核酸を配列特異的に標識する方法、およびそれを利用した新規核酸検出法
【課題】簡便に核酸を検出する技術を提供すること。
【解決手段】標識が導入された核酸を生産するための方法であって、以下の工程：Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、該鋳型核酸は、該標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに該標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチドを有する、工程；Ｂ）該標識対象核酸を、該鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；Ｃ）該標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、該標識対象核酸に少なくとも１つの該標識されたヌクレオチドが該鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；Ｄ）該伸長反応の後、生成した混合物から伸長した該標識対象核酸を取り出す工程、を包含する、方法。
【解決手段】標識が導入された核酸を生産するための方法であって、以下の工程：Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、該鋳型核酸は、該標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに該標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチドを有する、工程；Ｂ）該標識対象核酸を、該鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；Ｃ）該標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、該標識対象核酸に少なくとも１つの該標識されたヌクレオチドが該鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；Ｄ）該伸長反応の後、生成した混合物から伸長した該標識対象核酸を取り出す工程、を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の標識方法および標識された核酸の生産方法、ならびにそれを利用した核酸検出方法、ならびにそれらを利用するキットおよびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を検出するために種々の標識が使用されている。しかし、このような標識のほとんどは、検出対象自体を標識するというよりは、検出対象に特異的に相互作用する分子を標識する。したがって、手順がどうしても煩雑になるという欠点がある。
【０００３】
１９９０年代に入ってから、従来から知られていたｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡに加えて、新たな種類のＲＮＡの存在が明らかになってきた。そのような新たに発見されたＲＮＡの種類には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの小さなＲＮＡがある。このような小さなＲＮＡは、生体内で重要な役割を果たすことが近年解明されており、その検出技術の開発は、そのような解明を促進することにつながる。したがって、種々のＲＮＡなどの核酸を簡便に検出する技術に対する大きな要望が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、簡便に核酸（特に小ＲＮＡなど）を検出することができる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の開示）
本発明者らは、ハイブリダイズ技術をうまく応用した結果、小ＲＮＡでも容易に標識しおよび／または検出することができることができることを予想外に開発したことによって、本発明を完成させ、上記課題を解決した。
【０００６】
小ＲＮＡは、転写、翻訳およびｍＲＮＡ安定性を含む遺伝子調節における重要な役割を果たす。また、染色体構造の維持にも重要な役割を担っていると考えられている。さらに、小ＲＮＡは、侵入してきたウイルスＲＮＡを分解または自己トランスポゾンの不活性化といった、宿主細胞における核酸レベルでの自己防御システムの主要因子としても機能している。したがって、小ＲＮＡは、動物界、植物界の研究において、ますます重要になってきている分野である。しかし、その小さな分子量（短いヌクレオチド長、および乏しい存在量）がゆえ、小ＲＮＡの検出方法は複雑であり、効率も悪い。本発明において、小ＲＮＡを、ＤＮＡ鋳型およびＤＮＡポリメラーゼを用いてジデオキシヌクレオチドにより配列特異的に標識する方法を提供する。小ＲＮＡは、標的となる小ＲＮＡに実質的に相補的な鋳型ＤＮＡとハイブリダイズさせる。ついで、このＤＮＡ−ＲＮＡの複合体を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントなどのポリメラーゼおよび３２Ｐ標識などで標識されたデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドとともにインキュベートする。小ＲＮＡは、ＤＮＡ合成のプライマーとして働き、反応が、このジデオキシヌクレオチドの取り込みによって終結される。これは、プライマー停止法（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）と呼ぶ。標識されたＲＮＡは、変性ゲル電気泳動での分離およびオートラジオグラフィーによって検出することができる。標識は、配列特異的に行われ、ＤＮＡポリメラーゼの存在不存在にに完全に依存する。プライマー停止法を用いれば、アット（１０−１８）モルレベルの合成ＲＮＡおよび生体ＲＮＡ（例えば、マウスのｍｉＲＮＡ、トランスジェニック植物のｓｉＲＮＡなど）を検出することができる。検出限界を探る実験などの検出目的には、ＧＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ｍｉＲ１６、ｍｉＲ１７１などの遺伝子を用いることができる。
【０００７】
したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）
標識が導入された核酸を生産するための方法であって、以下の工程：
Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその鋳型核酸は、その標識対象核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標識対象核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）その標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、その標識対象核酸に少なくとも１つのその標識されたヌクレオチドがその鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；および
Ｄ）その伸長反応の後、生成した混合物から伸長したその標識対象核酸を取り出す工程、
を包含する、方法。
（２）
上記標識対象核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの組み合わせである、項目１に記載の方法。
（３）
上記標識対象核酸は、ＲＮＡである、項目１に記載の方法。
（４）
上記標識対象核酸は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、項目１に記載の方法。
（５）
上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸全部と相補的である配列を含む、項目１に記載の方法。
（６）
上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸の両方の先端において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、項目１に記載の方法。
（７）
上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸の少なくとも一方の先端から少なくとも約１０ヌクレオチド分長いヌクレオチド配列を有する、項目１に記載の方法。
（８）
上記鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側に位置している、項目１に記載の方法。
（９）
上記鋳型核酸の３’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側にあるその鋳型核酸のその長いヌクレオチド配列とは異なる長さを有する、項目６に記載の方法。
（１０）
上記鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列はその鋳型核酸の５’末端側に位置し、上記標識対象核酸の５’末端部分はその鋳型核酸の３’末端よりも長い、項目１に記載の方法。（１１）
上記鋳型核酸の３’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列より、識別可能な長さだけ長い、項目６に記載の方法。
（１２）
上記識別可能な程度の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである、項目１１に記載の方法。
（１３）
上記核酸合成酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、項目１に記載の方法。
（１４）
上記標識されたヌクレオチドは、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、酵素および化学発光からなる群より選択される標識で標識されたヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（１５）
上記標識されたヌクレオチドは、放射能を含む、項目１に記載の方法。
（１６）
上記伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、変性工程を包含する、項目１に記載の方法。
（１７）
さらに、未反応物を除去する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（１８）
上記未反応物の除去は、エタノール沈澱またはゲル濾過クロマトグラフィーにより達成される、項目１７に記載の方法。
（１９）
上記未反応物の除去工程は、伸長した上記標識対象核酸を分離する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（２０）
上記分離は、電気泳動またはクロマトグラフィーにより達成される、項目１９に記載の方法。
（２１）
上記伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、上記標識を検出する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（２２）
上記検出は、上記標識を直接または間接的に検出することを包含する、項目２１に記載の方法。
（２３）
伸長した上記標識対象核酸を分離する工程をさらに包含する、項目２１に記載の方法。
（２４）
上記分離の際に、上記検出が行われる、項目２３に記載の方法。
（２５）
上記分離および検出は、オートラジオグラフにより達成される、項目２４に記載の方法。（２６）
さらに、上記伸長反応を停止させる工程を包含する、項目１に記載の方法。
（２７）
上記停止工程は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ法）またはプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法より達成される、項目２６に記載の方法。
（２８）
上記標識対象核酸は、プローブとして使用される、項目１に記載の方法。
（２９）
上記標識対象核酸は、検出対象となる核酸である、項目１に記載の方法。
（３０）
上記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、項目１に記載の方法。
（３１）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、３’末端が改変されている、項目１に記載の方法。
（３２）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされている、項目１に記載の方法。
（３３）
上記改変は、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変である、項目３０に記載の方法。
（３４）
上記鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされている、項目１に記載の方法。
（３５）
核酸に標識を導入するための方法であって、以下の工程：
Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに、その標識対象核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標識対象核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；および
Ｃ）その標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行い、その標識対象核酸に少なくとも１つのその標識されたヌクレオチドがその鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程、
を包含する、方法。
（３６）
標的核酸を検出するための方法であって、以下の工程：
Ａ）その標的核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標的核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその標的核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標的核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標的核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）その標的核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程；および
Ｄ）その標的核酸に対応する伸長産物が存在するか検出する工程であって、その伸長産物の存在は、その標的核酸の存在の指標である、工程、
を包含する、方法。
（３７）
上記伸長反応の後、生成した混合物からその標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長産物とを分離する工程をさらに包含する、項目３６に記載の方法。
（３８）
上記標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの組み合わせである、項目３６に記載の方法。
（３９）
上記標的核酸は、ＲＮＡである、項目３６に記載の方法。
（４０）
上記標的核酸は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、項目３６に記載の方法。
（４１）
上記鋳型核酸は、上記標的核酸全部と相補的である配列を含む、項目３６に記載の方法。
（４２）
上記鋳型核酸は、上記標的核酸の両方の先端において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、項目３６に記載の方法。
（４３）
上記鋳型核酸は、上記標的核酸の少なくとも一方の先端から少なくとも約１０ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、項目３６に記載の方法。
（４４）
上記鋳型核酸の長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側に位置する、項目３６に記載の方法。
（４５）
上記鋳型核酸の３’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列とは異なる長さを有する、項目４２に記載の方法。
（４６）
上記鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側に位置し、上記標識対象核酸の５’末端部分は、その鋳型核酸の３’末端よりも長い、項目３６に記載の方法。
（４７）
上記鋳型核酸の３’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列より、識別可能な長さだけ長い、項目４２に記載の方法。
（４８）
上記識別可能な程度の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである、項目４７に記載の方法。
（４９）
上記核酸合成酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、項目３６に記載の方法。
（５０）
上記標識されたヌクレオチドは、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、酵素および化学発光からなる群より選択される標識で標識されたヌクレオチドを含む、項目３６に記載の方法。
（５１）
上記標識されたヌクレオチドは、放射能を含む、項目３６に記載の方法。
（５２）
上記伸長産物と鋳型核酸複合体の分離は、変性により達成される、項目３６に記載の方法。
（５３）
上記未反応物は、エタノール沈澱および濾過によりその未反応物を除去することによって、上記伸長産物と分離される、項目３６に記載の方法。
（５４）
上記検出は、上記標識を直接または間接的に検出することを包含する、項目３６に記載の方法。
（５５）
上記標的核酸に対応する伸長産物を取り出す工程をさらに包含する、項目３６に記載の方法。
（５６）
上記分離は、電気泳動またはクロマトグラフィーによる、項目３７に記載の方法。
（５７）
上記分離の際に、上記検出が行われる、項目３７に記載の方法。
（５８）
上記分離および検出は、オートラジオグラフによって達成される、項目５７に記載の方法。
（５９）
さらに、上記伸長反応を停止させる工程を包含する、項目３６に記載の方法。
（６０）
上記停止工程は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法またはプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法により達成される、項目５９に記載の方法。
（６１）
上記検出は、伸長された部分の配列に基づいて行われる、項目３６に記載の方法。
（６２）
上記検出は、上記伸長された標的核酸に特異的に結合する薬剤を用いて行われる、項目３６に記載の方法。
（６３）
上記検出は、上記標識されたヌクレオチドに起因する標識と、上記薬剤に起因する標識とを検出することによって行われる、項目６２に記載の方法。
（６４）
上記伸長された標的核酸に特異的に結合する薬剤は、伸長していない上記標的核酸にも、上記標識されたヌクレオチドにも結合しない、項目６２に記載の方法。
（６５）
上記検出は、上記伸長された標的核酸の長さに基づき行われる、項目３６に記載の方法。（６６）
上記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、項目３６に記載の方法。
（６７）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、３’末端が改変されている、項目３６に記載の方法。
（６８）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされる、項目３６に記載の方法。
（６９）
上記改変は、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変である、項目６６に記載の方法。
（７０）
上記鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされている、項目３６に記載の方法。
（７１）
標識が導入された核酸を生産するためのキットであって、以下の手段：
Ａ）標識の導入の対象となる標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその標的核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、鋳型核酸；および
Ｂ）核酸合成酵素；
を備える、キット。
（７２）
Ｃ）標識されたヌクレオチドをさらに備える、項目７１に記載のキット。
（７３）
生成した混合物からその標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長された伸長産物とを分離する手段をさらに備える、項目７２に記載のキット。
（７４）
標識されたヌクレオチドを検出する手段をさらに備える、項目７２に記載のキット。
（７５）
さらにコントロールとなる標準標的核酸を備える、項目７１に記載のキット。
（７６）
上記標準核酸は、上記鋳型核酸を同定するための核酸および上記標識対象核酸を同定するための核酸からなる群より選択される核酸を含む、項目７５に記載のキット。
（７７）
上記核酸合成酵素の反応のための試薬をさらに含む、項目７１に記載のキット。
（７８）
上記標識されたヌクレオチドは、核酸合成酵素の反応を停止する作用を有する、項目７２に記載のキット。
（７９）
支持体をさらに含み、上記鋳型核酸は、その支持体に固定される、項目７１に記載のキット。
（８０）
上記支持体は、ガラスまたはメンブレンである、項目７９に記載のキット。
（８１）
上記支持体に固定される上記鋳型核酸は、アレイ状に配置される、項目７９に記載のキット。
（８２）
上記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、項目７１に記載のキット。
（８３）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、３’末端が改変されている、項目７１に記載のキット。
（８４）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされる、項目７１に記載のキット。
（８５）
上記改変は、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変である、項目８２に記載のキット。
（８６）
上記鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされている、項目７１に記載のキット。
（８７）
標識が導入された核酸が固定された支持体を生産するための方法であって、以下の工程：
Ａ）支持体に固定された標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその標識対象核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標識対象核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）その標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、その標識対象核酸に少なくとも１つのその標識されたヌクレオチドがその鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；
Ｄ）その伸長反応の後、生成した混合物から伸長したその標識対象核酸を含む支持体を取り出す工程、
を包含する、方法。
（８８）
上記取り出し工程は、その支持体を洗浄して反応物を除去することによって達成される、項目８７に記載の方法。
（８９）
上記取り出し工程は、その支持体から標識を除去することによって達成される、項目８７に記載の方法。
（９０）
標的核酸を検出するためのキットであって、以下：
Ａ）その標的核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその標的核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、鋳型核酸；
Ｂ）核酸合成酵素；
Ｃ）標識されたヌクレオチド；
Ｄ）その標識されたヌクレオチドを検出する手段、
を備える、キット。
（９１）
生成した混合物からその標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長された伸長産物とを分離する手段をさらに備える、項目９０に記載のキット。
（９２）
上記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、項目９０に記載のキット。
（９３）
核酸が固定された支持体上で標的となる核酸を検出するための方法であって、以下の工程：
Ａ）支持体に固定された鋳型核酸および標識対象核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその鋳型核酸は、その標識対象核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標識対象核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）その標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、その標識対象核酸に少なくとも１つのその標識されたヌクレオチドがその鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；
Ｄ）その伸長反応の後、伸長したその標識対象核酸が存在するかどうかを決定する工程であって、伸長したその標識対象核酸の存在は、標的となる核酸が存在していることを示す、工程、
を包含する、方法。
（９４）
上記標識対象核酸は、ｓｉＲＮＡである、項目９３に記載の方法。
（９５）
上記支持体は、アレイである、項目９３に記載の方法
（９６）
核酸が固定された支持体において、標的となる核酸を検出するための方法であって、以下の工程：
Ａ）その支持体に固定された標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその標識対象核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標識対象核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）その標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、その標識対象核酸に少なくとも１つのその標識されたヌクレオチドがその鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；
Ｄ）その伸長反応の後、伸長したその標識対象核酸が存在するかどうかを決定する工程であって、伸長したその標識対象核酸の存在は、標的となる核酸が存在していることを示す、工程、
を包含する、方法。
（９７）
上記鋳型核酸は、ｍＲＮＡである、項目９６に記載の方法。
（９８）
上記支持体は、アレイである、項目９６に記載の方法。
【０００８】
以下に、好ましい実施形態によって本発明を説明する。本発明の実施形態は、本発明の説明および当該分野における周知慣用技術に基づいて適宜実施することができることが、当業者に理解される。本発明が奏する作用および効果は、当業者に容易に理解され得る。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、標識対象核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を、鋳型核酸（例えば、プライマー停止法では、鋳型ＤＮＡであり、プライマーアレイ法では、標的核酸である）とハイブリダイズさせたのち、標識対象核酸をプライマーとするＤＮＡ合成を行わせる。このＤＮＡ合成反応で新規に付加されるべきヌクレオチドを標識化合物とすることで、標的核酸を標識する方法が提供される。この場合において、標識された化合物が、ＤＮＡ合成に新たに加えられるヌクレオチドとして使用される。このようにして、標的核酸を標識するための方法が提供され得る。標的核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡを問わないが、特に、本発明は、短鎖ＲＮＡの標識法として有用性が高い。標識は、放射性同位体、蛍光色素、などが考えられるが、本明細書では放射性同位体を用いた方法で実証されている。標識された核酸は、その標識化合物を指標として検出できる。放射性標識の場合は、オートラジオグラフィーなどが使用され得る。標識の為のＤＮＡ合成反応は、ジデオキシチェーンターミネーション法によって限定された長さで停止させることができる。ジデオキシチェーンターミネーション法による方法をプライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法と呼ぶ。鋳型ＤＮＡは、標的核酸と相補的な配列部分を持つ必要があるが、標的核酸がｍｉＲＮＡの様な、配列が既知の小ＲＮＡの場合、前後の長さおよび配列は任意に選択する事ができる。これを利用して、標的核酸をプライマーとしたＤＮＡ合成反応を限定した長さにとどめることができる（限定されたＤＮＡ合成）。これをプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法と呼ぶ。
【００１０】
標識された標的核酸は、ゲル電気泳動によって分離後に検出する事ができる。限定されたＤＮＡ合成反応とゲル電気泳動を組み合わせることで、標的核酸の長さ（塩基対）を知ることができる。この技術は、蛍光標識とキャピラリーシークエンサーを用いた検出法への応用も考えられる。この技術は、植物、動物、菌類を問わず、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの検出法として応用できる。短鎖ＲＮＡに限定せず、一般的な核酸の配列を特異的に標識する方法として応用できる。例えばｓｓＤＮＡの配列特異的な末端標識が可能である。ｉｎ ｓｉｔｕラベリングも可能である。その他の種々の応用が可能である。
【００１１】
蛍光色素のヌクレオチドへの取り込みのための技術としては、例えば、アミノ基導入試薬（２−（４−モノメトキシトリチルアミノ）エチル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイトなど）、あるいはチオール基導入試薬（（Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘキシル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト、（Ｓ−トリチル−２−メルカプトエチル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイトなど）などを用いてヌクレオチドに直接標識する方法；核酸中の蛍光色素の標識部位のリン酸結合を官能基を有するホスホン酸結合に置き換えてリンカーの導入を行い、この官能基を利用して蛍光剤を結合させる方法（特開昭６１−４４３５３）などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１２】
また、本発明の方法は、新規な核酸検出法であり、核酸を配列特異的に直接標識できる点に新規性・有用性がある。また、ヌクレオチドや鋳型の選択により標識される長さを規定（１〜数塩基に限定）する事ができる。特に、近年注目されているＲＮＡ サイレンス化（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）に関与するｓｉＲＮＡや翻訳後の遺伝子発現調節機構の一部として注目されているｍｉＲＮＡの様な短鎖ＲＮＡを検出する方法として有効である。
【００１３】
従来法と比べて、本発明は、例えば以下：
１）プロトコールの操作が簡便で、短時間で検出できる。（ノーザンブロットなどのプローブ合成と同様の手順で核酸の直接標識が可能で、標識後は電気泳動して直接検出可能であり、電気泳動のトランスファーまたはメンブレンのハイブリダイゼーション、洗浄などの操作はいっさい不要である）；
２）ノーザンブロット法などと違い直接標識対象核酸を標識できる；
３）従来高感度とされている方法と比較できるレベルまたはそれ以上の検出感度がある。（アットモルレベルまで。これは市販のＲＮａｓｅ 保護を原理としたキットの検出限界｛つまりいわゆるチャンピオンデータ｝と同じレベル。なお、ＲＮａｓｅ保護ではＲＮａｓｅを用いるため、検出したＲＮＡがａｒｔｉｆａｃｔで有る可能性を排除しにくいと言う欠点がある。操作も本法の方が迅速・単純。）；ならびに
４）ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの検出ではしばしば小ＲＮＡ分画を精製しなければ検出不能であったが、本法では、トータルＲＮＡで可能である、
などの利点および効果があると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法の原理説明である。小ＲＮＡ：検出の標的とする短鎖ＲＮＡである。鋳型 ＤＮＡ：鋳型となるＤＮＡ。実施例では、合成ｓｓＤＮＡを用いているが、本発明はこれに限定されない。ＤＮＡ ｐｏｌ．：ＤＮＡポリメラーゼ。実施例にはクレノウフラグメントを用いているが、本発明はこれに限定されない。原理的には逆転写酵素でも可能である。（１）短鎖ＲＮＡを鋳型 ＤＮＡとハイブリダイズさせる。（２）常温にした後でＤＮＡポリメラーゼおよびジデオキシＮＴＰ（もしくはジデオキシＡＴＰのみ）を加える。ジデオキシＮＴＰは３２Ｐなどでラベルしておく。（３）ＤＮＡポリメラーゼによる、ＤＮＡとハイブリダイズした短鎖ＲＮＡをプライマーとしたＤＮＡ合成反応によって、短鎖ＲＮＡは標識される。この際、ジデオキシＮＴＰが取り込まれるため、反応は一塩基を付加したのみで停止する。（４）標識されたＲＮＡを変成してＤＮＡから解離させる。（５）ゲル電気泳動後オートグラムによって容易に検出できる。
【図２】図２は、実施例で示したモデル実験に用いた合成ＤＮＡおよびＲＮＡの配列を示す。ＤＮＡ１および２は、ＧＦＰ遺伝子のセンス方向のＯＲＦの一部である。ＲＮＡは２１ヌクレオチドの上記ＤＮＡの一部と相補的な配列を有する。ハイブリダイズした状態を図に示している。ＲＮＡをプライマーとした反応によって、ＲＮＡの３’に一塩基付加されると、ＤＮＡ１−ＲＮＡ１の組み合わせではｄＡＴＰが、ＤＮＡ２−ＲＮＡ２の組み合わせではｄＴＴＰが取り込まれる。ＤＮＡ１とＲＮＡ２、ＤＮＡ２とＲＮＡ１との間に相同性は無い。
【図３】図３は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法およびプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）のモデル実験である。ｐｏｌ．：Ｋｌｅｎｏｗフラグメント：ｓＲＮＡ（合成ＲＮＡ）：合成ＲＮＡ１または２：Ｔｅｍｐ（鋳型ＤＮＡ）．：合成ＤＮＡ１または２。 ＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれ１ｐｍｏｌおよび３３Ｐ−ジデオキシＮＴＰを、Ｋｌｅｎｏｗ反応溶液中で混合した後、９５℃で変性−常温に戻すことによってハイブリダイズさせた。Ｋｌｅｎｏｗ酵素を加え、ｓＲＮＡをプライマーとしたＤＮＡ合成反応を行わせた。クレノウ酵素をそこに加え、ＤＮＡ合成反応を、ｓＲＮＡをプライマーとして使用して行った。なお、３３ＰラベルされたジデオキシＮＴＰ以外のヌクレオチドは加えられていない。標識されたＲＮＡは、変性アクリルアミドゲル電気泳動後、オートグラムによって検出した。ＤＮＡ１−ＲＮＡ１、ＤＮＡ２−ＲＮＡ２の組み合わせでポリメラーゼ依存的に３３Ｐの取り込みが見られることから、本法によって配列特異的な短鎖ＲＮＡの標識が可能であることが示された。
【図４】図４は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）の検出限界の測定およびプライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）による生物からのｍｉＲＮＡの検出である。小ＲＮＡを１／１０に系列希釈して検出感度を求めた。本発明の方法では、少なくとも５ アットモル（５×１０−１８）レベルまで検出することができることが明らかになった。 左側のレーンは以下の通りである。（ａ）合成ＲＮＡの希釈系列を検出したもの、右側の２つのレーンは植物から調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡに含まれるｍｉＲＮＡを検出したもの。Ｌｕｃ：ネガティブコントロールとして植物のコードしないルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃの配列の一部を鋳型とした反応。ｍｉＲ１７１：植物内在性のｍｉｃｒｏ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるｍｉＲ１７１と相補的な配列＋一塩基のＴを含む配列を用いたプライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法である。このようにして、植物内在性のｍｉＲＮＡを検出することができる。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明のプライマーランオフ法でマウスのｍｉＲＮＡを確認することができることを示す。
【図５】図５は、プライマー停止法の原理を示す。
【図６】図６は、プライマーランオフ法の原理を示す。
【図７】図７は、プライマーアレイ法の原理を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本発明を以下に説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１６】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきではない。本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは、当業者に明らかである。
【００１７】
（用語）
本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。そのような核酸分子としては、例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡが挙げられるが、それらに限定されない。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。本明細書において「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエ−ト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデ−ト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボ−スとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾ−ルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボ−スが２’−Ｏ−プロピルリボ−スで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボ−スが２’−メトキシエトキシリボ−スで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、配列表に明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）、相補配列、対応する配列（例えば、ヒト配列に対するマウス配列など）を包含することが企図される。
【００１８】
本明細書において「小ＲＮＡ」（「ｓｍａｌｌ ＲＮＡ」）とは、サイズの小さなＲＮＡをいい、具体的には約５０ヌクレオチド長以下のものが包含され、より好ましくは約３０ヌクレオチド長以下のものが使用され得る。小ＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを挙げることができるが、それらに限定されない。小ＲＮＡは、近年注目されており、転写、翻訳およびｍＲＮＡ安定性を含む遺伝子調節における重要な役割を果たすといわれている。
【００１９】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
伸長反応に使用される場合、ヌクレオチドは、三リン酸の形態を採ることができる。ヌクレオシド三リン酸としては、ＤＮＡ構成成分であるデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）などが挙げられるが、それらに限定されない。伸長反応において、反応を停止させるヌクレオチドとしては、ジデオキシチェインターミネーター法において用いられるような、ジデオキシアデノシン三リン酸（ｄｄＡＴＰ）、ジデオキシグアノシン三リン酸（ｄｄＧＴＰ）、ジデオキシシチジン三リン酸（ｄｄＣＴＰ）、ジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）、ジデオキシウリジン三リン酸（ｄｄＵＴＰ）、ジデオキシイノシン三リン酸（ｄｄＩＴＰ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。特に言及しない場合、本発明において、「ヌクレオチド」と「ヌクレオチド三リン酸」とは互換可能に使用されることが理解される。
【００２１】
本明細書においてヌクレオチドは、「標識」され得る。そのような標識としては、例えば、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ＤＩＧ、酵素および化学発光を利用した任意の標識を挙げることができるがそれらに限定されない。
【００２２】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができるが、それらに限定されない。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。１つの好ましい実施形態では、標識は放射能標識される。
【００２３】
本明細書において、鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、「改変」され得る。このような核酸の末端の改変は、他のヌクレオチド（例えば、標識ヌクレオチド）を取り込まないような改変であることが好ましい。５’末端であっても３’末端であってもよいが、３’末端であることが好ましい。そのような改変としては、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化などを挙げることができるがそれらに限定されない。このようなフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化などの改変は、３’末端に取り込まれることによって、ポリメラーゼによる伸長反応を停止することができる。
【００２４】
本明細書において「変性」とは、核酸において、共有結合の切断を伴うことなく、天然の三次元構造を失う現象をいう。変性工程を包含することによって、核酸の分離が促進され、伸長した標識対象核酸の取出しが容易になることが理解される。
【００２５】
本明細書において「未反応物の除去」とは、核酸合成反応において、反応しなかった材料（例えば、標識されたヌクレオチドなど）を取り除くことをいう。除去されるべき未反応物には、特に、標識されたヌクレオチドが含まれることが有利である。標識されたヌクレオチドを除去することによって、伸長したもののみの標識を手がかりとして検出を行うことができるようになるからである。未反応物の除去は、例えば、アルコール沈澱（例えば、２−プロパノール、エタノールなどによる沈澱）およびその反応後の濾過を行うことによって行うことができる。アレイにおける未反応物の除去は、洗浄によって行うことができる。
【００２６】
本明細書において「核酸の分離」とは、ある核酸の集合を別の性質を有する核酸の集合から離すことをいう。そのような分離は、分子量、標識、親和性などを手がかりに行うことができる。分子量を手がかりに分離する場合は、電気泳動を行うことによって分離することができる。分子ふるいを用いても分子量による分離を行うことができる。
【００２７】
核酸の取り出しは、標識の検出と同時に行っても良い。
【００２８】
本発明では、標識の検出は、直接または間接的に行うことができる。直接行う場合は、例えば、放射能をガイガーカウンターなどで検出したり、蛍光を直接肉眼またはカメラなどで検出することができる。間接的に行う場合は、例えば、別に標識されたものをその標識に結合することによって、その別の標識を検出したり、標識を活性化する因子を付与してその活性化により標識（ビオチン、ストレプトアビジンなどの使用）を検出することなどにより検出を行うことが可能である。
【００２９】
本明細書において使用される「オートラジオグラフ」および「オートラジオグラフィー」とは、Ｘ線写真フィルムあるいは乾板を使って、生体内における放射性物質(トレーサ
ー)の取込みを観察し、生体内物質の分布、移動、代謝を細胞化学的または組織化学的に
調べる方法をいう。オートラジオグラフには、マクロオートラジオグラフ法（可視オートラジオグラフ法）、ミクロオートラジオグラフ法（光顕オートラジオグラフ法）、ウルトラミクロオートラジオグラフ法（電顕オートラジオグラフ法）などが挙げられる。本発明においては、その目的に応じてこれらのうちの一つを任意に選択して使用することができる。
【００３０】
本発明の方法では、生体分子の情報またはそれに相互作用する物質に起因する情報を検出することができる限り、種々の検出方法および検出手段を用いることができる。
【００３１】
本明細書において、生体分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなど）に対して「特異的に相互作用する」とは、その生体分子に対する親和性が、他の無関連の（特に、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどであれば、例えば、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に高いことをいう。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【００３２】
本明細書において「標的核酸」とは、反応（例えば、標識または検出）の対象となる核酸をいう。したがって、標識が目的である場合は、標的核酸と標識対象核酸とでは、重複し得る。
【００３３】
本明細書において「標識対象核酸」とは、本発明の標識方法の対象となる任意の核酸をいう。そのような核酸としては、任意の核酸が使用され得る。そのような標識対象核酸の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸合成酵素によって伸長反応を行うことができるようなＰＮＡなどを挙げることができるがそれらに限定されない。標的対象核酸の特に興味深い例としては、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどのような小ＲＮＡを挙げることができる。標識対象核酸は、プライマー停止法およびプライマーランオフ法では、検出の標的となり、プライマーアレイ法では、プローブとなる。
【００３４】
本明細書において「鋳型核酸」とは、本発明の方法において標識対象核酸を標識する際に利用する鋳型となる任意の核酸をいう。鋳型核酸自身は、本発明の方法では、標識されない。鋳型核酸は、プライマー停止法およびプライマーランオフ法では、プローブとなり、プライマーアレイ法では、標的となる。本発明において使用される鋳型核酸は、通常、標識対象核酸の少なくとも一部（好ましくは全部）と相補的であり、さらに標識対象核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する。したがって、通常、鋳型核酸は、標識対象核酸よりも長いが、それに限定されず、伸長方向（５’側であることが多い）にのみ長いような鋳型核酸であっても良い。鋳型核酸の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸合成酵素によって伸長反応の鋳型になることがで
きるようなＰＮＡなどを挙げることができるがそれらに限定されない。鋳型核酸と、標識対象核酸との間の長さの違いは、好ましくは、約５ヌクレオチド以上、約１０ヌクレオチド以上、または約１５ヌクレオチド以上であり得る。
【００３５】
本明細書において「識別可能な程度」の長さの相違とは、検出するときに容易に相違を識別することができる程度の長さをいい、電気泳動を用いる場合は、例えば、少なくとも約５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチドの相違がある場合をいう。
【００３６】
本明細書において、「相補的」であるとは、核酸について言及するとき、核酸の塩基配列において、各塩基をワトソン−クリック結合で対になる塩基でおきかえた塩基配列（核酸）をいう。通常、ＡとＴ（Ｕ）と、およびＣとＧとが互いに相補的であるといわれる。
【００３７】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００３８】
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号 １文字記号 意味
Ａｌａ Ａ アラニン
Ｃｙｓ Ｃ システイン
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸
Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン
Ｇｌｙ Ｇ グリシン
Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン
Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン
Ｌｙｓ Ｋ リジン
Ｌｅｕ Ｌ ロイシン
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン
Ａｓｎ Ｎ アスパラギン
Ｐｒｏ Ｐ プロリン
Ｇｌｎ Ｑ グルタミン
Ａｒｇ Ｒ アルギニン
Ｓｅｒ Ｓ セリン
Ｔｈｒ Ｔ トレオニン
Ｖａｌ Ｖ バリン
Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン
Ｔｙｒ Ｙ チロシン
Ａｓｘ アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ 不明または他のアミノ酸。
塩基
記号 意味
ａ アデニン
ｇ グアニン
ｃ シトシン
ｔ チミン
ｕ ウラシル
ｒ グアニンまたはアデニンプリン
ｙ チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ グアニンまたはシトシン
ｗ アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【００３９】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００４０】
本明細書において核酸の「少なくとも一方の先端」とは、その核酸の３’末端または５’末端の少なくとも一方を意味する。
【００４１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ
塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する。このような方法によって同定されるポリヌクレオチドを、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」という。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４２】
本明細書において「ハイブリダイズ可能」な核酸またはポリヌクレオチドとは、上記ハイブリダイズ条件下で別の核酸またはポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる核酸またはポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能な核酸として具体的には、配列表で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する核酸、好ましくは８０％以上の相同性を有する核酸、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸を挙げることができる。核酸配列の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
【００４３】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）、同第３版（２００１）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００４４】
ＤＮＡ二本鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二本鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Tm（℃）＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)−600／N−0.72（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００４５】
ＲＮＡ、ＰＮＡなどを利用したときは、当業者は、そのヌクレオチドに適切な関係式を利用することができる。
【００４６】
当業者は、上述のような関係式を用いて、標識または検出などに適切な条件を見出すことができることが理解される。
【００４７】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求めることも可能である。
【００４８】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象を捕捉するための手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
【００４９】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００５０】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００５１】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プライマーとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、最も好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００５２】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００５３】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ ＥＳ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５４】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００５５】
本明細書において核酸の存在を確認するには、放射能法、蛍光法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され得る。
【００５６】
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の検出／標識のための技術を使用することができる。
【００５７】
本明細書において、「複合体」とは、２つ以上の分子が相互作用を介して会合し、あたかも１つの分子のように挙動する状態となったものをいう。したがって、ハイブリダイズした核酸−核酸は複合体である。
【００５８】
本明細書において「核酸合成酵素」とは、核酸を合成する能力を有する任意の酵素をいう。本明細書では、ポリメラーゼともいう。これは、ヌクレオチドを縮合させてポリヌクレオチドにする反応を触媒する酵素の総称である。このような核酸合成酵素としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、などを挙げることができるがそれらに限定されない。ポリメラーゼとしては、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができる。また、どちらのポリメラーゼでも、検出するのはＤＮＡ、ＲＮＡを問わないことが理解される。鋳型がどちらか（あるいは両方か）という違いだけである。（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡも鋳型にする。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして売られているものの中にも、ＲＮＡ依存性活性も持つものが有る）。このようなポリメラーゼとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼI、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント、Ｔａｑポリ
メラーゼ、ＫＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００５９】
本明細書において「伸長反応」とは、核酸について言及するとき、その核酸が少なくとも１ヌクレオチド伸びるような任意の反応をいう。ポリメラーゼを用いた伸長反応を行う場合、通常、鋳型に基づいてヌクレオチドが導入されることから、特定の配列が標識対象核酸などの伸長すべき核酸において伸長することになる。
【００６０】
伸長反応は、（ｉ）標的核酸およびその相補鎖と核酸プライマーおよび核酸プローブとのハイブリダイゼーション（アニーリング）反応と、（ｉｉ）核酸合成酵素によるプライマー鎖の伸長反応及びプローブの分解反応からなりこれら反応（ｉ）および（ｉｉ）は、例えばトリス塩酸緩衝液等の適当な緩衝液を含む水溶液中で実施することができる。このハイブリダイゼーション反応は、代表的には、５５〜７５℃で実施することができるがそれに限定されない。酵素反応は、代表的には、３７℃で実施することができるがそれに限定されない。
【００６１】
プライマー伸長産物の変性は、上記伸長反応で得られるプライマー鎖伸長産物を含む溶液を、例えば９４〜９５℃で０．５〜１分間加熱処理するなどを行うことによって実施することができる。
【００６２】
標的核酸の増幅は、例えば、その標的核酸（標識対象核酸）が所望の量になるまで、工程上記伸長反応および変性を上記と同様の条件下で複数回繰り返せばよい。すなわち、上記の伸長反応および変性を、類似の条件下で複数回繰り返して行う。上記工程をｎ回行えば、理論的には標的核酸量は当初の２ｎ−１倍にまで増幅されることとなる。
【００６３】
このような伸長反応は、市販のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のための装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから販売されている）を用いれば、簡便かつ効率的に実施することができる。
【００６４】
混合物からの核酸の取り出しは、当該分野において任意の方法を用いて行うことができる。そのような取り出しとしては、例えば、電気泳動、クロマトグラフィー、変性、アルコール沈澱、アフィニティー精製、抗体などを用いることができるがそれらに限定されない。
【００６５】
（好ましい形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示である。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲以外によっては限定されない。
【００６６】
１つの局面において、本発明は、標識が導入された核酸を生産するための方法であって、以下の工程：Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標識対象核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；Ｂ）上記標識対象核酸を、上記鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；Ｃ）上記標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、上記標識対象核酸に少なくとも１つの上記標識されたヌクレオチドが上記鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；Ｄ）上記伸長反応の後、生成した混合物から伸長した上記標識対象核酸を取り出す工程、を包含する、方法を提供する。この方法により、初めて、標的となる核酸自体を自在に標識する方法が提供され、そのような標識核酸を生産することが可能となった。
【００６７】
別の局面にて、本発明は、核酸に標識を導入するための方法であって、以下の工程：標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標識対象核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；Ｂ）上記標識対象核酸を、上記鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；およびＣ）上記標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程、上記標識対象核酸に少なくとも１つの上記標識されたヌクレオチドが上記鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程、を包含する方法を提供する。この方法により、初めて、標的となる核酸自体を自在に標識する方法が提供された。
【００６８】
別の局面において、本発明は、標的核酸を検出するための方法であって、以下の工程：Ａ）上記標的核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、上記鋳型核酸は、上記標的核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標的核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；Ｂ）上記標的核酸を、上記鋳型核酸とハイブリダイズさせて標的核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；Ｃ）上記標的核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程；およびＤ）上記標的核酸に対応する伸長産物が存在するかどうか検出する工程であって、上記伸長産物の存在は、上記標的核酸の存在の指標である、工程、を包含する、方法を提供する。本発明によって、配列が部分的または完全に公知であるか、あるいは配列が部分的または完全に未知である、目的の核酸などの検出が顕著に容易になった。なぜなら、未知核酸自体が標識されるからである。したがって、従来のように、標識されたプローブを使用する方法とは、その検出の感度、容易さなどの点で顕著に異なることが理解される。好ましくは、検出の際に、伸長反応の後、生成した混合物から上記標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長産物とを分離する工程をさらに包含してもよい。検出が容易になるからである。
【００６９】
本発明の方法において用いられる核酸の提供工程は、当該分野において周知の任意の技法（例えば、化学合成、遺伝子工学の利用、生体からの抽出）を利用して行うことができる。
【００７０】
本発明の方法において用いられる複合体の生成は、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。例えば、本明細書において別の場所において説明したような通常使用されるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することによって、複合体生成を行うことができることが理解される。
【００７１】
本発明の方法において用いられる伸長反応は、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。伸長反応には、伸長反応の触媒（例えば、核酸合成酵素）、触媒が反応することができる条件を提供する物質（例えば、緩衝液など）、伸長の際に入るべきヌクレオチド（標識、非標識など）を考慮することができる。また、反応条件をコントロールするために、温度などを調節する装置（例えば、恒温槽）を使用しても良い。
【００７２】
伸長反応の後、混合物から標識が導入された核酸を取り出す工程もまた、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。そのような取り出す工程は、核酸を精製または分離するために通常使用される技術であれば、どのようなものであっても使用することができる。
【００７３】
本発明の方法において、標的核酸に対応する伸長産物が存在するか検出する工程では、検出は、当該分野において周知の任意の技法を用いて、標識を直接または間接的に任意の方法で実施することができることが理解される。ここで、伸長産物の存在は、上記標的核酸の存在の指標であることが理解される。伸長産物は、伸長される前の未知核酸が存在しない限り、検出されないからである。ただし、伸長される前の未知核酸は、複数種類存在することが考えられることから、伸長産物の配列を決定することによって、より詳細な検出をすることができる。そのような伸長産物の配列決定は、当該分野において公知の任意の技法を用いて行うことができる。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明において使用される標識対象核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの組み合わせであり、小ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）であることが好ましい。
【００７５】
鋳型核酸と、標識対象核酸との間の相補性は、伸長反応が進捗するに十分である程度であることが好ましい。そのような相補性の程度は、長さ、伸長反応条件などによって異なり、また、３’末端付近が伸長反応に適していることが好ましい。特に、３’末端の１〜２ヌクレオチドは、完全な相補性を有していることが好ましくあり得る。あるいは、短い方の核酸を基準として、通常、少なくとも５０％の相同性を有していることが好ましく、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有していることがさらに好ましくあり得る。あるいは、標識対象核酸全部と相補的であってもよい。
【００７６】
別の実施形態では、本発明に使用される鋳型核酸は、上記標識対象核酸の両方の先端において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチドを有し、さらに好ましくは、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチドは、少なくとも約２ヌクレオチド分長く、好ましくは少なくとも約３ヌクレオチド分長く、より好ましくは少なくとも約４ヌクレオチド分長く、さらに好ましくは少なくとも約５ヌクレオチド分長く、さらに好ましくは少なくとも約６ヌクレオチド分長く、さらに好ましくは少なくとも約７ヌクレオチド分長く、さらに好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド分長く、さらに好ましくは少なくとも約９ヌクレオチド分長く、約１０ヌクレオチド分長いヌクレオチドであってもよい。
【００７７】
本発明の別の実施形態では、鋳型核酸は、改変され得る。このような改変は、３’末端が改変されていることが好ましい。これは、３’末端の偶然の外的ヌクレオチド（例えば、標識ヌクレオチド）の取り込みを防ぐことができるからである。従って、このような鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされることが好ましい。
【００７８】
１つの好ましい実施形態では、そのような改変は、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変であり得る。
【００７９】
そのような改変は、鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされていることが好ましい。
【００８０】
別の実施形態では、鋳型核酸と標識対象核酸とでは、伸長反応後に期待される長さが異なるように設計されていることが好ましい。そのような設計は、検出する場合に使用される検出法（例えば、プライマー停止法、プライマーオンオフ法、プライマーアレイ法など）に依存して変動することが理解される。プライマー停止法では、使用するジデオキシヌクレオチドなどがポリメラーゼによる伸長を停止する能力を利用することから、使用するジデオキシヌクレオチドが取り込まれる位置をコントロールすることによって設計を変動させることができる。
【００８１】
別の好ましい実施形態では、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチドは、少なくとも５’末端側に付加されている。伸長反応は３’陥没末端において伸長することが通常であるが、本発明はそれに限定されない。
【００８２】
さらに別の実施形態において、本発明は、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列は、標識対象核酸と相補性のある部分からみて３’末端側と５’末端側とが異なる長さだけ付加されている。これは、標的対象核酸を鋳型核酸から識別が容易になるからである。
【００８３】
別の好ましい実施形態では、本発明は、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列は、標識対象核酸と相補性のある部分からみて５’末端側は長く付加されているが３’末端は鋳型核酸の方が短い。すなわち、標識対象核酸の５’末端部分が、鋳型核酸の３’末端から延びている。このような場合、プライマーランオフ法では、特に、鋳型核酸の方が短いことは担保され、標識対象核酸を鋳型核酸から識別が可能になる。プライマー停止法であっても、短いことによって、標識対象核酸から鋳型核酸を識別することが簡単になり得る。
【００８４】
別の実施形態では、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列は、標識対象核酸と相補性のある部分からみて３’末端側が５’末端側より長く付加されている。このようにすることによって、電気泳動などで伸長産物を識別する際に肉眼による識別も可能となるからである。
【００８５】
別の実施形態では、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列は、標識対象核酸と相補性のある部分からみて５’末端側が３’末端側より、識別可能な程度長く付加されている。このような識別可能な程度な長さは、検出方法によって変動するが、肉眼であれば、識別可能な程度の長さは、１〜５ヌクレオチドであり得るが、少なくとも約１０ヌクレオチドであることが好ましい。
【００８６】
別の実施形態では、核酸合成酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。伸長反応が達成される限り、どのような合成酵素であっても良いことが理解される。
【００８７】
本発明の標識方法において使用される標識は、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、酵素および化学発光などを挙げることができるがそれらに限定されない。標識は１つ用いても複数（あるいは複数種類）用いても良いことが理解される。色素、蛍光などでは、複数の色を用いることができる。好ましい実施形態では、標識としては、放射能を用いる。放射能は、アットモルレベルの検出を可能にするからである。しかし本発明は、それに限定されない。
【００８８】
別の実施形態において、伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、変性工程を包含し得る。変性させることにより、伸長した標識対象核酸をより識別しやすくし、取出しが容易になるからである。
【００８９】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、未反応物を除去する工程をさらに包含する。未反応物は、標識された核酸をその後に使用する際に、ノイズとなり得るからである。ここで、未反応物の除去にはどのような利用可能な技術でも用いることができるが、好ましくは、２−プロパノール沈澱またはエタノール沈澱などのアルコール沈澱、および濾過により達成され得る。この方法は、簡便であるからである。
【００９０】
未反応物の除去において、伸長した上記標識対象核酸を「分離する」工程をさらに包含してもよい。分離することによって、純度が上昇するからである。このような分離には、当該分野において任意の技術を用いることができるが、電気泳動またはクロマトグラフィーによることが好ましい。
【００９１】
別の実施形態では、本発明の方法における伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、標識を検出する工程を包含する。この検出工程は、標識を直接または間接的に検出してもよい。
【００９２】
別の実施形態では、本発明の方法は、伸長した上記標識対象核酸を分離する工程をさらに包含する。このような分離には、当該分野において任意の技術を用いることができるが、電気泳動またはクロマトグラフィーによることが好ましい。これらの技術は、当該分野において公知の技術であり、上述した任意の形態を用いることができることが理解され得る。
【００９３】
別の実施形態において、本発明の方法では、「分離の際に」検出が行われても良い。分離を行うことによって検出精度を上げることができ、検出および分離の効率が上昇するからである。
【００９４】
他の実施形態において分離および検出は、オートラジオグラフを使用しても良い。自動的に分離および検出を行うことが可能であるからである。
【００９５】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、伸長反応を停止させる工程を包含する。停止工程は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ法）またはプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法により達成され得るがそれらに限定されない。このような停止工程は、従来の標識方法では考えることができなかったことから、特異性の高い標識を実現することができることが理解される。
【００９６】
標識対象核酸は、通常は、配列が部分的または完全に公知または未知である目的の核酸であるが、それに限定されず、プローブとして使用されていても良い。目的の核酸である場合は、たとえその配列が部分的または完全に未知であったとしても、目的の核酸の検出に大いに効果を発揮することが理解される。
【００９７】
１つの例示的な実施形態では、標識対象核酸と鋳型となるＤＮＡまたはＲＮＡをハイブリダイズさせ、これにＤＮＡポリメラーゼと遊離ヌクレオチドを加えて、標識対象核酸（場合によってはプローブ）をプライマーとしたＤＮＡ合成（伸長）反応を行わせることによって、配列特異的に核酸を標識する。したがって、従来使用されているサザンブロッティング、ノーザンブロッティング、プライマー伸長法、サザンブロット、ノーザンブロット、プライマー伸長法、ＲＮａｓｅ保護、マイクロアレイ、マクロアレイなどの従来の配列特異的な核酸検出方法は、ハイブリダイゼーションの前にプローブに標識を入れるが、本発明の方法では標識対象核酸とプローブとなる核酸をハイブリダイズさせた後、どちらかをプライマーとするＤＮＡ合成反応を行わせることで、ハイブリダイズした核酸のみに標識を入れるという手法である。本発明の方法では、通常は標的核酸として使用される核酸の方に標識を入れることになるがそれに限定されない。従って、プローブとして使用される核酸の方に標識を入れることになってもよい。本発明の方法では、ハイブリダイズした核酸しか標識されないことから、標識対象核酸に配列特異的に標識が行われる点が、従来のプローブに標識を入れる（つまり間接的な）方法と比べて、顕著に異なる効果を奏する。従来法でのプローブの役割を、鋳型核酸が担うことになる。したがって、標識は鋳型核酸ではなく標識対象核酸の方に入る。なお、逆に標識対象核酸をプローブとして使用することもできる。この場合は、プローブの側に標識を入れる方法も含有される。このような形態は、ｍＲＮＡを用いたマイクロアレイに本法を応用する際に必要になる。
【００９８】
この方法では、鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼが、プライマーとしてＤＮＡもＲＮＡも用いることができることを利用する。鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ（クレノウフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩ等）が好ましいが、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）でも可能である。
【００９９】
両者のタイプのポリメラーゼは、前述の様にＤＮＡでもＲＮＡでもプライマーとして利用可能であり、これがハイブリダイズしている核酸と相補的な塩基をプライマーの３’側に付加する反応を触媒する。反応は、通常３’「陥没末端」でだけ起きる。３’突出末端では鋳型がない状態のため反応は、通常起きない。５’末端に塩基を付加する反応を触媒することができる場合は、「逆の反応」も可能であり得る。
【０１００】
（反応停止）
本明細書において、伸長反応の「停止」とは、核酸合成反応を停止することをいう。伸長反応の停止は、代表的には、以下の２種類の方法を（プライマー停止法、およびプライマーランオフ法）用いることができる。ここでは、標識ヌクレオチドの取り込まれる塩基数を規定（限定）できる点が、もう一つの特長である。
【０１０１】
本明細書において「プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法）」とは、ＤＮＡ合成（伸長）反応の際に加えるヌクレオチド３リン酸を、通常ＤＮＡ合成に用いられるでデオキシリボヌクレオチドではなく（もちろんリボヌクレオチドでもなく）ジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＧＴＰの混合物あるいはどれか一つ）のような核酸合成酵素による次の伸長反応を受けないが取り込みは可能なヌクレオチド３リン酸またはその類似物とすることで、１塩基または数塩基もしくは数十塩基取り込んだ後に反応を停止させる方法である。原理的には、ＤＮＡ配列決定反応に用いられるジデオキシチェーンターミネーション法と同じ原理を用いることができる。プライマー停止の原理については、図１および図５を参酌することができる。
【０１０２】
本明細書において「プライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法」とは、鋳型となる（プローブ）核酸を標識対象核酸の３’側（プローブがわからみると５’側）より１〜数塩基だけ長くしておいて、ＤＮＡ合成反応をその長さ分だけで（鋳型がなくなるため）停止させる方法である。プライマーランオフの原理については、図６を参酌することができる。
【０１０３】
プライマー停止法は、どのような場合でも使える方法である。プライマーランオフ法は、標識対象核酸の配列が既知のｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）の場合は有効であるが、遺伝子不活性化におけるｓｉＲＮＡの場合は、不活性化されている遺伝子と相補的な小ＲＮＡの混合物でいろいろな分子種を含むことから、プライマー停止法が好ましい。
【０１０４】
プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法の場合は、鋳型の長さは重要ではなく、任意の長さを用いることができる。この方法でｓｉＲＮＡを検出する場合、ｓｉＲＮＡはいろいろな分子種の集合であるために、次に来る塩基を規定することはできないことから、標識ヌクレオチドはできれば４種類（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＧＴＰ）全てを含むことが望ましいが、それに限定されない。感度が１／４になることを覚悟すれば１種類でも可能であることが当業者には理解される。
【０１０５】
プライマーランオフ法でｍｉＲＮＡを検出する場合は、鋳型の５’側（標的から見て３’側）は、決められた長さ（通常は１塩基だけ突出）である必ことが好ましい。なお、標的とハイブリダイズする部分は相補的であることが好ましいが、突出部分の配列は、自由に選択することができる。従って、４つの標識ヌクレオチド（すなわち、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ）のうち一つが取り込まれるように鋳型を設計可能で必要な一種類だけを反応に加えればよい。
【０１０６】
本明細書において「プライマーアレイ法」とは、多種類の核酸を同時に検出および定量するための方法である。プライマーアレイ法では、プローブ核酸を支持体に固定し、固定されたプローブと検出対象核酸の複合体を用いてＤＮＡ合成反応を行わせる際に、標識ヌクレオチドを取り込ませることで核酸を標識する方法である。支持体の異なった部位に、多種類のプローブを固定することで、複数種の核酸を同時定量することができる。検出対象となる核酸は、ｍＲＮＡであっても小ＲＮＡであってもよく、場合によっては、ＤＮＡであってもよい。従来のマイクロアレイ技術と比べて、支持体上での特異的な標識反応が行われることから、効率のよい検出が行うことができることが特徴である。小ＲＮＡを網羅的に解析することができる方法は、これまでに知られていない。プライマーアレイ法の原理については、図７を参酌することができる。
【０１０７】
プライマー停止法は、代表的に、ｓｉＲＮＡの検出に適している。プライマーランオフ法は、代表的に、ｍｉＲＮＡおよびＳｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ＝）の検出に適している。プライマーアレイ法は、ｍＲＮＡの検出に適している。
【０１０８】
プライマー停止法においては、標識対象核酸が標的核酸（検出対象；例えば、ｓｉＲＮＡ）となり、ポリメラーゼ反応におけるプライマーに該当する。したがって、検出対象自体が標識される。他方、鋳型核酸は、合成ＤＮＡなどの「提供」核酸であり、プローブに該当する。例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなどを使用することができる。したがって、鋳型核酸は、標識されない。プライマー停止法では、伸長反応の停止は、ジデオキシヌクレオチドなどの伸長反応の停止作用を有するヌクレオチド三リン酸を使用することによって実現される。
【０１０９】
プライマーランオフ法においては、標識対象核酸が標的核酸（検出対象；例えば、ｍｉＲＮＡ、ＳｎＲＮＡ）となり、ポリメラーゼ反応におけるプライマーに該当する。したがって、検出対象自体が標識される。他方、鋳型核酸は、合成ＤＮＡなどの「提供」核酸であり、プローブに該当する。例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなどを使用することができる。したがって、鋳型核酸は、標識されない。プライマーランオフ法では、伸長反応の停止は、対応する鋳型核酸が伸長すべき部分にヌクレオチド配列がないことにより、それ以上伸長しなくなることによって、実現される。
【０１１０】
プライマーアレイ法においては、標識対象核酸が今度は好ましくは固相支持体に固定され、したがって、プライマーとなる。標識対象核酸は、プライマーの役割を果たすことになることから、標識がされるような合成ＤＮＡなどの核酸を用いることができる。この場合、鋳型核酸はｍＲＮＡに相当し、標識されない。プライマーアレイ法では、伸長反応の終結反応は必ずしも必要ではない。
【０１１１】
本発明の「標識対象核酸をプライマーとするＤＮＡ合成反応によって、標識対象核酸を特異的に標識する方法」と、本発明の「ＤＮＡ合成反応の際、プライマー停止法もしくはプライマーランオフ法によって伸長塩基数を限定する方法」とを組み合わせることで、（とくに小ＲＮＡに有効な）新規核酸検出法となる。したがって、このような標識法は、従来では検出できなかった格別の効果を奏するといえる。前者だけでも、新規の核酸標識・検出法である。
【０１１２】
変性、電気泳動、検出はいろいろな組み合わせが考えるが、本発明の「配列特異的で塩基数を規定できる核酸ラベル法」を本明細書において記載されるように実施することにより、公知技術を応用して実施することができる。ただし、いろいろな組み合わせで幾つかの応用があり得ることが理解される。
【０１１３】
１つの実施形態では、検出は、伸長された部分の配列を検討することによって行うことができる。この場合、伸長された標的核酸に特異的に結合する薬剤を用いても良い。そのような薬剤には、伸長された標的核酸と特異的に相互作用する配列を有する別の核酸または抗体などを挙げることができるがそれらに限定されない。あるいは、伸長された標的核酸に特異的に結合する薬剤は、伸長していない上記標的核酸にも、上記標識されたヌクレオチドにも結合しない。
別の実施形態では、検出を行う場合、標識されたヌクレオチドに起因する標識と、上記薬剤に起因する標識とを検出することによって行われてもよい。
【０１１４】
別の実施形態では、検出は、伸長された標的核酸の長さに基づき行うことができる。
【０１１５】
（デバイス）
本発明は、アレイなどのデバイスにおける標識および検出に応用することができる。
【０１１６】
本明細書において「デバイス」とは、装置の一部または全部を構成することができる部分をいい、支持体（好ましくは固相支持体）およびその支持体に担持されるべき標的物質などから構成される。そのようなデバイスとしては、例えばチップ、アレイ、マイクロタイタープレート、細胞培養プレート、シャーレ、フィルム、ビーズなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１７】
アレイでは、支持体に結合させた核酸が用いられ、用途として、大きく分けて２つの応用が考えられる。
【０１１８】
１）ｓｉＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ検出用マイクロ（マクロ）アレイ
小ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）に対する鋳型核酸をガラス、メンブレンなどに固定させておき、この支持体上でハイブリダイゼーション、標識、検出を行わせる。小ＲＮＡの存在量を網羅的に解析できることが期待され、ほかに小ＲＮＡを網羅的に解析する方法は知られていない。
【０１１９】
２）ｍＲＮＡに対して相補的な配列を持つ核酸を支持体上に固定しておき、支持体上でハイブリダイゼーション、標識、検出を行わせる。従来のマイクロアレイと同じくｍＲＮＡの存在量を網羅的に解析するために利用できる。従来法と比べ、反応系が単純である。
【０１２０】
１）および２）のどちらについても、方法、支持体に固定した核酸そのもの、キットが実施形態として考えられる。
【０１２１】
あるいは、逆に小ＲＮＡが鋳型となってもよい。あるいは、５’および３’の両端で標識することも可能である。
【０１２２】
標識対象核酸から見て、３’側（鋳型側では５’）は１塩基の突出がもっとも考えられる長さであるがこれに限定されない。これとは別に５’側は１０塩基程度、鋳型の鋳型の方が長い方が望ましい。これによって、標的には１塩基の付加が起きる。５’側に鋳型を長くするのは、非特異的に鋳型に標識が入ったとしても、長さ的に標的と区別できるようにするためである。
【０１２３】
本明細書において使用される「支持体」は、生体分子のような物質を固定することができる材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）をいう。支持体の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子のような物質に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
【０１２４】
支持体として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。支持体は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。支持体を構成する材料が固相である場合、本明細書において特に「固相支持体」という。本明細書において、プレート、マイクロウェルプレート、チップ、スライドグラス、フィルム、ビーズ、金属（表面）などの形態をとり得る。支持体はコーティングされていてもよく、コーティングされていなくてもよい。
【０１２５】
本明細書において使用される「基板」とは、本発明のチップまたはアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。したがって、基板はプレートの概念に包含される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
【０１２６】
プレートおよび基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々の指標によって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。
【０１２７】
本明細書において「コーティング」とは、固相支持体または基板について用いられるとき、その固相支持体または基板の表面上にある物質の膜を形成させることおよびそのような膜をいう。コーティングは種々の目的で行われ、例えば、固相支持体および基板の品質向上（例えば、寿命の向上、耐酸性などの耐環境性の向上）、固相支持体または基板に結合されるべき物質の親和性の向上などを目的とすることが多い。そのようなコーティングのための物質としては、種々の物質が用いられ得、上述の固相支持体および基板自体に使用される物質のほか、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質などの生体物質、ポリマー（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、疎水性フッ素樹脂）、シラン（ＡＰＳ（例えば、γ−アミノプロピルシラン））、金属（例えば、金など）が使用され得るがそれらに限定されない。そのような物質の選択は当業者の技術範囲内にあり、当該分野において周知の技術を用いて場合ごとに選択することができる。一つの好ましい実施形態では、そのようなコーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、（例えば、エポキシシランまたはメルカプトシラン、ＡＰＳ（γ−アミノプロピルシラン））、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂、金のような金属を用いることが有利であり得る。
【０１２８】
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。チップとしては、例えば、ＤＮＡチップ、タンパク質チップなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２９】
本明細書において「アレイ」とは、１以上（例えば、１０００以上）の標的物質を含む組成物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より
大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望の核酸のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる核酸を少なくとも１０２個、より好ましくは少なくとも１０３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０４個、さらにより好ましくは少なくとも１０５個を含む。これらの抗体は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される標的物質（例えば、核酸など）を含む組成物は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の標的物質（例えば、核酸など）を含む組成物が固定され得る。
【０１３０】
基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の標的物質（例えば、核酸など）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、１０８個の生体分子を超える標的物質を含む組成物が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、標的物質を含む組成物（例えば、核酸など）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じくらい小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。本発明では、細胞への導入が企図される標的物質を含む組成物は、通常、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている。
【０１３１】
アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、標的物質を含む組成物の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある標的物質を含む組成物のスポットをある基板またはプレートに作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。
【０１３２】
本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。
【０１３３】
各々のアドレスのサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、標的物質を含む組成物の量および／または利用可能な試薬、微粒子のサイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。各アドレスのサイズは、例えば、１〜２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。
【０１３４】
アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。
【０１３５】
マイクロアレイについては、ゲノム機能研究プロトコール（実験医学別冊 ポストゲノム時代の実験講座１）、ゲノム医科学とこれからのゲノム医療（実験医学増刊）などに広く概説されている。
【０１３６】
マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ Ｏ．ら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。
【０１３７】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１ ５ Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１３８】
検出技術としては、核酸の標識に関連する情報を検出することができる限り、種々の検出方法および検出手段を用いることができる。そのような検出方法および検出手段としては、例えば、目視、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、レーザー光源を用いた読取装置、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング、電気信号、化学的または生化学的マーカーのいずれかあるいは複数種を用いる方法および手段を挙げることができるがそれらに限定されない。そのような検出装置としてはまた、蛍光分析装置、分光光度計、シンチレーションカウンター、ＣＣＤ、ルミノメーターなども挙げられるがそれらに限定されず、生体分子を検出することができる手段であればどのようなものでもよい。
【０１３９】
放射能であれば、ガイガーカウンター、シンチレーションカウンターなどの当該分野において周知の技法が用いられ得る。
【０１４０】
蛍光であれば、蛍光偏光の測定の際の励起波長及び検出波長を測定する必要があるが、当業者は、使用した蛍光標識の種類に応じて適宜選択（例えば、フルオレセインイソチオシアネートを蛍光標識とした場合は、励起波長及び検出波長は、各々４９０ｎｍおよび５２０ｎｍ）することができる。
【０１４１】
（キット）
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、酵素、鋳型核酸、標準など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、酵素、ヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、伸長反応を止めるヌクレオチドなど（およびその三リン酸）、鋳型核酸、標準など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、試薬成分、緩衝液、塩濃縮液、使用するための補助手段、使用方法を記載した指示書などが含まれる。
【０１４２】
本明細書において「指示書」は、本発明の試薬の使用方法、反応方法などを使用者に対して記載したものである。この指示書は、本発明の酵素反応などの手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、必要に応じて本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本における厚生労働省、米国におけるＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メールなど）のような形態でも提供され得る。
【０１４３】
１つの局面において、本発明は、標識が導入された核酸を生産するためのキットであって、以下の手段：Ａ）標識の導入の対象となる標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標識対象核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、鋳型核酸；Ｂ）核酸合成酵素；およびＣ）標識されたヌクレオチド；を備える、キットを提供する。
【０１４４】
１つの実施形態では、本発明のキットは、ＤＮＡ合成酵素と、コントロールの鋳型、標的（プライマー）、反応用のバッファー等を含み、実際の標的核酸に対する鋳型は自分で調製ないしはオリゴＤＮＡとして注文するように構成しても良い。これとは別に、主要な小ＲＮＡに対する鋳型のセットを含むものも考えられる。あるいは、鋳型のセットや、鋳型を上記のアレイにしたキットも考慮される。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明のキットにおいて、生成した混合物から上記標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長された伸長産物とを分離する手段がさらに含まれていても良い。
【０１４６】
別の実施形態において、本発明のキットは、標識されたヌクレオチドを検出する手段をさらに備えていてもよい。
【０１４７】
好ましい実施形態では、本発明のキットは、さらにコントロールとなる標準核酸を備える。コントロールとなる標準核酸は、電気泳動などにおいて検出する際の指標として用いることができる。
【０１４８】
ここで使用され得る標準核酸は、上記鋳型核酸を同定するための核酸および上記標識対象核酸を同定するための核酸からなる群より選択される核酸を含んでいてもよい。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明のキットは、核酸合成酵素の反応のための試薬をさらに含む。このような試薬には、緩衝液、必要なイオン濃縮液、塩濃縮液、ｐＨ調整剤などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１５０】
好ましい実施形態では、本発明のキットは、支持体をさらに含み、上記鋳型核酸は、上記支持体に固定されている。このような場合、支持体は、ガラスまたはメンブレンであってもよいがそれに限定されない。
【０１５１】
好ましい実施形態では、本発明のキットに含まれる支持体に固定される上記鋳型核酸は、アレイ状に配置される。このようなものは、ＤＮＡチップなどとも称され得る。このようなアレイを生産する方法もまた、本発明の範囲内にある。
【０１５２】
本発明のキットにおいて、種々の構成要件が採るべき状態は、本発明の標識方法および検出方法、標識が導入された核酸を生産する方法において詳述される任意の形態を採り得ることが理解される。
【０１５３】
別の局面では、本発明は、標的核酸を検出するためのキットであって、以下の工程：Ａ）上記標的核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標的核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、鋳型核酸；Ｂ）核酸合成酵素；Ｃ）標識されたヌクレオチド；Ｄ）標識されたヌクレオチドを検出する手段、を備える、キットを提供する。
【０１５４】
各構成要件（例えば、鋳型核酸、核酸合成酵素、標識されたヌクレオチド、検出手段）などは、本発明の方法の説明において詳述されている任意の形態をとりえることが理解され得る。
【０１５５】
１つの実施形態では、本発明のキットは、生成した混合物から上記標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長された伸長産物とを分離する手段をさらに備えていてもよい。このような手段は、電気泳動、クロマトグラフィーなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１５６】
（アレイ製造法）
別の局面において、本発明は、標識が導入された核酸が固定された支持体を生産するための方法であって、以下の工程：Ａ）支持体に固定された標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標識対象核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；Ｂ）上記標識対象核酸を、上記鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；Ｃ）上記標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、上記標識対象核酸に少なくとも１つの上記標識されたヌクレオチドが上記鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；およびＤ）上記伸長反応の後、生成した混合物から伸長した上記標識対象核酸を含む支持体を取り出す工程、を包含する方法を提供する。上記製造方法において、核酸の提供、複合体の生成、伸長反応、および支持体の取り出しは、本明細書の他の場所に記載されるような任意の技法を応用することができる。核酸の提供については、一旦目的とする核酸の情報が提供されると、化学合成、遺伝子工学の応用、細胞成分からの抽出などの任意の技法を用いることができる。複合体の生成は、上記２つの核酸を複合体生成可能な距離に置き、複合体生成が生じる条件に暴露することによって行うことができる。伸長反応は、例えば、複合体が生成された後、核酸合成酵素を加え、核酸合成酵素が機能するような条件に複合体と核酸合成酵素との混合物をさらすことによって行うことができる。反応後の支持体は、好ましくは、反応に使用した他の試薬から、支持体を分離することによって取り出すことができる。必要に応じて、固定された標識核酸が破壊されない条件下で洗浄（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などを用いる）してもよい。
【０１５７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１５８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【実施例】
【０１５９】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、和光純薬、Ｓｉｇｍａ、東洋紡、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、アマシャム、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、フナコシ、ニッポンジーンなどから市販されているものを使用した。合成ＤＮＡは、北海道システムサイエンス株式会社に生産を依頼し、合成ＲＮＡは、株式会社日本バイオサービスに合成を依頼したが、当業者は当該分野において周知の技法を用いてそのようなＤＮＡおよびＲＮＡを合成することができることが理解される。
【０１６０】
（実施例１）
本実施例では、本発明の標識技術がＲＮＡおよびＤＮＡで適用可能かどうかを実証した。
【０１６１】
（材料および方法）
（核酸）
ＧＦＰ遺伝子に相補的な合成小ＲＮＡおよびＧＦＰ遺伝子に対応するセンス鎖ＤＮＡを以下の表に列挙する。さらに、図２には、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＤＮＡ１、ＤＮＡ２の相補性についての概観を示す。図３右側（（ｉ）〜（ｖ））には、表１に示される各核酸の相互の相補性についての概観を示す。
（表１）
実施例に使用される代表的な合成ＤＮＡおよびＲＮＡの配列
小ＲＮＡ
ＲＮＡ１
５’−ＣＵＣ ＡＵＣ ＡＵＧ ＵＵＵ ＧＵＡ ＵＡＧ ＵＵＣ−３’（配列番号１）ＲＮＡ２
５’−ＡＵＣ ＧＣＣ ＡＡＵ ＵＧＧ ＡＧＵ ＡＵＵ ＵＵＧ−３’（配列番号２）
鋳型ＤＮＡ
ＤＮＡ１ （ｍ−ＧＦＰ５−ＥＲ−Ｓ ７２５−８１２）
５’−ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＧＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＧＡ ＧＴＴ ＴＧＴ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＧＡＴ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ Ａ−３’（配列番号３）
ＤＮＡ２ （ｍ−ＧＦＰ５−ＥＲ−Ｓ ５７２−６７０）
５’−ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＡ ＧＡＣ ＣＣＧ ＣＣＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＧＡ ＡＧＡ ＣＧＧ ＣＧＧ ＣＧＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＣＧＣ ＴＧＡ ＴＣＡ ＴＴＡ ＴＣＡ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＣＣ ＡＡＴ ＴＧＧ ＣＧＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＧＴ ＣＣＴ ＴＴＴ ＡＣＣ−３’（配列番号４）
ＬＵＣ （２１１３−ＬＵＣ ２６０３−２７０２）
５’−ＴＴＧ ＴＡＡ ＴＡＴ ＴＡＴ ＡＴＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＧＧ ＴＡＡ ＴＴＴ ＴＧＴ ＡＡＴ ＴＧＴ ＧＧＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＴＡＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＡＡ ＴＡＡ ＡＡＴ ＣＡＧ ＧＴＡ ＴＡＧ ＧＴＡ ＡＣＴ ＡＡＡ ＡＡＧ−３’（配列番号５）
Ｎｔａｂ ｍｉＲ１７１
５’−ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＧＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＴＣ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＴＣ ＡＡＴ ＣＡ−３’（配列番号６）
Ｎｔａｂ ｍｉＲ１６７
５’−ＴＴＡ ＧＡＴ ＣＡＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＴＣ ＡＡＴ ＣＡ−３’（配列番号７）
Ｍｍｕｓ ｍｉＲ１８１ Ｔ
５’−ＴＡＣ ＴＣＡ ＣＣＧ ＡＣＡ ＧＣＧ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＧＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＴＣ Ａ−３’（配列番号８）
Ｍｍｕｓ ｍｉＲ１６ Ｔ
５’−ＴＣＧ ＣＣＡ ＡＴＡ ＴＴＴ ＡＣＧ ＴＧＣ ＴＧＣ ＴＡＴ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＧＣ ＧＣＧ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＣＡ−３’（配列番号９）
ＧＦＰ５−ＥＲ Ｇ１０＋７８６−８１２
５’−ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ Ｃ−３’（配列番号１０）
ＧＦＰ５−ＥＲ Ｇ＋７８６−８１２
５’−ＧＧＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＴＣ ＡＡＴ ＣＡ−３’（配列番号１１）
トータルＲＮＡを雌性マウス成体およびタバコ植物から抽出した。抽出には、コンサート試薬（マウス；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはトリゾール試薬を製造業者（タバコ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示書に記載の通りに用いて行った。
【０１６２】
（ハイブリダイゼーションおよび標識）
上記小ＲＮＡおよびテンプレートＤＮＡ（０．０５ｐｍｏｌ）を含む溶液（総量４μｌ）をハイブリダイーゼション緩衝液（１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で混合してハイブリダイズさせ、そして９５℃で５分間変性させた。続いて、特別な場合を除いて６４℃で６時間インキュベートさせた。ついで、この溶液のうち４μｌを５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントと混合し、３７℃で１〜２時間インキュベートした。反応を、ホルムアミド溶液（２０ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％のＢＰＢ）を加えることによって終結させ、９５℃で５分間変性させた。ついで、この混合物を、アクリルアミドゲル（１５％アクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド １９：１）および７Ｍ尿素（尿素１２．７５ｇ）、４０％ ビスアクリルアミドを１１．２５ｍｌ、１０×ＴＢＥを３ｍｌ、Ｈ２Ｏを３ｍｌ、Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を３０μｌ、１０％ＡＰＳを３００μｌ加えることによって、１５％変性アクリルアミドゲルを調製した。ＴＢＥは、０．４４５ ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、１０ ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを５倍溶液として調製した）で３０分間電気泳動（ゲル板１０ｃｍの物を用い、有効ゲル長は約８ｃｍであった。）することによって分離させた。
【０１６３】
別の方法として、１ｐｍｏｌの鋳型ＤＮＡと小ＲＮＡとを変性させ、反応緩衝液（１０×ハイブリダイゼーション緩衝液（１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）を１０分の１量、α−３３Ｐ標識ジデオキシアデノシン三リン酸、シトシン三リン酸、ウラシル三リン酸およびグアノシン三リン酸を含む）中にいれてハイブリダイズさせ、ついでＤＮＡポリメラーゼを加えて、ヌクレオチド伸長を行った後にその反応を終結させた。終結は９５℃で５分間変性させて行ったか、あるいは自然に終結した。
【０１６４】
さらに別の方法として、小ＲＮＡおよびテンプレートＤＮＡ（０．０５ｐｍｏｌ）を含む溶液（総量４μｌ）をハイブリダイーゼション緩衝液（１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で混合してハイブリダイズさせ、そして９５℃で５分間変性させた。続いて、６４℃で６時間インキュベートさせ、この溶液のうち４μｌを５ユニットのＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を加え、そして３７℃で２時間インキュベートさせた。反応を、ホルムアミド／ＥＤＴＡ／ＢＰＢ（０．０５％ ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）および２０ｍＭ ＥＤＴＡをホルムアミドに溶解する）または反応停止／ローディング染色液（０．０５％ （ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、０．０５％ キシレンシアノール（ＸＣ）および２０ｍＭ ＥＤＴＡをホルムアミドに溶解する）溶液を加えることによって終結させ、そして変性アクリルアミド電気泳動に供した。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いることによって、本発明者らは、配列特異的な特定長（ここでは１ヌクレオチド）の伸長を検出することができた。
【０１６５】
図３（ａ）にその結果を示す。図３（ａ）は、ポリメラーゼの有無、標的核酸として合成ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）の種類（１または２）、鋳型核酸（ＤＮＡ）の種類（１または２）を組み合わせ、配列特異的に標識が行われている様子を示す。示されるように、相補性がある組み合わせで、かつ、ポリメラーゼがある場合に、シグナルが顕著に観察された。その詳細な説明は以下の通りである。
【０１６６】
まず、「３３Ｐ］ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＣＴＰ（いずれもＡｍｅｒｓｈａｍ ＡＨ９５３９、５５．５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ＝１，５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を単一のチューブ中で混合してｄｄＮＴＰ混合物とする。
【０１６７】
反応は、１０×Ｍ緩衝液（１０×Ｍ緩衝液として、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ ＤＴＴを用いた。）３μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）０．５μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）０．５μｌ、およびＨ２Ｏ １０．５μｌを加えて１４．５μｌとし、これを９５℃で５分間反応させた後、６時間室温に置いた。これに０．５μｌの５Ｕ／μｌ クレノウフラグメント（東洋紡から入手可能）を加えて反応させ、そのうち３μｌに３μｌのｄｄＮＴＰ混合物を加えて、３７℃で３０分間反応させた。これに４μｌの反応停止／ローディング緩衝液またはＳＴＯＰ溶液を加え、９５℃で２分間で反応を止め、氷上に置いた。これを１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動（ゲル板１０ｃｍの物を用い、有効ゲル長は約８ｃｍであった。）を行って分離して解析を行った。電気泳動は、ＭｉｎｉＧｅｌ
４００Ｖ×３０分間でＰｒｅ Ｒｕｎを行い、その後４００Ｖ×３０分で実行した。その後、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラムにより検出した。
【０１６８】
上述のように、３２Ｐで標識したシグナルの位置は、もともとの２１ヌクレオチド長の小ＲＮＡよりもいくらか高く、一ヌクレオチドの取り込みが反映されていることが分かる。したがって、本発明は、核酸に配列特異的に直接標識を行うことが可能であることが証明された。
【０１６９】
（実施例２：検出条件の改良）
次に、より強いシグナル検出を可能にするために、本発明者らは、ハイブリダイゼーション条件および反応条件の検討を行った。実施例１において使用した３３Ｐ標識に代えて、３２Ｐ標識されたジデオキシアデノシン三リン酸（アマシャム・ファルマシア）を使用した。他の条件は実質的に同様のものを使用した。
【０１７０】
さらに、ハイブリダイゼーションおよび反応工程を、別々に行って、ハイブリダイゼーション効率の改善を試みた。
【０１７１】
鋳型ＤＮＡ１（ｍＧＦＰ、配列番号３および４）および小ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１）をハイブリダイゼーション緩衝液に混合し、９５℃で５分間変性させた。ついで、これを、７０℃〜５５℃で６時間インキュベートするかまたは室温に冷した。上記混合物のうち４μｌを取り出し、ジデオキシヌクレオチドと混合し、クレノウ酵素を加えて１時間インキュベートした。
【０１７２】
図３（ｂ）は、本発明におけるプライマー−鋳型複合体系性のための温度条件を検証した実験である。その詳細な説明は以下の通りである：
１０×ハイブリダイゼーション緩衝液８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）４０μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２０μｌ、およびＨ２Ｏ １２μｌを加えて総量８０μｌとし、これを１０本に分注して、これらを９５℃で５分間、および７５〜５５℃または室温で６時間反応させた。各々のチューブから４μｌをとり、新たな反応チューブに移し、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、［α−３２Ｐ］ｄｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ＝１１０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＰＢ１０２３３、特に言及しない限りこの比活性を使用する）４μｌおよびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させた。この混合物に８．５μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加えた。その後、９５℃で２分間置くことにより反応を止め、氷上に置き、この一部（例えば、１０μｌ）を１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥに）より電気泳動を行って分離して解析を行った。
【０１７３】
放射標識したオリゴヌクレオチドは、変性したアガロースゲルで分離した後に検出した。室温から約７５℃までが検出が容易な温度であり、最も強いシグナルは、６４℃付近で検出されたが、この範囲以外の温度でも観察は可能であった。
【０１７４】
したがって、熱変性および遅い冷却がハイブリダイゼーションに十分であったが、６４℃付近でのインキュベーションを長くすると、ハイブリダイゼーション効率が改善した。
【０１７５】
図３（ｃ）は、図３（ａ）の条件に加え、放射標識ｄｄＡＴＰの有無およびｄＮＴＰとしてＧ＋Ｔ（ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の有無を条件検討した実験である。その詳細な説明は以下の通りである：
１０×ハイブリダイゼーション緩衝液０．８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、およびＨ２Ｏを加えて総量８μｌとして、これを９５℃で５分間、および６４℃で３０分間反応させた。このうち、４μｌをとり、新たな反応チューブに移し、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、［α−３２Ｐ］（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、特に言及しない限りこの比活性を使用する））ｄｄＡＴＰ ４μｌおよびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させた。レーン７のみ、５ｍＭ ｄＴＴＰ１μｌ、５ｍＭ ｄＣＴＰ１μｌ、Ｈ２Ｏ ０．７５μｌ使用した。この混合物に８．５μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加えた。その後９５℃で２分間反応させて反応を終結させ、氷上に置いた。ついで、これを１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動を行って分離して解析を行う。実際に使用したプライマー−鋳型の組合せ、ポリメラーゼ、ｄｄＮＴＰなどは、図３（ｃ）に記載される。
【０１７６】
この反応は、使用されるポリメラーゼ、使用されるジデオキシアデノシン、使用されるプライマーおよび小ＲＮＡと使用される鋳型ＤＮＡとの間の相同性のレベルに密接に依存することを示す。テンプレート１におけるプライマー１のプライミングの後、第一のヌクレオチドはアデノシンであったので、強いシグナルが組み合わせで検出された。テンプレート２におけるプライマー２のものは、チミンであったので、プライマー１は、３２Ｐ標識ジデオキシアデノシンでは標識されない。しかし、デオキシＴＴＰおよびＧＴＰを付加すると、２４ヌクレオチド長付近に強いシグナルが現れ、そしてより高い分子量にさらなるシグナルが現れた。２４ヌクレオチド長のシグナルバンドは、プライマー２に３ヌクレオチド伸長（デオキシＴおよびデオキシＧおよびデオキシＡが付加した）による産物に対応し、そして上のバンドは、プライマーＲＮＡおよび鋳型ＤＮＡへの不正確なヌクレオチド取り込みおよび伸長の結果であると考えられる。鋳型１におけるＲＮＡ１のプライミングがジデオキシＡＴＰによって終結しない場合、反応は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｃ、Ｇを順番に取り込んでいく。
【０１７７】
ついで、本発明者らは、デオキシＧＴＰなしで、デオキシＡＴＰ、デオキシＴＴＰおよびデオキシＣＴＰを含む反応混合物を調製した。
【０１７８】
図３（ｄ）左は、標識ｄｄＡＴＰ無しで、標識ｄＣＴＰの存在下で、かつ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰの存在下で、ポリメラーゼの有無の実験効果を示す図である。その詳細な説明は以下の通りである：そのプライマーは、３２ＰデオキシＣＴＰで標識され、そしてデオキシＧＴＰがないことによって、５ヌクレオチド側への伸長が終結するはずである。しかし、この反応は、より高分子量のバンドを複数生じることから、プライマーＲＮＡおよび鋳型ＤＮＡに不適切なヌクレオチドが誤って取り込まれることを示す。
【０１７９】
図３（ｄ）における詳細な実験手順は以下の通りである：
１０×ハイブリダイゼーション緩衝液０．８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、およびＨ２Ｏを加えて総量８μｌとして、これを９５℃で５分間、および６４℃で３０分間反応させた。このうち、４μｌをとり、新たな反応チューブに移し、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、［α−３２Ｐ］（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、特に言及しない限りこの比活性を使用する））ｄＣＴＰ ４μｌ、ｄＡＴＰ １μｌ、ｄＴＴＰ １μｌ、およびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させた。この混合物に８．５μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加えた。これにイソプロパノール沈澱を行い、沈澱したペレットに１０μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加えた。次いで９５℃で５分間反応させ、氷上に置く。この一部（例えば、１０μｌ）を１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動を行って分離して解析を行う。レーン１は、クレノウフラグメント有を示し、レーン２は、クレノウフラグメントなし（代わりにＨ２Ｏ）を示す。
【０１８０】
図３（ｄ）右は、鋳型ＤＮＡにさらに１ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチドを付加したものの効果を確認する実験である。その詳細な説明は以下の通りである。
【０１８１】
まず、プライマー１（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）、鋳型のＤＮＡ１（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）、ＤＮＡ１−Ｇ（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）、またはＤＮＡ−１Ｇ１０（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）を使用する。反応は、１０×ハイブリダイゼーション緩衝液０．８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌに３．２μｌのＨ２Ｏを加えて８μｌとして９５℃５分、６４℃３０分で反応させた。このうち４μｌに、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレのウフラグメント０．５μｌ、および［α−３２Ｐ］ｄｄＡＴＰ ４μｌ、およびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させる。これに８．５μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加える。これを１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動を行って分離して解析を行った。
【０１８２】
したがって、本発明者らは、小ＲＮＡによってプライミングされるＤＮＡ合成によって、小ＲＮＡを標識することができる。反応は、配列特異的であり、そして標識されたジデオキシヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼの存在に依存する。標識されたヌクレオチドは、変性アクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによって容易に検出することができた。ジデオキシＡＴＰを用いて、標識された小ＲＮＡの長さを決定することができる。
【０１８３】
小ＲＮＡでプライミングされた反応は、ジデオキシヌクレオチドの取り込みによって直接終結させる（本明細書中では「プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法」とも呼ばれる）。プライマー停止の検出限界を評価するために、合成した小ＲＮＡの１０倍系列希釈物を作製し、これを上記のように標識した。取り込まれていないジデオキシＡＴＰに由来するバックグラウンドを減少させるために、イソプロパノール沈澱を行い、その後、電気泳動を行った。プライマー停止法を用いると、本発明者らは、少なくとも５×１０１８分子（５アットモル）の小ＲＮＡを、一晩曝露することによって検出することができた。これは、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはノーザンブロッティングに基づく従来の方法よりも、顕著に高い。
【０１８４】
（実施例３：ｓｉＲＮＡでの検証）
プライマー停止法の可能性をさらに検証するために、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｅｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を用いて、上記実施例と同様の実験を行った。
【０１８５】
翻訳後にサイレンス化されるルシフェラーゼ遺伝子を用いてトランスジェニックタバコからこのｓｉＲＮＡが検出された。以下にその手順を示す。
【０１８６】
ｓｉＲＮＡは、導入遺伝子が転写後型遺伝子不活性化（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）によって不活性化されている生物（動物および植物を含む）で見出されていることが知られている。外来遺伝子がＲＮＡサイレンシングによって不活性化されている生物のモデルとして、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６０：３４３−３５２（２００２）に記載されているルシフェラーゼ遺伝子を高発現しているタバコ植物（ＮＷ７−２４−４）および不活性化されているタバコ植物（ＮＷ７−１３−１０）を用いた。鋳型ＤＮＡとして、導入されたルシフェラーゼ遺伝子と同じ配列を持つプラスミドｐＴ３／Ｔ７−ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いた。このプラスミドを１箇所だけ切断する制限酵素ＳｍａＩで切断し、エタノール沈澱によって回収したものを鋳型ＤＮＡとして用いた。制限酵素処理によって閉鎖環状のプラスミドは直鎖状となり、熱変性によって容易に一本鎖へと解離した。
【０１８７】
野生型のタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｓｕｍｓｕｎ ＮＮ）および上記の形質転換植物から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のトライゾール試薬を用いてトータルＲＮＡを調製した。ＲＮＡの抽出および調製方法は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示書およびマニュアルに従った。鋳型ＤＮＡ０．５ｐｍｏｌと、調製したトータルＲＮＡ１０μｇの１０×ハイブリダイゼーション緩衝液とを混合し、滅菌水を加えて合計で８μｌとして、９５℃で熱変性後、６４℃で９０分間ハイブリダイゼーションした。このうち、４μｌをとり、１０×クレノウ反応液１．２５μｌ、クレノウフラグメント（５ユニット／μｌ）０．５μｌ、［α−３２Ｐ］ｄｄＡＴＰ ４μｌおよび滅菌蒸留水を２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させる。この反応物をイソプロパノール沈澱させ、沈澱したペレットに１０μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加える。これを、１５％変性アクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、分離して解析を行う。
【０１８８】
Ｌｕｃ遺伝子が、不活性化植物からは２１−２５ヌクレオチド長の部分に強いシグナルが検出されるが、野生型植物およびｌｕｃ植物を高発現している植物からはシグナルが検出されない。
【０１８９】
（実施例４：ｍｉＲＮＡでの検証）
さらに、ｍｉＲＮＡでも同様の実験を行った。本実施例では、ｍｉＲＮＡとして、配列番号６〜９に示されるようなｍｉＲＮＡを選択し、プライマー停止法およびプライマーランオフ法によって検出することができるかどうかを検証した。
【０１９０】
植物ｍｉＲＮＡに相補的な鋳型ＤＮＡおよびマウスｍｉＲＮＡに相補的な鋳型ＤＮＡを合成した。合成は、実質的に上記実施例にしたがって行った。このＤＮＡは、５’末端にＴ残基をさらに含み、それにより、３’末端におけるジデオキシＡＴＰによる標識が可能になった。
【０１９１】
標識および検出については、実質的に上記実施例の手順に従って行った。使用したＲＮＡが配列番号６から９のものであったこと以外は、上記実施例に従って実験を行ってプライマー停止法を行った。
【０１９２】
図４にその結果を示す。図４は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）の検出限界の測定およびプライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）による生物からのｍｉＲＮＡの検出である。
【０１９３】
図４の左図は以下の通りである。
【０１９４】
左図は、図３（ａ）同様、合成ＲＮＡの希釈系列を検出したものである。右側２つは植物から調製したトータルＲＮＡに含まれるｍｉＲＮＡを検出したものである。
Ｌｕｃ：ネガティブコントロールとして植物のコードしないルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃの配列の一部を鋳型とした反応。
ｍｉＲ１７１：植物内在性のｍｉｃｒｏ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるｍｉＲ１７１と相補的な配列＋一塩基のＴを含む配列を用いたプライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法である。このようにして、植物内在性のｍｉＲＮＡを検出することができる。
【０１９５】
以下にタバコｍｉＲＮＡ検出の方法を実施する。
【０１９６】
タバコトータルＲＮＡをＴｒｙｓｏｌ法により５μｇ抽出する。鋳型としてｍｉＲ１７１またはＬＵＣを使用する。
【０１９７】
反応は、１０×ハイブリダイゼーション緩衝液０．８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、およびＨ２Ｏを加えて８μｌとし、９５℃で５分間、および６４℃で３０分間反応させた。このうち、４μｌをとり、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、［α−３２Ｐ］ｄｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、特に言及しない限りこの比活性を使用する）４μｌ、およびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させる。この混合物に８．５μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加える。これにイソプロパノール沈澱を行い、沈澱したペレットに１０μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加える。これを１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動を行って分離して解析を行う。
【０１９８】
図４に示されるように、小ＲＮＡを１／１０に系列希釈して検出感度を求めたところ、本発明の方法では、少なくとも５アットモル（５×１０−１８）まで検出することができることが明らかになった。
【０１９９】
プライマー停止法を用いて、本発明者らは、生物の内因性ｍｉＲＮＡを検出することができた。
【０２００】
次に、プライマーランオフ法が機能するかどうかを確認した。
【０２０１】
使用したマウスは、Ｃ５７マウス雌であり、このマウスの脳および心臓から単離したＲＮＡを用いた。
【０２０２】
ＲＮＡとして、コンサートＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。鋳型として、ＤＮＡ１Ｇ（＝５’−ＧＧＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＴＣ ＡＡＴ ＣＡ−３’（配列番号１２）；ＧＦＰセンスＤＮＡのネガティブコントロール）、ｍｉＲ１６Ｇ（マウスｍｉＲＮＡ検出用のＭｍｕｓ ｍｉＲ１６＝ＧＣＧ ＣＣＡ ＡＴＡ ＴＴＴ
ＡＣＧ ＴＧＣ ＴＧＣ ＴＡＴ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＧＣ ＧＣＧ ＧＣＴ ＣＡＡ
ＴＣＡ−３’（配列番号１３））を用いた。
【０２０３】
反応は、１０×ハイブリダイゼーション緩衝液０．８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ、およびＨ２Ｏを適宜加えて８μｌとし、これらを９５℃で５分間、および６４℃で３０分間反応させた。このうち、４μｌをとり、新たな反応チューブに移し、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＡＡ０００５、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）４μｌおよびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させた。これをエタノール沈澱し、得られたペレットに２０μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加えた。その後、これを１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動（プレランを４００Ｖ×３０分、実行は４００Ｖで３０分間）を行って分離して解析を行った。その結果は図４Ｂに示す。図４Ｂは、プライマーランオフ法でマウスのｍｉＲＮＡを確認することができることを示す。
【０２０４】
このように、本発明によって小ＲＮＡを検出するための新規方法（プライマー停止法）が提供される。これは、単純であるが、高感度であり、あまり時間がかからない方法である。本発明の方法は、従来のノーザンブロットなどに代わって、汎用される可能性を秘めている。
【０２０５】
（実施例５：他の条件改良の検討）
感度を高めるために、ハイブリダイゼーション−反応系を改良し、３２Ｐ標識ジデオキシＡＴＰを用いた実験を行った。主にハイブリダイゼーションの温度の検討を行った。
【０２０６】
少容量のハイブリダイゼーション緩衝液中で合成ＤＮＡ１およびＲＮＡ１（それぞれ１ｐｍｏｌ）を変性した後、７５℃から５５℃で保温もしくはそのまま常温に戻すことでハイブリダイゼーションを行わせた。ハイブリダイズしたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、ジデオキシＡＴＰを含に他のヌクレオチドを含まないクレノウ緩衝液（１０倍溶液を、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０，１Ｍ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、および０．５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを調製し、１０倍希釈する）に加えＤＮＡ合成反応を行わせた。６５℃前後で保温した場合にもっとも高い取り込みが認められるが、緩やかに常温に戻すことでも強い放射活性の取り込みが認められる。
【０２０７】
（プライマー停止法のコントロール実験）
上記により少量での変成−６４℃でのハイブリダイゼーション後、上に示す条件でＤＮＡ合成反応を行わせた。
【０２０８】
（ｉ）３２Ｐの取り込みは、使用されるポリメラーゼ、使用される小ＲＮＡ，使用される鋳型ＤＮＡ，使用されるｄｄＡＴＰおよび使用されるＤＮＡとＲＮＡとの間の相同性に依存している。入れたＲＮＡよりやや移動度の低い（高分子の）位置にバンドが見えることからも、一塩基の取り込みが起きていることが確認できた。
【０２０９】
（ｉｉ）ＤＮＡ２とＲＮＡ２の組み合わせの場合、ＲＮＡ２の次に取り込まれるべき塩基がＴＴＰで有るためにｄｄＡＴＰのみでは取り込みは起きなかった。しかし、ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰを加えることで４塩基先のＡまでＤＮＡ合成反応が進行するため、取り込みを見ることができた。この場合、４塩基の合成反応を反映してより高分子の位置にバンドが現れる。また、非特異反応も多少認められるが、検出には影響がないようである。非特異
的な検出は、例えば、このようにある反応の結果（バンド）が、鋳型と標的との相互作用に依存したものであることを示すコントロールとして使用することによって証明することができる。従って、ＤＮＡ１−ＧおよびＤＮＡ１−Ｇ１０のように二種類の長さを使用することによって、特異的反応であることを確認することが可能である。
【０２１０】
（ｄＣＴＰによるＲＮＡ標識反応）
（ｉｉｉ）ＤＮＡ１−ＲＮＡ１の組み合わせでは、次に続く塩基はＡ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，Ａ，およびＴであり、３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ（いずれもジデオキシではなくデオキシ）存在下で反応させることにより、（ｄＧＴＰが存在しないため）３２Ｐ−ｄＣＴＰを取り込みつつ６塩基先で反応が停止する事が期待されたが、（おそらく非特異的な伸長のため）比較的高分子の位置に取り込みがみられた。
【０２１１】
（ＤＮＡ１−ＲＮＡ１の組み合わせにｄｄＡＴＰを用いたプライマー停止反応）
（ｉｖ）ＤＮＡ１Ｇ−ＲＮＡ１の組み合わせで、ｄｄＡＴＰの代わりにｄＣＴＰを用いた。ＤＮＡ１Ｇは、ＲＮＡ１と相補的な配列＋一塩基のＧを有している。この反応では、ジデオキシヌクレオチドによる伸長停止は起きないが、Ｃを付加したところで鋳型が無くなるため、ポリメラーゼによる反応が停止した。
【０２１２】
（ｖ）ＤＮＡ１Ｇ１０−ＲＮＡ１の組み合わせで、ｄＣＴＰを用いた。ＤＮＡ１Ｇ１０は、ＲＮＡ１と相補的な配列＋１０塩基のＧ（５’−ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ Ｃ−３’（配列番号１４））を有している。この反応では、Ｃを１０塩基付加したところで鋳型が無くなるため、ポリメラーゼによる反応が停止した。
【０２１３】
期待通り、ＤＮＡ１Ｇを鋳型にした場合、ｄｄＡＴＰによるプライマー停止反応と同様１塩基付加されたと思われるバンドが検出され、ＤＮＡ１−Ｇ１０を用いた場合、さらに高分子のバンドが検出されることから、ターゲットとなる核酸と相補的な配列＋限定された長さの任意の塩基を持つｓｓＤＮＡを鋳型とすることで、ランオフ転写（ｒｕｎ−ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ではなく、ランオフ複製（ｒｕｎ−ｏｆｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）による長さを限定した標識が可能であることが判明した。
【０２１４】
（実施例６：別の標識方法）
上記の実施例に例示したプロトコールは、放射標識したヌクレオチドベースの方法を示したが、別の標識方法によっても、実現することができる。この実施例では、蛍光標識したヌクレオチドによって標識した小ＲＮＡを用いて検出を行った。このような蛍光標識したヌクレオチドによる標識を用いれば、キャピラリー電気泳動および関連技術においても使用することが可能である。したがって本発明は、配列決定技術においても応用することができ、さらに、配列特異的な直接の標識を行うことから、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドにおいて、種々の応用が考えられることになる。
【０２１５】
ここでは、蛍光標識を用いた場合を実証する。
【０２１６】
まず、１０×ハイブリダイゼーション緩衝液（１．５Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ）０．８μｌ；プライマー１（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ；鋳型ＤＮＡ１ａ（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ；およびＨ２Ｏ３．２μｌを加えて８μｌの反応液とする。これを９５℃、５分間反応させ、その後６４℃で３０分間反応させる。これに、８．５μｌの反応液（１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、２０ｍＭ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ １．２５μｌ、Ｈ２Ｏ ４μｌ）を加え、３７℃で６０分間インキュベートする。これに、８．５μｌの反応終結／ローディング染色液（０．０５％（ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、０．０５％ キシレンシアノール（ＸＣ）および２０ｍＭ ＥＤＴＡをホルムアミドに溶解する）を加え、９５℃で２分間で反応させた後、氷上に冷やす。これを、１５％ ＰＡＧＥ上で電気泳動して分離して、スキャンする（ＦＬＡ−８０００、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）。
【０２１７】
これによって、蛍光色素を用いた場合でも、本発明の方法が実施できることが分かる。
【０２１８】
（実施例７：逆転写酵素を用いた実験）
上記の実施例に例示したプロトコールは、逆転写酵素を用いた場合でも、実現することができる。
【０２１９】
ここでは、逆転写酵素（東洋紡Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ Ｍｉｎｕｓ＝コード番号ＲＴＮ−１０１）を用いた場合を実証する。プラスミドとしてｐＴ３／Ｔ７−ＬＵＣ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を利用する。このプラスミドをＳｍａＩ消化を行い消化産物を生成させる。これにより、Ｔ３のとなりにＬＵＣが並列する平滑末端の産物が生成する。この後、インビトロで転写反応を行う。転写反応は、５×反応緩衝液 １０μｌ；各々１０ｍＭのｒＮＴＰ；Ｔ３ポリメラーゼ（東洋紡コード番号ＳＣ６００１１１） １μｌ：およびＤＮＡ２μｌで５０μｌとして３７℃で３０分間反応を進行させる。この後エタノール沈澱を個々内、１０μｌのＴＥ（組成：１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ含有１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液，ｐＨ９．０）中に溶解する。これを鋳型として使用する。この後、１０×ハイブリダイゼーション緩衝液；鋳型核酸（ＬＵＣ ＲＮＡ）２μｌ；タバコ（野生型植物、ＬＵＣ高発現植物またはＬＵＣサイレンシング植物）トータルＲＮＡ ５μｌを合計８μｌとして、９５℃で５分間反応させ、その後６４℃で３０分間反応させる。このうち４μｌに１０×Ｍ−ＭＬＶ 逆転写酵素緩衝液（東洋紡から入手可能。５×反応緩衝液は２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および５０ｍＭ ＤＴＴ、適宜希釈する。）１．２５μｌ；Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（入手先）０．５μｌ；ＲＮａｓｅインヒビター１μｌ；［α−３２Ｐ］ｄｄＡＴＰ ４μｌ；Ｈ２Ｏ １．２５μｌを加え、３７℃で６０分間反応を行う。これに８．５μｌの停止ローディング緩衝液を加え、イソプロパノール沈澱を行い、１５％ＰＡＧＥにて電気泳動分析を行う。これによって、逆転写酵素を用いた場合でも、本発明の原理が応用できることが明らかになる。
【０２２０】
（実施例８：アレイの構築）
３’末端に、プローブとなる特異的配列を含むＤＮＡを合成し、２００ｐｍｏｌ／μｌに調製する。このＤＮＡを１μｌとりナイロンメンブレンに固定させる。
【０２２１】
ｍＲＮＡ（２μｇ）またはトータルＲＮＡ（４０μｇ）を滅菌済みＭｉｌｌｉＱ水で０．４８ｍｌに調製する。このＲＮＡ溶液を、ナイロンメンブレンを入れたハイブリダイゼーションバッグに注入し、６４℃で３０分間アニーリングさせた後、４２℃で１０分間インキュベートする。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（２００単位／μｌ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）４０μｌ、５×Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ反応緩衝液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）１５０μｌ、ＤＴＴ（０．１Ｍ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）８０μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを各々４０ｍＭ、ｄＣＴＰを２０ｍＭ、Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）４０μｌ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（２０ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）４０μｌを混合した溶液を作製する。この溶液を、上記ハイブリダイーゼションバッグ中に注入し、暗黒下、４２℃で２時間３０分間反応させる。メンブレンを、遮光下で一次洗浄液（０．２％ ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ（１５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ７．０），６５℃）で１回洗浄し、二次洗浄液（０．２％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ、６５℃）で２回洗浄する。水分を除去した後、蛍光スキャナー（ＦＬＡ−８０００、ＦＵＪＩＦＩＬＭ製)を用いて、Ｃｙ５の蛍光を検出およ
び測定する。
【０２２２】
これにより、プライマーアレイ法であっても、本発明が機能することが理解される。
【０２２３】
特定の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２２４】
本発明は、核酸の検出を簡便に行うことを実現することから、核酸の検出が必要とされる任意の場面（例えば、各種診断）において有用であることから、農業、生命科学が関与する一般産業、医薬品製造業など種々の場面において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２２５】
（配列表の説明）
配列番号１：ＲＮＡ１
配列番号２：ＲＮＡ２
配列番号３：ＤＮＡ１（ｍ−ＧＦＰ５−ＥＲ−Ｓ ７２５−８１２）
配列番号４：ＤＮＡ２ （ｍ−ＧＦＰ５−ＥＲ−Ｓ ５７２−６７０）
配列番号５：ＬＵＣ （２１１３−ＬＵＣ ２６０３−２７０２）
配列番号６：Ｎｔａｂ ｍｉＲ１７１
配列番号７：Ｎｔａｂ ｍｉＲ１６７
配列番号８：Ｍｍｕｓ ｍｉＲ１８１ Ｔ
配列番号９：Ｍｍｕｓ ｍｉＲ１６ Ｔ
配列番号１０：ＧＦＰ５−ＥＲ Ｇ１０＋７８６−８１２
配列番号１１：ＧＦＰ５−ＥＲ Ｇ＋７８６−８１２
配列番号１２：ＤＮＡ１−Ｇ
配列番号１３：マウスｍｉＲＮＡ検出用のＭｍｕｓ ｍｉＲ１６
配列番号１４：ＤＮＡ１−Ｇ１０
配列番号１５：ＲＮＡ１−Ｃ（ＤＮＡ１−Ｇ（配列番号１２）を使用した増幅産物）
配列番号１６：ＲＮＡ１−Ｃ１０（ＤＮＡ１−Ｇ１０（配列番号１４）を使用した増幅産物）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の標識方法および標識された核酸の生産方法、ならびにそれを利用した核酸検出方法、ならびにそれらを利用するキットおよびシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を検出するために種々の標識が使用されている。しかし、このような標識のほとんどは、検出対象自体を標識するというよりは、検出対象に特異的に相互作用する分子を標識する。したがって、手順がどうしても煩雑になるという欠点がある。
【０００３】
１９９０年代に入ってから、従来から知られていたｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡに加えて、新たな種類のＲＮＡの存在が明らかになってきた。そのような新たに発見されたＲＮＡの種類には、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどの小さなＲＮＡがある。このような小さなＲＮＡは、生体内で重要な役割を果たすことが近年解明されており、その検出技術の開発は、そのような解明を促進することにつながる。したがって、種々のＲＮＡなどの核酸を簡便に検出する技術に対する大きな要望が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、簡便に核酸（特に小ＲＮＡなど）を検出することができる技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の開示）
本発明者らは、ハイブリダイズ技術をうまく応用した結果、小ＲＮＡでも容易に標識しおよび／または検出することができることができることを予想外に開発したことによって、本発明を完成させ、上記課題を解決した。
【０００６】
小ＲＮＡは、転写、翻訳およびｍＲＮＡ安定性を含む遺伝子調節における重要な役割を果たす。また、染色体構造の維持にも重要な役割を担っていると考えられている。さらに、小ＲＮＡは、侵入してきたウイルスＲＮＡを分解または自己トランスポゾンの不活性化といった、宿主細胞における核酸レベルでの自己防御システムの主要因子としても機能している。したがって、小ＲＮＡは、動物界、植物界の研究において、ますます重要になってきている分野である。しかし、その小さな分子量（短いヌクレオチド長、および乏しい存在量）がゆえ、小ＲＮＡの検出方法は複雑であり、効率も悪い。本発明において、小ＲＮＡを、ＤＮＡ鋳型およびＤＮＡポリメラーゼを用いてジデオキシヌクレオチドにより配列特異的に標識する方法を提供する。小ＲＮＡは、標的となる小ＲＮＡに実質的に相補的な鋳型ＤＮＡとハイブリダイズさせる。ついで、このＤＮＡ−ＲＮＡの複合体を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントなどのポリメラーゼおよび３２Ｐ標識などで標識されたデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドとともにインキュベートする。小ＲＮＡは、ＤＮＡ合成のプライマーとして働き、反応が、このジデオキシヌクレオチドの取り込みによって終結される。これは、プライマー停止法（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）と呼ぶ。標識されたＲＮＡは、変性ゲル電気泳動での分離およびオートラジオグラフィーによって検出することができる。標識は、配列特異的に行われ、ＤＮＡポリメラーゼの存在不存在にに完全に依存する。プライマー停止法を用いれば、アット（１０−１８）モルレベルの合成ＲＮＡおよび生体ＲＮＡ（例えば、マウスのｍｉＲＮＡ、トランスジェニック植物のｓｉＲＮＡなど）を検出することができる。検出限界を探る実験などの検出目的には、ＧＦＰ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ｍｉＲ１６、ｍｉＲ１７１などの遺伝子を用いることができる。
【０００７】
したがって、本発明は、以下を提供する。
（１）
標識が導入された核酸を生産するための方法であって、以下の工程：
Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその鋳型核酸は、その標識対象核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標識対象核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）その標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、その標識対象核酸に少なくとも１つのその標識されたヌクレオチドがその鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；および
Ｄ）その伸長反応の後、生成した混合物から伸長したその標識対象核酸を取り出す工程、
を包含する、方法。
（２）
上記標識対象核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの組み合わせである、項目１に記載の方法。
（３）
上記標識対象核酸は、ＲＮＡである、項目１に記載の方法。
（４）
上記標識対象核酸は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、項目１に記載の方法。
（５）
上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸全部と相補的である配列を含む、項目１に記載の方法。
（６）
上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸の両方の先端において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、項目１に記載の方法。
（７）
上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸の少なくとも一方の先端から少なくとも約１０ヌクレオチド分長いヌクレオチド配列を有する、項目１に記載の方法。
（８）
上記鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側に位置している、項目１に記載の方法。
（９）
上記鋳型核酸の３’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側にあるその鋳型核酸のその長いヌクレオチド配列とは異なる長さを有する、項目６に記載の方法。
（１０）
上記鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列はその鋳型核酸の５’末端側に位置し、上記標識対象核酸の５’末端部分はその鋳型核酸の３’末端よりも長い、項目１に記載の方法。（１１）
上記鋳型核酸の３’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列より、識別可能な長さだけ長い、項目６に記載の方法。
（１２）
上記識別可能な程度の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである、項目１１に記載の方法。
（１３）
上記核酸合成酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、項目１に記載の方法。
（１４）
上記標識されたヌクレオチドは、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、酵素および化学発光からなる群より選択される標識で標識されたヌクレオチドを含む、項目１に記載の方法。
（１５）
上記標識されたヌクレオチドは、放射能を含む、項目１に記載の方法。
（１６）
上記伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、変性工程を包含する、項目１に記載の方法。
（１７）
さらに、未反応物を除去する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（１８）
上記未反応物の除去は、エタノール沈澱またはゲル濾過クロマトグラフィーにより達成される、項目１７に記載の方法。
（１９）
上記未反応物の除去工程は、伸長した上記標識対象核酸を分離する工程をさらに包含する、項目１７に記載の方法。
（２０）
上記分離は、電気泳動またはクロマトグラフィーにより達成される、項目１９に記載の方法。
（２１）
上記伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、上記標識を検出する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（２２）
上記検出は、上記標識を直接または間接的に検出することを包含する、項目２１に記載の方法。
（２３）
伸長した上記標識対象核酸を分離する工程をさらに包含する、項目２１に記載の方法。
（２４）
上記分離の際に、上記検出が行われる、項目２３に記載の方法。
（２５）
上記分離および検出は、オートラジオグラフにより達成される、項目２４に記載の方法。（２６）
さらに、上記伸長反応を停止させる工程を包含する、項目１に記載の方法。
（２７）
上記停止工程は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ法）またはプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法より達成される、項目２６に記載の方法。
（２８）
上記標識対象核酸は、プローブとして使用される、項目１に記載の方法。
（２９）
上記標識対象核酸は、検出対象となる核酸である、項目１に記載の方法。
（３０）
上記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、項目１に記載の方法。
（３１）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、３’末端が改変されている、項目１に記載の方法。
（３２）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされている、項目１に記載の方法。
（３３）
上記改変は、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変である、項目３０に記載の方法。
（３４）
上記鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされている、項目１に記載の方法。
（３５）
核酸に標識を導入するための方法であって、以下の工程：
Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに、その標識対象核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標識対象核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；および
Ｃ）その標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行い、その標識対象核酸に少なくとも１つのその標識されたヌクレオチドがその鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程、
を包含する、方法。
（３６）
標的核酸を検出するための方法であって、以下の工程：
Ａ）その標的核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標的核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその標的核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標的核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標的核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）その標的核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程；および
Ｄ）その標的核酸に対応する伸長産物が存在するか検出する工程であって、その伸長産物の存在は、その標的核酸の存在の指標である、工程、
を包含する、方法。
（３７）
上記伸長反応の後、生成した混合物からその標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長産物とを分離する工程をさらに包含する、項目３６に記載の方法。
（３８）
上記標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの組み合わせである、項目３６に記載の方法。
（３９）
上記標的核酸は、ＲＮＡである、項目３６に記載の方法。
（４０）
上記標的核酸は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、項目３６に記載の方法。
（４１）
上記鋳型核酸は、上記標的核酸全部と相補的である配列を含む、項目３６に記載の方法。
（４２）
上記鋳型核酸は、上記標的核酸の両方の先端において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、項目３６に記載の方法。
（４３）
上記鋳型核酸は、上記標的核酸の少なくとも一方の先端から少なくとも約１０ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、項目３６に記載の方法。
（４４）
上記鋳型核酸の長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側に位置する、項目３６に記載の方法。
（４５）
上記鋳型核酸の３’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列とは異なる長さを有する、項目４２に記載の方法。
（４６）
上記鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側に位置し、上記標識対象核酸の５’末端部分は、その鋳型核酸の３’末端よりも長い、項目３６に記載の方法。
（４７）
上記鋳型核酸の３’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列は、その鋳型核酸の５’末端側にあるその鋳型核酸の上記長いヌクレオチド配列より、識別可能な長さだけ長い、項目４２に記載の方法。
（４８）
上記識別可能な程度の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである、項目４７に記載の方法。
（４９）
上記核酸合成酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、項目３６に記載の方法。
（５０）
上記標識されたヌクレオチドは、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、酵素および化学発光からなる群より選択される標識で標識されたヌクレオチドを含む、項目３６に記載の方法。
（５１）
上記標識されたヌクレオチドは、放射能を含む、項目３６に記載の方法。
（５２）
上記伸長産物と鋳型核酸複合体の分離は、変性により達成される、項目３６に記載の方法。
（５３）
上記未反応物は、エタノール沈澱および濾過によりその未反応物を除去することによって、上記伸長産物と分離される、項目３６に記載の方法。
（５４）
上記検出は、上記標識を直接または間接的に検出することを包含する、項目３６に記載の方法。
（５５）
上記標的核酸に対応する伸長産物を取り出す工程をさらに包含する、項目３６に記載の方法。
（５６）
上記分離は、電気泳動またはクロマトグラフィーによる、項目３７に記載の方法。
（５７）
上記分離の際に、上記検出が行われる、項目３７に記載の方法。
（５８）
上記分離および検出は、オートラジオグラフによって達成される、項目５７に記載の方法。
（５９）
さらに、上記伸長反応を停止させる工程を包含する、項目３６に記載の方法。
（６０）
上記停止工程は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法またはプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法により達成される、項目５９に記載の方法。
（６１）
上記検出は、伸長された部分の配列に基づいて行われる、項目３６に記載の方法。
（６２）
上記検出は、上記伸長された標的核酸に特異的に結合する薬剤を用いて行われる、項目３６に記載の方法。
（６３）
上記検出は、上記標識されたヌクレオチドに起因する標識と、上記薬剤に起因する標識とを検出することによって行われる、項目６２に記載の方法。
（６４）
上記伸長された標的核酸に特異的に結合する薬剤は、伸長していない上記標的核酸にも、上記標識されたヌクレオチドにも結合しない、項目６２に記載の方法。
（６５）
上記検出は、上記伸長された標的核酸の長さに基づき行われる、項目３６に記載の方法。（６６）
上記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、項目３６に記載の方法。
（６７）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、３’末端が改変されている、項目３６に記載の方法。
（６８）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされる、項目３６に記載の方法。
（６９）
上記改変は、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変である、項目６６に記載の方法。
（７０）
上記鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされている、項目３６に記載の方法。
（７１）
標識が導入された核酸を生産するためのキットであって、以下の手段：
Ａ）標識の導入の対象となる標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその標的核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、鋳型核酸；および
Ｂ）核酸合成酵素；
を備える、キット。
（７２）
Ｃ）標識されたヌクレオチドをさらに備える、項目７１に記載のキット。
（７３）
生成した混合物からその標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長された伸長産物とを分離する手段をさらに備える、項目７２に記載のキット。
（７４）
標識されたヌクレオチドを検出する手段をさらに備える、項目７２に記載のキット。
（７５）
さらにコントロールとなる標準標的核酸を備える、項目７１に記載のキット。
（７６）
上記標準核酸は、上記鋳型核酸を同定するための核酸および上記標識対象核酸を同定するための核酸からなる群より選択される核酸を含む、項目７５に記載のキット。
（７７）
上記核酸合成酵素の反応のための試薬をさらに含む、項目７１に記載のキット。
（７８）
上記標識されたヌクレオチドは、核酸合成酵素の反応を停止する作用を有する、項目７２に記載のキット。
（７９）
支持体をさらに含み、上記鋳型核酸は、その支持体に固定される、項目７１に記載のキット。
（８０）
上記支持体は、ガラスまたはメンブレンである、項目７９に記載のキット。
（８１）
上記支持体に固定される上記鋳型核酸は、アレイ状に配置される、項目７９に記載のキット。
（８２）
上記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、項目７１に記載のキット。
（８３）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、３’末端が改変されている、項目７１に記載のキット。
（８４）
上記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされる、項目７１に記載のキット。
（８５）
上記改変は、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変である、項目８２に記載のキット。
（８６）
上記鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされている、項目７１に記載のキット。
（８７）
標識が導入された核酸が固定された支持体を生産するための方法であって、以下の工程：
Ａ）支持体に固定された標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその標識対象核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標識対象核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）その標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、その標識対象核酸に少なくとも１つのその標識されたヌクレオチドがその鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；
Ｄ）その伸長反応の後、生成した混合物から伸長したその標識対象核酸を含む支持体を取り出す工程、
を包含する、方法。
（８８）
上記取り出し工程は、その支持体を洗浄して反応物を除去することによって達成される、項目８７に記載の方法。
（８９）
上記取り出し工程は、その支持体から標識を除去することによって達成される、項目８７に記載の方法。
（９０）
標的核酸を検出するためのキットであって、以下：
Ａ）その標的核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその標的核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、鋳型核酸；
Ｂ）核酸合成酵素；
Ｃ）標識されたヌクレオチド；
Ｄ）その標識されたヌクレオチドを検出する手段、
を備える、キット。
（９１）
生成した混合物からその標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長された伸長産物とを分離する手段をさらに備える、項目９０に記載のキット。
（９２）
上記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、項目９０に記載のキット。
（９３）
核酸が固定された支持体上で標的となる核酸を検出するための方法であって、以下の工程：
Ａ）支持体に固定された鋳型核酸および標識対象核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその鋳型核酸は、その標識対象核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標識対象核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）その標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、その標識対象核酸に少なくとも１つのその標識されたヌクレオチドがその鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；
Ｄ）その伸長反応の後、伸長したその標識対象核酸が存在するかどうかを決定する工程であって、伸長したその標識対象核酸の存在は、標的となる核酸が存在していることを示す、工程、
を包含する、方法。
（９４）
上記標識対象核酸は、ｓｉＲＮＡである、項目９３に記載の方法。
（９５）
上記支持体は、アレイである、項目９３に記載の方法
（９６）
核酸が固定された支持体において、標的となる核酸を検出するための方法であって、以下の工程：
Ａ）その支持体に固定された標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、その鋳型核酸は、その標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらにその標識対象核酸の相補的な部分とその鋳型核酸とをハイブリダイズさせたときその標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）その標識対象核酸を、その鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）その標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、その標識対象核酸に少なくとも１つのその標識されたヌクレオチドがその鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；
Ｄ）その伸長反応の後、伸長したその標識対象核酸が存在するかどうかを決定する工程であって、伸長したその標識対象核酸の存在は、標的となる核酸が存在していることを示す、工程、
を包含する、方法。
（９７）
上記鋳型核酸は、ｍＲＮＡである、項目９６に記載の方法。
（９８）
上記支持体は、アレイである、項目９６に記載の方法。
【０００８】
以下に、好ましい実施形態によって本発明を説明する。本発明の実施形態は、本発明の説明および当該分野における周知慣用技術に基づいて適宜実施することができることが、当業者に理解される。本発明が奏する作用および効果は、当業者に容易に理解され得る。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によって、標識対象核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を、鋳型核酸（例えば、プライマー停止法では、鋳型ＤＮＡであり、プライマーアレイ法では、標的核酸である）とハイブリダイズさせたのち、標識対象核酸をプライマーとするＤＮＡ合成を行わせる。このＤＮＡ合成反応で新規に付加されるべきヌクレオチドを標識化合物とすることで、標的核酸を標識する方法が提供される。この場合において、標識された化合物が、ＤＮＡ合成に新たに加えられるヌクレオチドとして使用される。このようにして、標的核酸を標識するための方法が提供され得る。標的核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡを問わないが、特に、本発明は、短鎖ＲＮＡの標識法として有用性が高い。標識は、放射性同位体、蛍光色素、などが考えられるが、本明細書では放射性同位体を用いた方法で実証されている。標識された核酸は、その標識化合物を指標として検出できる。放射性標識の場合は、オートラジオグラフィーなどが使用され得る。標識の為のＤＮＡ合成反応は、ジデオキシチェーンターミネーション法によって限定された長さで停止させることができる。ジデオキシチェーンターミネーション法による方法をプライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法と呼ぶ。鋳型ＤＮＡは、標的核酸と相補的な配列部分を持つ必要があるが、標的核酸がｍｉＲＮＡの様な、配列が既知の小ＲＮＡの場合、前後の長さおよび配列は任意に選択する事ができる。これを利用して、標的核酸をプライマーとしたＤＮＡ合成反応を限定した長さにとどめることができる（限定されたＤＮＡ合成）。これをプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法と呼ぶ。
【００１０】
標識された標的核酸は、ゲル電気泳動によって分離後に検出する事ができる。限定されたＤＮＡ合成反応とゲル電気泳動を組み合わせることで、標的核酸の長さ（塩基対）を知ることができる。この技術は、蛍光標識とキャピラリーシークエンサーを用いた検出法への応用も考えられる。この技術は、植物、動物、菌類を問わず、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの検出法として応用できる。短鎖ＲＮＡに限定せず、一般的な核酸の配列を特異的に標識する方法として応用できる。例えばｓｓＤＮＡの配列特異的な末端標識が可能である。ｉｎ ｓｉｔｕラベリングも可能である。その他の種々の応用が可能である。
【００１１】
蛍光色素のヌクレオチドへの取り込みのための技術としては、例えば、アミノ基導入試薬（２−（４−モノメトキシトリチルアミノ）エチル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイトなど）、あるいはチオール基導入試薬（（Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘキシル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイト、（Ｓ−トリチル−２−メルカプトエチル）−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホルアミダイトなど）などを用いてヌクレオチドに直接標識する方法；核酸中の蛍光色素の標識部位のリン酸結合を官能基を有するホスホン酸結合に置き換えてリンカーの導入を行い、この官能基を利用して蛍光剤を結合させる方法（特開昭６１−４４３５３）などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００１２】
また、本発明の方法は、新規な核酸検出法であり、核酸を配列特異的に直接標識できる点に新規性・有用性がある。また、ヌクレオチドや鋳型の選択により標識される長さを規定（１〜数塩基に限定）する事ができる。特に、近年注目されているＲＮＡ サイレンス化（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）に関与するｓｉＲＮＡや翻訳後の遺伝子発現調節機構の一部として注目されているｍｉＲＮＡの様な短鎖ＲＮＡを検出する方法として有効である。
【００１３】
従来法と比べて、本発明は、例えば以下：
１）プロトコールの操作が簡便で、短時間で検出できる。（ノーザンブロットなどのプローブ合成と同様の手順で核酸の直接標識が可能で、標識後は電気泳動して直接検出可能であり、電気泳動のトランスファーまたはメンブレンのハイブリダイゼーション、洗浄などの操作はいっさい不要である）；
２）ノーザンブロット法などと違い直接標識対象核酸を標識できる；
３）従来高感度とされている方法と比較できるレベルまたはそれ以上の検出感度がある。（アットモルレベルまで。これは市販のＲＮａｓｅ 保護を原理としたキットの検出限界｛つまりいわゆるチャンピオンデータ｝と同じレベル。なお、ＲＮａｓｅ保護ではＲＮａｓｅを用いるため、検出したＲＮＡがａｒｔｉｆａｃｔで有る可能性を排除しにくいと言う欠点がある。操作も本法の方が迅速・単純。）；ならびに
４）ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの検出ではしばしば小ＲＮＡ分画を精製しなければ検出不能であったが、本法では、トータルＲＮＡで可能である、
などの利点および効果があると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法の原理説明である。小ＲＮＡ：検出の標的とする短鎖ＲＮＡである。鋳型 ＤＮＡ：鋳型となるＤＮＡ。実施例では、合成ｓｓＤＮＡを用いているが、本発明はこれに限定されない。ＤＮＡ ｐｏｌ．：ＤＮＡポリメラーゼ。実施例にはクレノウフラグメントを用いているが、本発明はこれに限定されない。原理的には逆転写酵素でも可能である。（１）短鎖ＲＮＡを鋳型 ＤＮＡとハイブリダイズさせる。（２）常温にした後でＤＮＡポリメラーゼおよびジデオキシＮＴＰ（もしくはジデオキシＡＴＰのみ）を加える。ジデオキシＮＴＰは３２Ｐなどでラベルしておく。（３）ＤＮＡポリメラーゼによる、ＤＮＡとハイブリダイズした短鎖ＲＮＡをプライマーとしたＤＮＡ合成反応によって、短鎖ＲＮＡは標識される。この際、ジデオキシＮＴＰが取り込まれるため、反応は一塩基を付加したのみで停止する。（４）標識されたＲＮＡを変成してＤＮＡから解離させる。（５）ゲル電気泳動後オートグラムによって容易に検出できる。
【図２】図２は、実施例で示したモデル実験に用いた合成ＤＮＡおよびＲＮＡの配列を示す。ＤＮＡ１および２は、ＧＦＰ遺伝子のセンス方向のＯＲＦの一部である。ＲＮＡは２１ヌクレオチドの上記ＤＮＡの一部と相補的な配列を有する。ハイブリダイズした状態を図に示している。ＲＮＡをプライマーとした反応によって、ＲＮＡの３’に一塩基付加されると、ＤＮＡ１−ＲＮＡ１の組み合わせではｄＡＴＰが、ＤＮＡ２−ＲＮＡ２の組み合わせではｄＴＴＰが取り込まれる。ＤＮＡ１とＲＮＡ２、ＤＮＡ２とＲＮＡ１との間に相同性は無い。
【図３】図３は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法およびプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）のモデル実験である。ｐｏｌ．：Ｋｌｅｎｏｗフラグメント：ｓＲＮＡ（合成ＲＮＡ）：合成ＲＮＡ１または２：Ｔｅｍｐ（鋳型ＤＮＡ）．：合成ＤＮＡ１または２。 ＤＮＡ、ＲＮＡそれぞれ１ｐｍｏｌおよび３３Ｐ−ジデオキシＮＴＰを、Ｋｌｅｎｏｗ反応溶液中で混合した後、９５℃で変性−常温に戻すことによってハイブリダイズさせた。Ｋｌｅｎｏｗ酵素を加え、ｓＲＮＡをプライマーとしたＤＮＡ合成反応を行わせた。クレノウ酵素をそこに加え、ＤＮＡ合成反応を、ｓＲＮＡをプライマーとして使用して行った。なお、３３ＰラベルされたジデオキシＮＴＰ以外のヌクレオチドは加えられていない。標識されたＲＮＡは、変性アクリルアミドゲル電気泳動後、オートグラムによって検出した。ＤＮＡ１−ＲＮＡ１、ＤＮＡ２−ＲＮＡ２の組み合わせでポリメラーゼ依存的に３３Ｐの取り込みが見られることから、本法によって配列特異的な短鎖ＲＮＡの標識が可能であることが示された。
【図４】図４は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）の検出限界の測定およびプライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）による生物からのｍｉＲＮＡの検出である。小ＲＮＡを１／１０に系列希釈して検出感度を求めた。本発明の方法では、少なくとも５ アットモル（５×１０−１８）レベルまで検出することができることが明らかになった。 左側のレーンは以下の通りである。（ａ）合成ＲＮＡの希釈系列を検出したもの、右側の２つのレーンは植物から調製したｔｏｔａｌ ＲＮＡに含まれるｍｉＲＮＡを検出したもの。Ｌｕｃ：ネガティブコントロールとして植物のコードしないルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃの配列の一部を鋳型とした反応。ｍｉＲ１７１：植物内在性のｍｉｃｒｏ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるｍｉＲ１７１と相補的な配列＋一塩基のＴを含む配列を用いたプライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法である。このようにして、植物内在性のｍｉＲＮＡを検出することができる。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本発明のプライマーランオフ法でマウスのｍｉＲＮＡを確認することができることを示す。
【図５】図５は、プライマー停止法の原理を示す。
【図６】図６は、プライマーランオフ法の原理を示す。
【図７】図７は、プライマーアレイ法の原理を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下に本発明を、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載する。本発明を以下に説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１６】
以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきではない。本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは、当業者に明らかである。
【００１７】
（用語）
本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。そのような核酸分子としては、例えば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡが挙げられるが、それらに限定されない。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。本明細書において「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエ−ト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデ−ト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボ−スとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾ−ルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、ＤＮＡ中のリボ−スが２’−Ｏ−プロピルリボ−スで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボ−スが２’−メトキシエトキシリボ−スで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、配列表に明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）、相補配列、対応する配列（例えば、ヒト配列に対するマウス配列など）を包含することが企図される。
【００１８】
本明細書において「小ＲＮＡ」（「ｓｍａｌｌ ＲＮＡ」）とは、サイズの小さなＲＮＡをいい、具体的には約５０ヌクレオチド長以下のものが包含され、より好ましくは約３０ヌクレオチド長以下のものが使用され得る。小ＲＮＡとしては、例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどを挙げることができるが、それらに限定されない。小ＲＮＡは、近年注目されており、転写、翻訳およびｍＲＮＡ安定性を含む遺伝子調節における重要な役割を果たすといわれている。
【００１９】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２０】
伸長反応に使用される場合、ヌクレオチドは、三リン酸の形態を採ることができる。ヌクレオシド三リン酸としては、ＤＮＡ構成成分であるデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）などが挙げられるが、それらに限定されない。伸長反応において、反応を停止させるヌクレオチドとしては、ジデオキシチェインターミネーター法において用いられるような、ジデオキシアデノシン三リン酸（ｄｄＡＴＰ）、ジデオキシグアノシン三リン酸（ｄｄＧＴＰ）、ジデオキシシチジン三リン酸（ｄｄＣＴＰ）、ジデオキシチミジン三リン酸（ｄｄＴＴＰ）、ジデオキシウリジン三リン酸（ｄｄＵＴＰ）、ジデオキシイノシン三リン酸（ｄｄＩＴＰ）などを挙げることができるがそれらに限定されない。特に言及しない場合、本発明において、「ヌクレオチド」と「ヌクレオチド三リン酸」とは互換可能に使用されることが理解される。
【００２１】
本明細書においてヌクレオチドは、「標識」され得る。そのような標識としては、例えば、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ＤＩＧ、酵素および化学発光を利用した任意の標識を挙げることができるがそれらに限定されない。
【００２２】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための存在（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができるが、それらに限定されない。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、使用される検出手段に検出され得るように目的とする対象を改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。１つの好ましい実施形態では、標識は放射能標識される。
【００２３】
本明細書において、鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、「改変」され得る。このような核酸の末端の改変は、他のヌクレオチド（例えば、標識ヌクレオチド）を取り込まないような改変であることが好ましい。５’末端であっても３’末端であってもよいが、３’末端であることが好ましい。そのような改変としては、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化などを挙げることができるがそれらに限定されない。このようなフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化などの改変は、３’末端に取り込まれることによって、ポリメラーゼによる伸長反応を停止することができる。
【００２４】
本明細書において「変性」とは、核酸において、共有結合の切断を伴うことなく、天然の三次元構造を失う現象をいう。変性工程を包含することによって、核酸の分離が促進され、伸長した標識対象核酸の取出しが容易になることが理解される。
【００２５】
本明細書において「未反応物の除去」とは、核酸合成反応において、反応しなかった材料（例えば、標識されたヌクレオチドなど）を取り除くことをいう。除去されるべき未反応物には、特に、標識されたヌクレオチドが含まれることが有利である。標識されたヌクレオチドを除去することによって、伸長したもののみの標識を手がかりとして検出を行うことができるようになるからである。未反応物の除去は、例えば、アルコール沈澱（例えば、２−プロパノール、エタノールなどによる沈澱）およびその反応後の濾過を行うことによって行うことができる。アレイにおける未反応物の除去は、洗浄によって行うことができる。
【００２６】
本明細書において「核酸の分離」とは、ある核酸の集合を別の性質を有する核酸の集合から離すことをいう。そのような分離は、分子量、標識、親和性などを手がかりに行うことができる。分子量を手がかりに分離する場合は、電気泳動を行うことによって分離することができる。分子ふるいを用いても分子量による分離を行うことができる。
【００２７】
核酸の取り出しは、標識の検出と同時に行っても良い。
【００２８】
本発明では、標識の検出は、直接または間接的に行うことができる。直接行う場合は、例えば、放射能をガイガーカウンターなどで検出したり、蛍光を直接肉眼またはカメラなどで検出することができる。間接的に行う場合は、例えば、別に標識されたものをその標識に結合することによって、その別の標識を検出したり、標識を活性化する因子を付与してその活性化により標識（ビオチン、ストレプトアビジンなどの使用）を検出することなどにより検出を行うことが可能である。
【００２９】
本明細書において使用される「オートラジオグラフ」および「オートラジオグラフィー」とは、Ｘ線写真フィルムあるいは乾板を使って、生体内における放射性物質(トレーサ
ー)の取込みを観察し、生体内物質の分布、移動、代謝を細胞化学的または組織化学的に
調べる方法をいう。オートラジオグラフには、マクロオートラジオグラフ法（可視オートラジオグラフ法）、ミクロオートラジオグラフ法（光顕オートラジオグラフ法）、ウルトラミクロオートラジオグラフ法（電顕オートラジオグラフ法）などが挙げられる。本発明においては、その目的に応じてこれらのうちの一つを任意に選択して使用することができる。
【００３０】
本発明の方法では、生体分子の情報またはそれに相互作用する物質に起因する情報を検出することができる限り、種々の検出方法および検出手段を用いることができる。
【００３１】
本明細書において、生体分子（例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドなど）に対して「特異的に相互作用する」とは、その生体分子に対する親和性が、他の無関連の（特に、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどであれば、例えば、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に高いことをいう。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。
【００３２】
本明細書において「標的核酸」とは、反応（例えば、標識または検出）の対象となる核酸をいう。したがって、標識が目的である場合は、標的核酸と標識対象核酸とでは、重複し得る。
【００３３】
本明細書において「標識対象核酸」とは、本発明の標識方法の対象となる任意の核酸をいう。そのような核酸としては、任意の核酸が使用され得る。そのような標識対象核酸の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸合成酵素によって伸長反応を行うことができるようなＰＮＡなどを挙げることができるがそれらに限定されない。標的対象核酸の特に興味深い例としては、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどのような小ＲＮＡを挙げることができる。標識対象核酸は、プライマー停止法およびプライマーランオフ法では、検出の標的となり、プライマーアレイ法では、プローブとなる。
【００３４】
本明細書において「鋳型核酸」とは、本発明の方法において標識対象核酸を標識する際に利用する鋳型となる任意の核酸をいう。鋳型核酸自身は、本発明の方法では、標識されない。鋳型核酸は、プライマー停止法およびプライマーランオフ法では、プローブとなり、プライマーアレイ法では、標的となる。本発明において使用される鋳型核酸は、通常、標識対象核酸の少なくとも一部（好ましくは全部）と相補的であり、さらに標識対象核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する。したがって、通常、鋳型核酸は、標識対象核酸よりも長いが、それに限定されず、伸長方向（５’側であることが多い）にのみ長いような鋳型核酸であっても良い。鋳型核酸の例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸合成酵素によって伸長反応の鋳型になることがで
きるようなＰＮＡなどを挙げることができるがそれらに限定されない。鋳型核酸と、標識対象核酸との間の長さの違いは、好ましくは、約５ヌクレオチド以上、約１０ヌクレオチド以上、または約１５ヌクレオチド以上であり得る。
【００３５】
本明細書において「識別可能な程度」の長さの相違とは、検出するときに容易に相違を識別することができる程度の長さをいい、電気泳動を用いる場合は、例えば、少なくとも約５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１０ヌクレオチドの相違がある場合をいう。
【００３６】
本明細書において、「相補的」であるとは、核酸について言及するとき、核酸の塩基配列において、各塩基をワトソン−クリック結合で対になる塩基でおきかえた塩基配列（核酸）をいう。通常、ＡとＴ（Ｕ）と、およびＣとＧとが互いに相補的であるといわれる。
【００３７】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。
【００３８】
その文字コードは以下のとおりである。
アミノ酸
３文字記号 １文字記号 意味
Ａｌａ Ａ アラニン
Ｃｙｓ Ｃ システイン
Ａｓｐ Ｄ アスパラギン酸
Ｇｌｕ Ｅ グルタミン酸
Ｐｈｅ Ｆ フェニルアラニン
Ｇｌｙ Ｇ グリシン
Ｈｉｓ Ｈ ヒスチジン
Ｉｌｅ Ｉ イソロイシン
Ｌｙｓ Ｋ リジン
Ｌｅｕ Ｌ ロイシン
Ｍｅｔ Ｍ メチオニン
Ａｓｎ Ｎ アスパラギン
Ｐｒｏ Ｐ プロリン
Ｇｌｎ Ｑ グルタミン
Ａｒｇ Ｒ アルギニン
Ｓｅｒ Ｓ セリン
Ｔｈｒ Ｔ トレオニン
Ｖａｌ Ｖ バリン
Ｔｒｐ Ｗ トリプトファン
Ｔｙｒ Ｙ チロシン
Ａｓｘ アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｇｌｘ グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘａａ 不明または他のアミノ酸。
塩基
記号 意味
ａ アデニン
ｇ グアニン
ｃ シトシン
ｔ チミン
ｕ ウラシル
ｒ グアニンまたはアデニンプリン
ｙ チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ グアニンまたはシトシン
ｗ アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。
【００３９】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。
【００４０】
本明細書において核酸の「少なくとも一方の先端」とは、その核酸の３’末端または５’末端の少なくとも一方を意味する。
【００４１】
本明細書において、「ストリンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ
塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄する。このような方法によって同定されるポリヌクレオチドを、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」という。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
【００４２】
本明細書において「ハイブリダイズ可能」な核酸またはポリヌクレオチドとは、上記ハイブリダイズ条件下で別の核酸またはポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる核酸またはポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能な核酸として具体的には、配列表で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有する核酸、好ましくは８０％以上の相同性を有する核酸、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する核酸を挙げることができる。核酸配列の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
【００４３】
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）、同第３版（２００１）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
【００４４】
ＤＮＡ二本鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二本鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Tm（℃）＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)−600／N−0.72（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
【００４５】
ＲＮＡ、ＰＮＡなどを利用したときは、当業者は、そのヌクレオチドに適切な関係式を利用することができる。
【００４６】
当業者は、上述のような関係式を用いて、標識または検出などに適切な条件を見出すことができることが理解される。
【００４７】
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求めることも可能である。
【００４８】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象を捕捉するための手段となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
【００４９】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００５０】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００５１】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましく１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは１１の連続するヌクレオチド長の、１２の連続するヌクレオチド長の、１３の連続するヌクレオチド長の、１４の連続するヌクレオチド長の、１５の連続するヌクレオチド長の、１６の連続するヌクレオチド長の、１７の連続するヌクレオチド長の、１８の連続するヌクレオチド長の、１９の連続するヌクレオチド長の、２０の連続するヌクレオチド長の、２５の連続するヌクレオチド長の、３０の連続するヌクレオチド長の、４０の連続するヌクレオチド長の、５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プライマーとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、９０％相同な、最も好ましくは９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００５２】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、ホルモン、サイトカインの情報伝達機能など）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
【００５３】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔ ＥＳ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５４】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【００５５】
本明細書において核酸の存在を確認するには、放射能法、蛍光法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価され得る。
【００５６】
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の検出／標識のための技術を使用することができる。
【００５７】
本明細書において、「複合体」とは、２つ以上の分子が相互作用を介して会合し、あたかも１つの分子のように挙動する状態となったものをいう。したがって、ハイブリダイズした核酸−核酸は複合体である。
【００５８】
本明細書において「核酸合成酵素」とは、核酸を合成する能力を有する任意の酵素をいう。本明細書では、ポリメラーゼともいう。これは、ヌクレオチドを縮合させてポリヌクレオチドにする反応を触媒する酵素の総称である。このような核酸合成酵素としては、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、ＲＮＡポリメラーゼ、などを挙げることができるがそれらに限定されない。ポリメラーゼとしては、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができる。また、どちらのポリメラーゼでも、検出するのはＤＮＡ、ＲＮＡを問わないことが理解される。鋳型がどちらか（あるいは両方か）という違いだけである。（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡも鋳型にする。ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして売られているものの中にも、ＲＮＡ依存性活性も持つものが有る）。このようなポリメラーゼとしては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼI、ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメント、Ｔａｑポリ
メラーゼ、ＫＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ、ＫＯＤポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【００５９】
本明細書において「伸長反応」とは、核酸について言及するとき、その核酸が少なくとも１ヌクレオチド伸びるような任意の反応をいう。ポリメラーゼを用いた伸長反応を行う場合、通常、鋳型に基づいてヌクレオチドが導入されることから、特定の配列が標識対象核酸などの伸長すべき核酸において伸長することになる。
【００６０】
伸長反応は、（ｉ）標的核酸およびその相補鎖と核酸プライマーおよび核酸プローブとのハイブリダイゼーション（アニーリング）反応と、（ｉｉ）核酸合成酵素によるプライマー鎖の伸長反応及びプローブの分解反応からなりこれら反応（ｉ）および（ｉｉ）は、例えばトリス塩酸緩衝液等の適当な緩衝液を含む水溶液中で実施することができる。このハイブリダイゼーション反応は、代表的には、５５〜７５℃で実施することができるがそれに限定されない。酵素反応は、代表的には、３７℃で実施することができるがそれに限定されない。
【００６１】
プライマー伸長産物の変性は、上記伸長反応で得られるプライマー鎖伸長産物を含む溶液を、例えば９４〜９５℃で０．５〜１分間加熱処理するなどを行うことによって実施することができる。
【００６２】
標的核酸の増幅は、例えば、その標的核酸（標識対象核酸）が所望の量になるまで、工程上記伸長反応および変性を上記と同様の条件下で複数回繰り返せばよい。すなわち、上記の伸長反応および変性を、類似の条件下で複数回繰り返して行う。上記工程をｎ回行えば、理論的には標的核酸量は当初の２ｎ−１倍にまで増幅されることとなる。
【００６３】
このような伸長反応は、市販のＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）のための装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから販売されている）を用いれば、簡便かつ効率的に実施することができる。
【００６４】
混合物からの核酸の取り出しは、当該分野において任意の方法を用いて行うことができる。そのような取り出しとしては、例えば、電気泳動、クロマトグラフィー、変性、アルコール沈澱、アフィニティー精製、抗体などを用いることができるがそれらに限定されない。
【００６５】
（好ましい形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示である。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲以外によっては限定されない。
【００６６】
１つの局面において、本発明は、標識が導入された核酸を生産するための方法であって、以下の工程：Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標識対象核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；Ｂ）上記標識対象核酸を、上記鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；Ｃ）上記標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、上記標識対象核酸に少なくとも１つの上記標識されたヌクレオチドが上記鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；Ｄ）上記伸長反応の後、生成した混合物から伸長した上記標識対象核酸を取り出す工程、を包含する、方法を提供する。この方法により、初めて、標的となる核酸自体を自在に標識する方法が提供され、そのような標識核酸を生産することが可能となった。
【００６７】
別の局面にて、本発明は、核酸に標識を導入するための方法であって、以下の工程：標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標識対象核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；Ｂ）上記標識対象核酸を、上記鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；およびＣ）上記標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程、上記標識対象核酸に少なくとも１つの上記標識されたヌクレオチドが上記鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程、を包含する方法を提供する。この方法により、初めて、標的となる核酸自体を自在に標識する方法が提供された。
【００６８】
別の局面において、本発明は、標的核酸を検出するための方法であって、以下の工程：Ａ）上記標的核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、上記鋳型核酸は、上記標的核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標的核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；Ｂ）上記標的核酸を、上記鋳型核酸とハイブリダイズさせて標的核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；Ｃ）上記標的核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程；およびＤ）上記標的核酸に対応する伸長産物が存在するかどうか検出する工程であって、上記伸長産物の存在は、上記標的核酸の存在の指標である、工程、を包含する、方法を提供する。本発明によって、配列が部分的または完全に公知であるか、あるいは配列が部分的または完全に未知である、目的の核酸などの検出が顕著に容易になった。なぜなら、未知核酸自体が標識されるからである。したがって、従来のように、標識されたプローブを使用する方法とは、その検出の感度、容易さなどの点で顕著に異なることが理解される。好ましくは、検出の際に、伸長反応の後、生成した混合物から上記標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長産物とを分離する工程をさらに包含してもよい。検出が容易になるからである。
【００６９】
本発明の方法において用いられる核酸の提供工程は、当該分野において周知の任意の技法（例えば、化学合成、遺伝子工学の利用、生体からの抽出）を利用して行うことができる。
【００７０】
本発明の方法において用いられる複合体の生成は、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。例えば、本明細書において別の場所において説明したような通常使用されるハイブリダイゼーションの条件を適宜選択することによって、複合体生成を行うことができることが理解される。
【００７１】
本発明の方法において用いられる伸長反応は、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。伸長反応には、伸長反応の触媒（例えば、核酸合成酵素）、触媒が反応することができる条件を提供する物質（例えば、緩衝液など）、伸長の際に入るべきヌクレオチド（標識、非標識など）を考慮することができる。また、反応条件をコントロールするために、温度などを調節する装置（例えば、恒温槽）を使用しても良い。
【００７２】
伸長反応の後、混合物から標識が導入された核酸を取り出す工程もまた、当該分野において周知の任意の技法を用いて行うことができる。そのような取り出す工程は、核酸を精製または分離するために通常使用される技術であれば、どのようなものであっても使用することができる。
【００７３】
本発明の方法において、標的核酸に対応する伸長産物が存在するか検出する工程では、検出は、当該分野において周知の任意の技法を用いて、標識を直接または間接的に任意の方法で実施することができることが理解される。ここで、伸長産物の存在は、上記標的核酸の存在の指標であることが理解される。伸長産物は、伸長される前の未知核酸が存在しない限り、検出されないからである。ただし、伸長される前の未知核酸は、複数種類存在することが考えられることから、伸長産物の配列を決定することによって、より詳細な検出をすることができる。そのような伸長産物の配列決定は、当該分野において公知の任意の技法を用いて行うことができる。
【００７４】
１つの実施形態において、本発明において使用される標識対象核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの組み合わせであり、小ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）であることが好ましい。
【００７５】
鋳型核酸と、標識対象核酸との間の相補性は、伸長反応が進捗するに十分である程度であることが好ましい。そのような相補性の程度は、長さ、伸長反応条件などによって異なり、また、３’末端付近が伸長反応に適していることが好ましい。特に、３’末端の１〜２ヌクレオチドは、完全な相補性を有していることが好ましくあり得る。あるいは、短い方の核酸を基準として、通常、少なくとも５０％の相同性を有していることが好ましく、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、さらに好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の相同性を有していることがさらに好ましくあり得る。あるいは、標識対象核酸全部と相補的であってもよい。
【００７６】
別の実施形態では、本発明に使用される鋳型核酸は、上記標識対象核酸の両方の先端において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチドを有し、さらに好ましくは、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチドは、少なくとも約２ヌクレオチド分長く、好ましくは少なくとも約３ヌクレオチド分長く、より好ましくは少なくとも約４ヌクレオチド分長く、さらに好ましくは少なくとも約５ヌクレオチド分長く、さらに好ましくは少なくとも約６ヌクレオチド分長く、さらに好ましくは少なくとも約７ヌクレオチド分長く、さらに好ましくは少なくとも約８ヌクレオチド分長く、さらに好ましくは少なくとも約９ヌクレオチド分長く、約１０ヌクレオチド分長いヌクレオチドであってもよい。
【００７７】
本発明の別の実施形態では、鋳型核酸は、改変され得る。このような改変は、３’末端が改変されていることが好ましい。これは、３’末端の偶然の外的ヌクレオチド（例えば、標識ヌクレオチド）の取り込みを防ぐことができるからである。従って、このような鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされることが好ましい。
【００７８】
１つの好ましい実施形態では、そのような改変は、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変であり得る。
【００７９】
そのような改変は、鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされていることが好ましい。
【００８０】
別の実施形態では、鋳型核酸と標識対象核酸とでは、伸長反応後に期待される長さが異なるように設計されていることが好ましい。そのような設計は、検出する場合に使用される検出法（例えば、プライマー停止法、プライマーオンオフ法、プライマーアレイ法など）に依存して変動することが理解される。プライマー停止法では、使用するジデオキシヌクレオチドなどがポリメラーゼによる伸長を停止する能力を利用することから、使用するジデオキシヌクレオチドが取り込まれる位置をコントロールすることによって設計を変動させることができる。
【００８１】
別の好ましい実施形態では、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチドは、少なくとも５’末端側に付加されている。伸長反応は３’陥没末端において伸長することが通常であるが、本発明はそれに限定されない。
【００８２】
さらに別の実施形態において、本発明は、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列は、標識対象核酸と相補性のある部分からみて３’末端側と５’末端側とが異なる長さだけ付加されている。これは、標的対象核酸を鋳型核酸から識別が容易になるからである。
【００８３】
別の好ましい実施形態では、本発明は、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列は、標識対象核酸と相補性のある部分からみて５’末端側は長く付加されているが３’末端は鋳型核酸の方が短い。すなわち、標識対象核酸の５’末端部分が、鋳型核酸の３’末端から延びている。このような場合、プライマーランオフ法では、特に、鋳型核酸の方が短いことは担保され、標識対象核酸を鋳型核酸から識別が可能になる。プライマー停止法であっても、短いことによって、標識対象核酸から鋳型核酸を識別することが簡単になり得る。
【００８４】
別の実施形態では、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列は、標識対象核酸と相補性のある部分からみて３’末端側が５’末端側より長く付加されている。このようにすることによって、電気泳動などで伸長産物を識別する際に肉眼による識別も可能となるからである。
【００８５】
別の実施形態では、鋳型核酸において付加されている少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列は、標識対象核酸と相補性のある部分からみて５’末端側が３’末端側より、識別可能な程度長く付加されている。このような識別可能な程度な長さは、検出方法によって変動するが、肉眼であれば、識別可能な程度の長さは、１〜５ヌクレオチドであり得るが、少なくとも約１０ヌクレオチドであることが好ましい。
【００８６】
別の実施形態では、核酸合成酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼであり得る。伸長反応が達成される限り、どのような合成酵素であっても良いことが理解される。
【００８７】
本発明の標識方法において使用される標識は、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ＤＩＧ（ジゴキシゲニン）、酵素および化学発光などを挙げることができるがそれらに限定されない。標識は１つ用いても複数（あるいは複数種類）用いても良いことが理解される。色素、蛍光などでは、複数の色を用いることができる。好ましい実施形態では、標識としては、放射能を用いる。放射能は、アットモルレベルの検出を可能にするからである。しかし本発明は、それに限定されない。
【００８８】
別の実施形態において、伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、変性工程を包含し得る。変性させることにより、伸長した標識対象核酸をより識別しやすくし、取出しが容易になるからである。
【００８９】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、未反応物を除去する工程をさらに包含する。未反応物は、標識された核酸をその後に使用する際に、ノイズとなり得るからである。ここで、未反応物の除去にはどのような利用可能な技術でも用いることができるが、好ましくは、２−プロパノール沈澱またはエタノール沈澱などのアルコール沈澱、および濾過により達成され得る。この方法は、簡便であるからである。
【００９０】
未反応物の除去において、伸長した上記標識対象核酸を「分離する」工程をさらに包含してもよい。分離することによって、純度が上昇するからである。このような分離には、当該分野において任意の技術を用いることができるが、電気泳動またはクロマトグラフィーによることが好ましい。
【００９１】
別の実施形態では、本発明の方法における伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、標識を検出する工程を包含する。この検出工程は、標識を直接または間接的に検出してもよい。
【００９２】
別の実施形態では、本発明の方法は、伸長した上記標識対象核酸を分離する工程をさらに包含する。このような分離には、当該分野において任意の技術を用いることができるが、電気泳動またはクロマトグラフィーによることが好ましい。これらの技術は、当該分野において公知の技術であり、上述した任意の形態を用いることができることが理解され得る。
【００９３】
別の実施形態において、本発明の方法では、「分離の際に」検出が行われても良い。分離を行うことによって検出精度を上げることができ、検出および分離の効率が上昇するからである。
【００９４】
他の実施形態において分離および検出は、オートラジオグラフを使用しても良い。自動的に分離および検出を行うことが可能であるからである。
【００９５】
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、伸長反応を停止させる工程を包含する。停止工程は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ法）またはプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法により達成され得るがそれらに限定されない。このような停止工程は、従来の標識方法では考えることができなかったことから、特異性の高い標識を実現することができることが理解される。
【００９６】
標識対象核酸は、通常は、配列が部分的または完全に公知または未知である目的の核酸であるが、それに限定されず、プローブとして使用されていても良い。目的の核酸である場合は、たとえその配列が部分的または完全に未知であったとしても、目的の核酸の検出に大いに効果を発揮することが理解される。
【００９７】
１つの例示的な実施形態では、標識対象核酸と鋳型となるＤＮＡまたはＲＮＡをハイブリダイズさせ、これにＤＮＡポリメラーゼと遊離ヌクレオチドを加えて、標識対象核酸（場合によってはプローブ）をプライマーとしたＤＮＡ合成（伸長）反応を行わせることによって、配列特異的に核酸を標識する。したがって、従来使用されているサザンブロッティング、ノーザンブロッティング、プライマー伸長法、サザンブロット、ノーザンブロット、プライマー伸長法、ＲＮａｓｅ保護、マイクロアレイ、マクロアレイなどの従来の配列特異的な核酸検出方法は、ハイブリダイゼーションの前にプローブに標識を入れるが、本発明の方法では標識対象核酸とプローブとなる核酸をハイブリダイズさせた後、どちらかをプライマーとするＤＮＡ合成反応を行わせることで、ハイブリダイズした核酸のみに標識を入れるという手法である。本発明の方法では、通常は標的核酸として使用される核酸の方に標識を入れることになるがそれに限定されない。従って、プローブとして使用される核酸の方に標識を入れることになってもよい。本発明の方法では、ハイブリダイズした核酸しか標識されないことから、標識対象核酸に配列特異的に標識が行われる点が、従来のプローブに標識を入れる（つまり間接的な）方法と比べて、顕著に異なる効果を奏する。従来法でのプローブの役割を、鋳型核酸が担うことになる。したがって、標識は鋳型核酸ではなく標識対象核酸の方に入る。なお、逆に標識対象核酸をプローブとして使用することもできる。この場合は、プローブの側に標識を入れる方法も含有される。このような形態は、ｍＲＮＡを用いたマイクロアレイに本法を応用する際に必要になる。
【００９８】
この方法では、鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼが、プライマーとしてＤＮＡもＲＮＡも用いることができることを利用する。鋳型依存性のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ（クレノウフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩ等）が好ましいが、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）でも可能である。
【００９９】
両者のタイプのポリメラーゼは、前述の様にＤＮＡでもＲＮＡでもプライマーとして利用可能であり、これがハイブリダイズしている核酸と相補的な塩基をプライマーの３’側に付加する反応を触媒する。反応は、通常３’「陥没末端」でだけ起きる。３’突出末端では鋳型がない状態のため反応は、通常起きない。５’末端に塩基を付加する反応を触媒することができる場合は、「逆の反応」も可能であり得る。
【０１００】
（反応停止）
本明細書において、伸長反応の「停止」とは、核酸合成反応を停止することをいう。伸長反応の停止は、代表的には、以下の２種類の方法を（プライマー停止法、およびプライマーランオフ法）用いることができる。ここでは、標識ヌクレオチドの取り込まれる塩基数を規定（限定）できる点が、もう一つの特長である。
【０１０１】
本明細書において「プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法）」とは、ＤＮＡ合成（伸長）反応の際に加えるヌクレオチド３リン酸を、通常ＤＮＡ合成に用いられるでデオキシリボヌクレオチドではなく（もちろんリボヌクレオチドでもなく）ジデオキシリボヌクレオチド（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＧＴＰの混合物あるいはどれか一つ）のような核酸合成酵素による次の伸長反応を受けないが取り込みは可能なヌクレオチド３リン酸またはその類似物とすることで、１塩基または数塩基もしくは数十塩基取り込んだ後に反応を停止させる方法である。原理的には、ＤＮＡ配列決定反応に用いられるジデオキシチェーンターミネーション法と同じ原理を用いることができる。プライマー停止の原理については、図１および図５を参酌することができる。
【０１０２】
本明細書において「プライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法」とは、鋳型となる（プローブ）核酸を標識対象核酸の３’側（プローブがわからみると５’側）より１〜数塩基だけ長くしておいて、ＤＮＡ合成反応をその長さ分だけで（鋳型がなくなるため）停止させる方法である。プライマーランオフの原理については、図６を参酌することができる。
【０１０３】
プライマー停止法は、どのような場合でも使える方法である。プライマーランオフ法は、標識対象核酸の配列が既知のｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）の場合は有効であるが、遺伝子不活性化におけるｓｉＲＮＡの場合は、不活性化されている遺伝子と相補的な小ＲＮＡの混合物でいろいろな分子種を含むことから、プライマー停止法が好ましい。
【０１０４】
プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法の場合は、鋳型の長さは重要ではなく、任意の長さを用いることができる。この方法でｓｉＲＮＡを検出する場合、ｓｉＲＮＡはいろいろな分子種の集合であるために、次に来る塩基を規定することはできないことから、標識ヌクレオチドはできれば４種類（ｄｄＡＴＰ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＴＴＰ，ｄｄＧＴＰ）全てを含むことが望ましいが、それに限定されない。感度が１／４になることを覚悟すれば１種類でも可能であることが当業者には理解される。
【０１０５】
プライマーランオフ法でｍｉＲＮＡを検出する場合は、鋳型の５’側（標的から見て３’側）は、決められた長さ（通常は１塩基だけ突出）である必ことが好ましい。なお、標的とハイブリダイズする部分は相補的であることが好ましいが、突出部分の配列は、自由に選択することができる。従って、４つの標識ヌクレオチド（すなわち、ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ）のうち一つが取り込まれるように鋳型を設計可能で必要な一種類だけを反応に加えればよい。
【０１０６】
本明細書において「プライマーアレイ法」とは、多種類の核酸を同時に検出および定量するための方法である。プライマーアレイ法では、プローブ核酸を支持体に固定し、固定されたプローブと検出対象核酸の複合体を用いてＤＮＡ合成反応を行わせる際に、標識ヌクレオチドを取り込ませることで核酸を標識する方法である。支持体の異なった部位に、多種類のプローブを固定することで、複数種の核酸を同時定量することができる。検出対象となる核酸は、ｍＲＮＡであっても小ＲＮＡであってもよく、場合によっては、ＤＮＡであってもよい。従来のマイクロアレイ技術と比べて、支持体上での特異的な標識反応が行われることから、効率のよい検出が行うことができることが特徴である。小ＲＮＡを網羅的に解析することができる方法は、これまでに知られていない。プライマーアレイ法の原理については、図７を参酌することができる。
【０１０７】
プライマー停止法は、代表的に、ｓｉＲＮＡの検出に適している。プライマーランオフ法は、代表的に、ｍｉＲＮＡおよびＳｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ＲＮＡ＝）の検出に適している。プライマーアレイ法は、ｍＲＮＡの検出に適している。
【０１０８】
プライマー停止法においては、標識対象核酸が標的核酸（検出対象；例えば、ｓｉＲＮＡ）となり、ポリメラーゼ反応におけるプライマーに該当する。したがって、検出対象自体が標識される。他方、鋳型核酸は、合成ＤＮＡなどの「提供」核酸であり、プローブに該当する。例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなどを使用することができる。したがって、鋳型核酸は、標識されない。プライマー停止法では、伸長反応の停止は、ジデオキシヌクレオチドなどの伸長反応の停止作用を有するヌクレオチド三リン酸を使用することによって実現される。
【０１０９】
プライマーランオフ法においては、標識対象核酸が標的核酸（検出対象；例えば、ｍｉＲＮＡ、ＳｎＲＮＡ）となり、ポリメラーゼ反応におけるプライマーに該当する。したがって、検出対象自体が標識される。他方、鋳型核酸は、合成ＤＮＡなどの「提供」核酸であり、プローブに該当する。例えば、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなどを使用することができる。したがって、鋳型核酸は、標識されない。プライマーランオフ法では、伸長反応の停止は、対応する鋳型核酸が伸長すべき部分にヌクレオチド配列がないことにより、それ以上伸長しなくなることによって、実現される。
【０１１０】
プライマーアレイ法においては、標識対象核酸が今度は好ましくは固相支持体に固定され、したがって、プライマーとなる。標識対象核酸は、プライマーの役割を果たすことになることから、標識がされるような合成ＤＮＡなどの核酸を用いることができる。この場合、鋳型核酸はｍＲＮＡに相当し、標識されない。プライマーアレイ法では、伸長反応の終結反応は必ずしも必要ではない。
【０１１１】
本発明の「標識対象核酸をプライマーとするＤＮＡ合成反応によって、標識対象核酸を特異的に標識する方法」と、本発明の「ＤＮＡ合成反応の際、プライマー停止法もしくはプライマーランオフ法によって伸長塩基数を限定する方法」とを組み合わせることで、（とくに小ＲＮＡに有効な）新規核酸検出法となる。したがって、このような標識法は、従来では検出できなかった格別の効果を奏するといえる。前者だけでも、新規の核酸標識・検出法である。
【０１１２】
変性、電気泳動、検出はいろいろな組み合わせが考えるが、本発明の「配列特異的で塩基数を規定できる核酸ラベル法」を本明細書において記載されるように実施することにより、公知技術を応用して実施することができる。ただし、いろいろな組み合わせで幾つかの応用があり得ることが理解される。
【０１１３】
１つの実施形態では、検出は、伸長された部分の配列を検討することによって行うことができる。この場合、伸長された標的核酸に特異的に結合する薬剤を用いても良い。そのような薬剤には、伸長された標的核酸と特異的に相互作用する配列を有する別の核酸または抗体などを挙げることができるがそれらに限定されない。あるいは、伸長された標的核酸に特異的に結合する薬剤は、伸長していない上記標的核酸にも、上記標識されたヌクレオチドにも結合しない。
別の実施形態では、検出を行う場合、標識されたヌクレオチドに起因する標識と、上記薬剤に起因する標識とを検出することによって行われてもよい。
【０１１４】
別の実施形態では、検出は、伸長された標的核酸の長さに基づき行うことができる。
【０１１５】
（デバイス）
本発明は、アレイなどのデバイスにおける標識および検出に応用することができる。
【０１１６】
本明細書において「デバイス」とは、装置の一部または全部を構成することができる部分をいい、支持体（好ましくは固相支持体）およびその支持体に担持されるべき標的物質などから構成される。そのようなデバイスとしては、例えばチップ、アレイ、マイクロタイタープレート、細胞培養プレート、シャーレ、フィルム、ビーズなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１１７】
アレイでは、支持体に結合させた核酸が用いられ、用途として、大きく分けて２つの応用が考えられる。
【０１１８】
１）ｓｉＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ検出用マイクロ（マクロ）アレイ
小ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）に対する鋳型核酸をガラス、メンブレンなどに固定させておき、この支持体上でハイブリダイゼーション、標識、検出を行わせる。小ＲＮＡの存在量を網羅的に解析できることが期待され、ほかに小ＲＮＡを網羅的に解析する方法は知られていない。
【０１１９】
２）ｍＲＮＡに対して相補的な配列を持つ核酸を支持体上に固定しておき、支持体上でハイブリダイゼーション、標識、検出を行わせる。従来のマイクロアレイと同じくｍＲＮＡの存在量を網羅的に解析するために利用できる。従来法と比べ、反応系が単純である。
【０１２０】
１）および２）のどちらについても、方法、支持体に固定した核酸そのもの、キットが実施形態として考えられる。
【０１２１】
あるいは、逆に小ＲＮＡが鋳型となってもよい。あるいは、５’および３’の両端で標識することも可能である。
【０１２２】
標識対象核酸から見て、３’側（鋳型側では５’）は１塩基の突出がもっとも考えられる長さであるがこれに限定されない。これとは別に５’側は１０塩基程度、鋳型の鋳型の方が長い方が望ましい。これによって、標的には１塩基の付加が起きる。５’側に鋳型を長くするのは、非特異的に鋳型に標識が入ったとしても、長さ的に標的と区別できるようにするためである。
【０１２３】
本明細書において使用される「支持体」は、生体分子のような物質を固定することができる材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）をいう。支持体の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子のような物質に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
【０１２４】
支持体として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。支持体は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。支持体を構成する材料が固相である場合、本明細書において特に「固相支持体」という。本明細書において、プレート、マイクロウェルプレート、チップ、スライドグラス、フィルム、ビーズ、金属（表面）などの形態をとり得る。支持体はコーティングされていてもよく、コーティングされていなくてもよい。
【０１２５】
本明細書において使用される「基板」とは、本発明のチップまたはアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。したがって、基板はプレートの概念に包含される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。
【０１２６】
プレートおよび基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々の指標によって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。
【０１２７】
本明細書において「コーティング」とは、固相支持体または基板について用いられるとき、その固相支持体または基板の表面上にある物質の膜を形成させることおよびそのような膜をいう。コーティングは種々の目的で行われ、例えば、固相支持体および基板の品質向上（例えば、寿命の向上、耐酸性などの耐環境性の向上）、固相支持体または基板に結合されるべき物質の親和性の向上などを目的とすることが多い。そのようなコーティングのための物質としては、種々の物質が用いられ得、上述の固相支持体および基板自体に使用される物質のほか、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質などの生体物質、ポリマー（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、疎水性フッ素樹脂）、シラン（ＡＰＳ（例えば、γ−アミノプロピルシラン））、金属（例えば、金など）が使用され得るがそれらに限定されない。そのような物質の選択は当業者の技術範囲内にあり、当該分野において周知の技術を用いて場合ごとに選択することができる。一つの好ましい実施形態では、そのようなコーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、（例えば、エポキシシランまたはメルカプトシラン、ＡＰＳ（γ−アミノプロピルシラン））、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂、金のような金属を用いることが有利であり得る。
【０１２８】
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。チップとしては、例えば、ＤＮＡチップ、タンパク質チップなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２９】
本明細書において「アレイ」とは、１以上（例えば、１０００以上）の標的物質を含む組成物（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より
大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望の核酸のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる核酸を少なくとも１０２個、より好ましくは少なくとも１０３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０４個、さらにより好ましくは少なくとも１０５個を含む。これらの抗体は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される標的物質（例えば、核酸など）を含む組成物は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の標的物質（例えば、核酸など）を含む組成物が固定され得る。
【０１３０】
基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の標的物質（例えば、核酸など）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、１０８個の生体分子を超える標的物質を含む組成物が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、標的物質を含む組成物（例えば、核酸など）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じくらい小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。本発明では、細胞への導入が企図される標的物質を含む組成物は、通常、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている。
【０１３１】
アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、標的物質を含む組成物の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある標的物質を含む組成物のスポットをある基板またはプレートに作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。
【０１３２】
本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。
【０１３３】
各々のアドレスのサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、標的物質を含む組成物の量および／または利用可能な試薬、微粒子のサイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。各アドレスのサイズは、例えば、１〜２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。
【０１３４】
アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。
【０１３５】
マイクロアレイについては、ゲノム機能研究プロトコール（実験医学別冊 ポストゲノム時代の実験講座１）、ゲノム医科学とこれからのゲノム医療（実験医学増刊）などに広く概説されている。
【０１３６】
マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ Ｏ．ら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。
【０１３７】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１ ５ Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１３８】
検出技術としては、核酸の標識に関連する情報を検出することができる限り、種々の検出方法および検出手段を用いることができる。そのような検出方法および検出手段としては、例えば、目視、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、レーザー光源を用いた読取装置、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング、電気信号、化学的または生化学的マーカーのいずれかあるいは複数種を用いる方法および手段を挙げることができるがそれらに限定されない。そのような検出装置としてはまた、蛍光分析装置、分光光度計、シンチレーションカウンター、ＣＣＤ、ルミノメーターなども挙げられるがそれらに限定されず、生体分子を検出することができる手段であればどのようなものでもよい。
【０１３９】
放射能であれば、ガイガーカウンター、シンチレーションカウンターなどの当該分野において周知の技法が用いられ得る。
【０１４０】
蛍光であれば、蛍光偏光の測定の際の励起波長及び検出波長を測定する必要があるが、当業者は、使用した蛍光標識の種類に応じて適宜選択（例えば、フルオレセインイソチオシアネートを蛍光標識とした場合は、励起波長及び検出波長は、各々４９０ｎｍおよび５２０ｎｍ）することができる。
【０１４１】
（キット）
本明細書において「キット」とは、通常２つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、酵素、鋳型核酸、標準など）が提供されるユニットをいう。混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、試薬、酵素、ヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、伸長反応を止めるヌクレオチドなど（およびその三リン酸）、鋳型核酸、標準など）をどのように処理すべきかを記載する説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、試薬成分、緩衝液、塩濃縮液、使用するための補助手段、使用方法を記載した指示書などが含まれる。
【０１４２】
本明細書において「指示書」は、本発明の試薬の使用方法、反応方法などを使用者に対して記載したものである。この指示書は、本発明の酵素反応などの手順を指示する文言が記載されている。この指示書は、必要に応じて本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本における厚生労働省、米国におけるＦｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、瓶に貼り付けられたフィルム、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ（ウェブサイト）、電子メールなど）のような形態でも提供され得る。
【０１４３】
１つの局面において、本発明は、標識が導入された核酸を生産するためのキットであって、以下の手段：Ａ）標識の導入の対象となる標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標識対象核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、鋳型核酸；Ｂ）核酸合成酵素；およびＣ）標識されたヌクレオチド；を備える、キットを提供する。
【０１４４】
１つの実施形態では、本発明のキットは、ＤＮＡ合成酵素と、コントロールの鋳型、標的（プライマー）、反応用のバッファー等を含み、実際の標的核酸に対する鋳型は自分で調製ないしはオリゴＤＮＡとして注文するように構成しても良い。これとは別に、主要な小ＲＮＡに対する鋳型のセットを含むものも考えられる。あるいは、鋳型のセットや、鋳型を上記のアレイにしたキットも考慮される。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明のキットにおいて、生成した混合物から上記標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長された伸長産物とを分離する手段がさらに含まれていても良い。
【０１４６】
別の実施形態において、本発明のキットは、標識されたヌクレオチドを検出する手段をさらに備えていてもよい。
【０１４７】
好ましい実施形態では、本発明のキットは、さらにコントロールとなる標準核酸を備える。コントロールとなる標準核酸は、電気泳動などにおいて検出する際の指標として用いることができる。
【０１４８】
ここで使用され得る標準核酸は、上記鋳型核酸を同定するための核酸および上記標識対象核酸を同定するための核酸からなる群より選択される核酸を含んでいてもよい。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明のキットは、核酸合成酵素の反応のための試薬をさらに含む。このような試薬には、緩衝液、必要なイオン濃縮液、塩濃縮液、ｐＨ調整剤などを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１５０】
好ましい実施形態では、本発明のキットは、支持体をさらに含み、上記鋳型核酸は、上記支持体に固定されている。このような場合、支持体は、ガラスまたはメンブレンであってもよいがそれに限定されない。
【０１５１】
好ましい実施形態では、本発明のキットに含まれる支持体に固定される上記鋳型核酸は、アレイ状に配置される。このようなものは、ＤＮＡチップなどとも称され得る。このようなアレイを生産する方法もまた、本発明の範囲内にある。
【０１５２】
本発明のキットにおいて、種々の構成要件が採るべき状態は、本発明の標識方法および検出方法、標識が導入された核酸を生産する方法において詳述される任意の形態を採り得ることが理解される。
【０１５３】
別の局面では、本発明は、標的核酸を検出するためのキットであって、以下の工程：Ａ）上記標的核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標的核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、鋳型核酸；Ｂ）核酸合成酵素；Ｃ）標識されたヌクレオチド；Ｄ）標識されたヌクレオチドを検出する手段、を備える、キットを提供する。
【０１５４】
各構成要件（例えば、鋳型核酸、核酸合成酵素、標識されたヌクレオチド、検出手段）などは、本発明の方法の説明において詳述されている任意の形態をとりえることが理解され得る。
【０１５５】
１つの実施形態では、本発明のキットは、生成した混合物から上記標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長された伸長産物とを分離する手段をさらに備えていてもよい。このような手段は、電気泳動、クロマトグラフィーなどを挙げることができるがそれらに限定されない。
【０１５６】
（アレイ製造法）
別の局面において、本発明は、標識が導入された核酸が固定された支持体を生産するための方法であって、以下の工程：Ａ）支持体に固定された標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、上記鋳型核酸は、上記標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに標識対象核酸の相補的な部分と鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；Ｂ）上記標識対象核酸を、上記鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；Ｃ）上記標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、上記標識対象核酸に少なくとも１つの上記標識されたヌクレオチドが上記鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；およびＤ）上記伸長反応の後、生成した混合物から伸長した上記標識対象核酸を含む支持体を取り出す工程、を包含する方法を提供する。上記製造方法において、核酸の提供、複合体の生成、伸長反応、および支持体の取り出しは、本明細書の他の場所に記載されるような任意の技法を応用することができる。核酸の提供については、一旦目的とする核酸の情報が提供されると、化学合成、遺伝子工学の応用、細胞成分からの抽出などの任意の技法を用いることができる。複合体の生成は、上記２つの核酸を複合体生成可能な距離に置き、複合体生成が生じる条件に暴露することによって行うことができる。伸長反応は、例えば、複合体が生成された後、核酸合成酵素を加え、核酸合成酵素が機能するような条件に複合体と核酸合成酵素との混合物をさらすことによって行うことができる。反応後の支持体は、好ましくは、反応に使用した他の試薬から、支持体を分離することによって取り出すことができる。必要に応じて、固定された標識核酸が破壊されない条件下で洗浄（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などを用いる）してもよい。
【０１５７】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１５８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【実施例】
【０１５９】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、和光純薬、Ｓｉｇｍａ、東洋紡、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、アマシャム、Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、フナコシ、ニッポンジーンなどから市販されているものを使用した。合成ＤＮＡは、北海道システムサイエンス株式会社に生産を依頼し、合成ＲＮＡは、株式会社日本バイオサービスに合成を依頼したが、当業者は当該分野において周知の技法を用いてそのようなＤＮＡおよびＲＮＡを合成することができることが理解される。
【０１６０】
（実施例１）
本実施例では、本発明の標識技術がＲＮＡおよびＤＮＡで適用可能かどうかを実証した。
【０１６１】
（材料および方法）
（核酸）
ＧＦＰ遺伝子に相補的な合成小ＲＮＡおよびＧＦＰ遺伝子に対応するセンス鎖ＤＮＡを以下の表に列挙する。さらに、図２には、ＲＮＡ１、ＲＮＡ２、ＤＮＡ１、ＤＮＡ２の相補性についての概観を示す。図３右側（（ｉ）〜（ｖ））には、表１に示される各核酸の相互の相補性についての概観を示す。
（表１）
実施例に使用される代表的な合成ＤＮＡおよびＲＮＡの配列
小ＲＮＡ
ＲＮＡ１
５’−ＣＵＣ ＡＵＣ ＡＵＧ ＵＵＵ ＧＵＡ ＵＡＧ ＵＵＣ−３’（配列番号１）ＲＮＡ２
５’−ＡＵＣ ＧＣＣ ＡＡＵ ＵＧＧ ＡＧＵ ＡＵＵ ＵＵＧ−３’（配列番号２）
鋳型ＤＮＡ
ＤＮＡ１ （ｍ−ＧＦＰ５−ＥＲ−Ｓ ７２５−８１２）
５’−ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＣＡ ＣＡＴ ＧＧＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＴＧＡ ＧＴＴ ＴＧＴ ＡＡＣ ＡＧＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＧＡＴ ＴＡＣ ＡＣＡ ＴＧＧ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＧＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ Ａ−３’（配列番号３）
ＤＮＡ２ （ｍ−ＧＦＰ５−ＥＲ−Ｓ ５７２−６７０）
５’−ＣＡＡ ＣＴＴ ＣＡＡ ＧＡＣ ＣＣＧ ＣＣＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＧＡ ＡＧＡ ＣＧＧ ＣＧＧ ＣＧＴ ＧＣＡ ＡＣＴ ＣＧＣ ＴＧＡ ＴＣＡ ＴＴＡ ＴＣＡ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＡＣ ＴＣＣ ＡＡＴ ＴＧＧ ＣＧＡ ＴＧＧ ＣＣＣ ＴＧＴ ＣＣＴ ＴＴＴ ＡＣＣ−３’（配列番号４）
ＬＵＣ （２１１３−ＬＵＣ ２６０３−２７０２）
５’−ＴＴＧ ＴＡＡ ＴＡＴ ＴＡＴ ＡＴＧ ＣＡＡ ＡＴＴ ＧＡＴ ＧＡＡ ＴＧＧ ＴＡＡ ＴＴＴ ＴＧＴ ＡＡＴ ＴＧＴ ＧＧＧ ＴＣＡ ＣＴＧ ＴＡＣ ＴＡＴ ＴＴＴ ＡＡＣ ＧＡＡ ＴＡＡ ＴＡＡ ＡＡＴ ＣＡＧ ＧＴＡ ＴＡＧ ＧＴＡ ＡＣＴ ＡＡＡ ＡＡＧ−３’（配列番号５）
Ｎｔａｂ ｍｉＲ１７１
５’−ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＧＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＴＣ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＴＣ ＡＡＴ ＣＡ−３’（配列番号６）
Ｎｔａｂ ｍｉＲ１６７
５’−ＴＴＡ ＧＡＴ ＣＡＴ ＧＣＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＴＴＣ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＴＣ ＡＡＴ ＣＡ−３’（配列番号７）
Ｍｍｕｓ ｍｉＲ１８１ Ｔ
５’−ＴＡＣ ＴＣＡ ＣＣＧ ＡＣＡ ＧＣＧ ＴＴＧ ＡＡＴ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＧＧ ＣＧＣ ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＴＣ Ａ−３’（配列番号８）
Ｍｍｕｓ ｍｉＲ１６ Ｔ
５’−ＴＣＧ ＣＣＡ ＡＴＡ ＴＴＴ ＡＣＧ ＴＧＣ ＴＧＣ ＴＡＴ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＧＣ ＧＣＧ ＧＣＴ ＣＡＡ ＴＣＡ−３’（配列番号９）
ＧＦＰ５−ＥＲ Ｇ１０＋７８６−８１２
５’−ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ Ｃ−３’（配列番号１０）
ＧＦＰ５−ＥＲ Ｇ＋７８６−８１２
５’−ＧＧＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＴＣ ＡＡＴ ＣＡ−３’（配列番号１１）
トータルＲＮＡを雌性マウス成体およびタバコ植物から抽出した。抽出には、コンサート試薬（マウス；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはトリゾール試薬を製造業者（タバコ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示書に記載の通りに用いて行った。
【０１６２】
（ハイブリダイゼーションおよび標識）
上記小ＲＮＡおよびテンプレートＤＮＡ（０．０５ｐｍｏｌ）を含む溶液（総量４μｌ）をハイブリダイーゼション緩衝液（１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で混合してハイブリダイズさせ、そして９５℃で５分間変性させた。続いて、特別な場合を除いて６４℃で６時間インキュベートさせた。ついで、この溶液のうち４μｌを５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩクレノウフラグメントと混合し、３７℃で１〜２時間インキュベートした。反応を、ホルムアミド溶液（２０ｍＭ ＥＤＴＡ、および０．０５％のＢＰＢ）を加えることによって終結させ、９５℃で５分間変性させた。ついで、この混合物を、アクリルアミドゲル（１５％アクリルアミド（アクリルアミド：ビスアクリルアミド １９：１）および７Ｍ尿素（尿素１２．７５ｇ）、４０％ ビスアクリルアミドを１１．２５ｍｌ、１０×ＴＢＥを３ｍｌ、Ｈ２Ｏを３ｍｌ、Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）を３０μｌ、１０％ＡＰＳを３００μｌ加えることによって、１５％変性アクリルアミドゲルを調製した。ＴＢＥは、０．４４５ ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ホウ酸、１０ ｍｍｏｌ／ｌ ＥＤＴＡを５倍溶液として調製した）で３０分間電気泳動（ゲル板１０ｃｍの物を用い、有効ゲル長は約８ｃｍであった。）することによって分離させた。
【０１６３】
別の方法として、１ｐｍｏｌの鋳型ＤＮＡと小ＲＮＡとを変性させ、反応緩衝液（１０×ハイブリダイゼーション緩衝液（１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）を１０分の１量、α−３３Ｐ標識ジデオキシアデノシン三リン酸、シトシン三リン酸、ウラシル三リン酸およびグアノシン三リン酸を含む）中にいれてハイブリダイズさせ、ついでＤＮＡポリメラーゼを加えて、ヌクレオチド伸長を行った後にその反応を終結させた。終結は９５℃で５分間変性させて行ったか、あるいは自然に終結した。
【０１６４】
さらに別の方法として、小ＲＮＡおよびテンプレートＤＮＡ（０．０５ｐｍｏｌ）を含む溶液（総量４μｌ）をハイブリダイーゼション緩衝液（１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ）中で混合してハイブリダイズさせ、そして９５℃で５分間変性させた。続いて、６４℃で６時間インキュベートさせ、この溶液のうち４μｌを５ユニットのＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を加え、そして３７℃で２時間インキュベートさせた。反応を、ホルムアミド／ＥＤＴＡ／ＢＰＢ（０．０５％ ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）および２０ｍＭ ＥＤＴＡをホルムアミドに溶解する）または反応停止／ローディング染色液（０．０５％ （ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、０．０５％ キシレンシアノール（ＸＣ）および２０ｍＭ ＥＤＴＡをホルムアミドに溶解する）溶液を加えることによって終結させ、そして変性アクリルアミド電気泳動に供した。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを用いることによって、本発明者らは、配列特異的な特定長（ここでは１ヌクレオチド）の伸長を検出することができた。
【０１６５】
図３（ａ）にその結果を示す。図３（ａ）は、ポリメラーゼの有無、標的核酸として合成ＲＮＡ（ｓＲＮＡ）の種類（１または２）、鋳型核酸（ＤＮＡ）の種類（１または２）を組み合わせ、配列特異的に標識が行われている様子を示す。示されるように、相補性がある組み合わせで、かつ、ポリメラーゼがある場合に、シグナルが顕著に観察された。その詳細な説明は以下の通りである。
【０１６６】
まず、「３３Ｐ］ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＣＴＰ（いずれもＡｍｅｒｓｈａｍ ＡＨ９５３９、５５．５ＴＢｑ／ｍｍｏｌ＝１，５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を単一のチューブ中で混合してｄｄＮＴＰ混合物とする。
【０１６７】
反応は、１０×Ｍ緩衝液（１０×Ｍ緩衝液として、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ ＤＴＴを用いた。）３μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）０．５μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）０．５μｌ、およびＨ２Ｏ １０．５μｌを加えて１４．５μｌとし、これを９５℃で５分間反応させた後、６時間室温に置いた。これに０．５μｌの５Ｕ／μｌ クレノウフラグメント（東洋紡から入手可能）を加えて反応させ、そのうち３μｌに３μｌのｄｄＮＴＰ混合物を加えて、３７℃で３０分間反応させた。これに４μｌの反応停止／ローディング緩衝液またはＳＴＯＰ溶液を加え、９５℃で２分間で反応を止め、氷上に置いた。これを１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動（ゲル板１０ｃｍの物を用い、有効ゲル長は約８ｃｍであった。）を行って分離して解析を行った。電気泳動は、ＭｉｎｉＧｅｌ
４００Ｖ×３０分間でＰｒｅ Ｒｕｎを行い、その後４００Ｖ×３０分で実行した。その後、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラムにより検出した。
【０１６８】
上述のように、３２Ｐで標識したシグナルの位置は、もともとの２１ヌクレオチド長の小ＲＮＡよりもいくらか高く、一ヌクレオチドの取り込みが反映されていることが分かる。したがって、本発明は、核酸に配列特異的に直接標識を行うことが可能であることが証明された。
【０１６９】
（実施例２：検出条件の改良）
次に、より強いシグナル検出を可能にするために、本発明者らは、ハイブリダイゼーション条件および反応条件の検討を行った。実施例１において使用した３３Ｐ標識に代えて、３２Ｐ標識されたジデオキシアデノシン三リン酸（アマシャム・ファルマシア）を使用した。他の条件は実質的に同様のものを使用した。
【０１７０】
さらに、ハイブリダイゼーションおよび反応工程を、別々に行って、ハイブリダイゼーション効率の改善を試みた。
【０１７１】
鋳型ＤＮＡ１（ｍＧＦＰ、配列番号３および４）および小ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ１）をハイブリダイゼーション緩衝液に混合し、９５℃で５分間変性させた。ついで、これを、７０℃〜５５℃で６時間インキュベートするかまたは室温に冷した。上記混合物のうち４μｌを取り出し、ジデオキシヌクレオチドと混合し、クレノウ酵素を加えて１時間インキュベートした。
【０１７２】
図３（ｂ）は、本発明におけるプライマー−鋳型複合体系性のための温度条件を検証した実験である。その詳細な説明は以下の通りである：
１０×ハイブリダイゼーション緩衝液８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）４０μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２０μｌ、およびＨ２Ｏ １２μｌを加えて総量８０μｌとし、これを１０本に分注して、これらを９５℃で５分間、および７５〜５５℃または室温で６時間反応させた。各々のチューブから４μｌをとり、新たな反応チューブに移し、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、［α−３２Ｐ］ｄｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ＝１１０ＴＢｑ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＰＢ１０２３３、特に言及しない限りこの比活性を使用する）４μｌおよびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させた。この混合物に８．５μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加えた。その後、９５℃で２分間置くことにより反応を止め、氷上に置き、この一部（例えば、１０μｌ）を１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥに）より電気泳動を行って分離して解析を行った。
【０１７３】
放射標識したオリゴヌクレオチドは、変性したアガロースゲルで分離した後に検出した。室温から約７５℃までが検出が容易な温度であり、最も強いシグナルは、６４℃付近で検出されたが、この範囲以外の温度でも観察は可能であった。
【０１７４】
したがって、熱変性および遅い冷却がハイブリダイゼーションに十分であったが、６４℃付近でのインキュベーションを長くすると、ハイブリダイゼーション効率が改善した。
【０１７５】
図３（ｃ）は、図３（ａ）の条件に加え、放射標識ｄｄＡＴＰの有無およびｄＮＴＰとしてＧ＋Ｔ（ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の有無を条件検討した実験である。その詳細な説明は以下の通りである：
１０×ハイブリダイゼーション緩衝液０．８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、およびＨ２Ｏを加えて総量８μｌとして、これを９５℃で５分間、および６４℃で３０分間反応させた。このうち、４μｌをとり、新たな反応チューブに移し、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、［α−３２Ｐ］（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、特に言及しない限りこの比活性を使用する））ｄｄＡＴＰ ４μｌおよびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させた。レーン７のみ、５ｍＭ ｄＴＴＰ１μｌ、５ｍＭ ｄＣＴＰ１μｌ、Ｈ２Ｏ ０．７５μｌ使用した。この混合物に８．５μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加えた。その後９５℃で２分間反応させて反応を終結させ、氷上に置いた。ついで、これを１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動を行って分離して解析を行う。実際に使用したプライマー−鋳型の組合せ、ポリメラーゼ、ｄｄＮＴＰなどは、図３（ｃ）に記載される。
【０１７６】
この反応は、使用されるポリメラーゼ、使用されるジデオキシアデノシン、使用されるプライマーおよび小ＲＮＡと使用される鋳型ＤＮＡとの間の相同性のレベルに密接に依存することを示す。テンプレート１におけるプライマー１のプライミングの後、第一のヌクレオチドはアデノシンであったので、強いシグナルが組み合わせで検出された。テンプレート２におけるプライマー２のものは、チミンであったので、プライマー１は、３２Ｐ標識ジデオキシアデノシンでは標識されない。しかし、デオキシＴＴＰおよびＧＴＰを付加すると、２４ヌクレオチド長付近に強いシグナルが現れ、そしてより高い分子量にさらなるシグナルが現れた。２４ヌクレオチド長のシグナルバンドは、プライマー２に３ヌクレオチド伸長（デオキシＴおよびデオキシＧおよびデオキシＡが付加した）による産物に対応し、そして上のバンドは、プライマーＲＮＡおよび鋳型ＤＮＡへの不正確なヌクレオチド取り込みおよび伸長の結果であると考えられる。鋳型１におけるＲＮＡ１のプライミングがジデオキシＡＴＰによって終結しない場合、反応は、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｃ、Ｇを順番に取り込んでいく。
【０１７７】
ついで、本発明者らは、デオキシＧＴＰなしで、デオキシＡＴＰ、デオキシＴＴＰおよびデオキシＣＴＰを含む反応混合物を調製した。
【０１７８】
図３（ｄ）左は、標識ｄｄＡＴＰ無しで、標識ｄＣＴＰの存在下で、かつ、ｄＡＴＰおよびｄＴＴＰの存在下で、ポリメラーゼの有無の実験効果を示す図である。その詳細な説明は以下の通りである：そのプライマーは、３２ＰデオキシＣＴＰで標識され、そしてデオキシＧＴＰがないことによって、５ヌクレオチド側への伸長が終結するはずである。しかし、この反応は、より高分子量のバンドを複数生じることから、プライマーＲＮＡおよび鋳型ＤＮＡに不適切なヌクレオチドが誤って取り込まれることを示す。
【０１７９】
図３（ｄ）における詳細な実験手順は以下の通りである：
１０×ハイブリダイゼーション緩衝液０．８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、およびＨ２Ｏを加えて総量８μｌとして、これを９５℃で５分間、および６４℃で３０分間反応させた。このうち、４μｌをとり、新たな反応チューブに移し、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、［α−３２Ｐ］（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、特に言及しない限りこの比活性を使用する））ｄＣＴＰ ４μｌ、ｄＡＴＰ １μｌ、ｄＴＴＰ １μｌ、およびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させた。この混合物に８．５μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加えた。これにイソプロパノール沈澱を行い、沈澱したペレットに１０μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加えた。次いで９５℃で５分間反応させ、氷上に置く。この一部（例えば、１０μｌ）を１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動を行って分離して解析を行う。レーン１は、クレノウフラグメント有を示し、レーン２は、クレノウフラグメントなし（代わりにＨ２Ｏ）を示す。
【０１８０】
図３（ｄ）右は、鋳型ＤＮＡにさらに１ヌクレオチドまたは１０ヌクレオチドを付加したものの効果を確認する実験である。その詳細な説明は以下の通りである。
【０１８１】
まず、プライマー１（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）、鋳型のＤＮＡ１（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）、ＤＮＡ１−Ｇ（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）、またはＤＮＡ−１Ｇ１０（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）を使用する。反応は、１０×ハイブリダイゼーション緩衝液０．８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌに３．２μｌのＨ２Ｏを加えて８μｌとして９５℃５分、６４℃３０分で反応させた。このうち４μｌに、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレのウフラグメント０．５μｌ、および［α−３２Ｐ］ｄｄＡＴＰ ４μｌ、およびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させる。これに８．５μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加える。これを１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動を行って分離して解析を行った。
【０１８２】
したがって、本発明者らは、小ＲＮＡによってプライミングされるＤＮＡ合成によって、小ＲＮＡを標識することができる。反応は、配列特異的であり、そして標識されたジデオキシヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼの存在に依存する。標識されたヌクレオチドは、変性アクリルアミドゲル電気泳動およびオートラジオグラフィーによって容易に検出することができた。ジデオキシＡＴＰを用いて、標識された小ＲＮＡの長さを決定することができる。
【０１８３】
小ＲＮＡでプライミングされた反応は、ジデオキシヌクレオチドの取り込みによって直接終結させる（本明細書中では「プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法」とも呼ばれる）。プライマー停止の検出限界を評価するために、合成した小ＲＮＡの１０倍系列希釈物を作製し、これを上記のように標識した。取り込まれていないジデオキシＡＴＰに由来するバックグラウンドを減少させるために、イソプロパノール沈澱を行い、その後、電気泳動を行った。プライマー停止法を用いると、本発明者らは、少なくとも５×１０１８分子（５アットモル）の小ＲＮＡを、一晩曝露することによって検出することができた。これは、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはノーザンブロッティングに基づく従来の方法よりも、顕著に高い。
【０１８４】
（実施例３：ｓｉＲＮＡでの検証）
プライマー停止法の可能性をさらに検証するために、ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｅｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）を用いて、上記実施例と同様の実験を行った。
【０１８５】
翻訳後にサイレンス化されるルシフェラーゼ遺伝子を用いてトランスジェニックタバコからこのｓｉＲＮＡが検出された。以下にその手順を示す。
【０１８６】
ｓｉＲＮＡは、導入遺伝子が転写後型遺伝子不活性化（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ，ＲＮＡ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）によって不活性化されている生物（動物および植物を含む）で見出されていることが知られている。外来遺伝子がＲＮＡサイレンシングによって不活性化されている生物のモデルとして、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６０：３４３−３５２（２００２）に記載されているルシフェラーゼ遺伝子を高発現しているタバコ植物（ＮＷ７−２４−４）および不活性化されているタバコ植物（ＮＷ７−１３−１０）を用いた。鋳型ＤＮＡとして、導入されたルシフェラーゼ遺伝子と同じ配列を持つプラスミドｐＴ３／Ｔ７−ｌｕｃ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を用いた。このプラスミドを１箇所だけ切断する制限酵素ＳｍａＩで切断し、エタノール沈澱によって回収したものを鋳型ＤＮＡとして用いた。制限酵素処理によって閉鎖環状のプラスミドは直鎖状となり、熱変性によって容易に一本鎖へと解離した。
【０１８７】
野生型のタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｓｕｍｓｕｎ ＮＮ）および上記の形質転換植物から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のトライゾール試薬を用いてトータルＲＮＡを調製した。ＲＮＡの抽出および調製方法は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの指示書およびマニュアルに従った。鋳型ＤＮＡ０．５ｐｍｏｌと、調製したトータルＲＮＡ１０μｇの１０×ハイブリダイゼーション緩衝液とを混合し、滅菌水を加えて合計で８μｌとして、９５℃で熱変性後、６４℃で９０分間ハイブリダイゼーションした。このうち、４μｌをとり、１０×クレノウ反応液１．２５μｌ、クレノウフラグメント（５ユニット／μｌ）０．５μｌ、［α−３２Ｐ］ｄｄＡＴＰ ４μｌおよび滅菌蒸留水を２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させる。この反応物をイソプロパノール沈澱させ、沈澱したペレットに１０μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加える。これを、１５％変性アクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、分離して解析を行う。
【０１８８】
Ｌｕｃ遺伝子が、不活性化植物からは２１−２５ヌクレオチド長の部分に強いシグナルが検出されるが、野生型植物およびｌｕｃ植物を高発現している植物からはシグナルが検出されない。
【０１８９】
（実施例４：ｍｉＲＮＡでの検証）
さらに、ｍｉＲＮＡでも同様の実験を行った。本実施例では、ｍｉＲＮＡとして、配列番号６〜９に示されるようなｍｉＲＮＡを選択し、プライマー停止法およびプライマーランオフ法によって検出することができるかどうかを検証した。
【０１９０】
植物ｍｉＲＮＡに相補的な鋳型ＤＮＡおよびマウスｍｉＲＮＡに相補的な鋳型ＤＮＡを合成した。合成は、実質的に上記実施例にしたがって行った。このＤＮＡは、５’末端にＴ残基をさらに含み、それにより、３’末端におけるジデオキシＡＴＰによる標識が可能になった。
【０１９１】
標識および検出については、実質的に上記実施例の手順に従って行った。使用したＲＮＡが配列番号６から９のものであったこと以外は、上記実施例に従って実験を行ってプライマー停止法を行った。
【０１９２】
図４にその結果を示す。図４は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）の検出限界の測定およびプライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）による生物からのｍｉＲＮＡの検出である。
【０１９３】
図４の左図は以下の通りである。
【０１９４】
左図は、図３（ａ）同様、合成ＲＮＡの希釈系列を検出したものである。右側２つは植物から調製したトータルＲＮＡに含まれるｍｉＲＮＡを検出したものである。
Ｌｕｃ：ネガティブコントロールとして植物のコードしないルシフェラーゼ遺伝子ｌｕｃの配列の一部を鋳型とした反応。
ｍｉＲ１７１：植物内在性のｍｉｃｒｏ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であるｍｉＲ１７１と相補的な配列＋一塩基のＴを含む配列を用いたプライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ）法である。このようにして、植物内在性のｍｉＲＮＡを検出することができる。
【０１９５】
以下にタバコｍｉＲＮＡ検出の方法を実施する。
【０１９６】
タバコトータルＲＮＡをＴｒｙｓｏｌ法により５μｇ抽出する。鋳型としてｍｉＲ１７１またはＬＵＣを使用する。
【０１９７】
反応は、１０×ハイブリダイゼーション緩衝液０．８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、およびＨ２Ｏを加えて８μｌとし、９５℃で５分間、および６４℃で３０分間反応させた。このうち、４μｌをとり、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、［α−３２Ｐ］ｄｄＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、特に言及しない限りこの比活性を使用する）４μｌ、およびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させる。この混合物に８．５μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加える。これにイソプロパノール沈澱を行い、沈澱したペレットに１０μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加える。これを１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動を行って分離して解析を行う。
【０１９８】
図４に示されるように、小ＲＮＡを１／１０に系列希釈して検出感度を求めたところ、本発明の方法では、少なくとも５アットモル（５×１０−１８）まで検出することができることが明らかになった。
【０１９９】
プライマー停止法を用いて、本発明者らは、生物の内因性ｍｉＲＮＡを検出することができた。
【０２００】
次に、プライマーランオフ法が機能するかどうかを確認した。
【０２０１】
使用したマウスは、Ｃ５７マウス雌であり、このマウスの脳および心臓から単離したＲＮＡを用いた。
【０２０２】
ＲＮＡとして、コンサートＲＮＡ抽出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を用いた。鋳型として、ＤＮＡ１Ｇ（＝５’−ＧＧＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ ＣＧＧ ＣＴＣ ＡＡＴ ＣＡ−３’（配列番号１２）；ＧＦＰセンスＤＮＡのネガティブコントロール）、ｍｉＲ１６Ｇ（マウスｍｉＲＮＡ検出用のＭｍｕｓ ｍｉＲ１６＝ＧＣＧ ＣＣＡ ＡＴＡ ＴＴＴ
ＡＣＧ ＴＧＣ ＴＧＣ ＴＡＴ ＧＡＴ ＡＴＴ ＧＧＣ ＧＣＧ ＧＣＴ ＣＡＡ
ＴＣＡ−３’（配列番号１３））を用いた。
【０２０３】
反応は、１０×ハイブリダイゼーション緩衝液０．８μｌ、プライマー（０．１ｐｍｏｌ／ｌ）２μｌ、鋳型（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ、およびＨ２Ｏを適宜加えて８μｌとし、これらを９５℃で５分間、および６４℃で３０分間反応させた。このうち、４μｌをとり、新たな反応チューブに移し、１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＡＡ０００５、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）４μｌおよびＨ２Ｏを２．７５μｌ加えて３７℃で１時間反応させた。これをエタノール沈澱し、得られたペレットに２０μｌの反応停止／ローディング緩衝液を加えた。その後、これを１５％変性ＰＡＧＥにより電気泳動（プレランを４００Ｖ×３０分、実行は４００Ｖで３０分間）を行って分離して解析を行った。その結果は図４Ｂに示す。図４Ｂは、プライマーランオフ法でマウスのｍｉＲＮＡを確認することができることを示す。
【０２０４】
このように、本発明によって小ＲＮＡを検出するための新規方法（プライマー停止法）が提供される。これは、単純であるが、高感度であり、あまり時間がかからない方法である。本発明の方法は、従来のノーザンブロットなどに代わって、汎用される可能性を秘めている。
【０２０５】
（実施例５：他の条件改良の検討）
感度を高めるために、ハイブリダイゼーション−反応系を改良し、３２Ｐ標識ジデオキシＡＴＰを用いた実験を行った。主にハイブリダイゼーションの温度の検討を行った。
【０２０６】
少容量のハイブリダイゼーション緩衝液中で合成ＤＮＡ１およびＲＮＡ１（それぞれ１ｐｍｏｌ）を変性した後、７５℃から５５℃で保温もしくはそのまま常温に戻すことでハイブリダイゼーションを行わせた。ハイブリダイズしたＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを、ジデオキシＡＴＰを含に他のヌクレオチドを含まないクレノウ緩衝液（１０倍溶液を、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０，１Ｍ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、および０．５ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを調製し、１０倍希釈する）に加えＤＮＡ合成反応を行わせた。６５℃前後で保温した場合にもっとも高い取り込みが認められるが、緩やかに常温に戻すことでも強い放射活性の取り込みが認められる。
【０２０７】
（プライマー停止法のコントロール実験）
上記により少量での変成−６４℃でのハイブリダイゼーション後、上に示す条件でＤＮＡ合成反応を行わせた。
【０２０８】
（ｉ）３２Ｐの取り込みは、使用されるポリメラーゼ、使用される小ＲＮＡ，使用される鋳型ＤＮＡ，使用されるｄｄＡＴＰおよび使用されるＤＮＡとＲＮＡとの間の相同性に依存している。入れたＲＮＡよりやや移動度の低い（高分子の）位置にバンドが見えることからも、一塩基の取り込みが起きていることが確認できた。
【０２０９】
（ｉｉ）ＤＮＡ２とＲＮＡ２の組み合わせの場合、ＲＮＡ２の次に取り込まれるべき塩基がＴＴＰで有るためにｄｄＡＴＰのみでは取り込みは起きなかった。しかし、ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰを加えることで４塩基先のＡまでＤＮＡ合成反応が進行するため、取り込みを見ることができた。この場合、４塩基の合成反応を反映してより高分子の位置にバンドが現れる。また、非特異反応も多少認められるが、検出には影響がないようである。非特異
的な検出は、例えば、このようにある反応の結果（バンド）が、鋳型と標的との相互作用に依存したものであることを示すコントロールとして使用することによって証明することができる。従って、ＤＮＡ１−ＧおよびＤＮＡ１−Ｇ１０のように二種類の長さを使用することによって、特異的反応であることを確認することが可能である。
【０２１０】
（ｄＣＴＰによるＲＮＡ標識反応）
（ｉｉｉ）ＤＮＡ１−ＲＮＡ１の組み合わせでは、次に続く塩基はＡ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，Ａ，およびＴであり、３２Ｐ−ｄＣＴＰおよびｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ（いずれもジデオキシではなくデオキシ）存在下で反応させることにより、（ｄＧＴＰが存在しないため）３２Ｐ−ｄＣＴＰを取り込みつつ６塩基先で反応が停止する事が期待されたが、（おそらく非特異的な伸長のため）比較的高分子の位置に取り込みがみられた。
【０２１１】
（ＤＮＡ１−ＲＮＡ１の組み合わせにｄｄＡＴＰを用いたプライマー停止反応）
（ｉｖ）ＤＮＡ１Ｇ−ＲＮＡ１の組み合わせで、ｄｄＡＴＰの代わりにｄＣＴＰを用いた。ＤＮＡ１Ｇは、ＲＮＡ１と相補的な配列＋一塩基のＧを有している。この反応では、ジデオキシヌクレオチドによる伸長停止は起きないが、Ｃを付加したところで鋳型が無くなるため、ポリメラーゼによる反応が停止した。
【０２１２】
（ｖ）ＤＮＡ１Ｇ１０−ＲＮＡ１の組み合わせで、ｄＣＴＰを用いた。ＤＮＡ１Ｇ１０は、ＲＮＡ１と相補的な配列＋１０塩基のＧ（５’−ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＡ ＡＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＴＡ ＡＴＧ ＡＴＡ ＴＴＧ ＧＣＧ Ｃ−３’（配列番号１４））を有している。この反応では、Ｃを１０塩基付加したところで鋳型が無くなるため、ポリメラーゼによる反応が停止した。
【０２１３】
期待通り、ＤＮＡ１Ｇを鋳型にした場合、ｄｄＡＴＰによるプライマー停止反応と同様１塩基付加されたと思われるバンドが検出され、ＤＮＡ１−Ｇ１０を用いた場合、さらに高分子のバンドが検出されることから、ターゲットとなる核酸と相補的な配列＋限定された長さの任意の塩基を持つｓｓＤＮＡを鋳型とすることで、ランオフ転写（ｒｕｎ−ｏｆｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）ではなく、ランオフ複製（ｒｕｎ−ｏｆｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）による長さを限定した標識が可能であることが判明した。
【０２１４】
（実施例６：別の標識方法）
上記の実施例に例示したプロトコールは、放射標識したヌクレオチドベースの方法を示したが、別の標識方法によっても、実現することができる。この実施例では、蛍光標識したヌクレオチドによって標識した小ＲＮＡを用いて検出を行った。このような蛍光標識したヌクレオチドによる標識を用いれば、キャピラリー電気泳動および関連技術においても使用することが可能である。したがって本発明は、配列決定技術においても応用することができ、さらに、配列特異的な直接の標識を行うことから、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドにおいて、種々の応用が考えられることになる。
【０２１５】
ここでは、蛍光標識を用いた場合を実証する。
【０２１６】
まず、１０×ハイブリダイゼーション緩衝液（１．５Ｍ ＫＣｌ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、５ｍＭ ＥＤＴＡ）０．８μｌ；プライマー１（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ；鋳型ＤＮＡ１ａ（０．１ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ；およびＨ２Ｏ３．２μｌを加えて８μｌの反応液とする。これを９５℃、５分間反応させ、その後６４℃で３０分間反応させる。これに、８．５μｌの反応液（１０×クレノウ緩衝液１．２５μｌ、クレノウフラグメント０．５μｌ、２０ｍＭ Ｃｙ５−ｄＣＴＰ １．２５μｌ、Ｈ２Ｏ ４μｌ）を加え、３７℃で６０分間インキュベートする。これに、８．５μｌの反応終結／ローディング染色液（０．０５％（ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、０．０５％ キシレンシアノール（ＸＣ）および２０ｍＭ ＥＤＴＡをホルムアミドに溶解する）を加え、９５℃で２分間で反応させた後、氷上に冷やす。これを、１５％ ＰＡＧＥ上で電気泳動して分離して、スキャンする（ＦＬＡ−８０００、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）。
【０２１７】
これによって、蛍光色素を用いた場合でも、本発明の方法が実施できることが分かる。
【０２１８】
（実施例７：逆転写酵素を用いた実験）
上記の実施例に例示したプロトコールは、逆転写酵素を用いた場合でも、実現することができる。
【０２１９】
ここでは、逆転写酵素（東洋紡Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素ＲＮａｓｅＨ Ｍｉｎｕｓ＝コード番号ＲＴＮ−１０１）を用いた場合を実証する。プラスミドとしてｐＴ３／Ｔ７−ＬＵＣ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）を利用する。このプラスミドをＳｍａＩ消化を行い消化産物を生成させる。これにより、Ｔ３のとなりにＬＵＣが並列する平滑末端の産物が生成する。この後、インビトロで転写反応を行う。転写反応は、５×反応緩衝液 １０μｌ；各々１０ｍＭのｒＮＴＰ；Ｔ３ポリメラーゼ（東洋紡コード番号ＳＣ６００１１１） １μｌ：およびＤＮＡ２μｌで５０μｌとして３７℃で３０分間反応を進行させる。この後エタノール沈澱を個々内、１０μｌのＴＥ（組成：１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ含有１０ｍｍｏｌ／Ｌ トリス緩衝液，ｐＨ９．０）中に溶解する。これを鋳型として使用する。この後、１０×ハイブリダイゼーション緩衝液；鋳型核酸（ＬＵＣ ＲＮＡ）２μｌ；タバコ（野生型植物、ＬＵＣ高発現植物またはＬＵＣサイレンシング植物）トータルＲＮＡ ５μｌを合計８μｌとして、９５℃で５分間反応させ、その後６４℃で３０分間反応させる。このうち４μｌに１０×Ｍ−ＭＬＶ 逆転写酵素緩衝液（東洋紡から入手可能。５×反応緩衝液は２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、および５０ｍＭ ＤＴＴ、適宜希釈する。）１．２５μｌ；Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（入手先）０．５μｌ；ＲＮａｓｅインヒビター１μｌ；［α−３２Ｐ］ｄｄＡＴＰ ４μｌ；Ｈ２Ｏ １．２５μｌを加え、３７℃で６０分間反応を行う。これに８．５μｌの停止ローディング緩衝液を加え、イソプロパノール沈澱を行い、１５％ＰＡＧＥにて電気泳動分析を行う。これによって、逆転写酵素を用いた場合でも、本発明の原理が応用できることが明らかになる。
【０２２０】
（実施例８：アレイの構築）
３’末端に、プローブとなる特異的配列を含むＤＮＡを合成し、２００ｐｍｏｌ／μｌに調製する。このＤＮＡを１μｌとりナイロンメンブレンに固定させる。
【０２２１】
ｍＲＮＡ（２μｇ）またはトータルＲＮＡ（４０μｇ）を滅菌済みＭｉｌｌｉＱ水で０．４８ｍｌに調製する。このＲＮＡ溶液を、ナイロンメンブレンを入れたハイブリダイゼーションバッグに注入し、６４℃で３０分間アニーリングさせた後、４２℃で１０分間インキュベートする。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（２００単位／μｌ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）４０μｌ、５×Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ反応緩衝液（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）１５０μｌ、ＤＴＴ（０．１Ｍ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）８０μｌ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを各々４０ｍＭ、ｄＣＴＰを２０ｍＭ、Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）４０μｌ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ（２０ｍＭ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）４０μｌを混合した溶液を作製する。この溶液を、上記ハイブリダイーゼションバッグ中に注入し、暗黒下、４２℃で２時間３０分間反応させる。メンブレンを、遮光下で一次洗浄液（０．２％ ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ（１５ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ ７．０），６５℃）で１回洗浄し、二次洗浄液（０．２％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ、６５℃）で２回洗浄する。水分を除去した後、蛍光スキャナー（ＦＬＡ−８０００、ＦＵＪＩＦＩＬＭ製)を用いて、Ｃｙ５の蛍光を検出およ
び測定する。
【０２２２】
これにより、プライマーアレイ法であっても、本発明が機能することが理解される。
【０２２３】
特定の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０２２４】
本発明は、核酸の検出を簡便に行うことを実現することから、核酸の検出が必要とされる任意の場面（例えば、各種診断）において有用であることから、農業、生命科学が関与する一般産業、医薬品製造業など種々の場面において有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０２２５】
（配列表の説明）
配列番号１：ＲＮＡ１
配列番号２：ＲＮＡ２
配列番号３：ＤＮＡ１（ｍ−ＧＦＰ５−ＥＲ−Ｓ ７２５−８１２）
配列番号４：ＤＮＡ２ （ｍ−ＧＦＰ５−ＥＲ−Ｓ ５７２−６７０）
配列番号５：ＬＵＣ （２１１３−ＬＵＣ ２６０３−２７０２）
配列番号６：Ｎｔａｂ ｍｉＲ１７１
配列番号７：Ｎｔａｂ ｍｉＲ１６７
配列番号８：Ｍｍｕｓ ｍｉＲ１８１ Ｔ
配列番号９：Ｍｍｕｓ ｍｉＲ１６ Ｔ
配列番号１０：ＧＦＰ５−ＥＲ Ｇ１０＋７８６−８１２
配列番号１１：ＧＦＰ５−ＥＲ Ｇ＋７８６−８１２
配列番号１２：ＤＮＡ１−Ｇ
配列番号１３：マウスｍｉＲＮＡ検出用のＭｍｕｓ ｍｉＲ１６
配列番号１４：ＤＮＡ１−Ｇ１０
配列番号１５：ＲＮＡ１−Ｃ（ＤＮＡ１−Ｇ（配列番号１２）を使用した増幅産物）
配列番号１６：ＲＮＡ１−Ｃ１０（ＤＮＡ１−Ｇ１０（配列番号１４）を使用した増幅産物）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標識が導入された核酸を生産するための方法であって、以下の工程：
Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、該鋳型核酸は、該標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに該鋳型核酸は、該標識対 象核酸の相補的な部分と該鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき該標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）該標識対象核酸を、該鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）該標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、該標識対象核酸に少なくとも１つの該標識されたヌクレオチドが該鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；および
Ｄ）該伸長反応の後、生成した混合物から伸長した該標識対象核酸を取り出す工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記標識対象核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識対象核酸は、ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標識対象核酸は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記鋳型核酸は、前記標識対象核酸全部と相補的である配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型核酸は、前記標識対象核酸の両方の先端において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記鋳型核酸は、前記標識対象核酸の少なくとも一方の先端から少なくとも１０ヌクレオチド分長いヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記鋳型核酸の前記長いヌクレオチド配列は、該鋳型核酸の５’末端側に位置している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記鋳型核酸の３’末端側にある該鋳型核酸の前記長いヌクレオチド配列は、該鋳型核酸の５’末端側にある該鋳型核酸の該長いヌクレオチド配列とは異なる長さを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記鋳型核酸の前記長いヌクレオチド配列は該鋳型核酸の５’末端側に位置し、前記標識対象核酸の５’末端部分は該鋳型核酸の３’末端よりも長い、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記鋳型核酸の３’末端側にある該鋳型核酸の前記長いヌクレオチド配列は、該鋳型核酸の５’末端側にある該鋳型核酸の前記長いヌクレオチド配列より、識別可能な長さだけ長い、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記識別可能な程度の長さは、少なくとも１０ヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸合成酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識されたヌクレオチドは、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、酵素および化学発光からなる群より選択される標識で標識されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標識されたヌクレオチドは、放射能を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、変性工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、未反応物を除去する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記未反応物の除去は、エタノール沈澱またはゲル濾過クロマトグラフィーにより達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記未反応物の除去工程は、伸長した前記標識対象核酸を分離する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離は、電気泳動またはクロマトグラフィーにより達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、前記標識を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出は、前記標識を直接または間接的に検出することを包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
伸長した前記標識対象核酸を分離する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記分離の際に、前記検出が行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分離および検出は、オートラジオグラフにより達成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、前記伸長反応を停止させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記停止工程は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ法）またはプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法より達成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標識対象核酸は、プローブとして使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識対象核酸は、検出対象となる核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、３’末端が改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記改変は、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチル ローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ 化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
核酸に標識を導入するための方法であって、以下の工程：
Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、該鋳型核酸は、該標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに、該標識対象核酸の相補 的な部分と該鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき該標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）該標識対象核酸を、該鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；および
Ｃ）該標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行い、該標識対象核酸に少なくとも１つの該標識されたヌクレオチドが該鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
標識が導入された核酸を生産するためのキットであって、以下の手段：
Ａ）標識の導入の対象となる標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに該標的核酸の相補的な部分と該鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき該 標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、鋳型核酸；および
Ｂ）核酸合成酵素；
を備える、キット。
【請求項３７】
Ｃ）標識されたヌクレオチド
をさらに備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
生成した混合物から該標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長された伸長産物とを分離する手段をさらに備える、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
標識されたヌクレオチドを検出する手段をさらに備える、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
さらにコントロールとなる標準標的核酸を備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項４１】
前記標準核酸は、前記鋳型核酸を同定するための核酸および前記標識対象核酸を同定するための核酸からなる群より選択される核酸を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記核酸合成酵素の反応のための試薬をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４３】
前記標識されたヌクレオチドは、核酸合成酵素の反応を停止する作用を有する、請求項３７に記載のキット。
【請求項４４】
支持体をさらに含み、前記鋳型核酸は、該支持体に固定される、請求項３６に記載のキット。
【請求項４５】
前記支持体は、ガラスまたはメンブレンである、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記支持体に固定される前記鋳型核酸は、アレイ状に配置される、請求項４４に記載のキット。
【請求項４７】
前記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、請求項３６に記載のキット。
【請求項４８】
前記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、３’末端が改変されている、請求項３６に記載のキット。
【請求項４９】
前記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされる、請求項３６に記載のキット。
【請求項５０】
前記改変は、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変である、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
前記鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチ ルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされている、請求項３６に記載のキット。
【請求項５２】
標識が導入された核酸が固定された支持体を生産するための方法であって、以下の工程：
Ａ）支持体に固定された標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、該鋳型核酸は、該標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに該標 識対象核酸の相補的な部分と該鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき該標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）該標識対象核酸を、該鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）該標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、該標識対象核酸に少なくとも１つの該標識されたヌクレオチドが該鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；
Ｄ）該伸長反応の後、生成した混合物から伸長した該標識対象核酸を含む支持体を取り出す工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
前記取り出し工程は、該支持体を洗浄して反応物を除去することによって達成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記取り出し工程は、該支持体から標識を除去することによって達成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項１】
標識が導入された核酸を生産するための方法であって、以下の工程：
Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、該鋳型核酸は、該標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに該鋳型核酸は、該標識対 象核酸の相補的な部分と該鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき該標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）該標識対象核酸を、該鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）該標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、該標識対象核酸に少なくとも１つの該標識されたヌクレオチドが該鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；および
Ｄ）該伸長反応の後、生成した混合物から伸長した該標識対象核酸を取り出す工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記標識対象核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡあるいはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標識対象核酸は、ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標識対象核酸は、ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡからなる群より選択されるＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記鋳型核酸は、前記標識対象核酸全部と相補的である配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型核酸は、前記標識対象核酸の両方の先端において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記鋳型核酸は、前記標識対象核酸の少なくとも一方の先端から少なくとも１０ヌクレオチド分長いヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記鋳型核酸の前記長いヌクレオチド配列は、該鋳型核酸の５’末端側に位置している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記鋳型核酸の３’末端側にある該鋳型核酸の前記長いヌクレオチド配列は、該鋳型核酸の５’末端側にある該鋳型核酸の該長いヌクレオチド配列とは異なる長さを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記鋳型核酸の前記長いヌクレオチド配列は該鋳型核酸の５’末端側に位置し、前記標識対象核酸の５’末端部分は該鋳型核酸の３’末端よりも長い、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記鋳型核酸の３’末端側にある該鋳型核酸の前記長いヌクレオチド配列は、該鋳型核酸の５’末端側にある該鋳型核酸の前記長いヌクレオチド配列より、識別可能な長さだけ長い、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記識別可能な程度の長さは、少なくとも１０ヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸合成酵素は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識されたヌクレオチドは、蛍光、放射能、燐光、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、酵素および化学発光からなる群より選択される標識で標識されたヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記標識されたヌクレオチドは、放射能を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、変性工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、未反応物を除去する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記未反応物の除去は、エタノール沈澱またはゲル濾過クロマトグラフィーにより達成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記未反応物の除去工程は、伸長した前記標識対象核酸を分離する工程をさらに包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離は、電気泳動またはクロマトグラフィーにより達成される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記伸長した標識対象核酸を取り出す工程は、前記標識を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出は、前記標識を直接または間接的に検出することを包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
伸長した前記標識対象核酸を分離する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記分離の際に、前記検出が行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記分離および検出は、オートラジオグラフにより達成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
さらに、前記伸長反応を停止させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記停止工程は、プライマー停止（Ｐｒｉｍｅｒ Ｈａｌｔ法）またはプライマーランオフ（Ｐｒｉｍｅｒ Ｒｕｎ−ｏｆｆ）法より達成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記標識対象核酸は、プローブとして使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記標識対象核酸は、検出対象となる核酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、３’末端が改変されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記改変は、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチル ローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシチェーンターミネーション法、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ 化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされている、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
核酸に標識を導入するための方法であって、以下の工程：
Ａ）標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、該鋳型核酸は、該標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに、該標識対象核酸の相補 的な部分と該鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき該標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）該標識対象核酸を、該鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；および
Ｃ）該標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行い、該標識対象核酸に少なくとも１つの該標識されたヌクレオチドが該鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
標識が導入された核酸を生産するためのキットであって、以下の手段：
Ａ）標識の導入の対象となる標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに該標的核酸の相補的な部分と該鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき該 標的核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、鋳型核酸；および
Ｂ）核酸合成酵素；
を備える、キット。
【請求項３７】
Ｃ）標識されたヌクレオチド
をさらに備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
生成した混合物から該標識されたヌクレオチドの未反応物と伸長された伸長産物とを分離する手段をさらに備える、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
標識されたヌクレオチドを検出する手段をさらに備える、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
さらにコントロールとなる標準標的核酸を備える、請求項３６に記載のキット。
【請求項４１】
前記標準核酸は、前記鋳型核酸を同定するための核酸および前記標識対象核酸を同定するための核酸からなる群より選択される核酸を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
前記核酸合成酵素の反応のための試薬をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項４３】
前記標識されたヌクレオチドは、核酸合成酵素の反応を停止する作用を有する、請求項３７に記載のキット。
【請求項４４】
支持体をさらに含み、前記鋳型核酸は、該支持体に固定される、請求項３６に記載のキット。
【請求項４５】
前記支持体は、ガラスまたはメンブレンである、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
前記支持体に固定される前記鋳型核酸は、アレイ状に配置される、請求項４４に記載のキット。
【請求項４７】
前記鋳型核酸は、末端のヌクレオチドが改変されている、請求項３６に記載のキット。
【請求項４８】
前記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、３’末端が改変されている、請求項３６に記載のキット。
【請求項４９】
前記鋳型核酸の末端のヌクレオチドは、標識ヌクレオチドを取り込まないような改変がされる、請求項３６に記載のキット。
【請求項５０】
前記改変は、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変である、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
前記鋳型核酸の３’末端のヌクレオチドが、ジデオキシ化、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）化、ビオチン化、アミノ化、リン酸化、テトラメチ ルローダミン（ＴＡＭＲＡ）化、チオール化およびローダミン化からなる群より選択される改変がされている、請求項３６に記載のキット。
【請求項５２】
標識が導入された核酸が固定された支持体を生産するための方法であって、以下の工程：
Ａ）支持体に固定された標識対象核酸および鋳型核酸を提供する工程であって、該鋳型核酸は、該標識対象核酸の少なくとも一部と相補的であり、さらに該標 識対象核酸の相補的な部分と該鋳型核酸とをハイブリダイズさせたとき該標識対象核酸の少なくとも一方の先端に対する部分において少なくとも１ヌクレオチド長いヌクレオチド配列を有する、工程；
Ｂ）該標識対象核酸を、該鋳型核酸とハイブリダイズさせて標識対象核酸−鋳型核酸複合体を生成する工程；
Ｃ）該標識対象核酸−鋳型核酸複合体に、核酸合成酵素および標識されたヌクレオチドを加えて伸長反応を行う工程であって、該標識対象核酸に少なくとも１つの該標識されたヌクレオチドが該鋳型核酸に基づいて取り込まれる、工程；
Ｄ）該伸長反応の後、生成した混合物から伸長した該標識対象核酸を含む支持体を取り出す工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
前記取り出し工程は、該支持体を洗浄して反応物を除去することによって達成される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記取り出し工程は、該支持体から標識を除去することによって達成される、請求項５２に記載の方法。
【図２】
【図１】
【図３】
【図４】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図３】
【図４】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１１−６２２０７（Ｐ２０１１−６２２０７Ａ）
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２４９１９１（Ｐ２０１０−２４９１９１）
【出願日】平成２２年１１月５日（２０１０．１１．５）
【分割の表示】特願２００７−５１９９５９（Ｐ２００７−５１９９５９）の分割
【原出願日】平成１７年７月６日（２００５．７．６）
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月５日（２０１０．１１．５）
【分割の表示】特願２００７−５１９９５９（Ｐ２００７−５１９９５９）の分割
【原出願日】平成１７年７月６日（２００５．７．６）
【出願人】（５０１１６７６４４）独立行政法人農業生物資源研究所 (200)
【Ｆターム（参考）】
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