腫瘍抗原の生物活性を特異的にブロックする抗体
ＫＡＡＧ１と特異的に結合する新規モノクローナル抗体を記載する。いくつかの実施形態において、抗体は、ＫＡＡＧ１の生物活性をブロックし、癌、さらに詳細には、卵巣、腎臓、肺、直腸結腸、胸部、脳、及び前立腺癌、並びに黒色腫などのＫＡＡＧ１細胞表面発現が増大した癌において、組成物で有用である。本発明はまた、ヒト化及びキメラ抗体などのモノクローナル抗体及び抗原結合フラグメントを発現する細胞に関する。さらに、抗体及びフラグメントを用いて癌を検出する方法及び癌を治療する方法も開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＫＡＡＧ１と特異的に結合するモノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメント並びに卵巣癌に関連する悪性腫瘍の診断、予防及び治療をはじめとする、ある疾患の治療のためのそれらの使用に関する。本発明は、様々な他の癌型の診断、予防及び治療のためのこれらの抗体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
婦人科悪性腫瘍の中でも、卵巣癌は、米国では女性において最も高い腫瘍に関連する死亡率の原因である（Ｊｅｍａｌら、２００５年）。卵巣癌は、米国における女性の癌による死亡の第四番目の原因である（Ｍｅｎｏｎら、２００５年）。米国癌協会は、２００５年に合計２２，２２０の新規症例を予測し、１６，２１０例の死因はこの疾患であるとした（Ｂｏｎｏｍｅら、２００５年）。過去３０年間で、統計値はほとんど変わらず、卵巣癌にかかっている女性のほとんどはこの疾患で死亡する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ及びＶａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ、２００６年）。当該疾患は、１：７０の生涯リスクを伴い、死亡率は６０％を越える（Ｃｈａｍｂｅｒｓ及びＶａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ、２００６年）。高い死亡率は、悪性腫瘍がすでに卵巣以外にも拡大していた場合には卵巣癌の早期発見が困難であるためである。実際、８０％を越える患者が進行期疾患（ＩＩＩ期又はＩＶ期）と診断されている（Ｂｏｎｏｍｅら、２００５年）。これらの患者は予後が悪く、このことは、８０％〜９０％が当初は化学療法に反応するが、５年生存率が４５％未満であることに反映される（Ｂｅｒｅｋら、２０００年）。数年前に５年生存率２０％と比べると成功率が増加しており、これは少なくとも一部には腫瘍組織が卵巣に限定される場合に腫瘍組織を最適に減量できるためであり、これは卵巣癌の重要な予後因子である（Ｂｒｉｓｔｏｗ Ｒ．Ｅ．、２０００年、Ｂｒｏｗｎら、２００４年）。早期疾患（Ｉ期）と診断された患者では、５年生存率は９０を越える（Ｃｈａｍｂｅｒｓ及びＶａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ、２００６年）。
【０００３】
卵巣癌は、卵巣の表層上皮又は表面介在物（ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）由来の異種群の腫瘍を含む。これらは、漿液性、粘液性、類内膜、明細胞、及び女性生殖器官における異なる種類の上皮に対応するブレナー（遷移）型に分類される（Ｓｈｉｈ及びＫｕｒｍａｎ、２００５年）。これらのうち、漿液性腫瘍は診断された卵巣癌症例の約６０％を占める。それぞれの組織学的下位範疇はさらに、それらの臨床的挙動を反映して、良性、中間（境界型腫瘍又は低悪性度（ＬＭＰ））、及び悪性の３群に分類される（Ｓｅｉｄｍａｎら、２００２年）。ＬＭＰは漿液性と診断された腫瘍の１０％〜１５％に相当し、非定型核構造及び転移挙動を示すので難題であるが、高悪性度漿液性腫瘍よりも悪性度はかなり低い。ＬＭＰ腫瘍の患者の５年生存率は９５％であるのに対して、同じ期間の進行した高悪性度疾患について生存率は４５％未満である（Ｂｅｒｅｋら、２０００年）。
【０００４】
現在、卵巣癌の診断は、一つには、患者の病歴の日常的分析を通じて、健康診断、超音波及びＸ線検査、並びに血液学的スクリーニングを実施することによって行われる。血清バイオマーカーの早期血液学的検出のために２つの代替法が報告されている。１つの方法は、癌の有無を検出する未知のタンパク質又はタンパク質フラグメントを見いだすための質量分析法による血清試料の分析である（Ｍｏｒら、２００５年、Ｋｏｚａｋら、２００３年）。しかし、この方法は費用がかかり、広く利用可能ではない。別法として、血清中の既知タンパク質／ペプチドの有無を、抗体マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、又は他の類似の方法を用いて検出する。ＣＡ−１２５（癌抗原１２５）と呼ばれるタンパク質バイオマーカーの血清試験が、卵巣癌のマーカーとして長年広く実施されてきた。しかし、卵巣癌細胞はこれらのタンパク質分子を過剰に産生し得るが、卵管癌又は子宮内膜癌（子宮の内膜の癌）をはじめとする他の癌、膵臓癌患者の６０％、及び他の悪性腫瘍の患者の２０％〜２５％は高レベルのＣＡ−１２５を有する。ＣＡ−１２５試験は、第Ｉ期卵巣癌患者の約５０％についてしか真陽性の結果を示さず、ＩＩ期、ＩＩＩ期、及びＩＶ期卵巣癌患者から真陽性結果がでる可能性は８０％である。卵巣癌患者の残り２０％はＣＡ−１２５濃度の増加を示さない。加えて、高ＣＡ−１２５試験は、月経、妊娠、又は子宮内膜症などの癌と関連しない他の良性活性を示す可能性がある。結果として、この試験は、まだ治療可能であり、１０％未満の陽性予測値（ＰＰＶ）を示す早期疾患の検出に関して臨床用途が非常に限定されている。ＣＡ−１２５に超音波スクリーニングを加えても、ＰＰＶは約２０％しか改善されない（Ｋｏｚａｋら、２００３年）。従って、この試験は有効なスクリーニング試験ではない。
【０００５】
この疾患の病因の知見の向上、積極的な腫瘍縮小手術、及び最新の併用化学療法にもかかわらず、死亡率はほとんど変わっていない。不良転帰は、（１）早期疾患検出のための適切なスクリーニング試験がなく、あわせてこの段階での症状の発現がごくわずかであり、診断は後期段階まで進行した後にしか頻繁に行われず、この時点では癌の腹膜播種のために有効な治療が制限されること、及び（２）標準的化学療法に対する耐性がしばしば発現し、患者の５年生存率の改善が制限されること、に起因する。卵巣癌の初期化学療法レジメンは、カルボプラチン（パラプラチン）及びパクリタキセル（タキソール）の組み合わせを包含する。数年の臨床試験によって、この組み合わせが、有効な手術後に最も有効である（新たに卵巣癌と診断された女性の約８０％において腫瘍体積が減少し、４０％〜５０％では完全に退縮する）ことが明らかになったが、これを改善する方法を求めて引き続き研究が行われている。到達が困難な（ｈａｒｄ−ｔｏ−ｒｅａｃｈ）細胞を標的とする最近の化学療法剤の腹腔内注入は静脈内送達との併用により有効性が増大する。しかし、重篤な副作用のために、多くの場合、治療コースが完了しない。いくつかの他の化学療法剤としては、ドキソルビシン、シスプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、エトポシド、ビンブラスチン、塩酸トポテカン、イホスファミド、５−フルオロウラシル及びメルファランが挙げられる。最近になって、臨床試験によりシスプラチンの腹腔内投与は全身性静脈内化学療法に比べて生存性において優位性があることが証明された（Ｃａｎｎｉｓｔｒａ及びＭｃＧｕｉｒｅ、２００７年）。疾患早期で化学療法を受けた女性の生存率が優れていることは、卵巣癌の検出を改善するための方法を開発する研究活動にとっては当然のことである。さらに、新規卵巣癌関連バイオマーカーの発見は、卵巣癌の将来の治療のための、副作用が最小であるさらに有効な治療法の開発につながる。
【０００６】
卵巣癌の理解および治療におけるこれらの最近の進歩にもかかわらず、化学療法の使用は必ず重大な有害反応を伴い、このためにそれらの使用が制限される。その結果として、抗原組織特異性とモノクローナル抗体の選択性とを組み合わせるなどのさらに特別な方法を要求することにより、的外れに関連する副作用が著しく軽減されるはずである。卵巣癌療法にモノクローナル抗体が使われ始め、行われる臨床試験数が増加している（Ｏｅｉら、２００８年；Ｎｉｃｏｄｅｍｕｓ及びｂｅｒｅｋ、２００５年）。これらの試みのほとんどでは、イットリウム９０などの放射性同位体と結合したモノクローナル抗体、または他の癌型ですでに同定されている腫瘍抗原を標的とする抗体の使用を調べている。これの一例は、血管内皮成長因子を標的とするベバシズマブの使用である（Ｂｕｒｇｅｒ、２００７年）。モノクローナル抗体の治療標的として現在調査中である卵巣癌特異的抗原はほとんどない。数例としては、Ｂ７−Ｈ４と称するタンパク質（Ｓｉｍｏｎら、２００６年）及び最近では葉酸受容体アルファ（Ｅｂｅｌら、２００７年）の使用が挙げられ、後者は最近、ＩＩ期臨床試験に入っている。
【０００７】
腎臓関連抗原１（ＫＡＡＧ１）は、元々は細胞傷害性Ｔリンパ球に対して提示される抗原ペプチドとして組織適合性白血球抗原−Ｂ７腎臓癌細胞系から誘導されるｃＤＮＡライブラリからクローンされた（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅら、１９９９年、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号Ｑ９ＵＢＰ８）。ＫＡＡＧ１を含む座位は、逆ストランド上で両方向に転写された２つの遺伝子をコード化することが判明した。センスストランドは、ＤＣＤＣ２と称するタンパク質をコード化する転写物をコード化することが判明した。これらの著者らによる発現研究により、ＫＡＡＧ１アンチセンス転写物が腫瘍特異的であり、正常組織ではほとんど発現を示さないのに対して、ＤＣＤＣ２センス転写物は偏在的に発現されることが見いだされた（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅら、１９９９年）。癌、特に卵巣癌、腎臓癌、肺癌、結腸癌、乳癌及び黒色腫におけるＫＡＡＧ１転写物の発現は、公開特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１３４号で開示された。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅらはまた、腎臓癌、結腸直腸癌、黒色腫、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳房癌、前立腺癌、食道癌、膀胱腫瘍、肺癌及び頭頸部腫瘍におけるＲＮＡ発現も観察した。近年、連鎖不均衡研究から得られた有力な遺伝学的証拠から、ＶＭＰ／ＤＣＤＣ２／ＫＡＡＧ１座位は失読症と関連することが判明した（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、２００６年、Ｃｏｐｅら、２００５年）。これらの報告のうちの１つは、失読症患者における原因としてＤＣＤＣ２マーカーを挙げた。その理由は、皮質ニューロン移動におけるこのタンパク質の機能がしばしば異常なニューロン移動及び成熟を示すこれらの患者の症状と一致したからであった（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、２００６年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、腫瘍細胞におけるＫＡＡＧ１の発現に関する。本発明はまた、特異的抗ＫＡＡＧ１抗体及び抗原結合フラグメント並びに癌の治療、検出及び診断に有用なキットに関する。抗体及び抗原結合フラグメントは、さらに詳細には、腫瘍細胞がＫＡＡＧ１を発現する癌、たとえば卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺の癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、膀胱癌、肺癌及び頭頸部癌の治療、検出及び診断に有用である。
【０００９】
本発明は、その一態様において、単離又は実質的に精製された抗体又は抗原結合フラグメントを提供し、これらは腎臓関連抗原１（配列番号２で定義されるＫＡＡＧ１）又はＫＡＡＧ１変異体と特異的に結合することができる。
【００１０】
さらに具体的に、そして本発明の実施形態によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３０とアミノ酸８４との間に位置するドメインと結合することができる。
【００１１】
本発明の別の実施形態によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸１〜３５に含まれるエピトープと結合することができる。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３６〜６０内に含まれるエピトープと結合することができる。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸６１〜８４に含まれるエピトープと結合することができる。
【００１４】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、特に、ＫＡＡＧ１の分泌された形態、すなわちシグナルペプチドが切断されたＫＡＡＧ１の形態と特異的に結合することができる。
【００１５】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは特に、ＫＡＡＧ１の細胞外領域と結合することができる。
【００１６】
従って、本発明は、ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対して特異性を有する診断用及び／又は治療用抗体又は抗原結合フラグメントを包含する。本発明の抗体と同じエピトープ特異性を有する抗体又は抗原結合フラグメントも本発明に含まれる。候補抗体は、本明細書に記載する抗体が結合するエピトープと結合するかどうかを究明すること及び／又はこのエピトープと結合することが知られている抗体又は抗原結合フラグメントとの競合分析を実施することによって同定することができる。
【００１７】
従って、本発明の別の態様は、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントと競合できる単離された抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。
【００１８】
本発明の単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞又はＫＡＡＧ１変異体発現腫瘍細胞の死滅（除去、破壊、溶解）を（たとえば、ＡＤＣＣに依存した方法で）誘発できるものを包含する。
【００１９】
本発明の単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の拡大を軽減するそれらの能力によって特徴づけられるもの及びＫＡＡＧ１発現腫瘍の形成を減少させるか又は損なうそれらの能力によって特徴づけられるものも包含する。
【００２０】
抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される場合に特に有効であり得、アンカレッジ依存性成長を特徴とするＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞を標的とするのに特に有用であり得る。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載する特性を有するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体（単離されたもの）並びに抗原結合フラグメントに関する。モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト抗体間の軽鎖及び／又は重鎖の置換を含む抗体又は抗原結合フラグメントも含まれる。
【００２２】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、したがってヒト定常領域のアミノ酸及び／又はヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含み得る。
【００２３】
「抗体」という用語は、インタクト抗体、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を意味する。「抗体」という用語は、二重特異的抗体などの多重特異的抗体も包含する。ヒト抗体は通常、２つの軽鎖及び２つの重鎖から形成され、それぞれは可変領域及び定常領域を含む。軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲ（本明細書では、フレームワーク領域が隣接するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に分類される）を含む。重鎖可変領域は、３つのＣＤＲ（本明細書では、フレームワーク領域が隣接するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３に分類される）を含む。
【００２４】
「抗原結合フラグメント」という用語は、本明細書で用いられる場合、抗原（たとえば、ＫＡＡＧ１、ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はその変異体）と結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能はインタクト抗体のフラグメントによって実行できることが証明された。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィドブリッジにより結合した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１ ５４４−５４６）、並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、たとえばＶＨＣＤＲ３が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する１本鎖ポリペプチド（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られ、たとえばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）にすることができる合成リンカーによってこれらを結合させることができる。このような１本鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれることが意図される。さらに、抗原結合フラグメントは、（ｉ）イムノグロブリンヒンジ領域ポリペプチドと融合した結合ドメインポリペプチド（たとえば、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又はリンカーペプチドを介して軽鎖可変領域と融合した重鎖可変領域）、（ｉｉ）ヒンジ領域と融合したイムノグロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域と融合したイムノグロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメインイムノグロブリン融合タンパク質を含む。ヒンジ領域は、１以上のシステイン残基をセリン残基で置換することにより修飾して、二量化を防止することができる。このような結合ドメインイムノグロブリン融合タンパク質はさらにＵＳ２００３／０１１８５９２及びＵＳ２００３／０１３３９３９で開示されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の通常の技術を用いて得られ、フラグメントをインタクト抗体と同様の方法で有用性についてスクリーンする。
【００２５】
典型的な抗原結合部位は、軽鎖イムノグロブリン及び重鎖イムノグロブリンを対にすることによって形成される可変領域から構成される。抗体可変領域の構造は非常に一貫性があり、非常に類似した構造を示す。これらの可変領域は、典型的には、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する３つの超可変領域が間に配置された比較的相同性のフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。抗原結合フラグメントの全体的な結合活性は、多くの場合、ＣＤＲの配列によって決定される。ＦＲは、多くの場合、最適な抗原結合のためのＣＤＲの３次元における適切な位置決定及びアラインメントに関与する。
【００２６】
本発明の抗体及び／又は抗原結合フラグメントは、たとえば、マウス、ラット若しくは任意の他の哺乳動物又は組換えＤＮＡ技術などを介した他の起源由来のものであってよい。
【００２７】
本発明のさらなる範囲、適用性及び利点は、以下の非限定的で詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この詳細な説明は、本発明の例示的実施形態を示すが、添付の図面を参照して例示のためのみに提示されると解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】２０超の卵巣腫瘍、良性（低悪性度）腫瘍、卵巣癌細胞系、及び３０の正常組織由来のＲＮＡ試料におけるＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡ発現のレベルを測定するために実施した半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いた発現プロファイリング分析を示す図である。対照パネルは、各ＲＴ−ＰＣＲ反応における出発物質の量を比較するために用いられるハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を示す。
【図１Ｂ】ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡが卵巣癌細胞系、特に腹水由来の細胞系において発現されることを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を示す図である。
【図１Ｃ】卵巣癌細胞系がスフェロイドと呼ばれる３Ｄ構造を形成するできることを表す図である。左のパネルは、血清がない培地中で成長させた細胞を示し、一方、５％血清はスフェロイド構造の形成を刺激した。
【図１Ｄ】ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡが卵巣癌細胞系におけるスフェロイド形成中に高度に誘発されることを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験の図である。
【図２Ａ】創傷又はスクラッチ分析、つまりあらかじめ決められた期間にわたって露出部分へ移動できる細胞系の能力の測定である細胞に基づく分析を示す図である。ＫＡＡＧ１ ｓｈＲＮＡを有するＴＯＶ−２１Ｇ細胞は、露出部分を満たす能力が低下している。
【図２Ｂ】コロニー形成法（コロニー生存分析とも呼ばれる）の図である。数日の期間にわたって希釈された細胞の生存を測定した。ＫＡＡＧ１ ｓｈＲＮＡを有するＴＯＶ−２１Ｇ細胞は生存が減少した。
【図３Ａ】クマシーブルーで染色され、一時的にトランスフェクトされた２９３Ｅ細胞において産生された精製Ｆｃ−ＫＡＡＧＩ融合タンパク質の試料（１０μｇ）を含むポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【図３Ｂ】抗ＫＡＡＧ１ Ｆａｂを含むＯｍｎｉｃｌｏｎａｌライブラリ＃３から選択される個々のモノクローナル抗体を含む９６穴プレートのうちの１つのＥＬＩＳＡの結果を示す。この結果から、４８（灰色で強調）のＦａｂがＫＡＡＧ１と非常に効率的に相互作用することがわかった。太字の数字で表示した穴は、例示的モノクローナル抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、及び３Ｃ４を含んでいた。
【図４Ａ】クマシーブルーで染色され、精製Ｆｃ−ＫＡＡＧＩ融合タンパク質（レーン１）、アミノ酸１〜６０の範囲のＫＡＡＧ１のトランケートされた突然変異体（レーン２）、及び一時的にトランスフェクトされた２９３Ｅ細胞において産生された、アミノ酸１〜３５の範囲のＫＡＡＧ１の別のトランケートされた突然変異体（レーン３）の試料（１０μｇ）を含むポリアクリルアミドゲルを示す。全てのタンパク質はＦｃ融合タンパク質であった。
【図４Ｂ】エピトープマッピング研究のために生成させたＫＡＡＧ１のトランケートされた突然変異体を表すスキームである。
【図４Ｃ】Ｏｍｎｉｃｌｏｎａｌライブラリ＃３中に含まれる抗ＫＡＡＧ１抗体によって結合されたエピトープをマッピングするためのＥＬＩＳＡ分析から得られた結果を説明するための図である。結果から、モノクローナル抗体の大部分はＫＡＡＧ１の中心部分と相互作用し、ある抗体はＫＡＡＧ１のアミノ末端又はカルボキシル末端と結合することがわかる。
【図５】マウスＦａｂをＩｇＧ１マウス−ヒトキメラｍＡｂに変えるための関連するステップを表すスキームである。
【図６】マウス抗ＫＡＡＧ１ Ｆａｂの結合を、例示的抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、及び３Ｃ４の対応するＩｇＧ１キメラモノクローナル抗体の結合と比較する図である。結果は、Ｆａｂ可変領域の相対的結合が、完全ヒトＩｇＧ１スカフォールドに移動した場合に維持されたことを示す。
【図７】キメラＩｇＧ１抗ＫＡＡＧ１モノクローナル抗体の存在下でＴＯＶ−２１Ｇ及びＯＶ−９０卵巣癌細胞系を用いたスフェロイド形成実験の図である。ゆるく充填された構造は、低侵襲性癌細胞系の指標となる。結果は、例示的抗ＫＡＡＧ１抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、又は３Ｃ４で処理されたスフェロイドを示す。
【図８Ａ】卵巣腫瘍患者から得られた約７０の生検試料を含む組織マイクロアレイのスキャンを示す図である。試料を３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体でブロットし、卵巣腫瘍の大部分が非常に高レベルのＫＡＡＧ１抗原を発現したことがわかった。
【図８Ｂ】組織マイクロアレイ実験から得られたさらに高倍率の図である。矢印は、漿液性卵巣腫瘍における細胞の上皮層の先端面でのＫＡＡＧ１の膜への局在を示す。
【図８Ｃ】ＫＡＡＧ１があらゆる種類の卵巣癌において高度に発現されることを証明する他の免疫組織化学的研究を示す図である。図示した組織型（ｈｉｓｔｏｔｙｐｅ）は、漿液性、粘液性及び類内膜である。
【図９Ａ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図９Ｂ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図９Ｃ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図１０Ａ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図１０Ｂ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図１０Ｃ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図１１】生成した軽鎖可変領域のそれぞれと配列番号１６、２０、２４又は１０５で同定された代表的な軽鎖可変領域との配列比較を表す図である。配列同一性（％）及び配列類似性（％）は、本明細書で示すようにＢｌａｓｔ２配列プログラムを用いて決定した。
【図１２】生成した重鎖可変領域のそれぞれと、配列番号１８、２２、２６又は１３２で同定された代表的な重鎖可変領域との配列比較を表す図である。配列同一性（％）及び配列類似性（％）は、本明細書で示すようにＢｌａｓｔ２配列プログラムを用いて決定した。
【図１３】ＫＡＡＧ１を標的とするＩｇＧ１抗体はインビトロでＡＤＣＣ活性を効率的に媒介することができる。ＰＢＭＮＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ，ＬＬＣ、カリフォルニア州エモリービル）を３Ｄ３とともに３０分間インキュベートし、ＯＶＣＡＲ−３又はＷＩＬ２−Ｓ細胞のいずれかと１：２５の比で混合した。細胞を４時間３７℃でインキュベートし、培地中のＬＤＨレベルを測定することによって細胞溶解を決定した。細胞傷害性を次のようにして計算した：細胞傷害性（％）＝（実験値−エフェクターの自発的溶解−標的の自発的溶解）×１００／（標的最大溶解−標的自発的溶解）。
【図１４】抗ＫＡＡＧ１ ｍＡｂはインビボでＴＯＶ−１１２Ｄ卵巣腫瘍の拡大を防止する。１×１０６細胞をＳＣＩＤマウスの腹腔中に２００μＬの体積で移植した。ＰＢＳ又はＰＢＳ中で希釈した抗体のいずれかを用いた治療を２５ｍｇ／ｋｇｑｗｋの用量で２日後に実施した。腹部の触診によって腫瘍が検出されるとすぐにマウスを屠殺した。腫瘍の数を視覚的に採点し（Ｂ）、パネルＡのデータを腫瘍／マウス±ＳＥの平均数として表す。
【図１５】扁平上皮細胞癌及び黒色腫から単離されたいくつかの切片のヒト皮膚腫瘍組織マイクロアレイ（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州リッチモンド）上で抗ＫＡＡＧ１抗体を用いて実施した免疫組織化学法を示す図である。
【図１６】キメラ３Ｄ３抗体の存在下又は非存在下での、黒色腫細胞系（Ａ３７５及びＳＫ−ＭＥＬ５）並びに腎臓細胞癌細胞系（Ａ４９８及び７８６−Ｏ）のスフェロイド形成を表す図である。
【図１７Ａ】増加する濃度の３Ｃ４、３Ｄ３及び３Ｇ１０抗体の、細胞を透過しない条件下で固定された細胞系（ＯＶ−９０、ＴＯＶ−２１Ｇ及びＳＫＯＶ−３）に対する結合を表すグラフである。
【図１７Ｂ】３Ｄ３抗体を用いてＳＫＯＶ−３細胞系に関して実施したフローサイトメトリーの結果を表すグラフである。
【図１８Ａ】３Ｄ３抗体モデルの構造を表す略図である。
【図１８Ｂ】３Ｃ４抗体モデルの構造を表す略図である。
【図１９Ａ】キメラ３Ｄ３抗体と比較した、増加する濃度のヒト化３Ｄ３抗体の組換えＫＡＡＧ１に対する結合を表すグラフである。
【図１９Ｂ】ヒト化３Ｄ３抗体、キメラ３Ｄ３抗体、並びにキメラ又はヒト化抗体の軽鎖及び重鎖の置換を含むハイブリッド抗体の動態パラメータをまとめた表である。
【図１９Ｃ】ヒト化３Ｄ３抗体、キメラ３Ｄ３抗体の存在下又は緩衝液若しくは対照ＩｇＧの存在下でのＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞のスフェロイド形成を表す図である。
【図２０Ａ】モノクローナル３Ｄ３軽鎖可変領域（配列番号１６）及びヒト化３Ｄ３軽鎖可変領域（配列番号１７８）の配列アラインメントを表す図である。ヒト化３Ｄ３軽鎖可変領域は、モノクローナル３Ｄ３軽鎖可変領域と８６％同一（９４％配列類似性）であり、それらの３つのＣＤＲは１００％同一である（太字で表示）。
【図２０Ｂ】モノクローナル３Ｄ３重鎖可変領域（配列番号１８）及びヒト化３Ｄ３重鎖可変領域（配列番号１７９）の配列アラインメントを表す。ヒト化３Ｄ３重鎖可変領域はモノクローナル３Ｄ３重鎖可変領域と８２％同一（９１％配列類似性）であり、それらの３つのＣＤＲは１００％同一である（太字で表示）。
【図２１Ａ】モノクローナル３Ｃ４軽鎖可変領域（配列番号２４）及びヒト化３Ｃ４軽鎖可変領域（配列番号１８２）の配列アラインメントを表す。ヒト化３Ｃ４軽鎖可変領域はモノクローナル３Ｃ４軽鎖可変領域と８５％同一（９３％配列類似性）であり、それらの３つのＣＤＲは１００％同一である（太字で表示）。
【図２１Ｂ】モノクローナル３Ｃ４重鎖可変領域（配列番号２６）及びヒト化３Ｃ４重鎖可変領域（配列番号１８３）の配列アラインメントを表す。ヒト化３Ｃ４重鎖可変領域は、モノクローナル３Ｃ４重鎖可変領域と８６％同一（９３％配列類似性）であり、それらの３つのＣＤＲは１００％同一である（太字で表示）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
癌細胞におけるＫＡＡＧ１の発現及び生物活性
本発明は、様々な癌型、特に卵巣癌において見いだされる腫瘍を標的とする抗体の使用に関する。抗体を腫瘍に向かわせるために、癌細胞表面で発現される腫瘍特異性抗原の同定を実施しなければならない。腫瘍特異性抗原を同定するために利用可能な技術がいくつかあり、卵巣腫瘍におけるＫＡＡＧ１を同定するために使用された方法（サブトラクティブトランスクリプションに基づくｍＲＮＡの増幅（ＳＴＡＲ）と呼ばれる革新的な発見の基盤）は、公開特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１３４号に記載されている。
【００３０】
卵巣癌ＳＴＡＲライブラリの分析によって、分泌されたタンパク質及び細胞表面タンパク質をコード化する多くの遺伝子を得た。ＡＢ−０４４７と称するこれらのうちの１つはオープンリーディングフレームを含み、これは、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する８８５塩基対のｃＤＡＮによってコード化された配列番号２に対応する８４のアミノ酸のポリペプチドをコード化した。公的に利用不可能なデータベースを検索することによって、ＡＢ−０４４７ヌクレオチド配列がＫＡＡＧ１と呼ばれる遺伝子と同じであることが明らかになった。バイオインフォーマティック分析によって、その機能的ドメインを細胞外区画に対して提示する膜に固定されたタンパク質が予想された。ＫＡＡＧ１は、最初は腎臓癌ライブラリから細胞表面抗原としてクローンされ、これはその膜局在化を裏付ける結果である。さらに、本発明者らの研究から、タンパク質がそのアミノ末端で処理されることがわかり、これはアミノ酸３０及び３４又はその間の機能的シグナルペプチドの切断と一致した結果であった。さらに、完全長ｃＤＮＡの一時的発現の結果、培地中で切断されたＫＡＡＧ１が検出された。この最後の発見から、この膜に固定されたタンパク質は、高レベルで発現された場合に細胞から除去できることが示された。対照的に、ＫＡＡＧ１のアミノトランケートされた突然変異体の発現によって、タンパク質の細胞内保持が起こった。現在、本発明により開示される様な、卵巣癌におけるＫＡＡＧ１の機能及び過剰発現を明らかにする公開された報告は今までに文書で記録されていない。
【００３１】
従って、本発明者らはＫＡＡＧ１を抗体に基づく診断及び治療に用いることができるかどうかを調査した。
【００３２】
ＴＯＶ−２１Ｇ、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＯＶ−９０などのいくつかの卵巣癌細胞に基づくモデルが確立され、当業者には周知である。これらの細胞は、卵巣腫瘍又は腹水を有する患者由来のヒト卵巣癌細胞系のコレクションの一部である。これらの細胞系は、これらをヒト卵巣癌の優れた細胞に基づくモデルとするマイクロアレイ上の全般的遺伝子発現パターンを包含する徹底的分析を受けた。成長性、遺伝子発現パターン、及び化学療法薬に対する反応は、これらの細胞系がインビボでの卵巣腫瘍挙動の非常に代表的なものであることを示す（Ｂｅｎｏｉｔら、２００７年）。これらの卵巣癌細胞系から単離された全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析から、ＫＡＡＧ１転写物は原発腫瘍由来の細胞系において弱く発現されたことがわかる。対照的に、腹水由来の細胞系は、高レベルのＫＡＡＧ１発現を含んでいた。腹水由来の細胞におけるＫＡＡＧ１の発現の増大は、細胞の環境がＫＡＡＧ１遺伝子の調節に影響を及ぼすことを示唆した。腹水細胞は進行した疾患と関連し、この発現パターンは、ＫＡＡＧ１レベルの増大がアンカレッジ依存性成長と関連することを意味する。この後者の示唆によって、ＫＡＡＧ１発現は、原発腫瘍由来の細胞系において、これらの細胞が３Ｄ培養でスフェロイドとして培養される場合に有意に増大することが判明した。これらのスフェロイドは、広く特徴づけられ、インビボで腫瘍に関連する多くの特性を示すことが判明した（Ｃｏｄｙら、２００８年）。従って、ＫＡＡＧ１の発現は、特に卵巣癌発生中の腫瘍の進行をまねたモデルにおいて有意に増大することが判明した。
【００３３】
ＫＡＡＧ１発現が卵巣癌細胞において調節されることが示されたので、卵巣癌細胞挙動におけるこの遺伝子の機能を細胞に基づいた分析で調べた。その趣旨で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、卵巣癌細胞系における内因性ＫＡＡＧ１遺伝子の発現をノックダウンし、ＫＡＡＧ１の発現の減少の結果、創傷治癒（又はスクラッチ）分析によって例示されるような標準的細胞運動性分析で測定すると細胞の移動が有意に減少することが判明した。この種類の分析は、細胞がコンフルエント単層中の露出部分を満たす速度を測定する。ＫＡＡＧ１の発現が減少すると、コロニー生存分析などのコロニー形成法によって測定される卵巣癌細胞系の生存が減少した。当業者は、癌細胞、特に卵巣癌細胞の挙動におけるＫＡＡＧ１の要件を評価するために他の方法を用いることができる。
【００３４】
卵巣腫瘍の大集団におけるＫＡＡＧ１の発現、正常組織におけるその限定された発現、及び発現レベルと増大した悪性との一致、及び卵巣癌細胞系の挙動におけるＫＡＡＧ１の推定上の生物学的役割に基づいて、卵巣癌の検出、予防、及び治療用抗体を開発するための治療標的としてＫＡＡＧ１を選択した。卵巣癌以外の癌におけるＫＡＡＧ１の発現によっても、本出願者らは他の癌の徴候に関する治療的又は診断的抗体を評価するに至った。
【００３５】
従って、様々な抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメント、たとえばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ及びヒト化抗体（ヒト化モノクローナル抗体を包含する）、抗体フラグメント、１本鎖抗体、ドメイン抗体、及び抗原結合領域を有するポリペプチドであって、ＫＡＡＧ１を標的とするのに有用なものが提供される。
【００３６】
抗原としてのＫＡＡＧ１及びＫＡＡＧ１由来のエピトープ
本出願者は、ＫＡＡＧ１がいくつかの腫瘍型において発現され、患者の血液及び腹水においても見いだされるという予想外の発見に至った。この抗原は従って、インビボで当該抗原を発現する腫瘍細胞を標的とするため、及びインビトロ又はインビボで腫瘍関連抗原を測定するための検出分析の開発に有用であり得る。血液中を循環するＫＡＡＧ１抗原はシグナルペプチドがない。
【００３７】
本発明はしたがって、ＫＡＡＧ１の循環形に特異的及び／又は腫瘍により発現されたＫＡＡＧ１に特異的な抗体を生成するために有用なＫＡＡＧ１抗原を提供する。ＫＡＡＧ１抗原（すなわちエピトープ）は、ＫＡＡＧ１の少なくとも１０個のアミノ酸（かつ８４個までのアミノ酸）のフラグメントを含み得、特にＫＡＡＧ１の細胞外領域と結合し得る。
【００３８】
抗原の一例は、配列番号２又はそのフラグメントと少なくとも８０％の配列同一性を有する全ＫＡＡＧ１タンパク質又は変異体形態である。
【００３９】
ＫＡＡＧ１由来の抗原の別の例は、ＫＡＡＧ１の分泌又は循環形であって、シグナルペプチド又はＫＡＡＧ１の細胞外領域がないものである。この抗原は、さらに詳細には、ＫＡＡＧ１のアミノ酸１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５又は１〜３６がない。
【００４０】
本明細書に記載する抗原又はエピトープは、抗体及び抗原結合フラグメントを生成させるために、キーホールリンペット（ＫＨＬ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）などの担体と融合させることができる。
【００４１】
本発明はまた、本明細書に記載する抗体及び抗原結合フラグメントを生成させるための配列番号２のアミノ酸１〜３５、配列番号２のアミノ酸３６〜６０又は配列番号２のアミノ酸アミノ酸６１〜８４に含まれるエピトープも提供する。本発明はさらに、ＫＡＡＧ１の分泌若しくは循環形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成させるための組成物を提供し、この組成物は、配列番号２のアミノ酸３０〜８４に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープ及び担体を含み得る。エピトープは特に、ＫＡＡＧ１の少なくとも１０個のアミノ酸を含み得る。
【００４２】
組成物の例示的実施形態は、ＫＡＡＧ１の分泌若しくは循環形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成させるための医薬組成物である。医薬組成物は、配列番号２のアミノ酸３０〜８４に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープ及び薬剤的に許容される担体を含み得る。
【００４３】
さらに別の態様において、本発明は、ＫＡＡＧ１の分泌若しくは循環形態に対する抗体を生成させるための方法を提供する。この方法は、配列番号２のアミノ酸３０〜８４に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープを含むポリペプチドを投与することを含み、ここで、エピトープはＫＡＡＧ１シグナルペプチドが欠失している。
【００４４】
あるいは、当該方法は、シグナルペプチドを含むエピトープを投与し、タンパク質の分泌形態又は細胞外領域のみと結合する抗体を選択することを含み得る。
【００４５】
さらなる態様において、本発明は、ＫＡＡＧ１の分泌又は循環形態に対する抗体を生成させるための、配列番号２のアミノ酸３０〜８４に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープの使用を提供する。
【００４６】
ＫＡＡＧ１と結合する抗体及び抗原結合フラグメント
抗体は、最初は興味のある抗原に対するそれらの特異性に関してＦａｂライブラリから単離された。最大の特徴を示す抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のアミノ酸配列の比較によって、ＣＤＲ内及び可変領域内のコンセンサス配列を誘導することができた。ＣＤＲのコンセンサス配列は、配列番号７４〜９０に示される。
【００４７】
本明細書に記載される可変領域を所望の種の定常領域と融合させ、これによって所望の種のエフェクター細胞によって抗体を認識させることができる。定常領域は、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ由来であり得る。定常領域のフレーム中での可変領域を用いたクローニング又は合成は、十分に当業者の技術範囲内であり、たとえば組換えＤＮＡ技術によって実施することができる。
【００４８】
本発明のある実施形態において、ＫＡＡＧ１と結合する抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプのものであってよい。本発明のさらに具体的な実施形態は、ＩｇＧ１サブタイプの抗体に関する。抗体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体媒介性細胞傷害性（ＣＭＣ）の媒介において生物学的に活性であるか、又は免疫複合体と関連するＩｇＧ１サブタイプのヒト化抗体であってよい。典型的なＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化に関与し、ＮＫ細胞の表面上のＦｃ受容体による抗体被覆細胞の認識に依存する。Ｆｃ受容体は、標的細胞、特に、ＫＡＡＧ１などの抗原を発現する癌性細胞の表面と結合するＩｇＧ１上に存在するような抗体のＦｃドメインを認識する。ＩｇＧのＦｃ受容体と結合した時点で、ＮＫ細胞はサイトカイン及び細胞傷害性顆粒を放出し、これらは標的細胞に侵入し、アポトーシスを引き起こすことによって細胞死を促進する。
【００４９】
数例において、抗体３Ｄ３と実質的に同一である軽及び重鎖可変領域を有する抗ＫＡＡＧ１抗体は、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３６〜６０（両端を含む）の範囲のエピトープと相互作用する。他の例では、抗体３Ｇ１０と実質的に同一である軽及び重鎖可変領域を有する抗ＫＡＡＧ１抗体は、ＫＡＡＧ１のアミノ酸６１〜８４（両端を含む）の範囲のエピトープと相互作用する。さらに別の例では、抗体３Ｃ４と実質的に同一である軽及び重鎖可変領域を有する抗ＫＡＡＧ１抗体は、ＫＡＡＧ１のアミノ酸１〜３５（両端を含む）のエピトープと相互作用する。
【００５０】
本発明は、ＫＡＡＧ１と結合する抗体のコレクションを記載する。ある実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、例えばキメラ又はヒト化抗体、抗体フラグメント、例えば抗原結合フラグメント、１本鎖抗体、ドメイン抗体、及び抗原結合領域を有するポリペプチドからなる群から選択することができる。
【００５１】
本発明の一態様において、本発明の単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞又はＫＡＡＧ１変異体発現腫瘍細胞の死滅（除去、破壊、溶解）を（たとえばＡＤＣＣに依存した方法で）誘発することができる。
【００５２】
本発明のさらなる態様において、本発明の単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の拡大を軽減するその能力によって特に特徴づけられる。
【００５３】
本発明のさらなる態様において、本発明の単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍の形成を減少させるかまたは損なう能力により特徴づけられる。
【００５４】
本発明の実施形態によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１がＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される場合にさらに有効であり得る。
【００５５】
また、本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、アンカレッジ依存性成長を特徴とするＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞を標的とするのに特に有用であり得る。
【００５６】
さらなる態様において、本発明は、ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞を含む癌の治療において用いられる、単離された抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００５７】
さらに別の態様において、本発明は、ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞を含む癌の検出において用いられる単離された抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００５８】
本発明の例示的実施形態において、単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、たとえばヒト抗体由来であり得る定常領域のアミノ酸を含み得る。
【００５９】
本発明の別の例示的実施形態において、単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含み得る。
【００６０】
本明細書に記載する例示的実施形態に限定されないが、本出願者は、本明細書に記載する目的のために有用であり得る抗体及び抗原結合フラグメントを生成させた。
【００６１】
本発明は、従って例示的一実施形態において、
（ａ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列、
（ｂ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列、又は
（ｃ）配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列
を有する軽鎖可変領域を含む単離された抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。
【００６２】
単離された抗体又は抗原結合フラグメントはまた、
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、又は
（ｃ）配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
を有する重鎖可変領域を含んでもよい。
【００６３】
例示的一実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域の個々のＣＤＲ又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の組み合わせを含んでもよい。ＣＤＲ３はさらに詳細に選択することができる。組み合わせとしては、たとえば、ＣＤＲＬ１とＣＤＲＬ３；ＣＤＲＬ１とＣＤＲＬ２；ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３及び；ＣＤＲＬ１とＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３が挙げられる。
【００６４】
別の例示的実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域の個々のＣＤＲ又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の組み合わせを含んでもよい。ＣＤＲ３はさらに詳細に選択することができる。組み合わせには、たとえばＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ３；ＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２；ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３及び；ＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３が含まれる。
【００６５】
本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る。
【００６６】
また、本発明によれば抗体又は抗原結合フラグメントは、１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含み得る。
【００６７】
さらに、本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは：
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のうちの少なくとも２つのＣＤＲ及び
（ｂ）ＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２又は１つのＣＤＲＨ３のうちの少なくとも２つのＣＤＲ
を含んでもよい。
【００６８】
抗体又は抗原結合フラグメントは、さらに詳細には、１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含んでもよい。
【００６９】
抗体又は抗原結合フラグメントはまた、さらに詳細には１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含んでもよい。
【００７０】
本発明の他の例示的実施形態は；
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、又は；
（ｃ）配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
を有する重鎖可変領域を含む単離された抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００７１】
本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２又は１つのＣＤＲＨ３を含んでもよい。
【００７２】
本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントはまた、１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含んでもよい。
【００７３】
軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のうちの１つだけが利用可能である場合、抗体又は抗原結合フラグメントを、当該技術分野で公知の方法を用いて相補性可変領域のライブラリをスクリーニングすることによって再構成することができる（Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）１５０：８８０−８８７， Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２：６２４−６２８）。
【００７４】
本明細書に記載する少なくとも１つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も本発明に含まれる。
【００７５】
本発明は、少なくとも２つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も含む。
【００７６】
本発明は、３つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も含む。
【００７７】
本発明は、少なくとも１つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も含む。
【００７８】
本発明は、少なくとも２つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も含む。
【００７９】
本発明は、３つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も含む。
【００８０】
別の態様において、本発明は、（単一のポリペプチド鎖又は別個のポリペプチド鎖上で）本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントのうちの１つの、軽鎖可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域及び重鎖可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域を含むポリペプチド、抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００８１】
本発明は、その別の態様において、（単一のポリペプチド鎖上又は別個のポリペプチド鎖上で）本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントの６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）全てを含み得る抗ＫＡＡＧ１抗体に関する。
【００８２】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、（１つ若しくは複数の）ＣＤＲのアミノ及び／又はカルボキシ領域に隣接するさらなるアミノ酸をさらに含み得る。これらのさらなるアミノ酸は、表Ａ又は表Ｂに示されるようなものであり得るか、又はたとえば保存的アミノ酸置換を含み得る。
【００８３】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ａＳＳＸ２ａＳＬＬＸ３ａＸ４ａＸ５ａＸ６ａＸ７ａＸ８ａＸ９ａＸ１０ａＬＸ１１ａ（配列番号７４）
（式中、Ｘ１ａは塩基性アミノ酸であり；
Ｘ２ａは塩基性アミノ酸であり；
Ｘ３ａはＨ、Ｙ又はＮであり；
Ｘ４ａはＳ、Ｔ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ５ａは存在しないか、Ｓ又はＮであり；
Ｘ６ａはＤ、Ｆ又はＮであり；
Ｘ７ａはＧ又はＱであり；
Ｘ８ａはＫ、Ｌ又はＮであり；
Ｘ９ａはＴ又はＮであり；
Ｘ１０ａは芳香族アミノ酸であり、そして
Ｘ１１ａはＡ、Ｎ、Ｅ又はＹである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【００８４】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ａはＫ又はＲであり得る。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態において、Ｘ２ａはＱ又はＫであり得る。
【００８６】
本発明のさらに別の実施形態において、Ｘ３ａはＮ又はＨであり得る。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態において、Ｘ１０ａはＹ又はＦであり得る。
【００８８】
本発明のさらに具体的な実施形態は、配列番号７４のＣＤＲＬ１を含み、ここで、Ｘ１ａはＫ；Ｘ２ａはＱ；Ｘ３ａはＮ；Ｘ３ａはＨ；Ｘ４ａはＳ；Ｘ４ａはＴ；Ｘ５ａはＳ；Ｘ５ａは存在しない：Ｘ６ａはＮ；Ｘ７ａはＱ；Ｘ７ａはＧ；Ｘ８ａはＫ；Ｘ９ａはＮ；Ｘ９ａはＴ；Ｘ１０ａはＹ；又はＸ１１ａはＡである。
【００８９】
本発明によれば、抗体は、式：
ＫＡＳＱＤＸ１ｂＸ２ｂＸ３ｂＸ４ｂＸ５ｂＸ６ｂ（配列番号７５）
（式中、Ｘ１ｂは疎水性アミノ酸であり；
Ｘ２ｂはＧ又はＨであり；
Ｘ３ｂはＴ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ４ｂはＦ、Ｙ又はＡであり；
Ｘ５ｂは疎水性アミノ酸であり、そして；
Ｘ６ｂはＮ又はＡである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【００９０】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｂはＶ又はＩであり得る。
【００９１】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ５ｂはＶ又はＬであり得る。
【００９２】
本発明のさらに具体的な実施形態は配列番号７５のＣＤＲＬ１を含み、ここで、Ｘ１ｂはＩ；Ｘ２ｂはＨ；Ｘ３ｂはＴ；Ｘ３ｂはＮ；Ｘ４ｂはＹ；Ｘ４ｂはＦ；Ｘ５ｂはＬ、又はＸ６ｂはＮである。
【００９３】
本発明によれば、抗体は、式：
ＦＸ１ｃＳＴＸ２ｃＸ３ｃＳ（配列番号７６）
（式中、Ｘ１ｃはＡ又はＧであり；
Ｘ２ｃはＲ又はＴであり、そして；
Ｘ３ｃはＥ、Ｋ又はＡである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【００９４】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｃはＡであり得、Ｘ２ｃはＴであり得る。
【００９５】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ１ｃはＡであり得、Ｘ２ｃはＲであり得る。
【００９６】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号７６のＣＤＲＬ２を含み、ここで、Ｘ１ｃはＡ；Ｘ２ｃはＲ、又はＸ３ｃはＥである。
【００９７】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ｄＶＳＸ２ｄＸ３ｄＸ４ｄＳ（配列番号７７）
（式中、Ｘ１ｄはＬ又はＫであり；
Ｘ２ｄは塩基性アミノ酸であり；
Ｘ３ｄはＬ又はＲであり、そして；
Ｘ４ｄはＤ又はＦである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【００９８】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｄはＫ又はＮであり得る。
【００９９】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号７７のＣＤＲＬ２を含み、ここで、Ｘ１ｄはＬ；Ｘ２ｄはＫ；Ｘ３ｄはＬ、又はＸ４ｄはＤである。
【０１００】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ｅＡＮＲＬＶＸ２ｅ（配列番号７８）
（式中、Ｘ１ｅは塩基性アミノ酸であり、そして
Ｘ２ｅはＤ又はＡである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０１０１】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｅはＲ又はＨであり得る。
【０１０２】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号７８のＣＤＲＬ２を含み、ここで、Ｘ１ｅはＲであるか、又はＸ２ｅはＤである。
【０１０３】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ｆＱＸ２ｆＸ３ｆＸ４ｆＸ５ｆＰＬＴ（配列番号７９）
（式中、Ｘ１ｆはＱ又はＬであり；
Ｘ２ｆは芳香族アミノ酸であり；
Ｘ３ｆはＤ、Ｆ又はＹであり；
Ｘ４ｆはＥ、Ａ、Ｎ又はＳであり、そして；
Ｘ５ｆはＩ、Ｆ又はＴである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１０４】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｆはＹ又はＨであり得る。
【０１０５】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ３ｆはＹ又はＤであり得る。
【０１０６】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、Ｘ５ｆはＩ又はＴであり得る。
【０１０７】
本発明の他の具体的な実施形態は配列番号７９のＣＤＲＬ３を含み、ここで、Ｘ１ｆはＱ；Ｘ２ｆはＨ；Ｘ３ｆはＤ；Ｘ３ｆはＹ；Ｘ４ｆはＳ；Ｘ４ｆはＥ；Ｘ４ｆはＡ；Ｘ５ｆはＴ、又はＸ５ｆはＩである。
【０１０８】
本発明によれば、抗体は、式：
ＱＱＨＸ１ｇＸ２ｇＸ３ｇＰＬＴ（配列番号８０）
（式中、Ｘ１ｇは芳香族アミノ酸であり；
Ｘ２ｇはＮ又はＳであり、そして；
Ｘ３ｇはＩ又はＴである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１０９】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｇはＦ又はＹであり得る。
【０１１０】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８０のＣＤＲＬ３を含み、ここで、Ｘ２ｇはＳであるか、又はＸ３ｇはＴである。
【０１１１】
本発明によれば、抗体は式：
Ｘ１ｈＱＧＸ２ｈＨＸ３ｈＰＸ４ｈＴ（配列番号８１）
（式中、Ｘ１ｈは芳香族アミノ酸であり；
Ｘ２ｈは中性の親水性アミノ酸であり；
Ｘ３ｈはＦ又はＶであり、そして；
Ｘ４ｈはＲ又はＬである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１１２】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｈはＷ又はＦであり得る。
【０１１３】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ２ｈはＳ又はＴであり得る。
【０１１４】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８１のＣＤＲＬ３を含み、ここで、Ｘ１ｈはＷ；Ｘ２ｈはＴ；Ｘ３ｈはＦ、又はＸ４ｈはＲである。
【０１１５】
本発明によれば、抗体は、式：
ＧＹＸ１ｉＦＸ２ｉＸ３ｉＹＸ４ｉＸ５ｉＨ（配列番号８２）
（式中、Ｘ１ｉはＴ、Ｉ又はＫであり；
Ｘ２ｉは中性の親水性アミノ酸であり；
Ｘ３ｉは酸性アミノ酸であり；
Ｘ４ｉはＥ、Ｎ又はＤであり、そして；
Ｘ５ｉは疎水性アミノ酸である）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０１１６】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｉはＴ又はＳであり得る。
【０１１７】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ３ｉはＤ又はＥであり得る。
【０１１８】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、Ｘ４ｉはＮ又はＥであり得る。
【０１１９】
本発明のさらなる例示的実施形態において、Ｘ５ｉはＭ、Ｉ又はｖであり得る。
【０１２０】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８２のＣＤＲＨ１を含み、ここで、Ｘ２ｉはＴ、Ｘ３ｉはＤ；Ｘ４ｉはＥ；Ｘ５ｉはＩ、又はＸ５ｉはＭである。
【０１２１】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ｊＸ２ｊＤＰＸ３ｊＴＧＸ４ｊＴＸ５ｊ（配列番号８３）
（式中、Ｘ１ｊはＶ又はＧであり、
Ｘ２ｊは疎水性アミノ酸であり；
Ｘ３ｊはＡ、Ｇ又はＥであり；
Ｘ４ｊはＲ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｓ、Ｎ又はＶであり、そして；
Ｘ５ｊは疎水性アミノ酸である）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０１２２】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｊはＩ又はＬであり得る。
【０１２３】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ５ｊはＡ又はＶであり得る。
【０１２４】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８３のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ１ｊはＶ；Ｘ２ｊはＩ；Ｘ３ｊはＥ；Ｘ４ｊはＤ、又はＸ５ｊはＡである。
【０１２５】
本発明によれば、抗体は、式：
ＶＸ１ｋＤＰＸ２ｋＴＧＸ３ｋＴＡ（配列番号８４）
（式中、Ｘ１ｋは疎水性アミノ酸であり；
Ｘ２ｋはＡ、Ｅ又はＧであり；
Ｘ３ｋはＲ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｖ又はＤである）を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０１２６】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｋはＬ又はＩであり得る。
【０１２７】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８４のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ１ｋはＩ、Ｘ２ｋはＥ、又はＸ３ｋはＤである。
【０１２８】
本発明によれば、抗体は、式：
ＹＩＸ１ｌＸ２ｌＸ３ｌＧＸ４ｌＸ５ｌＸ６ｌ（配列番号８５）
（式中、Ｘ１ｌはＳ又はＮであり；
Ｘ２ｌは芳香族アミノ酸であり；
Ｘ３ｌはＤ、Ｅ又はＮであり；
Ｘ４ｌはＤ又はＨであり；
Ｘ５ｌはＹ、Ｓ又はＮであり；
Ｘ６ｌはＤ、Ｅ又はＮである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０１２９】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ３ｌはＤ又はＮであり得る。
【０１３０】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ６ｌはＤ又はＮであり得る。
【０１３１】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８５のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ２ｌはＦ又はＹ、Ｘ３ｌはＮ、Ｘ４ｌはＤ、又はＸ６ｌはＮである。
【０１３２】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ｍＩＮＰＹＮＸ２ｍＶＴＥ（配列番号８６）
（式中、Ｘ１ｍはＮ又はＹであり；そして
Ｘ２ｍはＥ、Ｄ又はＮである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０１３３】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｍはＤ又はＮであり得る。
【０１３４】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８６のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ１ｍはＮであるか、又はＸ２ｍはＤである。
【０１３５】
本発明によれば、抗体は、式：
ＤＩＮＰＸ１ｎＹＧＸ２ｎＸ３ｎＴ（配列番号８７）
（式中、Ｘ１ｎはＮ又はＹであり；
Ｘ２ｎはＧ又はＴであり；そして
Ｘ３ｎはＩ又はＴである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０１３６】
本発明によれば、抗体は、式：
ＭＸ１ｏＸ２ｏＸ３ｏＤＹ（配列番号８８）
（式中、Ｘ１ｏはＧ又はＳであり；
Ｘ２ｏはＹ又はＨであり、そして；
Ｘ３ｏはＡ又はＳである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０１３７】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８８のＣＤＲＨ３を含み、ここで、Ｘ１ｏはＧ；Ｘ２ｏはＹ、又はＸ３ｏはＳである。
【０１３８】
本発明によれば、抗体は、式：
ＩＸ１ｐＹＡＸ２ｐＤＹ（配列番号８９）
（式中、Ｘ１ｐはＧ又はＳであり、そして；
Ｘ２ｐは存在しないか又はＭである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０１３９】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８９のＣＤＲＨ３を含み、ここで、Ｘ１ｐはＳであるか、又はＸ２ｐがＭである。
【０１４０】
本発明によれば、抗体は、式：
ＡＸ１ｑＸ２ｑＧＬＲＸ３ｑ（配列番号９０）
（式中、Ｘ１ｑはＲ又はＷであり；
Ｘ２ｑは芳香族アミノ酸であり、そして；
Ｘ３ｑは塩基性アミノ酸である）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０１４１】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｑはＷ又はＦであり得る。
【０１４２】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ３ｑはＱ又はＮであり得る。
【０１４３】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号９０のＣＤＲＨ３を含み、ここでＸ１ｑはＲ；Ｘ２ｑはＷ、又はＸ３ｑはＮである。
【０１４４】
本明細書で記載する重鎖及び／又は軽鎖のフレームワーク領域は、表Ａ及びＢに示すフレームワーク領域から誘導することができる。抗体又は抗原結合フラグメントは、従って、本明細書に記載する１以上のＣＤＲ（たとえば、特定のＣＤＲ又は配列番号７４〜９０のコンセンサスＣＤＲから選択される）並びに表Ａ及びＢに記載するもの由来のフレームワーク領域を含み得る。表Ａ及びＢでは、予想されるＣＤＲを太字で示し、フレームワーク領域は太字でない。
【０１４５】
表２は、抗ＫＡＡＧ１抗体の具体例の完全軽及び重鎖イムノグロブリンに対応するヌクレオチド及びアミノ酸の配列を記載する。
【０１４６】
【表１】
【０１４７】
ＫＡＡＧ１を結合できる抗体又は抗原結合フラグメントは、表２に記載するいずれか１つのＬ鎖といずれか１つのＨ鎖イムノグロブリンを含み得る。ある実施形態において、抗体３Ｄ３の軽鎖は、３Ｄ３の重鎖又は３Ｇ１０の重鎖と組み合わせて、ＫＡＡＧ１結合活性を有する完全抗体を形成することができる。本発明の例示的実施形態において、３Ｄ３Ｌ鎖を３Ｄ３Ｈ鎖と組み合わせることができるか、３Ｇ１０Ｌ鎖を３Ｇ１０Ｈ鎖と組み合わせることができるか、又は３Ｃ４Ｌ鎖を３Ｃ４Ｈ鎖と組み合わせることができる。さらに、抗体又は抗原結合フラグメントの数例は、表２に記載する抗体のリストからの２つのＬ鎖及びいずれか２つのＨ鎖の任意の組み合わせからなるものであってよい。
【０１４８】
抗体３Ｄ３の軽及び重イムノグロブリン鎖の完全ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号３及び５に示し、抗体３Ｄ３の軽及び重イムノグロブリン鎖の対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４及び６に示す。したがって、例示的一実施形態において、ＫＡＡＧ１と結合する抗体は、配列番号４に示す軽鎖アミノ酸を配列番号６に示す重鎖アミノ酸配列と組み合わせて含み得る。別の実施形態において、抗体は、配列番号４を含む２つの同じ３Ｄ３軽鎖及び配列番号６を含む２つの同じ３Ｄ３重鎖を含み得る。
【０１４９】
抗体３Ｇ１０の軽及び重イムノグロブリン鎖の完全ヌクレオチド配列を配列番号７及び９にそれぞれ示し、抗体３Ｇ１０の軽及び重イムノグロブリン鎖の対応するアミノ酸配列を配列番号８及び１０にそれぞれ示す。したがって、例示的一実施形態において、ＫＡＡＧ１と結合する抗体は、配列番号８に示す軽鎖アミノ酸を、配列番号１０に示す重鎖アミノ酸配列と組み合わせて含み得る。別の実施形態において、抗体は、配列番号８を含む２つの同じ３Ｇ１０軽鎖及び配列番号１０を含む２つの同じ３Ｇ１０重鎖を含み得る。
【０１５０】
抗体３Ｃ４の軽及び重イムノグロブリン鎖の完全ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１１及び１３に示し、抗体３Ｃ４の軽及び重イムノグロブリン鎖の対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１２及び１４に示す。したがって、例示的一実施形態において、ＫＡＡＧ１と結合する抗体は、配列番号１２に示す軽鎖アミノ酸を配列番号１４に示す重鎖アミノ酸配列と組み合わせて含み得る。別の実施形態において、抗体は、配列番号１２を含む２つの同じ３Ｃ４軽鎖及び配列番号１４を含む２つの同じ３Ｃ４重鎖を含み得る。
【０１５１】
軽及び／又は重イムノグロブリン鎖の組み合わせにより形成される他の抗ＫＡＡＧ１抗体又は抗原結合フラグメントの変異体であって、それぞれ独立して、表２に記載するアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有するものも提供される。ある実施形態において、抗体変異体は、少なくとも１つの軽鎖及び１つの重鎖を含み得る。他の例では、抗体変異体は、２つの同じ軽鎖及び２つの同じ重鎖を含み得る。本発明によれば、変異の領域は、定常領域中又は可変領域中に位置してもよい。また、本発明によれば、変異の領域は、フレームワーク領域中に位置してもよい。
【０１５２】
表Ａに記載する可変領域のうちの１つを含む軽鎖及び表Ｂに示す可変領域のうちの１つを含む重鎖を含む抗体も本発明に含まれる。軽鎖及び重鎖は定常領域を含み得る。表２、表Ａ及び表Ｂの軽鎖及び重鎖の組み合わせも本発明に含まれる。
【０１５３】
軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合フラグメントも本発明で提供される。さらに、ある実施形態は、これらの軽及び重鎖可変領域の抗原結合フラグメント、変異体、及び誘導体を包含する。
【０１５４】
本発明のさらに別の例示的実施形態は、配列番号２、配列番号２の細胞外部分、又は配列番号２の分泌形態若しくはその変異体と特異的に結合できる単離された抗体又は抗原結合フラグメントを包含し、この抗体は、
（ａ）配列番号１６で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１８で定義される重鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２０で定義される軽鎖可変領域及び配列番号２２で定義される重鎖可変領域、
（ｃ）配列番号２４で定義される軽鎖可変領域及び配列番号２６で定義される重鎖可変領域、
（ｄ）配列番号１０５で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３２で定義される重鎖可変領域、
（ｅ）配列番号１０６で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３３で定義される重鎖可変領域、
（ｆ）配列番号１０７で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３４で定義される重鎖可変領域、
（ｇ）配列番号１０８で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５４で定義される重鎖可変領域、
（ｈ）配列番号１０９で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５３で定義される重鎖可変領域、
（ｉ）配列番号１１０で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３５で定義される重鎖可変領域、
（ｊ）配列番号１１１で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３６で定義される重鎖可変領域、
（ｋ）配列番号１１２で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４９で定義される重鎖可変領域、
（ｌ）配列番号１１３で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３７で定義される重鎖可変領域、
（ｍ）配列番号１１４で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４０で定義される重鎖可変領域、
（ｎ）配列番号１１５で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４１で定義される重鎖可変領域、
（ｏ）配列番号１１６で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４２で定義される重鎖可変領域、
（ｐ）配列番号１１７で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３９で定義される重鎖可変領域、
（ｑ）配列番号１１９で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４３で定義される重鎖可変領域、
（ｒ）配列番号１２０で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５２で定義される重鎖可変領域、
（ｓ）配列番号１２１で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４６で定義される重鎖可変領域、
（ｔ）配列番号１２２で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３８で定義される重鎖可変領域、
（ｕ）配列番号１２３で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５０で定義される重鎖可変領域、
（ｖ）配列番号１２４で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４４で定義される重鎖可変領域、
（ｗ）配列番号１２６で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４５で定義される重鎖可変領域、
（ｘ）配列番号１２７で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５７で定義される重鎖可変領域、
（ｙ）配列番号１２８で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５５で定義される重鎖可変領域、
（ｚ）配列番号１２９で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５６で定義される重鎖可変領域、又は、
（ａａ）配列番号１３０で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５１で定義される重鎖可変領域
を含む。
【０１５５】
本明細書では、前記の特定の組み合わせの軽鎖可変領域を任意の他の軽鎖可変領域に変えることができると理解されるべきである。同様に、特定の組み合わせの重鎖可変領域を任意の他の重鎖可変領域に変えることができる。
【０１５６】
これらの軽及び重鎖可変領域中に存在する配列の具体例を表３に開示する。
【０１５７】
【表２】
【０１５８】
従って、ＫＡＡＧ１と結合する抗体及び抗原結合フラグメントは、同じ名称の抗体の１つの軽鎖可変領域及び１つの重鎖可変領域または任意の組み合わせを含み得る。たとえば、例示的一実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体又はフラグメントは、３Ｄ３軽鎖可変領域（配列番号１６）及び３Ｄ３重鎖可変領域（配列番号１８）を含み得る。別の実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体又はフラグメントは、３Ｄ３軽鎖可変領域（配列番号１６）及び３Ｇ１０重鎖可変領域（配列番号２２）を含み得る。別の実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体は、２つの同じ軽鎖可変領域及び２つの同じ重鎖領域を含み得る。さらに別の実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体は、２つの異なる軽鎖可変領域及び２つの異なる重鎖領域を含み得る。
【０１５９】
それぞれ、表３に記載するアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有する軽及び／又は重鎖可変領域の組み合わせによって形成される他の抗ＫＡＡＧ１抗体の変異体も提供される。当業者は、抗ＫＡＡＧ１抗体変異体が、表３に記載する軽及び／又は重鎖可変領域のアミノ酸配列において、保存的アミノ酸変化、アミノ酸置換、欠失、又は付加を含み得ることも認めるであろう。
【０１６０】
本発明によれば、変異領域は、可変領域のフレームワーク領域中に位置し得る。
【０１６１】
【表３】
【０１６２】
本発明のある実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体又は抗原結合フラグメントは、表４に示すＣＤＲ配列を含み得るか、又は表４のＣＤＲ配列と実質的な配列同一性を有し得る。例示的一実施形態において、３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体は、それぞれ配列番号２７、２８、及び２９によってコード化されるＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖可変領域、及び／又はそれぞれ配列番号３０、３１、及び３２によってコード化されるＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖可変領域を含み得る。他の実施形態において、ＣＤＲ３領域は抗原結合を提供するために十分であり得る。従って、ＣＤＲ３Ｌ又はＣＤＲ３Ｈ又はＣＤＲ３ＬとＣＤＲ３Ｈとの両方を含むポリペプチドは本発明に含まれる。
【０１６３】
さらに、抗ＫＡＡＧ１抗体又は抗原結合フラグメントは、表４に記載するＣＤＲの任意の組み合わせを含み得る。たとえば、抗体又は抗原結合フラグメントは軽鎖ＣＤＲ３及び重鎖ＣＤＲ３を含み得る。抗ＫＡＡＧ１抗体又は抗原結合フラグメント中に含まれるＣＤＲは、表４に記載するＣＤＲ配列と８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する変異体ＣＤＲであってよいと解釈される。当業者らはまた、変異体が表４に記載するＣＤＲ配列において保存的アミノ酸変化、アミノ酸置換、欠失又は付加を含み得ることを認識するであろう。
【０１６４】
本発明の他の例示的実施形態は、配列番号２、配列番号２の細胞外部分又は配列番号２の分泌形態若しくはその変異体と特異的に結合できる単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含み、この抗体は：
（ａ）配列番号１６で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１８で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｂ）配列番号２０で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号２２で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ；
（ｃ）配列番号２４で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号２６で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ；
（ｄ）配列番号１０５で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３２で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｅ）配列番号１０６で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３３で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｆ）配列番号１０７で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３４で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｇ）配列番号１０８で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５４で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｈ）配列番号１０９で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５３で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｉ）配列番号１１０で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３５で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｊ）配列番号１１１で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３６で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｋ）配列番号１１２で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４９で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｌ）配列番号１１３で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３７で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｍ）配列番号１１４で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４０で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｎ）配列番号１１５で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４１で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｏ）配列番号１１６で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４２で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｐ）配列番号１１７で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３９で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｑ）配列番号１１９で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４３で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｒ）配列番号１２０で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５２で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｓ）配列番号１２１で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４６で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｔ）配列番号１２２で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３８で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｕ）配列番号１２３で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５０で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｖ）配列番号１２４で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４４で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｗ）配列番号１２６で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４５で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｘ）配列番号１２７で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５７で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｙ）配列番号１２８で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５５で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｚ）配列番号１２９で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５６で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、又は；
（ａａ）配列番号１３０で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５１で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ
を含む。
【０１６５】
ここでも、前記の具体的な組み合わせの軽鎖可変領域は、本明細書に記載する任意の他の軽鎖可変領域に変えることができる。同様に、前記の具体的な組み合わせの重鎖可変領域は、本明細書に記載する任意の他の重鎖可変領域に変えることができる。
【０１６６】
変異体抗体及び抗原結合フラグメント
本発明は本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントの変異体も包含する。含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列に変異を有するものである。たとえば、含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの変異体ＣＤＲ（２、３、４、５若しくは６の変異体ＣＤＲ又はさらには１２の変異体ＣＤＲ）、変異体軽鎖可変領域、変異体重鎖可変領域、変異体軽鎖及び／又は変異体重鎖を有するものである。本発明に含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、たとえばもとの抗体又は抗原結合フラグメントと比べて結合親和性が類似しているか又は改善されているものである。
【０１６７】
本明細書で用いられる場合、「変異体」という用語は、本明細書に記載するすべての配列に適用され、例えば、変異体ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３のいずれか）、変異体軽鎖可変領域、変異体重鎖可変領域、変異体軽鎖、変異体重鎖、変異体抗体、変異体抗原結合フラグメント及びＫＡＡＧ１変異体が挙げられる。
【０１６８】
本発明に含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、挿入、欠失又はアミノ酸置換（保存的若しくは非保存的）を含み得るものである。これらの変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されていてもよい。
【０１６９】
置換型突然変異誘発のために最も重要な部位としては、超可変領域（ＣＤＲ）があげられるが、フレームワーク領域またはさらには定常領域における改変も想定される。保存的置換は、下記群（群１〜６）からの（ＣＤＲ、可変鎖、抗体などの）１つのアミノ酸を同じ群の別のアミノ酸と交換することによってなすことができる。
【０１７０】
保存的置換の他の例示的実施形態を、表１Ａ中「好適な置換」という見出しの下に記載する。このような置換の結果、望ましくない性質となる場合、表１Ａで「例示的な置換」と命名したさらに実質的な変化、又はアミノ酸のクラスに関連して以下でさらに記載する様なものを導入して、生成物をスクリーンしてもよい。
【０１７１】
変異体は、置換型突然変異誘発によって生成させることができ、本発明のポリペプチドの生物活性を保持することが、当該技術分野では知られている。これらの変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。たとえば、置換型突然変異誘発に関して興味深い１つの部位は、様々な種から得られる特定の残基が同一である部位を含み得る。「保存的置換」と特定される置換の例を表１Ａに示す。このような置換の結果、望ましくない変化が起こるならば、表１Ａで「例示的置換」と命名される他の種類の置換、又はアミノ酸のクラスに関連して本明細書でさらに記載するようなものを導入し、生成物をスクリーンしてもよい。
【０１７２】
機能又は免疫学的同一性における置換型修飾は、（ａ）置換部分でのポリペプチド骨格の構造、たとえばシートまたは螺旋状構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの影響が有意に異なる置換を選択することによって行う。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて次の群に分類される：
（１群）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Ｍｅｔ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）
（２群）中性親水性：システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）
（３群）酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）
（４群）塩基性：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）
（５群）鎖の配向に影響を及ぼす残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）；及び
（６群）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）
【０１７３】
非保存的置換は、これらの種類のメンバーを互いに交換する。
【０１７４】
【表４】
【０１７５】
変異体抗体又は抗原結合フラグメントのアミノ酸配列における変異は、アミノ酸付加、欠失、挿入、置換等、１以上のアミノ酸の骨格若しくは側鎖における１以上の修飾、又は１以上のアミノ酸（側鎖若しくは骨格）への1つの基若しくは別の分子の付加を包含する。
【０１７６】
変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、もとの抗体又は抗原結合フラグメントアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列において実質的な配列類似性及び／又は配列同一性を有し得る。２つの配列間の類似性の程度は、同一性（同じアミノ酸）及び保存的置換のパーセンテージに基づく。
【０１７７】
一般的に、可変鎖間の類似性及び同一性の程度は、本発明では、Ｂｌａｓｔ２配列プログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），“Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）を用い、デフォルト設定を用いて、すなわち、ｂｌａｓｔｐプログラム、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（オープンギャップ１１及びエクステンションギャップペナルティー１；ｇａｐｘドロップオフ５０、期待値１０．０、ワードサイズ３）及び活性化フィルターを用いて決定した。
【０１７８】
同一性（％）は、従ってもとのペプチドと比較して同一であり、同じか又は類似した位置を占め得るアミノ酸を表す。
【０１７９】
類似性（％）は、同一であり、もとのペプチドと比較して、同じか又は類似した位置にて保存的アミノ酸置換で置換されているアミノ酸を表す。
【０１８０】
本発明の変異体は、従って、もとの配列又はもとの配列の一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有し得るものを含む。
【０１８１】
変異体の例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも８１％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列類似性を有するものである。
【０１８２】
変異体の他の例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも８２％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％配列類似性を有するものである。
【０１８３】
変異体のさらなる例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも８５％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。
【０１８４】
変異体の他の例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。
【０１８５】
変異体のさらなる例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。
【０１８６】
変異体のさらなる例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも９７％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。
【０１８７】
簡潔にするために、本出願者は、本発明に含まれる個々の変異体の例示的実施形態を示し、特定の配列同一性（％）及び配列類似性（％）を含む表１Ｂを提示する。各「Ｘ」は、所与の変異体を示すと解釈される。
【０１８８】
【表５】
【０１８９】
本発明は、本明細書に記載する配列と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、重鎖、抗体及び／又は抗原結合フラグメントを含む。
【０１９０】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの例示的実施形態は、配列番号１６と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号２４と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号１０５と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列及び配列番号１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含むものである。
【０１９１】
これらの軽鎖可変領域は、配列番号２７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号２８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号２９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１９２】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２７と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０１９３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２７と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０１９４】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２８と少なくとも９０％同一であるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０１９５】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２８と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０１９６】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２９と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１９７】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２９と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１９８】
前記軽鎖可変領域は、配列番号３３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号３４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号３５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１９９】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３３と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２００】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３３と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２０１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３４と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２０２】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３４と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２０３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３５と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２０４】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３５と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２０５】
前記軽鎖可変領域は、配列番号３９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号４０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号４１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２０６】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３９と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２０７】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３９と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２０８】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４０と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２０９】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも配列番号４０と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２１０】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４１と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２１１】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４１と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２１２】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１５８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１５９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１６０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２１３】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも配列番号１５８と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２１４】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１５８と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２１５】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１５９と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２１６】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１５９と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２１７】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６０と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２１８】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６０と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２１９】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１６４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１６５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１６６と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２２０】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６４と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２２１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６４と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２２２】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６５と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２２３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６５と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２２４】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６６と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２２５】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６６と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２２６】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１７０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１７１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１７２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２２７】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７０と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２２８】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７０と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２２９】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７１と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２３０】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７１と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２３１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７２と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２３２】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７２と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２３３】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１６のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１６のフレームワーク領域と比較して、２２までのアミノ酸修飾（たとえば保存的又は非保存的アミノ酸置換）をそのフレームワーク領域中に有する軽鎖可変領域を含む。配列番号１６変異体を配列番号１７８に示す。
【０２３４】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２０のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号２０のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２２までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する軽鎖可変領域を含む。
【０２３５】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２４のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号２４のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２１までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する軽鎖可変領域を含む。配列番号２４変異体を配列番号１８２に示す。
【０２３６】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１０５のＣＤＲアミノ酸と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１０５のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２２までのアミノ酸修飾（たとえば保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する、軽鎖可変領域を含む。
【０２３７】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１０９のＣＤＲアミノ酸と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１０９のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２２までのアミノ酸修飾（たとえば保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する、軽鎖可変領域を含む。
【０２３８】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１２６のＣＤＲアミノ酸と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１２６のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２１までのアミノ酸修飾（たとえば保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する、軽鎖可変領域を含む。
【０２３９】
数例において、変異体抗体軽鎖可変領域は、アミノ酸欠失又は付加（アミノ酸置換と組み合わせて、又はアミノ酸置換を含まない）を含み得る。多くの場合、１、２、３、４又は５のアミノ酸欠失又は付加が許容され得る。
【０２４０】
例示的一実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号１８と少なくとも８０％同一である配列、配列番号２２と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号２６と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列及び配列番号１５３と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０２４１】
これらの重鎖可変領域は、配列番号３０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号３１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号３２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２４２】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３０と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２４３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３０と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２４４】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３１と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２４５】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３１と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２４６】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３２と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２４７】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３２と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２４８】
前記重鎖可変領域は、配列番号３６と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号３７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号３８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２４９】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３６と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２５０】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３６と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２５１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３７と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２５２】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３７と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２５３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３８と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２５４】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３８と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２５５】
前記重鎖可変領域は、配列番号４２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号４３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２５６】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４２と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２５７】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４２と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２５８】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４３と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２５９】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４３と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２６０】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４４と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２６１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４４と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２６２】
前記重鎖可変領域は、配列番号１６１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１６２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号１６３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２６３】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６１と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２６４】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６１と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２６５】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６２と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２６６】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６２と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２６７】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６３と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２６８】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６３と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２６９】
前記重鎖可変領域は、配列番号１６７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１６８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号１６９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２７０】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６６と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２７１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６６と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２７２】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６８と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２７３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６８と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２７４】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６９と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２７５】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６９と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２７６】
前記重鎖可変領域は、配列番号１７３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１７４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号１７５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２７７】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７３と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２７８】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７３と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２７９】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７４と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２８０】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７４と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２８１】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７５と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２８２】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７５と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２８３】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１８のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１８のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２２までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。配列番号１８変異体を配列番号１７９に示す。
【０２８４】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２２のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号２２のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２３までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。
【０２８５】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２６のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号２６のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域中で２３までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。配列番号２６変異体を配列番号１８３に示す。
【０２８６】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１３２のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１３２のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域中で２３までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。
【０２８７】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１５３のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１５３のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域中で２３までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。
【０２８８】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１４５のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１４５のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域中で２２までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。
【０２８９】
数例において、変異体抗体重鎖可変領域は、アミノ酸欠失又は付加（アミノ酸置換と組み合わせて、又はアミノ酸置換を含まない）を含み得る。多くの場合、１、２、３、４若しくは５のアミノ酸欠失又は付加が許容される。
【０２９０】
細胞における抗体の産生
本明細書で開示するＫＡＡＧ１抗体は、ハイブリドーマ法又は組換えＤＮＡ法などの当業者に周知の様々な方法によって作製することができる。
【０２９１】
本発明の例示的実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体は、通常のハイブリドーマによって産生することができ、この場合、マウスを抗原で免疫化し、脾臓細胞を単離し、ＨＧＰＲＴ発現が欠失した骨髄種細胞と融合させ、ハイブリッド細胞をヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミン（ＨＡＴ）含有培地によって選択する。
【０２９２】
本発明のさらなる例示的実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体を組換えＤＮＡ法によって産生することができる。
【０２９３】
抗ＫＡＡＧ１抗体を発現するために、本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つなどをコード化できるヌクレオチド配列を、発現ベクター、すなわち特定の宿主において挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳制御のためのエレメントを含むベクター中に挿入することができる。これらのエレメントには、調節配列、たとえばエンハンサー、構成及び誘導性プロモータ、並びに５’及び３’未翻訳領域が含まれる。当業者に周知の方法を用いて、かかる発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが挙げられる。
【０２９４】
当業者に公知の様々な発現ベクター／宿主細胞系を用いて、本明細書に記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列由来のポリペプチド又はＲＮＡを発現することができる。これらとしては、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミッドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；バクロウイルスベクターに感染した昆虫細胞系；ウイルス若しくは細菌発現ベクターで形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。哺乳動物系における組換えタンパク質の長期産生のために、細胞系における安定な発現を実施することができる。たとえば、本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を、同じか又は別のベクター上にウイルス性複製起点及び／又は内因性発現エレメント並びに選択又は可視マーカーを含み得る発現ベクターを用いて細胞系中に形質転換することができる。本発明は、用いられるベクター又は宿主細胞によって限定されない。本発明のある実施形態において、本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列をそれぞれ別の発現ベクター中に結合することができ、各鎖を別に発現させることができる。別の実施形態において、本明細書に記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できる軽及び重鎖の両方を１つの発現ベクター中に結合し、同時に発現させることができる。
【０２９５】
あるいは、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドを、インビトロ転写系又はカップリングしたインビトロ転写／翻訳系をそれぞれ使用して、本明細書に記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含むベクターから発現させることができる。
【０２９６】
一般的に、本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含有し、及び／又は本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列によってコード化されるポリペプチドを発現する宿主細胞、又はその一部は、当業者に公知の様々な手順によって同定することができる。これらの手順としては、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、及び核酸若しくはアミノ酸配列の検出及び／又は定量化のための膜、溶液、又はチップに基づく技術を包含するタンパク質生物検定又は免疫測定技術が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体のいずれかを用いたポリペプチドの発現を検出及び測定するための免疫学的方法は、当該技術分野で公知である。このような技術の例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、及び蛍光表示式細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。当業者らは、本発明にこれらの方法を容易に適合させることができる。
【０２９７】
本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、このように対応するＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）の転写及び／又は細胞培養物からのポリペプチドの発現のための条件下で培養することができる。細胞によって産生されたポリペプチドを、使用される配列及び／又はベクターに応じて分泌させることができるか、又は細胞内に保持することができる。例示的一実施形態において、本明細書に記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、原核又は真核細胞膜を通ってポリペプチドの分泌させるシグナル配列を含むように設計することができる。
【０２９８】
遺伝子コード特有の縮重のために、同じであるか又は実質的に同じであるか、又は機能的に等価なアミノ酸配列をコード化する他のＤＮＡ配列を産生し、たとえば本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列によってコード化されるポリペプチドを発現するために使用することができる。本発明のヌクレオチド配列を、様々な目的、たとえばこれらに限定されるものではないが、遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、及び／又は発現のためにヌクレオチドを改変するために、当該技術分野で一般的に知られている方法を用いて操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのランダムフラグメンテーション及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャッフリングを用いてヌクレオチド配列を操作することができる。たとえば、オリゴヌクレオチド媒介性部位特異的突然変異誘発を用いて、新しい制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変し、コドン優先性の変更、スプライス変異体の産生などの突然変異を導入することができる。
【０２９９】
加えて、宿主細胞株を、所望の方法で挿入された配列の発現を調節するか、又は発現されたポリペプチドを処理するその能力に関して選択することができる。ポリペプチドのこのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的一実施形態において、特定のグリコシル化構造又はパターンを含む抗ＫＡＡＧ１抗体が望ましい場合がある。ポリペプチドの「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングは、タンパク質ターゲティング、フォールディング、及び／又は活性を規定するためにも使用できる。特異的細胞機構及び翻訳後活性に特徴的な機構を有する様々な宿主細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、及びＷ１３８）が市販され、またアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能であり、発現されたポリペプチドの正しい修飾及びプロセッシングを確実にするために選択することができる。
【０３００】
当業者らは、天然、修飾、又は組換え核酸配列を異種配列と結合させて、その結果、前記宿主系のいずれかにおいて異種ポリペプチド部分を含む融合ポリペプチドの翻訳が得られることを容易に理解するであろう。このような異種ポリペプチド部分は、市販の親和性マトリックスを用いて融合ポリペプチドの精製を促進することができる。このような部分としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド、６−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、及び抗体エピトープ、たとえばモノクローナル抗体エピトープが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３０１】
さらに別の態様において、本発明は、融合タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含み得るポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質は、本明細書に記載するポリペプチド（たとえば、完全軽鎖、完全重鎖、可変領域、ＣＤＲなど）と融合する融合パートナー（たとえば、ＨＡ、Ｆｃなど）を含み得る。
【０３０２】
当業者らは、当該技術分野で周知の化学的または酵素的方法を用いて、全体としてまたは部分的に核酸及びポリペプチド配列を合成することができることも容易に理解するであろう。たとえば、ペプチド合成は、様々な固相技術及びＡＢＩ４３１などの機械を用いて実施することができる。ペプチド合成器（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成を自動化することができる。所望により、アミノ酸配列を合成中に改変及び／又は他のタンパク質由来の配列と組み合わせて、変異体タンパク質を産生することができる。
【０３０３】
抗体複合体
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを、検出可能な部分（すなわち、検出若しくは診断目的）又は治療部分（治療目的）と結合させることができる。
【０３０４】
「検出可能な部分」は、分光学、光化学、生化学、免疫化学、化学及び／又は他の物理的手段によって検出可能な部分である。検出可能な部分を直接的及び／又は間接的のいずれかで（たとえば、これらに限定されるものではないが、ＤＯＴＡ又はＮＨＳ結合などの結合を介して）、当該技術分野で周知の方法を用いて本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントとカップリングさせることができる。様々な検出可能な部分を用いることができ、その選択は、必要とされる感度、結合の容易さ、安定性要件及び利用可能な器具に依存する。好適な検出可能な部分としては、これらに限定されるものではないが、蛍光標識、放射性標識（たとえば、これらに限定されないが、１２５Ｉ、Ｉｎ１１１、Ｔｃ９９、Ｉ１３１、ＰＥＴスキャナー用陽電子放出同位体等を包含する）、核磁気共鳴活性標識、発光標識、化学発光標識、発色団標識、酵素標識（たとえば、これらに限定されるものではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、量子ドット及び／又はナノ粒子が挙げられる。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを誘発及び／又は産生することができ、これによって検出可能な部分からのシグナルを検出することが可能になる。
【０３０５】
本発明の別の例示的実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントを治療部分（たとえば、薬剤、細胞傷害性部分）とカップリング（修飾）することができる。
【０３０６】
例示的一実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体及び抗原結合フラグメントは、化学療法剤又は細胞傷害性剤を含んでもよい。たとえば、抗体及び抗原結合フラグメントは、化学療法剤又は細胞傷害性剤と結合させることができる。化学療法剤又は細胞傷害性剤としては、イットリウム９０、スカンジウム４７、レニウム１８６、ヨウ素１３１、ヨウ素１２５、及び当業者により認められる多くの他のもの（たとえば、ルテチウム（たとえば、Ｌｕ１７７）、ビスマス（たとえば、Ｂｉ２１３）、銅（たとえば、Ｃｕ６７））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の例では、化学療法剤又は細胞傷害性剤は、当業者に公知のもののなかでも、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、イリノテカン、タキサン、シュードモナス・エンドトキシン、リシン及び他の毒素から構成され得る。
【０３０７】
あるいは、本発明の方法を実施するために、そして当該技術分野で公知のように、本発明の抗体又は抗原結合フラグメント（共役又は非共役）を、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントと特異的に結合することができ、所望の検出可能な部分、診断部分又は治療部分を有し得る第２の分子（たとえば二次抗体など）と併用することができる。
【０３０８】
抗体の医薬組成物及びそれらの使用
抗ＫＡＡＧ１抗体（共役又は非共役）の医薬組成物も本発明に含まれる。医薬組成物は、抗ＫＡＡＧ１抗体又は抗原結合フラグメントを含んでもよく、また薬剤的に許容される担体も含んでもよい。
【０３０９】
本発明の他の態様は、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメント及び担体を含み得る組成物に関する。
【０３１０】
本発明はまた、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメント及び薬剤的に許容される担体を含み得る医薬組成物にも関する。
【０３１１】
本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載する単離された抗体又は抗原結合フラグメントの、卵巣癌の治療または診断における使用に関する。
【０３１２】
活性成分に加えて、医薬組成物は、水、ＰＢＳ、塩溶液、ゼラチン、油、アルコール、並びに活性化合物を薬剤的に使用できる製剤に加工するのを容易にする他の賦形剤及び助剤を含む薬剤的に許容される担体を含んでもよい。他の例では、このような製剤は滅菌してもよい。
【０３１３】
本明細書で用いられる場合、「医薬組成物」とは、薬剤的に許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体とあわせた治療有効量の薬剤を意味する。「治療有効量」とは、本明細書で用いられる場合、所与の状態及び投与レジメンに関して治療効果をもたらす量を意味する。このような組成物は、液体であるか又は凍結乾燥若しくは他の方法で乾燥された配合物であり、様々な緩衝液内容物（たとえば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、表面への吸収を防ぐためのアルブミン又はゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）を含む。可溶化剤（たとえば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、酸化防止剤（たとえば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（たとえば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質又は等張性改良剤（たとえば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールなどのポリマーのタンパク質に対する共有結合、金属イオンとの錯体形成、又はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物の粒子状調製物中若しくは上、或いはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多重層ベシクル、赤血球ゴースト、又はスフェロプラスト上への物質の組み入れを含む。このような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼす。制御放出又は持続放出組成物には、親油性デポー（たとえば、脂肪酸、ワックス、油）中の配合物が含まれる。ポリマー（たとえば、ポロキサマー又はポロキサミン）でコーティングされた粒子状組成物も本発明に含まれる。本発明の組成物の他の実施形態は、粒子状形態保護コーティング、プロテアーゼ阻害物質又は非経口、肺、鼻、経口、膣、直腸経路をはじめとする様々な投与経路用の透過促進剤を組み入れる。一実施形態において、医薬組成物は、非経口、癌近傍（ｐａｒａｃａｎｃｅｒａｌｌｙ）、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内及び腫瘍内投与される。
【０３１４】
さらに、本明細書で用いられる場合、「薬剤的に許容される担体」又は「医薬担体」は、当該技術分野で公知であり、０．０１〜０．１Ｍ若しくは０．０５Ｍリン酸塩緩衝液又は０．８％塩溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、このような薬剤的に許容される担体は、水性若しくは非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンであってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液（塩溶液及び緩衝媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補給薬、電解質補充薬、たとえばリンガーデキストロース系のものなどが含まれる。保存料及び他の添加剤、たとえば抗菌剤、酸化防止剤、照合剤（ｃｏｌｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、不活性ガスなども存在し得る。
【０３１５】
任意の化合物に関して、治療有効量は、細胞培養試験又はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、若しくはブタなどの動物モデルのいずれかで推定することができる。動物モデルは、濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用いることができる。このような情報を次に、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定するために用いることができる。これらの技術は当業者には周知であり、治療有効量とは、症状又は状態を改善する活性成分の量を意味する。治療効果及び毒性は、細胞培養において又は実験動物を用いて標準的薬剤的手順によって、たとえばＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）統計を計算し、対比することによって決定することができる。本明細書に記載する治療組成物のいずれも、かかる治療を必要とする任意の対象、たとえばこれらに限定されるものではないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及びヒトなどの哺乳動物に適用することができる。
【０３１６】
本発明において用いられる医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所、舌下、又は直腸手段をはじめとする任意の数の経路によって投与することができる。
【０３１７】
「治療」という用語は、本開示に関しては、治療と予防又は防止的処置の両方を意味し、この場合、目的は標的とされる病状又は疾患を予防若しくは減速（軽減）させることである。治療を必要とする者としては、すでに疾患にかかっている者並びに疾患に罹りやすい者又は障害を予防しなければならない者が挙げられる。
【０３１８】
抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメントは、卵巣癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、黒色腫などの様々な癌型の治療において治療的に使用することができる。例示的一実施形態において、抗体及びフラグメントは、卵巣癌において治療に使用される。ある例においては、抗ＫＡＡＧ１抗体及びフラグメントは、ＫＡＡＧ１を発現する癌細胞と相互作用して、ＡＤＣＣを媒介することによって免疫学的反応を誘発することができる。他の例では、抗ＫＡＡＧ１抗体及びフラグメントは、ＫＡＡＧ１とそのタンパク質パートナーとの相互作用をブロックすることができる。
【０３１９】
抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメントは、様々な種類の卵巣癌の治療において治療的に使用することができる。いくつかの異なる細胞型は異なる卵巣癌組織型（ｈｉｓｔｏｔｙｐｅ）を生じさせる可能性がある。卵巣癌の最も一般的な形態は、卵巣又は卵管の上皮細胞層に由来する腫瘍からなる。このような上皮卵巣癌としては、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍、粘液性腫瘍、明細胞腫瘍、及び境界型腫瘍が挙げられる。他の実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメントは、生殖系及び性索卵巣癌などの他の種類の卵巣癌の治療において用いられる。
【０３２０】
ある例では、抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメントを、同じ状態に対して施される他の治療と併用して同時に投与することができる。したがって、抗体を、抗有糸分裂剤（たとえば、タキサン）、白金系薬剤（たとえば、シスプラチン）、ＤＮＡ損傷剤（たとえば、ドキソルビシン）及び当業者に公知の他の抗癌治療薬とともに投与することができる。他の例では、抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメントを他の治療抗体とともに投与することができる。これらとしては、ＥＧＦＲ、ＣＤ−２０、及びＨｅｒ２を標的とする抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３２１】
本発明は、さらなる態様において、ＫＡＡＧ１発現細胞の成長を阻害する方法に関し、この方法は、当該細胞を有効量の本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントと接触させることを含み得る。
【０３２２】
本発明は、哺乳動物において癌を治療するか、又はＫＡＡＧ１発現細胞の成長を阻害する方法も包含し、この方法は、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントを、必要とする哺乳動物に投与することを含む。
【０３２３】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを用いた治療法、診断法及び検出法、並びにかかる目的のための医薬組成物若しくは薬剤の製造におけるこれらの抗体又は抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【０３２４】
本発明に含まれる治療法は、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントを、必要とする哺乳動物、特に癌に罹っているか若しくは癌に罹っている疑いのある患者に投与することを含む。
【０３２５】
本発明はまた、さらなる態様において、腫瘍の拡大、腫瘍浸潤、腫瘍形成を軽減するか、又は腫瘍溶解を誘発する方法も提供し、この方法は、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを、必要とする哺乳動物に投与することを含み得る。
【０３２６】
本発明は、従って、癌の治療、腫瘍の拡大、腫瘍浸潤、腫瘍形成の軽減又はＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の腫瘍溶解（の誘発のための医薬組成物の製造）における、本明細書に記載する単離された抗体の使用に関する。
【０３２７】
抗体又は抗原結合フラグメントは、さらに詳細には、たとえば転移する能力を有する悪性腫瘍及び／又はアンカレッジ依存性成長を特徴とする腫瘍細胞をはじめとする悪性腫瘍に適用可能である。本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、癌の診断においても使用することができる。癌の診断は、癌に罹っているか若しくは癌に罹っている疑いがある哺乳動物に対して本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを投与することによってインビボで実施することができる。診断は、哺乳動物から得た試料を抗体又は抗原結合フラグメントと接触させ、ＫＡＡＧ１を発現する細胞（腫瘍細胞）の有無を判断することによって、エクスビボで実施することもできる。
【０３２８】
本発明は、哺乳動物において癌を検出するか又はＫＡＡＧ１発現細胞を検出する方法も包含し、この方法は、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントを、必要とする哺乳動物に投与することを含み得る。
【０３２９】
本発明は、その別の態様において、ＫＡＡＧ１発現細胞を検出する方法に関し、この方法は、細胞を本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントと接触させ、抗体及びＫＡＡＧ１発現細胞によって形成される複合体を検出することを含み得る。検出法で使用される抗体又は抗原結合フラグメントの例示的実施形態は、ＫＡＡＧ１の細胞外領域と結合できるものである。
【０３３０】
検出法で使用される抗体又は抗原結合フラグメントの他の例示的実施形態は、腫瘍細胞の表面で発現されるＫＡＡＧ１と結合するものである。
【０３３１】
本明細書で記載する治療、検出又は診断法から恩恵を受ける患者は、卵巣癌（たとえば、漿液性、類内膜、明細胞若しくは粘液性）、皮膚癌（たとえば、黒色腫、扁平上皮細胞癌）、腎臓癌（たとえば、乳頭細胞癌、明細胞癌）、結腸直腸癌（たとえば、結腸直腸癌腫）、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌（たとえば、乳房癌）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）（たとえば、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ））、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍（たとえば、肺癌）又は頭頸部腫瘍に罹っているか若しくは罹っている疑いのある患者であり、特に癌が悪性であることを特徴とする場合及び／又はＫＡＡＧ１発現細胞がアンカレッジ依存性成長を特徴とする場合である。
【０３３２】
本発明に特に含まれるのは、卵巣癌（たとえば、漿液性、類内膜、明細胞若しくは粘液性）、皮膚癌（たとえば、黒色腫、扁平上皮細胞癌）又は腎臓癌（たとえば、乳頭細胞癌）に罹っているか若しくは罹っている疑いがある患者であり、特に癌が悪性であることを特徴とする場合及び／又はＫＡＡＧ１発現細胞がアンカレッジ依存性成長を特徴とする場合である。
【０３３３】
本発明の別の態様は、ＫＡＡＧ１（配列番号２）、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＫＡＡＧ１変異体又はＫＡＡＧ１若しくはＫＡＡＧ１変異体の分泌形態若しくは循環形態を検出する方法に関し、この方法は、ＫＡＡＧ１若しくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞又はＫＡＡＧ１若しくはＫＡＡＧ１変異体を含むか若しくは含むことが疑われる試料（生検、血清、血漿、尿など）を、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントと接触させ、結合を測定することを含み得る。試料は、癌（たとえば、卵巣癌）に罹っているか、又は癌（たとえば、卵巣癌）に罹っていることが疑われる哺乳動物（たとえば、ヒト）由来であり得る。試料は、哺乳動物から得られる組織試料又は細胞培養物上清であり得る。
【０３３４】
本発明によれば、試料は、哺乳動物から得られる血清試料、血漿試料、血液試料又は腹水であってよい。本明細書で記載する抗体又は抗原結合フラグメントは、有利には、ＫＡＡＧ１の分泌又は循環形態（血液中を循環）を検出することができる。
【０３３５】
当該方法は、ＫＡＡＧ１又はＫＡＡＧ１変異体と結合する抗体又は抗原結合フラグメントによって形成される複合体を定量化することを含み得る。
【０３３６】
抗体の抗原との結合は、抗原の予想される分子量を増大させる。従って、抗体又は抗原結合フラグメントと抗原との特異的結合によって物理的変化が起こる。
【０３３７】
このような変化は、たとえば電気泳動とそれに続くウェスタンブロット及びゲル又はブロットの着色、質量分析法、コンピュータとカップリングさせたＨＰＬＣなどを用いて検出することができる。分子量におけるシフトを計算できる他の装置は当該技術分野で公知であり、たとえば、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（商標）が挙げられる。
【０３３８】
抗体がたとえば検出可能な標識を含む場合、抗原−抗体複合体は、標識によって放出される蛍光、標識の放射線放出、その基質を用いて得られる標識の酵素活性などにより検出することができる。
【０３３９】
抗体又は抗原結合フラグメントと抗原との間の結合の検出及び／又は測定は、当該技術分野で公知の様々な方法によって実施することができる。抗体又は抗原結合フラグメントと抗原との間の結合は、検出可能な標識によって放出されるシグナル（放射線放出、蛍光、変色など）を検出できる装置を用いてモニタリングすることができる。このような装置は、生じた際に結合を示すデータを提供し、抗原に結合した抗体の量に関する表示も提供し得る。装置（通常、コンピュータとカップリングしたもの）は、バックグラウンドシグナル（たとえば、抗原−抗体結合の非存在下で得られるシグナル）又はバックグラウンドノイズと特異的抗体−抗原結合によって得られるシグナルとの差を計算することもできる。このような装置は、従って、抗原が検出されたかどうかに関する表示及び結論を使用者に提供する。
【０３４０】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載する１以上の抗体又は抗原結合フラグメントを含む１以上の容器を含み得るキットに関する。
【０３４１】
核酸、ベクター及び細胞
抗体は、通常、細胞中で作製され、軽鎖及び重鎖をコード化する核酸配列を含む（１つ若しくは複数の）ベクターから発現される軽鎖及び重鎖の発現を可能にする。
【０３４２】
本発明はしたがって、本明細書に記載するＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、重鎖のいずれかをコード化することができる核酸を含む。
【０３４３】
本発明はしたがって、さらなる態様において、ＫＡＡＧ１と特異的に結合できる抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコード化する核酸に関する。
【０３４４】
本発明の実施形態によれば、核酸は、特に、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の死滅（除去、破壊、溶解）を誘発することができる抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコード化することができる。
【０３４５】
本発明の別の実施形態によれば、核酸は、特に、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の拡大を軽減することができる抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコード化することができる。
【０３４６】
本発明のさらに別の実施形態によれば、核酸は、特に、ＫＡＡＧ１発現腫瘍の形成を減少又は損なうことができる抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコード化することができる。
【０３４７】
本発明の核酸の例示的実施形態は：
（ａ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列；
（ｂ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列、又は；
（ｃ）配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列
を含む軽鎖可変領域をコード化する核酸を含む。
【０３４８】
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る軽鎖可変領域をコード化することができる。
【０３４９】
また、本発明によれば、核酸は、１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域をコード化することができる。
【０３５０】
本発明はまた：
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、又は、
（ｃ）配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
を含む重鎖可変領域をコード化する核酸にも関する。
【０３５１】
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る重鎖可変領域をコード化することができる。
【０３５２】
本発明によれば、核酸は、１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含み得る重鎖可変領域をコード化することができる。
【０３５３】
少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する抗体変異体をコード化する核酸も本発明に含まれる。
【０３５４】
本発明によれば、核酸は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３５５】
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲのうちの少なくとも２つにおいて少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３５６】
本発明によれば、核酸は、３つのＣＤＲにおいて少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３５７】
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲの少なくとも１つにおいて少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３５８】
本発明によれば、核酸はＣＤＲの少なくとも２つにおいて少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３５９】
本発明によれば、核酸は３つのＣＤＲにおいて少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３６０】
本発明の他の態様は、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域をコード化する核酸に関する。
【０３６１】
本発明のさらに別の態様は、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域をコード化する核酸に関する。本発明の他の態様は、配列番号１、配列番号１の１０〜８８４ヌクレオチドのフラグメント及び前記のいずれかの補体からなる群から選択される核酸の、ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞の移動又は生存を損なうための使用に関する。かかる核酸の例示的実施形態は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイムなどを含む。
【０３６２】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書で記載する核酸を含むベクターに関する。
【０３６３】
本発明によれば、ベクターは発現ベクターであってよい。
【０３６４】
特定の宿主における挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳制御のためのエレメントを含むベクターは、当該技術分野で公知である。これらのエレメントには、調節配列、たとえばエンハンサー、構成及び誘導性プロモータ、並びに５’及び３’未翻訳領域が含まれる。当業者に周知の方法を用いて、このような発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが挙げられる。
【０３６５】
別の態様において、本発明は本明細書に記載する核酸を含み得る単離された細胞に関する。
【０３６６】
単離された細胞は、軽鎖可変領域をコード化する核酸及び重鎖可変領域をコード化する核酸を別個のベクター上又は同じベクター上のいずれかで含み得る。単離された細胞は、別のベクター上又は同じベクター上のいずれかで軽鎖をコード化する核酸及び重鎖をコード化する核酸も含み得る。
【０３６７】
本発明によれば、細胞は、抗体又はその抗原結合フラグメントを発現、構築及び／又は分泌することができる。
【０３６８】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載する抗体を含有及び／又は発現し得る細胞を提供する。
【０３６９】
本発明によれば、細胞は軽鎖可変領域をコード化する核酸及び重鎖可変領域をコード化する核酸を含み得る。
【０３７０】
細胞は、抗体又はその抗原結合フラグメントを発現、構築及び／又は分泌することができる。
【０３７１】
以下の実施例で本発明の詳細の概要を記載する。
【実施例】
【０３７２】
実施例１
この実施例は、卵巣腫瘍及び卵巣癌細胞系におけるＫＡＡＧ１遺伝子の発現パターンを記載する。
【０３７３】
ＰＣＲ分析を実施して、ＫＡＡＧ１をコード化するｍＲＮＡを発現する卵巣腫瘍（図中ＡＢ−０４４７として表示）のパーセンテージを検証した。結果から、ＫＡＡＧ１遺伝子が、疾患のあらゆる段階からの卵巣腫瘍の８５％超及び末期の腫瘍の１００％において発現されることがわかった。ＫＡＡＧ１の発現は、ＬＭＰ試料においては検出可能性が低いか又は検出不能である（図１Ａを参照）。各試料に関して、１μｇの増幅されたＲＮＡを、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてランダムヘキサマーで逆転写した。ｃＤＮＡを希釈し、反応の１／２００を、示されるように遺伝子特異的プライマーとの各ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡを増幅するために使用したプライマーは、配列番号４５及び４６に示す配列を含んでいた。ＰＣＲ反応を９６穴プレート中で実施し、２５μｌの反応物の半分を１％アガロースゲル上で電気泳動した。ゲルを可視化し、ゲル・ドキュメンテーション・システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて写真撮影した。図１Ａの上側のパネルは、６のＬＭＰ試料（ＬＭＰ）及び２２の卵巣腫瘍及び６の卵巣細胞系（右の最後の６レーン、ＯＶＣａ）試料からの結果を示す。図１の下側のパネルは、示されるように試験した３０の正常組織からのＲＮＡ試料を示す。
【０３７４】
ＫＡＡＧ１発現は、少数の正常な組織において弱く検出され、一方、ｍＲＮＡは卵管及び膵臓において明らかであった（図１Ａを参照）。これらの反応で使用した全ＲＮＡの量を、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の平行ＰＣＲ増幅を用いて制御し、結果から、各試料中に等価な出発物質が存在することがわかった（図１Ａを参照）。ＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するために使用したプライマーは、配列番号４７及び４８に示す配列を含んでいた。従って、ＫＡＡＧ１遺伝子の発現は、卵巣腫瘍の大部分で過剰発現され、その発現は、ほとんどの正常な組織で低いかまたは存在しないという重要な選択基準を満たす。これらのデータは、卵巣腫瘍がＫＡＡＧ１に対する高親和性モノクローナル抗体を用いて特異的に標的とされ得ることを示唆する。
【０３７５】
早期癌又は腫瘍は、高分化状態にある細胞で構成される傾向があるが、腫瘍はさらに悪性かつ侵襲的状態に進行するにつれ、癌細胞は次第に未分化状態になる。この遷移に貢献する因子を同定し、治療薬を開発するための標的としてこれらのタンパク質を活用する必要がある。原発腫瘍から誘導されたいくつかの卵巣癌細胞系が利用可能であり、機能研究の優れたモデルとしての働きをする。ＫＡＡＧ１の発現をこれらの細胞系において調べた。ＴＯＶ−２１Ｇ、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＴＯＶ−１９４６、及びＴＯＶ−２２２３Ｇと称する４つの系が原発腫瘍から確立され、一方、ＯＶ−９０及びＯＶ−１９４６は、進行した卵巣癌患者の腹水中に含まれる細胞由来の細胞系である。原発腫瘍から確立された細胞由来の全ＲＮＡ（図１Ｂにおいて、レーン１、ＴＯＶ−２１Ｇ；２、ＴＯＶ−１１２Ｄ；５、ＴＯＶ−１９４６；６、ＴＯＶ−２２２３Ｇを参照）及び腹水細胞から確立された細胞（レーン３、ＯＶ−９０；４、ＯＶ−１９４６）を、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変え、ＫＡＡＧ１特異的プライマー（配列番号４５及び４６）を用いたＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。負の対照として、正常な卵巣からの全ＲＮＡを用いて反応を実施した。ＧＡＰＤＨ（配列番号４７及び４８）を用いた平行ＰＣＲ反応により明らかなように等量の出発物質が使用された。ＰＣＲ反応の試料をアガロースゲル上で電気泳動させ、エチジウムブロミドで可視化した。図１Ｂで示すように、ＫＡＡＧ１は検出可能であったが、原発腫瘍由来の細胞系においては弱く発現され、多数サイクルで実施したＰＣＲ反応によって、これらの４つの細胞系全てにおいてＫＡＡＧ１転写物が示された。反対に、腹水細胞から確立された両細胞系は、高レベルのＫＡＡＧ１転写物を示した。腹水由来の細胞における増大した発現は、細胞の環境がＫＡＡＧ１遺伝子の調節に影響を及ぼすことを示唆する。
【０３７６】
腹水細胞は進行した疾患に関連し、図１Ｂで開示される発現のパターンは、増大したＫＡＡＧ１レベルがアンカレッジ依存性成長と関連することを意味する。細胞が単層として成長する場合と同様に、細胞がペトリ皿に付着するのを防止する状態である懸滴において細胞を培養することによってこの問題に取り組んだ。これらのいわゆる三次元培養によって、細胞が結合することができ、スフェロイドの形成が観察される（図１Ｃを参照）。スフェロイドを次のように培養した：ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＯＶ−９０、又はＴＯＶ−２１Ｇ細胞（１５μｌ中４０００）を４日間培地中、５％ＦＢＳの非存在下（左パネル、図１Ｃ）若しくは５％ＦＢＳの存在下（右パネル、図１Ｃ、＋５％血清）でインキュベートした。画像の倍率を１００×に設定した。これらのスフェロイドは広く特徴づけられており、マイクロアレイに基づく発現プロファイリングによって測定される形態学的及び機能的特性並びに分子署名をはじめとする、原発腫瘍において見いだされる特性の多くを示す。
【０３７７】
全ＲＮＡをスフェロイド調製物から単離し、図１Ａに関して記載するようにＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＴＯＶ−２１Ｇ、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＯＶ−９０細胞を、スフェロイドを産生する条件下で図１Ｃの説明文で記載するように播種した。４日後、全ＲＮＡを単離し、ＫＡＡＧ１特異的プライマー（配列番号４５及び４６）を用いたＲＴ−ＰＣＲ反応を実施するために使用した。ＰＣＲ反応をアガロースゲル上で電気泳動にかけた。ＧＡＰＤＨ（配列番号４７及び４８）を増幅するための平行反応の実施により、等量の出発物質が各試料中に存在することが示された。次の頭文字を図１Ｄで使用する。Ｃｅ．：単層として成長した細胞、Ｓｐｈ．：スフェロイドとして成長した細胞。特に、ＴＯＶ−２１Ｇ及びＴＯＶ−１１２Ｄがスフェロイドとして成長した場合にＫＡＡＧ１発現が上方調節された（図１Ｄを参照）。ＯＶ−９０細胞の場合、ＫＡＡＧ１遺伝子の発現レベルは変わらず、非常に高いままであった。おそらく、ＯＶ−９０細胞及びＯＶ−１９４６細胞（図１Ａを参照）により例示されるような腹水由来の細胞系で達成される発現レベルは最大に達した。
【０３７８】
これらの結果は、腹水由来の細胞系で高い発現を示す先のデータと相関し、ＫＡＡＧ１の発現が、癌細胞の微環境によって影響を受けることを裏付ける。さらに、スフェロイドで観察されたＫＡＡＧ１転写の上方調節は、悪性卵巣癌では高レベルのＫＡＡＧ１が存在することを意味する。
【０３７９】
実施例２
この実施例は、卵巣癌細胞の生存におけるＫＡＡＧ１の重要な役割を示唆するインビトロ結果を説明する。
【０３８０】
ＫＡＡＧ１発現が卵巣癌細胞において調節されることが示されたので、これらの細胞におけるこの遺伝子の機能を調べた。この課題に取り組むために、インビトロ分析を実施して、このタンパク質が癌細胞増殖、移動、及び／又は生存に関与するかどうかを究明した。ＲＮＡｉを使用して、ＴＯＶ−２１Ｇ卵巣癌細胞系における内因性ＫＡＡＧ１遺伝子の発現をノックダウンした。２つの独立したショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列の設計は、当業者が無料で利用可能なウェブベースのソフトウェア（例えばＱｉａｇｅｎ）を用いて実施した。これらの選択された配列（通常は１９−ｍｅｒ）を、ｓｈＲＮＡのテンプレートを形成する２つの相補的オリゴヌクレオチド中に含めた。すなわち１９−ｎｔセンス配列、９−ｎｔリンカー領域（ループ）、１９−ｎｔアンチセンス配列とそれに続くＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの終止用５−６ポリ−Ｔトラクト。ＫＡＡＧ１の発現をノックダウンするために使用した１９−ｍｅｒの配列を配列番号４９及び５０に示す。適切な制限部位をこれらのオリゴヌクレオチドの末端に挿入して、挿入物の正しいポジショニングを容易にして、転写出発点がｈＵ６プロモータの下流の的確な位置になるようにした。全てのＲＮＡ干渉研究で使用したプラスミドであるｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．０（配列番号５１）は、商業的供給業者（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）から購入した。ＲＮＡｉ効果を観察する機会及び表現型観察結果の特異性を増大させるために、２つの異なるｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築した。ＴＯＶ−２１Ｇ細胞を６穴プレート中に播種し、２４時間後に１μｇのｐＳｉｌ−ｓｈＲＮＡベクターを用いてトランスフェクトした。ｓｈ．１及びｓｈ．２を使用して、ＫＡＡＧ１遺伝子を標的とする２つの異なるｓｈＲＮＡ配列を指定した。安定な形質転換体を５〜７日間選択し、拡大させ、コンフルエンスになるまで成長させた。以下のインビトロ細胞ベースの分析は全て、これらのＫＡＡＧ１について特異的なｓｈＲＮＡを含む、安定にトランスフェクトされた細胞系を用いて実施した。
【０３８１】
細胞の移動又は移動度は、標準的な細胞運動性分析で測定した。このいわゆるスクラッチ分析は、細胞がコンフルエント単層中の露出部分を満たす速度を測定する。図２Ａで示すように、スクランブル化ｓｈＲＮＡを含むＴＯＶ−２１Ｇ細胞は、対照の未処置細胞と比較して、２４時間後にほぼ完全に創傷を満たした（左から２番目のパネルと１番左のパネルとを比較）。一方、ＫＡＡＧ１ ｓｈＲＮＡを発現するＴＯＶ−２１Ｇ細胞が露出部分を満たす能力は大幅に減少した。実際、ＫＡＡＧ１ ｓｈＲＮＡ細胞の存在下で露出部分を満たす細胞の数は、０時での細胞数とよく似ていた（左パネルと右パネルとを比較）。
【０３８２】
卵巣癌細胞におけるＫＡＡＧ１の減少した発現の長期効果を調べるために、コロニー生存分析において、細胞を十分に希釈し、１０日間培養した。ＴＯＶ−２１Ｇ細胞を１２穴プレート中に５００００細胞／穴の密度で播種し、２４時間後に１μｇのｐＳｉｌ−ｓｈＲＮＡベクターを用いてトランスフェクトした。ｓｈ−１及びｓｈ−２は、同じ遺伝子を標的とする２つの異なるｓｈＲＮＡ配列を指す。翌日、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む新鮮な培地を適用し、細胞の選択を３日間実施した。細胞を洗浄し、ピューロマイシンを含まない新鮮な培地を添加し、成長をさらに５日間継続させた。残りのコロニーを可視化するために、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、固定し、同時に１％クリスタルバイオレット／１０％ＰＢＳ中エタノール中で１５分間室温にて染色した。ＰＢＳ中でよく洗浄した後、乾燥したプレートを写真解析のためにスキャンした。癌細胞系の生存において有意な減少が観察され、代表的な実験結果を図２Ｂに示す。ｓｈＲＮＡを別の卵巣癌細胞系であるＴＯＶ−１１２Ｄ中にトランスフェクトした場合にも同じ結果が得られた。
【０３８３】
従って、まとめると、分離した細胞におけるＫＡＡＧ１の調節された発現は、卵巣癌細胞の移動及び生存におけるこの遺伝子の要件とあわせて、卵巣癌細胞におけるＫＡＡＧ１の重要な役割を裏付ける。さらに、これらの実験は、モノクローナル抗体などのＫＡＡＧ１タンパク質の拮抗物質が、侵襲性を減少させ、腫瘍生存を減少させることを示唆する。
【０３８４】
実施例３
この実施例は、ＫＡＡＧ１と結合するモノクローナル抗体のファミリーに関する詳細を提供する。
【０３８５】
ＫＡＡＧ１と結合する抗体を、Ｂｉｏｓｉｔｅファージ提示技術を用いて生成させた。この技術及びこれらの抗体の生成法の詳細は、米国特許第６，０５７，０９８号に記載されている。手短に言うと、この技術は、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を提示するファージライブラリのストリンジェントなパニングを利用する。数回のパニング後、Ｏｍｎｉｃｌｏｎａｌと称するライブラリを得、これはＫＡＡＧ１と非常に高い親和性及び特異性で結合する軽及び重鎖可変領域を含む組換えＦａｂを多く含んでいた。このライブラリ（より正確にはＯｍｎｉｃｌｏｎａｌ ＡＬ０００３Ｚ１）から、９６の個々の組換えモノクローナルＦａｂをイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から調製し、ＫＡＡＧ１結合について試験した。
【０３８６】
各モノクローナル抗体の相対的結合を測定するために、組換えヒトＫＡＡＧ１を、大規模一時的トランスフェクション技術を用いて２９３Ｅ細胞において産生した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２年；Ｄｕｒｏｃｈｅｒ、２００４年）。ＫＡＡＧ１ ｃＤＮＡの全コーディング領域を、ＢａｍＨＩ制限部位を組み入れた順方向プライマー（配列番号５２）及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を組み入れた逆方向プライマー（配列番号５３）を用いたＰＣＲによって増幅した。結果として得られたＰＣＲ産物は２７６塩基対であり、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化後、フラグメントを、同じ制限酵素で同様に消化した発現ベクターｐＹＤ５（配列番号５４）中に結合させた。ｐＹＤ５発現プラスミドはヒトＦｃドメインのコーディング配列を含み、これによって融合タンパク質が生成し、またＩｇＧ１シグナルペプチドをコード化する配列が培地中に融合タンパク質を分泌させることが可能になる。細胞１ミリリットルごとに、１マイクログラムのｐＹＤ５−０４４７と称する発現ベクターを、１５０００００〜２００００００細胞／ｍｌの密度まで懸濁液中で成長させた２９３Ｅ細胞中にトランスフェクトした。使用したトランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、（直線状、ＭＷ２５，０００、Ｃａｔ＃２３９６６ Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州ウォリントン）であり、これは１：３のＤＮＡ：ＰＥＩ比で含まれていた。細胞の成長を５日間継続させ、その後、培地を組換えＦｃ−ＫＡＡＧＩ融合タンパク質の精製のために集めた。タンパク質を、製造業者（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．、オンタリオ州オークビル）によって指示されるようにして、タンパク質−Ａアガロースを用いて精製した。精製Ｆｃ−ＫＡＡＧＩ（Ｆｃ−０４４７と表示）の試料を示す代表的なポリアクリルアミドゲルを図３Ａに示す。
【０３８７】
モノクローナル調製物の９６穴マスタープレートは、各ウェル中に様々な濃度の精製抗ＫＡＡＧ１ Ｆａｂを含んでいた。１０μｇ／ｍｌの最終濃度までＦａｂを希釈することによって第２のストックマスタープレートを調製し、これからＥＬＩＳＡ測定用のその後の全ての希釈を実施した。Ｆｃ−ＫＡＡＧＩをモノクローナル調製物と結合させるために、Ｆｃ−ＫＡＡＧＩを、ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を用いてビオチニル化し、１０ｎｇ／穴をストレプトアビジン９６穴プレート中にコーティングした。１ナノグラムの各Ｆａｂモノクローナル調製物を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。ＨＲＰ結合マウス抗カッパ軽鎖抗体を用いてＴＭＢ液体基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．、オンタリオ州オークビル）の存在下で結合した抗体を検出し、マイクロタイタープレートリーダーで４５０ｎｍにて読み取った。図３Ｂに示すように、合計４８の（灰色で強調した）モノクローナル抗体はこの分析で有意な結合を示した（＞０．１任意ＯＤ４５０単位）。抗体を意図的に１ｎｇ／穴まで希釈して、ＫＡＡＧ１について最高の親和性でこれらの抗体の結合を増強する。対照として、抗体はビオチニル化Ｆｃドメインと結合しなかった。これらのデータから、抗体の結合はウェルごとに異なることが明らかになり、このことは抗体がＫＡＡＧ１について異なる親和性を示すことを意味する。
【０３８８】
実施例４
この実施例は、ＫＡＡＧ１のどの領域に抗体が結合するかを究明するエピトープマッピング研究を記載する。
【０３８９】
モノクローナル抗体によって結合するＫＡＡＧ１の領域をさらに説明するために、ＫＡＡＧ１のトランケートされた突然変異体を発現させ、ＥＬＩＳＡにおいて使用した。完全長ＫＡＡＧ１について、トランケートされた形態をＰＣＲによって増幅し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＹＤ５中に結合させた。使用したプライマーは順方向オリゴヌクレオチドを、配列番号５５及び５６のプライマーを用いて配列番号５２に示す配列と組み合わせて、それぞれＫＡＡＧ１のアミノ酸番号６０及び３５を末端とするＦｃ融合フラグメントを産生した。これらの突然変異体の発現は、完全長Ｆｃ−ＫＡＡＧＩについて前述のように実施し、タンパク質−Ａアガロースで精製した。ＥＬＩＳＡで使用したタンパク質調製物の代表的なゲルを図４Ａに示し、エピトープマッピングに使用した突然変異タンパク質の概略図を図４Ｂに示す。
【０３９０】
結果から、ライブラリは、図示したＫＡＡＧ１領域のそれぞれと結合することができる抗体から構成されることがわかった。特に、最初のＥＬＩＳＡでＫＡＡＧ１と結合した４８個のｍＡｂのうち、９個（ウェルＡ２、Ａ１２、Ｃ２、Ｃ４、Ｄ１、Ｅ１０、Ｆ１、Ｈ３、及びＨ８）はＫＡＡＧ１の最初の３５のアミノ酸と相互作用することが判明したのに対して、５個（Ｄ１２、Ｅ８、Ｆ５、Ｇ１０、及びＨ５）はＫＡＡＧ１の最後の２５のアミノ酸と相互作用することが判明した。従って、残りの３４個の抗体は、アミノ酸３６〜５９の範囲のＫＡＡＧ１の領域と相互作用した。これらの結果は、２４の代表的な軽及び重鎖可変領域の配列分析と一致した。実際、これらの配列アラインメントによって、抗体は、それらの各ＣＤＲにおける同一性（％）に基づいて３群に分類されることが明らかになった。各クラスターに含まれる抗体は全て、ＫＡＡＧ１の同じ領域と相互作用した。
【０３９１】
従って、ｍＡｂの相対的結合親和性、差次的エピトープ相互作用特性、及び可変領域配列における差に基づいて、実施例３で記載したプレートからの３つの抗体を、例示的抗ＫＡＡＧ１モノクローナル抗体としてさらなる分析のために選択した。
【０３９２】
実施例５
この実施例は、Ｆａｂを完全ＩｇＧ１キメラモノクローナル抗体に変えるために使用される方法を開示する。方法のスキームを図５に示す。
【０３９３】
ＦａｂモノクローナルとＫＡＡＧ１タンパク質間の相互作用研究を実施する可能性は別として、Ｆａｂの使用は、重要なインビトロ及びインビボ研究を実施して抗原の生物学的機能を検証することに関して限定される。従って、Ｆａｂに含まれる軽及び重鎖可変領域を完全抗体スカフォールドに移し、マウス−ヒトキメラＩｇＧ１を生成させることが必要であった。軽及び重イムノグロブリン鎖の両方の発現ベクターを、ｉ）Ｆａｂ発現ベクターの上流のもとの細菌シグナルペプチド配列が哺乳動物シグナルペプチドと置換され、そしてｉｉ）マウス抗体中の軽及び重鎖定常領域がヒト定常領域と置換されるように構築した。この転移を実施するための方法は、当業者に周知の標準的分子生物学技術を使用した。方法論の簡単な概要をここで説明する（図５を参照）。
【０３９４】
軽鎖発現ベクター−２９３Ｅ一次的トランスフェクションシステムにおいて使用されるように設計された、ｐＴＴＶＨ８Ｇ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２年）と称する既存の哺乳動物発現プラスミドを修飾して、マウス軽鎖可変領域に適合させた。結果として得られるマウス−ヒトキメラ軽鎖は、マウス可変領域とそれに続いてヒトカッパ定常ドメインを含んでいた。ヒトカッパ定常ドメインをコード化するｃＤＮＡ配列を、プライマーＯＧＳ１７７３及びＯＧＳ１７７４（それぞれ配列番号５７及び５８）を用いてＰＣＲにより増幅した。ヒトカッパ定常領域のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５９及び６０に示す。結果として得られる３２１塩基対ＰＣＲ産物を、ヒトＶＥＧＦＡ（ＮＭ＿００３３７６）のシグナルペプチド配列のすぐ下流のｐＴＴＶＨ８Ｇ中に結合させた。このクローニングステップは、マウス軽鎖可変領域をコード化するｃＤＮＡの正確なポジショニングを可能にする独自のエンドヌクレアーゼ部位の位置決定も行った。ｐＴＴＶＫＩと称する最終発現プラスミドの配列を配列番号６１に示す。表３に開示された配列に基づいて、それらの５’末端で、ＶＥＧＦ Ａシグナルペプチドの最後の２０塩基対と同じ配列を組み入れた、抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、及び３Ｃ４の軽鎖可変領域（それぞれ配列番号１５、１９、及び２３）に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーの配列を配列番号６２、６３、及び６４に示す。同じ逆方向プライマーを使用して、３つの軽鎖可変領域全てを増幅させた。その理由は、３’側最末端は同じであるからである。このプライマー（配列番号６５）は、その３’末端で、ヒトカッパ定常ドメインの最初の２０塩基対と同じ配列を組み入れていた。ＰＣＲフラグメント及び消化されたｐＴＴＶＫＩの両方をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性で処理し、その結果、相補的末端を得、これをアニーリングによって結合させた。アニーリング反応をコンピテントイー・コリに変換し、マウス軽鎖可変領域がｐＴＴＶＫＩ発現ベクター中に適切に挿入されるようにシーケンシングすることによって発現プラスミドを検証した。当業者らは、軽鎖発現プラスミドの構築に用いられる方法が、もとのＦａｂライブラリ中に含まれる全ての抗ＫＡＡＧ１抗体に当てはまることを容易に認識するであろう。
【０３９５】
重鎖発現ベクター−重鎖イムノグロブリンを産生した発現ベクターを、軽鎖イムノグロブリンの産生について前述したｐＴＴＶＫＩと同様の方法で設計した。ヒトＩｇＧＫシグナルペプチド配列並びにＩｇＧ１のヒトＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３領域を含むプラスミドｐＹＤ１１（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２）を、ヒト定常ＣＨ１領域をコード化するｃＤＮＡ配列を結合させることによって修飾した。独自の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように設計されたＰＣＲプライマーＯＧＳ１７６９及びＯＧＳ１７７０（配列番号６６及び６７）を使用して、配列番号６８及び６９に示すヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域を増幅した。ＩｇＧＫシグナルペプチド配列のすぐ下流のヒトＣＨ１の３０９塩基対フラグメントの結合後、修飾されたプラスミド（配列番号７０）をｐＹＤ１５と指定した。選択された重鎖可変領域をこのベクター中に結合する場合、結果として得られるプラスミドは、ヒト定常領域を有する完全ＩｇＧ１重鎖イムノグロブリンをコード化する。表３に開示する配列に基づいて、その５’−末端でＩｇＧＫシグナルペプチドの最後の２０塩基対と同じ配列を組み入れた、抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、及び３Ｃ４の重鎖可変領域（それぞれ配列番号１７、２１、及び２５）に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーの配列を配列番号７１（３Ｄ３及び３Ｇ１０は同じ５’−末端配列を有する）並びに７２に示す。同じ逆方向プライマーを用いて３つの重鎖可変領域全てを増幅した。その理由は、３’側最末端は同じだからである。このプライマー（配列番号７３）は、その３’末端で、ヒトＣＨ１定常ドメインの最初の２０塩基対と同じ配列を組み入れていた。ＰＣＲフラグメント及び消化されたｐＹＤ１５の両方をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性で処理し、その結果、相補性末端を得、こアニーリングによって結合させた。アニーリング反応をコンピテントイー・コリ中に変換し、マウス重鎖可変領域がｐＹＤ１５発現ベクター中に適切に挿入されるようにシーケンシングすることによって発現プラスミドを検証した。当業者らは、重鎖発現プラスミドの構築に使用される方法がもとのＦａｂライブラリ中に含まれる全ての抗ＫＡＡＧ１抗体に当てはまることを容易に認識するであろう。
【０３９６】
２９３Ｅ細胞におけるヒトＩｇＧ１の発現−軽及び重鎖イムノグロブリンをコード化した、前段で調製された発現ベクターを、一時的トランスフェクションシステムを用いて２９３Ｅ細胞において発現した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２年）。軽及び重鎖発現ベクターをコトランスフェクションするために使用した方法は、実施例３で記載した。組織培地中で抗体の最高収率を達成するために軽鎖の重鎖に対する比を最適化し、９：１（Ｌ：Ｈ）であることが判明した。キメラ抗ＫＡＡＧ１モノクローナル抗体が組換えＦｃ−ＫＡＡＧＩと結合する能力をＥＬＩＳＡで測定し、もとのマウスＦａｂと比較した。方法は実施例３で記載した。図６で図示するように、３Ｄ３、及び３Ｇ１０キメラＩｇＧ１モノクローナル抗体の結合は、Ｆａｂと非常に似ていた。３Ｃ４の場合、キメラの結合活性は、Ｆａｂよりも若干低かった。これに反して、この結果から、マウスＦａｂからの可変領域のヒトＩｇＧ１骨格への転位は、軽及び重鎖可変領域がＫＡＡＧ１結合を付与する能力に有意に影響を及ぼさなかったことがわかる。
【０３９７】
実施例６
この実施例は、卵巣癌細胞モデルにおいてＫＡＡＧ１の活性をブロックするための抗ＫＡＡＧ１抗体の使用を記載する。
【０３９８】
実施例２は、ＫＡＡＧ１が卵巣癌細胞の挙動において重要な役割を果たすことを示すＲＮＡｉ研究を開示した。前述のモノクローナル抗体を使用して、細胞表面のＫＡＡＧ１を標的とすることによってこれらの結果を再現することが可能であるかどうかを究明した。ＴＯＶ−２１Ｇ及びＯＶ−９０細胞を、スフェロイドを産生する条件下で培養し、１０μｇ／ｍｌの３Ｄ３、３Ｇ１０、又は３Ｃ４抗ＫＡＡＧ１キメラモノクローナル抗体で処理した。図７に示すように、未処理のままで放置した場合（親）又は抗体希釈緩衝液で処理した場合（対照）に両細胞系は効率的にスフェロイドを形成した。対照的に、抗ＫＡＡＧ１抗体の存在は、ゆるく充填された構造をもたらし、ある場合には、細胞はスフェロイドに構築することができなかった。これらの結果は、先の観察結果を裏付け、抗ＫＡＡＧ１モノクローナル抗体がスフェロイドの形成中にＫＡＡＧ１の活性を調節できることを示唆する。癌細胞系によるスフェロイド形成は、腫瘍形成のインビトロモデルであるので、結果は、ＫＡＡＧ１をブロックすることがインビボでの腫瘍形成の軽減につながることも示唆する。
【０３９９】
実施例７
この実施例は、卵巣腫瘍におけるＫＡＡＧ１の発現を検出するための抗ＫＡＡＧ１抗体の使用を記載する。
【０４００】
卵巣癌腫瘍におけるＫＡＡＧ１タンパク質の発現を確認する手段として、そして遺伝子の発現がタンパク質の存在と相関するかどうかを究明するために、免疫組織化学法を実施した。患者生検から生成させた数ダースの卵巣腫瘍試料を含む組織マイクロアレイを得た。パラフィン包埋上皮卵巣腫瘍試料をスライドガラス上に置き、１５分間５０℃で固定した。キシレンで２回処理し、続いて１００％、８０％、及び７０％エタノール中で連続して５分間洗浄して脱水することによって、脱パラフィンを実施した。スライドをＰＢＳ中で２回、５分間洗浄し、そして抗原修復溶液で処理して（クエン酸塩−ＥＤＴＡ）、抗原をアンマスキングした。スライドをメタノール中でＨ２Ｏ２とともにインキュベートすることによって内因性ペルオキシド反応性種を除去し、スライドを無血清ブロッキング溶液（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）とともに２０分間室温にてインキュベートすることによってブロッキングを実施した。一次ｍＡｂ（抗ＫＡＡＧ１ ３Ｄ３）を１時間室温で添加した。ＫＡＡＧ１反応性抗原を、ビオチン結合マウス抗カッパ、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ三次抗体とともにインキュベートすることによって検出した。ポジティブ染色は、スライドをＤＡＢ−過酸化水素基質で５分未満処理することによって示され、続いてヘマトキシリンで対比染色した。ＫＡＡＧ１タンパク質は、大部分の卵巣腫瘍試料において非常に高レベルで発現されることが判明した。７０腫瘍を含む代表的なアレイを図８Ａに図示する。ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施した発現プロファイリングによって示されるように、ＫＡＡＧ１転写物は分析した卵巣腫瘍試料の８５％超で存在していた。明らかに、ＫＡＡＧ１遺伝子の転写と卵巣癌中のタンパク質の存在との間には優れた相関関係がある。試料の一部をさらに高倍率で調べて、どの細胞がＫＡＡＧ１タンパク質を発現しているかを究明した。図８Ｂで示すように、ＫＡＡＧ１は、卵巣腫瘍の表層上皮で主に発現される。加えて、これらの上皮細胞の先端側上で強い強度が観察された（図８Ｂ中の矢印を参照、倍率２０×）。最後に、免疫組織化学法を様々な組織型由来の卵巣腫瘍試料に関して繰り返した。先に説明したように、上皮卵巣癌は４つの主な組織型、すなわち漿液性、類内膜、明細胞、及び粘液性に分類することができる。ＫＡＡＧ１の発現は、上皮卵巣癌の全ての型、特に漿液性及び類内膜組織型で検出された（図８Ｃを参照）。
【０４０１】
まとめると、これらの免疫組織化学的研究は、モノクローナル抗体を用いた卵巣癌におけるＫＡＡＧ１検出の有用性を示す。
【０４０２】
実施例８
ＫＡＡＧ１に対するＩｇＧ１抗体はＡＤＣＣを媒介することができる。
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、細胞媒介性免疫機構であり、これによって免疫系のエフェクター細胞、典型的にはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、特異的抗体により結合された標的細胞を積極的に溶解する。ＮＫ細胞と抗体との間の相互作用は、抗体の定常Ｆｃドメイン及びＮＫ細胞の表面上の高親和性Ｆｃγ受容体によって起こる。ＩｇＧ１は、Ｆｃ受容体に関して最高の親和性を有し、一方、ＩｇＧ２ｍＡｂは非常に低い親和性を示す。この理由のために、ＫＡＡＧ１を標的とするキメラ抗体はＩｇＧ１として設計した。このように媒介されるこの種類のエフェクター機能によって、多くの場合、自身の細胞表面上で高レベルの抗原を発現する癌細胞を選択的に殺すことができるようになる。
【０４０３】
すでに公開されている方法の中から、抗ＫＡＡＧ１ ＩｇＧ１キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を測定するためのインビトロ分析を採用した。この方法で、ＷＩＬ２−Ｓと呼ばれるリンパ腫細胞系の存在下で抗ＣＤ２０リツキサンのＡＤＣＣ活性を測定した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，４１７８−４１８４）。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を、濃度が増大する３Ｄ３キメラＩｇＧ１抗体の存在下で活性化されたＮＫ細胞源として使用した（図１２を参照）。標的細胞を１：２５の比で活性化されたＰＢＭＮＣとともにインキュベートした。図示するように、細胞死は、ＯＶＣＡＲ−３及びリンパ腫細胞系の両方の存在下で用量に依存して増加し、後者はＲＴ−ＰＣＲによってＫＡＡＧ１を発現することが証明された（不図示）。正の対照として、公開された方法から得られた結果を再現し、この場合、リツキサンに関してＷＩＬ２−Ｓ細胞の存在下で高レベルのＡＤＣＣが得られた。
【０４０４】
ＡＤＣＣは、比較的高レベルのＫＡＡＧ１を発現する他の卵巣癌細胞系を用いても観察
された。これらの結果は、３Ｄ３により例示されるように、ＫＡＡＧ１について特異的なＩｇＧ１抗体が、自身の細胞表面上で抗原を発現する癌細胞の溶解を向上させ得ることを証明する。
【０４０５】
実施例９
ＫＡＡＧ１に対する抗体は、卵巣腫瘍の浸潤を軽減させることができる。
卵巣癌に罹っている患者は、卵巣の上皮層中、又は数例においては卵管中の細胞の制御不能な成長により典型的に開始する病巣を有する。早期に発見されたならば、これらの原発腫瘍を手術により除去し、初回化学療法の結果、非常に良好な奏効率を得ることができ、また全体的な生存を改善することができる。残念ながら、７０％の患者は疾患が再発し、その結果、腹腔全体に数百の微小転移性腫瘍が広がることになる。第二回治療は有効であり得るが、多くの場合、患者の反応が不良であるか、又は腫瘍が化学療法剤耐性になるかのいずれかである。治療法の選択肢は限られ、細胞傷害性剤に対する耐性を回避するための新規療法が緊急に必要とされる。
【０４０６】
インビボの抗ＫＡＡＧ１抗体の有効性を試験するために、ヒトにおける卵巣癌の臨床症状に最も近い卵巣癌の動物モデルを使用した。ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞系は、類内膜起源のものであり、ＲＴ−ＰＣＲにより測定されるようにＫＡＡＧ１抗原を発現する。先のＩＨＣ研究により、類内膜組織型の卵巣腫瘍は、ＫＡＡＧ１の強力な発現を含み、従って、１１２Ｄ細胞系を、抗ＫＡＡＧ１抗体を試験するための適切な選択肢とする。
【０４０７】
ＳＣＩＤマウスにおけるＴＯＶ−１１２Ｄ細胞系の腹腔内接種の結果、ヒトにおいて観察されるものと非常によく似た数ダースの微小転移性腫瘍が移植された。抗体の希釈剤であるＰＢＳで処置されたマウスは、検査によると、動物１匹あたり平均で２５〜３０の腫瘍を含んでいた（図１３Ａ及びＢ）。数例では、これらのマウスの腹腔中の腫瘍数は多すぎて腫瘍の数を容易に測定できなかったので、これらのマウスは統計分析から除外した。マウスを３Ｃ４及び３Ｄ３抗体で処理した場合、微小転移性腫瘍の数は大幅に減少した。加えて、抗ＫＡＡＧ１で処理した群につき少なくとも１匹の動物では腫瘍が見られなかった。さらに多数のＴＯＶ−１１２Ｄ腫瘍（＞５０／動物）を含むマウスで第２の実験を実施し、非常によく似た結果を得た。さらに、３Ｄ３抗体と比較して、３Ｃ４で処置された群ではほとんど差はなかった。しかし、これらのインビボ実験における傾向並びに細胞ベースの分析で得られた結果は、３Ｄ３抗体の方が若干有効性が高いことを示した。これが、よりアクセス可能なエピトープによるのか、又は抗原に対して３Ｃ４と比較して３Ｄ３のより高い親和性によるのかは、まだわかっていない。これらの２つの実験から得られた結果は、卵巣癌細胞表面上のＫＡＡＧ１を標的とすることは、インビボの腫瘍の拡大を著しく軽減することにつながり得ることを証明した。
【０４０８】
さらに、これらの発見は、細胞ベースの分析で得られた観察結果と完全に一致する。たとえば、単層として成長した細胞系と比較して、スフェロイドにおけるＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡの発現の増加；ＫＡＡＧ１ ｓｈＲＮＡの存在下での細胞移動の減少、ＫＡＡＧ１抗体で処置された場合の細胞系がスフェロイドを形成する能力の減少；そして最後に、抗ＫＡＡＧ１ ＩｇＧ１によるＡＤＣＣ活性の向上。まとめると、この結果は、抗体を用いてＫＡＡＧ１を標的とすることが再発性卵巣癌において治療上大いに有望であることを強力に示唆する。
【０４０９】
実施例１０
ＫＡＡＧ１は皮膚腫瘍及び腎臓細胞癌で発現され、これらの適応症における治療上の標的である。
実施したｍＲＮＡプロファイリング研究から、ＫＡＡＧ１抗原をコード化する転写物は、黒色腫試料及び腎臓癌由来の細胞系で高度に発現されたことがわかった。これらの結果は、Ｓｏｏｋｎａｎａｎら（２００７年）で開示された。これらの癌型におけるＫＡＡＧ１遺伝子の転写調節を確認するために、免疫組織化学法を、扁平上皮細胞癌及び黒色腫から単離されたいくつかの切片を含むヒト皮膚腫瘍組織マイクロアレイ（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州リッチモンド）で抗ＫＡＡＧ１抗体を用いて実施した。このアレイの分析は、扁平上皮細胞癌及び黒色腫から単離された生検において非常に強い染色を示した（図１４、上のパネル）。これらの型はどちらも皮膚癌の最も一般的な形態に含まれ、また興味深いことに、扁平上皮細胞癌は最も転移性が強く、この事実もＫＡＡＧ１の発現と侵襲的表現型とを結びつける。すでに観察されたように、アレイ上に含まれる３つの正常な皮膚試料上のＫＡＡＧ１の存在は非常に微弱であるか又は存在しなかった。同様に、ＫＡＡＧ１は、腎臓癌のアレイに含まれる試料の多くで検出された。陽性試料のほとんどは、主に乳頭細胞癌型のものであり、若干の明細胞癌がＫＡＡＧ１タンパク質を発現した。乳頭癌は腎臓癌症例の約２０％に相当する。
【０４１０】
ＫＡＡＧ１の機能が、卵巣癌におけるその役割と比較して、これらの種類の癌で同じかどうかを試験するために、黒色腫及び腎臓細胞癌由来の細胞系を得、スフェロイド培養試験で試験した（実施例１及び６を参照）。黒色腫モデルに関して、Ａ３７５及びＳＫ−ＭＥＬ５細胞の２つの悪性黒色腫細胞系を、これらが５％ＦＢＳの存在下でスフェロイドを形成することを可能にする条件下で培養した。培養物を５μｇ／ｍｌの濃度の抗ＫＡＡＧ１キメラ３Ｄ３抗体とともに又はこの抗体なしでインキュベートした。図１５に示すように、培養物中に３Ｄ３抗体を含めることで、黒色腫細胞系におけるスフェロイド構造の適切な構築が防止された。この結果は、ＫＡＡＧ１が卵巣癌において果たすのと同様の役割を黒色腫でも果たすことを示唆した。腎臓細胞癌由来の細胞系も試験した。Ａ−４９８細胞系は腎臓乳頭細胞癌細胞系であるのに対して、７８６−Ｏは腎臓明細胞癌である。図１５で示すように、Ａ−４９８スフェロイドのみが３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体の存在によって影響を受け、一方、７８６−Ｏ細胞系はこの分析で影響を受けなかった。これらの結果は、前述の免疫組織化学法の結果に匹敵し、スフェロイド形成の阻害が、主に乳頭腎臓癌由来の腎臓癌細胞表面上のＫＡＡＧ１の存在に依存することを示す。しかし、抗ＫＡＡＧ１抗体は腎臓明細胞癌の他の種類の分析において機能し得るこ可能性がある。
【０４１１】
まとめると、これらのデータは、黒色腫及び腎臓癌におけるＫＡＡＧ１の役割の重要な機能を強力に支持し、これらの適応症で抗体を用いてＫＡＡＧ１をブロックすることは、治療的可能性を有することを示す。
【０４１２】
実施例１１
ＫＡＡＧ１は卵巣癌細胞の表面上で発現される。ＫＡＡＧ１をコード化するｃＤＮＡの一次構造のバイオインフォーマティック分析、生化学研究、及び上皮細胞中のタンパク質の免疫組織化学的検出から得られた総合結果は、ＫＡＡＧ１抗原が細胞表面上に位置することを示唆した。しかし、ＫＡＡＧ１が実際に膜結合タンパク質であることを証明するためにはさらに直接的な証拠が必要であった。一方法において、ＫＡＡＧ１を発現することが知られている卵巣癌細胞系をマイクロタイタープレート中に播種し、細胞を透過しない条件下で固定し、抗ＫＡＡＧ１キメラ抗体の濃度を増加させつつインキュベートした。細胞をよく洗浄した後、修飾された細胞ベースのＥＬＩＳＡにおいて二次抗体としてＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧを用いて結合抗体を検出した（図１６Ａを参照）。これらの実験から得ることができる最初の観察結果は、抗体を細胞によって特異的に捕獲することができることであり、このことは、ＫＡＡＧ１が細胞表面で存在することを示唆した。第２に、結合の量は、ＳＫＯＶ−３細胞上で最強であり、ＴＯＶ−２１Ｇ細胞は最弱の結合を示した。これは、ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡがこれらの細胞系において同様の割合で発現されることを証明したＲＴ−ＰＣＲデータ（不図示）と完全に一致した。さらに、３Ｄ３抗体は最強のシグナルを生じ、このことは、この抗体によって標的とされるエピトープがこの分析では最もアクセス可能であったことを意味する。３Ｇ１０は、最高レベルのＡＢ−０４４７を発現した細胞系においてＫＡＡＧ１を検出できるだけであった（ＳＫＯＶ−３細胞、図１６Ａの右パネルを参照）。使用した第２の方法はフローサイトメトリーであった。この場合、マウス３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体をＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞とともに飽和条件でインキュベートし、続いてよく洗浄し、結合した３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体を、フローサイトメーターでＦＩＴＣと結合した抗マウスＩｇＧを用いて検出した。図１６Ｂで示すように、ＳＫＯＶ−３細胞の表面でのシグナルは、バックグラウンドの読みと同じ蛍光レベルである、非哺乳動物非関連性タンパク質について特異的な負の対照である抗ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）抗体で標識された同じ細胞と比較してはるかに高かった。まとめると、これらの結果は、ＫＡＡＧ１が細胞表面上に位置することを示す。
【０４１３】
実施例１２
ヒト化抗ＫＡＡＧ１抗体の使用法。
インビトロ及び予備インビボ結果の両方に基づいて、２つのマウス抗ＫＡＡＧ１抗体候補（３Ｄ３及び３Ｃ４と表示）を、当業者に周知の方法を使用するコンピュータ内でのモデリングを用いたヒト化について選択した。手短に言うと、ネズミ抗体の可変領域を、高い配列相同性と類似したＣＤＲループ長さを呈するマウス、ヒト化、及び完全ヒト可変領域の利用可能な結晶構造に基づいて３Ｄでモデル化した。ＣＤＲは、抗原結合に寄与するアミノ酸配列であり、抗体鎖上に３つのＣＤＲが存在する。さらに、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列であるフレームワーク領域を、マウスとヒト抗体配列との標準的相同性比較によって修飾し、その結果、「最良適合」ヒト配列を得た。これらの修飾は、潜在的なＮ及びＯ結合グリコシル化部位の保存はもちろんのこと、ヒト化構造における最大抗原結合を保証するために、これらの修飾はＣＤＲの適切なポジショニングが確実に維持されるようにした。ヒト化（ｈ）３Ｄ３及び３Ｇ４における重鎖及び軽鎖可変領域の両方の配列の結果として、それぞれ９６％及び９４％がヒト化された。各抗体の３Ｄ３及び３Ｃ４モデルの構造をそれぞれ図１７Ａ及び１７Ｂに示す。これらの構造に示されるように、３Ｄ３は、３つの異常なアミノ酸（図１７Ａ、重鎖上のＭｅｔ９３及びＧｌｙ９４、並びに軽鎖上のＳｅｒ５７）がＣＤＲモデルに近いので、これらのアミノ酸の維持を必要とした。モデリングは、これらのマウスアミノ酸のヒト等価物での置換が抗体のＫＡＡＧ１抗原との結合を相殺し得ることを予想した。３Ｃ４の場合、６個のアミノ酸が異常と見なされた（図１７Ｂ、重鎖上のＧｌｕ１、Ｇｌｎ７２及びＳｅｒ９８、並びに軽鎖上のＴｈｒ４６、Ｐｈｅ４９及びＳｅｒ８７）。両図において、軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３についてそれぞれＬ１、Ｌ２、及びＬ３により示され、一方、重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３についてそれぞれＨ１、Ｈ２、及びＨ３で示される。
【０４１４】
完全抗ＫＡＡＧ１ ３Ｄ３イムノグロブリン軽及び重鎖をコード化する配列をそれぞれ配列番号１７６及び１７７に示す。ヒト化３Ｄ３軽鎖の可変領域は配列番号１７６のアミノ酸２１〜１３３の間に含まれ、配列番号１７８に示される。ヒト化３Ｄ３重鎖の可変領域は配列番号１７７のアミノ酸２０〜１３２の間に含まれ、配列番号１７９に示される。完全抗ＫＡＡＧ１ ３Ｃ４イムノグロブリン軽及び重鎖をコード化する配列をそれぞれ配列番号１８０及び１８１に示す。ヒト化３Ｃ４軽鎖の可変領域は配列番号１８０のアミノ酸２１〜１２７の間に含まれ、配列番号１８２に示される。ヒト化３Ｃ４重鎖の可変領域は配列番号１８１のアミノ酸１９〜１３６の間に含まれ、配列番号１８３に示される。
【０４１５】
トランスフェクトされた哺乳動物細胞における発現ベクターのアセンブリ及びｈ３Ｄ３の産生後（実施例５を参照）、ヒト化プロセスの生物学的同等性を証明するためにいくつかの分析を実施した。エフェクター機能を有する抗体が必要とされたので、ｈ３Ｄ３をヒトＩｇＧ１として構築した。ｈ３Ｄ３の能力を組換えＫＡＡＧ１と直接比較するためにＥＬＩＳＡに基づく分析を実施した。これらの試験を実施するために用いられる方法は、組換えＦｃ−ＫＡＡＧＩを使用して実施例３に記載したとおりにした。図１８Ａに示すように、ｈ３Ｄ３の結合活性は、キメラ３Ｄ３の結合活性と同じであった。
【０４１６】
さらに正確な測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて実施した。動態解析を用いて、キメラ３Ｄ３のｈ３Ｄ３との親和性並びに軽及び重鎖の様々な置換を含むハイブリッド抗体との親和性を比較した（図１８Ｂを参照）。手短に言えば、抗ヒトＦｃをＢｉａｃｏｒｅセンサーチップ上に固定しキメラ又はｈ３Ｄ３をこのチップ上に捕獲した。様々な濃度のモノマー組換えＫＡＡＧ１を注入し、データを簡単な１：１モデルに全体的に適合させて、相互作用の動態パラメータを決定した。キメラ３Ｄ３の動態パラメータを図１８Ｂで図示した（ｍ３Ｄ３）。キメラ３Ｄ３の平均ＫＤは２．３５×１０−１０Ｍであった。比較して、キメラ（Ｃ）／ヒト化（Ｈ）の全置換は、非常に類似した動態パラメータを示した。キメラ重鎖とともに発現されたキメラ軽鎖（図１８Ｂでは「ＣＣ」として表示）の平均ＫＤは２．７１×１０−１０Ｍであり、キメラ重鎖とともに発現されたヒト化軽鎖（図１８Ｂでは「ＨＣ」として表示）の平均ＫＤは３．０９×１０−１０Ｍであり、ヒト化重鎖とともに発現されたキメラ軽鎖（図１８Ｂでは「ＣＨ」として表示）の平均ＫＤは５．０５×１０−１０Ｍであり、ヒト化重鎖とともに発現されたヒト化軽鎖（図１８Ｂでは「ＨＨ」として表示）の平均ＫＤは４．３９×１０−１０Ｍであった。分析から、３Ｄ３のヒト化がもとのマウス抗体の結合活性を保存することがわかった。
【０４１７】
ｈ３Ｄ３の生物学的機能をスフェロイド培養試験で評価した（実施例６を参照）。ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を、５％ＦＢＳの存在下、ｈ３Ｄ３又は非ＫＡＡＧ１結合同位体対照抗体の存在下で培養した。結果（図１８Ｃに図示）は、緩衝液又は非関連ＩｇＧのいずれかを用いた治療は、コンパクトな３−Ｄ構造の形成を阻害しなかったことを示す。対照的に、キメラ３Ｄ３とヒト化３Ｄ３とはどちらも、スフェロイドが形成されるのを防止した。結果を二とおりで示す（左及び右のパネル）。これらの結果は、キメラ３Ｄ３の生物活性がヒト化３Ｄ３で保存されることを示し、ｈ３Ｄ３が同様に挙動することを示唆する。
【０４１８】
［参考文献］
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＫＡＡＧ１と特異的に結合するモノクローナル抗体及びその抗原結合フラグメント並びに卵巣癌に関連する悪性腫瘍の診断、予防及び治療をはじめとする、ある疾患の治療のためのそれらの使用に関する。本発明は、様々な他の癌型の診断、予防及び治療のためのこれらの抗体の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
婦人科悪性腫瘍の中でも、卵巣癌は、米国では女性において最も高い腫瘍に関連する死亡率の原因である（Ｊｅｍａｌら、２００５年）。卵巣癌は、米国における女性の癌による死亡の第四番目の原因である（Ｍｅｎｏｎら、２００５年）。米国癌協会は、２００５年に合計２２，２２０の新規症例を予測し、１６，２１０例の死因はこの疾患であるとした（Ｂｏｎｏｍｅら、２００５年）。過去３０年間で、統計値はほとんど変わらず、卵巣癌にかかっている女性のほとんどはこの疾患で死亡する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ及びＶａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ、２００６年）。当該疾患は、１：７０の生涯リスクを伴い、死亡率は６０％を越える（Ｃｈａｍｂｅｒｓ及びＶａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ、２００６年）。高い死亡率は、悪性腫瘍がすでに卵巣以外にも拡大していた場合には卵巣癌の早期発見が困難であるためである。実際、８０％を越える患者が進行期疾患（ＩＩＩ期又はＩＶ期）と診断されている（Ｂｏｎｏｍｅら、２００５年）。これらの患者は予後が悪く、このことは、８０％〜９０％が当初は化学療法に反応するが、５年生存率が４５％未満であることに反映される（Ｂｅｒｅｋら、２０００年）。数年前に５年生存率２０％と比べると成功率が増加しており、これは少なくとも一部には腫瘍組織が卵巣に限定される場合に腫瘍組織を最適に減量できるためであり、これは卵巣癌の重要な予後因子である（Ｂｒｉｓｔｏｗ Ｒ．Ｅ．、２０００年、Ｂｒｏｗｎら、２００４年）。早期疾患（Ｉ期）と診断された患者では、５年生存率は９０を越える（Ｃｈａｍｂｅｒｓ及びＶａｎｄｅｒｈｙｄｅｎ、２００６年）。
【０００３】
卵巣癌は、卵巣の表層上皮又は表面介在物（ｓｕｒｆａｃｅ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）由来の異種群の腫瘍を含む。これらは、漿液性、粘液性、類内膜、明細胞、及び女性生殖器官における異なる種類の上皮に対応するブレナー（遷移）型に分類される（Ｓｈｉｈ及びＫｕｒｍａｎ、２００５年）。これらのうち、漿液性腫瘍は診断された卵巣癌症例の約６０％を占める。それぞれの組織学的下位範疇はさらに、それらの臨床的挙動を反映して、良性、中間（境界型腫瘍又は低悪性度（ＬＭＰ））、及び悪性の３群に分類される（Ｓｅｉｄｍａｎら、２００２年）。ＬＭＰは漿液性と診断された腫瘍の１０％〜１５％に相当し、非定型核構造及び転移挙動を示すので難題であるが、高悪性度漿液性腫瘍よりも悪性度はかなり低い。ＬＭＰ腫瘍の患者の５年生存率は９５％であるのに対して、同じ期間の進行した高悪性度疾患について生存率は４５％未満である（Ｂｅｒｅｋら、２０００年）。
【０００４】
現在、卵巣癌の診断は、一つには、患者の病歴の日常的分析を通じて、健康診断、超音波及びＸ線検査、並びに血液学的スクリーニングを実施することによって行われる。血清バイオマーカーの早期血液学的検出のために２つの代替法が報告されている。１つの方法は、癌の有無を検出する未知のタンパク質又はタンパク質フラグメントを見いだすための質量分析法による血清試料の分析である（Ｍｏｒら、２００５年、Ｋｏｚａｋら、２００３年）。しかし、この方法は費用がかかり、広く利用可能ではない。別法として、血清中の既知タンパク質／ペプチドの有無を、抗体マイクロアレイ、ＥＬＩＳＡ、又は他の類似の方法を用いて検出する。ＣＡ−１２５（癌抗原１２５）と呼ばれるタンパク質バイオマーカーの血清試験が、卵巣癌のマーカーとして長年広く実施されてきた。しかし、卵巣癌細胞はこれらのタンパク質分子を過剰に産生し得るが、卵管癌又は子宮内膜癌（子宮の内膜の癌）をはじめとする他の癌、膵臓癌患者の６０％、及び他の悪性腫瘍の患者の２０％〜２５％は高レベルのＣＡ−１２５を有する。ＣＡ−１２５試験は、第Ｉ期卵巣癌患者の約５０％についてしか真陽性の結果を示さず、ＩＩ期、ＩＩＩ期、及びＩＶ期卵巣癌患者から真陽性結果がでる可能性は８０％である。卵巣癌患者の残り２０％はＣＡ−１２５濃度の増加を示さない。加えて、高ＣＡ−１２５試験は、月経、妊娠、又は子宮内膜症などの癌と関連しない他の良性活性を示す可能性がある。結果として、この試験は、まだ治療可能であり、１０％未満の陽性予測値（ＰＰＶ）を示す早期疾患の検出に関して臨床用途が非常に限定されている。ＣＡ−１２５に超音波スクリーニングを加えても、ＰＰＶは約２０％しか改善されない（Ｋｏｚａｋら、２００３年）。従って、この試験は有効なスクリーニング試験ではない。
【０００５】
この疾患の病因の知見の向上、積極的な腫瘍縮小手術、及び最新の併用化学療法にもかかわらず、死亡率はほとんど変わっていない。不良転帰は、（１）早期疾患検出のための適切なスクリーニング試験がなく、あわせてこの段階での症状の発現がごくわずかであり、診断は後期段階まで進行した後にしか頻繁に行われず、この時点では癌の腹膜播種のために有効な治療が制限されること、及び（２）標準的化学療法に対する耐性がしばしば発現し、患者の５年生存率の改善が制限されること、に起因する。卵巣癌の初期化学療法レジメンは、カルボプラチン（パラプラチン）及びパクリタキセル（タキソール）の組み合わせを包含する。数年の臨床試験によって、この組み合わせが、有効な手術後に最も有効である（新たに卵巣癌と診断された女性の約８０％において腫瘍体積が減少し、４０％〜５０％では完全に退縮する）ことが明らかになったが、これを改善する方法を求めて引き続き研究が行われている。到達が困難な（ｈａｒｄ−ｔｏ−ｒｅａｃｈ）細胞を標的とする最近の化学療法剤の腹腔内注入は静脈内送達との併用により有効性が増大する。しかし、重篤な副作用のために、多くの場合、治療コースが完了しない。いくつかの他の化学療法剤としては、ドキソルビシン、シスプラチン、シクロホスファミド、ブレオマイシン、エトポシド、ビンブラスチン、塩酸トポテカン、イホスファミド、５−フルオロウラシル及びメルファランが挙げられる。最近になって、臨床試験によりシスプラチンの腹腔内投与は全身性静脈内化学療法に比べて生存性において優位性があることが証明された（Ｃａｎｎｉｓｔｒａ及びＭｃＧｕｉｒｅ、２００７年）。疾患早期で化学療法を受けた女性の生存率が優れていることは、卵巣癌の検出を改善するための方法を開発する研究活動にとっては当然のことである。さらに、新規卵巣癌関連バイオマーカーの発見は、卵巣癌の将来の治療のための、副作用が最小であるさらに有効な治療法の開発につながる。
【０００６】
卵巣癌の理解および治療におけるこれらの最近の進歩にもかかわらず、化学療法の使用は必ず重大な有害反応を伴い、このためにそれらの使用が制限される。その結果として、抗原組織特異性とモノクローナル抗体の選択性とを組み合わせるなどのさらに特別な方法を要求することにより、的外れに関連する副作用が著しく軽減されるはずである。卵巣癌療法にモノクローナル抗体が使われ始め、行われる臨床試験数が増加している（Ｏｅｉら、２００８年；Ｎｉｃｏｄｅｍｕｓ及びｂｅｒｅｋ、２００５年）。これらの試みのほとんどでは、イットリウム９０などの放射性同位体と結合したモノクローナル抗体、または他の癌型ですでに同定されている腫瘍抗原を標的とする抗体の使用を調べている。これの一例は、血管内皮成長因子を標的とするベバシズマブの使用である（Ｂｕｒｇｅｒ、２００７年）。モノクローナル抗体の治療標的として現在調査中である卵巣癌特異的抗原はほとんどない。数例としては、Ｂ７−Ｈ４と称するタンパク質（Ｓｉｍｏｎら、２００６年）及び最近では葉酸受容体アルファ（Ｅｂｅｌら、２００７年）の使用が挙げられ、後者は最近、ＩＩ期臨床試験に入っている。
【０００７】
腎臓関連抗原１（ＫＡＡＧ１）は、元々は細胞傷害性Ｔリンパ球に対して提示される抗原ペプチドとして組織適合性白血球抗原−Ｂ７腎臓癌細胞系から誘導されるｃＤＮＡライブラリからクローンされた（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅら、１９９９年、Ｇｅｎｅｂａｎｋ受入番号Ｑ９ＵＢＰ８）。ＫＡＡＧ１を含む座位は、逆ストランド上で両方向に転写された２つの遺伝子をコード化することが判明した。センスストランドは、ＤＣＤＣ２と称するタンパク質をコード化する転写物をコード化することが判明した。これらの著者らによる発現研究により、ＫＡＡＧ１アンチセンス転写物が腫瘍特異的であり、正常組織ではほとんど発現を示さないのに対して、ＤＣＤＣ２センス転写物は偏在的に発現されることが見いだされた（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅら、１９９９年）。癌、特に卵巣癌、腎臓癌、肺癌、結腸癌、乳癌及び黒色腫におけるＫＡＡＧ１転写物の発現は、公開特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１３４号で開示された。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅらはまた、腎臓癌、結腸直腸癌、黒色腫、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳房癌、前立腺癌、食道癌、膀胱腫瘍、肺癌及び頭頸部腫瘍におけるＲＮＡ発現も観察した。近年、連鎖不均衡研究から得られた有力な遺伝学的証拠から、ＶＭＰ／ＤＣＤＣ２／ＫＡＡＧ１座位は失読症と関連することが判明した（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、２００６年、Ｃｏｐｅら、２００５年）。これらの報告のうちの１つは、失読症患者における原因としてＤＣＤＣ２マーカーを挙げた。その理由は、皮質ニューロン移動におけるこのタンパク質の機能がしばしば異常なニューロン移動及び成熟を示すこれらの患者の症状と一致したからであった（Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、２００６年）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、腫瘍細胞におけるＫＡＡＧ１の発現に関する。本発明はまた、特異的抗ＫＡＡＧ１抗体及び抗原結合フラグメント並びに癌の治療、検出及び診断に有用なキットに関する。抗体及び抗原結合フラグメントは、さらに詳細には、腫瘍細胞がＫＡＡＧ１を発現する癌、たとえば卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺の癌、乳癌、前立腺癌、食道癌、膀胱癌、肺癌及び頭頸部癌の治療、検出及び診断に有用である。
【０００９】
本発明は、その一態様において、単離又は実質的に精製された抗体又は抗原結合フラグメントを提供し、これらは腎臓関連抗原１（配列番号２で定義されるＫＡＡＧ１）又はＫＡＡＧ１変異体と特異的に結合することができる。
【００１０】
さらに具体的に、そして本発明の実施形態によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３０とアミノ酸８４との間に位置するドメインと結合することができる。
【００１１】
本発明の別の実施形態によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸１〜３５に含まれるエピトープと結合することができる。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３６〜６０内に含まれるエピトープと結合することができる。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１のアミノ酸６１〜８４に含まれるエピトープと結合することができる。
【００１４】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、特に、ＫＡＡＧ１の分泌された形態、すなわちシグナルペプチドが切断されたＫＡＡＧ１の形態と特異的に結合することができる。
【００１５】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは特に、ＫＡＡＧ１の細胞外領域と結合することができる。
【００１６】
従って、本発明は、ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対して特異性を有する診断用及び／又は治療用抗体又は抗原結合フラグメントを包含する。本発明の抗体と同じエピトープ特異性を有する抗体又は抗原結合フラグメントも本発明に含まれる。候補抗体は、本明細書に記載する抗体が結合するエピトープと結合するかどうかを究明すること及び／又はこのエピトープと結合することが知られている抗体又は抗原結合フラグメントとの競合分析を実施することによって同定することができる。
【００１７】
従って、本発明の別の態様は、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントと競合できる単離された抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。
【００１８】
本発明の単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞又はＫＡＡＧ１変異体発現腫瘍細胞の死滅（除去、破壊、溶解）を（たとえば、ＡＤＣＣに依存した方法で）誘発できるものを包含する。
【００１９】
本発明の単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の拡大を軽減するそれらの能力によって特徴づけられるもの及びＫＡＡＧ１発現腫瘍の形成を減少させるか又は損なうそれらの能力によって特徴づけられるものも包含する。
【００２０】
抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される場合に特に有効であり得、アンカレッジ依存性成長を特徴とするＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞を標的とするのに特に有用であり得る。
【００２１】
本発明は、本明細書に記載する特性を有するモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体（単離されたもの）並びに抗原結合フラグメントに関する。モノクローナル、キメラ、ヒト化又はヒト抗体間の軽鎖及び／又は重鎖の置換を含む抗体又は抗原結合フラグメントも含まれる。
【００２２】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、したがってヒト定常領域のアミノ酸及び／又はヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含み得る。
【００２３】
「抗体」という用語は、インタクト抗体、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を意味する。「抗体」という用語は、二重特異的抗体などの多重特異的抗体も包含する。ヒト抗体は通常、２つの軽鎖及び２つの重鎖から形成され、それぞれは可変領域及び定常領域を含む。軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲ（本明細書では、フレームワーク領域が隣接するＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３に分類される）を含む。重鎖可変領域は、３つのＣＤＲ（本明細書では、フレームワーク領域が隣接するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３に分類される）を含む。
【００２４】
「抗原結合フラグメント」という用語は、本明細書で用いられる場合、抗原（たとえば、ＫＡＡＧ１、ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はその変異体）と結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能はインタクト抗体のフラグメントによって実行できることが証明された。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィドブリッジにより結合した２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖフラグメント（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１ ５４４−５４６）、並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、たとえばＶＨＣＤＲ３が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域が対になって一価分子を形成する１本鎖ポリペプチド（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られ、たとえばＢｉｒｄ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６、及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３を参照のこと）にすることができる合成リンカーによってこれらを結合させることができる。このような１本鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に含まれることが意図される。さらに、抗原結合フラグメントは、（ｉ）イムノグロブリンヒンジ領域ポリペプチドと融合した結合ドメインポリペプチド（たとえば、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、又はリンカーペプチドを介して軽鎖可変領域と融合した重鎖可変領域）、（ｉｉ）ヒンジ領域と融合したイムノグロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域と融合したイムノグロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメインイムノグロブリン融合タンパク質を含む。ヒンジ領域は、１以上のシステイン残基をセリン残基で置換することにより修飾して、二量化を防止することができる。このような結合ドメインイムノグロブリン融合タンパク質はさらにＵＳ２００３／０１１８５９２及びＵＳ２００３／０１３３９３９で開示されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の通常の技術を用いて得られ、フラグメントをインタクト抗体と同様の方法で有用性についてスクリーンする。
【００２５】
典型的な抗原結合部位は、軽鎖イムノグロブリン及び重鎖イムノグロブリンを対にすることによって形成される可変領域から構成される。抗体可変領域の構造は非常に一貫性があり、非常に類似した構造を示す。これらの可変領域は、典型的には、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する３つの超可変領域が間に配置された比較的相同性のフレームワーク領域（ＦＲ）から構成される。抗原結合フラグメントの全体的な結合活性は、多くの場合、ＣＤＲの配列によって決定される。ＦＲは、多くの場合、最適な抗原結合のためのＣＤＲの３次元における適切な位置決定及びアラインメントに関与する。
【００２６】
本発明の抗体及び／又は抗原結合フラグメントは、たとえば、マウス、ラット若しくは任意の他の哺乳動物又は組換えＤＮＡ技術などを介した他の起源由来のものであってよい。
【００２７】
本発明のさらなる範囲、適用性及び利点は、以下の非限定的で詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この詳細な説明は、本発明の例示的実施形態を示すが、添付の図面を参照して例示のためのみに提示されると解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】２０超の卵巣腫瘍、良性（低悪性度）腫瘍、卵巣癌細胞系、及び３０の正常組織由来のＲＮＡ試料におけるＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡ発現のレベルを測定するために実施した半定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を用いた発現プロファイリング分析を示す図である。対照パネルは、各ＲＴ−ＰＣＲ反応における出発物質の量を比較するために用いられるハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現を示す。
【図１Ｂ】ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡが卵巣癌細胞系、特に腹水由来の細胞系において発現されることを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験を示す図である。
【図１Ｃ】卵巣癌細胞系がスフェロイドと呼ばれる３Ｄ構造を形成するできることを表す図である。左のパネルは、血清がない培地中で成長させた細胞を示し、一方、５％血清はスフェロイド構造の形成を刺激した。
【図１Ｄ】ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡが卵巣癌細胞系におけるスフェロイド形成中に高度に誘発されることを示す半定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験の図である。
【図２Ａ】創傷又はスクラッチ分析、つまりあらかじめ決められた期間にわたって露出部分へ移動できる細胞系の能力の測定である細胞に基づく分析を示す図である。ＫＡＡＧ１ ｓｈＲＮＡを有するＴＯＶ−２１Ｇ細胞は、露出部分を満たす能力が低下している。
【図２Ｂ】コロニー形成法（コロニー生存分析とも呼ばれる）の図である。数日の期間にわたって希釈された細胞の生存を測定した。ＫＡＡＧ１ ｓｈＲＮＡを有するＴＯＶ−２１Ｇ細胞は生存が減少した。
【図３Ａ】クマシーブルーで染色され、一時的にトランスフェクトされた２９３Ｅ細胞において産生された精製Ｆｃ−ＫＡＡＧＩ融合タンパク質の試料（１０μｇ）を含むポリアクリルアミドゲルを示す図である。
【図３Ｂ】抗ＫＡＡＧ１ Ｆａｂを含むＯｍｎｉｃｌｏｎａｌライブラリ＃３から選択される個々のモノクローナル抗体を含む９６穴プレートのうちの１つのＥＬＩＳＡの結果を示す。この結果から、４８（灰色で強調）のＦａｂがＫＡＡＧ１と非常に効率的に相互作用することがわかった。太字の数字で表示した穴は、例示的モノクローナル抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、及び３Ｃ４を含んでいた。
【図４Ａ】クマシーブルーで染色され、精製Ｆｃ−ＫＡＡＧＩ融合タンパク質（レーン１）、アミノ酸１〜６０の範囲のＫＡＡＧ１のトランケートされた突然変異体（レーン２）、及び一時的にトランスフェクトされた２９３Ｅ細胞において産生された、アミノ酸１〜３５の範囲のＫＡＡＧ１の別のトランケートされた突然変異体（レーン３）の試料（１０μｇ）を含むポリアクリルアミドゲルを示す。全てのタンパク質はＦｃ融合タンパク質であった。
【図４Ｂ】エピトープマッピング研究のために生成させたＫＡＡＧ１のトランケートされた突然変異体を表すスキームである。
【図４Ｃ】Ｏｍｎｉｃｌｏｎａｌライブラリ＃３中に含まれる抗ＫＡＡＧ１抗体によって結合されたエピトープをマッピングするためのＥＬＩＳＡ分析から得られた結果を説明するための図である。結果から、モノクローナル抗体の大部分はＫＡＡＧ１の中心部分と相互作用し、ある抗体はＫＡＡＧ１のアミノ末端又はカルボキシル末端と結合することがわかる。
【図５】マウスＦａｂをＩｇＧ１マウス−ヒトキメラｍＡｂに変えるための関連するステップを表すスキームである。
【図６】マウス抗ＫＡＡＧ１ Ｆａｂの結合を、例示的抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、及び３Ｃ４の対応するＩｇＧ１キメラモノクローナル抗体の結合と比較する図である。結果は、Ｆａｂ可変領域の相対的結合が、完全ヒトＩｇＧ１スカフォールドに移動した場合に維持されたことを示す。
【図７】キメラＩｇＧ１抗ＫＡＡＧ１モノクローナル抗体の存在下でＴＯＶ−２１Ｇ及びＯＶ−９０卵巣癌細胞系を用いたスフェロイド形成実験の図である。ゆるく充填された構造は、低侵襲性癌細胞系の指標となる。結果は、例示的抗ＫＡＡＧ１抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、又は３Ｃ４で処理されたスフェロイドを示す。
【図８Ａ】卵巣腫瘍患者から得られた約７０の生検試料を含む組織マイクロアレイのスキャンを示す図である。試料を３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体でブロットし、卵巣腫瘍の大部分が非常に高レベルのＫＡＡＧ１抗原を発現したことがわかった。
【図８Ｂ】組織マイクロアレイ実験から得られたさらに高倍率の図である。矢印は、漿液性卵巣腫瘍における細胞の上皮層の先端面でのＫＡＡＧ１の膜への局在を示す。
【図８Ｃ】ＫＡＡＧ１があらゆる種類の卵巣癌において高度に発現されることを証明する他の免疫組織化学的研究を示す図である。図示した組織型（ｈｉｓｔｏｔｙｐｅ）は、漿液性、粘液性及び類内膜である。
【図９Ａ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図９Ｂ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図９Ｃ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図１０Ａ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図１０Ｂ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図１０Ｃ】ＣｌｕｓｔａｌＷ２プログラムを用いて選択されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３配列について得られたアラインメント結果のまとめであり；「＊」は、その列の残基がアラインメント中の全配列で同じであることを意味し、「：」は、保存的置換が観察されたことを意味し、「．」は半保存的置換が観察されることを意味する。ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いてコンセンサスＣＤＲを得た（Ｌａｒｋｉｎ Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．，（２００７）ＣｌｕｓｔａｌＷ ａｎｄ ＣｌｕｓｔａｌＸ ｖｅｒｓｉｏｎ ２． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２００７ ２３（２１）：２９４７−２９４８）。
【図１１】生成した軽鎖可変領域のそれぞれと配列番号１６、２０、２４又は１０５で同定された代表的な軽鎖可変領域との配列比較を表す図である。配列同一性（％）及び配列類似性（％）は、本明細書で示すようにＢｌａｓｔ２配列プログラムを用いて決定した。
【図１２】生成した重鎖可変領域のそれぞれと、配列番号１８、２２、２６又は１３２で同定された代表的な重鎖可変領域との配列比較を表す図である。配列同一性（％）及び配列類似性（％）は、本明細書で示すようにＢｌａｓｔ２配列プログラムを用いて決定した。
【図１３】ＫＡＡＧ１を標的とするＩｇＧ１抗体はインビトロでＡＤＣＣ活性を効率的に媒介することができる。ＰＢＭＮＣ（ＡｌｌＣｅｌｌｓ，ＬＬＣ、カリフォルニア州エモリービル）を３Ｄ３とともに３０分間インキュベートし、ＯＶＣＡＲ−３又はＷＩＬ２−Ｓ細胞のいずれかと１：２５の比で混合した。細胞を４時間３７℃でインキュベートし、培地中のＬＤＨレベルを測定することによって細胞溶解を決定した。細胞傷害性を次のようにして計算した：細胞傷害性（％）＝（実験値−エフェクターの自発的溶解−標的の自発的溶解）×１００／（標的最大溶解−標的自発的溶解）。
【図１４】抗ＫＡＡＧ１ ｍＡｂはインビボでＴＯＶ−１１２Ｄ卵巣腫瘍の拡大を防止する。１×１０６細胞をＳＣＩＤマウスの腹腔中に２００μＬの体積で移植した。ＰＢＳ又はＰＢＳ中で希釈した抗体のいずれかを用いた治療を２５ｍｇ／ｋｇｑｗｋの用量で２日後に実施した。腹部の触診によって腫瘍が検出されるとすぐにマウスを屠殺した。腫瘍の数を視覚的に採点し（Ｂ）、パネルＡのデータを腫瘍／マウス±ＳＥの平均数として表す。
【図１５】扁平上皮細胞癌及び黒色腫から単離されたいくつかの切片のヒト皮膚腫瘍組織マイクロアレイ（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州リッチモンド）上で抗ＫＡＡＧ１抗体を用いて実施した免疫組織化学法を示す図である。
【図１６】キメラ３Ｄ３抗体の存在下又は非存在下での、黒色腫細胞系（Ａ３７５及びＳＫ−ＭＥＬ５）並びに腎臓細胞癌細胞系（Ａ４９８及び７８６−Ｏ）のスフェロイド形成を表す図である。
【図１７Ａ】増加する濃度の３Ｃ４、３Ｄ３及び３Ｇ１０抗体の、細胞を透過しない条件下で固定された細胞系（ＯＶ−９０、ＴＯＶ−２１Ｇ及びＳＫＯＶ−３）に対する結合を表すグラフである。
【図１７Ｂ】３Ｄ３抗体を用いてＳＫＯＶ−３細胞系に関して実施したフローサイトメトリーの結果を表すグラフである。
【図１８Ａ】３Ｄ３抗体モデルの構造を表す略図である。
【図１８Ｂ】３Ｃ４抗体モデルの構造を表す略図である。
【図１９Ａ】キメラ３Ｄ３抗体と比較した、増加する濃度のヒト化３Ｄ３抗体の組換えＫＡＡＧ１に対する結合を表すグラフである。
【図１９Ｂ】ヒト化３Ｄ３抗体、キメラ３Ｄ３抗体、並びにキメラ又はヒト化抗体の軽鎖及び重鎖の置換を含むハイブリッド抗体の動態パラメータをまとめた表である。
【図１９Ｃ】ヒト化３Ｄ３抗体、キメラ３Ｄ３抗体の存在下又は緩衝液若しくは対照ＩｇＧの存在下でのＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞のスフェロイド形成を表す図である。
【図２０Ａ】モノクローナル３Ｄ３軽鎖可変領域（配列番号１６）及びヒト化３Ｄ３軽鎖可変領域（配列番号１７８）の配列アラインメントを表す図である。ヒト化３Ｄ３軽鎖可変領域は、モノクローナル３Ｄ３軽鎖可変領域と８６％同一（９４％配列類似性）であり、それらの３つのＣＤＲは１００％同一である（太字で表示）。
【図２０Ｂ】モノクローナル３Ｄ３重鎖可変領域（配列番号１８）及びヒト化３Ｄ３重鎖可変領域（配列番号１７９）の配列アラインメントを表す。ヒト化３Ｄ３重鎖可変領域はモノクローナル３Ｄ３重鎖可変領域と８２％同一（９１％配列類似性）であり、それらの３つのＣＤＲは１００％同一である（太字で表示）。
【図２１Ａ】モノクローナル３Ｃ４軽鎖可変領域（配列番号２４）及びヒト化３Ｃ４軽鎖可変領域（配列番号１８２）の配列アラインメントを表す。ヒト化３Ｃ４軽鎖可変領域はモノクローナル３Ｃ４軽鎖可変領域と８５％同一（９３％配列類似性）であり、それらの３つのＣＤＲは１００％同一である（太字で表示）。
【図２１Ｂ】モノクローナル３Ｃ４重鎖可変領域（配列番号２６）及びヒト化３Ｃ４重鎖可変領域（配列番号１８３）の配列アラインメントを表す。ヒト化３Ｃ４重鎖可変領域は、モノクローナル３Ｃ４重鎖可変領域と８６％同一（９３％配列類似性）であり、それらの３つのＣＤＲは１００％同一である（太字で表示）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
癌細胞におけるＫＡＡＧ１の発現及び生物活性
本発明は、様々な癌型、特に卵巣癌において見いだされる腫瘍を標的とする抗体の使用に関する。抗体を腫瘍に向かわせるために、癌細胞表面で発現される腫瘍特異性抗原の同定を実施しなければならない。腫瘍特異性抗原を同定するために利用可能な技術がいくつかあり、卵巣腫瘍におけるＫＡＡＧ１を同定するために使用された方法（サブトラクティブトランスクリプションに基づくｍＲＮＡの増幅（ＳＴＡＲ）と呼ばれる革新的な発見の基盤）は、公開特許出願第ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１１３４号に記載されている。
【００３０】
卵巣癌ＳＴＡＲライブラリの分析によって、分泌されたタンパク質及び細胞表面タンパク質をコード化する多くの遺伝子を得た。ＡＢ−０４４７と称するこれらのうちの１つはオープンリーディングフレームを含み、これは、配列番号１に示すヌクレオチド配列を有する８８５塩基対のｃＤＡＮによってコード化された配列番号２に対応する８４のアミノ酸のポリペプチドをコード化した。公的に利用不可能なデータベースを検索することによって、ＡＢ−０４４７ヌクレオチド配列がＫＡＡＧ１と呼ばれる遺伝子と同じであることが明らかになった。バイオインフォーマティック分析によって、その機能的ドメインを細胞外区画に対して提示する膜に固定されたタンパク質が予想された。ＫＡＡＧ１は、最初は腎臓癌ライブラリから細胞表面抗原としてクローンされ、これはその膜局在化を裏付ける結果である。さらに、本発明者らの研究から、タンパク質がそのアミノ末端で処理されることがわかり、これはアミノ酸３０及び３４又はその間の機能的シグナルペプチドの切断と一致した結果であった。さらに、完全長ｃＤＮＡの一時的発現の結果、培地中で切断されたＫＡＡＧ１が検出された。この最後の発見から、この膜に固定されたタンパク質は、高レベルで発現された場合に細胞から除去できることが示された。対照的に、ＫＡＡＧ１のアミノトランケートされた突然変異体の発現によって、タンパク質の細胞内保持が起こった。現在、本発明により開示される様な、卵巣癌におけるＫＡＡＧ１の機能及び過剰発現を明らかにする公開された報告は今までに文書で記録されていない。
【００３１】
従って、本発明者らはＫＡＡＧ１を抗体に基づく診断及び治療に用いることができるかどうかを調査した。
【００３２】
ＴＯＶ−２１Ｇ、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＯＶ−９０などのいくつかの卵巣癌細胞に基づくモデルが確立され、当業者には周知である。これらの細胞は、卵巣腫瘍又は腹水を有する患者由来のヒト卵巣癌細胞系のコレクションの一部である。これらの細胞系は、これらをヒト卵巣癌の優れた細胞に基づくモデルとするマイクロアレイ上の全般的遺伝子発現パターンを包含する徹底的分析を受けた。成長性、遺伝子発現パターン、及び化学療法薬に対する反応は、これらの細胞系がインビボでの卵巣腫瘍挙動の非常に代表的なものであることを示す（Ｂｅｎｏｉｔら、２００７年）。これらの卵巣癌細胞系から単離された全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析から、ＫＡＡＧ１転写物は原発腫瘍由来の細胞系において弱く発現されたことがわかる。対照的に、腹水由来の細胞系は、高レベルのＫＡＡＧ１発現を含んでいた。腹水由来の細胞におけるＫＡＡＧ１の発現の増大は、細胞の環境がＫＡＡＧ１遺伝子の調節に影響を及ぼすことを示唆した。腹水細胞は進行した疾患と関連し、この発現パターンは、ＫＡＡＧ１レベルの増大がアンカレッジ依存性成長と関連することを意味する。この後者の示唆によって、ＫＡＡＧ１発現は、原発腫瘍由来の細胞系において、これらの細胞が３Ｄ培養でスフェロイドとして培養される場合に有意に増大することが判明した。これらのスフェロイドは、広く特徴づけられ、インビボで腫瘍に関連する多くの特性を示すことが判明した（Ｃｏｄｙら、２００８年）。従って、ＫＡＡＧ１の発現は、特に卵巣癌発生中の腫瘍の進行をまねたモデルにおいて有意に増大することが判明した。
【００３３】
ＫＡＡＧ１発現が卵巣癌細胞において調節されることが示されたので、卵巣癌細胞挙動におけるこの遺伝子の機能を細胞に基づいた分析で調べた。その趣旨で、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を用いて、卵巣癌細胞系における内因性ＫＡＡＧ１遺伝子の発現をノックダウンし、ＫＡＡＧ１の発現の減少の結果、創傷治癒（又はスクラッチ）分析によって例示されるような標準的細胞運動性分析で測定すると細胞の移動が有意に減少することが判明した。この種類の分析は、細胞がコンフルエント単層中の露出部分を満たす速度を測定する。ＫＡＡＧ１の発現が減少すると、コロニー生存分析などのコロニー形成法によって測定される卵巣癌細胞系の生存が減少した。当業者は、癌細胞、特に卵巣癌細胞の挙動におけるＫＡＡＧ１の要件を評価するために他の方法を用いることができる。
【００３４】
卵巣腫瘍の大集団におけるＫＡＡＧ１の発現、正常組織におけるその限定された発現、及び発現レベルと増大した悪性との一致、及び卵巣癌細胞系の挙動におけるＫＡＡＧ１の推定上の生物学的役割に基づいて、卵巣癌の検出、予防、及び治療用抗体を開発するための治療標的としてＫＡＡＧ１を選択した。卵巣癌以外の癌におけるＫＡＡＧ１の発現によっても、本出願者らは他の癌の徴候に関する治療的又は診断的抗体を評価するに至った。
【００３５】
従って、様々な抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメント、たとえばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ及びヒト化抗体（ヒト化モノクローナル抗体を包含する）、抗体フラグメント、１本鎖抗体、ドメイン抗体、及び抗原結合領域を有するポリペプチドであって、ＫＡＡＧ１を標的とするのに有用なものが提供される。
【００３６】
抗原としてのＫＡＡＧ１及びＫＡＡＧ１由来のエピトープ
本出願者は、ＫＡＡＧ１がいくつかの腫瘍型において発現され、患者の血液及び腹水においても見いだされるという予想外の発見に至った。この抗原は従って、インビボで当該抗原を発現する腫瘍細胞を標的とするため、及びインビトロ又はインビボで腫瘍関連抗原を測定するための検出分析の開発に有用であり得る。血液中を循環するＫＡＡＧ１抗原はシグナルペプチドがない。
【００３７】
本発明はしたがって、ＫＡＡＧ１の循環形に特異的及び／又は腫瘍により発現されたＫＡＡＧ１に特異的な抗体を生成するために有用なＫＡＡＧ１抗原を提供する。ＫＡＡＧ１抗原（すなわちエピトープ）は、ＫＡＡＧ１の少なくとも１０個のアミノ酸（かつ８４個までのアミノ酸）のフラグメントを含み得、特にＫＡＡＧ１の細胞外領域と結合し得る。
【００３８】
抗原の一例は、配列番号２又はそのフラグメントと少なくとも８０％の配列同一性を有する全ＫＡＡＧ１タンパク質又は変異体形態である。
【００３９】
ＫＡＡＧ１由来の抗原の別の例は、ＫＡＡＧ１の分泌又は循環形であって、シグナルペプチド又はＫＡＡＧ１の細胞外領域がないものである。この抗原は、さらに詳細には、ＫＡＡＧ１のアミノ酸１〜２５、１〜２６、１〜２７、１〜２８、１〜２９、１〜３０、１〜３１、１〜３２、１〜３３、１〜３４、１〜３５又は１〜３６がない。
【００４０】
本明細書に記載する抗原又はエピトープは、抗体及び抗原結合フラグメントを生成させるために、キーホールリンペット（ＫＨＬ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）などの担体と融合させることができる。
【００４１】
本発明はまた、本明細書に記載する抗体及び抗原結合フラグメントを生成させるための配列番号２のアミノ酸１〜３５、配列番号２のアミノ酸３６〜６０又は配列番号２のアミノ酸アミノ酸６１〜８４に含まれるエピトープも提供する。本発明はさらに、ＫＡＡＧ１の分泌若しくは循環形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成させるための組成物を提供し、この組成物は、配列番号２のアミノ酸３０〜８４に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープ及び担体を含み得る。エピトープは特に、ＫＡＡＧ１の少なくとも１０個のアミノ酸を含み得る。
【００４２】
組成物の例示的実施形態は、ＫＡＡＧ１の分泌若しくは循環形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成させるための医薬組成物である。医薬組成物は、配列番号２のアミノ酸３０〜８４に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープ及び薬剤的に許容される担体を含み得る。
【００４３】
さらに別の態様において、本発明は、ＫＡＡＧ１の分泌若しくは循環形態に対する抗体を生成させるための方法を提供する。この方法は、配列番号２のアミノ酸３０〜８４に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープを含むポリペプチドを投与することを含み、ここで、エピトープはＫＡＡＧ１シグナルペプチドが欠失している。
【００４４】
あるいは、当該方法は、シグナルペプチドを含むエピトープを投与し、タンパク質の分泌形態又は細胞外領域のみと結合する抗体を選択することを含み得る。
【００４５】
さらなる態様において、本発明は、ＫＡＡＧ１の分泌又は循環形態に対する抗体を生成させるための、配列番号２のアミノ酸３０〜８４に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープの使用を提供する。
【００４６】
ＫＡＡＧ１と結合する抗体及び抗原結合フラグメント
抗体は、最初は興味のある抗原に対するそれらの特異性に関してＦａｂライブラリから単離された。最大の特徴を示す抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のアミノ酸配列の比較によって、ＣＤＲ内及び可変領域内のコンセンサス配列を誘導することができた。ＣＤＲのコンセンサス配列は、配列番号７４〜９０に示される。
【００４７】
本明細書に記載される可変領域を所望の種の定常領域と融合させ、これによって所望の種のエフェクター細胞によって抗体を認識させることができる。定常領域は、たとえばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ由来であり得る。定常領域のフレーム中での可変領域を用いたクローニング又は合成は、十分に当業者の技術範囲内であり、たとえば組換えＤＮＡ技術によって実施することができる。
【００４８】
本発明のある実施形態において、ＫＡＡＧ１と結合する抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプのものであってよい。本発明のさらに具体的な実施形態は、ＩｇＧ１サブタイプの抗体に関する。抗体は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体媒介性細胞傷害性（ＣＭＣ）の媒介において生物学的に活性であるか、又は免疫複合体と関連するＩｇＧ１サブタイプのヒト化抗体であってよい。典型的なＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化に関与し、ＮＫ細胞の表面上のＦｃ受容体による抗体被覆細胞の認識に依存する。Ｆｃ受容体は、標的細胞、特に、ＫＡＡＧ１などの抗原を発現する癌性細胞の表面と結合するＩｇＧ１上に存在するような抗体のＦｃドメインを認識する。ＩｇＧのＦｃ受容体と結合した時点で、ＮＫ細胞はサイトカイン及び細胞傷害性顆粒を放出し、これらは標的細胞に侵入し、アポトーシスを引き起こすことによって細胞死を促進する。
【００４９】
数例において、抗体３Ｄ３と実質的に同一である軽及び重鎖可変領域を有する抗ＫＡＡＧ１抗体は、ＫＡＡＧ１のアミノ酸３６〜６０（両端を含む）の範囲のエピトープと相互作用する。他の例では、抗体３Ｇ１０と実質的に同一である軽及び重鎖可変領域を有する抗ＫＡＡＧ１抗体は、ＫＡＡＧ１のアミノ酸６１〜８４（両端を含む）の範囲のエピトープと相互作用する。さらに別の例では、抗体３Ｃ４と実質的に同一である軽及び重鎖可変領域を有する抗ＫＡＡＧ１抗体は、ＫＡＡＧ１のアミノ酸１〜３５（両端を含む）のエピトープと相互作用する。
【００５０】
本発明は、ＫＡＡＧ１と結合する抗体のコレクションを記載する。ある実施形態において、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、例えばキメラ又はヒト化抗体、抗体フラグメント、例えば抗原結合フラグメント、１本鎖抗体、ドメイン抗体、及び抗原結合領域を有するポリペプチドからなる群から選択することができる。
【００５１】
本発明の一態様において、本発明の単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞又はＫＡＡＧ１変異体発現腫瘍細胞の死滅（除去、破壊、溶解）を（たとえばＡＤＣＣに依存した方法で）誘発することができる。
【００５２】
本発明のさらなる態様において、本発明の単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の拡大を軽減するその能力によって特に特徴づけられる。
【００５３】
本発明のさらなる態様において、本発明の単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１発現腫瘍の形成を減少させるかまたは損なう能力により特徴づけられる。
【００５４】
本発明の実施形態によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＫＡＡＧ１がＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される場合にさらに有効であり得る。
【００５５】
また、本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、アンカレッジ依存性成長を特徴とするＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞を標的とするのに特に有用であり得る。
【００５６】
さらなる態様において、本発明は、ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞を含む癌の治療において用いられる、単離された抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００５７】
さらに別の態様において、本発明は、ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞を含む癌の検出において用いられる単離された抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００５８】
本発明の例示的実施形態において、単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、たとえばヒト抗体由来であり得る定常領域のアミノ酸を含み得る。
【００５９】
本発明の別の例示的実施形態において、単離された抗体又は抗原結合フラグメントは、ヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含み得る。
【００６０】
本明細書に記載する例示的実施形態に限定されないが、本出願者は、本明細書に記載する目的のために有用であり得る抗体及び抗原結合フラグメントを生成させた。
【００６１】
本発明は、従って例示的一実施形態において、
（ａ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列、
（ｂ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列、又は
（ｃ）配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列
を有する軽鎖可変領域を含む単離された抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。
【００６２】
単離された抗体又は抗原結合フラグメントはまた、
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、又は
（ｃ）配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
を有する重鎖可変領域を含んでもよい。
【００６３】
例示的一実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、軽鎖可変領域の個々のＣＤＲ又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の組み合わせを含んでもよい。ＣＤＲ３はさらに詳細に選択することができる。組み合わせとしては、たとえば、ＣＤＲＬ１とＣＤＲＬ３；ＣＤＲＬ１とＣＤＲＬ２；ＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３及び；ＣＤＲＬ１とＣＤＲＬ２とＣＤＲＬ３が挙げられる。
【００６４】
別の例示的実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、重鎖可変領域の個々のＣＤＲ又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の組み合わせを含んでもよい。ＣＤＲ３はさらに詳細に選択することができる。組み合わせには、たとえばＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ３；ＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２；ＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３及び；ＣＤＲＨ１とＣＤＲＨ２とＣＤＲＨ３が含まれる。
【００６５】
本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る。
【００６６】
また、本発明によれば抗体又は抗原結合フラグメントは、１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含み得る。
【００６７】
さらに、本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは：
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のうちの少なくとも２つのＣＤＲ及び
（ｂ）ＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２又は１つのＣＤＲＨ３のうちの少なくとも２つのＣＤＲ
を含んでもよい。
【００６８】
抗体又は抗原結合フラグメントは、さらに詳細には、１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含んでもよい。
【００６９】
抗体又は抗原結合フラグメントはまた、さらに詳細には１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含んでもよい。
【００７０】
本発明の他の例示的実施形態は；
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、又は；
（ｃ）配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
を有する重鎖可変領域を含む単離された抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００７１】
本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントは、１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２又は１つのＣＤＲＨ３を含んでもよい。
【００７２】
本発明によれば、抗体又は抗原結合フラグメントはまた、１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含んでもよい。
【００７３】
軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のうちの１つだけが利用可能である場合、抗体又は抗原結合フラグメントを、当該技術分野で公知の方法を用いて相補性可変領域のライブラリをスクリーニングすることによって再構成することができる（Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９３）１５０：８８０−８８７， Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２：６２４−６２８）。
【００７４】
本明細書に記載する少なくとも１つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も本発明に含まれる。
【００７５】
本発明は、少なくとも２つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も含む。
【００７６】
本発明は、３つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も含む。
【００７７】
本発明は、少なくとも１つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も含む。
【００７８】
本発明は、少なくとも２つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も含む。
【００７９】
本発明は、３つのＣＤＲにおいて（もとのＣＤＲと比較して）少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を有する可変鎖を含むポリペプチド又は抗体も含む。
【００８０】
別の態様において、本発明は、（単一のポリペプチド鎖又は別個のポリペプチド鎖上で）本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントのうちの１つの、軽鎖可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域及び重鎖可変領域の少なくとも１つの相補性決定領域を含むポリペプチド、抗体又は抗原結合フラグメントに関する。
【００８１】
本発明は、その別の態様において、（単一のポリペプチド鎖上又は別個のポリペプチド鎖上で）本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントの６個の相補性決定領域（ＣＤＲ）全てを含み得る抗ＫＡＡＧ１抗体に関する。
【００８２】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、（１つ若しくは複数の）ＣＤＲのアミノ及び／又はカルボキシ領域に隣接するさらなるアミノ酸をさらに含み得る。これらのさらなるアミノ酸は、表Ａ又は表Ｂに示されるようなものであり得るか、又はたとえば保存的アミノ酸置換を含み得る。
【００８３】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ａＳＳＸ２ａＳＬＬＸ３ａＸ４ａＸ５ａＸ６ａＸ７ａＸ８ａＸ９ａＸ１０ａＬＸ１１ａ（配列番号７４）
（式中、Ｘ１ａは塩基性アミノ酸であり；
Ｘ２ａは塩基性アミノ酸であり；
Ｘ３ａはＨ、Ｙ又はＮであり；
Ｘ４ａはＳ、Ｔ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ５ａは存在しないか、Ｓ又はＮであり；
Ｘ６ａはＤ、Ｆ又はＮであり；
Ｘ７ａはＧ又はＱであり；
Ｘ８ａはＫ、Ｌ又はＮであり；
Ｘ９ａはＴ又はＮであり；
Ｘ１０ａは芳香族アミノ酸であり、そして
Ｘ１１ａはＡ、Ｎ、Ｅ又はＹである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【００８４】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ａはＫ又はＲであり得る。
【００８５】
本発明のさらなる実施形態において、Ｘ２ａはＱ又はＫであり得る。
【００８６】
本発明のさらに別の実施形態において、Ｘ３ａはＮ又はＨであり得る。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態において、Ｘ１０ａはＹ又はＦであり得る。
【００８８】
本発明のさらに具体的な実施形態は、配列番号７４のＣＤＲＬ１を含み、ここで、Ｘ１ａはＫ；Ｘ２ａはＱ；Ｘ３ａはＮ；Ｘ３ａはＨ；Ｘ４ａはＳ；Ｘ４ａはＴ；Ｘ５ａはＳ；Ｘ５ａは存在しない：Ｘ６ａはＮ；Ｘ７ａはＱ；Ｘ７ａはＧ；Ｘ８ａはＫ；Ｘ９ａはＮ；Ｘ９ａはＴ；Ｘ１０ａはＹ；又はＸ１１ａはＡである。
【００８９】
本発明によれば、抗体は、式：
ＫＡＳＱＤＸ１ｂＸ２ｂＸ３ｂＸ４ｂＸ５ｂＸ６ｂ（配列番号７５）
（式中、Ｘ１ｂは疎水性アミノ酸であり；
Ｘ２ｂはＧ又はＨであり；
Ｘ３ｂはＴ、Ｎ又はＲであり；
Ｘ４ｂはＦ、Ｙ又はＡであり；
Ｘ５ｂは疎水性アミノ酸であり、そして；
Ｘ６ｂはＮ又はＡである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【００９０】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｂはＶ又はＩであり得る。
【００９１】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ５ｂはＶ又はＬであり得る。
【００９２】
本発明のさらに具体的な実施形態は配列番号７５のＣＤＲＬ１を含み、ここで、Ｘ１ｂはＩ；Ｘ２ｂはＨ；Ｘ３ｂはＴ；Ｘ３ｂはＮ；Ｘ４ｂはＹ；Ｘ４ｂはＦ；Ｘ５ｂはＬ、又はＸ６ｂはＮである。
【００９３】
本発明によれば、抗体は、式：
ＦＸ１ｃＳＴＸ２ｃＸ３ｃＳ（配列番号７６）
（式中、Ｘ１ｃはＡ又はＧであり；
Ｘ２ｃはＲ又はＴであり、そして；
Ｘ３ｃはＥ、Ｋ又はＡである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【００９４】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｃはＡであり得、Ｘ２ｃはＴであり得る。
【００９５】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ１ｃはＡであり得、Ｘ２ｃはＲであり得る。
【００９６】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号７６のＣＤＲＬ２を含み、ここで、Ｘ１ｃはＡ；Ｘ２ｃはＲ、又はＸ３ｃはＥである。
【００９７】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ｄＶＳＸ２ｄＸ３ｄＸ４ｄＳ（配列番号７７）
（式中、Ｘ１ｄはＬ又はＫであり；
Ｘ２ｄは塩基性アミノ酸であり；
Ｘ３ｄはＬ又はＲであり、そして；
Ｘ４ｄはＤ又はＦである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【００９８】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｄはＫ又はＮであり得る。
【００９９】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号７７のＣＤＲＬ２を含み、ここで、Ｘ１ｄはＬ；Ｘ２ｄはＫ；Ｘ３ｄはＬ、又はＸ４ｄはＤである。
【０１００】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ｅＡＮＲＬＶＸ２ｅ（配列番号７８）
（式中、Ｘ１ｅは塩基性アミノ酸であり、そして
Ｘ２ｅはＤ又はＡである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０１０１】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｅはＲ又はＨであり得る。
【０１０２】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号７８のＣＤＲＬ２を含み、ここで、Ｘ１ｅはＲであるか、又はＸ２ｅはＤである。
【０１０３】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ｆＱＸ２ｆＸ３ｆＸ４ｆＸ５ｆＰＬＴ（配列番号７９）
（式中、Ｘ１ｆはＱ又はＬであり；
Ｘ２ｆは芳香族アミノ酸であり；
Ｘ３ｆはＤ、Ｆ又はＹであり；
Ｘ４ｆはＥ、Ａ、Ｎ又はＳであり、そして；
Ｘ５ｆはＩ、Ｆ又はＴである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１０４】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｆはＹ又はＨであり得る。
【０１０５】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ３ｆはＹ又はＤであり得る。
【０１０６】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、Ｘ５ｆはＩ又はＴであり得る。
【０１０７】
本発明の他の具体的な実施形態は配列番号７９のＣＤＲＬ３を含み、ここで、Ｘ１ｆはＱ；Ｘ２ｆはＨ；Ｘ３ｆはＤ；Ｘ３ｆはＹ；Ｘ４ｆはＳ；Ｘ４ｆはＥ；Ｘ４ｆはＡ；Ｘ５ｆはＴ、又はＸ５ｆはＩである。
【０１０８】
本発明によれば、抗体は、式：
ＱＱＨＸ１ｇＸ２ｇＸ３ｇＰＬＴ（配列番号８０）
（式中、Ｘ１ｇは芳香族アミノ酸であり；
Ｘ２ｇはＮ又はＳであり、そして；
Ｘ３ｇはＩ又はＴである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１０９】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｇはＦ又はＹであり得る。
【０１１０】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８０のＣＤＲＬ３を含み、ここで、Ｘ２ｇはＳであるか、又はＸ３ｇはＴである。
【０１１１】
本発明によれば、抗体は式：
Ｘ１ｈＱＧＸ２ｈＨＸ３ｈＰＸ４ｈＴ（配列番号８１）
（式中、Ｘ１ｈは芳香族アミノ酸であり；
Ｘ２ｈは中性の親水性アミノ酸であり；
Ｘ３ｈはＦ又はＶであり、そして；
Ｘ４ｈはＲ又はＬである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１１２】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｈはＷ又はＦであり得る。
【０１１３】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ２ｈはＳ又はＴであり得る。
【０１１４】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８１のＣＤＲＬ３を含み、ここで、Ｘ１ｈはＷ；Ｘ２ｈはＴ；Ｘ３ｈはＦ、又はＸ４ｈはＲである。
【０１１５】
本発明によれば、抗体は、式：
ＧＹＸ１ｉＦＸ２ｉＸ３ｉＹＸ４ｉＸ５ｉＨ（配列番号８２）
（式中、Ｘ１ｉはＴ、Ｉ又はＫであり；
Ｘ２ｉは中性の親水性アミノ酸であり；
Ｘ３ｉは酸性アミノ酸であり；
Ｘ４ｉはＥ、Ｎ又はＤであり、そして；
Ｘ５ｉは疎水性アミノ酸である）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０１１６】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｉはＴ又はＳであり得る。
【０１１７】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ３ｉはＤ又はＥであり得る。
【０１１８】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、Ｘ４ｉはＮ又はＥであり得る。
【０１１９】
本発明のさらなる例示的実施形態において、Ｘ５ｉはＭ、Ｉ又はｖであり得る。
【０１２０】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８２のＣＤＲＨ１を含み、ここで、Ｘ２ｉはＴ、Ｘ３ｉはＤ；Ｘ４ｉはＥ；Ｘ５ｉはＩ、又はＸ５ｉはＭである。
【０１２１】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ｊＸ２ｊＤＰＸ３ｊＴＧＸ４ｊＴＸ５ｊ（配列番号８３）
（式中、Ｘ１ｊはＶ又はＧであり、
Ｘ２ｊは疎水性アミノ酸であり；
Ｘ３ｊはＡ、Ｇ又はＥであり；
Ｘ４ｊはＲ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｓ、Ｎ又はＶであり、そして；
Ｘ５ｊは疎水性アミノ酸である）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０１２２】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｊはＩ又はＬであり得る。
【０１２３】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ５ｊはＡ又はＶであり得る。
【０１２４】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８３のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ１ｊはＶ；Ｘ２ｊはＩ；Ｘ３ｊはＥ；Ｘ４ｊはＤ、又はＸ５ｊはＡである。
【０１２５】
本発明によれば、抗体は、式：
ＶＸ１ｋＤＰＸ２ｋＴＧＸ３ｋＴＡ（配列番号８４）
（式中、Ｘ１ｋは疎水性アミノ酸であり；
Ｘ２ｋはＡ、Ｅ又はＧであり；
Ｘ３ｋはＲ、Ｇ、Ａ、Ｓ、Ｎ、Ｖ又はＤである）を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０１２６】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ１ｋはＬ又はＩであり得る。
【０１２７】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８４のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ１ｋはＩ、Ｘ２ｋはＥ、又はＸ３ｋはＤである。
【０１２８】
本発明によれば、抗体は、式：
ＹＩＸ１ｌＸ２ｌＸ３ｌＧＸ４ｌＸ５ｌＸ６ｌ（配列番号８５）
（式中、Ｘ１ｌはＳ又はＮであり；
Ｘ２ｌは芳香族アミノ酸であり；
Ｘ３ｌはＤ、Ｅ又はＮであり；
Ｘ４ｌはＤ又はＨであり；
Ｘ５ｌはＹ、Ｓ又はＮであり；
Ｘ６ｌはＤ、Ｅ又はＮである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０１２９】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ３ｌはＤ又はＮであり得る。
【０１３０】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ６ｌはＤ又はＮであり得る。
【０１３１】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８５のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ２ｌはＦ又はＹ、Ｘ３ｌはＮ、Ｘ４ｌはＤ、又はＸ６ｌはＮである。
【０１３２】
本発明によれば、抗体は、式：
Ｘ１ｍＩＮＰＹＮＸ２ｍＶＴＥ（配列番号８６）
（式中、Ｘ１ｍはＮ又はＹであり；そして
Ｘ２ｍはＥ、Ｄ又はＮである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０１３３】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｍはＤ又はＮであり得る。
【０１３４】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８６のＣＤＲＨ２を含み、ここで、Ｘ１ｍはＮであるか、又はＸ２ｍはＤである。
【０１３５】
本発明によれば、抗体は、式：
ＤＩＮＰＸ１ｎＹＧＸ２ｎＸ３ｎＴ（配列番号８７）
（式中、Ｘ１ｎはＮ又はＹであり；
Ｘ２ｎはＧ又はＴであり；そして
Ｘ３ｎはＩ又はＴである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０１３６】
本発明によれば、抗体は、式：
ＭＸ１ｏＸ２ｏＸ３ｏＤＹ（配列番号８８）
（式中、Ｘ１ｏはＧ又はＳであり；
Ｘ２ｏはＹ又はＨであり、そして；
Ｘ３ｏはＡ又はＳである）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０１３７】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８８のＣＤＲＨ３を含み、ここで、Ｘ１ｏはＧ；Ｘ２ｏはＹ、又はＸ３ｏはＳである。
【０１３８】
本発明によれば、抗体は、式：
ＩＸ１ｐＹＡＸ２ｐＤＹ（配列番号８９）
（式中、Ｘ１ｐはＧ又はＳであり、そして；
Ｘ２ｐは存在しないか又はＭである）
を含むか、又はこれからなるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０１３９】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号８９のＣＤＲＨ３を含み、ここで、Ｘ１ｐはＳであるか、又はＸ２ｐがＭである。
【０１４０】
本発明によれば、抗体は、式：
ＡＸ１ｑＸ２ｑＧＬＲＸ３ｑ（配列番号９０）
（式中、Ｘ１ｑはＲ又はＷであり；
Ｘ２ｑは芳香族アミノ酸であり、そして；
Ｘ３ｑは塩基性アミノ酸である）
を含むか、またはこれからなるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０１４１】
本発明の例示的実施形態において、Ｘ２ｑはＷ又はＦであり得る。
【０１４２】
本発明の別の例示的実施形態において、Ｘ３ｑはＱ又はＮであり得る。
【０１４３】
本発明の他の具体的な実施形態は、配列番号９０のＣＤＲＨ３を含み、ここでＸ１ｑはＲ；Ｘ２ｑはＷ、又はＸ３ｑはＮである。
【０１４４】
本明細書で記載する重鎖及び／又は軽鎖のフレームワーク領域は、表Ａ及びＢに示すフレームワーク領域から誘導することができる。抗体又は抗原結合フラグメントは、従って、本明細書に記載する１以上のＣＤＲ（たとえば、特定のＣＤＲ又は配列番号７４〜９０のコンセンサスＣＤＲから選択される）並びに表Ａ及びＢに記載するもの由来のフレームワーク領域を含み得る。表Ａ及びＢでは、予想されるＣＤＲを太字で示し、フレームワーク領域は太字でない。
【０１４５】
表２は、抗ＫＡＡＧ１抗体の具体例の完全軽及び重鎖イムノグロブリンに対応するヌクレオチド及びアミノ酸の配列を記載する。
【０１４６】
【表１】
【０１４７】
ＫＡＡＧ１を結合できる抗体又は抗原結合フラグメントは、表２に記載するいずれか１つのＬ鎖といずれか１つのＨ鎖イムノグロブリンを含み得る。ある実施形態において、抗体３Ｄ３の軽鎖は、３Ｄ３の重鎖又は３Ｇ１０の重鎖と組み合わせて、ＫＡＡＧ１結合活性を有する完全抗体を形成することができる。本発明の例示的実施形態において、３Ｄ３Ｌ鎖を３Ｄ３Ｈ鎖と組み合わせることができるか、３Ｇ１０Ｌ鎖を３Ｇ１０Ｈ鎖と組み合わせることができるか、又は３Ｃ４Ｌ鎖を３Ｃ４Ｈ鎖と組み合わせることができる。さらに、抗体又は抗原結合フラグメントの数例は、表２に記載する抗体のリストからの２つのＬ鎖及びいずれか２つのＨ鎖の任意の組み合わせからなるものであってよい。
【０１４８】
抗体３Ｄ３の軽及び重イムノグロブリン鎖の完全ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号３及び５に示し、抗体３Ｄ３の軽及び重イムノグロブリン鎖の対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号４及び６に示す。したがって、例示的一実施形態において、ＫＡＡＧ１と結合する抗体は、配列番号４に示す軽鎖アミノ酸を配列番号６に示す重鎖アミノ酸配列と組み合わせて含み得る。別の実施形態において、抗体は、配列番号４を含む２つの同じ３Ｄ３軽鎖及び配列番号６を含む２つの同じ３Ｄ３重鎖を含み得る。
【０１４９】
抗体３Ｇ１０の軽及び重イムノグロブリン鎖の完全ヌクレオチド配列を配列番号７及び９にそれぞれ示し、抗体３Ｇ１０の軽及び重イムノグロブリン鎖の対応するアミノ酸配列を配列番号８及び１０にそれぞれ示す。したがって、例示的一実施形態において、ＫＡＡＧ１と結合する抗体は、配列番号８に示す軽鎖アミノ酸を、配列番号１０に示す重鎖アミノ酸配列と組み合わせて含み得る。別の実施形態において、抗体は、配列番号８を含む２つの同じ３Ｇ１０軽鎖及び配列番号１０を含む２つの同じ３Ｇ１０重鎖を含み得る。
【０１５０】
抗体３Ｃ４の軽及び重イムノグロブリン鎖の完全ヌクレオチド配列をそれぞれ配列番号１１及び１３に示し、抗体３Ｃ４の軽及び重イムノグロブリン鎖の対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１２及び１４に示す。したがって、例示的一実施形態において、ＫＡＡＧ１と結合する抗体は、配列番号１２に示す軽鎖アミノ酸を配列番号１４に示す重鎖アミノ酸配列と組み合わせて含み得る。別の実施形態において、抗体は、配列番号１２を含む２つの同じ３Ｃ４軽鎖及び配列番号１４を含む２つの同じ３Ｃ４重鎖を含み得る。
【０１５１】
軽及び／又は重イムノグロブリン鎖の組み合わせにより形成される他の抗ＫＡＡＧ１抗体又は抗原結合フラグメントの変異体であって、それぞれ独立して、表２に記載するアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有するものも提供される。ある実施形態において、抗体変異体は、少なくとも１つの軽鎖及び１つの重鎖を含み得る。他の例では、抗体変異体は、２つの同じ軽鎖及び２つの同じ重鎖を含み得る。本発明によれば、変異の領域は、定常領域中又は可変領域中に位置してもよい。また、本発明によれば、変異の領域は、フレームワーク領域中に位置してもよい。
【０１５２】
表Ａに記載する可変領域のうちの１つを含む軽鎖及び表Ｂに示す可変領域のうちの１つを含む重鎖を含む抗体も本発明に含まれる。軽鎖及び重鎖は定常領域を含み得る。表２、表Ａ及び表Ｂの軽鎖及び重鎖の組み合わせも本発明に含まれる。
【０１５３】
軽鎖及び重鎖可変領域を含む抗体又は抗原結合フラグメントも本発明で提供される。さらに、ある実施形態は、これらの軽及び重鎖可変領域の抗原結合フラグメント、変異体、及び誘導体を包含する。
【０１５４】
本発明のさらに別の例示的実施形態は、配列番号２、配列番号２の細胞外部分、又は配列番号２の分泌形態若しくはその変異体と特異的に結合できる単離された抗体又は抗原結合フラグメントを包含し、この抗体は、
（ａ）配列番号１６で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１８で定義される重鎖可変領域、
（ｂ）配列番号２０で定義される軽鎖可変領域及び配列番号２２で定義される重鎖可変領域、
（ｃ）配列番号２４で定義される軽鎖可変領域及び配列番号２６で定義される重鎖可変領域、
（ｄ）配列番号１０５で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３２で定義される重鎖可変領域、
（ｅ）配列番号１０６で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３３で定義される重鎖可変領域、
（ｆ）配列番号１０７で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３４で定義される重鎖可変領域、
（ｇ）配列番号１０８で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５４で定義される重鎖可変領域、
（ｈ）配列番号１０９で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５３で定義される重鎖可変領域、
（ｉ）配列番号１１０で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３５で定義される重鎖可変領域、
（ｊ）配列番号１１１で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３６で定義される重鎖可変領域、
（ｋ）配列番号１１２で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４９で定義される重鎖可変領域、
（ｌ）配列番号１１３で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３７で定義される重鎖可変領域、
（ｍ）配列番号１１４で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４０で定義される重鎖可変領域、
（ｎ）配列番号１１５で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４１で定義される重鎖可変領域、
（ｏ）配列番号１１６で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４２で定義される重鎖可変領域、
（ｐ）配列番号１１７で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３９で定義される重鎖可変領域、
（ｑ）配列番号１１９で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４３で定義される重鎖可変領域、
（ｒ）配列番号１２０で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５２で定義される重鎖可変領域、
（ｓ）配列番号１２１で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４６で定義される重鎖可変領域、
（ｔ）配列番号１２２で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１３８で定義される重鎖可変領域、
（ｕ）配列番号１２３で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５０で定義される重鎖可変領域、
（ｖ）配列番号１２４で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４４で定義される重鎖可変領域、
（ｗ）配列番号１２６で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１４５で定義される重鎖可変領域、
（ｘ）配列番号１２７で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５７で定義される重鎖可変領域、
（ｙ）配列番号１２８で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５５で定義される重鎖可変領域、
（ｚ）配列番号１２９で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５６で定義される重鎖可変領域、又は、
（ａａ）配列番号１３０で定義される軽鎖可変領域及び配列番号１５１で定義される重鎖可変領域
を含む。
【０１５５】
本明細書では、前記の特定の組み合わせの軽鎖可変領域を任意の他の軽鎖可変領域に変えることができると理解されるべきである。同様に、特定の組み合わせの重鎖可変領域を任意の他の重鎖可変領域に変えることができる。
【０１５６】
これらの軽及び重鎖可変領域中に存在する配列の具体例を表３に開示する。
【０１５７】
【表２】
【０１５８】
従って、ＫＡＡＧ１と結合する抗体及び抗原結合フラグメントは、同じ名称の抗体の１つの軽鎖可変領域及び１つの重鎖可変領域または任意の組み合わせを含み得る。たとえば、例示的一実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体又はフラグメントは、３Ｄ３軽鎖可変領域（配列番号１６）及び３Ｄ３重鎖可変領域（配列番号１８）を含み得る。別の実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体又はフラグメントは、３Ｄ３軽鎖可変領域（配列番号１６）及び３Ｇ１０重鎖可変領域（配列番号２２）を含み得る。別の実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体は、２つの同じ軽鎖可変領域及び２つの同じ重鎖領域を含み得る。さらに別の実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体は、２つの異なる軽鎖可変領域及び２つの異なる重鎖領域を含み得る。
【０１５９】
それぞれ、表３に記載するアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％の同一性を有する軽及び／又は重鎖可変領域の組み合わせによって形成される他の抗ＫＡＡＧ１抗体の変異体も提供される。当業者は、抗ＫＡＡＧ１抗体変異体が、表３に記載する軽及び／又は重鎖可変領域のアミノ酸配列において、保存的アミノ酸変化、アミノ酸置換、欠失、又は付加を含み得ることも認めるであろう。
【０１６０】
本発明によれば、変異領域は、可変領域のフレームワーク領域中に位置し得る。
【０１６１】
【表３】
【０１６２】
本発明のある実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体又は抗原結合フラグメントは、表４に示すＣＤＲ配列を含み得るか、又は表４のＣＤＲ配列と実質的な配列同一性を有し得る。例示的一実施形態において、３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体は、それぞれ配列番号２７、２８、及び２９によってコード化されるＣＤＲ１、２、及び３を含む軽鎖可変領域、及び／又はそれぞれ配列番号３０、３１、及び３２によってコード化されるＣＤＲ１、２、及び３を含む重鎖可変領域を含み得る。他の実施形態において、ＣＤＲ３領域は抗原結合を提供するために十分であり得る。従って、ＣＤＲ３Ｌ又はＣＤＲ３Ｈ又はＣＤＲ３ＬとＣＤＲ３Ｈとの両方を含むポリペプチドは本発明に含まれる。
【０１６３】
さらに、抗ＫＡＡＧ１抗体又は抗原結合フラグメントは、表４に記載するＣＤＲの任意の組み合わせを含み得る。たとえば、抗体又は抗原結合フラグメントは軽鎖ＣＤＲ３及び重鎖ＣＤＲ３を含み得る。抗ＫＡＡＧ１抗体又は抗原結合フラグメント中に含まれるＣＤＲは、表４に記載するＣＤＲ配列と８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する変異体ＣＤＲであってよいと解釈される。当業者らはまた、変異体が表４に記載するＣＤＲ配列において保存的アミノ酸変化、アミノ酸置換、欠失又は付加を含み得ることを認識するであろう。
【０１６４】
本発明の他の例示的実施形態は、配列番号２、配列番号２の細胞外部分又は配列番号２の分泌形態若しくはその変異体と特異的に結合できる単離された抗体又は抗原結合フラグメントを含み、この抗体は：
（ａ）配列番号１６で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１８で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｂ）配列番号２０で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号２２で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ；
（ｃ）配列番号２４で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号２６で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ；
（ｄ）配列番号１０５で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３２で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｅ）配列番号１０６で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３３で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｆ）配列番号１０７で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３４で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｇ）配列番号１０８で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５４で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｈ）配列番号１０９で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５３で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｉ）配列番号１１０で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３５で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｊ）配列番号１１１で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３６で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｋ）配列番号１１２で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４９で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｌ）配列番号１１３で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３７で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｍ）配列番号１１４で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４０で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｎ）配列番号１１５で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４１で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｏ）配列番号１１６で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４２で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｐ）配列番号１１７で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３９で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｑ）配列番号１１９で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４３で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｒ）配列番号１２０で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５２で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｓ）配列番号１２１で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４６で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｔ）配列番号１２２で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１３８で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｕ）配列番号１２３で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５０で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｖ）配列番号１２４で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４４で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｗ）配列番号１２６で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１４５で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｘ）配列番号１２７で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５７で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｙ）配列番号１２８で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５５で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、
（ｚ）配列番号１２９で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５６で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ、又は；
（ａａ）配列番号１３０で定義される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び／又は配列番号１５１で定義される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ
を含む。
【０１６５】
ここでも、前記の具体的な組み合わせの軽鎖可変領域は、本明細書に記載する任意の他の軽鎖可変領域に変えることができる。同様に、前記の具体的な組み合わせの重鎖可変領域は、本明細書に記載する任意の他の重鎖可変領域に変えることができる。
【０１６６】
変異体抗体及び抗原結合フラグメント
本発明は本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントの変異体も包含する。含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、アミノ酸配列に変異を有するものである。たとえば、含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの変異体ＣＤＲ（２、３、４、５若しくは６の変異体ＣＤＲ又はさらには１２の変異体ＣＤＲ）、変異体軽鎖可変領域、変異体重鎖可変領域、変異体軽鎖及び／又は変異体重鎖を有するものである。本発明に含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、たとえばもとの抗体又は抗原結合フラグメントと比べて結合親和性が類似しているか又は改善されているものである。
【０１６７】
本明細書で用いられる場合、「変異体」という用語は、本明細書に記載するすべての配列に適用され、例えば、変異体ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及び／又はＣＤＲＨ３のいずれか）、変異体軽鎖可変領域、変異体重鎖可変領域、変異体軽鎖、変異体重鎖、変異体抗体、変異体抗原結合フラグメント及びＫＡＡＧ１変異体が挙げられる。
【０１６８】
本発明に含まれる変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、挿入、欠失又はアミノ酸置換（保存的若しくは非保存的）を含み得るものである。これらの変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されていてもよい。
【０１６９】
置換型突然変異誘発のために最も重要な部位としては、超可変領域（ＣＤＲ）があげられるが、フレームワーク領域またはさらには定常領域における改変も想定される。保存的置換は、下記群（群１〜６）からの（ＣＤＲ、可変鎖、抗体などの）１つのアミノ酸を同じ群の別のアミノ酸と交換することによってなすことができる。
【０１７０】
保存的置換の他の例示的実施形態を、表１Ａ中「好適な置換」という見出しの下に記載する。このような置換の結果、望ましくない性質となる場合、表１Ａで「例示的な置換」と命名したさらに実質的な変化、又はアミノ酸のクラスに関連して以下でさらに記載する様なものを導入して、生成物をスクリーンしてもよい。
【０１７１】
変異体は、置換型突然変異誘発によって生成させることができ、本発明のポリペプチドの生物活性を保持することが、当該技術分野では知られている。これらの変異体は、アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されている。たとえば、置換型突然変異誘発に関して興味深い１つの部位は、様々な種から得られる特定の残基が同一である部位を含み得る。「保存的置換」と特定される置換の例を表１Ａに示す。このような置換の結果、望ましくない変化が起こるならば、表１Ａで「例示的置換」と命名される他の種類の置換、又はアミノ酸のクラスに関連して本明細書でさらに記載するようなものを導入し、生成物をスクリーンしてもよい。
【０１７２】
機能又は免疫学的同一性における置換型修飾は、（ａ）置換部分でのポリペプチド骨格の構造、たとえばシートまたは螺旋状構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するそれらの影響が有意に異なる置換を選択することによって行う。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて次の群に分類される：
（１群）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Ｍｅｔ）、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）
（２群）中性親水性：システイン（Ｃｙｓ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）
（３群）酸性：アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）
（４群）塩基性：アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）
（５群）鎖の配向に影響を及ぼす残基：グリシン（Ｇｌｙ）、プロリン（Ｐｒｏ）；及び
（６群）芳香族：トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）
【０１７３】
非保存的置換は、これらの種類のメンバーを互いに交換する。
【０１７４】
【表４】
【０１７５】
変異体抗体又は抗原結合フラグメントのアミノ酸配列における変異は、アミノ酸付加、欠失、挿入、置換等、１以上のアミノ酸の骨格若しくは側鎖における１以上の修飾、又は１以上のアミノ酸（側鎖若しくは骨格）への1つの基若しくは別の分子の付加を包含する。
【０１７６】
変異体抗体又は抗原結合フラグメントは、もとの抗体又は抗原結合フラグメントアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列において実質的な配列類似性及び／又は配列同一性を有し得る。２つの配列間の類似性の程度は、同一性（同じアミノ酸）及び保存的置換のパーセンテージに基づく。
【０１７７】
一般的に、可変鎖間の類似性及び同一性の程度は、本発明では、Ｂｌａｓｔ２配列プログラム（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ（１９９９），“Ｂｌａｓｔ ２ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）を用い、デフォルト設定を用いて、すなわち、ｂｌａｓｔｐプログラム、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（オープンギャップ１１及びエクステンションギャップペナルティー１；ｇａｐｘドロップオフ５０、期待値１０．０、ワードサイズ３）及び活性化フィルターを用いて決定した。
【０１７８】
同一性（％）は、従ってもとのペプチドと比較して同一であり、同じか又は類似した位置を占め得るアミノ酸を表す。
【０１７９】
類似性（％）は、同一であり、もとのペプチドと比較して、同じか又は類似した位置にて保存的アミノ酸置換で置換されているアミノ酸を表す。
【０１８０】
本発明の変異体は、従って、もとの配列又はもとの配列の一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列同一性を有し得るものを含む。
【０１８１】
変異体の例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも８１％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％の配列類似性を有するものである。
【０１８２】
変異体の他の例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも８２％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％配列類似性を有するものである。
【０１８３】
変異体のさらなる例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも８５％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。
【０１８４】
変異体の他の例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。
【０１８５】
変異体のさらなる例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。
【０１８６】
変異体のさらなる例示的実施形態は、本明細書に記載する配列と少なくとも９７％の配列同一性を有し、もとの配列又はもとの配列の一部と９７％、９８％、９９％又は１００％の配列類似性を有するものである。
【０１８７】
簡潔にするために、本出願者は、本発明に含まれる個々の変異体の例示的実施形態を示し、特定の配列同一性（％）及び配列類似性（％）を含む表１Ｂを提示する。各「Ｘ」は、所与の変異体を示すと解釈される。
【０１８８】
【表５】
【０１８９】
本発明は、本明細書に記載する配列と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、重鎖、抗体及び／又は抗原結合フラグメントを含む。
【０１９０】
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントの例示的実施形態は、配列番号１６と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号２０と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号２４と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号１０５と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号１０９と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列及び配列番号１２６と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含むものである。
【０１９１】
これらの軽鎖可変領域は、配列番号２７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号２８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号２９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１９２】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２７と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０１９３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２７と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０１９４】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２８と少なくとも９０％同一であるＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０１９５】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２８と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０１９６】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２９と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１９７】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号２９と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１９８】
前記軽鎖可変領域は、配列番号３３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号３４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号３５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０１９９】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３３と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２００】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３３と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２０１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３４と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２０２】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３４と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２０３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３５と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２０４】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３５と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２０５】
前記軽鎖可変領域は、配列番号３９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号４０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号４１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２０６】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３９と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２０７】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３９と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２０８】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４０と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２０９】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも配列番号４０と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２１０】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４１と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２１１】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４１と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２１２】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１５８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１５９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１６０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２１３】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも配列番号１５８と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２１４】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１５８と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２１５】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１５９と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２１６】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１５９と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２１７】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６０と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２１８】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６０と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２１９】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１６４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１６５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１６６と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２２０】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６４と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２２１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６４と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２２２】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６５と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２２３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６５と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２２４】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６６と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２２５】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６６と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２２６】
前記軽鎖可変領域は、配列番号１７０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１７１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１７２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２２７】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７０と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２２８】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７０と１００％同一であり得るＣＤＲＬ１配列を含み得る。
【０２２９】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７１と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２３０】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７１と１００％同一であり得るＣＤＲＬ２配列を含み得る。
【０２３１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７２と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２３２】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７２と１００％同一であり得るＣＤＲＬ３配列を含み得る。
【０２３３】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１６のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１６のフレームワーク領域と比較して、２２までのアミノ酸修飾（たとえば保存的又は非保存的アミノ酸置換）をそのフレームワーク領域中に有する軽鎖可変領域を含む。配列番号１６変異体を配列番号１７８に示す。
【０２３４】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２０のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号２０のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２２までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する軽鎖可変領域を含む。
【０２３５】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２４のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号２４のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２１までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する軽鎖可変領域を含む。配列番号２４変異体を配列番号１８２に示す。
【０２３６】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１０５のＣＤＲアミノ酸と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１０５のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２２までのアミノ酸修飾（たとえば保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する、軽鎖可変領域を含む。
【０２３７】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１０９のＣＤＲアミノ酸と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１０９のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２２までのアミノ酸修飾（たとえば保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する、軽鎖可変領域を含む。
【０２３８】
変異体抗体軽鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１２６のＣＤＲアミノ酸と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１２６のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２１までのアミノ酸修飾（たとえば保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する、軽鎖可変領域を含む。
【０２３９】
数例において、変異体抗体軽鎖可変領域は、アミノ酸欠失又は付加（アミノ酸置換と組み合わせて、又はアミノ酸置換を含まない）を含み得る。多くの場合、１、２、３、４又は５のアミノ酸欠失又は付加が許容され得る。
【０２４０】
例示的一実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号１８と少なくとも８０％同一である配列、配列番号２２と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号２６と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号１３２と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列、配列番号１４５と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列及び配列番号１５３と少なくとも７０％、７５％、８０％同一である配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含み得る。
【０２４１】
これらの重鎖可変領域は、配列番号３０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号３１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号３２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２４２】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３０と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２４３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３０と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２４４】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３１と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２４５】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３１と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２４６】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３２と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２４７】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３２と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２４８】
前記重鎖可変領域は、配列番号３６と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号３７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号３８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２４９】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３６と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２５０】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３６と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２５１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３７と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２５２】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３７と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２５３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３８と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２５４】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号３８と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２５５】
前記重鎖可変領域は、配列番号４２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号４３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列、及び配列番号４４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２５６】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４２と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２５７】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４２と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２５８】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４３と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２５９】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４３と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２６０】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４４と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２６１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号４４と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２６２】
前記重鎖可変領域は、配列番号１６１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１６２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号１６３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２６３】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６１と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２６４】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６１と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２６５】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６２と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２６６】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６２と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２６７】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６３と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２６８】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６３と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２６９】
前記重鎖可変領域は、配列番号１６７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１６８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号１６９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２７０】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６６と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２７１】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６６と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２７２】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６８と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２７３】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６８と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２７４】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６９と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２７５】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１６９と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２７６】
前記重鎖可変領域は、配列番号１７３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１７４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号１７５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２７７】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７３と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２７８】
本発明の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７３と１００％同一であり得るＣＤＲＨ１配列を含み得る。
【０２７９】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７４と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２８０】
本発明のさらなる例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７４と１００％同一であり得るＣＤＲＨ２配列を含み得る。
【０２８１】
本発明の別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７５と少なくとも９０％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２８２】
本発明のさらに別の例示的実施形態において、本明細書に記載する抗体はいずれも、配列番号１７５と１００％同一であり得るＣＤＲＨ３配列を含み得る。
【０２８３】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１８のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１８のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２２までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。配列番号１８変異体を配列番号１７９に示す。
【０２８４】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２２のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号２２のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域において２３までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。
【０２８５】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号２６のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号２６のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域中で２３までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。配列番号２６変異体を配列番号１８３に示す。
【０２８６】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１３２のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１３２のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域中で２３までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。
【０２８７】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１５３のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１５３のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域中で２３までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。
【０２８８】
変異体抗体重鎖可変領域の例示的実施形態は、配列番号１４５のＣＤＲアミノ酸配列と１００％同一であるＣＤＲアミノ酸配列を有し、配列番号１４５のフレームワーク領域と比較して、そのフレームワーク領域中で２２までのアミノ酸修飾（たとえば、保存的又は非保存的アミノ酸置換）を有する重鎖可変領域を含む。
【０２８９】
数例において、変異体抗体重鎖可変領域は、アミノ酸欠失又は付加（アミノ酸置換と組み合わせて、又はアミノ酸置換を含まない）を含み得る。多くの場合、１、２、３、４若しくは５のアミノ酸欠失又は付加が許容される。
【０２９０】
細胞における抗体の産生
本明細書で開示するＫＡＡＧ１抗体は、ハイブリドーマ法又は組換えＤＮＡ法などの当業者に周知の様々な方法によって作製することができる。
【０２９１】
本発明の例示的実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体は、通常のハイブリドーマによって産生することができ、この場合、マウスを抗原で免疫化し、脾臓細胞を単離し、ＨＧＰＲＴ発現が欠失した骨髄種細胞と融合させ、ハイブリッド細胞をヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミン（ＨＡＴ）含有培地によって選択する。
【０２９２】
本発明のさらなる例示的実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体を組換えＤＮＡ法によって産生することができる。
【０２９３】
抗ＫＡＡＧ１抗体を発現するために、本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つなどをコード化できるヌクレオチド配列を、発現ベクター、すなわち特定の宿主において挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳制御のためのエレメントを含むベクター中に挿入することができる。これらのエレメントには、調節配列、たとえばエンハンサー、構成及び誘導性プロモータ、並びに５’及び３’未翻訳領域が含まれる。当業者に周知の方法を用いて、かかる発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが挙げられる。
【０２９４】
当業者に公知の様々な発現ベクター／宿主細胞系を用いて、本明細書に記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列由来のポリペプチド又はＲＮＡを発現することができる。これらとしては、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミッドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；バクロウイルスベクターに感染した昆虫細胞系；ウイルス若しくは細菌発現ベクターで形質転換された植物細胞系；又は動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されるものではない。哺乳動物系における組換えタンパク質の長期産生のために、細胞系における安定な発現を実施することができる。たとえば、本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を、同じか又は別のベクター上にウイルス性複製起点及び／又は内因性発現エレメント並びに選択又は可視マーカーを含み得る発現ベクターを用いて細胞系中に形質転換することができる。本発明は、用いられるベクター又は宿主細胞によって限定されない。本発明のある実施形態において、本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列をそれぞれ別の発現ベクター中に結合することができ、各鎖を別に発現させることができる。別の実施形態において、本明細書に記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できる軽及び重鎖の両方を１つの発現ベクター中に結合し、同時に発現させることができる。
【０２９５】
あるいは、ＲＮＡ及び／又はポリペプチドを、インビトロ転写系又はカップリングしたインビトロ転写／翻訳系をそれぞれ使用して、本明細書に記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含むベクターから発現させることができる。
【０２９６】
一般的に、本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含有し、及び／又は本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列によってコード化されるポリペプチドを発現する宿主細胞、又はその一部は、当業者に公知の様々な手順によって同定することができる。これらの手順としては、ＤＮＡ／ＤＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ増幅、及び核酸若しくはアミノ酸配列の検出及び／又は定量化のための膜、溶液、又はチップに基づく技術を包含するタンパク質生物検定又は免疫測定技術が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特異的ポリクローナル又はモノクローナル抗体のいずれかを用いたポリペプチドの発現を検出及び測定するための免疫学的方法は、当該技術分野で公知である。このような技術の例としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定（ＲＩＡ）、及び蛍光表示式細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。当業者らは、本発明にこれらの方法を容易に適合させることができる。
【０２９７】
本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、このように対応するＲＮＡ（ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなど）の転写及び／又は細胞培養物からのポリペプチドの発現のための条件下で培養することができる。細胞によって産生されたポリペプチドを、使用される配列及び／又はベクターに応じて分泌させることができるか、又は細胞内に保持することができる。例示的一実施形態において、本明細書に記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、原核又は真核細胞膜を通ってポリペプチドの分泌させるシグナル配列を含むように設計することができる。
【０２９８】
遺伝子コード特有の縮重のために、同じであるか又は実質的に同じであるか、又は機能的に等価なアミノ酸配列をコード化する他のＤＮＡ配列を産生し、たとえば本明細書で記載する軽及び重イムノグロブリン鎖のいずれか１つをコード化できるヌクレオチド配列によってコード化されるポリペプチドを発現するために使用することができる。本発明のヌクレオチド配列を、様々な目的、たとえばこれらに限定されるものではないが、遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、及び／又は発現のためにヌクレオチドを改変するために、当該技術分野で一般的に知られている方法を用いて操作することができる。遺伝子フラグメント及び合成オリゴヌクレオチドのランダムフラグメンテーション及びＰＣＲ再構築によるＤＮＡシャッフリングを用いてヌクレオチド配列を操作することができる。たとえば、オリゴヌクレオチド媒介性部位特異的突然変異誘発を用いて、新しい制限部位の作製、グリコシル化パターンの改変し、コドン優先性の変更、スプライス変異体の産生などの突然変異を導入することができる。
【０２９９】
加えて、宿主細胞株を、所望の方法で挿入された配列の発現を調節するか、又は発現されたポリペプチドを処理するその能力に関して選択することができる。ポリペプチドのこのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化が挙げられるが、これらに限定されるものではない。例示的一実施形態において、特定のグリコシル化構造又はパターンを含む抗ＫＡＡＧ１抗体が望ましい場合がある。ポリペプチドの「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセッシングは、タンパク質ターゲティング、フォールディング、及び／又は活性を規定するためにも使用できる。特異的細胞機構及び翻訳後活性に特徴的な機構を有する様々な宿主細胞（たとえば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、及びＷ１３８）が市販され、またアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能であり、発現されたポリペプチドの正しい修飾及びプロセッシングを確実にするために選択することができる。
【０３００】
当業者らは、天然、修飾、又は組換え核酸配列を異種配列と結合させて、その結果、前記宿主系のいずれかにおいて異種ポリペプチド部分を含む融合ポリペプチドの翻訳が得られることを容易に理解するであろう。このような異種ポリペプチド部分は、市販の親和性マトリックスを用いて融合ポリペプチドの精製を促進することができる。このような部分としては、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド、６−Ｈｉｓ（Ｈｉｓ）、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、及び抗体エピトープ、たとえばモノクローナル抗体エピトープが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３０１】
さらに別の態様において、本発明は、融合タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含み得るポリヌクレオチドに関する。融合タンパク質は、本明細書に記載するポリペプチド（たとえば、完全軽鎖、完全重鎖、可変領域、ＣＤＲなど）と融合する融合パートナー（たとえば、ＨＡ、Ｆｃなど）を含み得る。
【０３０２】
当業者らは、当該技術分野で周知の化学的または酵素的方法を用いて、全体としてまたは部分的に核酸及びポリペプチド配列を合成することができることも容易に理解するであろう。たとえば、ペプチド合成は、様々な固相技術及びＡＢＩ４３１などの機械を用いて実施することができる。ペプチド合成器（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成を自動化することができる。所望により、アミノ酸配列を合成中に改変及び／又は他のタンパク質由来の配列と組み合わせて、変異体タンパク質を産生することができる。
【０３０３】
抗体複合体
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを、検出可能な部分（すなわち、検出若しくは診断目的）又は治療部分（治療目的）と結合させることができる。
【０３０４】
「検出可能な部分」は、分光学、光化学、生化学、免疫化学、化学及び／又は他の物理的手段によって検出可能な部分である。検出可能な部分を直接的及び／又は間接的のいずれかで（たとえば、これらに限定されるものではないが、ＤＯＴＡ又はＮＨＳ結合などの結合を介して）、当該技術分野で周知の方法を用いて本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントとカップリングさせることができる。様々な検出可能な部分を用いることができ、その選択は、必要とされる感度、結合の容易さ、安定性要件及び利用可能な器具に依存する。好適な検出可能な部分としては、これらに限定されるものではないが、蛍光標識、放射性標識（たとえば、これらに限定されないが、１２５Ｉ、Ｉｎ１１１、Ｔｃ９９、Ｉ１３１、ＰＥＴスキャナー用陽電子放出同位体等を包含する）、核磁気共鳴活性標識、発光標識、化学発光標識、発色団標識、酵素標識（たとえば、これらに限定されるものではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等）、量子ドット及び／又はナノ粒子が挙げられる。検出可能な部分は、検出可能なシグナルを誘発及び／又は産生することができ、これによって検出可能な部分からのシグナルを検出することが可能になる。
【０３０５】
本発明の別の例示的実施形態において、抗体又はその抗原結合フラグメントを治療部分（たとえば、薬剤、細胞傷害性部分）とカップリング（修飾）することができる。
【０３０６】
例示的一実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体及び抗原結合フラグメントは、化学療法剤又は細胞傷害性剤を含んでもよい。たとえば、抗体及び抗原結合フラグメントは、化学療法剤又は細胞傷害性剤と結合させることができる。化学療法剤又は細胞傷害性剤としては、イットリウム９０、スカンジウム４７、レニウム１８６、ヨウ素１３１、ヨウ素１２５、及び当業者により認められる多くの他のもの（たとえば、ルテチウム（たとえば、Ｌｕ１７７）、ビスマス（たとえば、Ｂｉ２１３）、銅（たとえば、Ｃｕ６７））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の例では、化学療法剤又は細胞傷害性剤は、当業者に公知のもののなかでも、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、イリノテカン、タキサン、シュードモナス・エンドトキシン、リシン及び他の毒素から構成され得る。
【０３０７】
あるいは、本発明の方法を実施するために、そして当該技術分野で公知のように、本発明の抗体又は抗原結合フラグメント（共役又は非共役）を、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントと特異的に結合することができ、所望の検出可能な部分、診断部分又は治療部分を有し得る第２の分子（たとえば二次抗体など）と併用することができる。
【０３０８】
抗体の医薬組成物及びそれらの使用
抗ＫＡＡＧ１抗体（共役又は非共役）の医薬組成物も本発明に含まれる。医薬組成物は、抗ＫＡＡＧ１抗体又は抗原結合フラグメントを含んでもよく、また薬剤的に許容される担体も含んでもよい。
【０３０９】
本発明の他の態様は、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメント及び担体を含み得る組成物に関する。
【０３１０】
本発明はまた、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメント及び薬剤的に許容される担体を含み得る医薬組成物にも関する。
【０３１１】
本発明のさらに別の態様は、本明細書に記載する単離された抗体又は抗原結合フラグメントの、卵巣癌の治療または診断における使用に関する。
【０３１２】
活性成分に加えて、医薬組成物は、水、ＰＢＳ、塩溶液、ゼラチン、油、アルコール、並びに活性化合物を薬剤的に使用できる製剤に加工するのを容易にする他の賦形剤及び助剤を含む薬剤的に許容される担体を含んでもよい。他の例では、このような製剤は滅菌してもよい。
【０３１３】
本明細書で用いられる場合、「医薬組成物」とは、薬剤的に許容される希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体とあわせた治療有効量の薬剤を意味する。「治療有効量」とは、本明細書で用いられる場合、所与の状態及び投与レジメンに関して治療効果をもたらす量を意味する。このような組成物は、液体であるか又は凍結乾燥若しくは他の方法で乾燥された配合物であり、様々な緩衝液内容物（たとえば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ及びイオン強度の希釈剤、表面への吸収を防ぐためのアルブミン又はゼラチンなどの添加剤、界面活性剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ ２０、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８、胆汁酸塩）を含む。可溶化剤（たとえば、グリセロール、ポリエチレングリセロール）、酸化防止剤（たとえば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（たとえば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、増量物質又は等張性改良剤（たとえば、ラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールなどのポリマーのタンパク質に対する共有結合、金属イオンとの錯体形成、又はポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲルなどのポリマー化合物の粒子状調製物中若しくは上、或いはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層若しくは多重層ベシクル、赤血球ゴースト、又はスフェロプラスト上への物質の組み入れを含む。このような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、及びインビボクリアランス速度に影響を及ぼす。制御放出又は持続放出組成物には、親油性デポー（たとえば、脂肪酸、ワックス、油）中の配合物が含まれる。ポリマー（たとえば、ポロキサマー又はポロキサミン）でコーティングされた粒子状組成物も本発明に含まれる。本発明の組成物の他の実施形態は、粒子状形態保護コーティング、プロテアーゼ阻害物質又は非経口、肺、鼻、経口、膣、直腸経路をはじめとする様々な投与経路用の透過促進剤を組み入れる。一実施形態において、医薬組成物は、非経口、癌近傍（ｐａｒａｃａｎｃｅｒａｌｌｙ）、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内及び腫瘍内投与される。
【０３１４】
さらに、本明細書で用いられる場合、「薬剤的に許容される担体」又は「医薬担体」は、当該技術分野で公知であり、０．０１〜０．１Ｍ若しくは０．０５Ｍリン酸塩緩衝液又は０．８％塩溶液が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、このような薬剤的に許容される担体は、水性若しくは非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンであってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液（塩溶液及び緩衝媒体を含む）が挙げられる。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液又は固定油が挙げられる。静脈内ビヒクルには、流体及び栄養補給薬、電解質補充薬、たとえばリンガーデキストロース系のものなどが含まれる。保存料及び他の添加剤、たとえば抗菌剤、酸化防止剤、照合剤（ｃｏｌｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、不活性ガスなども存在し得る。
【０３１５】
任意の化合物に関して、治療有効量は、細胞培養試験又はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、若しくはブタなどの動物モデルのいずれかで推定することができる。動物モデルは、濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用いることができる。このような情報を次に、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定するために用いることができる。これらの技術は当業者には周知であり、治療有効量とは、症状又は状態を改善する活性成分の量を意味する。治療効果及び毒性は、細胞培養において又は実験動物を用いて標準的薬剤的手順によって、たとえばＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）統計を計算し、対比することによって決定することができる。本明細書に記載する治療組成物のいずれも、かかる治療を必要とする任意の対象、たとえばこれらに限定されるものではないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及びヒトなどの哺乳動物に適用することができる。
【０３１６】
本発明において用いられる医薬組成物は、これらに限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、経腸、局所、舌下、又は直腸手段をはじめとする任意の数の経路によって投与することができる。
【０３１７】
「治療」という用語は、本開示に関しては、治療と予防又は防止的処置の両方を意味し、この場合、目的は標的とされる病状又は疾患を予防若しくは減速（軽減）させることである。治療を必要とする者としては、すでに疾患にかかっている者並びに疾患に罹りやすい者又は障害を予防しなければならない者が挙げられる。
【０３１８】
抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメントは、卵巣癌、腎臓癌、結腸癌、肺癌、黒色腫などの様々な癌型の治療において治療的に使用することができる。例示的一実施形態において、抗体及びフラグメントは、卵巣癌において治療に使用される。ある例においては、抗ＫＡＡＧ１抗体及びフラグメントは、ＫＡＡＧ１を発現する癌細胞と相互作用して、ＡＤＣＣを媒介することによって免疫学的反応を誘発することができる。他の例では、抗ＫＡＡＧ１抗体及びフラグメントは、ＫＡＡＧ１とそのタンパク質パートナーとの相互作用をブロックすることができる。
【０３１９】
抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメントは、様々な種類の卵巣癌の治療において治療的に使用することができる。いくつかの異なる細胞型は異なる卵巣癌組織型（ｈｉｓｔｏｔｙｐｅ）を生じさせる可能性がある。卵巣癌の最も一般的な形態は、卵巣又は卵管の上皮細胞層に由来する腫瘍からなる。このような上皮卵巣癌としては、漿液性腫瘍、類内膜腫瘍、粘液性腫瘍、明細胞腫瘍、及び境界型腫瘍が挙げられる。他の実施形態において、抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメントは、生殖系及び性索卵巣癌などの他の種類の卵巣癌の治療において用いられる。
【０３２０】
ある例では、抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメントを、同じ状態に対して施される他の治療と併用して同時に投与することができる。したがって、抗体を、抗有糸分裂剤（たとえば、タキサン）、白金系薬剤（たとえば、シスプラチン）、ＤＮＡ損傷剤（たとえば、ドキソルビシン）及び当業者に公知の他の抗癌治療薬とともに投与することができる。他の例では、抗ＫＡＡＧ１抗体及びその抗原結合フラグメントを他の治療抗体とともに投与することができる。これらとしては、ＥＧＦＲ、ＣＤ−２０、及びＨｅｒ２を標的とする抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０３２１】
本発明は、さらなる態様において、ＫＡＡＧ１発現細胞の成長を阻害する方法に関し、この方法は、当該細胞を有効量の本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントと接触させることを含み得る。
【０３２２】
本発明は、哺乳動物において癌を治療するか、又はＫＡＡＧ１発現細胞の成長を阻害する方法も包含し、この方法は、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントを、必要とする哺乳動物に投与することを含む。
【０３２３】
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを用いた治療法、診断法及び検出法、並びにかかる目的のための医薬組成物若しくは薬剤の製造におけるこれらの抗体又は抗原結合フラグメントの使用を提供する。
【０３２４】
本発明に含まれる治療法は、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントを、必要とする哺乳動物、特に癌に罹っているか若しくは癌に罹っている疑いのある患者に投与することを含む。
【０３２５】
本発明はまた、さらなる態様において、腫瘍の拡大、腫瘍浸潤、腫瘍形成を軽減するか、又は腫瘍溶解を誘発する方法も提供し、この方法は、単離された抗体又は抗原結合フラグメントを、必要とする哺乳動物に投与することを含み得る。
【０３２６】
本発明は、従って、癌の治療、腫瘍の拡大、腫瘍浸潤、腫瘍形成の軽減又はＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の腫瘍溶解（の誘発のための医薬組成物の製造）における、本明細書に記載する単離された抗体の使用に関する。
【０３２７】
抗体又は抗原結合フラグメントは、さらに詳細には、たとえば転移する能力を有する悪性腫瘍及び／又はアンカレッジ依存性成長を特徴とする腫瘍細胞をはじめとする悪性腫瘍に適用可能である。本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、癌の診断においても使用することができる。癌の診断は、癌に罹っているか若しくは癌に罹っている疑いがある哺乳動物に対して本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを投与することによってインビボで実施することができる。診断は、哺乳動物から得た試料を抗体又は抗原結合フラグメントと接触させ、ＫＡＡＧ１を発現する細胞（腫瘍細胞）の有無を判断することによって、エクスビボで実施することもできる。
【０３２８】
本発明は、哺乳動物において癌を検出するか又はＫＡＡＧ１発現細胞を検出する方法も包含し、この方法は、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントを、必要とする哺乳動物に投与することを含み得る。
【０３２９】
本発明は、その別の態様において、ＫＡＡＧ１発現細胞を検出する方法に関し、この方法は、細胞を本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントと接触させ、抗体及びＫＡＡＧ１発現細胞によって形成される複合体を検出することを含み得る。検出法で使用される抗体又は抗原結合フラグメントの例示的実施形態は、ＫＡＡＧ１の細胞外領域と結合できるものである。
【０３３０】
検出法で使用される抗体又は抗原結合フラグメントの他の例示的実施形態は、腫瘍細胞の表面で発現されるＫＡＡＧ１と結合するものである。
【０３３１】
本明細書で記載する治療、検出又は診断法から恩恵を受ける患者は、卵巣癌（たとえば、漿液性、類内膜、明細胞若しくは粘液性）、皮膚癌（たとえば、黒色腫、扁平上皮細胞癌）、腎臓癌（たとえば、乳頭細胞癌、明細胞癌）、結腸直腸癌（たとえば、結腸直腸癌腫）、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌（たとえば、乳房癌）、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｅ ｃａｎｃｅｒ）（たとえば、前立腺癌（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ））、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍（たとえば、肺癌）又は頭頸部腫瘍に罹っているか若しくは罹っている疑いのある患者であり、特に癌が悪性であることを特徴とする場合及び／又はＫＡＡＧ１発現細胞がアンカレッジ依存性成長を特徴とする場合である。
【０３３２】
本発明に特に含まれるのは、卵巣癌（たとえば、漿液性、類内膜、明細胞若しくは粘液性）、皮膚癌（たとえば、黒色腫、扁平上皮細胞癌）又は腎臓癌（たとえば、乳頭細胞癌）に罹っているか若しくは罹っている疑いがある患者であり、特に癌が悪性であることを特徴とする場合及び／又はＫＡＡＧ１発現細胞がアンカレッジ依存性成長を特徴とする場合である。
【０３３３】
本発明の別の態様は、ＫＡＡＧ１（配列番号２）、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＫＡＡＧ１変異体又はＫＡＡＧ１若しくはＫＡＡＧ１変異体の分泌形態若しくは循環形態を検出する方法に関し、この方法は、ＫＡＡＧ１若しくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞又はＫＡＡＧ１若しくはＫＡＡＧ１変異体を含むか若しくは含むことが疑われる試料（生検、血清、血漿、尿など）を、本明細書に記載する抗体又は抗原結合フラグメントと接触させ、結合を測定することを含み得る。試料は、癌（たとえば、卵巣癌）に罹っているか、又は癌（たとえば、卵巣癌）に罹っていることが疑われる哺乳動物（たとえば、ヒト）由来であり得る。試料は、哺乳動物から得られる組織試料又は細胞培養物上清であり得る。
【０３３４】
本発明によれば、試料は、哺乳動物から得られる血清試料、血漿試料、血液試料又は腹水であってよい。本明細書で記載する抗体又は抗原結合フラグメントは、有利には、ＫＡＡＧ１の分泌又は循環形態（血液中を循環）を検出することができる。
【０３３５】
当該方法は、ＫＡＡＧ１又はＫＡＡＧ１変異体と結合する抗体又は抗原結合フラグメントによって形成される複合体を定量化することを含み得る。
【０３３６】
抗体の抗原との結合は、抗原の予想される分子量を増大させる。従って、抗体又は抗原結合フラグメントと抗原との特異的結合によって物理的変化が起こる。
【０３３７】
このような変化は、たとえば電気泳動とそれに続くウェスタンブロット及びゲル又はブロットの着色、質量分析法、コンピュータとカップリングさせたＨＰＬＣなどを用いて検出することができる。分子量におけるシフトを計算できる他の装置は当該技術分野で公知であり、たとえば、Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（商標）が挙げられる。
【０３３８】
抗体がたとえば検出可能な標識を含む場合、抗原−抗体複合体は、標識によって放出される蛍光、標識の放射線放出、その基質を用いて得られる標識の酵素活性などにより検出することができる。
【０３３９】
抗体又は抗原結合フラグメントと抗原との間の結合の検出及び／又は測定は、当該技術分野で公知の様々な方法によって実施することができる。抗体又は抗原結合フラグメントと抗原との間の結合は、検出可能な標識によって放出されるシグナル（放射線放出、蛍光、変色など）を検出できる装置を用いてモニタリングすることができる。このような装置は、生じた際に結合を示すデータを提供し、抗原に結合した抗体の量に関する表示も提供し得る。装置（通常、コンピュータとカップリングしたもの）は、バックグラウンドシグナル（たとえば、抗原−抗体結合の非存在下で得られるシグナル）又はバックグラウンドノイズと特異的抗体−抗原結合によって得られるシグナルとの差を計算することもできる。このような装置は、従って、抗原が検出されたかどうかに関する表示及び結論を使用者に提供する。
【０３４０】
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載する１以上の抗体又は抗原結合フラグメントを含む１以上の容器を含み得るキットに関する。
【０３４１】
核酸、ベクター及び細胞
抗体は、通常、細胞中で作製され、軽鎖及び重鎖をコード化する核酸配列を含む（１つ若しくは複数の）ベクターから発現される軽鎖及び重鎖の発現を可能にする。
【０３４２】
本発明はしたがって、本明細書に記載するＣＤＲ、軽鎖可変領域、重鎖可変領域、軽鎖、重鎖のいずれかをコード化することができる核酸を含む。
【０３４３】
本発明はしたがって、さらなる態様において、ＫＡＡＧ１と特異的に結合できる抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコード化する核酸に関する。
【０３４４】
本発明の実施形態によれば、核酸は、特に、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の死滅（除去、破壊、溶解）を誘発することができる抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコード化することができる。
【０３４５】
本発明の別の実施形態によれば、核酸は、特に、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の拡大を軽減することができる抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコード化することができる。
【０３４６】
本発明のさらに別の実施形態によれば、核酸は、特に、ＫＡＡＧ１発現腫瘍の形成を減少又は損なうことができる抗体の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域をコード化することができる。
【０３４７】
本発明の核酸の例示的実施形態は：
（ａ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列；
（ｂ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列、又は；
（ｃ）配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列
を含む軽鎖可変領域をコード化する核酸を含む。
【０３４８】
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る軽鎖可変領域をコード化することができる。
【０３４９】
また、本発明によれば、核酸は、１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含み得る軽鎖可変領域をコード化することができる。
【０３５０】
本発明はまた：
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、又は、
（ｃ）配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
を含む重鎖可変領域をコード化する核酸にも関する。
【０３５１】
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３の少なくとも２つのＣＤＲを含み得る重鎖可変領域をコード化することができる。
【０３５２】
本発明によれば、核酸は、１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含み得る重鎖可変領域をコード化することができる。
【０３５３】
少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する抗体変異体をコード化する核酸も本発明に含まれる。
【０３５４】
本発明によれば、核酸は、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３５５】
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲのうちの少なくとも２つにおいて少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３５６】
本発明によれば、核酸は、３つのＣＤＲにおいて少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３５７】
本発明によれば、核酸は、ＣＤＲの少なくとも１つにおいて少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３５８】
本発明によれば、核酸はＣＤＲの少なくとも２つにおいて少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３５９】
本発明によれば、核酸は３つのＣＤＲにおいて少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化することができる。
【０３６０】
本発明の他の態様は、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域をコード化する核酸に関する。
【０３６１】
本発明のさらに別の態様は、配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７からなる群から選択される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域をコード化する核酸に関する。本発明の他の態様は、配列番号１、配列番号１の１０〜８８４ヌクレオチドのフラグメント及び前記のいずれかの補体からなる群から選択される核酸の、ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞の移動又は生存を損なうための使用に関する。かかる核酸の例示的実施形態は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイムなどを含む。
【０３６２】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書で記載する核酸を含むベクターに関する。
【０３６３】
本発明によれば、ベクターは発現ベクターであってよい。
【０３６４】
特定の宿主における挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳制御のためのエレメントを含むベクターは、当該技術分野で公知である。これらのエレメントには、調節配列、たとえばエンハンサー、構成及び誘導性プロモータ、並びに５’及び３’未翻訳領域が含まれる。当業者に周知の方法を用いて、このような発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝子組換えが挙げられる。
【０３６５】
別の態様において、本発明は本明細書に記載する核酸を含み得る単離された細胞に関する。
【０３６６】
単離された細胞は、軽鎖可変領域をコード化する核酸及び重鎖可変領域をコード化する核酸を別個のベクター上又は同じベクター上のいずれかで含み得る。単離された細胞は、別のベクター上又は同じベクター上のいずれかで軽鎖をコード化する核酸及び重鎖をコード化する核酸も含み得る。
【０３６７】
本発明によれば、細胞は、抗体又はその抗原結合フラグメントを発現、構築及び／又は分泌することができる。
【０３６８】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載する抗体を含有及び／又は発現し得る細胞を提供する。
【０３６９】
本発明によれば、細胞は軽鎖可変領域をコード化する核酸及び重鎖可変領域をコード化する核酸を含み得る。
【０３７０】
細胞は、抗体又はその抗原結合フラグメントを発現、構築及び／又は分泌することができる。
【０３７１】
以下の実施例で本発明の詳細の概要を記載する。
【実施例】
【０３７２】
実施例１
この実施例は、卵巣腫瘍及び卵巣癌細胞系におけるＫＡＡＧ１遺伝子の発現パターンを記載する。
【０３７３】
ＰＣＲ分析を実施して、ＫＡＡＧ１をコード化するｍＲＮＡを発現する卵巣腫瘍（図中ＡＢ−０４４７として表示）のパーセンテージを検証した。結果から、ＫＡＡＧ１遺伝子が、疾患のあらゆる段階からの卵巣腫瘍の８５％超及び末期の腫瘍の１００％において発現されることがわかった。ＫＡＡＧ１の発現は、ＬＭＰ試料においては検出可能性が低いか又は検出不能である（図１Ａを参照）。各試料に関して、１μｇの増幅されたＲＮＡを、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてランダムヘキサマーで逆転写した。ｃＤＮＡを希釈し、反応の１／２００を、示されるように遺伝子特異的プライマーとの各ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡを増幅するために使用したプライマーは、配列番号４５及び４６に示す配列を含んでいた。ＰＣＲ反応を９６穴プレート中で実施し、２５μｌの反応物の半分を１％アガロースゲル上で電気泳動した。ゲルを可視化し、ゲル・ドキュメンテーション・システム（ＢｉｏＲａｄ）を用いて写真撮影した。図１Ａの上側のパネルは、６のＬＭＰ試料（ＬＭＰ）及び２２の卵巣腫瘍及び６の卵巣細胞系（右の最後の６レーン、ＯＶＣａ）試料からの結果を示す。図１の下側のパネルは、示されるように試験した３０の正常組織からのＲＮＡ試料を示す。
【０３７４】
ＫＡＡＧ１発現は、少数の正常な組織において弱く検出され、一方、ｍＲＮＡは卵管及び膵臓において明らかであった（図１Ａを参照）。これらの反応で使用した全ＲＮＡの量を、ハウスキーピング遺伝子であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の平行ＰＣＲ増幅を用いて制御し、結果から、各試料中に等価な出発物質が存在することがわかった（図１Ａを参照）。ＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するために使用したプライマーは、配列番号４７及び４８に示す配列を含んでいた。従って、ＫＡＡＧ１遺伝子の発現は、卵巣腫瘍の大部分で過剰発現され、その発現は、ほとんどの正常な組織で低いかまたは存在しないという重要な選択基準を満たす。これらのデータは、卵巣腫瘍がＫＡＡＧ１に対する高親和性モノクローナル抗体を用いて特異的に標的とされ得ることを示唆する。
【０３７５】
早期癌又は腫瘍は、高分化状態にある細胞で構成される傾向があるが、腫瘍はさらに悪性かつ侵襲的状態に進行するにつれ、癌細胞は次第に未分化状態になる。この遷移に貢献する因子を同定し、治療薬を開発するための標的としてこれらのタンパク質を活用する必要がある。原発腫瘍から誘導されたいくつかの卵巣癌細胞系が利用可能であり、機能研究の優れたモデルとしての働きをする。ＫＡＡＧ１の発現をこれらの細胞系において調べた。ＴＯＶ−２１Ｇ、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＴＯＶ−１９４６、及びＴＯＶ−２２２３Ｇと称する４つの系が原発腫瘍から確立され、一方、ＯＶ−９０及びＯＶ−１９４６は、進行した卵巣癌患者の腹水中に含まれる細胞由来の細胞系である。原発腫瘍から確立された細胞由来の全ＲＮＡ（図１Ｂにおいて、レーン１、ＴＯＶ−２１Ｇ；２、ＴＯＶ−１１２Ｄ；５、ＴＯＶ−１９４６；６、ＴＯＶ−２２２３Ｇを参照）及び腹水細胞から確立された細胞（レーン３、ＯＶ−９０；４、ＯＶ−１９４６）を、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに変え、ＫＡＡＧ１特異的プライマー（配列番号４５及び４６）を用いたＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用した。負の対照として、正常な卵巣からの全ＲＮＡを用いて反応を実施した。ＧＡＰＤＨ（配列番号４７及び４８）を用いた平行ＰＣＲ反応により明らかなように等量の出発物質が使用された。ＰＣＲ反応の試料をアガロースゲル上で電気泳動させ、エチジウムブロミドで可視化した。図１Ｂで示すように、ＫＡＡＧ１は検出可能であったが、原発腫瘍由来の細胞系においては弱く発現され、多数サイクルで実施したＰＣＲ反応によって、これらの４つの細胞系全てにおいてＫＡＡＧ１転写物が示された。反対に、腹水細胞から確立された両細胞系は、高レベルのＫＡＡＧ１転写物を示した。腹水由来の細胞における増大した発現は、細胞の環境がＫＡＡＧ１遺伝子の調節に影響を及ぼすことを示唆する。
【０３７６】
腹水細胞は進行した疾患に関連し、図１Ｂで開示される発現のパターンは、増大したＫＡＡＧ１レベルがアンカレッジ依存性成長と関連することを意味する。細胞が単層として成長する場合と同様に、細胞がペトリ皿に付着するのを防止する状態である懸滴において細胞を培養することによってこの問題に取り組んだ。これらのいわゆる三次元培養によって、細胞が結合することができ、スフェロイドの形成が観察される（図１Ｃを参照）。スフェロイドを次のように培養した：ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＯＶ−９０、又はＴＯＶ−２１Ｇ細胞（１５μｌ中４０００）を４日間培地中、５％ＦＢＳの非存在下（左パネル、図１Ｃ）若しくは５％ＦＢＳの存在下（右パネル、図１Ｃ、＋５％血清）でインキュベートした。画像の倍率を１００×に設定した。これらのスフェロイドは広く特徴づけられており、マイクロアレイに基づく発現プロファイリングによって測定される形態学的及び機能的特性並びに分子署名をはじめとする、原発腫瘍において見いだされる特性の多くを示す。
【０３７７】
全ＲＮＡをスフェロイド調製物から単離し、図１Ａに関して記載するようにＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＴＯＶ−２１Ｇ、ＴＯＶ−１１２Ｄ、ＯＶ−９０細胞を、スフェロイドを産生する条件下で図１Ｃの説明文で記載するように播種した。４日後、全ＲＮＡを単離し、ＫＡＡＧ１特異的プライマー（配列番号４５及び４６）を用いたＲＴ−ＰＣＲ反応を実施するために使用した。ＰＣＲ反応をアガロースゲル上で電気泳動にかけた。ＧＡＰＤＨ（配列番号４７及び４８）を増幅するための平行反応の実施により、等量の出発物質が各試料中に存在することが示された。次の頭文字を図１Ｄで使用する。Ｃｅ．：単層として成長した細胞、Ｓｐｈ．：スフェロイドとして成長した細胞。特に、ＴＯＶ−２１Ｇ及びＴＯＶ−１１２Ｄがスフェロイドとして成長した場合にＫＡＡＧ１発現が上方調節された（図１Ｄを参照）。ＯＶ−９０細胞の場合、ＫＡＡＧ１遺伝子の発現レベルは変わらず、非常に高いままであった。おそらく、ＯＶ−９０細胞及びＯＶ−１９４６細胞（図１Ａを参照）により例示されるような腹水由来の細胞系で達成される発現レベルは最大に達した。
【０３７８】
これらの結果は、腹水由来の細胞系で高い発現を示す先のデータと相関し、ＫＡＡＧ１の発現が、癌細胞の微環境によって影響を受けることを裏付ける。さらに、スフェロイドで観察されたＫＡＡＧ１転写の上方調節は、悪性卵巣癌では高レベルのＫＡＡＧ１が存在することを意味する。
【０３７９】
実施例２
この実施例は、卵巣癌細胞の生存におけるＫＡＡＧ１の重要な役割を示唆するインビトロ結果を説明する。
【０３８０】
ＫＡＡＧ１発現が卵巣癌細胞において調節されることが示されたので、これらの細胞におけるこの遺伝子の機能を調べた。この課題に取り組むために、インビトロ分析を実施して、このタンパク質が癌細胞増殖、移動、及び／又は生存に関与するかどうかを究明した。ＲＮＡｉを使用して、ＴＯＶ−２１Ｇ卵巣癌細胞系における内因性ＫＡＡＧ１遺伝子の発現をノックダウンした。２つの独立したショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）配列の設計は、当業者が無料で利用可能なウェブベースのソフトウェア（例えばＱｉａｇｅｎ）を用いて実施した。これらの選択された配列（通常は１９−ｍｅｒ）を、ｓｈＲＮＡのテンプレートを形成する２つの相補的オリゴヌクレオチド中に含めた。すなわち１９−ｎｔセンス配列、９−ｎｔリンカー領域（ループ）、１９−ｎｔアンチセンス配列とそれに続くＲＮＡポリメラーゼＩＩＩの終止用５−６ポリ−Ｔトラクト。ＫＡＡＧ１の発現をノックダウンするために使用した１９−ｍｅｒの配列を配列番号４９及び５０に示す。適切な制限部位をこれらのオリゴヌクレオチドの末端に挿入して、挿入物の正しいポジショニングを容易にして、転写出発点がｈＵ６プロモータの下流の的確な位置になるようにした。全てのＲＮＡ干渉研究で使用したプラスミドであるｐＳｉｌｅｎｃｅｒ ２．０（配列番号５１）は、商業的供給業者（Ａｍｂｉｏｎ、テキサス州オースチン）から購入した。ＲＮＡｉ効果を観察する機会及び表現型観察結果の特異性を増大させるために、２つの異なるｓｈＲＮＡ発現ベクターを構築した。ＴＯＶ−２１Ｇ細胞を６穴プレート中に播種し、２４時間後に１μｇのｐＳｉｌ−ｓｈＲＮＡベクターを用いてトランスフェクトした。ｓｈ．１及びｓｈ．２を使用して、ＫＡＡＧ１遺伝子を標的とする２つの異なるｓｈＲＮＡ配列を指定した。安定な形質転換体を５〜７日間選択し、拡大させ、コンフルエンスになるまで成長させた。以下のインビトロ細胞ベースの分析は全て、これらのＫＡＡＧ１について特異的なｓｈＲＮＡを含む、安定にトランスフェクトされた細胞系を用いて実施した。
【０３８１】
細胞の移動又は移動度は、標準的な細胞運動性分析で測定した。このいわゆるスクラッチ分析は、細胞がコンフルエント単層中の露出部分を満たす速度を測定する。図２Ａで示すように、スクランブル化ｓｈＲＮＡを含むＴＯＶ−２１Ｇ細胞は、対照の未処置細胞と比較して、２４時間後にほぼ完全に創傷を満たした（左から２番目のパネルと１番左のパネルとを比較）。一方、ＫＡＡＧ１ ｓｈＲＮＡを発現するＴＯＶ−２１Ｇ細胞が露出部分を満たす能力は大幅に減少した。実際、ＫＡＡＧ１ ｓｈＲＮＡ細胞の存在下で露出部分を満たす細胞の数は、０時での細胞数とよく似ていた（左パネルと右パネルとを比較）。
【０３８２】
卵巣癌細胞におけるＫＡＡＧ１の減少した発現の長期効果を調べるために、コロニー生存分析において、細胞を十分に希釈し、１０日間培養した。ＴＯＶ−２１Ｇ細胞を１２穴プレート中に５００００細胞／穴の密度で播種し、２４時間後に１μｇのｐＳｉｌ−ｓｈＲＮＡベクターを用いてトランスフェクトした。ｓｈ−１及びｓｈ−２は、同じ遺伝子を標的とする２つの異なるｓｈＲＮＡ配列を指す。翌日、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む新鮮な培地を適用し、細胞の選択を３日間実施した。細胞を洗浄し、ピューロマイシンを含まない新鮮な培地を添加し、成長をさらに５日間継続させた。残りのコロニーを可視化するために、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、固定し、同時に１％クリスタルバイオレット／１０％ＰＢＳ中エタノール中で１５分間室温にて染色した。ＰＢＳ中でよく洗浄した後、乾燥したプレートを写真解析のためにスキャンした。癌細胞系の生存において有意な減少が観察され、代表的な実験結果を図２Ｂに示す。ｓｈＲＮＡを別の卵巣癌細胞系であるＴＯＶ−１１２Ｄ中にトランスフェクトした場合にも同じ結果が得られた。
【０３８３】
従って、まとめると、分離した細胞におけるＫＡＡＧ１の調節された発現は、卵巣癌細胞の移動及び生存におけるこの遺伝子の要件とあわせて、卵巣癌細胞におけるＫＡＡＧ１の重要な役割を裏付ける。さらに、これらの実験は、モノクローナル抗体などのＫＡＡＧ１タンパク質の拮抗物質が、侵襲性を減少させ、腫瘍生存を減少させることを示唆する。
【０３８４】
実施例３
この実施例は、ＫＡＡＧ１と結合するモノクローナル抗体のファミリーに関する詳細を提供する。
【０３８５】
ＫＡＡＧ１と結合する抗体を、Ｂｉｏｓｉｔｅファージ提示技術を用いて生成させた。この技術及びこれらの抗体の生成法の詳細は、米国特許第６，０５７，０９８号に記載されている。手短に言うと、この技術は、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を提示するファージライブラリのストリンジェントなパニングを利用する。数回のパニング後、Ｏｍｎｉｃｌｏｎａｌと称するライブラリを得、これはＫＡＡＧ１と非常に高い親和性及び特異性で結合する軽及び重鎖可変領域を含む組換えＦａｂを多く含んでいた。このライブラリ（より正確にはＯｍｎｉｃｌｏｎａｌ ＡＬ０００３Ｚ１）から、９６の個々の組換えモノクローナルＦａｂをイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）から調製し、ＫＡＡＧ１結合について試験した。
【０３８６】
各モノクローナル抗体の相対的結合を測定するために、組換えヒトＫＡＡＧ１を、大規模一時的トランスフェクション技術を用いて２９３Ｅ細胞において産生した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２年；Ｄｕｒｏｃｈｅｒ、２００４年）。ＫＡＡＧ１ ｃＤＮＡの全コーディング領域を、ＢａｍＨＩ制限部位を組み入れた順方向プライマー（配列番号５２）及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を組み入れた逆方向プライマー（配列番号５３）を用いたＰＣＲによって増幅した。結果として得られたＰＣＲ産物は２７６塩基対であり、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化後、フラグメントを、同じ制限酵素で同様に消化した発現ベクターｐＹＤ５（配列番号５４）中に結合させた。ｐＹＤ５発現プラスミドはヒトＦｃドメインのコーディング配列を含み、これによって融合タンパク質が生成し、またＩｇＧ１シグナルペプチドをコード化する配列が培地中に融合タンパク質を分泌させることが可能になる。細胞１ミリリットルごとに、１マイクログラムのｐＹＤ５−０４４７と称する発現ベクターを、１５０００００〜２００００００細胞／ｍｌの密度まで懸濁液中で成長させた２９３Ｅ細胞中にトランスフェクトした。使用したトランスフェクション試薬は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、（直線状、ＭＷ２５，０００、Ｃａｔ＃２３９６６ Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州ウォリントン）であり、これは１：３のＤＮＡ：ＰＥＩ比で含まれていた。細胞の成長を５日間継続させ、その後、培地を組換えＦｃ−ＫＡＡＧＩ融合タンパク質の精製のために集めた。タンパク質を、製造業者（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．、オンタリオ州オークビル）によって指示されるようにして、タンパク質−Ａアガロースを用いて精製した。精製Ｆｃ−ＫＡＡＧＩ（Ｆｃ−０４４７と表示）の試料を示す代表的なポリアクリルアミドゲルを図３Ａに示す。
【０３８７】
モノクローナル調製物の９６穴マスタープレートは、各ウェル中に様々な濃度の精製抗ＫＡＡＧ１ Ｆａｂを含んでいた。１０μｇ／ｍｌの最終濃度までＦａｂを希釈することによって第２のストックマスタープレートを調製し、これからＥＬＩＳＡ測定用のその後の全ての希釈を実施した。Ｆｃ−ＫＡＡＧＩをモノクローナル調製物と結合させるために、Ｆｃ−ＫＡＡＧＩを、ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を用いてビオチニル化し、１０ｎｇ／穴をストレプトアビジン９６穴プレート中にコーティングした。１ナノグラムの各Ｆａｂモノクローナル調製物を各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。ＨＲＰ結合マウス抗カッパ軽鎖抗体を用いてＴＭＢ液体基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．、オンタリオ州オークビル）の存在下で結合した抗体を検出し、マイクロタイタープレートリーダーで４５０ｎｍにて読み取った。図３Ｂに示すように、合計４８の（灰色で強調した）モノクローナル抗体はこの分析で有意な結合を示した（＞０．１任意ＯＤ４５０単位）。抗体を意図的に１ｎｇ／穴まで希釈して、ＫＡＡＧ１について最高の親和性でこれらの抗体の結合を増強する。対照として、抗体はビオチニル化Ｆｃドメインと結合しなかった。これらのデータから、抗体の結合はウェルごとに異なることが明らかになり、このことは抗体がＫＡＡＧ１について異なる親和性を示すことを意味する。
【０３８８】
実施例４
この実施例は、ＫＡＡＧ１のどの領域に抗体が結合するかを究明するエピトープマッピング研究を記載する。
【０３８９】
モノクローナル抗体によって結合するＫＡＡＧ１の領域をさらに説明するために、ＫＡＡＧ１のトランケートされた突然変異体を発現させ、ＥＬＩＳＡにおいて使用した。完全長ＫＡＡＧ１について、トランケートされた形態をＰＣＲによって増幅し、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＹＤ５中に結合させた。使用したプライマーは順方向オリゴヌクレオチドを、配列番号５５及び５６のプライマーを用いて配列番号５２に示す配列と組み合わせて、それぞれＫＡＡＧ１のアミノ酸番号６０及び３５を末端とするＦｃ融合フラグメントを産生した。これらの突然変異体の発現は、完全長Ｆｃ−ＫＡＡＧＩについて前述のように実施し、タンパク質−Ａアガロースで精製した。ＥＬＩＳＡで使用したタンパク質調製物の代表的なゲルを図４Ａに示し、エピトープマッピングに使用した突然変異タンパク質の概略図を図４Ｂに示す。
【０３９０】
結果から、ライブラリは、図示したＫＡＡＧ１領域のそれぞれと結合することができる抗体から構成されることがわかった。特に、最初のＥＬＩＳＡでＫＡＡＧ１と結合した４８個のｍＡｂのうち、９個（ウェルＡ２、Ａ１２、Ｃ２、Ｃ４、Ｄ１、Ｅ１０、Ｆ１、Ｈ３、及びＨ８）はＫＡＡＧ１の最初の３５のアミノ酸と相互作用することが判明したのに対して、５個（Ｄ１２、Ｅ８、Ｆ５、Ｇ１０、及びＨ５）はＫＡＡＧ１の最後の２５のアミノ酸と相互作用することが判明した。従って、残りの３４個の抗体は、アミノ酸３６〜５９の範囲のＫＡＡＧ１の領域と相互作用した。これらの結果は、２４の代表的な軽及び重鎖可変領域の配列分析と一致した。実際、これらの配列アラインメントによって、抗体は、それらの各ＣＤＲにおける同一性（％）に基づいて３群に分類されることが明らかになった。各クラスターに含まれる抗体は全て、ＫＡＡＧ１の同じ領域と相互作用した。
【０３９１】
従って、ｍＡｂの相対的結合親和性、差次的エピトープ相互作用特性、及び可変領域配列における差に基づいて、実施例３で記載したプレートからの３つの抗体を、例示的抗ＫＡＡＧ１モノクローナル抗体としてさらなる分析のために選択した。
【０３９２】
実施例５
この実施例は、Ｆａｂを完全ＩｇＧ１キメラモノクローナル抗体に変えるために使用される方法を開示する。方法のスキームを図５に示す。
【０３９３】
ＦａｂモノクローナルとＫＡＡＧ１タンパク質間の相互作用研究を実施する可能性は別として、Ｆａｂの使用は、重要なインビトロ及びインビボ研究を実施して抗原の生物学的機能を検証することに関して限定される。従って、Ｆａｂに含まれる軽及び重鎖可変領域を完全抗体スカフォールドに移し、マウス−ヒトキメラＩｇＧ１を生成させることが必要であった。軽及び重イムノグロブリン鎖の両方の発現ベクターを、ｉ）Ｆａｂ発現ベクターの上流のもとの細菌シグナルペプチド配列が哺乳動物シグナルペプチドと置換され、そしてｉｉ）マウス抗体中の軽及び重鎖定常領域がヒト定常領域と置換されるように構築した。この転移を実施するための方法は、当業者に周知の標準的分子生物学技術を使用した。方法論の簡単な概要をここで説明する（図５を参照）。
【０３９４】
軽鎖発現ベクター−２９３Ｅ一次的トランスフェクションシステムにおいて使用されるように設計された、ｐＴＴＶＨ８Ｇ（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２年）と称する既存の哺乳動物発現プラスミドを修飾して、マウス軽鎖可変領域に適合させた。結果として得られるマウス−ヒトキメラ軽鎖は、マウス可変領域とそれに続いてヒトカッパ定常ドメインを含んでいた。ヒトカッパ定常ドメインをコード化するｃＤＮＡ配列を、プライマーＯＧＳ１７７３及びＯＧＳ１７７４（それぞれ配列番号５７及び５８）を用いてＰＣＲにより増幅した。ヒトカッパ定常領域のヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５９及び６０に示す。結果として得られる３２１塩基対ＰＣＲ産物を、ヒトＶＥＧＦＡ（ＮＭ＿００３３７６）のシグナルペプチド配列のすぐ下流のｐＴＴＶＨ８Ｇ中に結合させた。このクローニングステップは、マウス軽鎖可変領域をコード化するｃＤＮＡの正確なポジショニングを可能にする独自のエンドヌクレアーゼ部位の位置決定も行った。ｐＴＴＶＫＩと称する最終発現プラスミドの配列を配列番号６１に示す。表３に開示された配列に基づいて、それらの５’末端で、ＶＥＧＦ Ａシグナルペプチドの最後の２０塩基対と同じ配列を組み入れた、抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、及び３Ｃ４の軽鎖可変領域（それぞれ配列番号１５、１９、及び２３）に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーの配列を配列番号６２、６３、及び６４に示す。同じ逆方向プライマーを使用して、３つの軽鎖可変領域全てを増幅させた。その理由は、３’側最末端は同じであるからである。このプライマー（配列番号６５）は、その３’末端で、ヒトカッパ定常ドメインの最初の２０塩基対と同じ配列を組み入れていた。ＰＣＲフラグメント及び消化されたｐＴＴＶＫＩの両方をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性で処理し、その結果、相補的末端を得、これをアニーリングによって結合させた。アニーリング反応をコンピテントイー・コリに変換し、マウス軽鎖可変領域がｐＴＴＶＫＩ発現ベクター中に適切に挿入されるようにシーケンシングすることによって発現プラスミドを検証した。当業者らは、軽鎖発現プラスミドの構築に用いられる方法が、もとのＦａｂライブラリ中に含まれる全ての抗ＫＡＡＧ１抗体に当てはまることを容易に認識するであろう。
【０３９５】
重鎖発現ベクター−重鎖イムノグロブリンを産生した発現ベクターを、軽鎖イムノグロブリンの産生について前述したｐＴＴＶＫＩと同様の方法で設計した。ヒトＩｇＧＫシグナルペプチド配列並びにＩｇＧ１のヒトＦｃドメインのＣＨ２及びＣＨ３領域を含むプラスミドｐＹＤ１１（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２）を、ヒト定常ＣＨ１領域をコード化するｃＤＮＡ配列を結合させることによって修飾した。独自の制限エンドヌクレアーゼ部位を含むように設計されたＰＣＲプライマーＯＧＳ１７６９及びＯＧＳ１７７０（配列番号６６及び６７）を使用して、配列番号６８及び６９に示すヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１ ＣＨ１領域を増幅した。ＩｇＧＫシグナルペプチド配列のすぐ下流のヒトＣＨ１の３０９塩基対フラグメントの結合後、修飾されたプラスミド（配列番号７０）をｐＹＤ１５と指定した。選択された重鎖可変領域をこのベクター中に結合する場合、結果として得られるプラスミドは、ヒト定常領域を有する完全ＩｇＧ１重鎖イムノグロブリンをコード化する。表３に開示する配列に基づいて、その５’−末端でＩｇＧＫシグナルペプチドの最後の２０塩基対と同じ配列を組み入れた、抗体３Ｄ３、３Ｇ１０、及び３Ｃ４の重鎖可変領域（それぞれ配列番号１７、２１、及び２５）に特異的なＰＣＲプライマーを設計した。これらのプライマーの配列を配列番号７１（３Ｄ３及び３Ｇ１０は同じ５’−末端配列を有する）並びに７２に示す。同じ逆方向プライマーを用いて３つの重鎖可変領域全てを増幅した。その理由は、３’側最末端は同じだからである。このプライマー（配列番号７３）は、その３’末端で、ヒトＣＨ１定常ドメインの最初の２０塩基対と同じ配列を組み入れていた。ＰＣＲフラグメント及び消化されたｐＹＤ１５の両方をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性で処理し、その結果、相補性末端を得、こアニーリングによって結合させた。アニーリング反応をコンピテントイー・コリ中に変換し、マウス重鎖可変領域がｐＹＤ１５発現ベクター中に適切に挿入されるようにシーケンシングすることによって発現プラスミドを検証した。当業者らは、重鎖発現プラスミドの構築に使用される方法がもとのＦａｂライブラリ中に含まれる全ての抗ＫＡＡＧ１抗体に当てはまることを容易に認識するであろう。
【０３９６】
２９３Ｅ細胞におけるヒトＩｇＧ１の発現−軽及び重鎖イムノグロブリンをコード化した、前段で調製された発現ベクターを、一時的トランスフェクションシステムを用いて２９３Ｅ細胞において発現した（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、２００２年）。軽及び重鎖発現ベクターをコトランスフェクションするために使用した方法は、実施例３で記載した。組織培地中で抗体の最高収率を達成するために軽鎖の重鎖に対する比を最適化し、９：１（Ｌ：Ｈ）であることが判明した。キメラ抗ＫＡＡＧ１モノクローナル抗体が組換えＦｃ−ＫＡＡＧＩと結合する能力をＥＬＩＳＡで測定し、もとのマウスＦａｂと比較した。方法は実施例３で記載した。図６で図示するように、３Ｄ３、及び３Ｇ１０キメラＩｇＧ１モノクローナル抗体の結合は、Ｆａｂと非常に似ていた。３Ｃ４の場合、キメラの結合活性は、Ｆａｂよりも若干低かった。これに反して、この結果から、マウスＦａｂからの可変領域のヒトＩｇＧ１骨格への転位は、軽及び重鎖可変領域がＫＡＡＧ１結合を付与する能力に有意に影響を及ぼさなかったことがわかる。
【０３９７】
実施例６
この実施例は、卵巣癌細胞モデルにおいてＫＡＡＧ１の活性をブロックするための抗ＫＡＡＧ１抗体の使用を記載する。
【０３９８】
実施例２は、ＫＡＡＧ１が卵巣癌細胞の挙動において重要な役割を果たすことを示すＲＮＡｉ研究を開示した。前述のモノクローナル抗体を使用して、細胞表面のＫＡＡＧ１を標的とすることによってこれらの結果を再現することが可能であるかどうかを究明した。ＴＯＶ−２１Ｇ及びＯＶ−９０細胞を、スフェロイドを産生する条件下で培養し、１０μｇ／ｍｌの３Ｄ３、３Ｇ１０、又は３Ｃ４抗ＫＡＡＧ１キメラモノクローナル抗体で処理した。図７に示すように、未処理のままで放置した場合（親）又は抗体希釈緩衝液で処理した場合（対照）に両細胞系は効率的にスフェロイドを形成した。対照的に、抗ＫＡＡＧ１抗体の存在は、ゆるく充填された構造をもたらし、ある場合には、細胞はスフェロイドに構築することができなかった。これらの結果は、先の観察結果を裏付け、抗ＫＡＡＧ１モノクローナル抗体がスフェロイドの形成中にＫＡＡＧ１の活性を調節できることを示唆する。癌細胞系によるスフェロイド形成は、腫瘍形成のインビトロモデルであるので、結果は、ＫＡＡＧ１をブロックすることがインビボでの腫瘍形成の軽減につながることも示唆する。
【０３９９】
実施例７
この実施例は、卵巣腫瘍におけるＫＡＡＧ１の発現を検出するための抗ＫＡＡＧ１抗体の使用を記載する。
【０４００】
卵巣癌腫瘍におけるＫＡＡＧ１タンパク質の発現を確認する手段として、そして遺伝子の発現がタンパク質の存在と相関するかどうかを究明するために、免疫組織化学法を実施した。患者生検から生成させた数ダースの卵巣腫瘍試料を含む組織マイクロアレイを得た。パラフィン包埋上皮卵巣腫瘍試料をスライドガラス上に置き、１５分間５０℃で固定した。キシレンで２回処理し、続いて１００％、８０％、及び７０％エタノール中で連続して５分間洗浄して脱水することによって、脱パラフィンを実施した。スライドをＰＢＳ中で２回、５分間洗浄し、そして抗原修復溶液で処理して（クエン酸塩−ＥＤＴＡ）、抗原をアンマスキングした。スライドをメタノール中でＨ２Ｏ２とともにインキュベートすることによって内因性ペルオキシド反応性種を除去し、スライドを無血清ブロッキング溶液（Ｄａｋｏｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）とともに２０分間室温にてインキュベートすることによってブロッキングを実施した。一次ｍＡｂ（抗ＫＡＡＧ１ ３Ｄ３）を１時間室温で添加した。ＫＡＡＧ１反応性抗原を、ビオチン結合マウス抗カッパ、続いてストレプトアビジン−ＨＲＰ三次抗体とともにインキュベートすることによって検出した。ポジティブ染色は、スライドをＤＡＢ−過酸化水素基質で５分未満処理することによって示され、続いてヘマトキシリンで対比染色した。ＫＡＡＧ１タンパク質は、大部分の卵巣腫瘍試料において非常に高レベルで発現されることが判明した。７０腫瘍を含む代表的なアレイを図８Ａに図示する。ＲＴ−ＰＣＲを用いて実施した発現プロファイリングによって示されるように、ＫＡＡＧ１転写物は分析した卵巣腫瘍試料の８５％超で存在していた。明らかに、ＫＡＡＧ１遺伝子の転写と卵巣癌中のタンパク質の存在との間には優れた相関関係がある。試料の一部をさらに高倍率で調べて、どの細胞がＫＡＡＧ１タンパク質を発現しているかを究明した。図８Ｂで示すように、ＫＡＡＧ１は、卵巣腫瘍の表層上皮で主に発現される。加えて、これらの上皮細胞の先端側上で強い強度が観察された（図８Ｂ中の矢印を参照、倍率２０×）。最後に、免疫組織化学法を様々な組織型由来の卵巣腫瘍試料に関して繰り返した。先に説明したように、上皮卵巣癌は４つの主な組織型、すなわち漿液性、類内膜、明細胞、及び粘液性に分類することができる。ＫＡＡＧ１の発現は、上皮卵巣癌の全ての型、特に漿液性及び類内膜組織型で検出された（図８Ｃを参照）。
【０４０１】
まとめると、これらの免疫組織化学的研究は、モノクローナル抗体を用いた卵巣癌におけるＫＡＡＧ１検出の有用性を示す。
【０４０２】
実施例８
ＫＡＡＧ１に対するＩｇＧ１抗体はＡＤＣＣを媒介することができる。
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、細胞媒介性免疫機構であり、これによって免疫系のエフェクター細胞、典型的にはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、特異的抗体により結合された標的細胞を積極的に溶解する。ＮＫ細胞と抗体との間の相互作用は、抗体の定常Ｆｃドメイン及びＮＫ細胞の表面上の高親和性Ｆｃγ受容体によって起こる。ＩｇＧ１は、Ｆｃ受容体に関して最高の親和性を有し、一方、ＩｇＧ２ｍＡｂは非常に低い親和性を示す。この理由のために、ＫＡＡＧ１を標的とするキメラ抗体はＩｇＧ１として設計した。このように媒介されるこの種類のエフェクター機能によって、多くの場合、自身の細胞表面上で高レベルの抗原を発現する癌細胞を選択的に殺すことができるようになる。
【０４０３】
すでに公開されている方法の中から、抗ＫＡＡＧ１ ＩｇＧ１キメラ抗体のＡＤＣＣ活性を測定するためのインビトロ分析を採用した。この方法で、ＷＩＬ２−Ｓと呼ばれるリンパ腫細胞系の存在下で抗ＣＤ２０リツキサンのＡＤＣＣ活性を測定した（Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４，４１７８−４１８４）。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＮＣ）を、濃度が増大する３Ｄ３キメラＩｇＧ１抗体の存在下で活性化されたＮＫ細胞源として使用した（図１２を参照）。標的細胞を１：２５の比で活性化されたＰＢＭＮＣとともにインキュベートした。図示するように、細胞死は、ＯＶＣＡＲ−３及びリンパ腫細胞系の両方の存在下で用量に依存して増加し、後者はＲＴ−ＰＣＲによってＫＡＡＧ１を発現することが証明された（不図示）。正の対照として、公開された方法から得られた結果を再現し、この場合、リツキサンに関してＷＩＬ２−Ｓ細胞の存在下で高レベルのＡＤＣＣが得られた。
【０４０４】
ＡＤＣＣは、比較的高レベルのＫＡＡＧ１を発現する他の卵巣癌細胞系を用いても観察
された。これらの結果は、３Ｄ３により例示されるように、ＫＡＡＧ１について特異的なＩｇＧ１抗体が、自身の細胞表面上で抗原を発現する癌細胞の溶解を向上させ得ることを証明する。
【０４０５】
実施例９
ＫＡＡＧ１に対する抗体は、卵巣腫瘍の浸潤を軽減させることができる。
卵巣癌に罹っている患者は、卵巣の上皮層中、又は数例においては卵管中の細胞の制御不能な成長により典型的に開始する病巣を有する。早期に発見されたならば、これらの原発腫瘍を手術により除去し、初回化学療法の結果、非常に良好な奏効率を得ることができ、また全体的な生存を改善することができる。残念ながら、７０％の患者は疾患が再発し、その結果、腹腔全体に数百の微小転移性腫瘍が広がることになる。第二回治療は有効であり得るが、多くの場合、患者の反応が不良であるか、又は腫瘍が化学療法剤耐性になるかのいずれかである。治療法の選択肢は限られ、細胞傷害性剤に対する耐性を回避するための新規療法が緊急に必要とされる。
【０４０６】
インビボの抗ＫＡＡＧ１抗体の有効性を試験するために、ヒトにおける卵巣癌の臨床症状に最も近い卵巣癌の動物モデルを使用した。ＴＯＶ−１１２Ｄ細胞系は、類内膜起源のものであり、ＲＴ−ＰＣＲにより測定されるようにＫＡＡＧ１抗原を発現する。先のＩＨＣ研究により、類内膜組織型の卵巣腫瘍は、ＫＡＡＧ１の強力な発現を含み、従って、１１２Ｄ細胞系を、抗ＫＡＡＧ１抗体を試験するための適切な選択肢とする。
【０４０７】
ＳＣＩＤマウスにおけるＴＯＶ−１１２Ｄ細胞系の腹腔内接種の結果、ヒトにおいて観察されるものと非常によく似た数ダースの微小転移性腫瘍が移植された。抗体の希釈剤であるＰＢＳで処置されたマウスは、検査によると、動物１匹あたり平均で２５〜３０の腫瘍を含んでいた（図１３Ａ及びＢ）。数例では、これらのマウスの腹腔中の腫瘍数は多すぎて腫瘍の数を容易に測定できなかったので、これらのマウスは統計分析から除外した。マウスを３Ｃ４及び３Ｄ３抗体で処理した場合、微小転移性腫瘍の数は大幅に減少した。加えて、抗ＫＡＡＧ１で処理した群につき少なくとも１匹の動物では腫瘍が見られなかった。さらに多数のＴＯＶ−１１２Ｄ腫瘍（＞５０／動物）を含むマウスで第２の実験を実施し、非常によく似た結果を得た。さらに、３Ｄ３抗体と比較して、３Ｃ４で処置された群ではほとんど差はなかった。しかし、これらのインビボ実験における傾向並びに細胞ベースの分析で得られた結果は、３Ｄ３抗体の方が若干有効性が高いことを示した。これが、よりアクセス可能なエピトープによるのか、又は抗原に対して３Ｃ４と比較して３Ｄ３のより高い親和性によるのかは、まだわかっていない。これらの２つの実験から得られた結果は、卵巣癌細胞表面上のＫＡＡＧ１を標的とすることは、インビボの腫瘍の拡大を著しく軽減することにつながり得ることを証明した。
【０４０８】
さらに、これらの発見は、細胞ベースの分析で得られた観察結果と完全に一致する。たとえば、単層として成長した細胞系と比較して、スフェロイドにおけるＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡの発現の増加；ＫＡＡＧ１ ｓｈＲＮＡの存在下での細胞移動の減少、ＫＡＡＧ１抗体で処置された場合の細胞系がスフェロイドを形成する能力の減少；そして最後に、抗ＫＡＡＧ１ ＩｇＧ１によるＡＤＣＣ活性の向上。まとめると、この結果は、抗体を用いてＫＡＡＧ１を標的とすることが再発性卵巣癌において治療上大いに有望であることを強力に示唆する。
【０４０９】
実施例１０
ＫＡＡＧ１は皮膚腫瘍及び腎臓細胞癌で発現され、これらの適応症における治療上の標的である。
実施したｍＲＮＡプロファイリング研究から、ＫＡＡＧ１抗原をコード化する転写物は、黒色腫試料及び腎臓癌由来の細胞系で高度に発現されたことがわかった。これらの結果は、Ｓｏｏｋｎａｎａｎら（２００７年）で開示された。これらの癌型におけるＫＡＡＧ１遺伝子の転写調節を確認するために、免疫組織化学法を、扁平上皮細胞癌及び黒色腫から単離されたいくつかの切片を含むヒト皮膚腫瘍組織マイクロアレイ（Ｐａｎｔｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州リッチモンド）で抗ＫＡＡＧ１抗体を用いて実施した。このアレイの分析は、扁平上皮細胞癌及び黒色腫から単離された生検において非常に強い染色を示した（図１４、上のパネル）。これらの型はどちらも皮膚癌の最も一般的な形態に含まれ、また興味深いことに、扁平上皮細胞癌は最も転移性が強く、この事実もＫＡＡＧ１の発現と侵襲的表現型とを結びつける。すでに観察されたように、アレイ上に含まれる３つの正常な皮膚試料上のＫＡＡＧ１の存在は非常に微弱であるか又は存在しなかった。同様に、ＫＡＡＧ１は、腎臓癌のアレイに含まれる試料の多くで検出された。陽性試料のほとんどは、主に乳頭細胞癌型のものであり、若干の明細胞癌がＫＡＡＧ１タンパク質を発現した。乳頭癌は腎臓癌症例の約２０％に相当する。
【０４１０】
ＫＡＡＧ１の機能が、卵巣癌におけるその役割と比較して、これらの種類の癌で同じかどうかを試験するために、黒色腫及び腎臓細胞癌由来の細胞系を得、スフェロイド培養試験で試験した（実施例１及び６を参照）。黒色腫モデルに関して、Ａ３７５及びＳＫ−ＭＥＬ５細胞の２つの悪性黒色腫細胞系を、これらが５％ＦＢＳの存在下でスフェロイドを形成することを可能にする条件下で培養した。培養物を５μｇ／ｍｌの濃度の抗ＫＡＡＧ１キメラ３Ｄ３抗体とともに又はこの抗体なしでインキュベートした。図１５に示すように、培養物中に３Ｄ３抗体を含めることで、黒色腫細胞系におけるスフェロイド構造の適切な構築が防止された。この結果は、ＫＡＡＧ１が卵巣癌において果たすのと同様の役割を黒色腫でも果たすことを示唆した。腎臓細胞癌由来の細胞系も試験した。Ａ−４９８細胞系は腎臓乳頭細胞癌細胞系であるのに対して、７８６−Ｏは腎臓明細胞癌である。図１５で示すように、Ａ−４９８スフェロイドのみが３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体の存在によって影響を受け、一方、７８６−Ｏ細胞系はこの分析で影響を受けなかった。これらの結果は、前述の免疫組織化学法の結果に匹敵し、スフェロイド形成の阻害が、主に乳頭腎臓癌由来の腎臓癌細胞表面上のＫＡＡＧ１の存在に依存することを示す。しかし、抗ＫＡＡＧ１抗体は腎臓明細胞癌の他の種類の分析において機能し得るこ可能性がある。
【０４１１】
まとめると、これらのデータは、黒色腫及び腎臓癌におけるＫＡＡＧ１の役割の重要な機能を強力に支持し、これらの適応症で抗体を用いてＫＡＡＧ１をブロックすることは、治療的可能性を有することを示す。
【０４１２】
実施例１１
ＫＡＡＧ１は卵巣癌細胞の表面上で発現される。ＫＡＡＧ１をコード化するｃＤＮＡの一次構造のバイオインフォーマティック分析、生化学研究、及び上皮細胞中のタンパク質の免疫組織化学的検出から得られた総合結果は、ＫＡＡＧ１抗原が細胞表面上に位置することを示唆した。しかし、ＫＡＡＧ１が実際に膜結合タンパク質であることを証明するためにはさらに直接的な証拠が必要であった。一方法において、ＫＡＡＧ１を発現することが知られている卵巣癌細胞系をマイクロタイタープレート中に播種し、細胞を透過しない条件下で固定し、抗ＫＡＡＧ１キメラ抗体の濃度を増加させつつインキュベートした。細胞をよく洗浄した後、修飾された細胞ベースのＥＬＩＳＡにおいて二次抗体としてＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧを用いて結合抗体を検出した（図１６Ａを参照）。これらの実験から得ることができる最初の観察結果は、抗体を細胞によって特異的に捕獲することができることであり、このことは、ＫＡＡＧ１が細胞表面で存在することを示唆した。第２に、結合の量は、ＳＫＯＶ−３細胞上で最強であり、ＴＯＶ−２１Ｇ細胞は最弱の結合を示した。これは、ＫＡＡＧ１ ｍＲＮＡがこれらの細胞系において同様の割合で発現されることを証明したＲＴ−ＰＣＲデータ（不図示）と完全に一致した。さらに、３Ｄ３抗体は最強のシグナルを生じ、このことは、この抗体によって標的とされるエピトープがこの分析では最もアクセス可能であったことを意味する。３Ｇ１０は、最高レベルのＡＢ−０４４７を発現した細胞系においてＫＡＡＧ１を検出できるだけであった（ＳＫＯＶ−３細胞、図１６Ａの右パネルを参照）。使用した第２の方法はフローサイトメトリーであった。この場合、マウス３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体をＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞とともに飽和条件でインキュベートし、続いてよく洗浄し、結合した３Ｄ３抗ＫＡＡＧ１抗体を、フローサイトメーターでＦＩＴＣと結合した抗マウスＩｇＧを用いて検出した。図１６Ｂで示すように、ＳＫＯＶ−３細胞の表面でのシグナルは、バックグラウンドの読みと同じ蛍光レベルである、非哺乳動物非関連性タンパク質について特異的な負の対照である抗ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）抗体で標識された同じ細胞と比較してはるかに高かった。まとめると、これらの結果は、ＫＡＡＧ１が細胞表面上に位置することを示す。
【０４１３】
実施例１２
ヒト化抗ＫＡＡＧ１抗体の使用法。
インビトロ及び予備インビボ結果の両方に基づいて、２つのマウス抗ＫＡＡＧ１抗体候補（３Ｄ３及び３Ｃ４と表示）を、当業者に周知の方法を使用するコンピュータ内でのモデリングを用いたヒト化について選択した。手短に言うと、ネズミ抗体の可変領域を、高い配列相同性と類似したＣＤＲループ長さを呈するマウス、ヒト化、及び完全ヒト可変領域の利用可能な結晶構造に基づいて３Ｄでモデル化した。ＣＤＲは、抗原結合に寄与するアミノ酸配列であり、抗体鎖上に３つのＣＤＲが存在する。さらに、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列であるフレームワーク領域を、マウスとヒト抗体配列との標準的相同性比較によって修飾し、その結果、「最良適合」ヒト配列を得た。これらの修飾は、潜在的なＮ及びＯ結合グリコシル化部位の保存はもちろんのこと、ヒト化構造における最大抗原結合を保証するために、これらの修飾はＣＤＲの適切なポジショニングが確実に維持されるようにした。ヒト化（ｈ）３Ｄ３及び３Ｇ４における重鎖及び軽鎖可変領域の両方の配列の結果として、それぞれ９６％及び９４％がヒト化された。各抗体の３Ｄ３及び３Ｃ４モデルの構造をそれぞれ図１７Ａ及び１７Ｂに示す。これらの構造に示されるように、３Ｄ３は、３つの異常なアミノ酸（図１７Ａ、重鎖上のＭｅｔ９３及びＧｌｙ９４、並びに軽鎖上のＳｅｒ５７）がＣＤＲモデルに近いので、これらのアミノ酸の維持を必要とした。モデリングは、これらのマウスアミノ酸のヒト等価物での置換が抗体のＫＡＡＧ１抗原との結合を相殺し得ることを予想した。３Ｃ４の場合、６個のアミノ酸が異常と見なされた（図１７Ｂ、重鎖上のＧｌｕ１、Ｇｌｎ７２及びＳｅｒ９８、並びに軽鎖上のＴｈｒ４６、Ｐｈｅ４９及びＳｅｒ８７）。両図において、軽鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３についてそれぞれＬ１、Ｌ２、及びＬ３により示され、一方、重鎖ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３についてそれぞれＨ１、Ｈ２、及びＨ３で示される。
【０４１４】
完全抗ＫＡＡＧ１ ３Ｄ３イムノグロブリン軽及び重鎖をコード化する配列をそれぞれ配列番号１７６及び１７７に示す。ヒト化３Ｄ３軽鎖の可変領域は配列番号１７６のアミノ酸２１〜１３３の間に含まれ、配列番号１７８に示される。ヒト化３Ｄ３重鎖の可変領域は配列番号１７７のアミノ酸２０〜１３２の間に含まれ、配列番号１７９に示される。完全抗ＫＡＡＧ１ ３Ｃ４イムノグロブリン軽及び重鎖をコード化する配列をそれぞれ配列番号１８０及び１８１に示す。ヒト化３Ｃ４軽鎖の可変領域は配列番号１８０のアミノ酸２１〜１２７の間に含まれ、配列番号１８２に示される。ヒト化３Ｃ４重鎖の可変領域は配列番号１８１のアミノ酸１９〜１３６の間に含まれ、配列番号１８３に示される。
【０４１５】
トランスフェクトされた哺乳動物細胞における発現ベクターのアセンブリ及びｈ３Ｄ３の産生後（実施例５を参照）、ヒト化プロセスの生物学的同等性を証明するためにいくつかの分析を実施した。エフェクター機能を有する抗体が必要とされたので、ｈ３Ｄ３をヒトＩｇＧ１として構築した。ｈ３Ｄ３の能力を組換えＫＡＡＧ１と直接比較するためにＥＬＩＳＡに基づく分析を実施した。これらの試験を実施するために用いられる方法は、組換えＦｃ−ＫＡＡＧＩを使用して実施例３に記載したとおりにした。図１８Ａに示すように、ｈ３Ｄ３の結合活性は、キメラ３Ｄ３の結合活性と同じであった。
【０４１６】
さらに正確な測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて実施した。動態解析を用いて、キメラ３Ｄ３のｈ３Ｄ３との親和性並びに軽及び重鎖の様々な置換を含むハイブリッド抗体との親和性を比較した（図１８Ｂを参照）。手短に言えば、抗ヒトＦｃをＢｉａｃｏｒｅセンサーチップ上に固定しキメラ又はｈ３Ｄ３をこのチップ上に捕獲した。様々な濃度のモノマー組換えＫＡＡＧ１を注入し、データを簡単な１：１モデルに全体的に適合させて、相互作用の動態パラメータを決定した。キメラ３Ｄ３の動態パラメータを図１８Ｂで図示した（ｍ３Ｄ３）。キメラ３Ｄ３の平均ＫＤは２．３５×１０−１０Ｍであった。比較して、キメラ（Ｃ）／ヒト化（Ｈ）の全置換は、非常に類似した動態パラメータを示した。キメラ重鎖とともに発現されたキメラ軽鎖（図１８Ｂでは「ＣＣ」として表示）の平均ＫＤは２．７１×１０−１０Ｍであり、キメラ重鎖とともに発現されたヒト化軽鎖（図１８Ｂでは「ＨＣ」として表示）の平均ＫＤは３．０９×１０−１０Ｍであり、ヒト化重鎖とともに発現されたキメラ軽鎖（図１８Ｂでは「ＣＨ」として表示）の平均ＫＤは５．０５×１０−１０Ｍであり、ヒト化重鎖とともに発現されたヒト化軽鎖（図１８Ｂでは「ＨＨ」として表示）の平均ＫＤは４．３９×１０−１０Ｍであった。分析から、３Ｄ３のヒト化がもとのマウス抗体の結合活性を保存することがわかった。
【０４１７】
ｈ３Ｄ３の生物学的機能をスフェロイド培養試験で評価した（実施例６を参照）。ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞を、５％ＦＢＳの存在下、ｈ３Ｄ３又は非ＫＡＡＧ１結合同位体対照抗体の存在下で培養した。結果（図１８Ｃに図示）は、緩衝液又は非関連ＩｇＧのいずれかを用いた治療は、コンパクトな３−Ｄ構造の形成を阻害しなかったことを示す。対照的に、キメラ３Ｄ３とヒト化３Ｄ３とはどちらも、スフェロイドが形成されるのを防止した。結果を二とおりで示す（左及び右のパネル）。これらの結果は、キメラ３Ｄ３の生物活性がヒト化３Ｄ３で保存されることを示し、ｈ３Ｄ３が同様に挙動することを示唆する。
【０４１８】
［参考文献］
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＫＡＡＧ１（配列番号２）又は配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＫＡＡＧ１変異体と特異的に結合できる、単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体が、ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域と特異的に結合できる、請求項１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸３０からアミノ酸８４の間に位置するドメインと結合する、請求項２記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸１〜３５内に含まれるエピトープと結合できる、請求項１又は２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸３６〜６０内に含まれるエピトープと結合できる、請求項１又は２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸６１〜８４内に含まれるエピトープと結合できる、請求項１又は２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号１６と少なくとも８０％同一である配列、配列番号２０と少なくとも８０％同一である配列、配列番号２４と少なくとも８０％同一である配列、配列番号１０５と少なくとも８０％同一である配列、配列番号１０９と少なくとも８０％同一である配列及び配列番号１２６と少なくとも８０％同一である配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号２８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号２９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記ＣＤＲＬ１配列が、配列番号２７と少なくとも９０％同一である、請求項８記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号２７と１００％同一である、請求項９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号２８と少なくとも９０％同一である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号２８と１００％同一である、請求項１１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号２９と少なくとも９０％同一である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号２９と１００％同一である、請求項１３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前記軽鎖可変領域が、配列番号３３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号３４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号３５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号３３と少なくとも９０％同一である、請求項１５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号３３と１００％同一である、請求項１６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号３４と少なくとも９０％同一である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号３４と１００％同一である、請求項１８記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号３５と少なくとも９０％同一である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号３５と１００％同一である、請求項２０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
前記軽鎖可変領域が、配列番号３９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号４０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号４１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号３９と少なくとも９０％同一である、請求項２２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号３９と１００％同一である、請求項２３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号４０と少なくとも９０％同一である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号４０と１００％同一である、請求項２５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号４１と少なくとも９０％同一である、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号４１と１００％同一である、請求項２７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１５８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１５９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１６０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１５８と少なくとも９０％同一である、請求項２９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１５８と１００％同一である、請求項３０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１５９と少なくとも９０％同一である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１５９と１００％同一である、請求項３２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１６０と少なくとも９０％同一である、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３５】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１６０と１００％同一である、請求項３４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１６４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１６５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１６６と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３７】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１６４と少なくとも９０％同一である、請求項３６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３８】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１６４と１００％同一である、請求項３７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３９】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１６５と少なくとも９０％同一である、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４０】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１６５と１００％同一である、請求項３９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４１】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１６６と少なくとも９０％同一である、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４２】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１６６と１００％同一である、請求項４１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４３】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１７０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１７１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１７２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４４】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１７０と少なくとも９０％同一である、請求項４３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４５】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１７０と１００％同一である、請求項４４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４６】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１７１と少なくとも９０％同一である、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４７】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１７１と１００％同一である、請求項４６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４８】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１７２と少なくとも９０％同一である、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４９】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１７２と１００％同一である、請求項４８記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５０】
前記抗体が、配列番号１８と少なくとも８０％同一である配列、配列番号２２と少なくとも８０％同一である配列、配列番号２６と少なくとも８０％同一である配列、配列番号１３２と少なくとも８０％同一である配列、配列番号１４５と少なくとも８０％同一である配列、及び配列番号１５３と少なくとも８０％同一である配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５１】
前記重鎖可変領域が、配列番号３０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号３１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号３２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５２】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号３０と少なくとも９０％同一である、請求項５１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５３】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号３０と１００％同一である、請求項５２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５４】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号３１と少なくとも９０％同一である、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５５】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号３１と１００％同一である、請求項５４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５６】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号３２と少なくとも９０％同一である、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５７】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号３２と１００％同一である、請求項５６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５８】
前記重鎖可変領域が、配列番号３６と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号３７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号３８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５９】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号３６と少なくとも９０％同一である、請求項５８記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６０】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号３６と１００％同一である、請求項５９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６１】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号３７と少なくとも９０％同一である、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６２】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号３７と１００％同一である、請求項６１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６３】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号３８と少なくとも９０％同一である、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６４】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号３８と１００％同一である、請求項６３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６５】
前記重鎖可変領域が、配列番号４２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号４３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号４４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６６】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号４２と少なくとも９０％同一である、請求項６５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６７】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号４２と１００％同一である、請求項６６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６８】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号４３と少なくとも９０％同一である、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６９】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号４３と１００％同一である、請求項６８記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７０】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号４４と少なくとも９０％同一である、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７１】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号４４と１００％同一である、請求項７０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７２】
前記重鎖可変領域が、配列番号１６１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１６２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列、及び配列番号１６３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７３】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１６１と少なくとも９０％同一である、請求項７２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７４】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１６１と１００％同一である、請求項７３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７５】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１６２と少なくとも９０％同一である、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７６】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１６２と１００％同一である、請求項７５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７７】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１６３と少なくとも９０％同一である、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７８】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１６３と１００％同一である、請求項７７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７９】
前記重鎖可変領域が、配列番号１６７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１６８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列、及び配列番号１６９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８０】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１６６と少なくとも９０％同一である、請求項７９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８１】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１６６と１００％同一である、請求項８０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８２】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１６８と少なくとも９０％同一である、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８３】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１６８と１００％同一である、請求項８２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８４】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１６９と少なくとも９０％同一である、請求項７９〜８３のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８５】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１６９と１００％同一である、請求項８４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８６】
前記重鎖可変領域が、配列番号１７３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１７４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列、及び配列番号１７５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８７】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１７３と少なくとも９０％同一である、請求項８６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８８】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１７３と１００％同一である、請求項８７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８９】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１７４と少なくとも９０％同一である、請求項８７〜８８のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９０】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１７４と１００％同一である、請求項８９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９１】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１７５と少なくとも９０％同一である、請求項８７〜９０のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９２】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１７５と１００％同一である、請求項９１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９３】
（ａ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列；
（ｂ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列、並びに
（ｃ）配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列
からなる群から選択されるＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９４】
前記抗体が、
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、並びに
（ｃ）配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
からなる群から選択されるＣＤＲを有する重鎖可変領域を含む、請求項９３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９５】
前記抗体が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のうちの少なくとも２つのＣＤＲを含む、請求項９３又は９４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９６】
前記抗体が、１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含む、請求項９５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９７】
前記抗体が、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の少なくとも２つのＣＤＲ、及び
（ｂ）ＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２又は１つのＣＤＲＨ３のうちの少なくとも２つのＣＤＲ
を含む、請求項９４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９８】
前記抗体が１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含む、請求項９７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９９】
前記抗体が１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含む、請求項９７又は９８記載の単離された抗体。
【請求項１００】
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、並びに
（ｃ）配列番号８８，配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
からなる群から選択されるＣＤＲを有する重鎖可変領域を含む単離された抗体又は抗原結合フラグメント又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０１】
前記抗体が１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２又は１つのＣＤＲＨ３を含む、請求項１００記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０２】
前記前記抗体が１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含む、請求項１００記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０３】
前記ＣＤＲの少なくとも１つで少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０４】
前記ＣＤＲの少なくとも２つで少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０５】
前記３ＣＤＲ中に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０６】
前記ＣＤＲの少なくとも１つで少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０７】
前記ＣＤＲの少なくとも２つで少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０８】
前記３ＣＤＲ中に少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０９】
ＮＯ．：ＫＡＡＧ１又はＮＯ．：ＫＡＡＧ１の分泌形態、ＫＡＡＧ１の細胞外領域若しくはその変異体と特異的に結合することができる単離された抗体又は抗原結合フラグメントであって、前記抗体が：
（ａ）配列番号１６で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１８で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｂ）配列番号２０で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号２２で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ；
（ｃ）配列番号２４で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号２６で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ；
（ｄ）配列番号１０５で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３２で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｅ）配列番号１０６で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３３で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ
（ｆ）配列番号１０７で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３４で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｇ）配列番号１０８で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５４で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｈ）配列番号１０９で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５３で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｉ）配列番号１１０で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３５で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｊ）配列番号１１１で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３６で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｋ）配列番号１１２で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４９で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｌ）配列番号１１３で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３７で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｍ）配列番号１１４で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４０で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｎ）配列番号１１５で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４１で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｏ）配列番号１１６で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４２で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｐ）配列番号１１７で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３９で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｑ）配列番号１１９で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４３で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｒ）配列番号１２０で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５２で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｓ）配列番号１２１で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４６で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｔ）配列番号１２２で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３８で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｕ）配列番号１２３で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５０で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｖ）配列番号１２４で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４４で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｗ）配列番号１２６で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４５で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｘ）配列番号１２７で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５７で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｙ）配列番号１２８で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５５で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｚ）配列番号１２９において定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５６において定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、又は
（ａａ）配列番号１３０において定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５１において定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ
を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１０】
ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の溶解を誘発できることを特徴とする、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１１】
ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１１０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１２】
ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の拡大を軽減できることを特徴とする、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１３】
ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１１２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１４】
前記ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞がアンカレッジ依存性成長を特徴とする、請求項１１２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１５】
ＫＡＡＧ１発現腫瘍の形成を減少させるかまたは損なうことができることを特徴とする、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１６】
ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１１５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１７】
ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞を含む癌の治療において用いられる、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１８】
ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１１７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１９】
ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞を含む癌の検出において用いられる、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２０】
ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１１９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２１】
前記抗体が定常領域のアミノ酸を含む、請求項１〜１２０のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２２】
前記定常領域の前記アミノ酸がヒト抗体由来である、請求項１２１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２３】
ヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含む、請求項１〜１２２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２４】
前記抗原結合フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又は（Ｆａｂ’）２である、請求項１〜１２３のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２５】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項１〜１２４のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２６】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１２５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２７】
請求項１〜１２６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントと競合できる、単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２８】
前記抗体が検出可能な部分又は細胞傷害性部分と結合する、請求項１〜１２７のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２９】
ＫＡＡＧ１に対して特異的結合できる抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコード化する核酸。
【請求項１３０】
前記抗体が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の死滅を誘発できる、請求項１２９記載の核酸。
【請求項１３１】
前記抗体が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の拡大を軽減することができる、請求項１２９記載の核酸。
【請求項１３２】
前記抗体が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍の形成を減少または損なうことができる、請求項１２９記載の核酸。
【請求項１３３】
（ａ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列；
（ｂ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列、又は
（ｃ）配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列
を含む、軽鎖可変領域をコード化する核酸。
【請求項１３４】
前記軽鎖可変領域が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の少なくとも２つのＣＤＲを含む、請求項１３３記載の核酸。
【請求項１３５】
前記軽鎖可変領域が１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含む、請求項１３４記載の核酸。
【請求項１３６】
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、又は
（ｃ）配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
を含む重鎖可変領域をコード化する核酸。
【請求項１３７】
前記重鎖可変領域が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３の少なくとも２つのＣＤＲを含む、請求項１３６記載の核酸。
【請求項１３８】
前記重鎖可変領域が１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含む、請求項１３７記載の核酸。
【請求項１３９】
少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４０】
前記ＣＤＲの少なくとも２つで少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４１】
前記３ＣＤＲ中に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４２】
前記ＣＤＲの少なくとも１つに少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４３】
前記ＣＤＲのうちの少なくとも２つにおいて少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４４】
前記３ＣＤＲにおいて少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４５】
配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域をコード化する核酸。
【請求項１４６】
配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域をコード化する核酸。
【請求項１４７】
請求項１２９〜１４６のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４８】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１４７記載のベクター。
【請求項１４９】
請求項１２９〜１４６のいずれか１項に記載の核酸を含む、単離された細胞。
【請求項１５０】
前記細胞が、軽鎖可変領域をコード化する核酸及び重鎖可変領域をコード化する核酸を含む、請求項１４９記載の単離された細胞。
【請求項１５１】
前記細胞が、抗体又はその抗原結合フラグメントの発現、構築及び／又は分泌が可能である、請求項１５０記載の単離された細胞。
【請求項１５２】
請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含むか又は発現する、単離された細胞。
【請求項１５３】
前記細胞が軽鎖可変領域をコード化する核酸及び重鎖可変領域をコード化する核酸を含む、請求項１５２記載の単離された細胞。
【請求項１５４】
前記細胞が、抗体又はその抗原結合フラグメントの発現、構築及び／又は分泌が可能である、請求項１５３記載の単離された細胞。
【請求項１５５】
請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント及び薬剤的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５６】
請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントおよび担体を含む組成物。
【請求項１５７】
ＫＡＡＧ１発現細胞を含む癌の治療における、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の単離された抗体の使用。
【請求項１５８】
前記癌が、卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍及び頭頸部腫瘍からなる群から選択される、請求項１５７記載の使用。
【請求項１５９】
前記癌が悪性であることを特徴とする、請求項１５８記載で定義される使用。
【請求項１６０】
ＫＡＡＧ１発現細胞を含む癌の診断における、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の単離された抗体の使用。
【請求項１６１】
前記ＫＡＡＧ１発現細胞がアンカレッジ依存性成長を特徴とする、請求項１６０で定義される使用。
【請求項１６２】
前記癌が、卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍及び頭頸部腫瘍からなる群から選択される、請求項１６０で定義される使用。
【請求項１６３】
前記癌が悪性であることを特徴とする、請求項１６２で定義される使用。
【請求項１６４】
ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の検出における、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の単離された抗体の使用。
【請求項１６５】
ＫＡＡＧ１が、前記ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１６４で定義される使用。
【請求項１６６】
前記腫瘍細胞が、卵巣癌細胞、皮膚癌細胞、腎臓癌細胞、結腸直腸癌細胞、肉腫細胞、白血病細胞、脳腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、食道腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、肺腫瘍細胞及び頭頸部腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項１６４で定義される使用。
【請求項１６７】
前記癌細胞が悪性であることを特徴とする、請求項１６６で定義される使用。
【請求項１６８】
前記癌細胞がアンカレッジ依存性成長を特徴とする、請求項１６６で定義される使用。
【請求項１６９】
ＫＡＡＧ１発現細胞を含む癌を治療する方法であって、必要とする哺乳動物に請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１７０】
前記癌が、卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍及び頭頸部腫瘍からなる群から選択される、請求項１６９記載の方法。
【請求項１７１】
ＫＡＡＧ１発現細胞を含む腫瘍を検出する方法であって、必要とする哺乳動物に請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１７２】
ＫＡＡＧ１が前記ＫＡＡＧ１発現細胞の表面で発現される、請求項１７１記載の方法。
【請求項１７３】
前記癌が、卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍及び頭頸部腫瘍からなる群から選択される、請求項１７２記載の方法。
【請求項１７４】
配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＫＡＡＧ１（配列番号２）又はＫＡＡＧ１変異体を検出する方法であって、ＫＡＡＧ１若しくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞、或いはＫＡＡＧ１若しくはＫＡＡＧ１変異体を含むか又は含むことが疑われる試料を請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の抗体と接触させ、結合を測定することを含む、方法。
【請求項１７５】
前記試料が哺乳動物由来である、請求項１７４記載の方法。
【請求項１７６】
前記哺乳動物が癌を有するか又は癌を有することが疑われる、請求項１７５記載の方法。
【請求項１７７】
前記試料が、前記哺乳動物から得られる血清試料、血漿試料又は血液試料である、請求項１７４〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記試料が前記哺乳動物から得られる組織試料である、請求項１７４〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記試料が細胞培養物又は上清である、請求項１７４記載の方法。
【請求項１８０】
ＫＡＡＧ１又はＫＡＡＧ１変異体に結合した抗体の量を定量化することを含む、請求項１７４〜１７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８１】
請求項１〜１２９のいずか１項に記載の抗体を含むキット。
【請求項１８２】
抗体の産生におけるＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域の使用。
【請求項１８３】
ＫＡＡＧ１はシグナルペプチドが欠失している、請求項１８２で定義される使用。
【請求項１８４】
ＫＡＡＧ１はアミノ酸１〜３０が欠失している、請求項１８２で定義される使用。
【請求項１８５】
配列番号２ＮＯ．：ＮＯ．：ＮＯ．：の少なくとも１０個のアミノ酸を含むエピトープの、癌を診断または治療するための抗体を生成させるための使用。
【請求項１８６】
前記エピトープが、ＫＡＡＧ１の細胞外領域由来である、請求項１８５で定義される使用。
【請求項１８７】
ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成させるための組成物であって、配列番号２のアミノ酸３０〜８４内に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープ及び担体を含む、組成物。
【請求項１８８】
ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成させるための医薬組成物であって、配列番号２のアミノ酸３０〜８４内に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープ及び薬剤的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８９】
ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成させるための方法であって、配列番号２のアミノ酸３０〜８４内に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープを含むポリペプチドを投与することを含み、前記エピトープはＫＡＡＧ１シグナルペプチドが欠失している、方法。
【請求項１９０】
配列番号２のアミノ酸３０〜８４内に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープの、ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成するための使用。
【請求項１９１】
腫瘍の拡大、腫瘍浸潤若しくは腫瘍形成を減少させるため又は腫瘍溶解を誘発するための請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の単離された抗体の使用であって、前記腫瘍がＫＡＡＧ１又はＫＡＡＧ１変異体を発現する、使用。
【請求項１９２】
前記腫瘍が悪性腫瘍である、請求項１９１記載の使用。
【請求項１９３】
前記悪性腫瘍が転移する能力を有する、請求項１９２記載の使用。
【請求項１９４】
前記腫瘍がアンカレッジ依存性成長を特徴とする腫瘍細胞を含む、請求項１９１記載の使用。
【請求項１９５】
腫瘍の拡大、腫瘍浸潤、腫瘍形成を軽減するため又は腫瘍溶解を誘発するための方法であって、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の単離された抗体を必要とする哺乳動物に投与することを含む方法であって、前記腫瘍がＫＡＡＧ１又はＫＡＡＧ１変異体を発現する、方法。
【請求項１９６】
必要とする前記哺乳動物が悪性腫瘍を有する、請求項１９５記載の方法。
【請求項１９７】
前記悪性腫瘍が転移する能力を有する、請求項１９６記載の方法。
【請求項１９８】
ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞の移動又は生存を損なう、配列番号１、配列番号１の１０〜８８４ヌクレオチドのフラグメント及び補体からなる群から選択される核酸の使用。
【請求項１９９】
ＫＡＡＧ１を発現する前記腫瘍細胞が、アンカレッジ依存性成長を特徴とする、請求項１９８で定義される使用。
【請求項１】
ＫＡＡＧ１（配列番号２）又は配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＫＡＡＧ１変異体と特異的に結合できる、単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記抗体が、ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域と特異的に結合できる、請求項１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸３０からアミノ酸８４の間に位置するドメインと結合する、請求項２記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸１〜３５内に含まれるエピトープと結合できる、請求項１又は２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸３６〜６０内に含まれるエピトープと結合できる、請求項１又は２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸６１〜８４内に含まれるエピトープと結合できる、請求項１又は２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号１６と少なくとも８０％同一である配列、配列番号２０と少なくとも８０％同一である配列、配列番号２４と少なくとも８０％同一である配列、配列番号１０５と少なくとも８０％同一である配列、配列番号１０９と少なくとも８０％同一である配列及び配列番号１２６と少なくとも８０％同一である配列からなる群から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号２８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号２９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記ＣＤＲＬ１配列が、配列番号２７と少なくとも９０％同一である、請求項８記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号２７と１００％同一である、請求項９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号２８と少なくとも９０％同一である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号２８と１００％同一である、請求項１１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号２９と少なくとも９０％同一である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号２９と１００％同一である、請求項１３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前記軽鎖可変領域が、配列番号３３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号３４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号３５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号３３と少なくとも９０％同一である、請求項１５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号３３と１００％同一である、請求項１６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号３４と少なくとも９０％同一である、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号３４と１００％同一である、請求項１８記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号３５と少なくとも９０％同一である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号３５と１００％同一である、請求項２０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
前記軽鎖可変領域が、配列番号３９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号４０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号４１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号３９と少なくとも９０％同一である、請求項２２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号３９と１００％同一である、請求項２３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号４０と少なくとも９０％同一である、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号４０と１００％同一である、請求項２５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号４１と少なくとも９０％同一である、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号４１と１００％同一である、請求項２７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１５８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１５９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１６０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１５８と少なくとも９０％同一である、請求項２９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３１】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１５８と１００％同一である、請求項３０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３２】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１５９と少なくとも９０％同一である、請求項２９〜３１のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１５９と１００％同一である、請求項３２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１６０と少なくとも９０％同一である、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３５】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１６０と１００％同一である、請求項３４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３６】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１６４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１６５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１６６と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３７】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１６４と少なくとも９０％同一である、請求項３６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３８】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１６４と１００％同一である、請求項３７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項３９】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１６５と少なくとも９０％同一である、請求項３６〜３８のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４０】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１６５と１００％同一である、請求項３９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４１】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１６６と少なくとも９０％同一である、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４２】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１６６と１００％同一である、請求項４１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４３】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１７０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ１配列、配列番号１７１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ２配列及び配列番号１７２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＬ３配列を含む、請求項７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４４】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１７０と少なくとも９０％同一である、請求項４３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４５】
前記ＣＤＲＬ１配列が配列番号１７０と１００％同一である、請求項４４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４６】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１７１と少なくとも９０％同一である、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４７】
前記ＣＤＲＬ２配列が配列番号１７１と１００％同一である、請求項４６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４８】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１７２と少なくとも９０％同一である、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項４９】
前記ＣＤＲＬ３配列が配列番号１７２と１００％同一である、請求項４８記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５０】
前記抗体が、配列番号１８と少なくとも８０％同一である配列、配列番号２２と少なくとも８０％同一である配列、配列番号２６と少なくとも８０％同一である配列、配列番号１３２と少なくとも８０％同一である配列、配列番号１４５と少なくとも８０％同一である配列、及び配列番号１５３と少なくとも８０％同一である配列からなる群から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１〜４９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５１】
前記重鎖可変領域が、配列番号３０と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号３１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号３２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５２】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号３０と少なくとも９０％同一である、請求項５１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５３】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号３０と１００％同一である、請求項５２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５４】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号３１と少なくとも９０％同一である、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５５】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号３１と１００％同一である、請求項５４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５６】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号３２と少なくとも９０％同一である、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５７】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号３２と１００％同一である、請求項５６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５８】
前記重鎖可変領域が、配列番号３６と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号３７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号３８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項５９】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号３６と少なくとも９０％同一である、請求項５８記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６０】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号３６と１００％同一である、請求項５９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６１】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号３７と少なくとも９０％同一である、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６２】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号３７と１００％同一である、請求項６１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６３】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号３８と少なくとも９０％同一である、請求項５８〜６２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６４】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号３８と１００％同一である、請求項６３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６５】
前記重鎖可変領域が、配列番号４２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号４３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列及び配列番号４４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６６】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号４２と少なくとも９０％同一である、請求項６５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６７】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号４２と１００％同一である、請求項６６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６８】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号４３と少なくとも９０％同一である、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項６９】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号４３と１００％同一である、請求項６８記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７０】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号４４と少なくとも９０％同一である、請求項６５〜６９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７１】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号４４と１００％同一である、請求項７０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７２】
前記重鎖可変領域が、配列番号１６１と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１６２と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列、及び配列番号１６３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７３】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１６１と少なくとも９０％同一である、請求項７２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７４】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１６１と１００％同一である、請求項７３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７５】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１６２と少なくとも９０％同一である、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７６】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１６２と１００％同一である、請求項７５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７７】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１６３と少なくとも９０％同一である、請求項７２〜７６のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７８】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１６３と１００％同一である、請求項７７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項７９】
前記重鎖可変領域が、配列番号１６７と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１６８と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列、及び配列番号１６９と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８０】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１６６と少なくとも９０％同一である、請求項７９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８１】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１６６と１００％同一である、請求項８０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８２】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１６８と少なくとも９０％同一である、請求項７９〜８１のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８３】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１６８と１００％同一である、請求項８２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８４】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１６９と少なくとも９０％同一である、請求項７９〜８３のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８５】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１６９と１００％同一である、請求項８４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８６】
前記重鎖可変領域が、配列番号１７３と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ１配列、配列番号１７４と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ２配列、及び配列番号１７５と少なくとも８０％同一であるＣＤＲＨ３配列を含む、請求項５０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８７】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１７３と少なくとも９０％同一である、請求項８６記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８８】
前記ＣＤＲＨ１配列が配列番号１７３と１００％同一である、請求項８７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項８９】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１７４と少なくとも９０％同一である、請求項８７〜８８のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９０】
前記ＣＤＲＨ２配列が配列番号１７４と１００％同一である、請求項８９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９１】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１７５と少なくとも９０％同一である、請求項８７〜９０のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９２】
前記ＣＤＲＨ３配列が配列番号１７５と１００％同一である、請求項９１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９３】
（ａ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列；
（ｂ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列、並びに
（ｃ）配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列
からなる群から選択されるＣＤＲを有する軽鎖可変領域を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９４】
前記抗体が、
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、並びに
（ｃ）配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
からなる群から選択されるＣＤＲを有する重鎖可変領域を含む、請求項９３記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９５】
前記抗体が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３のうちの少なくとも２つのＣＤＲを含む、請求項９３又は９４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９６】
前記抗体が、１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含む、請求項９５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９７】
前記抗体が、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の少なくとも２つのＣＤＲ、及び
（ｂ）ＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２又は１つのＣＤＲＨ３のうちの少なくとも２つのＣＤＲ
を含む、請求項９４記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９８】
前記抗体が１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含む、請求項９７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項９９】
前記抗体が１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含む、請求項９７又は９８記載の単離された抗体。
【請求項１００】
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、並びに
（ｃ）配列番号８８，配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
からなる群から選択されるＣＤＲを有する重鎖可変領域を含む単離された抗体又は抗原結合フラグメント又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０１】
前記抗体が１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２又は１つのＣＤＲＨ３を含む、請求項１００記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０２】
前記前記抗体が１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含む、請求項１００記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０３】
前記ＣＤＲの少なくとも１つで少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０４】
前記ＣＤＲの少なくとも２つで少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０５】
前記３ＣＤＲ中に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０６】
前記ＣＤＲの少なくとも１つで少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０７】
前記ＣＤＲの少なくとも２つで少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０８】
前記３ＣＤＲ中に少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含む、請求項７〜１０２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１０９】
ＮＯ．：ＫＡＡＧ１又はＮＯ．：ＫＡＡＧ１の分泌形態、ＫＡＡＧ１の細胞外領域若しくはその変異体と特異的に結合することができる単離された抗体又は抗原結合フラグメントであって、前記抗体が：
（ａ）配列番号１６で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１８で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｂ）配列番号２０で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号２２で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ；
（ｃ）配列番号２４で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号２６で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ；
（ｄ）配列番号１０５で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３２で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｅ）配列番号１０６で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３３で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ
（ｆ）配列番号１０７で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３４で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｇ）配列番号１０８で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５４で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｈ）配列番号１０９で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５３で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｉ）配列番号１１０で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３５で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｊ）配列番号１１１で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３６で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｋ）配列番号１１２で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４９で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｌ）配列番号１１３で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３７で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｍ）配列番号１１４で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４０で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｎ）配列番号１１５で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４１で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｏ）配列番号１１６で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４２で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｐ）配列番号１１７で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３９で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｑ）配列番号１１９で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４３で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｒ）配列番号１２０で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５２で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｓ）配列番号１２１で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４６で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｔ）配列番号１２２で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１３８で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｕ）配列番号１２３で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５０で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｖ）配列番号１２４で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４４で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｗ）配列番号１２６で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１４５で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｘ）配列番号１２７で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５７で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｙ）配列番号１２８で定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５５で定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、
（ｚ）配列番号１２９において定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５６において定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ、又は
（ａａ）配列番号１３０において定義される軽鎖可変領域の３ＣＤＲ及び配列番号１５１において定義される重鎖可変領域の３ＣＤＲ
を含む、単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１０】
ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の溶解を誘発できることを特徴とする、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１１】
ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１１０記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１２】
ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の拡大を軽減できることを特徴とする、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１３】
ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１１２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１４】
前記ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞がアンカレッジ依存性成長を特徴とする、請求項１１２記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１５】
ＫＡＡＧ１発現腫瘍の形成を減少させるかまたは損なうことができることを特徴とする、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１６】
ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１１５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１７】
ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞を含む癌の治療において用いられる、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１８】
ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１１７記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１１９】
ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞を含む癌の検出において用いられる、請求項１〜１０９のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２０】
ＫＡＡＧ１が、ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１１９記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２１】
前記抗体が定常領域のアミノ酸を含む、請求項１〜１２０のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２２】
前記定常領域の前記アミノ酸がヒト抗体由来である、請求項１２１記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２３】
ヒト抗体のフレームワークアミノ酸を含む、請求項１〜１２２のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２４】
前記抗原結合フラグメントが、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又は（Ｆａｂ’）２である、請求項１〜１２３のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２５】
前記抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体及びヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントからなる群から選択される、請求項１〜１２４のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２６】
前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項１２５記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２７】
請求項１〜１２６のいずれか１項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントと競合できる、単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２８】
前記抗体が検出可能な部分又は細胞傷害性部分と結合する、請求項１〜１２７のいずれか１項に記載の単離された抗体又は抗原結合フラグメント。
【請求項１２９】
ＫＡＡＧ１に対して特異的結合できる抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域をコード化する核酸。
【請求項１３０】
前記抗体が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の死滅を誘発できる、請求項１２９記載の核酸。
【請求項１３１】
前記抗体が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の拡大を軽減することができる、請求項１２９記載の核酸。
【請求項１３２】
前記抗体が、ＫＡＡＧ１発現腫瘍の形成を減少または損なうことができる、請求項１２９記載の核酸。
【請求項１３３】
（ａ）配列番号７４及び配列番号７５からなる群から選択されるＣＤＲＬ１配列；
（ｂ）配列番号７６、配列番号７７及び配列番号７８からなる群から選択されるＣＤＲＬ２配列、又は
（ｃ）配列番号７９、配列番号８０及び配列番号８１からなる群から選択されるＣＤＲＬ３配列
を含む、軽鎖可変領域をコード化する核酸。
【請求項１３４】
前記軽鎖可変領域が、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２又はＣＤＲＬ３の少なくとも２つのＣＤＲを含む、請求項１３３記載の核酸。
【請求項１３５】
前記軽鎖可変領域が１つのＣＤＲＬ１、１つのＣＤＲＬ２及び１つのＣＤＲＬ３を含む、請求項１３４記載の核酸。
【請求項１３６】
（ａ）配列番号８２を含むＣＤＲＨ１配列；
（ｂ）配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６及び配列番号８７からなる群から選択されるＣＤＲＨ２配列、又は
（ｃ）配列番号８８、配列番号８９及び配列番号９０からなる群から選択されるＣＤＲＨ３配列
を含む重鎖可変領域をコード化する核酸。
【請求項１３７】
前記重鎖可変領域が、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２又はＣＤＲＨ３の少なくとも２つのＣＤＲを含む、請求項１３６記載の核酸。
【請求項１３８】
前記重鎖可変領域が１つのＣＤＲＨ１、１つのＣＤＲＨ２及び１つのＣＤＲＨ３を含む、請求項１３７記載の核酸。
【請求項１３９】
少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４０】
前記ＣＤＲの少なくとも２つで少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４１】
前記３ＣＤＲ中に少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４２】
前記ＣＤＲの少なくとも１つに少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４３】
前記ＣＤＲのうちの少なくとも２つにおいて少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４４】
前記３ＣＤＲにおいて少なくとも２つの保存的アミノ酸置換を含むＣＤＲをコード化する、請求項１３３〜１３８のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４５】
配列番号１６、配列番号２０、配列番号２４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０及び配列番号１３１からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域をコード化する核酸。
【請求項１４６】
配列番号１８、配列番号２２、配列番号２６、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７からなる群から選択される配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する重鎖可変領域をコード化する核酸。
【請求項１４７】
請求項１２９〜１４６のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４８】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１４７記載のベクター。
【請求項１４９】
請求項１２９〜１４６のいずれか１項に記載の核酸を含む、単離された細胞。
【請求項１５０】
前記細胞が、軽鎖可変領域をコード化する核酸及び重鎖可変領域をコード化する核酸を含む、請求項１４９記載の単離された細胞。
【請求項１５１】
前記細胞が、抗体又はその抗原結合フラグメントの発現、構築及び／又は分泌が可能である、請求項１５０記載の単離された細胞。
【請求項１５２】
請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含むか又は発現する、単離された細胞。
【請求項１５３】
前記細胞が軽鎖可変領域をコード化する核酸及び重鎖可変領域をコード化する核酸を含む、請求項１５２記載の単離された細胞。
【請求項１５４】
前記細胞が、抗体又はその抗原結合フラグメントの発現、構築及び／又は分泌が可能である、請求項１５３記載の単離された細胞。
【請求項１５５】
請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメント及び薬剤的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５６】
請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の抗体または抗原結合フラグメントおよび担体を含む組成物。
【請求項１５７】
ＫＡＡＧ１発現細胞を含む癌の治療における、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の単離された抗体の使用。
【請求項１５８】
前記癌が、卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍及び頭頸部腫瘍からなる群から選択される、請求項１５７記載の使用。
【請求項１５９】
前記癌が悪性であることを特徴とする、請求項１５８記載で定義される使用。
【請求項１６０】
ＫＡＡＧ１発現細胞を含む癌の診断における、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の単離された抗体の使用。
【請求項１６１】
前記ＫＡＡＧ１発現細胞がアンカレッジ依存性成長を特徴とする、請求項１６０で定義される使用。
【請求項１６２】
前記癌が、卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍及び頭頸部腫瘍からなる群から選択される、請求項１６０で定義される使用。
【請求項１６３】
前記癌が悪性であることを特徴とする、請求項１６２で定義される使用。
【請求項１６４】
ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の検出における、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の単離された抗体の使用。
【請求項１６５】
ＫＡＡＧ１が、前記ＫＡＡＧ１発現腫瘍細胞の表面で発現される、請求項１６４で定義される使用。
【請求項１６６】
前記腫瘍細胞が、卵巣癌細胞、皮膚癌細胞、腎臓癌細胞、結腸直腸癌細胞、肉腫細胞、白血病細胞、脳腫瘍細胞、甲状腺腫瘍細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、食道腫瘍細胞、膀胱腫瘍細胞、肺腫瘍細胞及び頭頸部腫瘍細胞からなる群から選択される、請求項１６４で定義される使用。
【請求項１６７】
前記癌細胞が悪性であることを特徴とする、請求項１６６で定義される使用。
【請求項１６８】
前記癌細胞がアンカレッジ依存性成長を特徴とする、請求項１６６で定義される使用。
【請求項１６９】
ＫＡＡＧ１発現細胞を含む癌を治療する方法であって、必要とする哺乳動物に請求項１〜２８のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１７０】
前記癌が、卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍及び頭頸部腫瘍からなる群から選択される、請求項１６９記載の方法。
【請求項１７１】
ＫＡＡＧ１発現細胞を含む腫瘍を検出する方法であって、必要とする哺乳動物に請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の抗体を投与することを含む、方法。
【請求項１７２】
ＫＡＡＧ１が前記ＫＡＡＧ１発現細胞の表面で発現される、請求項１７１記載の方法。
【請求項１７３】
前記癌が、卵巣癌、皮膚癌、腎臓癌、結腸直腸癌、肉腫、白血病、脳腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、前立腺癌、食道腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍及び頭頸部腫瘍からなる群から選択される、請求項１７２記載の方法。
【請求項１７４】
配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有するＫＡＡＧ１（配列番号２）又はＫＡＡＧ１変異体を検出する方法であって、ＫＡＡＧ１若しくはＫＡＡＧ１変異体を発現する細胞、或いはＫＡＡＧ１若しくはＫＡＡＧ１変異体を含むか又は含むことが疑われる試料を請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の抗体と接触させ、結合を測定することを含む、方法。
【請求項１７５】
前記試料が哺乳動物由来である、請求項１７４記載の方法。
【請求項１７６】
前記哺乳動物が癌を有するか又は癌を有することが疑われる、請求項１７５記載の方法。
【請求項１７７】
前記試料が、前記哺乳動物から得られる血清試料、血漿試料又は血液試料である、請求項１７４〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７８】
前記試料が前記哺乳動物から得られる組織試料である、請求項１７４〜１７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７９】
前記試料が細胞培養物又は上清である、請求項１７４記載の方法。
【請求項１８０】
ＫＡＡＧ１又はＫＡＡＧ１変異体に結合した抗体の量を定量化することを含む、請求項１７４〜１７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８１】
請求項１〜１２９のいずか１項に記載の抗体を含むキット。
【請求項１８２】
抗体の産生におけるＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域の使用。
【請求項１８３】
ＫＡＡＧ１はシグナルペプチドが欠失している、請求項１８２で定義される使用。
【請求項１８４】
ＫＡＡＧ１はアミノ酸１〜３０が欠失している、請求項１８２で定義される使用。
【請求項１８５】
配列番号２ＮＯ．：ＮＯ．：ＮＯ．：の少なくとも１０個のアミノ酸を含むエピトープの、癌を診断または治療するための抗体を生成させるための使用。
【請求項１８６】
前記エピトープが、ＫＡＡＧ１の細胞外領域由来である、請求項１８５で定義される使用。
【請求項１８７】
ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成させるための組成物であって、配列番号２のアミノ酸３０〜８４内に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープ及び担体を含む、組成物。
【請求項１８８】
ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成させるための医薬組成物であって、配列番号２のアミノ酸３０〜８４内に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープ及び薬剤的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１８９】
ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成させるための方法であって、配列番号２のアミノ酸３０〜８４内に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープを含むポリペプチドを投与することを含み、前記エピトープはＫＡＡＧ１シグナルペプチドが欠失している、方法。
【請求項１９０】
配列番号２のアミノ酸３０〜８４内に含まれるＫＡＡＧ１のエピトープの、ＫＡＡＧ１の分泌された形態又はＫＡＡＧ１の細胞外領域に対する抗体を生成するための使用。
【請求項１９１】
腫瘍の拡大、腫瘍浸潤若しくは腫瘍形成を減少させるため又は腫瘍溶解を誘発するための請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の単離された抗体の使用であって、前記腫瘍がＫＡＡＧ１又はＫＡＡＧ１変異体を発現する、使用。
【請求項１９２】
前記腫瘍が悪性腫瘍である、請求項１９１記載の使用。
【請求項１９３】
前記悪性腫瘍が転移する能力を有する、請求項１９２記載の使用。
【請求項１９４】
前記腫瘍がアンカレッジ依存性成長を特徴とする腫瘍細胞を含む、請求項１９１記載の使用。
【請求項１９５】
腫瘍の拡大、腫瘍浸潤、腫瘍形成を軽減するため又は腫瘍溶解を誘発するための方法であって、請求項１〜１２８のいずれか１項に記載の単離された抗体を必要とする哺乳動物に投与することを含む方法であって、前記腫瘍がＫＡＡＧ１又はＫＡＡＧ１変異体を発現する、方法。
【請求項１９６】
必要とする前記哺乳動物が悪性腫瘍を有する、請求項１９５記載の方法。
【請求項１９７】
前記悪性腫瘍が転移する能力を有する、請求項１９６記載の方法。
【請求項１９８】
ＫＡＡＧ１を発現する腫瘍細胞の移動又は生存を損なう、配列番号１、配列番号１の１０〜８８４ヌクレオチドのフラグメント及び補体からなる群から選択される核酸の使用。
【請求項１９９】
ＫＡＡＧ１を発現する前記腫瘍細胞が、アンカレッジ依存性成長を特徴とする、請求項１９８で定義される使用。
【図１Ｂ】
【図１Ｃａｎｄ１Ｄ】
【図２Ａ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａａｎｄ４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１Ａ】
【図２Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【図１Ｃａｎｄ１Ｄ】
【図２Ａ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａａｎｄ４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１Ａ】
【図２Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ｃ】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７Ａ】
【図１７Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図１９Ｃ】
【図２０Ａ】
【図２０Ｂ】
【図２１Ａ】
【図２１Ｂ】
【公表番号】特表２０１２−５０７２６６（Ｐ２０１２−５０７２６６Ａ）
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５３３５００（Ｐ２０１１−５３３５００）
【出願日】平成２１年１１月３日（２００９．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６０１８６
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（５０７１９６４９１）アレシア・バイオセラピューティクス・インコーポレーテッド (7)
【出願人】（５９５００６２２３）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月３日（２００９．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１５８６
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０６０１８６
【国際公開日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【出願人】（５０７１９６４９１）アレシア・バイオセラピューティクス・インコーポレーテッド (7)
【出願人】（５９５００６２２３）ナショナル リサーチ カウンシル オブ カナダ (25)
【Ｆターム（参考）】
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