新規シュウドモナス属細菌
【課題】蜜蜂、動物、野菜における細菌、真菌またはウイルスが原因となる疾病の防除方法、並びに、蜜蜂、動物、野菜の成長を促進する方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、シュウドモナス・フォンスに属し、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する細菌、並びに、本細菌を有効成分とする病原性細菌、真菌またはウイルスの感染および増殖の抑制剤を提供する。新規シュウドモナス属細菌としては特にシュウドモナス・フォンス MS-1株（受託番号FERM P-21673）が好ましい。
【解決手段】本発明は、シュウドモナス・フォンスに属し、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する細菌、並びに、本細菌を有効成分とする病原性細菌、真菌またはウイルスの感染および増殖の抑制剤を提供する。新規シュウドモナス属細菌としては特にシュウドモナス・フォンス MS-1株（受託番号FERM P-21673）が好ましい。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規シュウドモナス属細菌、それを用いた蜜蜂、動物または植物の成長促進方法、疾病の防除方法、並びに、該細菌の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハチミツは、長い歴史のなかで健康食品として、また高級嗜好品として人々に重用されてきており、日本のみならず、西欧、イスラム圏や中華民族圏においても、人気のある食品となっている。
【０００３】
このハチミツをつくる蜜蜂は、日本では日本蜜蜂が古来種として用いられてきたが、本種は、移動する習性などのため飼育が難しく、現在は西洋蜜蜂がハチミツ生産における主要種となっている。
【０００４】
西洋蜜蜂には、いくつかの疾病が発症し、おおきな被害が生じている。なかでも腐蛆病菌（ヨーロッパ腐蛆病Melissococcus plutonius、アメリカ腐蛆病Paenibacillus larvae）に原因する腐蛆病は、成蜂が本菌を飲み込み蜂児に与えることにより、蜂幼虫において発症し大量死にいたる。この疾病は、法定家畜伝染病であり、発生蜂群は法律により焼却処分にしなければならない。疾病への予防対策では、抗生物質(ミロサマイシン)を含む「アピテン」が使用されているが、この薬剤が成蜂を経由してハチミツに混入する事態が生じており、ハチミツのブランド性を損なうものと危惧されている。
【０００５】
また、真菌Ascosphaera apisに原因するチョーク病は、3〜5日齢の蜂幼虫に高率に感染して、大量死をひきおこすが、真菌には抗生物質の効果がないなど、本疾病に対する有効な対処方法は少ない。
【０００６】
また、近年、蜜蜂にはウイルス病が発生し、蜂が集団で消失してしまう事態がおきている。これは、蜜蜂群れ崩壊症候群といわれ、急性まひウイルス等が原因ウイルスとされている。このウイルス疾病に対しても、有効な薬剤は見つかっていない。
【０００７】
近年の、食品素材への薬剤使用に対する社会的抑制傾向において、ハチミツ中の残留抗生物質等に対する社会的関心が高まっているため、薬剤を使用しない蜜蜂飼育方法の確立が必要となっている。
【０００８】
一方、家畜、野菜類の疾病は拡大しており、新たな薬剤の使用と耐性菌の出現、あるいは新規疾病発生の繰り返しとなっている。この疾病発生・拡大の理由の一つには、多種多量の薬剤使用による、動物消化管内あるいは土壌などの環境中の微生物バランスの崩壊があげられる。例えば、自然界では、ウイルスは細菌によって抑制されているが、日常的に使用される抗生物質によって、細菌が減少するため、細菌の抑制から解かれたウイルスが増加している。この現象は、恒常的に抗生物質（成長促進剤）を使用している家畜現場において顕著に現れている。このため、薬剤に依存しない動植物の生産方法への転換が必要とされている。
【０００９】
本方法は、これらの疾病の原因となる病原細菌、病原性真菌、病原ウイルスの増殖・感染を抑制する有用細菌を用いて疾病を防除するもので、この有用細菌の使用により薬剤を低減、抑止することができる。
【００１０】
通常、微生物は、液体中に可溶性栄養物を添加した液体培地を用いて培養されており、液体：固形培地の割合は、液体中の沈殿物を考慮しても、100：1以下となる。しかし、この液体培養の場合には、単位mlあたりの細菌収量が少なく、最大収量は109〜1010 細菌細胞/ml 程度であり、動植物に投与する場合には、大量の培養微生物が必要となる。このため、細菌収量を大幅に増大するような培養方法の開発が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、蜜蜂、動物、野菜における細菌、真菌またはウイルスが原因となる疾病の防除方法、並びに、蜜蜂、動物、野菜の成長を促進する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは驚くべきことに、シュウドモナス・フォンス (Pseudomonas fons) MS-1株（受託番号FERM P-21673）を包含する、シュウドモナス・フォンスに属し、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する細菌により上記課題が解決できることを見出した。本発明は以下の発明を包含する。
(1) シュウドモナス・フォンス (Pseudomonas fons) に属し、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する細菌。
(2) シュウドモナス・フォンスMS-1株（受託番号FERM P-21673）またはその変異株である(1)の細菌。
【００１３】
(3) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌の感染および増殖の抑制剤。
(4) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の真菌の感染および増殖の抑制剤。
【００１４】
(5) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性のウイルスの感染および増殖の抑制剤。
(6) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂または動物の成長促進剤。
(7) (1)または(2)の細菌を含有する、植物の成長促進剤。
【００１５】
(8) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物のための、細菌、真菌またはウイルスが原因である疾病の防除剤。
(9) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂または動物のための飼料・食物または飼料・食物添加剤。
【００１６】
(10) (1)または(2)の細菌を含有する、肥料または肥料添加剤。
(11) 固形粉末から調製された固体培地を用いて培養を行うことを特徴とする、(1)または(2)の細菌の培養方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の新規シュウドモナス属細菌の使用により、蜜蜂、動物、野菜の主たる疾病である腐蛆病、チョーク病、サルモネラ症、鶏インフルエンザウイルス病、免疫不全ウイルス病、立枯病、そうか病等の罹病、拡散を防ぐことができる。また、本発明の新規シュウドモナス属細菌により、蜜蜂の成蜂数が大幅に増加、すなわちハチミツの生産能の向上効果が得られるとともに、家畜などの動物、野菜の成長促進効果が得られる。そして、これらの結果は、動物医薬あるいは人の健康食品としての使用を可能とすることも示している。
【００１８】
また、新規シュウドモナス属細菌を固体培地を用いて培養する場合には、当該細菌を高濃度で培養すること、すなわち当該細菌を高い収量で得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明をより詳細に説明する。
１．新規細菌
本発明の新規シュウドモナス属細菌は、シュウドモナス・フォンスに属し、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する細菌であれば特に限定されない。「動物」および「植物」については後述するとおりである。本発明の新規シュウドモナス属細菌により感染および増殖が抑制される細菌の例としては腐蛆病菌（Melissococcus plutoniusまたはPaenibacillus larvae）、サルモネラ症菌 （Salmonella infantis）、立枯病菌（Ralstonia solanacearum）、瘡痂（そうか）病菌（Streptomycesscabies, S. acidiscabies）が挙げられ、真菌の例としては病原真菌（Ascosphaera apis）が挙げられ、ウイルスの例としては鶏インフルエンザウイルス（H3N8）、ヒラメ貧血症ウイルス（IHNV）、ロタウイルス(Rotavirus)が挙げられるがこれらには限定されない。
【００２０】
このような能力を有する細菌としてはシュウドモナス・フォンス(Pseudomonas fons) MS-1株（受託番号FERM P-21673）が最も好ましいがこれには限定されず、例えば、16SrRNAの遺伝子の部分配列が配列番号１で表される、シュウドモナス・フォンスに属する細菌や、以下の菌学的性質：
形状
桿菌、長さ：1〜3ミクロン、運動性：有り、胞子形成：無し、グラム染色：陰性、OFテスト：−
生育程度
1〜2日程度培養で数mmのコロニーを形成する、色：薄茶色、光沢：特になし、表面：平滑、拡散性色素：無し、pH：4.0 (-), 5.0(+), 5.6(+), 8.6(+), 9.0(+), 10.0 (+) 温度：中温性7〜45℃、NaCl：0〜4%
硝酸還元：−、脱窒反応：−、インドール：−、硫化水素：−、クエン酸：−、硝酸塩利用：−、色素産生：−、ウレアーゼ：−、オキシダーゼ：＋、カタラーゼ：＋、DNA G+C content:68 mol%
を有する、シュウドモナス・フォンスに分類される細菌が使用できる。
【００２１】
蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する限り、シュウドモナス・フォンスMS-1株の変異体もまた好適に使用できる。ここで変異体とはシュウドモナス・フォンスMS-1株が変異誘発処理された変異株である。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。
【００２２】
本発明の新規シュウドモナス属細菌の培養には、固体培養基（大豆粉８００ｇ、米糠２００ｇ、酵母抽出物４ｇ、蒸留水１０００ｍｌ）ともに、一般的な細菌用の培地を適用することができ、特に組成を限定するものではない。例えば、ソイトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸二カリウム０．２ｇ、蒸留水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４の培地を作製し、１２１℃、１５分間の加熱滅菌を行って使用することができる。
【００２３】
また、新規シュウドモナス属細菌を固体及び液体で培養するときの培養容器は、一般的な微生物の培養に用いられる装置を用いることができ、特に方法を限定するものではない。例えば、小規模の培養では試験管、フラスコ、シャーレなどを用いることができ、大規模の培養にはジャーファメンター、通気攪拌できるタンクなどを使用することができる。
【００２４】
本発明の新規細菌の大量生産のためには、固形粉末から調製された固体培地を用いて培養を行うことが特に好ましい。ここで固形粉末としては、大豆粉末、米糠粉末を主材料とし、添加物として少量の酵母抽出物やミルク由来ペプトンを加えた混合物が好ましい。また、固形粉末として珪酸質粒子などの無機物質を使用することもできる。本発明者らは、固形粉末に、水分として、蒸留水を固形粉末100gあたりに20ml、40ml、60ml、80mlを加え、上記細菌を接種して、25℃で3日間にわたり培養した場合、60ml以上の水分を加えた培地において細菌は良く増殖することを見出した。その増殖量は、1010〜1012 細菌細胞/gに達する。固形粉末100gに対する水分量は80〜140mlが好ましい。また、珪酸質などの無機物粒子（粒径約10μm）数10gを培養液１Lに加えても、シュウドモナス属細菌の生菌量が約10倍に増加する。この無機粒子の量は、培養液１リットルに対して20〜50gの範囲が好ましい。固体培養、あるいは液体培地に固形粉末を添加した培養では高濃度の栄養物に本発明の新規細菌が接触するため、あるいは固形物といった付着物質に菌が付着するため、細菌収量が大幅に増加する。そして、この細菌収量は、液体培養の場合の収量よりも10〜100倍多い。この固体培養物は、水や砂糖液で希釈することにより、均質に分散するため、蜜蜂または動物の餌あるいは植物の肥料として、あるいは蜜蜂、動物または植物の生育環境への散布剤として使用することができる。
【００２５】
本発明の細菌を下記の用途に使用する場合、その形態は特に限定されず、菌体または培養物あるいはそれらの処理物等の種々の形態で使用できる。ここで「培養物」とは固体または液体培地中で細菌を培養して生じる、菌体の分離を行っていない培養物（液体培地の場合は培養液）である。「処理物」とは、培養物を常法により処理したもの全てを包含する概念であり、例えば、培養物の希釈物、濃縮物、乾燥物、凍結物などを指す。
【００２６】
本発明の目的には、培養を終了した菌体培養物と菌を含むそのままの状態で使用できる。本発明の細菌は保存温度５℃以下で２〜３週間程度の期間有効に保管できるため、低温輸送、冷蔵庫保管することによって蜜蜂、動物または植物の飼育・栽培に際して有効に利用することができる。
【００２７】
培養を終了した菌体培養物を小分けし、グルコースやグリセリルを添加して凍結して保管するのもまた、長期保存の観点から有効である。凍結した培養物は、そのまま−２０℃以下で保管することによって６ヶ月以上の保管が可能であり、長期にわたって蜜蜂、動物または植物の飼育・栽培のために有効に利用することができる。
【００２８】
培養を終了した菌体培養物は乾燥して用いることもできる。菌の活力が低下するため効力が低下する欠点はあるが、長期に保管して動植物の飼育・栽培に使用できる観点から適している。乾燥方法は、特に限定するものではないが、例えば、噴霧乾燥、真空乾燥、真空凍結乾燥などを用いることができる。
【００２９】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物は、使用目的（例えば養蜂用途、飼料用途、食品用途、肥料用途、医薬用途、獣医学的用途、水産養殖用途）において許容される賦形剤または担体とともに使用することができる。例えば、混合できる物質として、配合飼料、乳酸菌、バチルス菌、魚粉、穀物粉末、海藻粉末、無機物質粉末が挙げられ、所望の用途に使用できるものであれば種類を問わない。
【００３０】
２．蜜蜂のための用途
本発明の新規シュウドモナス属細菌は養蜂における疾病（特に腐蛆病およびチョーク病）の防除のために有用である。すなわち本発明は、有効量の新規シュウドモナス属細菌を蜜蜂またはその幼虫に投与する工程を含む、細菌、真菌またはウイルス（特に細菌または真菌）が原因である蜜蜂の疾病を防除する方法に関する。有効量の新規シュウドモナス属細菌を蜜蜂へ投与する手段は特に限定されないが、例えば蜜蜂の幼虫の餌（例えば砂糖液）に新規シュウドモナス属細菌を添加して摂食させる方法や、巣箱などの生育環境中に新規シュウドモナス属細菌を含有する液体（例えば培養物の希釈液）を噴霧する方法などが挙げられる。ミルク由来ペプトン、酵母抽出液、大豆由来ペプトンで調整した固体培地を用いて新規シュウドモナス属細菌を培養した場合、培養物を水または砂糖液で希釈し、巣箱へ噴霧するか餌として蜜蜂幼虫に摂食させることができるため特に好ましい。有利なことに、新規シュウドモナス属細菌の投与によって蜂幼虫の疾病が減少し、幼虫の生残率が向上するため、成蜂数が大幅に増加することも実施例では確認されている。
【００３１】
３．動物のための用途
本発明の新規シュウドモナス属細菌は動物における疾病（例えばサルモネラ症、ロタウイルスによる下痢およびそれに起因する成長不全）の防除のために有用である。ここで「防除」とは治療、予防および抑制を包含する概念である。すなわち本発明は、有効量の新規シュウドモナス属細菌を動物に投与する工程を含む、細菌、真菌またはウイルスが原因である動物の疾病を防除する方法に関する。「動物」とは、家畜（例えばウシ、ブタ）、ペット、家禽（例えばニワトリ）、または人などを指す。有効量の新規シュウドモナス属細菌を動物へ投与する手段は特に限定されないが、例えば動物の餌に新規シュウドモナス属細菌を添加して摂食させる方法や、動物の生育環境中に新規シュウドモナス属細菌を含有する液体を噴霧する方法などが挙げられる。本発明者らは、サルモネラ症のニワトリでの抑制効果、および深刻な成長不全の原因となるロタウイルスによる下痢の仔牛での改善効果を実際に確認している。さらに、人の健康食品としての使用も可能である。
【００３２】
４．植物のための用途
本発明の新規シュウドモナス属細菌は植物における疾病（例えばトマトの立枯病、イモ類のそうか病）の防除のために有用である。ここで「防除」とは治療、予防および抑制を包含する概念である。すなわち本発明は、有効量の新規シュウドモナス属細菌を植物に施用する工程を含む、細菌、真菌またはウイルスが原因である植物の疾病を防除する方法に関する。「植物」とは、野菜類、穀類などを指し、具体的にはトマト、ピーマン、ブロッコリー、イモ類等の野菜が挙げられる。有効量の新規シュウドモナス属細菌を野菜へ施用する手段は特に限定されないが、例えば有効量の新規シュウドモナス属細菌を土壌中に混和する方法や、植物体に適用する方法、種子に適用する方法等が挙げられる。
【００３３】
本発明はまた、有効量の新規シュウドモナス属細菌を植物に施用する工程を含む、植物の成長促進方法に関する。本発明者らはトマト、ピーマン、およびブロッコリーにおいてこの成長促進効果を確認している。植物への施用方法は上記の通りである。
【実施例１】
【００３４】
シュウドモナス・フォンス MS-1株の単離および同定
１．本菌は、淡水環境から単離された菌株であり、以下のような特徴をもつ。
２．形状
桿菌、長さ：1〜3ミクロン、運動性：有り、胞子形成：無し、グラム染色：陰性、OFテスト：−
【００３５】
３．生育程度
1〜2日程度培養で数mmのコロニーを形成する、色：薄茶色、光沢：特になし、表面：平滑、拡散性色素：無し、pH：4.0 (-), 5.0(+), 5.6(+), 8.6(+), 9.0(+), 10.0 (+) 温度：中温性7〜45℃、NaCl：0〜4%
４．硝酸還元：−、脱窒反応：−、インドール：−、硫化水素：−、クエン酸：−、硝酸塩利用：−、色素産生：−、ウレアーゼ：−、オキシダーゼ：＋、カタラーゼ：＋、DNA G+C content:68 mol%
【００３６】
５．16SrRNAの解析
Sepa Gene キット（三光純薬社製）を用いて核酸の抽出を行った後、エタノール沈殿により核酸を回収した。16SrRNAに特異的なユニバーサルプライマー2種を用いて増幅をおこない、次にスピンカラム（ファルマシア社製）を用いて精製を行った。精製したPCR増幅産物についてアプライド バイオシステムズ377シークエンサーにより塩基配列の解析を行った。その後、シーンバンクのデータベースよりオンライン検索を行った。
【００３７】
以下に、Pseudomonas fons MS-1株の16SrRNAの遺伝子の塩基配列を、対応するDNAデータとして示す（表１）。
【００３８】
本菌を産業別審査基準応用微生物工業改訂版（特許庁編）の新種細菌の記載例に従って、その性状をしらべ、Baumann (1984)に基づきその分類学上の位置を検討した結果、本菌に該当する記載菌株はないため、Pseudomonas fonsMS-1株とした。
【００３９】
本発明者らは当該菌株をシュウドモナス・フォンスMS-1株と命名し、平成20年9月18日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-21673として寄託した。
【００４０】
【表１】
【実施例２】
【００４１】
シュウドモナス・フォンスMS-1株の病原細菌の増殖抑制能
上記のシュウドモナス・フォンス MS-1株が病原性細菌の増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。
【００４２】
寒天培地にあらかじめ塗沫した2本の上記菌株のスミアの間に、サルモネラ病菌 Salmonella infantis、立枯病菌 Ralstonia solanacearumを移植して25℃下にて10日間培養、その後のスミアの間の病原菌のコロニーの大きさを、病原菌のみを対照区として培養した場合のコロニーの大きさと比較したところ、表２に示すとおり、サルモネラ、立枯病菌の増殖が抑制された。表２中の「阻害率」は、対照区培地上の病原菌のコロニーの横幅の大きさと試験区の同菌のコロニーの同大きさとの比を百分率で表したものである。
【００４３】
さらに、上記のシュウドモナス・フォンスMS-1株が、腐蛆病（Melissococcus plutonius 及び Paenibacillus larvae）とチョーク病菌（Ascosphaera apis）の増殖を抑制する能力を有することを、同様の方法で確認した。
【００４４】
【表２】
【実施例３】
【００４５】
シュウドモナス・フォンス MS-1株のウイルス感染抑制能
自然界では、ウイルスの感染を抑制したり、あるいはウイルスを分解したりする細菌が多く分布している。このような自然界において、抗生物質を使用するとウイルスを抑えている細菌（抗ウイルス細菌）が殺滅されてしまう。一方、大半の抗生物質に対しては、ウイルスは抵抗性を保持している。この結果、抗生物質の使用により、抗ウイルス細菌が排除されてしまうため、ウイルスは、その阻害要因が少なくなった部分、よりよく感染、増殖を行うことになる。
【００４６】
養蜂においても、抗生物質の使用により、腐蛆病菌などは殺滅されるかわりに、ウイルスの増殖が促進されることになり、ウイルス病が流行する可能性が高い。同様の事象は、豚、鶏、ウシおよび養殖魚においては、すでに長年にわたって起こっている。そこで、本研究では、有用細菌MS-1株における、ウイルス抑制能について検定した。
【００４７】
上記の菌株シュウドモナス・フォンスMS-1株が病原性ウイルスの増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。なお、蜜蜂の疾病原因となるウイルスはまだ培養できないため、外皮（カプシド）を保持するという、比較相似したウイルスとして鶏インフルエンザウイルス（H3N8）及び伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）を対照ウイルスとして採用した。すなわち、ウイルスの不活化は、その多くがウイルス外皮の分解、損傷に起因するものであるため、本実験の結果は、蜜蜂の疾病原因ウイルスを含む多くのウイルスの不活化を示唆するものといえる。
【００４８】
まず、犬の腎臓MDCK細胞の培養系において、上記MS-1株の培養上澄液が鶏インフルエンザの原因ウイルスである鶏インフルエンザウイルス（BUD/H3N8株）の感染作用を抑制するか否かについて検定した。作用抑制効果は犬腎臓細胞の変性効果 (CPE) を抑止する度合いを指標として判定した。すなわち、犬の腎臓MDCK細胞を、1 mLの液体培地（10％ウシ血清成分、0．075％NaHCO3、100 IU／mLペニシリン、100μg／mLストレプトマイシン、1.6％Tris-HCl(pH 7.8) 含有）中で25℃にて培養し、その培養系に、鶏インフルエンザウイルス（H3N8）培養液(0.1 ml)および上記シュウドモナス属細菌MS-1株の培養上清液（0.1 mL）を加えた。対照実験として、前記培養系に鶏インフルエンザウイルス（BUD/H3N8株）の培養液のみ（0.1 mL）を添加した。ここで、上記シュウドモナス属細菌の培養上清液とは、当該細菌をソイトン培地中で3日間25℃で培養した後に遠沈(4000rpm)して菌体を沈澱させ、0.22μmのフィルターでろ過して得られた濾液を指す。また鶏インフルエンザウイルス（BUD/H3N8株）の培養液とは、同様の上記培養液および犬の腎臓MDCK細胞を用いて鶏インフルエンザウイルス（H3N8）を増殖させた後、0.45μmのフィルターで濾過して得られた濾液を指す。
【００４９】
上記の菌体培養上清液を添加した後のCPEを経時的に測定した。CPEが低いということは、すなわちウイルスの増殖が抑制されていることを意味する。結果を別表３に示すとおり、シュウドモナス・フォンス MS-1株の培養上清を添加した場合に鶏インフルエンザウイルス（BUD/H3N8株）の増殖が抑制された。
【００５０】
更に、上記の方法を一部改変し、シュウドモナス・フォンス MS-1株が伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の感染・増殖を抑制する能力を有することを確認した。すなわち、上記の方法において犬腎臓細胞の替わりにマスノスケ細胞(IHV)を用い、インフルエンザウイルス（H3N8）の替わりに伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）を用いて調べた結果、シュウドモナス・フォンスMS-1株培養上清液は伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の増殖を抑制した(表３)。なお、ウイルスの能力は、培養細胞感染価（TCID50）としてあらわした。
【００５１】
【表３】
【実施例４】
【００５２】
腐蛆病菌による蜜蜂への攻撃試験とシュウドモナス・フォンス MS-1株の疾病防除効果
閉鎖系飼育室内に3つの網室を設置し、各網室内に蜜蜂の1蜂群ずつの合計3蜂群を導入し、飼育した。3蜂群中1蜂群にはMS-1株を巣箱内に噴霧投与し（投与群I）、別の1蜂群にはMS-1株を蜂の餌である砂糖液に混合して投与した（投与群II）。残りの1蜂群は攻撃対照群とし、MS-1株は投与していない。MS-1株投与期間途中に3蜂群全てに対して腐蛆病菌で攻撃し、攻撃後5週までの腐蛆疾病発症の有無及び蜂群の状態（飼料摂取量、幼虫数、蜂児圏の状態及び成蜂の活動状態等）について観察した。この結果、飼料の摂取量では、3群において相異はなかった。そして、腐蛆病原菌の攻撃後は、軽度で一時的な蜂児圏の乱れが3蜂群において共通して認められ、その数は若干減少したが、腐蛆病はMS-1株投与群では発症が認められず、攻撃対照群では発症した。すなわち、有用細菌を投与した2蜂群においては、腐蛆病発症はみられなかった。
【００５３】
以上のことから、蜂群における有用細菌MS-1株による腐蛆病の疾病防除の効力が明らかとなった（表４）。
【００５４】
【表４】
【実施例５】
【００５５】
シュウドモナス・フォンス MS-1株によるチョーク病の防除
蜂群を８巣箱にわけ、MS-1株の液体培養液希釈液（1/10倍に希釈）を蜂の巣に噴霧し、チョーク病の発生状況を2ヶ月にわたり観察した。その結果、MS-1株を噴霧した巣箱では、チョーク病の発症が抑制された（表５）。表５の蜂蛆数の値は、各実験区4箱における数を平均した値で表した。
【００５６】
【表５】
【実施例６】
【００５７】
シュウドモナス・フォンスMS-1株の蜜蜂の成長促進効果
上記の、高い抗菌力を保持するMS-1株について、その培養菌液を餌・水に混合してミツバチに投与し、ミツバチの成体に及ばす影響を検定した。
【００５８】
実験期間は約2ヶ月で、実験場所は宮崎県綾町および同県小林市に設定し、菌の投与は1日おきに、蜜蜂の内検は毎日行った。この投与試験の結果、6カ所に設定した菌株投与区において、餌や水の摂取量に多少の違いが見られたが、対照区と比較し、全ての菌株投与実験区において蜜蜂の健康度には問題のないことが判明し、また、蜂数の増加する傾向がみられた（表６）。表６の蜂数は、巣框（すわく）１枚あたりの平均値として表した。
【００５９】
【表６】
【実施例７】
【００６０】
シュウドモナス・フォンス MS-1株による養鶏の疾病防除と成長促進効果
鶏の飼育試験における体重増
生後8日齢の鶏ひな（名古屋コーチン）を、各々の1区に10羽おき、13齢までの６日間の飼育試験を行った。
【００６１】
各区の構成は、添加生菌量：5%（表７−１）、生菌無添加（表７−２）である。
基礎飼料としては、抗菌性添加物の無混合の飼料（バランスアップ18、日本配合飼料社製造）を採用した。
【００６２】
【表７−１】
【００６３】
【表７−２】
【００６４】
シュウドモナス・フォンス MS-1株を投与したひな鶏の観察項目の結果
食欲：良好
ふん便性状；固形状（良好）
活力：良好
羽毛の光沢など：良好
飼料摂取量及び体重：表７−１および７−２（体重は順調に増加）
剖検（病理性状の有無）：肝臓の変色、萎縮、過剰な脂肪蓄積など無し
腹部膨満無し
腎臓の結石など無し
腸壁の異常無し
【００６５】
疾病防除効果
若鶏100尾を2群にわけ、1群には、シュウドモナス・フォンス MS-1株を投与、他の1群には菌株を投与しなかった。そして、若鶏に病原性サルモネラ菌（Salmonella infantis）を配合飼料に混合して投与したところ、シュウドモナス・フォンスMS-1株を投与した若鶏では、サルモネラ病は発症する尾数は大幅に減少した（表８）。
【００６６】
【表８】
【実施例８】
【００６７】
シュウドモナス・フォンス MS-1株による仔牛の下痢抑止効果
仔牛では、ロタウイルスによる下痢が発生し、食物の消化が進まないため、成長の著しく遅滞する弊害が生じている。ここで、ミルク５００ｍｌに１００ｍｌのシュウドモナス・フォンス MS-1株培養液を混合して仔牛に投与した。すなわち、仔牛３０頭（黒毛和牛、生後約30日）を３群にわけ、第１群には、シュウドモナス・フォンス MS-1株を１回投与、第２群には２回投与し、第３群には投与しない実証試験を行った。この結果、シュウドモナス・フォンスMS-1株を投与した仔牛では、下痢症状が著しく改善された（表９）。
【００６８】
【表９】
【実施例９】
【００６９】
シュウドモナス・フォンス MS-1株による野菜の栽培試験（成長促進と疾病防除効果）（表１０，１１）
トマトの苗20本を、10本ずつの2群に分けて植栽した。次に、シュウドモナス・フォンス MS-1株を土壌に混合（10%）し、その25gを1群のトマト10本について各苗の根圏に施用し、他の1群については菌株の施用を行わなかった。そして、このトマトについて、３週間後の成長を測定した（表１０）。この結果、シュウドモナス・フォンス MS-1株を投与したトマトの成長の促進されることがわかった。
【００７０】
【表１０】
【００７１】
上記の３週間経過したトマトの2群について、立枯病菌（Ralstonia solanacearum）の菌液（108細胞／ml）を、20mlの量で全トマトの根圏に投与し、立枯病菌発症の有無を判定した。この結果、シュウドモナス・フォンスMS-1株を投与したトマトでは、疾病の発症が抑制されることが判明した（表１１）。
【００７２】
【表１１】
【実施例１０】
【００７３】
シュウドモナス・フォンス MS-1株によるピーマンの栽培試験
ピーマンの苗１２０本（平均の主茎長は１０．８cm）を、６０本ずつの２群に分けて植栽した。次に、シュウドモナス・フォンス MS-1株を土壌に混合（10%）し、その25gを第１群のピーマン６０本について、各苗の根圏に施用し、第２群の６０本については菌株の施用を行わなかった。そして、このトマトについて、４週間後の成長を測定した（表１２）。この結果、シュウドモナス・フォンス MS-1株を投与するとピーマンの成長の促進されることがわかった。
【００７４】
【表１２】
【実施例１１】
【００７５】
シュウドモナス・フォンス MS-1株によるブロッコリーの栽培試験
ブロッコリーの種、約200個を２群にわけ、第１群の100個は、目の細かい網に乗せた状態で、シュウドモナス・フォンス MS-1株液に30分間浸漬した。第２群の種約100個については、浸漬しなかった。これらの種を、水を含んだスポンジの上に置き、２週間放置した。この結果、スポンジ上のブロッコリーの種から発芽し、茎が伸張したので、その茎の長さを測定したところ、シュウドモナス・フォンス MS-1株に浸漬した種から発芽した茎は成長の早いことが明らかになった（表１３）
【００７６】
【表１３】
【実施例１２】
【００７７】
イモ類のそうか病の防除
イモ類（特にジャガイモ）には、全国において放線菌（Streptomyces scabies, S. acidiscabies）によるそうか病が蔓延している。この疾病は、イモの表面より感染し、内部に空洞を作ることで、イモの生産減少と味覚低減の弊害が生じ、また商品価値の低下にいたる。本疾病に対しては、薬剤の効力が低い。そこで、ジャガイモの種200個を、100個ずつの2グループに分けて植栽して、次の試験を行った。すなわち、シュウドモナス・フォンス MS-1株を土壌に混合（10%）し、その50gを第1グループのジャガイモの種100個について、各種イモの周囲に施用し、他の1グループについては菌株の施用を行わなかった。そして、このジャガイモについて、３ヵ月後における疾病の有無を測定した（表１４）。この結果、シュウドモナス・フォンス MS-1株を投与したジャガイモでは、そうか病の発生が抑制されることが判明した。なお、種となるイモからは、10個以上のイモが増える。このため、種イモの1個から増えたイモを1群とし、種イモ100個から派生した100群のイモについて、そうか病罹病の有無を測定した。
【００７８】
【表１４】
【実施例１３】
【００７９】
シュウドモナス・フォンスMS-1株の固体培養方法
大豆粉８００ｇ、米ぬか２００ｇ、酵母抽出物４ｇ、蒸留水１０００ｍｌを混合して固体培地を作成し、１２１℃で１５分間加熱滅菌をおこなった。この固体培地に、液体培地（ソイトン５ｇ、酵母抽出液３ｇ、リン酸二カリウム０．２ｇ、蒸留水１，０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４）で培養したMS-1株培養液５０ｍｌを加えて混合し、４日間培養した。その結果、固体培養したMS-1株の菌数／ｇは液体培養した菌数／ｇの１０〜１００倍となった（表１５）。
【００８０】
【表１５】
【００８１】
また、この固体培養方法を一般的な細菌用の培地に適用することができる。例えば、ソイトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸二カリウム０．２ｇ、蒸留水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４の培地を作製し、これに珪藻土（植物プランクトン珪藻の外側の殻）などの無機質粒子（粒子径、約10μm）を数10g（例：20〜50g）加え、振とうして培養した場合でも、シュウドモナス・フォンス MS-1株の菌体量は大幅に増加した。同様に、ゼオライトなどの無機物質の粒子を加えた場合も、同様に菌体量が増加した（表１６）。
【００８２】
【表１６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規シュウドモナス属細菌、それを用いた蜜蜂、動物または植物の成長促進方法、疾病の防除方法、並びに、該細菌の培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハチミツは、長い歴史のなかで健康食品として、また高級嗜好品として人々に重用されてきており、日本のみならず、西欧、イスラム圏や中華民族圏においても、人気のある食品となっている。
【０００３】
このハチミツをつくる蜜蜂は、日本では日本蜜蜂が古来種として用いられてきたが、本種は、移動する習性などのため飼育が難しく、現在は西洋蜜蜂がハチミツ生産における主要種となっている。
【０００４】
西洋蜜蜂には、いくつかの疾病が発症し、おおきな被害が生じている。なかでも腐蛆病菌（ヨーロッパ腐蛆病Melissococcus plutonius、アメリカ腐蛆病Paenibacillus larvae）に原因する腐蛆病は、成蜂が本菌を飲み込み蜂児に与えることにより、蜂幼虫において発症し大量死にいたる。この疾病は、法定家畜伝染病であり、発生蜂群は法律により焼却処分にしなければならない。疾病への予防対策では、抗生物質(ミロサマイシン)を含む「アピテン」が使用されているが、この薬剤が成蜂を経由してハチミツに混入する事態が生じており、ハチミツのブランド性を損なうものと危惧されている。
【０００５】
また、真菌Ascosphaera apisに原因するチョーク病は、3〜5日齢の蜂幼虫に高率に感染して、大量死をひきおこすが、真菌には抗生物質の効果がないなど、本疾病に対する有効な対処方法は少ない。
【０００６】
また、近年、蜜蜂にはウイルス病が発生し、蜂が集団で消失してしまう事態がおきている。これは、蜜蜂群れ崩壊症候群といわれ、急性まひウイルス等が原因ウイルスとされている。このウイルス疾病に対しても、有効な薬剤は見つかっていない。
【０００７】
近年の、食品素材への薬剤使用に対する社会的抑制傾向において、ハチミツ中の残留抗生物質等に対する社会的関心が高まっているため、薬剤を使用しない蜜蜂飼育方法の確立が必要となっている。
【０００８】
一方、家畜、野菜類の疾病は拡大しており、新たな薬剤の使用と耐性菌の出現、あるいは新規疾病発生の繰り返しとなっている。この疾病発生・拡大の理由の一つには、多種多量の薬剤使用による、動物消化管内あるいは土壌などの環境中の微生物バランスの崩壊があげられる。例えば、自然界では、ウイルスは細菌によって抑制されているが、日常的に使用される抗生物質によって、細菌が減少するため、細菌の抑制から解かれたウイルスが増加している。この現象は、恒常的に抗生物質（成長促進剤）を使用している家畜現場において顕著に現れている。このため、薬剤に依存しない動植物の生産方法への転換が必要とされている。
【０００９】
本方法は、これらの疾病の原因となる病原細菌、病原性真菌、病原ウイルスの増殖・感染を抑制する有用細菌を用いて疾病を防除するもので、この有用細菌の使用により薬剤を低減、抑止することができる。
【００１０】
通常、微生物は、液体中に可溶性栄養物を添加した液体培地を用いて培養されており、液体：固形培地の割合は、液体中の沈殿物を考慮しても、100：1以下となる。しかし、この液体培養の場合には、単位mlあたりの細菌収量が少なく、最大収量は109〜1010 細菌細胞/ml 程度であり、動植物に投与する場合には、大量の培養微生物が必要となる。このため、細菌収量を大幅に増大するような培養方法の開発が求められている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、蜜蜂、動物、野菜における細菌、真菌またはウイルスが原因となる疾病の防除方法、並びに、蜜蜂、動物、野菜の成長を促進する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは驚くべきことに、シュウドモナス・フォンス (Pseudomonas fons) MS-1株（受託番号FERM P-21673）を包含する、シュウドモナス・フォンスに属し、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する細菌により上記課題が解決できることを見出した。本発明は以下の発明を包含する。
(1) シュウドモナス・フォンス (Pseudomonas fons) に属し、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する細菌。
(2) シュウドモナス・フォンスMS-1株（受託番号FERM P-21673）またはその変異株である(1)の細菌。
【００１３】
(3) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌の感染および増殖の抑制剤。
(4) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の真菌の感染および増殖の抑制剤。
【００１４】
(5) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性のウイルスの感染および増殖の抑制剤。
(6) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂または動物の成長促進剤。
(7) (1)または(2)の細菌を含有する、植物の成長促進剤。
【００１５】
(8) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物のための、細菌、真菌またはウイルスが原因である疾病の防除剤。
(9) (1)または(2)の細菌を含有する、蜜蜂または動物のための飼料・食物または飼料・食物添加剤。
【００１６】
(10) (1)または(2)の細菌を含有する、肥料または肥料添加剤。
(11) 固形粉末から調製された固体培地を用いて培養を行うことを特徴とする、(1)または(2)の細菌の培養方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の新規シュウドモナス属細菌の使用により、蜜蜂、動物、野菜の主たる疾病である腐蛆病、チョーク病、サルモネラ症、鶏インフルエンザウイルス病、免疫不全ウイルス病、立枯病、そうか病等の罹病、拡散を防ぐことができる。また、本発明の新規シュウドモナス属細菌により、蜜蜂の成蜂数が大幅に増加、すなわちハチミツの生産能の向上効果が得られるとともに、家畜などの動物、野菜の成長促進効果が得られる。そして、これらの結果は、動物医薬あるいは人の健康食品としての使用を可能とすることも示している。
【００１８】
また、新規シュウドモナス属細菌を固体培地を用いて培養する場合には、当該細菌を高濃度で培養すること、すなわち当該細菌を高い収量で得ることが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
以下、本発明をより詳細に説明する。
１．新規細菌
本発明の新規シュウドモナス属細菌は、シュウドモナス・フォンスに属し、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する細菌であれば特に限定されない。「動物」および「植物」については後述するとおりである。本発明の新規シュウドモナス属細菌により感染および増殖が抑制される細菌の例としては腐蛆病菌（Melissococcus plutoniusまたはPaenibacillus larvae）、サルモネラ症菌 （Salmonella infantis）、立枯病菌（Ralstonia solanacearum）、瘡痂（そうか）病菌（Streptomycesscabies, S. acidiscabies）が挙げられ、真菌の例としては病原真菌（Ascosphaera apis）が挙げられ、ウイルスの例としては鶏インフルエンザウイルス（H3N8）、ヒラメ貧血症ウイルス（IHNV）、ロタウイルス(Rotavirus)が挙げられるがこれらには限定されない。
【００２０】
このような能力を有する細菌としてはシュウドモナス・フォンス(Pseudomonas fons) MS-1株（受託番号FERM P-21673）が最も好ましいがこれには限定されず、例えば、16SrRNAの遺伝子の部分配列が配列番号１で表される、シュウドモナス・フォンスに属する細菌や、以下の菌学的性質：
形状
桿菌、長さ：1〜3ミクロン、運動性：有り、胞子形成：無し、グラム染色：陰性、OFテスト：−
生育程度
1〜2日程度培養で数mmのコロニーを形成する、色：薄茶色、光沢：特になし、表面：平滑、拡散性色素：無し、pH：4.0 (-), 5.0(+), 5.6(+), 8.6(+), 9.0(+), 10.0 (+) 温度：中温性7〜45℃、NaCl：0〜4%
硝酸還元：−、脱窒反応：−、インドール：−、硫化水素：−、クエン酸：−、硝酸塩利用：−、色素産生：−、ウレアーゼ：−、オキシダーゼ：＋、カタラーゼ：＋、DNA G+C content:68 mol%
を有する、シュウドモナス・フォンスに分類される細菌が使用できる。
【００２１】
蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する限り、シュウドモナス・フォンスMS-1株の変異体もまた好適に使用できる。ここで変異体とはシュウドモナス・フォンスMS-1株が変異誘発処理された変異株である。変異誘発処理は任意の適当な変異原を用いて行われ得る。ここで、「変異原」なる語は、その広義において、例えば変異原効果を有する薬剤のみならずＵＶ照射のごとき変異原効果を有する処理をも含むものと理解すべきである。適当な変異原の例としてエチルメタンスルホネート、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ブロモウラシルのようなヌクレオチド塩基類似体及びアクリジン類が挙げられるが、他の任意の効果的な変異原もまた使用され得る。
【００２２】
本発明の新規シュウドモナス属細菌の培養には、固体培養基（大豆粉８００ｇ、米糠２００ｇ、酵母抽出物４ｇ、蒸留水１０００ｍｌ）ともに、一般的な細菌用の培地を適用することができ、特に組成を限定するものではない。例えば、ソイトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸二カリウム０．２ｇ、蒸留水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４の培地を作製し、１２１℃、１５分間の加熱滅菌を行って使用することができる。
【００２３】
また、新規シュウドモナス属細菌を固体及び液体で培養するときの培養容器は、一般的な微生物の培養に用いられる装置を用いることができ、特に方法を限定するものではない。例えば、小規模の培養では試験管、フラスコ、シャーレなどを用いることができ、大規模の培養にはジャーファメンター、通気攪拌できるタンクなどを使用することができる。
【００２４】
本発明の新規細菌の大量生産のためには、固形粉末から調製された固体培地を用いて培養を行うことが特に好ましい。ここで固形粉末としては、大豆粉末、米糠粉末を主材料とし、添加物として少量の酵母抽出物やミルク由来ペプトンを加えた混合物が好ましい。また、固形粉末として珪酸質粒子などの無機物質を使用することもできる。本発明者らは、固形粉末に、水分として、蒸留水を固形粉末100gあたりに20ml、40ml、60ml、80mlを加え、上記細菌を接種して、25℃で3日間にわたり培養した場合、60ml以上の水分を加えた培地において細菌は良く増殖することを見出した。その増殖量は、1010〜1012 細菌細胞/gに達する。固形粉末100gに対する水分量は80〜140mlが好ましい。また、珪酸質などの無機物粒子（粒径約10μm）数10gを培養液１Lに加えても、シュウドモナス属細菌の生菌量が約10倍に増加する。この無機粒子の量は、培養液１リットルに対して20〜50gの範囲が好ましい。固体培養、あるいは液体培地に固形粉末を添加した培養では高濃度の栄養物に本発明の新規細菌が接触するため、あるいは固形物といった付着物質に菌が付着するため、細菌収量が大幅に増加する。そして、この細菌収量は、液体培養の場合の収量よりも10〜100倍多い。この固体培養物は、水や砂糖液で希釈することにより、均質に分散するため、蜜蜂または動物の餌あるいは植物の肥料として、あるいは蜜蜂、動物または植物の生育環境への散布剤として使用することができる。
【００２５】
本発明の細菌を下記の用途に使用する場合、その形態は特に限定されず、菌体または培養物あるいはそれらの処理物等の種々の形態で使用できる。ここで「培養物」とは固体または液体培地中で細菌を培養して生じる、菌体の分離を行っていない培養物（液体培地の場合は培養液）である。「処理物」とは、培養物を常法により処理したもの全てを包含する概念であり、例えば、培養物の希釈物、濃縮物、乾燥物、凍結物などを指す。
【００２６】
本発明の目的には、培養を終了した菌体培養物と菌を含むそのままの状態で使用できる。本発明の細菌は保存温度５℃以下で２〜３週間程度の期間有効に保管できるため、低温輸送、冷蔵庫保管することによって蜜蜂、動物または植物の飼育・栽培に際して有効に利用することができる。
【００２７】
培養を終了した菌体培養物を小分けし、グルコースやグリセリルを添加して凍結して保管するのもまた、長期保存の観点から有効である。凍結した培養物は、そのまま−２０℃以下で保管することによって６ヶ月以上の保管が可能であり、長期にわたって蜜蜂、動物または植物の飼育・栽培のために有効に利用することができる。
【００２８】
培養を終了した菌体培養物は乾燥して用いることもできる。菌の活力が低下するため効力が低下する欠点はあるが、長期に保管して動植物の飼育・栽培に使用できる観点から適している。乾燥方法は、特に限定するものではないが、例えば、噴霧乾燥、真空乾燥、真空凍結乾燥などを用いることができる。
【００２９】
本発明の細菌の培養物、菌体、またはそれらの処理物は、使用目的（例えば養蜂用途、飼料用途、食品用途、肥料用途、医薬用途、獣医学的用途、水産養殖用途）において許容される賦形剤または担体とともに使用することができる。例えば、混合できる物質として、配合飼料、乳酸菌、バチルス菌、魚粉、穀物粉末、海藻粉末、無機物質粉末が挙げられ、所望の用途に使用できるものであれば種類を問わない。
【００３０】
２．蜜蜂のための用途
本発明の新規シュウドモナス属細菌は養蜂における疾病（特に腐蛆病およびチョーク病）の防除のために有用である。すなわち本発明は、有効量の新規シュウドモナス属細菌を蜜蜂またはその幼虫に投与する工程を含む、細菌、真菌またはウイルス（特に細菌または真菌）が原因である蜜蜂の疾病を防除する方法に関する。有効量の新規シュウドモナス属細菌を蜜蜂へ投与する手段は特に限定されないが、例えば蜜蜂の幼虫の餌（例えば砂糖液）に新規シュウドモナス属細菌を添加して摂食させる方法や、巣箱などの生育環境中に新規シュウドモナス属細菌を含有する液体（例えば培養物の希釈液）を噴霧する方法などが挙げられる。ミルク由来ペプトン、酵母抽出液、大豆由来ペプトンで調整した固体培地を用いて新規シュウドモナス属細菌を培養した場合、培養物を水または砂糖液で希釈し、巣箱へ噴霧するか餌として蜜蜂幼虫に摂食させることができるため特に好ましい。有利なことに、新規シュウドモナス属細菌の投与によって蜂幼虫の疾病が減少し、幼虫の生残率が向上するため、成蜂数が大幅に増加することも実施例では確認されている。
【００３１】
３．動物のための用途
本発明の新規シュウドモナス属細菌は動物における疾病（例えばサルモネラ症、ロタウイルスによる下痢およびそれに起因する成長不全）の防除のために有用である。ここで「防除」とは治療、予防および抑制を包含する概念である。すなわち本発明は、有効量の新規シュウドモナス属細菌を動物に投与する工程を含む、細菌、真菌またはウイルスが原因である動物の疾病を防除する方法に関する。「動物」とは、家畜（例えばウシ、ブタ）、ペット、家禽（例えばニワトリ）、または人などを指す。有効量の新規シュウドモナス属細菌を動物へ投与する手段は特に限定されないが、例えば動物の餌に新規シュウドモナス属細菌を添加して摂食させる方法や、動物の生育環境中に新規シュウドモナス属細菌を含有する液体を噴霧する方法などが挙げられる。本発明者らは、サルモネラ症のニワトリでの抑制効果、および深刻な成長不全の原因となるロタウイルスによる下痢の仔牛での改善効果を実際に確認している。さらに、人の健康食品としての使用も可能である。
【００３２】
４．植物のための用途
本発明の新規シュウドモナス属細菌は植物における疾病（例えばトマトの立枯病、イモ類のそうか病）の防除のために有用である。ここで「防除」とは治療、予防および抑制を包含する概念である。すなわち本発明は、有効量の新規シュウドモナス属細菌を植物に施用する工程を含む、細菌、真菌またはウイルスが原因である植物の疾病を防除する方法に関する。「植物」とは、野菜類、穀類などを指し、具体的にはトマト、ピーマン、ブロッコリー、イモ類等の野菜が挙げられる。有効量の新規シュウドモナス属細菌を野菜へ施用する手段は特に限定されないが、例えば有効量の新規シュウドモナス属細菌を土壌中に混和する方法や、植物体に適用する方法、種子に適用する方法等が挙げられる。
【００３３】
本発明はまた、有効量の新規シュウドモナス属細菌を植物に施用する工程を含む、植物の成長促進方法に関する。本発明者らはトマト、ピーマン、およびブロッコリーにおいてこの成長促進効果を確認している。植物への施用方法は上記の通りである。
【実施例１】
【００３４】
シュウドモナス・フォンス MS-1株の単離および同定
１．本菌は、淡水環境から単離された菌株であり、以下のような特徴をもつ。
２．形状
桿菌、長さ：1〜3ミクロン、運動性：有り、胞子形成：無し、グラム染色：陰性、OFテスト：−
【００３５】
３．生育程度
1〜2日程度培養で数mmのコロニーを形成する、色：薄茶色、光沢：特になし、表面：平滑、拡散性色素：無し、pH：4.0 (-), 5.0(+), 5.6(+), 8.6(+), 9.0(+), 10.0 (+) 温度：中温性7〜45℃、NaCl：0〜4%
４．硝酸還元：−、脱窒反応：−、インドール：−、硫化水素：−、クエン酸：−、硝酸塩利用：−、色素産生：−、ウレアーゼ：−、オキシダーゼ：＋、カタラーゼ：＋、DNA G+C content:68 mol%
【００３６】
５．16SrRNAの解析
Sepa Gene キット（三光純薬社製）を用いて核酸の抽出を行った後、エタノール沈殿により核酸を回収した。16SrRNAに特異的なユニバーサルプライマー2種を用いて増幅をおこない、次にスピンカラム（ファルマシア社製）を用いて精製を行った。精製したPCR増幅産物についてアプライド バイオシステムズ377シークエンサーにより塩基配列の解析を行った。その後、シーンバンクのデータベースよりオンライン検索を行った。
【００３７】
以下に、Pseudomonas fons MS-1株の16SrRNAの遺伝子の塩基配列を、対応するDNAデータとして示す（表１）。
【００３８】
本菌を産業別審査基準応用微生物工業改訂版（特許庁編）の新種細菌の記載例に従って、その性状をしらべ、Baumann (1984)に基づきその分類学上の位置を検討した結果、本菌に該当する記載菌株はないため、Pseudomonas fonsMS-1株とした。
【００３９】
本発明者らは当該菌株をシュウドモナス・フォンスMS-1株と命名し、平成20年9月18日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号FERM P-21673として寄託した。
【００４０】
【表１】
【実施例２】
【００４１】
シュウドモナス・フォンスMS-1株の病原細菌の増殖抑制能
上記のシュウドモナス・フォンス MS-1株が病原性細菌の増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。
【００４２】
寒天培地にあらかじめ塗沫した2本の上記菌株のスミアの間に、サルモネラ病菌 Salmonella infantis、立枯病菌 Ralstonia solanacearumを移植して25℃下にて10日間培養、その後のスミアの間の病原菌のコロニーの大きさを、病原菌のみを対照区として培養した場合のコロニーの大きさと比較したところ、表２に示すとおり、サルモネラ、立枯病菌の増殖が抑制された。表２中の「阻害率」は、対照区培地上の病原菌のコロニーの横幅の大きさと試験区の同菌のコロニーの同大きさとの比を百分率で表したものである。
【００４３】
さらに、上記のシュウドモナス・フォンスMS-1株が、腐蛆病（Melissococcus plutonius 及び Paenibacillus larvae）とチョーク病菌（Ascosphaera apis）の増殖を抑制する能力を有することを、同様の方法で確認した。
【００４４】
【表２】
【実施例３】
【００４５】
シュウドモナス・フォンス MS-1株のウイルス感染抑制能
自然界では、ウイルスの感染を抑制したり、あるいはウイルスを分解したりする細菌が多く分布している。このような自然界において、抗生物質を使用するとウイルスを抑えている細菌（抗ウイルス細菌）が殺滅されてしまう。一方、大半の抗生物質に対しては、ウイルスは抵抗性を保持している。この結果、抗生物質の使用により、抗ウイルス細菌が排除されてしまうため、ウイルスは、その阻害要因が少なくなった部分、よりよく感染、増殖を行うことになる。
【００４６】
養蜂においても、抗生物質の使用により、腐蛆病菌などは殺滅されるかわりに、ウイルスの増殖が促進されることになり、ウイルス病が流行する可能性が高い。同様の事象は、豚、鶏、ウシおよび養殖魚においては、すでに長年にわたって起こっている。そこで、本研究では、有用細菌MS-1株における、ウイルス抑制能について検定した。
【００４７】
上記の菌株シュウドモナス・フォンスMS-1株が病原性ウイルスの増殖を抑制する能力を有することを以下のように確認した。なお、蜜蜂の疾病原因となるウイルスはまだ培養できないため、外皮（カプシド）を保持するという、比較相似したウイルスとして鶏インフルエンザウイルス（H3N8）及び伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）を対照ウイルスとして採用した。すなわち、ウイルスの不活化は、その多くがウイルス外皮の分解、損傷に起因するものであるため、本実験の結果は、蜜蜂の疾病原因ウイルスを含む多くのウイルスの不活化を示唆するものといえる。
【００４８】
まず、犬の腎臓MDCK細胞の培養系において、上記MS-1株の培養上澄液が鶏インフルエンザの原因ウイルスである鶏インフルエンザウイルス（BUD/H3N8株）の感染作用を抑制するか否かについて検定した。作用抑制効果は犬腎臓細胞の変性効果 (CPE) を抑止する度合いを指標として判定した。すなわち、犬の腎臓MDCK細胞を、1 mLの液体培地（10％ウシ血清成分、0．075％NaHCO3、100 IU／mLペニシリン、100μg／mLストレプトマイシン、1.6％Tris-HCl(pH 7.8) 含有）中で25℃にて培養し、その培養系に、鶏インフルエンザウイルス（H3N8）培養液(0.1 ml)および上記シュウドモナス属細菌MS-1株の培養上清液（0.1 mL）を加えた。対照実験として、前記培養系に鶏インフルエンザウイルス（BUD/H3N8株）の培養液のみ（0.1 mL）を添加した。ここで、上記シュウドモナス属細菌の培養上清液とは、当該細菌をソイトン培地中で3日間25℃で培養した後に遠沈(4000rpm)して菌体を沈澱させ、0.22μmのフィルターでろ過して得られた濾液を指す。また鶏インフルエンザウイルス（BUD/H3N8株）の培養液とは、同様の上記培養液および犬の腎臓MDCK細胞を用いて鶏インフルエンザウイルス（H3N8）を増殖させた後、0.45μmのフィルターで濾過して得られた濾液を指す。
【００４９】
上記の菌体培養上清液を添加した後のCPEを経時的に測定した。CPEが低いということは、すなわちウイルスの増殖が抑制されていることを意味する。結果を別表３に示すとおり、シュウドモナス・フォンス MS-1株の培養上清を添加した場合に鶏インフルエンザウイルス（BUD/H3N8株）の増殖が抑制された。
【００５０】
更に、上記の方法を一部改変し、シュウドモナス・フォンス MS-1株が伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の感染・増殖を抑制する能力を有することを確認した。すなわち、上記の方法において犬腎臓細胞の替わりにマスノスケ細胞(IHV)を用い、インフルエンザウイルス（H3N8）の替わりに伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）を用いて調べた結果、シュウドモナス・フォンスMS-1株培養上清液は伝染性造血器壊死症ウイルス（IHNV）の増殖を抑制した(表３)。なお、ウイルスの能力は、培養細胞感染価（TCID50）としてあらわした。
【００５１】
【表３】
【実施例４】
【００５２】
腐蛆病菌による蜜蜂への攻撃試験とシュウドモナス・フォンス MS-1株の疾病防除効果
閉鎖系飼育室内に3つの網室を設置し、各網室内に蜜蜂の1蜂群ずつの合計3蜂群を導入し、飼育した。3蜂群中1蜂群にはMS-1株を巣箱内に噴霧投与し（投与群I）、別の1蜂群にはMS-1株を蜂の餌である砂糖液に混合して投与した（投与群II）。残りの1蜂群は攻撃対照群とし、MS-1株は投与していない。MS-1株投与期間途中に3蜂群全てに対して腐蛆病菌で攻撃し、攻撃後5週までの腐蛆疾病発症の有無及び蜂群の状態（飼料摂取量、幼虫数、蜂児圏の状態及び成蜂の活動状態等）について観察した。この結果、飼料の摂取量では、3群において相異はなかった。そして、腐蛆病原菌の攻撃後は、軽度で一時的な蜂児圏の乱れが3蜂群において共通して認められ、その数は若干減少したが、腐蛆病はMS-1株投与群では発症が認められず、攻撃対照群では発症した。すなわち、有用細菌を投与した2蜂群においては、腐蛆病発症はみられなかった。
【００５３】
以上のことから、蜂群における有用細菌MS-1株による腐蛆病の疾病防除の効力が明らかとなった（表４）。
【００５４】
【表４】
【実施例５】
【００５５】
シュウドモナス・フォンス MS-1株によるチョーク病の防除
蜂群を８巣箱にわけ、MS-1株の液体培養液希釈液（1/10倍に希釈）を蜂の巣に噴霧し、チョーク病の発生状況を2ヶ月にわたり観察した。その結果、MS-1株を噴霧した巣箱では、チョーク病の発症が抑制された（表５）。表５の蜂蛆数の値は、各実験区4箱における数を平均した値で表した。
【００５６】
【表５】
【実施例６】
【００５７】
シュウドモナス・フォンスMS-1株の蜜蜂の成長促進効果
上記の、高い抗菌力を保持するMS-1株について、その培養菌液を餌・水に混合してミツバチに投与し、ミツバチの成体に及ばす影響を検定した。
【００５８】
実験期間は約2ヶ月で、実験場所は宮崎県綾町および同県小林市に設定し、菌の投与は1日おきに、蜜蜂の内検は毎日行った。この投与試験の結果、6カ所に設定した菌株投与区において、餌や水の摂取量に多少の違いが見られたが、対照区と比較し、全ての菌株投与実験区において蜜蜂の健康度には問題のないことが判明し、また、蜂数の増加する傾向がみられた（表６）。表６の蜂数は、巣框（すわく）１枚あたりの平均値として表した。
【００５９】
【表６】
【実施例７】
【００６０】
シュウドモナス・フォンス MS-1株による養鶏の疾病防除と成長促進効果
鶏の飼育試験における体重増
生後8日齢の鶏ひな（名古屋コーチン）を、各々の1区に10羽おき、13齢までの６日間の飼育試験を行った。
【００６１】
各区の構成は、添加生菌量：5%（表７−１）、生菌無添加（表７−２）である。
基礎飼料としては、抗菌性添加物の無混合の飼料（バランスアップ18、日本配合飼料社製造）を採用した。
【００６２】
【表７−１】
【００６３】
【表７−２】
【００６４】
シュウドモナス・フォンス MS-1株を投与したひな鶏の観察項目の結果
食欲：良好
ふん便性状；固形状（良好）
活力：良好
羽毛の光沢など：良好
飼料摂取量及び体重：表７−１および７−２（体重は順調に増加）
剖検（病理性状の有無）：肝臓の変色、萎縮、過剰な脂肪蓄積など無し
腹部膨満無し
腎臓の結石など無し
腸壁の異常無し
【００６５】
疾病防除効果
若鶏100尾を2群にわけ、1群には、シュウドモナス・フォンス MS-1株を投与、他の1群には菌株を投与しなかった。そして、若鶏に病原性サルモネラ菌（Salmonella infantis）を配合飼料に混合して投与したところ、シュウドモナス・フォンスMS-1株を投与した若鶏では、サルモネラ病は発症する尾数は大幅に減少した（表８）。
【００６６】
【表８】
【実施例８】
【００６７】
シュウドモナス・フォンス MS-1株による仔牛の下痢抑止効果
仔牛では、ロタウイルスによる下痢が発生し、食物の消化が進まないため、成長の著しく遅滞する弊害が生じている。ここで、ミルク５００ｍｌに１００ｍｌのシュウドモナス・フォンス MS-1株培養液を混合して仔牛に投与した。すなわち、仔牛３０頭（黒毛和牛、生後約30日）を３群にわけ、第１群には、シュウドモナス・フォンス MS-1株を１回投与、第２群には２回投与し、第３群には投与しない実証試験を行った。この結果、シュウドモナス・フォンスMS-1株を投与した仔牛では、下痢症状が著しく改善された（表９）。
【００６８】
【表９】
【実施例９】
【００６９】
シュウドモナス・フォンス MS-1株による野菜の栽培試験（成長促進と疾病防除効果）（表１０，１１）
トマトの苗20本を、10本ずつの2群に分けて植栽した。次に、シュウドモナス・フォンス MS-1株を土壌に混合（10%）し、その25gを1群のトマト10本について各苗の根圏に施用し、他の1群については菌株の施用を行わなかった。そして、このトマトについて、３週間後の成長を測定した（表１０）。この結果、シュウドモナス・フォンス MS-1株を投与したトマトの成長の促進されることがわかった。
【００７０】
【表１０】
【００７１】
上記の３週間経過したトマトの2群について、立枯病菌（Ralstonia solanacearum）の菌液（108細胞／ml）を、20mlの量で全トマトの根圏に投与し、立枯病菌発症の有無を判定した。この結果、シュウドモナス・フォンスMS-1株を投与したトマトでは、疾病の発症が抑制されることが判明した（表１１）。
【００７２】
【表１１】
【実施例１０】
【００７３】
シュウドモナス・フォンス MS-1株によるピーマンの栽培試験
ピーマンの苗１２０本（平均の主茎長は１０．８cm）を、６０本ずつの２群に分けて植栽した。次に、シュウドモナス・フォンス MS-1株を土壌に混合（10%）し、その25gを第１群のピーマン６０本について、各苗の根圏に施用し、第２群の６０本については菌株の施用を行わなかった。そして、このトマトについて、４週間後の成長を測定した（表１２）。この結果、シュウドモナス・フォンス MS-1株を投与するとピーマンの成長の促進されることがわかった。
【００７４】
【表１２】
【実施例１１】
【００７５】
シュウドモナス・フォンス MS-1株によるブロッコリーの栽培試験
ブロッコリーの種、約200個を２群にわけ、第１群の100個は、目の細かい網に乗せた状態で、シュウドモナス・フォンス MS-1株液に30分間浸漬した。第２群の種約100個については、浸漬しなかった。これらの種を、水を含んだスポンジの上に置き、２週間放置した。この結果、スポンジ上のブロッコリーの種から発芽し、茎が伸張したので、その茎の長さを測定したところ、シュウドモナス・フォンス MS-1株に浸漬した種から発芽した茎は成長の早いことが明らかになった（表１３）
【００７６】
【表１３】
【実施例１２】
【００７７】
イモ類のそうか病の防除
イモ類（特にジャガイモ）には、全国において放線菌（Streptomyces scabies, S. acidiscabies）によるそうか病が蔓延している。この疾病は、イモの表面より感染し、内部に空洞を作ることで、イモの生産減少と味覚低減の弊害が生じ、また商品価値の低下にいたる。本疾病に対しては、薬剤の効力が低い。そこで、ジャガイモの種200個を、100個ずつの2グループに分けて植栽して、次の試験を行った。すなわち、シュウドモナス・フォンス MS-1株を土壌に混合（10%）し、その50gを第1グループのジャガイモの種100個について、各種イモの周囲に施用し、他の1グループについては菌株の施用を行わなかった。そして、このジャガイモについて、３ヵ月後における疾病の有無を測定した（表１４）。この結果、シュウドモナス・フォンス MS-1株を投与したジャガイモでは、そうか病の発生が抑制されることが判明した。なお、種となるイモからは、10個以上のイモが増える。このため、種イモの1個から増えたイモを1群とし、種イモ100個から派生した100群のイモについて、そうか病罹病の有無を測定した。
【００７８】
【表１４】
【実施例１３】
【００７９】
シュウドモナス・フォンスMS-1株の固体培養方法
大豆粉８００ｇ、米ぬか２００ｇ、酵母抽出物４ｇ、蒸留水１０００ｍｌを混合して固体培地を作成し、１２１℃で１５分間加熱滅菌をおこなった。この固体培地に、液体培地（ソイトン５ｇ、酵母抽出液３ｇ、リン酸二カリウム０．２ｇ、蒸留水１，０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４）で培養したMS-1株培養液５０ｍｌを加えて混合し、４日間培養した。その結果、固体培養したMS-1株の菌数／ｇは液体培養した菌数／ｇの１０〜１００倍となった（表１５）。
【００８０】
【表１５】
【００８１】
また、この固体培養方法を一般的な細菌用の培地に適用することができる。例えば、ソイトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、リン酸二カリウム０．２ｇ、蒸留水１０００ｍｌ、ｐＨ７．２〜７．４の培地を作製し、これに珪藻土（植物プランクトン珪藻の外側の殻）などの無機質粒子（粒子径、約10μm）を数10g（例：20〜50g）加え、振とうして培養した場合でも、シュウドモナス・フォンス MS-1株の菌体量は大幅に増加した。同様に、ゼオライトなどの無機物質の粒子を加えた場合も、同様に菌体量が増加した（表１６）。
【００８２】
【表１６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シュウドモナス・フォンス (Pseudomonas fons) に属し、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する細菌。
【請求項２】
シュウドモナス・フォンス MS-1株（受託番号FERM P-21673）またはその変異株である請求項１の細菌。
【請求項３】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌の感染および増殖の抑制剤。
【請求項４】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の真菌の感染および増殖の抑制剤。
【請求項５】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性のウイルスの感染および増殖の抑制剤。
【請求項６】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂または動物の成長促進剤。
【請求項７】
請求項１または２の細菌を含有する、植物の成長促進剤。
【請求項８】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物のための、細菌、真菌またはウイルスが原因である疾病の防除剤。
【請求項９】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂または動物のための飼料・食物または飼料・食物添加剤。
【請求項１０】
請求項１または２の細菌を含有する、肥料または肥料添加剤。
【請求項１１】
固形粉末から調製された固体培地を用いて培養を行うことを特徴とする、請求項１または２の細菌の培養方法。
【請求項１】
シュウドモナス・フォンス (Pseudomonas fons) に属し、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌、真菌およびウイルスの感染および増殖を抑制する能力を有する細菌。
【請求項２】
シュウドモナス・フォンス MS-1株（受託番号FERM P-21673）またはその変異株である請求項１の細菌。
【請求項３】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の細菌の感染および増殖の抑制剤。
【請求項４】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性の真菌の感染および増殖の抑制剤。
【請求項５】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物に対し病原性のウイルスの感染および増殖の抑制剤。
【請求項６】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂または動物の成長促進剤。
【請求項７】
請求項１または２の細菌を含有する、植物の成長促進剤。
【請求項８】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂、動物または植物のための、細菌、真菌またはウイルスが原因である疾病の防除剤。
【請求項９】
請求項１または２の細菌を含有する、蜜蜂または動物のための飼料・食物または飼料・食物添加剤。
【請求項１０】
請求項１または２の細菌を含有する、肥料または肥料添加剤。
【請求項１１】
固形粉末から調製された固体培地を用いて培養を行うことを特徴とする、請求項１または２の細菌の培養方法。
【公開番号】特開２０１０−１３６６６８（Ｐ２０１０−１３６６６８Ａ）
【公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１５５５９（Ｐ２００８−３１５５５９）
【出願日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【出願人】（５９７１７４６８７）社団法人 日本養蜂はちみつ協会 (1)
【出願人】（５０６０３００８８）バイオプロジェクト株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月２４日（２０１０．６．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月１１日（２００８．１２．１１）
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【出願人】（５９７１７４６８７）社団法人 日本養蜂はちみつ協会 (1)
【出願人】（５０６０３００８８）バイオプロジェクト株式会社 (2)
【Ｆターム（参考）】
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