アミノ酸位置507がセリンで置換されたアミノ酸残基のアミノ酸置換を有するイソプレンシンターゼ変異体であって、各アミノ酸位置の番号がSEQ ID NO: 120に示すポプライソプレンシンターゼ配列中のアミノ酸位置に対応して付与されるイソプレンシンターゼ変異体、及び、このイソプレンシンターゼ変異体をコードするとともに、プロモータに作動可能に結合された非相同ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体であって、前記変異体がイソプレンシンターゼのＮ−末端に切断を有するポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項２】
前記イソプレンシンターゼ変異体が、全長イソプレンシンターゼよりも高い比活性度を有する、請求項１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項３】
前記イソプレンシンターゼが、SEQ ID NO: 120に示すポプラ・アルバ（alba）イソプレンシンターゼである、請求項１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項４】
前記変異体が、MEA変異体 (SEQ ID NO: 122)、MSV変異体(SEQ ID NO: 124)、MVS変異体(SEQ ID NO: 126)、MTE変異体(SEQ ID NO: 128)、MNV変異体(SEQ ID NO: 130)から成る群から選択される、請求項３に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項５】
前記変異体がMEA変異体 (SEQ ID NO: 122)である、請求項４に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項６】
前記変異体が、TRC (-3)変異体(SEQ ID NO: 136)、TRC (-4)変異体(SEQ ID NO: 138)、TRC (-5)変異体(SEQ ID NO: 140)、TRC (-6)変異体(SEQ ID NO: 142)、及びTRC (-7)変異体(SEQ ID NO: 144)から成る群から選択される、請求項３に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項７】
前記変異体が、ポプラ・トレムロイデス（tremuloides）イソプレンシンターゼの MET変異体(SEQ ID NO: 146)である、請求項１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項８】
前記変異体が、ポプラ・トリコカーパ（trichocharpa）イソプレンシンターゼの MET変異体(SEQ ID NO: 148)である、請求項１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項９】
単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体であって、前記変異体は野生型イソプレンシンターゼのアミノ酸残基の１以上を置換して成り、前記変異体は野生型イソプレンシンターゼよりも高いイソプレンシンターゼ活性を有する、ポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１０】
向上したイソプレンシンターゼ活性が、ジメチルアリルピロホスフェート (DMAPP)の存在下において、イソプレン変異体を含む宿主細胞の方が親イソプレンシンターゼを含む宿主細胞より速く成長することにより示される、請求項９に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１１】
前記イソプレンシンターゼが、SEQ ID NO: 120に示すポプラ・アルバ（alba）イソプレンシンターゼである、請求項９に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１２】
前記変異体が、VlOM, F12S, T15A, E18G, V58I, V58F, L70Q, L70V, L70T, T71P, V79L, E89D, G94A, S119F, F120L, G127R, E175V, T212I, S257A, R262G, A266G, F280L, N297K, F305L, L319M, E323K, A328T, D342E, A359T, K366N, E368D, L374M, S396T, V418S, K438N, H440R, T442I, T442A, I449V, A469S, K500R, K505Q, G507S, S509N, F511Y, 及びN532Kから成る群から選択される１以上のアミノ酸置換を有する、請求項１１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１３】
少なくとも１のアミノ酸置換がL70R置換である、請求項１１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１４】
前記変異体が、G127R/F511Y, L70Q/G94A/R262G/F305L, F12S/ T15A/E18G/N297K, S396T/T442I, V10M/E323K, F120L/A266G, K438N/K500R, V79L/S509N, E175V/S257A/E368D/A469S, T71P/L374M, F280L/H440R, E89D/H440R, V58F/A328T/N532K, S119F/D342E/I449V, 及びK366N/G507Sから成る群から選択される１以上のアミノ酸置換を備える、請求項１１に記載の単離されたポプライソプレンシンターゼ変異体。
【請求項１５】
SEQ ID NO: 120 (図19)に示すアミノ酸残基から成る、結晶形態のポリペプチド。
【請求項１６】
イソプレンを産出する方法であって、（ａ）イソプレンシンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を備える発現ベクターを有する宿主細胞を調製する工程と、（ｂ）前記宿主細胞をイソプレン産出に適した条件下で培養する工程とを備える、イソプレンを産出する方法。
【請求項１７】
さらに、(c)前記イソプレンを回収する工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに、(d)前記イソプレンを重合させる工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
イソプレンシンターゼ活性の分析法であって、(a) 発現ベクターを備える宿主細胞をイソプレンシンターゼ変異体の産出に適した条件下で培養する工程と、(b)リゾチームを含む溶解緩衝液で宿主細胞を溶解して細胞溶解物を生成させる工程と、(c) ジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)から産出されたイソプレンを測定することにより、細胞溶解物中のイソプレンシンターゼ活性を分析する工程とが含まれる、イソプレンシンターゼ活性の分析法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が、グラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌類細胞、及びイースト細胞から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、エシェリキア(Escherichia)属 (E. coli)、パントエア(Panteoa) 属 (P. シトレア(citrea) )、バシラス(Bacillus) 属(B. スブチリス(subtilis))、ヤロウイア(Yarrowia) 属(Y. リポリティカ(lipolytica) )、及びトリコデルマ(Trichoderma) 属(T. リーゼイ(reesei)) から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記宿主細胞を、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、ショ糖、及びオイルから選択される炭素源を含有する培地を用いて培養する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
複数のサンプル中のイソプレンを高速スクリーニングで検出する方法であって、(a) i)各々がイソプレンシンターゼを含む複数のサンプル、ii) 複数のウエルを有するガラス板、及びiii) ガラス板のシール部材を準備する工程；(b) 複数のサンプルをガラス板の複数のウエルに入れる工程；(c) ガラス板をシール部材でシールして、複数のウエルの各々のサンプル上にヘッドスペースを有するシールされたガラス板を作成する工程；(d)イソプレンシンターゼが活性になる条件下でガラス板を培養する工程；及び(e) ヘッドスペース中のイソプレンを分析する工程から成る方法。
【請求項２４】
前記イソプレンをガスクロマトグラフィー−質量分析(GC-MS)により分析する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数のサンプルに、プロモータに作動可能に結合されるとともにイソプレンシンターゼ変異体をコードするポリヌクレオチド配列を有する発現ベクターを含む宿主細胞が含有されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記複数のサンプルに、宿主細胞の溶解物、リゾチーム、及びジメチルアリルジホスフェート(DMAPP)が含有されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記ガラス板がディープウエルガラスブロックである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数のウエルが少なくとも24個のウエルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記複数のウエルの各ウエルの容積が2 ml以下である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
プロモータに作動可能に結合されるとともにイソプレンシンターゼ変異体をコードする非相同ポリヌクレオチド配列を備える宿主細胞であって、前記イソプレンシンターゼ変異体がポプライソプレンシンターゼにおいて対応する位置の1以上（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, または10）の残基に置換を有する宿主細胞。
【請求項３１】
前記イソプレンシンターゼがSEQ ID NO: 120に示すP. アルバ・イソプレンシンターゼである、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記変異体が、MEA変異体 (SEQ ID NO: 122)、MSV変異体(SEQ ID NO: 124)、MVS変異体(SEQ ID NO: 126)、MTE変異体(SEQ ID NO: 128)、MNV変異体(SEQ ID NO: 130)から成る群から選択される、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
前記変異体が、TRC (-3)変異体(SEQ ID NO: 136)、TRC (-4)変異体(SEQ ID NO: 138)、TRC (-5) 変異体(SEQ ID NO: 140)、TRC (-6)変異体(SEQ ID NO: 142)、及びTRC (-7) 変異体(SEQ ID NO: 144) から成る群から選択される、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
前記変異体が、P. トレムロイデス（tremuloides）イソプレンシンターゼ のMET変異体である(SEQ ID NO: 146)、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３５】
前記変異体が、P. トリコカーパ（trichocharpa）イソプレンシンターゼのMET変異体である(SEQ ID NO: 148）である、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記イソプレンシンターゼ変異体が、V10M, F12S, T15A, E18G, V58I, V58F, L70Q, L70V, L70T, T71P, V79L, E89D, G94A, S119F, F120L, G127R, E175V, T212I, S257A, R262G, A266G, F280L, N297K, F305L, L319M, E323K, A328T, D342E, A359T, K366N, E368D, L374M, S396T, V418S, K438N, H440R, T442I, T442A, I449V, A469S, K500R, K505Q, G507S, S509N, F511Y, 及びN532Kから成る群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
少なくとも1のアミノ酸置換がL70R置換である、請求項３６に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
前記変異体が、G127R/F511Y, L70Q/G94A/R262G/F305L, F12S/T15A/E18G/N297K, S396T/T442I, V10M/E323K, F120L/A266G, K438N/K500R, V79L/S509N, E175V/S257A/E368D/A469S, T71P/L374M, F280L/H440R, E89D/H440R, V58F/A328T/N532K, S119F/D342E/I449V, 及び K366N/G507Sから成る群から選択される1以上のアミノ酸置換を有する、請求項３１に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
前記ポリヌクレオチド配列がプラスミド中に含まれている、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチド配列が宿主細胞中の染色体に組み込まれている、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、グラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌類細胞、及びイースト細胞から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４２】
前記宿主細胞が、エシェリキア(Escherichia)属 (E. coli)、パントエア(Panteoa) 属 (P. シトレア(citrea) )、バシラス(Bacillus) 属(B. スブチリス(subtilis))、ヤロウイア(Yarrowia) 属(Y. リポリティカ(lipolytica) )、及びトリコデルマ(Trichoderma) 属(T. リーゼイ(reesei)) から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
前記宿主細胞が、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、ショ糖、及びオイルから選択される炭素源を含有する培地を用いて培養される、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４４】
前記宿主細胞がさらに、IDIポリペプチドをコードする非相同または天然の核酸、および／または、DXSポリペプチドをコードする非相同または天然の核酸を備え、任意に天然のDXP経路と組み合わされている、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４５】
前記宿主細胞がさらに、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸を備える、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４６】
宿主細胞がイソプレンシンターゼ変異体、IDIポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1のベクターを備える、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
宿主細胞がさらに、サッカロミセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisia) 由来の MVA経路ポリペプチド、及びエンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)由来の MVA経路ポリペプチドから成る群から選択されるMVA経路ポリペプチドをコードする非相同核酸を備える、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
宿主細胞がさらにMVA経路ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする1以上の核酸を備え、1のベクターがイソプレンシンターゼ変異体、MVA経路ポリペプチド及びDXSポリペプチドをコードする、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項４９】
宿主細胞がさらにDXSポリペプチド、IDIポリペプチド、または1以上の残りのDXP経路ポリペプチド、及びMVA経路ポリペプチドをコードする1以上の核酸を備える、請求項４８に記載の宿主細胞。
【請求項５０】
イソプレンを産出する方法であって、(a)イソプレン産出に適した培養条件下で請求項３０に記載の宿主細胞を培養する工程と、(b) イソプレンを産出する工程とが含まれる方法。
【請求項５１】
さらに、(c)イソプレンを回収する工程が含まれる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
さらに、イソプレンを重合する工程が含まれる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
イソプレンシンターゼを産出する方法であって、(a) (i)宿主細胞；及び(ii)プロモータに作動可能に結合するとともにイソプレンシンターゼ変異体をコードする核酸を準備する工程であって、前記イソプレンシンターゼ変異体がSEQ ID NO: 120に示すアミノ酸配列を有するP. アルバ・イソプレンシンターゼにおいて対応する位置の1以上（1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, または10）の残基における置換を有する工程と、
(b) 前記宿主細胞を前記核酸に接触させて形質転換された宿主細胞を調製する工程と、
(c) 形質転換された宿主細胞をイソプレンシンターゼの産出に適した条件下で培養する工程とが含まれる方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１１】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１３】

【図１４Ａ】

【図１４Ｂ】

【図１４Ｃ】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８Ａ】

【図１８Ｂ】

【図１８Ｃ】

【図１９】

【図２０Ａ】

【図２０Ｂ】

【図２０Ｃ】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６Ａ】

【図２６Ｂ】

【図２６Ｃ】

【図２７】

【図２８Ａ】

【図２８Ｂ】

【図２８Ｃ】

【図２９】

【図３０Ａ】

【図３０Ｂ】

【図３０Ｃ】

【図３１】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【図３２Ｃ】

【図３３】

【図３４Ａ】

【図３４Ｂ】

【図３４Ｃ】

【図３５】

【図３６】

【図３７Ａ】

【図３７Ｂ】

【図３７Ｃ】

【図３８】

【図３９Ａ】

【図３９Ｂ】

【図３９Ｃ】

【図４０】

【図４１】

【図４２】

【図４３】

【図４４】

【図４５】

【図４６】

【図４７】

【図４８】

【図４９】

【図５０】

【図５１】

【図５２Ａ】

【図５２Ｂ】

【図５２Ｃ】

【図５３】

【図５４Ａ】

【図５４Ｂ】

【図５４Ｃ】

【図５５】

【図５６Ａ】

【図５６Ｂ】

【図５６Ｃ】

【図５７】

【図５８Ａ】

【図５８Ｂ】

【図５８Ｃ】

【図５９】

【図６０Ａ】

【図６０Ｂ】

【図６０Ｃ】

【図６１】

【図６２Ａ】

【図６２Ｂ】

【図６２Ｃ】

【図６３】

【図６４Ａ】

【図６４Ｂ】

【図６４Ｃ】

【図６５】

【図６６Ａ】

【図６６Ｂ】

【図６６Ｃ】

【図６７】

【図６８Ａ】

【図６８Ｂ】

【図６８Ｃ】

【図６９】

【図７０】

【図７１】

【図７２Ａ】

【図７２Ｂ】

【図７３】

【図７４Ａ】

【図７４Ｂ】

【図７４Ｃ】

【図７５】

【図７６Ａ】

【図７６Ｂ】

【図７６Ｃ】

【図７７】

【図７８Ａ】

【図７８Ｂ】

【図７８Ｃ】

【図７８Ｄ】

【図７９】

【図８０】

【図８１Ａ】

【図８１Ｂ】

【図８１Ｃ】

【図８２】

【図８３Ａ】

【図８３Ｂ】

【図８３Ｃ】

【図８４】

【図８５】

【図８６Ａ】

【図８６Ｂ】

【図８６Ｃ】

【図８７】

【図８８Ａ】

【図８８Ｂ】

【図８８Ｃ】

【図８９】

【図９０Ａ】

【図９０Ｂ】

【図９０Ｃ】

【図９１】

【図９２】

【図９３Ａ】

【図９３Ｂ】

【図９３Ｃ】

【図９３Ｄ】

【図９４Ａ】

【図９４Ｂ】

【図９５Ａ】

【図９５Ｂ】

【図９６Ａ】

【図９６Ｂ】

【図９７Ａ】

【図９７Ｂ】

【公表番号】特表２０１１−５１８５６４（Ｐ２０１１−５１８５６４Ａ）
【公表日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５０６４６０（Ｐ２０１１−５０６４６０）
【出願日】平成２１年４月２３日（２００９．４．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４１５８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１３２２２０
【国際公開日】平成２１年１０月２９日（２００９．１０．２９）
【出願人】（５０９２４０４７９）ダニスコ・ユーエス・インク (81)
【出願人】（５９０００２９７６）ザ・グッドイヤー・タイヤ・アンド・ラバー・カンパニー (256)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ　ＧＯＯＤＹＥＡＲ　ＴＩＲＥ　＆　ＲＵＢＢＥＲ　ＣＯＭＰＡＮＹ
【住所又は居所原語表記】１１４４　Ｅａｓｔ　Ｍａｒｋｅｔ　Ｓｔｒｅｅｔ，Ａｋｒｏｎ，Ｏｈｉｏ　４４３１６−０００１，Ｕ．Ｓ．Ａ．
【Ｆターム（参考）】