた。したがって、以後の試験例においては、抗体を結合しないリポソームと抗体を結合したリポソーム間で、コレステロール濃度が一定になるようにＰＢＳで希釈し使用した。
実施例６：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（２２２−２Ｄ１２）結合リポソームの調製（調製例▲１７▼）および対照リポソームの調製（調製例▲１８▼、▲１９▼）
ＷＯ０２／０４１０００Ａ１記載の方法に従って得たクローン番号２２２−２Ｄ１２の抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を用い実施例２−１）および２）と同様の方法で得たＦａｂ’画分を用いたことと、マレインイミド基導入リポソームのマレインイミドモル比を１：３となるようにした以外は、実施例５と同様の方法で、ＮＢＤ−Ｃ６−ＨＰＣを添加したＤＯＸを封入しない表２処方１１のＮＢＤ−ＬＰ−ｍａｌ（マレインイミド濃度：１３０ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率：１０％）よりＦａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼）を得た。また、このリポソームの対照例として、クローン番号２２２−１Ｄ８由来のＦａｂ’を同じＮＢＤ−ＬＰ−ｍａｌに結合させたＦａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１８▼）および表２処方１２のＮＢＤ−ＬＰをゲル濾過したリポソーム（調製例▲１９▼）も同様に調製した。
試験例５：リポソームへの抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体の結合の確認
１）ＨＲＰ−Ｆａｂ’との競合による確認
組換え大腸菌より精製したヒトＭＴ１−ＭＭＰ（１５０μｇ／ｍＬ）を０．１Ｍ Ｎａ−Ｐ ｐＨ７．０にて６０００倍に希釈し、充分に攪拌した。これを、９６穴プレート枠にセットしたイムノモジュールに１００μＬずつ加え、プレートシール後、低温室に一晩以上静置し、抗原をコーティングした（ａとする）。
実施例５および６で調製した各種リポソーム（調製例▲１１▼〜▲１９▼）をコレステロール濃度が１０μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、０．４％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液を同容量加え混合後、３７℃恒温槽に一晩静置し、界面活性剤処理を行った（ｂとする）。ａを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液にて３００μＬ／ｗｅｌｌ、３回洗浄し、１０ｍＭ ＩＲＢ（１％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、３０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）を３００μＬ／ｗｅｌｌ加え、２５℃恒温槽に１時間静置し、ブロッキングした（ｃとする）。標準曲線用のＩｇＧ（２２２−１Ｄ８）をＰＢＳにて１００μｇ／ｍＬに希釈し、さらに０．２％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液にて順次希釈し、標準曲線系列用溶液（１２．５、３．１２５、０．７８１、０．１９５、０．０４９、０μｇ／ｍＬ）を調製した（ｄとする）。ＨＲＰ−Ｆａｂ’（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを標識した２２２−１Ｄ８由来Ｆａｂ’）を１０ｍＭ ＩＲＢにて希釈し、０．１２５μｇ／ｍＬ溶液を調製した（ｅとする）。ｂまたはｄと、ｅを容量比１：４にて混合した（ｆとする）。ｃをリン酸緩衝液にて３００μＬ／ｗｅｌｌ、３回洗浄後、ｆを１００μＬ／ｗｅｌｌ（ｎ＝２）加え、２５℃恒温槽に１時間静置し、抗原抗体反応（競合反応）を行った（ｇとする）。ｇを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液にて３００μＬ／ｗｅｌｌ、３回洗浄し、ＴＭＢ（Ｂｉｏ ＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、２５℃恒温槽に１５分間静置し、ＴＭＢを基質としたＨＲＰの酵素反応を行った（ｈとする）。ｈに１Ｎ Ｈ２ＳＯ４水溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、反応を停止し直ちにＡ４５０を測定した。なお、ｄにおいて０μｇ／ｍＬのウェル、ａにおいて抗原をコーティングしないウェルを作成、それぞれを対照、ブランクとした。標準曲線系列のＡ４５０から、ＩｇＧ濃度に依存した競合反応であることを確認した（表３）。
このＩｇＧ濃度依存競合曲線を標準曲線とし、各抗体リポソームサンプル中のＩｇＧ換算量を算出した。Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰもしくはＦａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰをサンプルとした場合の吸光度は、溶媒をサンプルとした場合（対照）、抗体非結合リポソームや２２２−２Ｄ１２抗体結合リポソームをサンプルとした場合（非競合検体）と比較し、明らかに低い値を示し、ＨＲＰ−Ｆａｂ’の抗原抗体反応が競合された。種々濃度のマレインイミド基をもつリポソームと抗体を結合させ調製した調製例▲１１▼〜▲１６▼については、マレインイミド濃度に比例して、競合率が上昇した。すなわち、算出した単位コレステロール量あたりのＩｇＧ換算量は、使用したＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌのマレインイミド濃度にほぼ比例して変動し、種々抗体結合率のＦａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰが得られたことが確認された（表４）。
これより、抗体結合リポソームの抗体結合率をコントロールするためには、抗体結合リポソームの調製時に、リポソームに導入するマレインイミド量を変動させることが有効であることを見出した。
２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認
Ｆａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼）を６×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（還元）にてコレステロール濃度が約０．８μｇ／ｌａｎｅとなるように希釈し、また、クローン番号２２２−２Ｄ１２抗体由来のＦ（ａｂ’）２を６×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（還元）にてタンパク濃度が約１μｇ／ｌａｎｅとなるように希釈し、いずれも９５℃で５分間置いた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供し、ＣＢＢで染色した。
レーン１（Ｆａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼））、レーン２（２２２−２Ｄ１２抗体由来のＦ（ａｂ’）２）共に、約３０ｋＤａのＦａｂ’バンドが認められた。したがって、調製例▲１７▼の抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−２Ｄ１２）結合リポソームに抗体が結合していることが確認された（第１０図）。
試験例６：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞接合性評価
１）細胞増殖抑制試験
試験例２−１）記載の方法に準じて、ＨＴ１０８０細胞を用いて各種抗体結合リポソームの細胞増殖抑制能を評価した。細胞を９６穴プレートに接着後、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−１Ｄ８）結合抗癌剤封入リポソーム（Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰ）を加え、１時間培養した。培養後細胞を洗浄し、新たな培地を添加し、さらに２４時間培養した。細胞洗浄後２４時間培養した後に、ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｓｓａｙを行い、生細胞数の指標となるＡ４５０をプロットした。各群のｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）を表示した。対照として、Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰの代わりに、培地のみ（対照）もしくは抗体を結合しない抗癌剤封入リポソーム（ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲１１▼））、抗癌剤単独（ｆｒｅｅ ＤＯＸ）を加えた。また、細胞を加えず培地のみを同様に処理した群をブランクとした。なお、試験例２にて阻害率算出などに使用していたｓｔａｒｔ値は、ＤＯＸ単体（ｆｒｅｅ ＤＯＸ）１００μｇ／ｍｌをサンプルとした場合の吸光度と殆ど変わらないことを複数回の試験により確認し、ｆｒｅｅ ＤＯＸ １００μｇ／ｍｌ群の値をｓｔａｒｔ値として使用した。このｓｔａｒｔ値は、第１１図および第１２図中のＡ４５０値０．６付近に表記した。
調製例▲１１▼〜▲１６▼について試験した結果、ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率が１％以下（表２処方６、７）のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌより調製した調製例▲１２▼〜▲１３▼には、細胞増殖抑制活性は殆ど認められなかった。一方、ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率が５％以上のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ（表２処方８〜１０）より調製した調製例▲１４▼〜▲１６▼には、細胞増殖抑制活性が認められ、その活性は、原料のＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率に比例したものであった。すなわち、２０％のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ（表２処方１０）より調製した調製例▲１６▼は、対照のＤＯＸ−ＬＰのおよそ１０倍、１０％のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ（表２処方９）より調製した調製例▲１５▼は、約６〜９倍、５％のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ（表２処方８）より調製した調製例▲１４▼は、約２倍程度の細胞増殖抑制活性をもつことが示された（第１１図、第１２図）。表５はＤＯＸ濃度２５μｇ／ｍＬにおけるＨＴ１０８０細胞増殖抑制率（１００−［サンプル］／（［対照］−［ＤＯＸ（１００μｇ／ｍＬ）］）×１００、［］内は各群のＡ４５０値の平均値）をまとめた表である。
以上の試験例５−１）の結果および試験例６−１）の結果より、抗体結合に使用するマレインイミド導入リポソームのマレインイミド導入率と競合法により得られる抗体結合リポソームの推定抗体結合率と、このＨＴ１０８０細胞増殖抑制能は、パラレルな関係にあることが示唆された。
これらの実施例および試験例は、種々の抗体結合率を有する抗体結合リポソームの調製例を示したもの、種々の抗体結合率を有する抗体結合リポソームが有する細胞増殖抑制能の評価方法を示したもの、また、リポソームに対する抗体結合量が抗体結合リポソームの細胞増殖抑制能を制御する因子のひとつであることを示したものであって、本願記載の抗体結合リポソームの処方、調製方法、マレインイミド基の数、抗体の種類、抗体結合率、封入する薬剤の種類や濃度などを限定するものではない。
２）蛍光抗体法
試験例２−２）記載の方法に準じて、ＰＬＰ（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）固定したＨＴ１０８０細胞を用いて蛍光抗体染色を行った。
調製例▲１７▼〜▲１９▼をコレステロール濃度が約１００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳにて希釈した液をサンプルとして試験した。なお、これらの希釈サンプル液の蛍光強度がほぼ等しいことを蛍光吸光度プレートリーダー（パーキンエルマー社、ｗａｌｌａｃ１４２０マルチラベルカウンター）による蛍光強度測定にて確認した。
Ｆａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼）もしくはＦａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１８▼）とＨＴ１０８０細胞を反応させた場合には、ほとんどすべての細胞（主として細胞膜）に緑色の蛍光が認められた。一方、これらの抗体を結合しないＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１９▼）の場合は蛍光が認められなかった。
抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を結合しているリポソームのみがＭＴ１−ＭＭＰを発現しているＨＴ１０８０細胞の細胞膜上に接合することが確認され、この接合は抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体２２２−１Ｄ８および２２２−２Ｄ１２結合リポソームで同様に認められた。
試験例７：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのｉｎ ｖｉｖｏ細胞接合性評価（皮下腫瘍モデル）
１）ｉｎ ｖｉｖｏリポソーム取り込み実験
Ｂａｌｂ−ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス、７〜８週令）の背部皮下にＨＴ１０８０を１×１０６個／マウス移植後１４〜２１日目に、ＰＢＳに希釈したＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１９▼）、Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１８▼）或いはＦａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼）を各１５μｇ（コレステロール量）／２００μｌ／マウス尾静脈投与した。投与２時間後、皮下腫瘍を摘出し、鋭剪にて厚さ約２〜３ｍｍの組織スライスをつくり、ＰＢＳにて３０分軽く洗浄した後、蛍光顕微鏡冷却ＣＣＤカメラで観察した。
Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１８▼）およびＦａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼）投与群では、特に径の小さい（１ｃｍ未満）腫瘍の周囲血管（新生血管）付近に、特異的な蛍光シグナルが検出された。一方、抗体の結合していないリポソーム（調製例▲１９▼；ＮＢＤ−ＬＰ）では、腫瘍の周囲血管（新生血管）を含めて腫瘍組織における明確な蛍光シグナルは認められなかった。以上の結果より、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームは、増殖中の腫瘍の周囲血管（新生血管）に有意に集積されることが示された。
試験例８：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのステルス性評価
１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ凝集性評価
調製例▲１１▼〜▲１９▼をコレステロール濃度７５μｇ／ｍｌになるようＰＢＳにて希釈した液４０μＬと、ＰＢＳまたは１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地を６０μＬとを混合後、室温にて１５、３０、６０分間静置した（調製例▲１７▼〜▲１９▼については３０分のみ）。軽く攪拌した後の吸光度（６３０ｎｍ）を測定し、実体顕微鏡にてリポソームの凝集の有無を観察した。調製例▲１１▼〜▲１５▼および▲１７▼〜▲１９▼の吸光度は、混合させる媒体がＰＢＳの場合と１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭの場合で差が認められず、また、対応する抗体非結合リポソーム（調製例▲１１▼および▲１９▼）の吸光度との差が認められなかったが、調製例▲１６▼と１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地を混合した場合に、凝集に伴う明らかな吸光度の上昇が認められ、顕微鏡観察においても、明らかな凝集像が認められた（表６）。
２）ｉｎ ｖｉｖｏ血中滞留性試験
Ｂａｌｂ／ｃＡｎＮＣｒｊ−ｎｕマウス（オス、６〜７週令）に、超遠心機にて濃縮したＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲１１▼）またはＦａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲１４▼〜▲１６▼）を各７．５ｍｇ（ＨＰＬＣ測定によるＤＯＸ量）／ｋｇ尾静脈内投与した。投与２、６、２４、４８および７２時間後、各マウスから血漿を採取し、ＤＯＸ未変化体としての血漿中濃度をＨＰＬＣ蛍光検出法にて測定した。表７に、各群の各採血ポイント当たりｎ＝３のマウスから得られた血漿中ＤＯＸ濃度の平均値を記載した。調製例▲１１▼、▲１４▼及び▲１５▼は、ほぼ同様な血漿中濃度の変動を示したのに対して、調製例▲１６▼は、投与後、速やかに血漿中濃度が低下し、その後も調製例▲１１▼、▲１４▼及び▲１５▼の１／１０程度の滞留しか認められなかった（表７）。
以上の結果より、ｉｎ ｖｉｔｒｏ凝集評価試験におけるＦＣＳとの混合後認められる吸光度（６３０ｎｍ）の上昇は、リポソームの凝集を反映したものであり、かつ、この凝集によって、ｉｎ ｖｉｖｏ血中滞留性が明らかに低下することが示唆された。また、ＦＣＳとの混合により凝集を示しｉｎ ｖｉｖｏ血中滞留性が低下した抗体結合リポソームは調製例▲１６▼（ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率：２０％のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌより調製）のみであったことより、多量に抗体を結合したリポソームはステルス性を悪化させることが判明した。これに対し、ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率が１０％のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌより調製した調製例▲１５▼は、ステルス性の悪化が認められず、かつ、試験例６より細胞増殖抑制能も有意に認められることから、調製例▲１５▼の処方がより好ましい処方であると示唆された。
これらの実施例および試験例は、種々の抗体および抗体結合率を有する抗体結合リポソームの凝集性の評価方法を示したもの、血中滞留性の評価方法を示したもの、また、リポソームに対する過剰な抗体結合が抗体結合リポソームの性能低下の要因のひとつであることを見出した試験例を示したものであって、本願記載の抗体結合リポソームの処方、調製方法、マレインイミド基の数、抗体の種類、抗体結合率、封入する薬剤の種類や濃度などを限定するものではない。
【産業上の利用可能性】
本発明の抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体は、薬効成分及び／又は遺伝子を細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）が発現した腫瘍細胞に対して効率的に送達することができ、さらに腫瘍内部における血管新生先端部位に対しても薬効成分及び／又は遺伝子を効率的に送達するドラッグデリバリーシステムとして有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【技術分野】
本発明は、抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を含有する新規な脂質膜構造体に関する。
【背景技術】
マトリックスメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰｓ）は、細胞外マトリックス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ：ＥＣＭ）と基底膜成分のさまざまな構成タンパク質を分解し、細胞外マトリックス代謝に必須であると考えられている亜鉛依存性のエンドペプチダーゼのファミリーである。これらの酵素群は、正常な胚の発生、骨の成長あるいは創傷の治癒など、結合組織の再構成に関連しており、また、アテローム性動脈硬化症、肺気腫、リウマチ性関節炎、癌の浸潤・転移などの各種の病的な過程にも関与することが明らかにされてきている。これまでに、数多くの哺乳類ＭＭＰｓがｃＤＮＡクローニングによりアミノ酸レベルまで解析されている。
例えば、哺乳類ＭＭＰｓとして、ＭＭＰ−１（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）；ＭＭＰ−２（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａ）；ＭＭＰ−３（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−１）；ＭＭＰ−７（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）；ＭＭＰ−８（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ）；ＭＭＰ−９（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ｂ）；ＭＭＰ−１０（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−２）；ＭＭＰ−１１（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−３）；ＭＭＰ−１２（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｅｌａｓｔａｓｅ）；ＭＭＰ−１３（ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ−３）；ＭＭＰ−１４（ＭＴ１−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１５（ＭＴ２−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１６（ＭＴ３−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１７（ＭＴ４−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−１９；ＭＭＰ−２０（ｅｎａｍｅｌｙｓｉｎ）；ＭＭＰ−２４（ＭＴ５−ＭＭＰ）；ＭＭＰ−２５（ＭＴ６−ＭＭＰ）などが知られている。これらのＭＭＰｓは、１次構造、基質特異性及び細胞分布により、少なくとも４種のサブファミリー：コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン及び細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼ類（ＭＴ−ＭＭＰｓ）に分類されているが、このうちＭＴ−ＭＭＰｓサブファミリーは、最も新しくＭＭＰｓのサブクラスとして報告されたものであり、ＭＭＰｓに保存された領域に対するディジェネレートプライマーとＲＴ−ＰＣＲによって、これまでＭＴ１−ＭＭＰ，ＭＴ２−ＭＭＰ，ＭＴ３−ＭＭＰ，ＭＴ４−ＭＭＰ，ＭＴ５−ＭＭＰ，ＭＴ６−ＭＭＰなどが単離同定されている（Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４）；Ｗｉｌｌ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３１，６０２−６０８（１９９５）；Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，２３０１３−２３０２０（１９９５）；Ｐｕｅｎｔｅ Ｘ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５６，９４４−９４９（１９９６）；特開２０００−２７０８７４号公報；Ｐｅｉ，Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，８９２５−８９３２（１９９９）；Ｋａｊｉｔａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，４５７，３５３−３５６（１９９９））。
ＭＴ−ＭＭＰｓは、多くのＭＭＰｓに特徴的なヘモペキシンドメインの後方に、単一の膜貫通領域と短い細胞内テールを持つＩ型の膜タンパク質である。さらに、これらには、プロペプチドと活性ドメインの間に塩基性アミノ酸の挿入が共通して存在しており、フィウリン（ｆｕｒｉｎ）あるいはフィウリン様酵素による切断でこれらの膜タンパク質の活性化がおきる（Ｐｅｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，９１３５−９１４０（１９９６）；Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３９３，１０１−１０４（１９９６）；Ｃａｏ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，３０１７４−３０１８０（１９９６））。
細胞が組織内を移動・浸潤・転移する際には、その周りを取り囲む細胞外基質（ＥＣＭ）の分解が必須のステップである。そのステップに中心的な役割を担っているのがＭＭＰと呼ばれる酵素群であり、なかでも細胞膜表面に発現するＭＴ１−ＭＭＰは癌の移動・浸潤・転移及び血管新生においてその役割が重要視されている。ＭＴ１−ＭＭＰは、細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ １ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ：ＭＴ１−ＭＭＰ）あるいはＭＭＰ−１４とも呼ばれる酵素（ＭＥＲＯＰＳ ＩＤ：Ｍ１０．０１４）で、ヒトにおいてはその染色体遺伝子座１４ｑ１１−ｑ１２を占める遺伝子（Ｍｉｇｎｏｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２８，３６０−３６１（１９９５））の産物であると報告されている。この酵素については、ＤＮＡクローニング並びに組換えタンパク質の発現によりその存在が確認されるとともに詳細な構造及び特性が明らかにされている（Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４）；Ｔａｋｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１５５，２９３−２９８（１９９５）；特開平７−２０３９６１号公報；特開平７−３０３４８２号公報；ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：Ｄ２６５１２）。ＭＴ１−ＭＭＰは、ヒトの他、イヌ、ヤギ、ウサギ、イノシシ、ネズミなどでもその存在が確認されている。ヒトＭＴ１−ＭＭＰのｃＤＮＡは、５８２個のアミノ酸残基をコードし（ＥＭＢＬ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｄ２６５１２，Ｅ０９７２０ ＆Ｅ １０２９７；ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ：Ｐ５０２８１）、その構造はシグナルペプチドに続くプロペプチドドメイン、ストロメライシン−３（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ−３）に類似した特異な１０個のアミノ酸残基からなる挿入配列（フィウリン（ｆｕｒｉｎ）−様酵素認識部位の可能性のある配列）、亜鉛結合サイトの可能性を持つ部位を有するコア酵素ドメイン、ヒンジドメイン、ヘモペキシン様ドメイン、膜貫通（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ：ＴＭ）ドメインからなっている。
これまでに、ＭＴ１−ＭＭＰが同じＭＭＰメンバーであり基底膜分解酵素であるゼラチナーゼＡ（ＭＭＰ−２）の潜在型（プロゼラチナーゼＡ／７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ：ｐｒｏＭＭＰ−２）を活性化すること、及び、ＭＴ１−ＭＭＰ自身もＩ，ＩＩ及びＩＩＩ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン及びａｇｇｒｅｃａｎなど様々なＥＣＭ分子を分解することが解明されている。また、ＭＴ１−ＭＭＰが腫瘍浸潤や転移の過程を促進することも示されている（Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，Ａｐｍｉｓ，１０７，１３７−１４３（１９９９）；Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４））。さらに、ＭＴ１−ＭＭＰはｐｒｏＭＭＰ−２（Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４））やプロコラゲナーゼ−３（ｐｒｏＭＭＰ−１３）（Ｋｎａｕｐｅｒ，Ｖ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，１７１２４−１７１３１（１９９６））のような他のＭＭＰｓを活性化することも知られている。このように、ＭＴ１−ＭＭＰの発現は細胞表面での多様なタンパク分解酵素カスケードの開始に関与する可能性があり、ＭＴ１−ＭＭＰは癌細胞浸潤や転移（Ｓｅｉｋｉ，Ｍ．，Ａｐｍｉｓ，１０７，１３７−１４３（１９９９）；Ｓａｔｏ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７０，６１−６５（１９９４））だけでなく脈管形成（Ｈｉｒａｏｋａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ９５，３６５−７７（１９９８）；Ｚｈｏｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，４０５２−４０５７（２０００））や骨格発育（Ｚｈｏｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，４０５２−４０５７（２０００）；Ｈｏｌｍｂｅｃｋ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９９，８１−９２（１９９９））のような他の生理的プロセスにも関与していることが示されている。このようにＭＴ１−ＭＭＰは組織における生理的、病理学的細胞浸潤に対する必要な道具であると考えられる。
一方、従来より、ドラッグデリバリーシステムとしてモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体が種々提案されてきたが、十分に満足すべき性能を有している脂質膜構造体は未だ提供されていない。また、抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体は従来知られていなかった。
【発明の開示】
本発明の課題は、抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体（以下、本明細書において、細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼを「ＭＴ−ＭＭＰ」、抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を「抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体」と略す場合がある）を含有する脂質膜構造体を提供することにある。より具体的には、ＭＴ−ＭＭＰが発現した腫瘍細胞などに対して薬効成分及び／又は遺伝子を効率的に送達するためのドラッグデリバリーシステムとして、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体を提供することが本発明の課題である。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体を提供することに成功し、この脂質膜構造体が、ＭＴ−ＭＭＰが発現した腫瘍細胞に効率的に薬効成分及び／又は遺伝子を送達できることを見出した。また、本発明者らは、上記の脂質膜構造体が、腫瘍内部における血管新生先端部位に対しても効率よく薬効成分及び／又は遺伝子を送達できることを見出した。つまり、本発明の脂質膜構造体は、ＭＴ−ＭＭＰを発現している腫瘍細胞と新生血管を同時にターゲットにし、効率的に薬効成分及び／又は遺伝子を送達できるものである。従来の脂質膜構造体は、腫瘍細胞又は新生血管のどちらか一方のみをターゲットとしているものであり、本発明により、初めて腫瘍細胞と新生血管の両方を同時にターゲットとしうる脂質膜構造体を見出した。従来は、腫瘍がある程度大きくなったような固形癌しかターゲットにできなかったが、本発明の脂質膜構造体によれば、新生血管ができ始めた小さな腫瘍の段階からでも薬効成分及び／又は遺伝子を送達することができ、治療が可能になる。本発明はこれらの知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明により、抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体が提供される。この発明の好ましい態様によれば、該モノクローナル抗体が脂質膜構造体の脂質膜の中、表面、内部、脂質層中、及び／又は脂質層の表面に存在する上記の脂質膜構造体、該モノクローナル抗体を該脂質膜構造体の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体、及び該モノクローナル抗体が該脂質膜構造体の膜表面に結合した上記の脂質膜構造体が提供される。
さらに好ましい態様によれば、該モノクローナル抗体が、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ２−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ３−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ５−ＭＭＰモノクローナル抗体、及び抗ＭＴ６−ＭＭＰモノクローナル抗体から選ばれる１種又は２種以上のモノクローナル抗体である上記の脂質膜構造体；該モノクローナル抗体がヒト型又はマウス型のモノクローナル抗体である上記の脂質膜構造体；該モノクローナル抗体がＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、又はＦａｂ’フラグメントである上記の脂質膜構造体；該モノクローナル抗体を脂質膜構造体に結合させるための物質を含有する上記の脂質膜構造体；該モノクローナル抗体を脂質膜構造体に結合させるための物質が抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体又はそのフラグメント中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体である上記の脂質膜構造体が提供される。
また、本発明により、リン脂質及び／又はリン脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体；リン脂質及び／又はリン脂質誘導体が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファリジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１，２−ジミリストイル−１，２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン及びホスファチジン酸からなる群より選ばれる１種又は２種以上のリン脂質及び／又はリン脂質誘導体である上記の脂質膜構造体；さらにステロール類を脂質膜構造体の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体；ステロール類がコレステロール及び／又はコレスタノールである上記の脂質膜構造体が提供される。
さらに、本発明により、血中滞留性機能を有する上記の脂質膜構造体；血中滞留性脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体；血中滞留性脂質誘導体がポリエチレングリコール脂質誘導体又はポリグリセリンリン脂質誘導体である上記の脂質膜構造体；ポリエチレングリコール脂質誘導体が、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、及びＮ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンからなる群から選ばれる１種又は２種以上のポリエチレングリコール脂質誘導体である上記の脂質膜構造体；温度変化感受性機能を有する上記の脂質膜構造体；温度感受性脂質誘導体を脂質膜構造体中の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体；温度感受性脂質誘導体がジパルミトイルホスファチジルコリンである上記の脂質膜構造体；ｐＨ感受性機能を有する上記の脂質膜構造体；ｐＨ感受性脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する上記の脂質膜構造体；ｐＨ感受性脂質誘導体がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである上記の脂質膜構造体が提供される。
また、腫瘍細胞膜上の細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼと反応する上記の脂質膜構造体；腫瘍細胞がＭＴ−ＭＭＰ発現細胞である上記の脂質膜構造体；腫瘍細胞が線維肉腫、扁平上皮癌、神経芽細胞腫、乳癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、甲状腺腫瘍、尿路上皮癌、グリア芽細胞腫、急性骨髄性白血病、膵管癌、又は前立腺癌の細胞である上記の脂質膜構造体；新生血管の細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼと反応する上記の脂質膜構造体；脂質膜構造体がミセル、エマルション、リポソーム、又はこれらの混合物の形態である上記の脂質膜構造体；水系溶媒分散形態、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、又は凍結形態のいずれかの形態である上記の脂質膜構造体が本発明により提供される。
別の観点からは、上記の脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とを含有する医薬組成物が本発明により提供される。この発明の好ましい態様によれば、薬効成分及び／又は遺伝子が、脂質膜構造体の膜中、表面、内部、脂質層中及び／又は脂質層の表面に存在するものである上記の医薬組成物；及び水系溶媒分散形態、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、又は凍結形態のいずれかの形態である上記の医薬組成物が提供される。
抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体から公知の方法により作製した酵素標識モノクローナル抗体と上記の脂質膜構造体の双方が抗原物質に対して起こす競合反応を酵素免疫学的方法により検出することを特徴とする該脂質膜構造体に含有される抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体の量を推定する方法が本発明により提供される。
さらに別の観点からは、ＭＴ−ＭＭＰが関わる種々の疾病、例えば、腫瘍の予防及び／又は治療方法であって、上記の脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とを含有する医薬組成物をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；薬効成分及び／又は遺伝子を腫瘍細胞及び／又は新生血管に送達する方法であって、薬効成分及び／又は遺伝子を上記の脂質膜構造体に保持させた形態でヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が本発明により提供される。
【図面の簡単な説明】
第１図は、リコンビナントプロテインＡセファロースＦＦゲルカラムを用いて、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（ＩｇＧ）を含む腹水からＩｇＧをアフィニティー精製した結果を示した図である。
第２図は、精製したＩｇＧをペプシン消化した後のゲル濾過の結果を示した図である。
第３図は、Ｆ（ａｂ’）２画分を還元処理した後のゲル濾過の結果を示した図である。
第４図は、Ｆａｂ’画分とマレインイミド基導入抗癌剤（ＤＯＸ）封入リポソームをマレインイミドモル比が１：１となるように混合し、低温、遮光下２０時間反応させた後のゲル濾過の結果を示した図である。
第５図は、Ｆａｂ’画分とマレインイミド基導入抗癌剤（ＤＯＸ）封入リポソームをマレインイミドモル比が１：３となるように混合し、低温、遮光下２０時間反応させた後のゲル濾過の結果を示した図である。
第６図は、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソーム及びマレインイミド基導入リポソームの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す写真である。リポソームに結合したＦａｂ’と予想される大きさのバンドの位置を矢印で示した。レーン１，３，５はＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例（１０）、▲２▼及び▲３▼）、レーン２，４，６はＦａｂ’−ＬＰ（調製例▲９▼、▲６▼及び▲７▼）、レーン７はＬＰ−ｍａｌ、レーン８はＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ、Ｍは分子量マーカーを示す。
第７図は、各リポソームの細胞増殖抑制作用を示した図である。図左半分は、ＭＴ１−ＭＭＰの発現細胞であるＨＴ１０８０細胞を用いた場合、図右半分は、ＭＴ１−ＭＭＰを発現しないＭＣＦ−７細胞を用いた場合の結果である。右表には、Ｃｏｎｔｒｏｌ群のｓｔａｒｔ（細胞洗浄直後）から２４時間の培養の間に増殖した細胞数に対する試験群の細胞増殖抑制率を示した。
第８図は、細胞増殖抑制試験の結果を示した図である。Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰの細胞増殖抑制作用の用量依存性を示した。
第９図は、マウス腹膜播種（ＨＴ１０８０）モデルにおける細胞接着試験の模式図である。ＬＰ（上図）又はＦａｂ’−ＬＰ（下図）を腹腔内投与したモデルの腹膜腫瘍の様子を模式化して示した。□の部分、すなわち腫瘍内部から一部と腫瘍表層から２部の割面について写真撮影を行った。
第１０図は、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−２Ｄ１２）結合リポソームおよびＦ（ａｂ’）２（クローン番号２２２−２Ｄ１２）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥパターンを示す写真である。リポソームに結合したＦａｂ’と予想される大きさのバンドの位置を矢印で示した。
第１１図は、ＨＴ１０８０細胞を用いた細胞増殖抑制試験の結果を示した図である。凡例記載の数値は、各検体のドキソルビシン濃度を表す。
第１２図は、第１１図と同様に細胞増殖抑制試験の結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明の脂質膜構造体は、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を含有することを特徴としている。本発明の脂質膜構造体は、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体以外の成分として、脂質膜構造体を構成する膜構成成分を含んでいる。上記の膜構成成分としては、例えば、リン脂質及び／又はリン脂質誘導体を用いることが好ましい。リン脂質及びリン脂質誘導体としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１，２−ジミリストイル−１，２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、ホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは１種又は２種以上を組み合わせて用いることができる。これらリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチン等の天然物由来のリン脂質を用いることもできる。
本発明の脂質膜構造体は、リン脂質及び／又はリン脂質以外の膜構成成分として、コレステロール、コレスタノール等のステロール類、炭素数８〜２２の飽和又は不飽和のアシル基を有する脂肪酸類、α−トコフェロール等の酸化防止剤を含有してもよい。もっとも、膜構成成分はこれらに限定されることはない。
本発明の脂質膜構造体には、例えば、血中滞留性機能、温度変化感受性機能、及びｐＨ感受性機能などのいずれか１つ又は２つ以上の機能を付与することができ、こ（れら）の機能を付加することによって、例えば、薬効成分及び／又は遺伝子を含む脂質膜構造体からなる本発明の医薬組成物の血液中での滞留性を向上させ、肝臓、脾臓などの細網内皮系組織（ＲＥＴＩＣＵＬＯＥＮＤＯＴＨＥＬＩＡＬ ＳＹＳＴＥＭ）による捕捉率を低下させることができ、あるいは薬効成分及び／又は遺伝子の放出性を高めることができる。
血中滞留性機能を付与することができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、グリコフォリン、ガングリオシドＧＭ１、ホスファチジルイノシトール、ガングリオシドＧＭ３、グルクロン酸誘導体、グルタミン酸誘導体、ポリグリセリンリン脂質誘導体、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン等のポリエチレングリコール誘導体等を挙げることができる。
温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等を挙げることができる。また、ｐＨ感受性機能を付与することができるｐＨ感受性脂質誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等を挙げることができる。
本発明の脂質膜構造体の形態は特に限定されないが、例えば、脂質膜構造体の膜構成成分であるリン脂質等とともに抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体が脂質膜構造体を形成している形態が好ましい。より具体的には、例えば、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体がリン脂質等から構成される脂質膜構造体の脂質膜中、脂質膜表面、脂質膜構造体内部、脂質層中、及び脂質層表面からなる群から選ばれる１以上の部分に存在（結合）している形態を挙げることができる。さらに好ましくは、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体がリン脂質等とともに膜構成成分となって脂質膜構造体を形成した形態、又は抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体が脂質膜構造体の脂質膜表面に結合した形態を挙げることができる。
本発明の脂質膜構造体の形態及びその製造方法は特に限定されないが、形態としては、例えば、乾燥した混合物の形態、あるいは水系溶媒に分散された形態又はこれを乾燥させた形態若しくは凍結させた形態等を挙げることができる。以下に、これらの形態の脂質膜構造体を製造する方法を説明するが、本発明の脂質膜構造体の形態及びその製造方法は上記の形態又は下記に説明する製造方法に限定されることはない。
（１）脂質膜構造体の構成成分全てを用いて製造する方法
乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体は、例えば、脂質膜構造体の構成成分全てを一旦クロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いでエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、上記の乾燥した混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化することで製造することができる。また、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。脂質膜構造体の大きさを制御したい場合には、孔径のそろったメンブランフィルター等を用いて、高圧下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態としては、一枚膜リポソーム、多重層リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などを挙げることができる。本発明の脂質膜構造体の好ましい形態としてリポソームを挙げることができる。分散した状態の脂質膜構造体の大きさは特に限定されるべきものではないが、例えば、リポソームやエマルションの場合には粒子径が５０ｎｍから５μｍであり、５０ｎｍから４００ｎｍが好ましく、５０ｎｍから２００ｎｍが好ましく、５０ｎｍから１５０ｎｍのものがより好ましい。球状ミセルの場合は、粒子径が５ｎｍから１００ｎｍである。ひも状ミセルや不定型の層状構造物の場合は、その１層あたりの厚みが５ｎｍから１０ｎｍでこれらが層を形成しているものが好ましい。なお、粒子径は、準弾性光散乱法による重量平抱粒子径を意味するものである。
水系溶媒（分散媒）の組成は特に限定されるべきものではなく、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地などを挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は脂質膜構造体を安定に分散させることができるが、さらに、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖（水溶液）や、グリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコールなどの多価アルコール（水溶液）等を加えてもよい。この水系溶媒（分散媒）に分散した脂質膜構造体を安定に長期間保存するには、凝集などの物理的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）中の電解質を極力なくすことが望ましい。また、脂質の化学的安定性の面から、水系溶媒（分散媒）のｐＨを弱酸性から中性付近（ｐＨ３．０から８．０）に設定することや窒素バブリングにより溶存酸素を除去することが望ましい。
さらに脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態を乾燥・凍結させた形態は、上記の水系溶媒に分散した脂質膜構造体を通常の凍結乾燥や噴霧乾燥による乾燥・凍結方法等により製造することができる。水系溶媒に分散した形態の脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥すると、脂質膜構造体の長期保存が可能となるほか、この乾燥した脂質膜構造体に薬効成分含有水溶液を添加すると、効率よく脂質混合物が水和されるために薬効成分を効率よく脂質膜構造体に保持させることができる長所がある。
凍結乾燥や噴霧乾燥する場合には、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、イノシトール、リボース、キシロース糖の単糖類、乳糖、ショ糖、セロビオース、トレハロース、マルトース等の二糖類、ラフィノース、メレジノース等の三糖類、シクロデキストリン等の多糖類、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール、マンニトール、マルチトール等の糖アルコールなどの糖（水溶液）を用いると安定に長期間保存することができる。また、凍結する場合には、例えば、前記した糖（水溶液）やグリセリン、ジグリセリン、ポリグリセリン、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、エチレングリコールモノアルキルエーテル、ジエチレングリコールモノアルキルエーテル、１，３−ブチレングリコール等の多価アルコール（水溶液）をそれぞれ用いると安定に長期間保存することができる。糖と多価アルコールとを組み合わせて用いてもよい。脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態における糖又は多価アルコールの濃度は特に限定されるべきものではないが、脂質膜構造体が水系溶媒に分散した状態において、例えば、糖は、２〜２０％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、５〜１０％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。また、多価アルコールは、１〜５％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、２〜２．５％（Ｗ／Ｖ）がさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）として、緩衝液を用いる場合には、緩衝剤の濃度が５〜５０ｍＭが好ましく、１０〜２０ｍＭがさらに好ましい。水系溶媒（分散媒）における脂質膜構造体の濃度は特に限定されるべきものではないが、脂質膜構造体における脂質総量の濃度は、０．１ｍＭ〜５００ｍＭが好ましく、１ｍＭ〜１００ｍＭがさらに好ましい。
（２）段階的に製造する方法（抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体以外の構成成分の一部又は全部を用いて脂質膜構造体を製造した後に、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜表面に結合させる方法）
乾燥した混合物の形態の脂質膜構造体は、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体以外の脂質膜構造体の構成成分の一部又は全部をいったんクロロホルム等の有機溶媒に溶解させ、次いで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体と、場合により脂質膜構造体の構成成分の残余とを添加した後に、エバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことによって製造することができる。
脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態は、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体以外の構成成分の一部又は全部からなる上記の乾燥した混合物を水系溶媒に添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等により乳化し、次いで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体と、場合により脂質膜構造体の構成成分の残余とを添加することで製造することができる。また、乳化操作の代わりに、リポソームを製造する方法としてよく知られている方法、例えば逆相蒸発法などによっても製造することができる。また、得られた脂質膜構造体が水系溶媒に分散した形態のものを通常の方法で、乾燥（凍結乾燥や噴霧乾燥）や凍結することができる。
本発明においては、薬効成分及び／又は遺伝子の送達の効率性から、上記（２）で示した製造方法で製した抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体が好ましい。抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜の表面に存在又は結合させる方法としては、公知の方法（ＳＴＥＡＬＴＨ ＬＩＰＯＳＯＭＥ，第２３３−２４４頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．発行，Ｄａｎｉｌｏ Ｌａｓｉｃ及びＦｒａｎｋ Ｍａｒｔｉｎ編）又はこれに準じた方法を挙げることができる。例えば、脂質膜構造体の構成成分として、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦａｂ’フラグメント等）中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体、具体的にはポリ（エチレングリコール）−α−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ω−マレインイミド、α−［Ｎ−（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォリル−エチル）カルバミル］−ω−｛３−［２−（２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−１−イル）エタンカルボキサミド］プロピル｝−ポリ（オキシ−１，２−エタンジル）等のマレインイミド構造を有する脂質誘導体を含有させることで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜の表面に存在又は結合させることができる。
抗ＭＴ−ＭＭＰ抗体は、所望のＭＴ−ＭＭＰの細胞外ドメイン領域及び／又は関連ペプチド断片などを認識可能な単一のモノクローナル抗体、あるいは各種エピトープに対する特異性を持つ２種以上のモノクローナル抗体を含む組成物であってもよい。また、１価抗体又は多価抗体のいずれでもよく、天然型（ｉｎｔａｃｔ）分子又はそのフラグメント若しくは誘導体を用いてもよい。例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦａｂといったフラグメントを用いてもよく、少なくとも二つの抗原又はエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）結合部位を有するキメラ抗体若しくは雑種抗体、又は、例えば、クワドローム（ｑｕａｄｒｏｍｅ），トリオーム（ｔｒｉｏｍｅ）などの二重特異性組換え抗体、種間雑種抗体、抗イディオタイプ抗体、さらには化学的に修飾あるいは加工などされてこれらの誘導体と考えられるものを用いることもできる。公知の細胞融合又はハイブリドーマ技術や抗体工学を適用し、合成あるいは半合成技術を使用して得られた抗体、抗体生成の観点から公知である従来技術を適用し、ＤＮＡ組換え技術を用いて調製される抗体、ＭＴ−ＭＭＰあるいは標的エピトープに関して中和特性を有する抗体又は結合特性を有する抗体を用いてもよい。
ＭＴ−ＭＭＰを特異的に認識するモノクローナル抗体は任意の方法により産生することができる。「モノクローナル」とは、実質上均質な抗体の集団であることを意味しており、何らかの特定の方法によりその抗体が産生される必要があると限定的に解釈してはならない。個々のモノクローナル抗体は、自然に生じ得る変異体を僅かな量含む可能性があるが、実質的に同一の抗体の集団を含んでいる。上記のように、本発明で用いられるモノクローナル抗体は、ハイブリッド抗体及びリコンビナント抗体を含むが、それらは、所望の生物活性を有する限り、その由来、イムノグロブリンクラス、サブクラスの種別に関わりなく、可変領域ドメインを定常領域ドメインで置き換えたり（例えば、ヒト化抗体）、あるいは軽鎖を重鎖で置き換えたり、ある種の鎖を別の種の鎖でもって置き換えたり、あるいはヘテロジーニアスなタンパク質と融合することが可能である。このような修飾を施したモノクローナル抗体を本発明で用いることもできる。これらの技術については、例えば、米国特許第４８１６５６７号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，７９−９７，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５（１９８４）などに記載されている。
モノクローナル抗体を製造する好適な方法の例としては、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ，４，７２−７９（１９８３）；Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３，３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；トリオーマ法；ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，７７−９６（１９８５））（ヒトモノクローナル抗体を産生するための方法）；米国特許第４９４６７７８号（単鎖抗体の産生のための技術）が挙げられる。抗体に関しては、Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，９，１０１−１０８（１９９０）；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６（１９８８）；Ｂｏｓｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，３７９１−３８０６（１９８４）；Ｂｕｋｏｖｓｋｙ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，６，２１９−２２８（１９８７）；Ｄａｉｎｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６６，２２３−２２９（１９８７）；Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３（１９８８）；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２−５２５（１９８６）；Ｌａｎｇｏｎｅ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（ｅｄ．），″Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ″，Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６８５１−６８５５（１９８４）；Ｏｉ，Ｖ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，２１４−２２１（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３−３２７（１９８８）；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３，６７３６−６７４０（１９８６）；Ｗｏｏｄ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４４６−４４９（１９８５）；Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４５２−４５４（１９８５）あるいはそこで引用された文献（それらの中にある記載はそれを参照することにより本明細書の開示に含められる）を挙げることができる。
本発明における抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体としては、ＭＴ−ＭＭＰを特異的に認識できるモノクローナル抗体であればいかなるものを用いてもよい。抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体の製造のために用いる抗原としてのＭＴ−ＭＭＰとしては、従来、ＭＴ１−ＭＭＰ、ＭＴ２−ＭＭＰ、ＭＴ３−ＭＭＰ、ＭＴ４−ＭＭＰ、ＭＴ５−ＭＭＰ、及びＭＴ６−ＭＭＰの６種類が知られているが、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体はこれらのうちの少なくとも１種、好ましくは１種のみを特異的に認識できることが必要である。また、上記の６種類のＭＴ−ＭＭＰ以外にも、ＭＴ−ＭＭＰに属する抗原が存在する可能性があるが、そのような抗原を認識できるモノクローナル抗体を用いることもできる。
抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体は、ミエローマ細胞を用いての細胞融合技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５）など）を利用して得られたモノクローナル抗体を用いることができる。例えば、ＭＴ−ＭＭＰｓのうちの少なくとも１種、好ましくは特定のＭＴ−ＭＭＰ又はその抗原決定基を含む断片を抗原として公知の方法で製造された抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ２−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ３−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ５−ＭＭＰモノクローナル抗体、及び抗ＭＴ６−ＭＭＰモノクローナル抗体からなる群から選ばれる１種又は２種以上の抗体を用いることができる。より好ましくは抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体である。これらの抗体は、市販されているものもあり、容易に入手することができる。また、脂質膜構造体と結合させる抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体としては、好ましくは抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、又はＦａｂフラグメントを用いることができ、より好ましくはＦａｂ’フラグメントを用いることができる。また、ヒト化したＦａｂ’フラグメントが好ましい。抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体の配合量は、脂質膜構造体の脂質総量に対してモル比が１：０．００００１〜１：０．２５が好ましく、１：０．０００１〜１：０．２がより好ましく、１：０．０００１〜１：０．０１がさらに好ましい。また、脂質膜構造体中にマレインイミド構造を有する脂質誘導体が含まれる場合には、マレインイミド基に対してモル比（抗体：マレインイミド基）が１：０．０１〜１：２０であることが好ましく、１：０．２５〜１：４．５がより好ましく、１：１〜１：３がさらに好ましい。上述の範囲は一例と示したのみであり、必ずしもこの範囲に限定されるべきものではない。
本発明の抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体がその優れた効果を示すには、該脂質膜構造体が凝集しないこと、及び血中滞留性を有することが望ましい。凝集を防止するためには、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体の配合量及び／又は抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を脂質膜構造体の膜の表面に存在又は結合させるための脂質誘導体（例えば、マレインイミド構造を有する脂質誘導体）の含有量を適宜検討すればよい。なお、脂質膜構造体中にマレインイミド構造を有する脂質誘導体を含む場合の当該脂質誘導体の配合量は、上述したとおりである。
抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とを含有する本発明の医薬組成物では、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体に含まれる抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体がＭＴ−ＭＭＰと特異的かつ選択的に反応する。ＭＴ−ＭＭＰは、ある種の腫瘍細胞において発現していることが知られており、また、血管新生に関与することが知られている。しかし、ＭＴ−ＭＭＰが新生血管において発現しているか否かについては、よく分かっていなかった。本発明の医薬組成物をヒト等の動物や実験用細胞に投与すると、薬効成分及び／又は遺伝子を効率的に該腫瘍細胞に送達することができる。ＭＴ−ＭＭＰが発現している腫瘍細胞としては、例えば、線維肉腫、扁平上皮癌、神経芽細胞腫、乳癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、甲状腺腫瘍、尿路上皮癌、グリア芽細胞腫、急性骨髄性白血病、膵管癌及び前立腺癌等の細胞を挙げることができるが、これらの細胞に限定されることはない。また、この医薬組成物をヒト等の動物や実験用細胞に投与すると、腫瘍内部における血管新生先端部位に薬効成分及び／又は遺伝子を効率的に送達することができる。腫瘍内部における血管新生先端部位としては、ｒｕｆｆｌｉｎｇ ｅｄｇｅの内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）などを挙げることができるが、これに限定されることはない。
本発明の医薬組成物は、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子を含有するものであるが、その形態は特に限定されることはない。例えば、上記の脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とが単に混合された形態のほか、上記の脂質膜構造体に薬効成分及び／又は遺伝子が保持された形態でもよい。「保持」とは、薬効成分及び／又は遺伝子が、上記の脂質膜構造体の脂質膜の中、表面、内部、脂質層中、及び／又は脂質層の表面に存在することを意味する。ヒト等の動物に投与することを考慮すると、本発明の医薬組成物は、上記脂質膜構造体に薬効成分及び／又は遺伝子が保持された形態が好ましい。本発明の医薬組成物において、薬効成分及び／又は遺伝子の量は特に限定されず、そ（れら）の薬効を生体（細胞）内で有効に発揮させるのに充分な量であればよい。薬効成分及び／又は遺伝子の種類も特に限定されず、治療及び／又は予防すべき疾患の種類、治療又は予防の目的、脂質膜構造体の形態などにより適宜決定すればよい。
本発明の医薬組成物中に含まれる薬効成分の種類は特に限定されるべきものではないが、例えば、抗腫瘍剤、免疫賦活剤、抗腫瘍効果を有するサイトカイン、造影剤等を挙げることができる。抗腫瘍剤としては、例えば、塩酸イリノテカン、塩酸ノギテカン、エキサテカン、ＲＦＳ−２０００、Ｌｕｒｔｏｔｅｃａｎ、ＢＮＰ−１３５０、Ｂａｙ−３８３４４１、ＰＮＵ−１６６１４８、ＩＤＥＣ−１３２、ＢＮ−８０９１５、ＤＢ−３８、ＤＢ−８１、ＤＢ−９０、ＤＢ−９１、ＣＫＤ−６２０、Ｔ−０１２８、ＳＴ−１４８０、ＳＴ−１４８１、ＤＲＦ−１０４２、ＤＥ−３１０等のカンプトテシン誘導体、ドセタキセル水和物、パクリタキセル、ＩＮＤ−５１０９、ＢＭＳ−１８４４７６、ＢＭＳ−１８８７９７、Ｔ−３７８２、ＴＡＸ−１０１１、ＳＢ−ＲＡ−３１０１２、ＳＢＴ−１５１４、ＤＪ−９２７等のタキサン誘導体、イホスファミド、塩酸ニムスチン、カルボコン、シクロホスファミド、ダカルバジン、チオテパ、ブスルファン、メルファラン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、６−メルカプトプリンリボシド、エノシタビン、塩酸ゲムシタビン、カルモフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート、テガフール、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、リン酸フルダラビン、アクチノマイシンＤ、塩酸アクラルビシン、塩酸イダルビシン、塩酸エビルビシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸ブレオマイシン、ジノスタチンスチマラマー、ネオカルチノスタチン、マイトマイシンＣ、硫酸プレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、エトポシド、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、硫酸ビンブラスチン、塩酸アムルビシン、ゲフィニチブ、エキセメスタン、カペシタビン、ＴＮＰ−４７０、ＴＡＫ−１６５、ＫＷ−２４０１、ＫＷ−２１７０、ＫＷ−２８７１、ＫＴ−５５５５、ＫＴ−８３９１、ＴＺＴ−１０２７、Ｓ−３３０４、ＣＳ−６８２、ＹＭ−５１１、ＹＭ−５９８、ＴＡＴ−５９、ＴＡＳ−１０１、ＴＡＳ−１０２、ＴＡ−１０６、ＦＫ−２２８、ＦＫ−３１７、Ｅ７０７０、Ｅ７３８９、ＫＲＮ−７００、ＫＲＮ−５５００、Ｊ−１０７０８８、ＨＭＮ−２１４、ＳＭ−１１３５５、ＺＤ−０４７３等を挙げることができ、造影剤としては、例えば、アミドトリゾ酸ナトリウムメグルミン、アミドトリゾ酸メグルミン、イオキサグル酸、イオキシラン、イオジキサノール、イオラクタム酸ナトリウム、イオトロクス酸メグルミン、イオトロラン、イオパノ酸、イオパミドール、イオプロミド、イオヘキソール、イオベルソール、イオメプロール等を挙げることができる。
また、本発明の医薬組成物中に含まれる遺伝子としては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、又はＲＮＡのいずれでもよく、特に形質転換等のイン・ビトロにおける導入用遺伝子や、イン・ビボで発現することにより作用する遺伝子、例えば、遺伝子治療用遺伝子等を挙げることができる。遺伝子治療用遺伝子としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、酵素、サイトカイン等の生理活性物質をコードする遺伝子等を挙げることができ、これらのうち遺伝子産物が抗腫瘍効果を有する遺伝子が好ましい。
本発明の医薬組成物において、遺伝子を含む場合、細胞へ遺伝子を効率的に導入するために、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体の構成成分として、遺伝子導入機能を有する化合物を加えることが好ましい。このような化合物としては、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジドデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジテトラデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジヘキサデカノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’−Ｎ−ジオクタデセノイル−Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジエタノールアミンクロリド、Ｏ，Ｏ’，Ｏ’’−トリデカノイル−Ｎ−（ω−トリメチルアンモニオデカノイル）アミノメタンブロミド及びＮ−［α−トリメチルアンモニオアセチル］−ジドデシル−Ｄ−グルタメート、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド、３−β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール等を挙げることができる。これらの遺伝子導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の膜の中、表面、内部、脂質層中及び／又は脂質層の表面に存在（結合）している形態が好ましい。
本発明の医薬組成物は、脂質膜構造体に薬効成分及び／又は遺伝子を添加することにより製造することができ、ＭＴ−ＭＭＰが関わる種々の疾病、好ましくは腫瘍や癌の治療及び／又は予防のための医薬組成物として用いることができる。遺伝子を含む場合には、遺伝子導入用キットとしても用いることができる。本発明の医薬組成物の存在形態及びその製造方法は特に限定されず、上記の脂質膜構造体と同様の形態として調製することが可能である。例えば、形態としては、混合乾燥物形態、水系溶媒に分散した形態、さらにこれを乾燥させた形態や凍結させた形態を挙げることができる。
混合乾燥物形態は、例えば、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体の構成成分と薬効成分及び／又は遺伝子とを一旦クロロホルム等の有機溶媒で溶解させ、次にこれをエバポレータによる減圧乾固や噴霧乾燥機による噴霧乾燥を行うことにより製造することができる。水系溶媒に分散した形態としては、多重層リポソーム、一枚膜リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定形の層状構造物などを挙げることができるが、特に限定されるべきものではない。混合物としての大きさ（粒子径）や水系溶媒の組成なども特に限定されることはないが、例えばリポソームの場合には５０ｎｍ〜５μｍ、５０〜４００ｎｍが好ましく、５０〜２００ｎｍが好ましく、５０〜１５０ｎｍのものがより好ましい。球状ミセルの場合は５〜１００ｎｍ、エマルジョンを形成する場合は５０ｎｍ〜５μｍである。なお、粒子径は、準弾性光散乱法による重量平均粒子径を意味するものである。混合物としての水系溶媒における濃度も特に限定されることはない。なお、脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とを含む混合物が水系溶媒に分散した形態の製造方法としてはいくつかの方法が知られており、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子との混合物の存在様式に応じて、下記のように適当な製造方法を選択することができる。
製造方法１
上述の混合乾燥物に水系溶媒を添加し、さらにホモジナイザー等の乳化機、超音波乳化機、高圧噴射乳化機等による乳化を行い製造する方法である。大きさ（粒子径）を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。この方法の場合、まず抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体の構成成分と薬効成分及び／又は遺伝子との混合乾燥物を作るために、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体、薬効成分及び／又は遺伝子を有機溶媒に溶解する必要があるが、薬効成分及び／又は遺伝子と脂質膜構造体の構成成分との相互作用を最大限に利用できる長所がある。すなわち、脂質膜構造体が層状構造を有する場合にも、薬効成分及び／又は遺伝子は多重層の内部にまで入り込むことが可能であり、この製造方法を用いると薬効成分及び／又は遺伝子の脂質膜構造体への保持率を高くできる長所がある。
製造方法２
抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体の構成成分を有機溶媒で一旦溶解後、有機溶媒を留去した乾燥物に、さらに薬効成分及び／又は遺伝子を含む水系溶媒を添加して乳化を行い製造する方法である。大きさ（粒子径）を制御する場合には、さらに孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。有機溶媒には溶解しにくいが、水系溶媒には溶解し得る薬効成分及び／又は遺伝子に適用できる。脂質膜構造体がリポソームの場合、内水相部分にも薬効成分及び／又は遺伝子を保持できる長所がある。
製造方法３
水系溶媒に既に分散したリポソーム、エマルション、ミセル、又は層状構造物などの抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体に、さらに薬効成分及び／又は遺伝子を含む水系溶媒を添加して製造する方法である。対象となる薬効成分及び／又は遺伝子としては、水溶性のものを利用できる。既にでき上がっている脂質膜構造体に外部から薬効成分及び／又は遺伝子を添加する方法であることから、薬効成分及び／又は遺伝子が高分子の場合には、薬効成分及び／又は遺伝子は脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に存在（結合）した存在様式をとる可能性がある。脂質膜構造体としてリポソームを用いた場合、この製造方法３を用いると、薬効成分及び／又は遺伝子がリポソーム粒子同士の間に挟まったサンドイッチ構造（一般的には複合体あるいはコンプレックスと呼ばれている。）を形成することが知られている。この製造方法では、脂質膜構造体単独の水分散液をあらかじめ製造するため、乳化時における薬効成分及び／又は遺伝子の分解等を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もし易い。したがって、製造方法１や製造方法２に比べて比較的容易に製造することができる。
製造方法４
水系溶媒に分散した抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体を製造して乾燥することにより得られた乾燥物に、さらに薬効成分及び／又は遺伝子を含む水系溶媒を添加して製造する方法である。製造方法３と同様に対象となる薬効成分及び／又は遺伝子としては、水溶性のものを利用できる。製造方法３との相違点は、脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子との存在様式にあり、この製造方法４では、水系溶媒に分散した脂質膜構造体を一旦製造した上でさらに乾燥させた乾燥物を製造することから、この段階で脂質膜構造体は脂質膜の断片として固体状態で存在する。この脂質膜の断片を固体状態に存在させるためには、前記したように水系溶媒に、さらに糖（水溶液）、好ましくはショ糖（水溶液）や乳糖（水溶液）を添加した溶媒を用いることが好ましい。ここで、薬効成分及び／又は遺伝子を含む水系溶媒を添加すると、固体状態で存在していた脂質膜の断片は水の侵入とともに速やかに水和し始め、脂質膜構造体を再構築することができる。この時、薬効成分及び／又は遺伝子が脂質膜構造体内部に保持された形態の構造体が製造できる。
製造方法３では、薬効成分及び／又は遺伝子が高分子の場合には、薬効成分及び／又は遺伝子は脂質膜構造体内部には入り込めず、脂質膜構造体の表面に結合した存在様式をとるが、製造方法４はこの点で大きく異なる。すなわち、この製造方法４は、脂質膜構造体単独の分散液をあらかじめ製造するため、乳化時の薬効成分及び／又は遺伝子の分解を考慮する必要がなく、大きさ（粒子径）の制御もし易い。従って、製造方法１や製造方法２に比べて比較的製造が容易である。また、この他に、一旦凍結乾燥又は噴霧乾燥を行うため、製剤（医薬組成物）としての保存安定性を保証し易く、乾燥製剤を薬効成分及び／又は遺伝子の水溶液で再水和しても大きさ（粒子径）を元に戻せること、高分子の薬効成分及び／又は遺伝子であっても、脂質膜構造体内部に薬効成分及び／又は遺伝子を保持させ易いことなどの長所がある。
脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子との混合物が水系溶媒に分散した形態を製造するための他の方法としては、リポソームを製造する方法としてよく知られた方法、例えば逆相蒸発法などを採用できる。大きさ（粒子径）を制御する場合には、孔径のそろったメンブランフィルターを用いて、高圧力下でイクストルージョン（押し出し濾過）を行えばよい。また、上記の脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに乾燥させる方法としては、凍結乾燥や噴霧乾燥等を挙げることができる。この時の水系溶媒としては、上述の糖（水溶液）、好ましくはショ糖（水溶液）や乳糖（水溶液）を添加した溶媒を用いることが好ましい。脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子との混合物が水系溶媒に分散した分散液をさらに凍結させる方法としては、通常の凍結方法が挙げられるが、この場合の水系溶媒としては、糖（水溶液）や多価アルコール（水溶液）を添加した溶媒を用いるのが好ましい。
製造方法５
上記の製造方法１〜４に準じて、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体以外の脂質膜構造体の構成成分（抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体（好ましくは、抗体のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦａｂ’フラグメント等）中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体を含む）と薬効成分及び／又は遺伝子とを用いて脂質膜構造体を製造し、次いで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体を添加することで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体が脂質膜構造体の膜の表面に存在（結合）する形態の組成物を製造することができる。
製造方法６
上記の製造方法１〜４に準じて、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体、及び抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体（好ましくは、抗体のＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント又はＦａｂ’フラグメント等）中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体以外の脂質膜構造体の構成成分と薬効成分及び／又は遺伝子とを用いて脂質膜構造体を製造し、次いで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体及び抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体中のメルカプト基と反応し得る脂質膜誘導体を添加することで、抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体が脂質膜構造体の膜の表面に存在（結合）する形態の組成物を製造することができる。
本発明の医薬組成物において配合し得る脂質は、使用する薬効成分及び／又は遺伝子の種類などに応じて適宜選択すればよいが、例えば、薬効成分を用いる場合には、薬効成分１質量部に対して、総脂質として０．１〜１０００質量部が好ましく、０．５〜２００質量部がより好ましい。また、遺伝子を用いる場合には、遺伝子１μｇに対して、総脂質として１から５００ｎｍｏｌが好ましく、１０から２００ｎｍｏｌがより好ましい。
本発明の脂質膜構造体を含む医薬組成物の投与方法は特に限定されず、経口投与又は非経口投与のいずれも選択可能である。経口投与の剤形としては、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、シロップ剤、カプセル剤、内服液剤等を挙げることができ、非経口投与の剤形としては、例えば、注射剤、点滴剤、点眼剤、軟膏剤、座剤、懸濁剤、パップ剤、ローション剤、エアゾール剤、プラスター剤等を挙げることができる。これらのうち注射剤又は点滴剤が好ましく、投与方法としては、静脈注射、動脈注射、皮下注射、皮内注射などのほか、標的とする細胞や臓器に対しての局所注射を挙げることができる。
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
実施例１：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの測定
１．抗体不含リポソームの調製
表１に示す４処方のリポソームを調製した。全ての処方において、リポソームマーカーとして、蛍光脂質（２−（６−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ）ヘキサノイル−１−ヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン：ＮＢＤ−Ｃ６−ＨＰＣ）を添加した。
空リポソームの癌細胞への吸着（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）や移行（ｉｎ ｖｉｖｏ）を確認するための抗癌剤（ドキソルビシン：ＤＯＸ）未封入群（処方１、２）と薬理実験のための抗癌剤封入群（処方３、４）とに分け、各々抗体結合脂質（ポリ（エチレングリコール）−α−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ｍ−マレインイミド：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬ）を含まない、ネガティブコントロールサンプル（処方１、３）を対照として調製した。
水素添加大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）を秤取し、クロロホルム・メタノール混液（３：１）適当量に溶解させた後、５ｍｇ／ｍｌでメタノールに溶解させたＮＢＤ−Ｃ６−ＨＰＣを添加した。エバポレーターにより有機溶媒を留去し、更に１時間減圧乾固させた。この脂質乾燥物（リピドフィルム）に、予め６５℃に加温しておいた１５５ｍＭ硫酸アンモニウム水溶液（ｐＨ５．５）を加え、ボルテックスミキサーにて軽く撹拌した（ナスフラスコから脂質が剥がれる程度まで）。この時点において、蛍光脂質を含めた各脂質濃度は、ＨＳＰＣ ２８．２ｍＭ、Ｃｈｏｌ １９．２ｍＭ、ＮＢＤ−Ｃ６−ＨＰＣ ０．２ｍｇ／ｍＬとなるように調製した。次に、この脂質分散液をホモジナイザーに移して、１０ｓｔｒｏｋｅホモジナイズした後、種々孔径のポリカーボネートメンブレンフィルターを用いてサイジング（０．２μｍ×２回、０．１μｍ×２回、０．０５μｍ×２回）を行い、粒子径１００ｎｍ前後の空リポソーム分散液を調製した。
この空リポソーム分散液を生理食塩水で５倍希釈し、超遠心用チューブに入れ、６５０００ｒｐｍで１時間遠心分離した後、上清を捨て生理食塩水で希釈前のリポソーム分散液量になるように再懸濁させた。このように外水相を生理食塩水に置換した空リポソーム分散液を、空リポソーム用と薬物封入用との２群に分けた。
次に薬物封入方法を示す。空リポソーム分散液及びＤＯＸ溶液（薬物濃度：３．３ｍｇ／ｍｌ生理食塩水）は、予め６５℃に加温しておき、容量比で空リポソーム分散液４に対しＤＯＸ溶液６を加えた後（即ち、最終薬物濃度は２．０ｍｇ／ｍｌ）、１時間６５℃でインキュベートした。
空リポソーム群及び薬物封入リポソーム群を各々二分し、一方に対しては、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）のみを表１に示す膜組成となるよう添加し（処方１、３）、もう一方に対しては、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬを表１に示す膜組成となるよう添加した（処方２、４）。これらは、各々粉末状態で添加し、１０分間６５℃でインキュベートした。
２．リポソームの物性の測定
（１）ドキソルビシンのリポソームへの保持率
上記リポソーム分散液（処方３、４）の一部を取ってゲル濾過（セファデックスＧ−５０；移動相は生理食塩水）を行い、ボイドボリュームに溶出したリポソーム分画中のドキソルビシンを蛍光検出器にて定量することにより求めた。各処方の薬物封入率は、ほぼ１００％であった。
（２）粒子径
上記リポソーム分散液（処方１〜４）の一部を取って準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）法にて粒子径を測定した結果、いずれもほぼ１００ｎｍ前後であった。また、抗体を付加したリポソームについても確認した結果、その粒子径はほぼ１００ｎｍ前後であった。
以下に、実施例２以降に用いる略語の意味を示す。
Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合抗癌剤封入リポソーム
Ｆａｂ’−ＬＰ：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソーム
ＤＯＸ−ＬＰ：抗癌剤封入リポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）
ＬＰ：リポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）
ＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ：マレインイミド基導入抗癌剤封入リポソーム
ＬＰ−ｍａｌ：マレインイミド基導入リポソーム
実施例２：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの調製
１）ＩｇＧの生産と精製
ＷＯ ０２／０４１０００ Ａ１記載の方法にしたがって得た抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、１．０×１０８個の細胞を得た。細胞を培地で１．０×１０７個／０．５ｍｌに懸濁し、予め１週間前にプリスタンを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ系、雌、６週令）に腹腔内投与した。７日目及び９日目に１０匹のマウスより腹水採取を行い１８ｍｌの腹水を得た。
得られた腹水を遠心して、不溶物、沈殿物を取り除き、固形硫酸アンモニウムを４０％飽和となるように徐々に添加した。添加後、２時間攪拌を継続した。遠心で沈殿物を回収し、少量の０．５Ｍ ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）で溶解した。これを透析チューブにとり、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）に透析した。透析後、遠心で沈殿物を取り除き、体積とＡ２８０を測定して含有するタンパク質量を１４０ｍｇ／１２．５ｍｌと見積もった。
遠心上清を０．５Ｍ ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）で平衡化したリコンビナントプロテインＡセファロースＦＦゲルカラム（直径２．５ｃｍ×長さ５．９ｃｍ）に供し、０．５Ｍ ＮａＣｌ含有１．５Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ８．９）で洗浄した。カラムを通過した遠心上清、洗浄液を４ｍｌづつ分画し、フラクション番号１から２３番までのＡ２８０を測定した。Ａ２８０が０．０５以下になったことを確認した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で吸着タンパク質の溶出を行った。溶出液は、予め０．５ｍｌの３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を添加した試験管に４ｍｌづつ分画し、フラクション番号２６から４１番までのＡ２８０を継続して測定した。第１図はＩｇＧのアフィニティー精製の様子を示したものである。ＩｇＧとしてフラクション番号２９から３６番を回収、プールした。得られたＩｇＧ画分を透析チューブにとり、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に透析した。Ｕｌｔｒａ Ｆｉｌｔｅｒ ＵＫ−５０を用いて透析画分を濃縮した。濃縮画分のＡ２８０測定からＩｇＧ画分を６２ｍｇ／６ｍｌと見積もった。ＩｇＧ濃度を１０ｍｇ／ｍｌに調整し、１ｍｌづつに分けて凍結保存した。
２）ＩｇＧのＦａｂ’断片化
上記１）で精製し、１０ｍｇ／ｍｌに調整した精製ＩｇＧを１ｍｌとり、０．１Ｍ ＮａＣｌ含有０．１Ｍ酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４．２）で透析、抗体量の２％（ｗ／ｗ）のペプシンを加え、３７℃で２０時間消化した。消化物に３Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を０．２ｍｌ添加し、反応を停止した。消化物の全量を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４ゲル濾過カラム（直径１．５ｃｍ×長さ４７ｃｍ）に供し、１ｍｌづつ分画しフラクション番号１１から３０番までのＡ２８０を測定した。第２図はＦ（ａｂ’）２画分のゲル濾過の様子を示したものである。Ｆ（ａｂ’）２画分としてフラクション番号１３から１８番を回収、プールした。得られたＦ（ａｂ’）２画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で０．４６ｍｌに濃縮した。濃縮画分のＡ２８０を測定し、得られたＦ（ａｂ’）２を３．４ｍｇと見積もった。
得られたＦ（ａｂ’）２を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で０．９ｍｌに調整し、０．１ｍｌの０．１Ｍシステアミン塩酸塩を添加（最終濃度０．０１Ｍ）、３７℃で１．５時間還元した。これを５ｍＭ ＥＤＴＡ含有ＰＢＳで平衡化したウルトロゲルＡｃＡ４４ゲル濾過カラム（直径１．５ｃｍ×長さ４７ｃｍ）に供し、１ｍｌづつ分画しフラクション番号１１から３０番までのＡ２８０を測定した。第３図はＦａｂ’画分のゲル濾過の様子を示したものである。Ｆａｂ’画分としてフラクション番号１９から２３番を回収、プールした。得られたＦａｂ’画分をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で０．５６ｍｌに濃縮した。濃縮画分のＡ２８０を測定し、得られたＦａｂ’を１．５ｍｇと見積もった。
３）抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの調製（調製例▲１▼〜▲７▼）
上記２）で作製したＦａｂ’画分（１．９６ｍｇ／０．３７ｍｌ）に表１の処方４のマレインイミド基導入抗癌剤（ドキソルビシン（ＤＯＸ））封入リポソーム（ＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ）（マレインイミド濃度：１０４ｎｍｏｌ／ｍｌ）をマレインイミドモル比が１：１となるように０．４１ｍｌ加えて混合した。低温室で遮光下、２０時間反応させた後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレインイミド（０．１Ｍ水溶液を４．２６μｌ添加）で未反応のメルカプト基をブロックした。これをＰＢＳで平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径１．５ｃｍ×長さ４７ｃｍ）に供し、２ｍｌづつ分画しフラクション番号１１から４２番までのＡ２８０（タンパク濃度を反映）を、１１から２０番までのＡ６１０（濁度すなわち脂質濃度を反映）を測定した。第４図はこのときのゲル濾過溶出の様子を示したものである。抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体結合抗癌剤封入リポソーム（Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ）画分としてフラクション番号１３から１４番を回収、プールし、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲１▼（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率１０％）を得た。未反応Ｆａｂ’は、フラクション番号２９から３５番に溶出し、リポソーム画分と未反応Ｆａｂ’画分がゲル濾過にて分離されたことを確認した。
同様な方法で、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲２▼（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率９．２％）、調製例▲３▼（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率１２％）及び調整例▲４▼（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率３．９％）を調製した。また、表１の処方２のマレインイミド基導入リポソーム（ＬＰ−ｍａｌ）（マレインイミド濃度：２６０ｎｍｏｌ／ｍｌ）より、抗癌剤を封入しない抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体結合リポソーム（Ｆａｂ’−ＬＰ）（調製例▲５▼（ＨＳＰＣを基準にした時の希釈率３．７％）、調製例▲６▼（ＨＳＰＣを基準にした時の希釈率４．４％）、及び調製例▲７▼（ＨＳＰＣを基準にした時の希釈率２．１％）を上記と同様の方法で調製した。
なお、調製例のリポソーム原料からの希釈割合は、前記抗体結合後のゲル濾過時のＡ６１０値より算出した抗体結合リポソームとしてプールした画分のＡ６１０積算値／ボイド画分のＡ６１０積算値に各原料仕込みボリューム／調製例ボリュームを乗じて算出した。また、抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体結合リポソームのリン脂質濃度は、表１の処方２のＬＰ−ｍａｌ若しくは表１の処方４のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌのリン脂質濃度（リン脂質Ｂ−テストワコー（和光純薬工業）にて測定し、ＤＯＸ単体による測定系への影響分を差し引いた。）に、上記希釈率を乗じて算出した。
また、以後の試験例において抗体を結合しないリポソームとして使用したリポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）（ＬＰ）若しくは抗癌剤封入リポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）（ＤＯＸ−ＬＰ）については、上記と同様に表１の処方１若しくは表１の処方３のマレインイミド基非導入リポソームのリン脂質濃度を測定し、対応する抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのリン脂質濃度に合わせてＰＢＳで希釈し使用した。
実施例３：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの調製（調製例▲８▼）
Ｆａｂ’画分とマレインイミド基導入リポソームのマレインイミドモル比を１：３となるようにした以外は、実施例２と同様の方法で、表１処方４のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ（マレインイミド濃度：１００ｎｍｏｌ／ｍｌ）よりＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲８▼（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率１４％）を得た。第５図はこのときのゲル濾過溶出の様子を示したものである。Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ画分はフラクション番号１４から１５番に溶出し、フラクション番号２９から３５番に溶出する未反応Ｆａｂ’量が前記実施例２と比較し減少した。
実施例４：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの調製（調製例▲９▼及び（１０））
Ｆａｂ’画分とマレインイミド基導入リポソームのマレインイミドモル比を１：０．２５、１：１．６、１：２及び１：４．５とした以外は、実施例２と同様の方法でＦａｂ’−ＬＰ及びＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰを得た。表１の処方２のＬＰ−ｍａｌよりマレインイミドモル比を１：１．６として作製されたＦａｂ’−ＬＰ（ＨＳＰＣを基準にした時の希釈率６．０％）を調製例▲９▼、表１の処方４のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌよりマレインイミドモル比を１：２として作製されたＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（ＤＯＸを基準に測定した時の希釈率２１％）を調製例（１０）とした。
試験例１：リポソームへの抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体の結合の確認
表１の処方２のＬＰ−ｍａｌ、表１の処方４のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ、実施例２及び４にて作製したＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲２▼、▲３▼及び（１０））並びにＦａｂ’−ＬＰ（調製例▲６▼、▲７▼及び▲９▼）を６ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（還元）にてリン脂質濃度が約３μｇ／ｌａｎｅとなるように希釈し、９５℃で５分間置いた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（「マルチゲル４／２０」、第一化学薬品）に供した。Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ又はＦａｂ’−ＬＰを供したレーン１〜６には約３０ｋＤａのＦａｂ’バンドが認められた。一方、ＬＰ−ｍａｌ又はＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌを供したレーン７及び８では認められなかった。全ての抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームに抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体が結合していることが確認された（第６図）。
試験例２：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞接合性評価
１）細胞増殖抑制試験
培地：ＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）に、ペニシリンＧカリウム（ＳＩＧＭＡ）、硫酸ストレプトマイシン（ＳＩＧＭＡ）を各５０Ｕ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、さらに非働化したウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を１０％（ｖ／ｖ）の濃度になるように加えた。ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔのヒト繊維肉腫細胞ＨＴ１０８０若しくはヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７を０．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳにて２回洗浄後、少量残した０．５ｍＭ ＥＤＴＡ／ＰＢＳをなじませ、約５分間静置することにより細胞を剥離した。培地を適当量加え細胞を懸濁後、室温下１０００ｒ．ｐ．ｍ、３分間遠心した。上清を吸引後、１〜２ｍｌの培地に懸濁した細胞懸濁液の一部に等量のトリパンブルー溶液を加え染色後、血球計数板にてカウントした。必要な細胞密度となるように培地を加え希釈した。
この細胞懸濁液を９６穴マイクロプレートに５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、３７℃、ＣＯ２インキュベーターにて約２４時間培養し、細胞をプレートに接着させた。一方、ＤＯＸ−ＬＰ（表１処方３）及びＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲２▼及び▲３▼）を必要なリン脂質濃度となるように培地にて希釈しサンプルとした。このサンプルを先の細胞に５０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、さらに１時間培養した。未反応サンプルを除去する目的で、培地を吸引除去後、ＰＢＳを２００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、細胞を洗浄した。洗浄操作は２回繰り返した。洗浄後直ちに新たな培地を１００μｌ／ｗｅｌｌ添加し、さらに２４時間培養し、以下のＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｓｓａｙを行った。一部のプレート（ｓｔａｒｔ値確認用）は、洗浄後の２４時間の培養を行わず、培地添加後直ちにＣｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｓｓａｙを行った。
Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｓｓａｙ：「Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ」（和光純薬工業）の添付文書に従い調製しフィルター濾過滅菌したＷＳＴ−１溶液を１０μｌ／ｗｅｌｌ添加し、攪拌後さらに４時間培養した後、Ａ４５０を測定した。このＡ４５０値は、生細胞数に比例し上昇する。
試験群は、Ｂｌａｎｋ（培地のみ）、Ｃｏｎｔｒｏｌ（細胞に培地を添加）及び各Ｓａｍｐｌｅ（細胞にＤＯＸ−ＬＰ又はＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰを添加）群を設定し、各群ｎ＝４にて試験した。各サンプルのリン脂質濃度（Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｎ．（μｇ／ｍｌ））は、細胞にサンプルを添加した時の濃度を記した。細胞増殖抑制率（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）は、以下の式に各試験群のＡ４５０の平均値を代入して算出した。
Ｉｎｈｂｉｔｉｏｎ＝１−｛（Ｓａｍｐｌｅ ａｔ ２４ｈｒ−Ｂｌａｎｋ ａｔ ２４ｈｒ）−（Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔ ｓｔａｒｔ−Ｂｌａｎｋ ａｔ ｓｔａｒｔ）｝／｛（Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔ ２４ｈｒ−Ｂｌａｎｋ ａｔ ２４ｈｒ）−（Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｔ ｓｔａｒｔ−Ｂｌａｎｋ ａｔ ｓｔａｒｔ）｝（％）
有意差検定は、バートレットの等分散検定にて各群が等分散であることを確認後、Ｔｕｋｅｙタイプ多重比較検定を行い、ＤＯＸ−ＬＰ群とＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ群間の有意差を検定した。
ｓｔａｒｔ値にＤＯＸ−ＬＰ若しくはＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰの影響は認められなかった（第７図及び第８図）。
一方、細胞洗浄後２４時間培養においては、ＨＴ１０８０細胞の場合、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ群は、ＤＯＸ−ＬＰ群より有意に低い吸光度を示し、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を結合させることにより細胞増殖をより強く抑制することが確認され（第７図）、その細胞増殖の抑制作用は用量依存的であった（第８図）。また、ＭＴ１−ＭＭＰを発現しないＭＣＦ−７細胞の場合、抗体結合の有無による顕著な差は認められなかった（第７図及び第８図）。抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を結合している抗癌剤封入リポソームのみがＭＴ１−ＭＭＰを発現しているＨＴ１０８０細胞の細胞増殖を用量依存的に抑制することが確認された。
２）蛍光抗体法
前記１）の試験と同様に継代した約１．５ｘ１０５ｃｅｌｌ／ｍｌのＨＴ１０８０細胞懸濁液をチェンバースライド（ＮＵＮＣ）に１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、一晩培養した。培養上清を吸引除去後、チェンバーとスライドを分離し、ＰＢＳを満たした洗浄瓶にスライドを入れ、７回タッピングし、非接着細胞を除去した。このスライドを湿潤箱に静置し、ＬＰ（表１の処方１を調製例▲７▼のリン脂質濃度に合わせてＰＢＳにて希釈したもの）或いはＦａｂ’−ＬＰ（調製例▲７▼）を２０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、低温室にて遮光下約１時間反応させた。反応後、未反応のリポソームサンプルを除去するために、ＰＢＳ洗浄（１５回タッピング）を行い、直ちに落射蛍光顕微鏡装置（オリンパス）にて観察し、冷却ＣＣＤカメラ（キーエンス）にて撮影した。Ｆａｂ’−ＬＰをリポソームサンプルとした場合には、ほとんどすべての細胞（主として細胞膜）に強い緑色の蛍光が認められた。一方、同抗体を結合しないＬＰの場合は蛍光が認められなかった。抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体を結合しているリポソームのみがＭＴ１−ＭＭＰを発現しているＨＴ１０８０細胞の細胞膜上に接合することが確認された。
試験例３：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのｉｎ ｖｉｖｏ細胞接合性評価（腹膜播種モデル）
１）ｉｎ ｖｉｖｏ細胞接着試験
Ｂａｌｂ−ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス、６週令）にＨＴ１０８０細胞を１×１０６個／マウス腹腔内投与後、１４日目にＬＰ（表１の処方１を調製例▲５▼のリン脂質濃度に合わせてＰＢＳにて希釈した）或いはＦａｂ’−ＬＰ（調製例▲５▼）を５０μｌ／マウス腹腔内投与した。２日後、腹膜腫瘍を摘出し、その割面を蛍光顕微鏡冷却ＣＣＤカメラで観察した。腫瘍表層には、ＬＰ或いはＦａｂ’−ＬＰ投与マウスのいずれにおいてもリポソームの接着（蛍光シグナル）を認めた。腫瘍内部においては、Ｆａｂ’−ＬＰ投与マウスのみにおいてリポソームの接着（蛍光シグナル）を認めた（第９図）。
２）ｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性試験
Ｂａｌｂ−ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス、６週令）にＨＴ１０８０細胞を１×１０６個／マウス腹腔内投与後、２１日目にＤＯＸ−ＬＰ（表１の処方３を調製例▲４▼のリン脂質濃度に合わせてＰＢＳにて希釈した）又はＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲４▼）を５０μｌ／マウス腹腔内投与した。対照としてリポソームの代わりにＰＢＳを使用した。７日後、腹膜腫瘍を摘出し、その割面を肉眼で観察した。また、その病理像をヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により観察した。ＨＥ染色は通常の方法に従い、以下のように行った。ホルマリン固定後パラフィン包埋し、ミクロトームにて薄切した切片をキシレンにて脱パラフィンし（６５℃、５分×３系列に浸漬）、アルコール系列にて脱水（１００％エタノールに５分×３系列浸漬後、９５％エタノールに５分間浸漬）後、２〜５分間ヘマトキシリン液に浸漬、水道水にて５〜１０分間水洗し発色後、９５％エタノールに５分間浸漬し、１０〜３０秒間エオジン液に浸漬した。染色後、アルコール系列にて脱水（１００％エタノールに５分×３系列浸漬）後、キシレンにて透徹し（５分×３系列浸漬）、マウントし、ＨＥ染色標本とした。
腫瘍表層と割面の肉眼所見においては、対照に比べてＤＯＸ−ＬＰ又はＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ投与マウスにおいて広く充実性腫瘍の表層に出血壊死部が認められた。またＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ投与マウスでは、内部にも出血班が点在した。ＨＥ染色による各腫瘍の病理像は、対照において血管を伴った充実性、髄様の腫瘍細胞を認めた。ＤＯＸ−ＬＰ投与マウスにおいて表層部に出血性壊死部を認めるが深部腫瘍組織は対照と変わらず健常な腫瘍組織を形成していた。他方、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ投与マウスにおいては、肉眼所見では、ＤＯＸ−ＬＰ投与マウスの腫瘍に比べ、腫瘍表面の凹凸不正が非常に著しく、腫瘍組織そのものが脆かった。さらに病理学的には、表層に続く壊死巣は深部へ広がり、斑状の壊死部が深部腫瘍内に散見された。
試験例４：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのｉｎ ｖｉｖｏ細胞接合性評価（皮下腫瘍モデル）
１）ｉｎ ｖｉｖｏ細胞毒性試験
Ｂａｌｂ−ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス、６週令）背部の左右２箇所にＨＴ１０８０細胞を１×１０６個／マウス皮下投与後、投与部位（左右２箇所）に腫瘍形成を確認し１０日目にＤＯＸ−ＬＰ（表１処方３を調製例▲８▼のリン脂質濃度に合わせてＰＢＳにて希釈したもの）或いはＦａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲８▼）を２５μｌ腫瘍形成部位（右）皮下及び尾静脈投与した。右側の腫瘍は皮下（局所）投与したリポソームの効果が反映された腫瘍、左側の腫瘍が尾静脈（全身）投与したリポソームの効果が反映された腫瘍と仮定した。また、対照として、ＬＰ（表１の処方１をＰＢＳにてリン脂質濃度０．４６ｍｇ／ｍＬに希釈したもの）を使用した。
７日後、皮下腫瘍を摘出し、その割面を肉眼で観察した。また、その病理像及び血管新生をラット由来抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ：５５７３５５）を用いた免疫染色（対比染色：ヘマトキシリン染色）により観察した。免疫染色は以下のように行った。クリオスタットにて厚さ８〜１０μｍの凍結切片を作製した。この凍結切片を冷アセトンにて１０分間固定し、ＰＢＳ洗浄後、０．３％ Ｈ２Ｏ２含有メタノールに浸し、組織内パーオキシダーゼ活性を失活させた。この切片をブロッキング後（０．１％ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＰＢＳに２０分間浸漬）、１００倍希釈した抗ＣＤ３１抗体を滴下し、湿潤箱内で２時間、抗原抗体反応を行った。反応後、ＰＢＳ洗浄（１０分×３回）にて未反応の抗ＣＤ３１抗体を除去した後、２００倍希釈したＨＲＰ標識抗ラット抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を滴下し、湿潤箱内で３０分間、抗原抗体反応を行った。反応後、ＰＢＳ洗浄（１０分×２回）にて未反応の２次抗体を除去した後、０．１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６．４に約１０分浸漬し、さらに約１０〜２０分間ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンチジンテトラヒドロクロライド）発色した。ＤＡＢ発色後、ヘマトキシリンによる対比染色を行い、マウントし、ＣＤ３１染色標本とした。
腫瘍割面の肉眼所見においては、ＬＰやＤＯＸ−ＬＰに比べ、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰを投与したマウスにおいて腫瘍中心部に潰瘍を認めた。また、その潰瘍は尾静脈投与を反映する腫瘍（左）においても認められたが、皮下投与を反映する腫瘍（右）においてより顕著であった。尾静脈投与を反映する腫瘍の病理所見において、ＤＯＸ−ＬＰに比べ、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰを投与したマウスにおいて抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体特異的な抗腫瘍効果（中心部壊死）が認められ、ＣＤ３１染色結果から、腫瘍内新生血管の走行及び形成の乱れが認められた。さらに、ＤＯＸ−ＬＰ尾静脈投与を反映する腫瘍においては血管走行が比較的保たれているのに比べ、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰ尾静脈投与を反映する腫瘍においては血管走行が乏しく、Ｆａｂ’−ＤＯＸ−ＬＰによる新生血管へのダメージが先行して生じる可能性が示唆された。
実施例５以降に用いる略語の意味を示す。
Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰ：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−１Ｄ８）結合抗癌剤封入リポソーム
Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰ：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−１Ｄ８）結合蛍光剤封入リポソーム
Ｆａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−２Ｄ１２）結合蛍光剤封入リポソーム
ＤＯＸ−ＬＰ：抗癌剤封入リポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）
ＮＢＤ−ＬＰ：蛍光剤封入リポソーム（マレインイミド基非導入リポソーム）
ＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ：マレインイミド基導入抗癌剤封入リポソーム
ＮＢＤ−ＬＰ−ｍａｌ：マレインイミド基導入蛍光剤封入リポソーム
実施例５：種々抗体結合率を示す抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（２２２−１Ｄ８）結合リポソームの調製（調製例▲１１▼〜▲１６▼）
ＷＯ０２／０４１０００Ａ１記載の方法に従って得た抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞（クローン番号２２２−１Ｄ８）を用い、実施例２−１）および２）と同様の方法で得たＦａｂ’画分（これをａとする）にＮＢＤ−Ｃ６−ＨＰＣを添加せず、ＤＳＰＥ−ＰＥＧおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＭＡＬを溶液状態で添加した以外は実施例１−１）と同様の方法で得た表２処方５〜１０の各種マレインイミド基導入抗癌剤（ドキソルビシン（ＤＯＸ））封入リポソーム（ＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ）（マレインイミド濃度：０、２．６、５．２、２６、５２、１０４ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率：０、０．５、１、５、１０、２０％）（これをｂとする）をａとｂとがマレインイミドモル比で１：１となるように加えて混合した。
低温室で遮光下、２０時間反応させた後、Ｆａｂ’の１０倍モル量のＮ−エチルマレインイミド（０．１Ｍ水溶液を添加）で未反応のチオール基をブロックした。これをＰＢＳで平衡化したセファロースＣＬ−４Ｂカラム（直径１．５または３．０ｃｍ×長さ４７ｃｍ）に供し、２または８ｍｌづつ分画し、実施例２−３）と同様な方法で、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−１Ｄ８）結合抗癌剤封入リポソーム（Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰ）画分をボイドボリュームから回収、プールし、Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲１１▼〜▲１６▼）を得た。一方、未反応Ｆａｂ’は、フラクション番号２９から３５番前後に溶出し、リポソーム画分と未反応Ｆａｂ’画分がゲル濾過にて分離されたことを確認した。
また、リポソームもしくは抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームの脂質濃度は、コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業）にて測定したコレステロール濃度を脂質濃度として使用した。なお、ＤＯＸ単体による測定系への影響は認められず、このコレステロール濃度とＨＰＬＣによるＤＯＸ濃度との間には良好な相関関係が認められた。したがって、以後の試験例においては、抗体を結合しないリポソームと抗体を結合したリポソーム間で、コレステロール濃度が一定になるようにＰＢＳで希釈し使用した。
実施例６：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（２２２−２Ｄ１２）結合リポソームの調製（調製例▲１７▼）および対照リポソームの調製（調製例▲１８▼、▲１９▼）
ＷＯ０２／０４１０００Ａ１記載の方法に従って得たクローン番号２２２−２Ｄ１２の抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を用い実施例２−１）および２）と同様の方法で得たＦａｂ’画分を用いたことと、マレインイミド基導入リポソームのマレインイミドモル比を１：３となるようにした以外は、実施例５と同様の方法で、ＮＢＤ−Ｃ６−ＨＰＣを添加したＤＯＸを封入しない表２処方１１のＮＢＤ−ＬＰ−ｍａｌ（マレインイミド濃度：１３０ｎｍｏｌ／ｍｌ、ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率：１０％）よりＦａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼）を得た。また、このリポソームの対照例として、クローン番号２２２−１Ｄ８由来のＦａｂ’を同じＮＢＤ−ＬＰ−ｍａｌに結合させたＦａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１８▼）および表２処方１２のＮＢＤ−ＬＰをゲル濾過したリポソーム（調製例▲１９▼）も同様に調製した。
試験例５：リポソームへの抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体の結合の確認
１）ＨＲＰ−Ｆａｂ’との競合による確認
組換え大腸菌より精製したヒトＭＴ１−ＭＭＰ（１５０μｇ／ｍＬ）を０．１Ｍ Ｎａ−Ｐ ｐＨ７．０にて６０００倍に希釈し、充分に攪拌した。これを、９６穴プレート枠にセットしたイムノモジュールに１００μＬずつ加え、プレートシール後、低温室に一晩以上静置し、抗原をコーティングした（ａとする）。
実施例５および６で調製した各種リポソーム（調製例▲１１▼〜▲１９▼）をコレステロール濃度が１０μｇ／ｍＬになるようにＰＢＳで希釈し、０．４％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液を同容量加え混合後、３７℃恒温槽に一晩静置し、界面活性剤処理を行った（ｂとする）。ａを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液にて３００μＬ／ｗｅｌｌ、３回洗浄し、１０ｍＭ ＩＲＢ（１％ ＢＳＡ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、３０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１Ｍ ＮａＣｌ）を３００μＬ／ｗｅｌｌ加え、２５℃恒温槽に１時間静置し、ブロッキングした（ｃとする）。標準曲線用のＩｇＧ（２２２−１Ｄ８）をＰＢＳにて１００μｇ／ｍＬに希釈し、さらに０．２％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液にて順次希釈し、標準曲線系列用溶液（１２．５、３．１２５、０．７８１、０．１９５、０．０４９、０μｇ／ｍＬ）を調製した（ｄとする）。ＨＲＰ−Ｆａｂ’（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを標識した２２２−１Ｄ８由来Ｆａｂ’）を１０ｍＭ ＩＲＢにて希釈し、０．１２５μｇ／ｍＬ溶液を調製した（ｅとする）。ｂまたはｄと、ｅを容量比１：４にて混合した（ｆとする）。ｃをリン酸緩衝液にて３００μＬ／ｗｅｌｌ、３回洗浄後、ｆを１００μＬ／ｗｅｌｌ（ｎ＝２）加え、２５℃恒温槽に１時間静置し、抗原抗体反応（競合反応）を行った（ｇとする）。ｇを０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝液にて３００μＬ／ｗｅｌｌ、３回洗浄し、ＴＭＢ（Ｂｉｏ ＦＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、２５℃恒温槽に１５分間静置し、ＴＭＢを基質としたＨＲＰの酵素反応を行った（ｈとする）。ｈに１Ｎ Ｈ２ＳＯ４水溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、反応を停止し直ちにＡ４５０を測定した。なお、ｄにおいて０μｇ／ｍＬのウェル、ａにおいて抗原をコーティングしないウェルを作成、それぞれを対照、ブランクとした。標準曲線系列のＡ４５０から、ＩｇＧ濃度に依存した競合反応であることを確認した（表３）。
このＩｇＧ濃度依存競合曲線を標準曲線とし、各抗体リポソームサンプル中のＩｇＧ換算量を算出した。Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰもしくはＦａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰをサンプルとした場合の吸光度は、溶媒をサンプルとした場合（対照）、抗体非結合リポソームや２２２−２Ｄ１２抗体結合リポソームをサンプルとした場合（非競合検体）と比較し、明らかに低い値を示し、ＨＲＰ−Ｆａｂ’の抗原抗体反応が競合された。種々濃度のマレインイミド基をもつリポソームと抗体を結合させ調製した調製例▲１１▼〜▲１６▼については、マレインイミド濃度に比例して、競合率が上昇した。すなわち、算出した単位コレステロール量あたりのＩｇＧ換算量は、使用したＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌのマレインイミド濃度にほぼ比例して変動し、種々抗体結合率のＦａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰが得られたことが確認された（表４）。
これより、抗体結合リポソームの抗体結合率をコントロールするためには、抗体結合リポソームの調製時に、リポソームに導入するマレインイミド量を変動させることが有効であることを見出した。
２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる確認
Ｆａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼）を６×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（還元）にてコレステロール濃度が約０．８μｇ／ｌａｎｅとなるように希釈し、また、クローン番号２２２−２Ｄ１２抗体由来のＦ（ａｂ’）２を６×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ（還元）にてタンパク濃度が約１μｇ／ｌａｎｅとなるように希釈し、いずれも９５℃で５分間置いた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供し、ＣＢＢで染色した。
レーン１（Ｆａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼））、レーン２（２２２−２Ｄ１２抗体由来のＦ（ａｂ’）２）共に、約３０ｋＤａのＦａｂ’バンドが認められた。したがって、調製例▲１７▼の抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−２Ｄ１２）結合リポソームに抗体が結合していることが確認された（第１０図）。
試験例６：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞接合性評価
１）細胞増殖抑制試験
試験例２−１）記載の方法に準じて、ＨＴ１０８０細胞を用いて各種抗体結合リポソームの細胞増殖抑制能を評価した。細胞を９６穴プレートに接着後、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体（クローン番号２２２−１Ｄ８）結合抗癌剤封入リポソーム（Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰ）を加え、１時間培養した。培養後細胞を洗浄し、新たな培地を添加し、さらに２４時間培養した。細胞洗浄後２４時間培養した後に、ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｓｓａｙを行い、生細胞数の指標となるＡ４５０をプロットした。各群のｍｅａｎ±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝４）を表示した。対照として、Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰの代わりに、培地のみ（対照）もしくは抗体を結合しない抗癌剤封入リポソーム（ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲１１▼））、抗癌剤単独（ｆｒｅｅ ＤＯＸ）を加えた。また、細胞を加えず培地のみを同様に処理した群をブランクとした。なお、試験例２にて阻害率算出などに使用していたｓｔａｒｔ値は、ＤＯＸ単体（ｆｒｅｅ ＤＯＸ）１００μｇ／ｍｌをサンプルとした場合の吸光度と殆ど変わらないことを複数回の試験により確認し、ｆｒｅｅ ＤＯＸ １００μｇ／ｍｌ群の値をｓｔａｒｔ値として使用した。このｓｔａｒｔ値は、第１１図および第１２図中のＡ４５０値０．６付近に表記した。
調製例▲１１▼〜▲１６▼について試験した結果、ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率が１％以下（表２処方６、７）のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌより調製した調製例▲１２▼〜▲１３▼には、細胞増殖抑制活性は殆ど認められなかった。一方、ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率が５％以上のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ（表２処方８〜１０）より調製した調製例▲１４▼〜▲１６▼には、細胞増殖抑制活性が認められ、その活性は、原料のＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率に比例したものであった。すなわち、２０％のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ（表２処方１０）より調製した調製例▲１６▼は、対照のＤＯＸ−ＬＰのおよそ１０倍、１０％のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ（表２処方９）より調製した調製例▲１５▼は、約６〜９倍、５％のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌ（表２処方８）より調製した調製例▲１４▼は、約２倍程度の細胞増殖抑制活性をもつことが示された（第１１図、第１２図）。表５はＤＯＸ濃度２５μｇ／ｍＬにおけるＨＴ１０８０細胞増殖抑制率（１００−［サンプル］／（［対照］−［ＤＯＸ（１００μｇ／ｍＬ）］）×１００、［］内は各群のＡ４５０値の平均値）をまとめた表である。
以上の試験例５−１）の結果および試験例６−１）の結果より、抗体結合に使用するマレインイミド導入リポソームのマレインイミド導入率と競合法により得られる抗体結合リポソームの推定抗体結合率と、このＨＴ１０８０細胞増殖抑制能は、パラレルな関係にあることが示唆された。
これらの実施例および試験例は、種々の抗体結合率を有する抗体結合リポソームの調製例を示したもの、種々の抗体結合率を有する抗体結合リポソームが有する細胞増殖抑制能の評価方法を示したもの、また、リポソームに対する抗体結合量が抗体結合リポソームの細胞増殖抑制能を制御する因子のひとつであることを示したものであって、本願記載の抗体結合リポソームの処方、調製方法、マレインイミド基の数、抗体の種類、抗体結合率、封入する薬剤の種類や濃度などを限定するものではない。
２）蛍光抗体法
試験例２−２）記載の方法に準じて、ＰＬＰ（ｐｅｒｉｏｄａｔｅ−ｌｙｓｉｎｅ−ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）固定したＨＴ１０８０細胞を用いて蛍光抗体染色を行った。
調製例▲１７▼〜▲１９▼をコレステロール濃度が約１００μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳにて希釈した液をサンプルとして試験した。なお、これらの希釈サンプル液の蛍光強度がほぼ等しいことを蛍光吸光度プレートリーダー（パーキンエルマー社、ｗａｌｌａｃ１４２０マルチラベルカウンター）による蛍光強度測定にて確認した。
Ｆａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼）もしくはＦａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１８▼）とＨＴ１０８０細胞を反応させた場合には、ほとんどすべての細胞（主として細胞膜）に緑色の蛍光が認められた。一方、これらの抗体を結合しないＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１９▼）の場合は蛍光が認められなかった。
抗ＭＴ１−ＭＭＰ抗体を結合しているリポソームのみがＭＴ１−ＭＭＰを発現しているＨＴ１０８０細胞の細胞膜上に接合することが確認され、この接合は抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体２２２−１Ｄ８および２２２−２Ｄ１２結合リポソームで同様に認められた。
試験例７：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのｉｎ ｖｉｖｏ細胞接合性評価（皮下腫瘍モデル）
１）ｉｎ ｖｉｖｏリポソーム取り込み実験
Ｂａｌｂ−ｃ ｎｕ／ｎｕマウス（メス、７〜８週令）の背部皮下にＨＴ１０８０を１×１０６個／マウス移植後１４〜２１日目に、ＰＢＳに希釈したＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１９▼）、Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１８▼）或いはＦａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼）を各１５μｇ（コレステロール量）／２００μｌ／マウス尾静脈投与した。投与２時間後、皮下腫瘍を摘出し、鋭剪にて厚さ約２〜３ｍｍの組織スライスをつくり、ＰＢＳにて３０分軽く洗浄した後、蛍光顕微鏡冷却ＣＣＤカメラで観察した。
Ｆａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１８▼）およびＦａｂ’（２２２−２Ｄ１２）−ＮＢＤ−ＬＰ（調製例▲１７▼）投与群では、特に径の小さい（１ｃｍ未満）腫瘍の周囲血管（新生血管）付近に、特異的な蛍光シグナルが検出された。一方、抗体の結合していないリポソーム（調製例▲１９▼；ＮＢＤ−ＬＰ）では、腫瘍の周囲血管（新生血管）を含めて腫瘍組織における明確な蛍光シグナルは認められなかった。以上の結果より、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームは、増殖中の腫瘍の周囲血管（新生血管）に有意に集積されることが示された。
試験例８：抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体結合リポソームのステルス性評価
１）ｉｎ ｖｉｔｒｏ凝集性評価
調製例▲１１▼〜▲１９▼をコレステロール濃度７５μｇ／ｍｌになるようＰＢＳにて希釈した液４０μＬと、ＰＢＳまたは１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地を６０μＬとを混合後、室温にて１５、３０、６０分間静置した（調製例▲１７▼〜▲１９▼については３０分のみ）。軽く攪拌した後の吸光度（６３０ｎｍ）を測定し、実体顕微鏡にてリポソームの凝集の有無を観察した。調製例▲１１▼〜▲１５▼および▲１７▼〜▲１９▼の吸光度は、混合させる媒体がＰＢＳの場合と１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭの場合で差が認められず、また、対応する抗体非結合リポソーム（調製例▲１１▼および▲１９▼）の吸光度との差が認められなかったが、調製例▲１６▼と１０％ＦＣＳ／ＤＭＥＭ培地を混合した場合に、凝集に伴う明らかな吸光度の上昇が認められ、顕微鏡観察においても、明らかな凝集像が認められた（表６）。
２）ｉｎ ｖｉｖｏ血中滞留性試験
Ｂａｌｂ／ｃＡｎＮＣｒｊ−ｎｕマウス（オス、６〜７週令）に、超遠心機にて濃縮したＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲１１▼）またはＦａｂ’（２２２−１Ｄ８）−ＤＯＸ−ＬＰ（調製例▲１４▼〜▲１６▼）を各７．５ｍｇ（ＨＰＬＣ測定によるＤＯＸ量）／ｋｇ尾静脈内投与した。投与２、６、２４、４８および７２時間後、各マウスから血漿を採取し、ＤＯＸ未変化体としての血漿中濃度をＨＰＬＣ蛍光検出法にて測定した。表７に、各群の各採血ポイント当たりｎ＝３のマウスから得られた血漿中ＤＯＸ濃度の平均値を記載した。調製例▲１１▼、▲１４▼及び▲１５▼は、ほぼ同様な血漿中濃度の変動を示したのに対して、調製例▲１６▼は、投与後、速やかに血漿中濃度が低下し、その後も調製例▲１１▼、▲１４▼及び▲１５▼の１／１０程度の滞留しか認められなかった（表７）。
以上の結果より、ｉｎ ｖｉｔｒｏ凝集評価試験におけるＦＣＳとの混合後認められる吸光度（６３０ｎｍ）の上昇は、リポソームの凝集を反映したものであり、かつ、この凝集によって、ｉｎ ｖｉｖｏ血中滞留性が明らかに低下することが示唆された。また、ＦＣＳとの混合により凝集を示しｉｎ ｖｉｖｏ血中滞留性が低下した抗体結合リポソームは調製例▲１６▼（ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率：２０％のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌより調製）のみであったことより、多量に抗体を結合したリポソームはステルス性を悪化させることが判明した。これに対し、ＰＥＧ−ｍａｌ／ＰＥＧ率が１０％のＤＯＸ−ＬＰ−ｍａｌより調製した調製例▲１５▼は、ステルス性の悪化が認められず、かつ、試験例６より細胞増殖抑制能も有意に認められることから、調製例▲１５▼の処方がより好ましい処方であると示唆された。
これらの実施例および試験例は、種々の抗体および抗体結合率を有する抗体結合リポソームの凝集性の評価方法を示したもの、血中滞留性の評価方法を示したもの、また、リポソームに対する過剰な抗体結合が抗体結合リポソームの性能低下の要因のひとつであることを見出した試験例を示したものであって、本願記載の抗体結合リポソームの処方、調製方法、マレインイミド基の数、抗体の種類、抗体結合率、封入する薬剤の種類や濃度などを限定するものではない。
【産業上の利用可能性】
本発明の抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体含有脂質膜構造体は、薬効成分及び／又は遺伝子を細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＴ−ＭＭＰ）が発現した腫瘍細胞に対して効率的に送達することができ、さらに腫瘍内部における血管新生先端部位に対しても薬効成分及び／又は遺伝子を効率的に送達するドラッグデリバリーシステムとして有用である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体。
【請求項２】
該モノクローナル抗体が脂質膜構造体の脂質膜の中、表面、内部、脂質層中、及び／又は脂質層の表面に存在する請求の範囲第１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項３】
該モノクローナル抗体を該脂質膜構造体の構成成分として含有する請求の範囲第１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項４】
該モノクローナル抗体が該脂質膜構造体の膜表面に結合した請求の範囲第１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項５】
該モノクローナル抗体が、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ２−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ３−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ５−ＭＭＰモノクローナル抗体、及び抗ＭＴ６−ＭＭＰモノクローナル抗体から選ばれる１種又は２種以上のモノクローナル抗体である請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項６】
該モノクローナル抗体がヒト型又はマウス型のモノクローナル抗体である請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項７】
該モノクローナル抗体がＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、又はＦａｂ’フラグメントである請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項８】
該モノクローナル抗体を脂質膜構造体に結合させるための物質を含有する請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項９】
該モノクローナル抗体を脂質膜構造体に結合させるための物質が抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体又はそのフラグメント中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体である請求の範囲第８項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１０】
リン脂質及び／又はリン脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１１】
リン脂質及び／又はリン脂質誘導体が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファリジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１，２−ジミリストイル−１，２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、及びホスファチジン酸からなる群より選ばれる１種又は２種以上のリン脂質及び／又はリン脂質誘導体である請求の範囲第１０項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１２】
さらにステロール類を脂質膜構造体の構成成分として含有する請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１３】
ステロール類がコレステロール及び／又はコレスタノールである請求の範囲第１２項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１４】
血中滞留性機能を有する請求の範囲第１項ないし第１３項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１５】
血中滞留性脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する請求の範囲第１４項記載の脂質膜構造体。
【請求項１６】
血中滞留性脂質誘導体がポリエチレングリコール脂質誘導体又はポリグリセリンリン脂質誘導体である請求の範囲第１５項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１７】
ポリエチレングリコール脂質誘導体が、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、及びＮ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンからなる群から選ばれる１種又は２種以上のポリエチレングリコール脂質誘導体である請求の範囲第１６項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１８】
温度変化感受性機能を有する請求の範囲第１項ないし第１７項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１９】
温度感受性脂質誘導体を脂質膜構造体中の構成成分として含有する請求の範囲第１８項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２０】
温度感受性脂質誘導体がジパルミトイルホスファチジルコリンである請求の範囲第１９項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２１】
ｐＨ感受性機能を有する請求の範囲第１項ないし第２０項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２２】
ｐＨ感受性脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する請求の範囲第２１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２３】
ｐＨ感受性脂質誘導体がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲第２２項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２４】
腫瘍細胞膜上の細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼと反応する請求の範囲第１項ないし第２３項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２５】
腫瘍細胞がＭＴ−ＭＭＰ発現細胞である請求の範囲第２４項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２６】
腫瘍細胞が線維肉腫、扁平上皮癌、神経芽細胞腫、乳癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、甲状腺腫瘍、尿路上皮癌、グリア芽細胞腫、急性骨髄性白血病、膵管癌、又は前立腺癌の細胞である請求の範囲第２４項又は第２５項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２７】
新生血管の細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼと反応する請求の範囲第１項ないし第２６項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２８】
脂質膜構造体がミセル、エマルション、リポソーム、又はこれらの混合物の形態である請求の範囲第１項ないし第２７項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２９】
水系溶媒分散形態、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、又は凍結形態のいずれかの形態である請求の範囲第１項ないし第２８項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項３０】
請求の範囲第１項ないし第２９項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とを含有する医薬組成物。
【請求項３１】
薬効成分及び／又は遺伝子が脂質膜構造体の膜中、表面、内部、脂質層中及び／又は脂質層の表面に存在する請求の範囲第３０項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
水系溶媒分散形態、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、又は凍結形態のいずれかの形態である請求の範囲第３０項又は第３１項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体から公知の方法により作製した酵素標識モノクローナル抗体と請求の範囲第１項ないし第２３項に記載の脂質膜構造体の双方が抗原物質に対して起こす競合反応を酵素免疫学的方法により検出することを特徴とする該脂質膜構造体に含有される抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体の量を推定する方法。
【請求項１】
抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体を含有する脂質膜構造体。
【請求項２】
該モノクローナル抗体が脂質膜構造体の脂質膜の中、表面、内部、脂質層中、及び／又は脂質層の表面に存在する請求の範囲第１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項３】
該モノクローナル抗体を該脂質膜構造体の構成成分として含有する請求の範囲第１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項４】
該モノクローナル抗体が該脂質膜構造体の膜表面に結合した請求の範囲第１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項５】
該モノクローナル抗体が、抗ＭＴ１−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ２−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ３−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ４−ＭＭＰモノクローナル抗体、抗ＭＴ５−ＭＭＰモノクローナル抗体、及び抗ＭＴ６−ＭＭＰモノクローナル抗体から選ばれる１種又は２種以上のモノクローナル抗体である請求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項６】
該モノクローナル抗体がヒト型又はマウス型のモノクローナル抗体である請求の範囲第１項ないし第５項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項７】
該モノクローナル抗体がＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、又はＦａｂ’フラグメントである請求の範囲第１項ないし第６項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項８】
該モノクローナル抗体を脂質膜構造体に結合させるための物質を含有する請求の範囲第１項ないし第７項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項９】
該モノクローナル抗体を脂質膜構造体に結合させるための物質が抗ＭＴ−ＭＭＰモノクローナル抗体又はそのフラグメント中のメルカプト基と反応し得る脂質誘導体である請求の範囲第８項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１０】
リン脂質及び／又はリン脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する請求の範囲第１項ないし第９項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１１】
リン脂質及び／又はリン脂質誘導体が、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファリジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、１，２−ジミリストイル−１，２−デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、及びホスファチジン酸からなる群より選ばれる１種又は２種以上のリン脂質及び／又はリン脂質誘導体である請求の範囲第１０項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１２】
さらにステロール類を脂質膜構造体の構成成分として含有する請求の範囲第１項ないし第１１項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１３】
ステロール類がコレステロール及び／又はコレスタノールである請求の範囲第１２項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１４】
血中滞留性機能を有する請求の範囲第１項ないし第１３項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１５】
血中滞留性脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する請求の範囲第１４項記載の脂質膜構造体。
【請求項１６】
血中滞留性脂質誘導体がポリエチレングリコール脂質誘導体又はポリグリセリンリン脂質誘導体である請求の範囲第１５項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１７】
ポリエチレングリコール脂質誘導体が、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−７５０｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、Ｎ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、及びＮ−｛カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−５０００｝−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンからなる群から選ばれる１種又は２種以上のポリエチレングリコール脂質誘導体である請求の範囲第１６項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１８】
温度変化感受性機能を有する請求の範囲第１項ないし第１７項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項１９】
温度感受性脂質誘導体を脂質膜構造体中の構成成分として含有する請求の範囲第１８項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２０】
温度感受性脂質誘導体がジパルミトイルホスファチジルコリンである請求の範囲第１９項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２１】
ｐＨ感受性機能を有する請求の範囲第１項ないし第２０項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２２】
ｐＨ感受性脂質誘導体を脂質膜構造体の構成成分として含有する請求の範囲第２１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２３】
ｐＨ感受性脂質誘導体がジオレオイルホスファチジルエタノールアミンである請求の範囲第２２項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２４】
腫瘍細胞膜上の細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼと反応する請求の範囲第１項ないし第２３項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２５】
腫瘍細胞がＭＴ−ＭＭＰ発現細胞である請求の範囲第２４項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２６】
腫瘍細胞が線維肉腫、扁平上皮癌、神経芽細胞腫、乳癌、胃癌、肝細胞癌、膀胱癌、甲状腺腫瘍、尿路上皮癌、グリア芽細胞腫、急性骨髄性白血病、膵管癌、又は前立腺癌の細胞である請求の範囲第２４項又は第２５項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２７】
新生血管の細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼと反応する請求の範囲第１項ないし第２６項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２８】
脂質膜構造体がミセル、エマルション、リポソーム、又はこれらの混合物の形態である請求の範囲第１項ないし第２７項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項２９】
水系溶媒分散形態、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、又は凍結形態のいずれかの形態である請求の範囲第１項ないし第２８項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体。
【請求項３０】
請求の範囲第１項ないし第２９項のいずれか１項に記載の脂質膜構造体と薬効成分及び／又は遺伝子とを含有する医薬組成物。
【請求項３１】
薬効成分及び／又は遺伝子が脂質膜構造体の膜中、表面、内部、脂質層中及び／又は脂質層の表面に存在する請求の範囲第３０項に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
水系溶媒分散形態、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、又は凍結形態のいずれかの形態である請求の範囲第３０項又は第３１項に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体から公知の方法により作製した酵素標識モノクローナル抗体と請求の範囲第１項ないし第２３項に記載の脂質膜構造体の双方が抗原物質に対して起こす競合反応を酵素免疫学的方法により検出することを特徴とする該脂質膜構造体に含有される抗細胞膜貫通型マトリックスメタロプロテアーゼモノクローナル抗体の量を推定する方法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８９４１９
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０５２７３（Ｐ２００５−５０５２７３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４８７６
【国際出願日】平成１６年４月２日（２００４．４．２）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（３９００１０２０５）第一ファインケミカル株式会社 (23)
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年１０月２１日（２００４．１０．２１）
【発行日】平成１８年７月６日（２００６．７．６）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００４８７６
【国際出願日】平成１６年４月２日（２００４．４．２）
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（３９００１０２０５）第一ファインケミカル株式会社 (23)
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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