遺伝子導入剤及びその製造方法
【課題】ゲル化、側鎖分解等の問題点を解決し、遺伝子導入効率が高く、生体内での代謝性、分解性、及び生体からの排出性に優れた架橋体よりなる遺伝子導入剤を提供する。
【解決手段】芳香環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、複数の分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖の末端はＳＨ基であり、該架橋体は、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士が結合したものであることを特徴とする。前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましい。この遺伝子導入剤を製造する製造方法。
【解決手段】芳香環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、複数の分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖の末端はＳＨ基であり、該架橋体は、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士が結合したものであることを特徴とする。前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることが好ましい。この遺伝子導入剤を製造する製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターが、ＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１,２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【０００４】
本出願人らはまた、特許文献１，２に記載される遺伝子導入剤の遺伝子導入効率を更に向上させたものとして、芳香環を核とし、それから放射状に伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、複数の該分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤を発明した（下記特許文献３）。
【０００５】
この遺伝子導入剤は、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性の分岐鎖が伸延する分岐型重合体同士を架橋させた架橋体よりなる合成高分子ベクターであり、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。即ち、この遺伝子導入剤は、分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、特許文献１，２に記載されるような１個の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【０００６】
特許文献３の遺伝子導入剤を構成する架橋体は、細胞への悪影響が懸念される架橋剤を用いることなく、分岐鎖末端の光開裂性官能基の光開裂で発生するラジカルを利用して分岐鎖同士を架橋して形成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８号公報
【特許文献２】特開２００７−７０５７９号公報
【特許文献３】特開２００８−２８９４６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の如く、特許文献３の遺伝子導入剤は、特許文献１，２の遺伝子導入剤よりも分岐鎖の入り組んだ複雑な構造を有するものとなっているため、この特異的な構造上の効果で遺伝子導入活性がより高いものとなっているが、生体内での代謝性、生体からの排出性に難があり、生体内に残り易いことが考えられる。
【０００９】
本発明は、上記特許文献３に記載される架橋体よりなる遺伝子導入剤をさらに改良し、遺伝子導入効率が高く、生体内での代謝性ないし分解性、生体からの排出性に優れた架橋体よりなる遺伝子導入剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、複数の分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖の末端はＳＨ基であり、該架橋体は、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士が結合したものであることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項３の遺伝導入剤は、請求項２において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項２又は３において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項２ないし４のいずれか１項において、該分岐鎖は１種類のモノマーよりなるホモポリマーであることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項２ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記２種以上のモノマーのランダムコポリマー又はブロックコポリマーであることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記分岐鎖の１本当たりの分子量が、３００〜６，０００であることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記架橋体の分子量が、１，０００〜６０，０００であることを特徴とするものである。
【００１８】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法（請求項９）は、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤を製造する方法であって、芳香環に該芳香環から放射状に伸延する複数の分岐鎖を導入する分岐型重合体製造工程と、得られた分岐型重合体を加水分解することにより該分岐型重合体の分岐鎖の末端をＳＨ基に変換する加水分解工程と、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士を反応させることにより分岐型重合体同士を架橋する架橋工程とを有することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、分岐鎖の末端にＳＨ基を有する複数の分岐型重合体が架橋した架橋体であり、この架橋体は、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士が結合することにより架橋されたものである。
【００２０】
この遺伝子導入剤は、複数の分岐型重合体が架橋することにより、さらに多くの分岐鎖が入り組んだ複雑なネットワーク構造となっており、その構造上の利点によりＤＮＡなどの核酸を高密度に凝集することができる。
【００２１】
また、この遺伝子導入剤は、分岐鎖の末端のＳＨ基同士の反応により形成されるジスルフィド結合（以下「Ｓ−Ｓ結合」と称す場合がある。）により分岐型重合体同士が架橋したものである。このＳ−Ｓ結合は、還元性物質の存在下で解離する不可逆的な結合であるため、本発明の遺伝子導入剤は、生体内に存在するグルタチオン、システイン、アスコルビン酸、ビタミンＥなどの還元性物質により、容易に低分子量体へと分解される。即ち、生体内でＳ−Ｓ結合が解離することにより、遺伝子導入剤に凝集されたＤＮＡなどの核酸が遺伝子導入剤からリリースされやすくなり、遺伝子導入活性が向上する。
【００２２】
また、上述の如く、本発明の遺伝子導入剤は、生体内に存在する還元性物質により、容易に低分子量体へと分解されるため、生体内での代謝性ないしは分解性、生体からの排出性にも優れている。
【００２３】
しかも、本発明の遺伝子導入剤における分岐型重合体同士の架橋は、分岐鎖の末端のＳＨ基同士の自己酸化還元反応によるＳ−Ｓ結合によるものであり、この架橋反応は、温和な条件で、例えば、酸素共存下に室温で放置するだけでも速やかに進行する。また、この架橋反応は、ラジカル反応よりも選択性が高いマイルドな反応であるため、架橋点が分岐鎖の主鎖や側鎖に入り乱れた複雑なネットワークになりにくく、分岐鎖の末端同士が選択的に反応しやすいため、ゲル化が起こりにくい。このため、製造効率に優れ、歩留まりよく製造することができる。
【００２４】
また、上述のように、本発明における架橋反応は、温和な条件で進行させることができ、光照射なども不要であるため分岐型重合体に光照射することによる分岐鎖の分解などを引き起こすこともない。
【００２５】
本発明において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させたものであることが好ましく（請求項２）、このＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合しているものであることが好ましい（請求項３）。
【００２６】
前記ビニル系モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい（請求項４）。
【００２７】
本発明において、前記分岐鎖は１種類のモノマーよりなるホモポリマーであってもよく（請求項５）、２種以上のモノマーのランダムコポリマー又はブロックコポリマーであってもよい（請求項６）。
【００２８】
本発明において、前記分岐鎖の１本当たりの分子量は、３００〜６，０００であることが好ましく（請求項７）、架橋体の分子量は、１，０００〜６０，０００であることが好ましい（請求項８）。
【００２９】
分岐型重合体の分岐鎖１本当たりの分子量、並びに架橋体の分子量が上記範囲内であると、高分子量化を抑えた上でより効率的に遺伝子導入剤と核酸とを複合させて、低分子量で遺伝子導入効率に優れた核酸複合体を得ることができる。
【００３０】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法（請求項９）は、芳香環に該芳香環から放射状に伸延する複数の分岐鎖を導入する分岐型重合体製造工程と、得られた分岐型重合体を加水分解することにより該分岐型重合体の分岐鎖の末端をＳＨ基に変換する加水分解工程と、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士を反応させることにより分岐型重合体同士を架橋する架橋工程とを有することを特徴とするものであり、本発明の遺伝子導入剤を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１、比較例１及び参考例１の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下に、本発明の遺伝子導入剤及びその製造方法の実施の形態を詳細に説明する。
【００３３】
［遺伝子導入剤］
本発明の遺伝導入剤は、芳香環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、複数の分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖の末端はＳＨ基であり、該架橋体は、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士が結合したものであることを特徴とする。
【００３４】
本発明の遺伝子導入剤は、前述の通り、Ｓ−Ｓ結合により分岐型重合体同士が架橋したものであるため、遺伝子導入効率、生体内における代謝性ないしは分解性、生体からの排出性に優れている。
【００３５】
即ち、Ｓ−Ｓ結合は、生体内に存在するグルタチオン、システイン、アスコルビン酸、ビタミンＥなどの還元性物質により分解されやすいため、本発明の遺伝子導入剤は、核酸を包蔵した核酸複合体として生体内に導入された後、これらの生体内に存在する還元性物質により分解され、その際に、包蔵した核酸を容易に放出する。このため、遺伝子導入剤に凝集されたＤＮＡなどの核酸が遺伝子導入剤からリリースされやすい。
【００３６】
このような本発明の遺伝子導入剤を製造する方法に特に制限はないが、芳香環に該芳香環から放射状に伸延する複数の分岐鎖を導入する分岐型重合体製造工程と、得られた分岐型重合体を加水分解することにより該分岐型重合体の分岐鎖の末端をＳＨ基に変換する加水分解工程と、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士を反応させることにより分岐型重合体同士を架橋する架橋工程とを有する本発明の遺伝子導入剤の製造方法により製造することが好ましい。
【００３７】
以下に、本発明の遺伝子導入剤を、本発明の遺伝子導入剤の製造方法により製造する場合の製造手順に従って説明するが、本発明の遺伝子導入剤の製造方法は、何ら以下の方法に限定されるものではない。
【００３８】
＜分岐型重合体製造工程＞
本発明において用いる分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターにビニル系モノマーを光照射リビング重合させたものが好ましい。
【００３９】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００４０】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００４１】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００４２】
このイニファターの芳香環に対して放射状に伸延する複数の分岐鎖を導入するには、このイニファターにビニル系モノマーを光照射リビング重合させることが好ましい。
【００４３】
この場合、イニファターに重合させるビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられ、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４４】
イニファターと上記ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しビニル系モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００４５】
該原料溶液中のビニル系モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。
【００４６】
照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適であり、例えばショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜９０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１〜６０分程度が特に好適である。
【００４７】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分に同一のビニル系モノマーよりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるホモポリマーを得る。
【００４８】
この分岐型重合体の分岐鎖の１本当たりの分子量としては、３００〜６，０００程度、特に１，０００〜２，０００程度が好ましく、分岐型重合体の分子量は、分岐鎖の鎖数にもよるが、１，０００〜６０，０００程度、特に５，０００〜３０，０００程度が好ましい。
【００４９】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００５０】
本発明に係る分岐型重合体の分岐鎖は、前述のカチオン性ビニル系モノマーの１種のみからなるホモポリマーであってもよく、２種以上のモノマーを導入したブロックコポリマー又はランダムコポリマーであってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、ホモポリマーの合成に用いたビニル系モノマーとは異なるビニル系モノマー、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。具体的には、上記イニファターに対し、まずＮ−イソプロピルアクリルアミドをブロック重合させて、ホモポリマーを形成し、その後、このホモポリマーに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをブロック重合させ、分岐鎖の基端側をＮ−イソプロピルアクリルアミドのブロックポリマー、分岐鎖の先端側を３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのブロックポリマーで構成した分岐鎖としてもよい。このように、分岐鎖を２種類以上のモノマーのブロックコポリマーとする場合、イニファターに対する重合の順序は任意である。いずれの場合も分岐鎖の末端は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基となる。
【００５１】
＜加水分解工程＞
上記の分岐型重合体製造工程で得られた分岐型重合体を加水分解することにより、該分岐型重合体の分岐鎖の末端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基をＳＨ基に変換する。
【００５２】
この分岐型重合体の加水分解は、アルカリ条件下における一般的な方法により行うことができる。例えば、分岐型重合体を水に溶かして０．１〜１０．０重量％程度の濃度の水溶液とし、１〜４Ｍ程度の濃度の水酸化ナトリウム水溶液で、この分岐型重合体溶液をｐＨ＝８以上のアリカリ性とし、６０℃〜１００℃に加温して１〜２４時間攪拌することで行える。この加水分解後には、必要に応じて脱離したチオカルバメート化合物を除去するための精製を行うことも可能であり、例えば、前記加水分解処理後の水溶液を透析チューブへ封入し、０．１〜４Ｍ程度の濃度の水酸化ナトリウム水溶液で１〜３日間程度透析を行い、次いで、１〜３日間程度、水により透析を行った後、透析液を濾過し、得られた重合体を凍結乾燥することにより目的とする分岐型重合体を得ることができる。
【００５３】
なお、この加水分解工程において、一部の分岐型重合体が加水分解と共にＳＨ基同士の架橋反応を起こす場合もある。
【００５４】
＜架橋工程＞
上述の加水分解工程で得られた分岐型重合体のＳＨ基を反応させることにより、複数の分岐型重合体同士を架橋する。この架橋方法としては、分岐鎖末端のＳＨ基同士の自己酸化還元反応による架橋が好ましい。
【００５５】
上述の分岐型重合体の分岐鎖末端のＳＨ基は、酸素、過酸化水素などの酸化剤によって酸化されやすいため容易にＳ−Ｓ結合を形成する。従って、上記分岐型重合体を含む溶液を調製し、これを空気中でゆるやかに撹拌するなどして反応させることにより目的とする架橋体を容易に得ることができる。
【００５６】
この架橋工程において用いる溶媒としては、メタノール、エタノール等のアルコール、やクロロホルム、ベンゼンなど化学的に安定な溶媒が好ましく、分岐型重合体を含む溶液の分岐型重合体の濃度としては、１〜１０％程度が好ましい。この反応時間としては１〜２４時間程度が好ましい。
【００５７】
この架橋反応は、光照射により発生するラジカルを用いたラジカル反応ではないため、側鎖や主鎖を介した架橋を伴う複雑なネットワーク構造が形成されにくく、分岐鎖末端同士が結合した２量体や３量体を得やすい。また、光照射を行う反応ではないため、光照射により生じるアミノ基の酸化による着色などの変質が起こらず、分岐鎖（例えば、ジメチルアミノ基）が光酸化反応からも保護され、品質の良い遺伝子導入剤を得ることができる。
【００５８】
このような製造方法により得ることができる架橋体（本発明の遺伝子導入剤）の分子量としては、１，０００〜６０，０００程度、特に１０，０００〜５０，０００程度が好ましい。
【００５９】
この架橋体の分子量は、架橋工程の反応時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、架橋反応を進行させて分子量の大きい架橋体を得ることができる。なお、１本当たりの分岐鎖の分子量は、加水分解により加水分解前の分岐鎖の分子量よりも若干小さくなり、通常３００〜６，０００程度、好ましくは１，０００〜２，０００程度となる。
【００６０】
［核酸複合体］
上記の本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００６１】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００６２】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００６３】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００６４】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００６５】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００６６】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６７】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６８】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００６９】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００７０】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００７１】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００７２】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００７３】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００７４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００７５】
［遺伝子導入剤の合成］
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００７６】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノールへ投入して３０分間撹拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ結晶を濾別後、大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００７７】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００７８】
【化１】
【００７９】
ii)４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス[(Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル)−ポリ−(３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)−メチル]ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００８０】
即ち、上記i)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０〜４００ｎｍの混合紫外線を２５分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型重合体ｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率３２％）。得られた分岐型重合体の分岐鎖１本当たりの分子量は、ポリエチレングリコール換算のＧＰＣにより約７，５００であり、分岐型重合体の分子量は、３０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５）と測定された。
【００８１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００８２】
【化２】
【００８３】
iii)４分岐型スター型重合体の分岐鎖末端の光解裂性官能基の加水分解処理
上記ii)で合成した４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマー２．０ｇを１００ｍＬの水に溶解した。溶液はｐＨ＝約９のアルカリ性を呈した。この溶液を滅菌瓶へ移し、１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌処置した。放冷後、透析チューブへ封入し、０．１Ｎ水酸化ナトリム溶液で３日間透析を行った後、脱塩水で３日間透析を行った。透析した溶液を０．２μｍフィルターで濾過後、凍結乾燥して分岐鎖末端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を加水分解処理した４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを得た。
【００８４】
【化３】
【００８５】
得られた４分岐型スター型重合体の水溶液の紫外可視吸収スペクトルを分光光度計で測定すると、加水分解前に確認されたジチオカルバメート基に由来するλｍａｘ＝２７８ｎｍの吸収がほぼ消失していた。この結果から、分岐鎖末端のジチオカルバメート基が加水分解によりＳＨ基に変換されたと考えられる。
【００８６】
次いで、分岐鎖末端がＳＨ基に変換されていることを、加水分解処理した４分岐型スター型重合体と５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）との反応により確認した。
即ち、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）およびトリエチルアミンを、ＤＭＦ／水＝５０／５０（Ｖ／Ｖ）の混合溶媒に溶解し、この溶液と、前記加水分解処理した４分岐型スター型重合体の水溶液とを混合したところ、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のＳ−Ｓ結合が還元されて生成する５−チオ（２−ニトロ安息香酸）イオンの強い発色（λｍａｘ＝４９５ｎｍ）が確認された。この結果より、加水分解処理した４分岐型スター型重合体の分岐鎖の末端のジチオカルバメート基はＳＨ基となっていることが示唆された。
【００８７】
加水分解後の４分岐型スター型重合体の分子量は、ポリエチレングリコール換算のＧＰＣにより、３２，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６）と測定され、分子量の増大と分子量分布のブロード化が認められた。ジチオカルバメート基の脱離（ＳＨ基への加水分解）により、４分岐型スター型重合体の分子量は、減少することが予想されたが、実際の分子量は増大していた。これは、加水分解処理した４分岐型スター型重合体の分岐鎖末端のＳＨ基同士が、一部透析精製中に反応し、２量体、３量体またはオリゴマーとなったためであると考えられる。
【００８８】
iv）分岐鎖末端をＳＨ基に変換した４分岐型スター型重合体同士の架橋
上記iii)で合成した分岐鎖の末端にＳＨ基を有する４分岐型スター型重合体０．２ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へ入れ、３．０ｇのメタノールへ溶解し、開放系（容器内が空気と交換できるようにして）で回転子で緩やかに攪拌した。メタノール溶液中のポリマーの分子量は経時的に増加し、攪拌開始から１２０分後の分子量は３６，０００であり、２４０分後の分子量は、４０，０００であったが、不溶性の成分は形成されなかった。ゲル成分が確認されなかったのは、分岐鎖の末端同士でＳ−Ｓ結合が形成されて２量体、３量体またはオリゴマーが生成しているものと考えられる。
【００８９】
【化４】
【００９０】
v)４分岐型スター型重合体からなる架橋体の解離試験
上記iv）で合成した４分岐型スター型重合体の架橋体（反応時間２４０分、分子量Ｍｎ＝４０，０００の架橋体）のメタノール溶液へ１００ｍＭジチオスレイトール溶液を加えて窒素雰囲気下で６０分攪拌した。６０分撹拌後の分子量はポリエチレングリコール換算のＧＰＣにより２９，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６）と測定された。この結果より、架橋体が架橋前の４分岐型スター型重合体の単量体の状態に戻ったことがわかる。これは、ジチオスレイトールにより分岐型重合体間のＳ−Ｓ結合が還元され、架橋体同士が解離した結果であると考えられる。即ち、この架橋体は、生体内おいても還元性物質の存在下であれば、架橋体のＳ−Ｓ結合が解離し、低分子量体になることがわかる。
【００９１】
vi）遺伝子導入活性
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【００９２】
遺伝子導入剤としては、上記iv）において、反応時間２４０分で得られた分子量が４０，０００の架橋体を実施例１の遺伝子導入剤とし、上記ii)で合成した４分岐型スター型重合体を比較例１の遺伝子導入剤とし、上記v)において実施例１の遺伝子導入剤の架橋体を再解離した４分岐型スター型重合体を参考例１の遺伝子導入剤として使用した。
【００９３】
遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はカチオン性ポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【００９４】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。３時間の培養の後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し、ＰＢＳで洗浄した後に完全培地を加えてさらに４８時間培養を行った。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。
【００９５】
［考察］
図１より、実施例１の遺伝子導入剤の遺伝子導入活性が、比較例１及び参考例１の遺伝子導入剤の遺伝子導入活性に比べて高いことが分かる。これは、実施例１の遺伝子導入剤が、複数の分岐型重合体同士の架橋による複雑なネットワーク構造を有しているためであると考えられる。実施例１の遺伝子導入剤をジチオスレイトールで処理を行った参考例１の遺伝子導入剤は、実施例１の遺伝子導入剤のＳ−Ｓ結合が解離したものであると考えられるため、架橋構造の構造的優位性を失い、架橋前の４分岐型スター型重合体である比較例１の遺伝子導入剤と同程度の活性しか示さなかったと考えられる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子導入剤及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
安全性、品質安定性、製造コストに問題があるウイルスベクターに代わる遺伝子導入技術として、合成高分子ベクター、カチオン性脂質ベクターが研究開発されている。
【０００３】
本出願人らは、合成高分子ベクターとして、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性ポリマー鎖が放射状に伸延する分岐構造のベクターが、ＤＮＡを高密度で凝縮させて小さな核酸複合体微粒子を形成させ、効率良く細胞へ遺伝子導入できることを発明した（下記特許文献１,２）。この複合体微粒子が細胞膜を透過するメカニズムとしては、カチオン性ポリマー鎖による陽電荷が細胞膜表面の陰電荷と静電的に結合しエンドサイトーシスにより細胞内へ取り込まれる作用に大きく依存していると考えられる。
【０００４】
本出願人らはまた、特許文献１，２に記載される遺伝子導入剤の遺伝子導入効率を更に向上させたものとして、芳香環を核とし、それから放射状に伸延したカチオン性の複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、複数の該分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤を発明した（下記特許文献３）。
【０００５】
この遺伝子導入剤は、ベンゼンなどの芳香環を核としてカチオン性の分岐鎖が伸延する分岐型重合体同士を架橋させた架橋体よりなる合成高分子ベクターであり、その構造上の利点により、ＤＮＡなどの核酸を高密度に凝縮することができる。即ち、この遺伝子導入剤は、分岐型重合体が複数個架橋したものであるため、特許文献１，２に記載されるような１個の分岐型重合体よりなる遺伝子導入剤に比べてＤＮＡなどの核酸をより広いネットワークで包蔵することができ、優れた遺伝子導入活性を示すようになる。
【０００６】
特許文献３の遺伝子導入剤を構成する架橋体は、細胞への悪影響が懸念される架橋剤を用いることなく、分岐鎖末端の光開裂性官能基の光開裂で発生するラジカルを利用して分岐鎖同士を架橋して形成される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０９２３８８号公報
【特許文献２】特開２００７−７０５７９号公報
【特許文献３】特開２００８−２８９４６８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述の如く、特許文献３の遺伝子導入剤は、特許文献１，２の遺伝子導入剤よりも分岐鎖の入り組んだ複雑な構造を有するものとなっているため、この特異的な構造上の効果で遺伝子導入活性がより高いものとなっているが、生体内での代謝性、生体からの排出性に難があり、生体内に残り易いことが考えられる。
【０００９】
本発明は、上記特許文献３に記載される架橋体よりなる遺伝子導入剤をさらに改良し、遺伝子導入効率が高く、生体内での代謝性ないし分解性、生体からの排出性に優れた架橋体よりなる遺伝子導入剤及びその製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、芳香環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、複数の分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖の末端はＳＨ基であり、該架橋体は、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士が結合したものであることを特徴とするものである。
【００１１】
請求項２の遺伝子導入剤は、請求項１において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とするものである。
【００１２】
請求項３の遺伝導入剤は、請求項２において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とするものである。
【００１３】
請求項４の遺伝子導入剤は、請求項２又は３において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とするものである。
【００１４】
請求項５の遺伝子導入剤は、請求項２ないし４のいずれか１項において、該分岐鎖は１種類のモノマーよりなるホモポリマーであることを特徴とするものである。
【００１５】
請求項６の遺伝子導入剤は、請求項２ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記２種以上のモノマーのランダムコポリマー又はブロックコポリマーであることを特徴とするものである。
【００１６】
請求項７の遺伝子導入剤は、請求項１ないし６のいずれか１項において、前記分岐鎖の１本当たりの分子量が、３００〜６，０００であることを特徴とするものである。
【００１７】
請求項８の遺伝子導入剤は、請求項１ないし７のいずれか１項において、前記架橋体の分子量が、１，０００〜６０，０００であることを特徴とするものである。
【００１８】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法（請求項９）は、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤を製造する方法であって、芳香環に該芳香環から放射状に伸延する複数の分岐鎖を導入する分岐型重合体製造工程と、得られた分岐型重合体を加水分解することにより該分岐型重合体の分岐鎖の末端をＳＨ基に変換する加水分解工程と、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士を反応させることにより分岐型重合体同士を架橋する架橋工程とを有することを特徴とするものである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明（請求項１）の遺伝子導入剤は、分岐鎖の末端にＳＨ基を有する複数の分岐型重合体が架橋した架橋体であり、この架橋体は、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士が結合することにより架橋されたものである。
【００２０】
この遺伝子導入剤は、複数の分岐型重合体が架橋することにより、さらに多くの分岐鎖が入り組んだ複雑なネットワーク構造となっており、その構造上の利点によりＤＮＡなどの核酸を高密度に凝集することができる。
【００２１】
また、この遺伝子導入剤は、分岐鎖の末端のＳＨ基同士の反応により形成されるジスルフィド結合（以下「Ｓ−Ｓ結合」と称す場合がある。）により分岐型重合体同士が架橋したものである。このＳ−Ｓ結合は、還元性物質の存在下で解離する不可逆的な結合であるため、本発明の遺伝子導入剤は、生体内に存在するグルタチオン、システイン、アスコルビン酸、ビタミンＥなどの還元性物質により、容易に低分子量体へと分解される。即ち、生体内でＳ−Ｓ結合が解離することにより、遺伝子導入剤に凝集されたＤＮＡなどの核酸が遺伝子導入剤からリリースされやすくなり、遺伝子導入活性が向上する。
【００２２】
また、上述の如く、本発明の遺伝子導入剤は、生体内に存在する還元性物質により、容易に低分子量体へと分解されるため、生体内での代謝性ないしは分解性、生体からの排出性にも優れている。
【００２３】
しかも、本発明の遺伝子導入剤における分岐型重合体同士の架橋は、分岐鎖の末端のＳＨ基同士の自己酸化還元反応によるＳ−Ｓ結合によるものであり、この架橋反応は、温和な条件で、例えば、酸素共存下に室温で放置するだけでも速やかに進行する。また、この架橋反応は、ラジカル反応よりも選択性が高いマイルドな反応であるため、架橋点が分岐鎖の主鎖や側鎖に入り乱れた複雑なネットワークになりにくく、分岐鎖の末端同士が選択的に反応しやすいため、ゲル化が起こりにくい。このため、製造効率に優れ、歩留まりよく製造することができる。
【００２４】
また、上述のように、本発明における架橋反応は、温和な条件で進行させることができ、光照射なども不要であるため分岐型重合体に光照射することによる分岐鎖の分解などを引き起こすこともない。
【００２５】
本発明において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させたものであることが好ましく（請求項２）、このＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合しているものであることが好ましい（請求項３）。
【００２６】
前記ビニル系モノマーとしては、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることが好ましい（請求項４）。
【００２７】
本発明において、前記分岐鎖は１種類のモノマーよりなるホモポリマーであってもよく（請求項５）、２種以上のモノマーのランダムコポリマー又はブロックコポリマーであってもよい（請求項６）。
【００２８】
本発明において、前記分岐鎖の１本当たりの分子量は、３００〜６，０００であることが好ましく（請求項７）、架橋体の分子量は、１，０００〜６０，０００であることが好ましい（請求項８）。
【００２９】
分岐型重合体の分岐鎖１本当たりの分子量、並びに架橋体の分子量が上記範囲内であると、高分子量化を抑えた上でより効率的に遺伝子導入剤と核酸とを複合させて、低分子量で遺伝子導入効率に優れた核酸複合体を得ることができる。
【００３０】
本発明の遺伝子導入剤の製造方法（請求項９）は、芳香環に該芳香環から放射状に伸延する複数の分岐鎖を導入する分岐型重合体製造工程と、得られた分岐型重合体を加水分解することにより該分岐型重合体の分岐鎖の末端をＳＨ基に変換する加水分解工程と、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士を反応させることにより分岐型重合体同士を架橋する架橋工程とを有することを特徴とするものであり、本発明の遺伝子導入剤を効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】実施例１、比較例１及び参考例１の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下に、本発明の遺伝子導入剤及びその製造方法の実施の形態を詳細に説明する。
【００３３】
［遺伝子導入剤］
本発明の遺伝導入剤は、芳香環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、複数の分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤において、該分岐鎖の末端はＳＨ基であり、該架橋体は、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士が結合したものであることを特徴とする。
【００３４】
本発明の遺伝子導入剤は、前述の通り、Ｓ−Ｓ結合により分岐型重合体同士が架橋したものであるため、遺伝子導入効率、生体内における代謝性ないしは分解性、生体からの排出性に優れている。
【００３５】
即ち、Ｓ−Ｓ結合は、生体内に存在するグルタチオン、システイン、アスコルビン酸、ビタミンＥなどの還元性物質により分解されやすいため、本発明の遺伝子導入剤は、核酸を包蔵した核酸複合体として生体内に導入された後、これらの生体内に存在する還元性物質により分解され、その際に、包蔵した核酸を容易に放出する。このため、遺伝子導入剤に凝集されたＤＮＡなどの核酸が遺伝子導入剤からリリースされやすい。
【００３６】
このような本発明の遺伝子導入剤を製造する方法に特に制限はないが、芳香環に該芳香環から放射状に伸延する複数の分岐鎖を導入する分岐型重合体製造工程と、得られた分岐型重合体を加水分解することにより該分岐型重合体の分岐鎖の末端をＳＨ基に変換する加水分解工程と、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士を反応させることにより分岐型重合体同士を架橋する架橋工程とを有する本発明の遺伝子導入剤の製造方法により製造することが好ましい。
【００３７】
以下に、本発明の遺伝子導入剤を、本発明の遺伝子導入剤の製造方法により製造する場合の製造手順に従って説明するが、本発明の遺伝子導入剤の製造方法は、何ら以下の方法に限定されるものではない。
【００３８】
＜分岐型重合体製造工程＞
本発明において用いる分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、このイニファターにビニル系モノマーを光照射リビング重合させたものが好ましい。
【００３９】
イニファターとなるＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する芳香族化合物としては、ベンゼン環に該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基、好ましくはＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基が３個以上分岐鎖として結合しているものが好適であり、具体的には次が例示される。即ち、３分岐鎖化合物としては、１，３，５−トリ（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，３，５−トリ（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、４分岐鎖化合物としては、１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られる１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンであり、６分岐鎖化合物としては、ヘキサキス（ブロモメチル）ベンゼンとＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミン酸ナトリウム（ナトリウムＮ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバメート）とをエタノール中で付加反応させて得られるヘキサキス（Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル）ベンゼンが挙げられる。なお、ここで、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に含まれるジアルキル部分のアルキル基としては、エチル基等の炭素数２〜１８個のアルキル基が好ましいが、アルキル基に限らず、フェニル基など芳香族系の炭化水素基であっても構わない。即ち、Ｎ，Ｎ−ジアルキルジチオカルバミルメチル基に限らず、Ｎ，Ｎ−ジアリールジチオカルバミルメチル基等を含む、脂肪族炭化水素基及び／又は芳香族炭化水素基で置換されたＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であれば目的を達成することができる。
【００４０】
上記のイニファターは、アルコール等の極性溶媒に対しては殆ど不溶であるが、非極性溶媒には易溶である。この非極性溶媒としては炭化水素、ハロゲン化アルキル又はハロゲン化アルキレンが好適であり、特に、ベンゼン、トルエン、クロロホルム又は塩化メチレン特にトルエンが好適である。
【００４１】
なお、本明細書において、イニファターとは、光照射によりラジカルを発生させる重合開始剤、連鎖移動剤としての機能と共に、成長末端と結合して成長を停止する機能、さらに光照射が停止すると重合を停止させる重合開始・重合停止剤として機能する分子のことである。
【００４２】
このイニファターの芳香環に対して放射状に伸延する複数の分岐鎖を導入するには、このイニファターにビニル系モノマーを光照射リビング重合させることが好ましい。
【００４３】
この場合、イニファターに重合させるビニル系モノマーとしては、アクリル酸誘導体、スチレン誘導体等のビニル系モノマーが好適であり、具体的には３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、４−Ｎ，Ｎ-ジメチルアミノスチレン、及び４−アミノスチレンの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられ、特に、耐加水分解性に優れることから、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドＣＨ２＝ＣＨＣＯＮＨＣ３Ｈ６Ｎ（ＣＨ３）２、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート等のカチオン性ビニル系モノマーが好ましい。これらのビニル系モノマーは１種を単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。
【００４４】
イニファターと上記ビニル系モノマーとを反応させるには、イニファター及びビニル系モノマーを含んでなる原料溶液を調製し、これに光照射することによって、イニファターに対しビニル系モノマーが結合した反応生成物を生成させる。
【００４５】
該原料溶液中のビニル系モノマーの濃度は０．５Ｍ以上、例えば０．５Ｍ〜２．５Ｍが好適であり、イニファターの濃度は１〜２０ｍＭ程度が好適である。
【００４６】
照射する光の波長は２５０〜４００ｎｍが好適であり、例えばショートアークキセノンランプ、低圧水銀灯、高圧水銀灯などを用いることができる。光の照射時間は照射強度にも依存するが、１〜９０分程度が好適であり、１μＷ／ｃｍ２〜１０ｍＷ／ｃｍ２程度の低い照射強度で１〜６０分程度が特に好適である。
【００４７】
この光照射により、反応液中に目的とする分岐型重合体が生成するので、必要に応じ精製することにより、分岐鎖部分に同一のビニル系モノマーよりなるポリマー鎖が導入され、分岐鎖の末端がＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基であるホモポリマーを得る。
【００４８】
この分岐型重合体の分岐鎖の１本当たりの分子量としては、３００〜６，０００程度、特に１，０００〜２，０００程度が好ましく、分岐型重合体の分子量は、分岐鎖の鎖数にもよるが、１，０００〜６０，０００程度、特に５，０００〜３０，０００程度が好ましい。
【００４９】
なお、本明細書において、分子量とは、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）によるポリエチレングリコール換算の数平均分子量をさす。
【００５０】
本発明に係る分岐型重合体の分岐鎖は、前述のカチオン性ビニル系モノマーの１種のみからなるホモポリマーであってもよく、２種以上のモノマーを導入したブロックコポリマー又はランダムコポリマーであってもよい。例えば、上記ホモポリマーに対し、ホモポリマーの合成に用いたビニル系モノマーとは異なるビニル系モノマー、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレートなどを導入してもよい。具体的には、上記イニファターに対し、まずＮ−イソプロピルアクリルアミドをブロック重合させて、ホモポリマーを形成し、その後、このホモポリマーに３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをブロック重合させ、分岐鎖の基端側をＮ−イソプロピルアクリルアミドのブロックポリマー、分岐鎖の先端側を３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドのブロックポリマーで構成した分岐鎖としてもよい。このように、分岐鎖を２種類以上のモノマーのブロックコポリマーとする場合、イニファターに対する重合の順序は任意である。いずれの場合も分岐鎖の末端は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基となる。
【００５１】
＜加水分解工程＞
上記の分岐型重合体製造工程で得られた分岐型重合体を加水分解することにより、該分岐型重合体の分岐鎖の末端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基をＳＨ基に変換する。
【００５２】
この分岐型重合体の加水分解は、アルカリ条件下における一般的な方法により行うことができる。例えば、分岐型重合体を水に溶かして０．１〜１０．０重量％程度の濃度の水溶液とし、１〜４Ｍ程度の濃度の水酸化ナトリウム水溶液で、この分岐型重合体溶液をｐＨ＝８以上のアリカリ性とし、６０℃〜１００℃に加温して１〜２４時間攪拌することで行える。この加水分解後には、必要に応じて脱離したチオカルバメート化合物を除去するための精製を行うことも可能であり、例えば、前記加水分解処理後の水溶液を透析チューブへ封入し、０．１〜４Ｍ程度の濃度の水酸化ナトリウム水溶液で１〜３日間程度透析を行い、次いで、１〜３日間程度、水により透析を行った後、透析液を濾過し、得られた重合体を凍結乾燥することにより目的とする分岐型重合体を得ることができる。
【００５３】
なお、この加水分解工程において、一部の分岐型重合体が加水分解と共にＳＨ基同士の架橋反応を起こす場合もある。
【００５４】
＜架橋工程＞
上述の加水分解工程で得られた分岐型重合体のＳＨ基を反応させることにより、複数の分岐型重合体同士を架橋する。この架橋方法としては、分岐鎖末端のＳＨ基同士の自己酸化還元反応による架橋が好ましい。
【００５５】
上述の分岐型重合体の分岐鎖末端のＳＨ基は、酸素、過酸化水素などの酸化剤によって酸化されやすいため容易にＳ−Ｓ結合を形成する。従って、上記分岐型重合体を含む溶液を調製し、これを空気中でゆるやかに撹拌するなどして反応させることにより目的とする架橋体を容易に得ることができる。
【００５６】
この架橋工程において用いる溶媒としては、メタノール、エタノール等のアルコール、やクロロホルム、ベンゼンなど化学的に安定な溶媒が好ましく、分岐型重合体を含む溶液の分岐型重合体の濃度としては、１〜１０％程度が好ましい。この反応時間としては１〜２４時間程度が好ましい。
【００５７】
この架橋反応は、光照射により発生するラジカルを用いたラジカル反応ではないため、側鎖や主鎖を介した架橋を伴う複雑なネットワーク構造が形成されにくく、分岐鎖末端同士が結合した２量体や３量体を得やすい。また、光照射を行う反応ではないため、光照射により生じるアミノ基の酸化による着色などの変質が起こらず、分岐鎖（例えば、ジメチルアミノ基）が光酸化反応からも保護され、品質の良い遺伝子導入剤を得ることができる。
【００５８】
このような製造方法により得ることができる架橋体（本発明の遺伝子導入剤）の分子量としては、１，０００〜６０，０００程度、特に１０，０００〜５０，０００程度が好ましい。
【００５９】
この架橋体の分子量は、架橋工程の反応時間を制御することにより調整することができる。即ち、反応時間を長くすることにより、架橋反応を進行させて分子量の大きい架橋体を得ることができる。なお、１本当たりの分岐鎖の分子量は、加水分解により加水分解前の分岐鎖の分子量よりも若干小さくなり、通常３００〜６，０００程度、好ましくは１，０００〜２，０００程度となる。
【００６０】
［核酸複合体］
上記の本発明の遺伝子導入剤（ベクター）が核酸を核酸含有複合体として包囲することによって、生体内の酵素による核酸の失活、分解を抑制することができる。
【００６１】
上記遺伝子導入剤と核酸とを複合させるには、遺伝子導入剤の濃度１〜１０００μｇ／ｍＬ程度の溶液に対し、核酸を添加し、混合すればよい。核酸に対して遺伝子導入剤を過剰量添加し、遺伝子導入剤中のカチオン性ポリマーを核酸に対し飽和状態に核酸含有複合体として複合化させるのが好ましい。
【００６２】
核酸の好ましい例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ１−ＴＫ遺伝子），ｐ５３癌抑制遺伝子及びＢＲＣＡ１癌抑制遺伝子やサイトカイン遺伝子としてＴＮＦ−α遺伝子，ＩＬ−２遺伝子，ＩＬ−４遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／ＩＬ−２遺伝子，ＨＬＡ−Ｂ７／Ｂ２Ｍ遺伝子，ＩＬ−７遺伝子，ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子，ＩＦＮ−γ遺伝子及びＩＬ−１２遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｇｐ−１００，ＭＡＲＴ−１及びＭＡＧＥ−１などの癌抗原ペプチド遺伝子が癌治療に利用できる。
【００６３】
また、ＶＥＧＦ遺伝子，ＨＧＦ遺伝子及びＦＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子並びにｃ−ｍｙｃアンチセンス，ｃ−ｍｙｂアンチセンス，ｃｄｃ２キナーゼアンチセンス，ＰＣＮＡアンチセンス，Ｅ２Ｆデコイやｐ２１（ｓｄｉ−１）遺伝子が血管治療に利用できる。かかる一連の遺伝子は当業者には良く知られたものである。
【００６４】
核酸複合体の粒径は５０〜４００ｎｍ程度が好適である。この粒径は、例えばレーザを用いた動的光散乱法によって測定される。粒径がこれよりも小さいと、核酸複合体内部の核酸にまで酵素の作用が及ぶおそれ、あるいは腎臓にて濾過排出されるおそれがある。また、これよりも大きいと、細胞に導入されにくくなるおそれがある。
【００６５】
核酸は、細胞に導入されることによりその細胞内で機能を発現することができるような形態で用いる。例えばＤＮＡの場合、導入された細胞内で当該ＤＮＡが転写され、それにコードされるポリペプチドの産生を経て機能発現されるように当該ＤＮＡが配置されたプラスミドとして用いる。好ましくは、プロモーター領域、開始コドン、所望の機能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域が連続的に配列されている。
【００６６】
所望により２種以上の核酸をひとつのプラスミドに含めることも可能である。
【００６７】
本発明において、核酸を導入する対象として望ましい「細胞」としては、当該核酸の機能発現が求められるものであり、このような細胞としては、例えば使用する核酸（すなわちその機能）に応じて種々選択され、例えば心筋細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨格筋細胞、血管内皮細胞、骨髄細胞、骨細胞、血球幹細胞、血球細胞等が挙げられる。また、単球、樹状細胞、マクロファージ、組織球、クッパー細胞、破骨細胞、滑膜Ａ細胞、小膠細胞、ランゲルハンス細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等、消化管上皮細胞・尿細管上皮細胞などである。
【００６８】
本発明の核酸複合体は培養試験に用いるほか、任意の方法で生体に投与することができる。
【００６９】
生体への投与方法としては静脈内又は動脈内への注入が特に好ましいが、筋肉内、脂肪組織内、皮下、皮内、リンパ管内、リンパ節内、体腔（心膜腔、胸腔、腹腔、脳脊髄腔等）内、骨髄内への投与の他に病変組織内に直接投与することも可能である。
【００７０】
この核酸複合体を有効成分とする医薬は、更に必要に応じて製剤上許容し得る担体（浸透圧調整剤，安定化剤、保存剤、可溶化剤、ｐＨ調整剤、増粘剤等）と混合することが可能である。これら担体は公知のものが使用できる。
【００７１】
また、この核酸複合体を有効成分とする医薬は、含まれる核酸の種類が異なる２種以上の核酸含有複合体を含めたものも包含される。このような複数の治療目的を併せ持つ医薬は、多様化する遺伝子治療の分野で特に有用である。
【００７２】
投与量としては、動物、特にヒトに投与される用量は目的の核酸、投与方法および治療される特定部位等、種々の要因によって変化する。しかしながら、その投与量は治療的応答をもたらすに十分であるべきである。
【００７３】
この核酸複合体は、好ましくは遺伝子治療に適用される。適用可能な疾患としては、当該複合体に含められる核酸の種類によって異なるが、末梢動脈疾患、冠動脈疾患、動脈拡張術後再狭窄等の病変を生じる循環器領域での疾患に加え、癌（悪性黒色腫、脳腫瘍、転移性悪性腫瘍、乳癌等）、感染症（ＨＩＶ等）、単一遺伝病（嚢胞性線維症、慢性肉芽腫、α１−アンチトリプシン欠損症、Gaucher病等）等が挙げられる。
【実施例】
【００７４】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。
【００７５】
［遺伝子導入剤の合成］
ｉ）イニファターの合成
下記反応式に従って、１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンを次のようにして合成した。
【００７６】
１，２，４，５−テトラキス（ブロモメチルベンゼン）５．０ｇとＮ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル酸ナトリウム３４．０ｇをエタノール１００ｍＬ中へ加え、遮光下、室温で４日間攪拌した。沈殿物を濾過し、３Ｌのメタノールへ投入して３０分間撹拌して濾過した。この操作を繰り返して合計４回行った。沈殿物をトルエン２００ｍＬへ溶解した後、１００ｍＬのメタノールを加えて５０℃に加温し、冷蔵庫中で１５時間保管して再結晶させ結晶を濾別後、大量のメタノールで洗浄した。結晶を室温で減圧乾燥して白色の１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼンの針状結晶を得た（収率９０％）。高速液体クロマトグラフィーにより、原料ピークが消失し、精製物が単一物質であることを確認した。
【００７７】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ ＣＤＣｌ３）の測定結果はδ１．２６−１．３１ｐｐｍ（ｔ，２４Ｈ，ＣＨ２ＣＨ３），δ３．６９−３．７７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ３．９９−４．０７ｐｐｍ（ｑ，８Ｈ，Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２），δ４．５７ｐｐｍ（ｓ，８Ｈ，Ａｒ−ＣＨ２），δ７．４９ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ，Ａｒ−Ｈ）となった。
【００７８】
【化１】
【００７９】
ii)４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーの光重合による合成
３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミドをカチオン性モノマーとして用い、１，２，４，５−テトラキス[(Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミル)−ポリ−(３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド)−メチル]ベンゼン（以下、ｐＤＭＡＰＡＡｍと記載することがある。）よりなるカチオン性ホモポリマーの合成を行った。
【００８０】
即ち、上記i)により合成した１，２，４，５−テトラキス（Ｎ，Ｎ−ジエチルジチオカルバミルメチル）ベンゼン４５．６ｍｇを２０ｍＬのトルエンへ溶解し、３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド（３−Ｎ，Ｎ−ＤＭＡＰＡＡｍ）７．９ｇを加えて混合し、全量をトルエンで５０ｍＬに調整した。３ｍｍ厚軟質ガラスセル中で激しく攪拌しながら高純度窒素ガスで５分間パージした後に、３００Ｗショートアークキセノンランプ（朝日分光社製、ＭＡＸ−３０１）で２５０〜４００ｎｍの混合紫外線を２５分間照射した。照射強度はウシオ電機社のＵＩＴ−１５０へＵＶＤ−Ｃ４０５（検出波長範囲３２０ｎｍ〜４７０ｎｍ）を装着して２．５ｍＷ／ｃｍ２に調整した。重合溶液をエバポレーターで濃縮し、ジエチルエーテルで重合物を再沈殿させ、クロロホルム／ジエチルエーテル系で３回再沈殿を繰り返して精製し、エーテルを蒸散させた後に少量の水へ溶解し、０．２μｍフィルターで濾過してから凍結乾燥させて４分岐型スター型重合体ｐＤＭＡＰＡＡｍよりなるカチオン性ホモポリマーを得た（重合率３２％）。得られた分岐型重合体の分岐鎖１本当たりの分子量は、ポリエチレングリコール換算のＧＰＣにより約７，５００であり、分岐型重合体の分子量は、３０，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５）と測定された。
【００８１】
１Ｈ ＮＭＲ（ｉｎ Ｄ２Ｏ）の測定結果は、δ１．５−１．８ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−），δ２．１−２．２ｐｐｍ(ｂｒ，６Ｈ，Ｎ−ＣＨ３)，δ２．２−２．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＣＨ２−Ｎ），δ３．０−３．４ｐｐｍ（ｂｒ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２），δ７．４−７．８ｐｐｍ（ｂｒ，１Ｈ，−ＮＨ−）となった。
【００８２】
【化２】
【００８３】
iii)４分岐型スター型重合体の分岐鎖末端の光解裂性官能基の加水分解処理
上記ii)で合成した４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマー２．０ｇを１００ｍＬの水に溶解した。溶液はｐＨ＝約９のアルカリ性を呈した。この溶液を滅菌瓶へ移し、１２１℃で２０分間高圧蒸気滅菌処置した。放冷後、透析チューブへ封入し、０．１Ｎ水酸化ナトリム溶液で３日間透析を行った後、脱塩水で３日間透析を行った。透析した溶液を０．２μｍフィルターで濾過後、凍結乾燥して分岐鎖末端のＮ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を加水分解処理した４分岐型スター型重合体よりなるカチオン性ホモポリマーを得た。
【００８４】
【化３】
【００８５】
得られた４分岐型スター型重合体の水溶液の紫外可視吸収スペクトルを分光光度計で測定すると、加水分解前に確認されたジチオカルバメート基に由来するλｍａｘ＝２７８ｎｍの吸収がほぼ消失していた。この結果から、分岐鎖末端のジチオカルバメート基が加水分解によりＳＨ基に変換されたと考えられる。
【００８６】
次いで、分岐鎖末端がＳＨ基に変換されていることを、加水分解処理した４分岐型スター型重合体と５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）との反応により確認した。
即ち、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）およびトリエチルアミンを、ＤＭＦ／水＝５０／５０（Ｖ／Ｖ）の混合溶媒に溶解し、この溶液と、前記加水分解処理した４分岐型スター型重合体の水溶液とを混合したところ、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）のＳ−Ｓ結合が還元されて生成する５−チオ（２−ニトロ安息香酸）イオンの強い発色（λｍａｘ＝４９５ｎｍ）が確認された。この結果より、加水分解処理した４分岐型スター型重合体の分岐鎖の末端のジチオカルバメート基はＳＨ基となっていることが示唆された。
【００８７】
加水分解後の４分岐型スター型重合体の分子量は、ポリエチレングリコール換算のＧＰＣにより、３２，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６）と測定され、分子量の増大と分子量分布のブロード化が認められた。ジチオカルバメート基の脱離（ＳＨ基への加水分解）により、４分岐型スター型重合体の分子量は、減少することが予想されたが、実際の分子量は増大していた。これは、加水分解処理した４分岐型スター型重合体の分岐鎖末端のＳＨ基同士が、一部透析精製中に反応し、２量体、３量体またはオリゴマーとなったためであると考えられる。
【００８８】
iv）分岐鎖末端をＳＨ基に変換した４分岐型スター型重合体同士の架橋
上記iii)で合成した分岐鎖の末端にＳＨ基を有する４分岐型スター型重合体０．２ｇを１００ｍＬ滅菌瓶へ入れ、３．０ｇのメタノールへ溶解し、開放系（容器内が空気と交換できるようにして）で回転子で緩やかに攪拌した。メタノール溶液中のポリマーの分子量は経時的に増加し、攪拌開始から１２０分後の分子量は３６，０００であり、２４０分後の分子量は、４０，０００であったが、不溶性の成分は形成されなかった。ゲル成分が確認されなかったのは、分岐鎖の末端同士でＳ−Ｓ結合が形成されて２量体、３量体またはオリゴマーが生成しているものと考えられる。
【００８９】
【化４】
【００９０】
v)４分岐型スター型重合体からなる架橋体の解離試験
上記iv）で合成した４分岐型スター型重合体の架橋体（反応時間２４０分、分子量Ｍｎ＝４０，０００の架橋体）のメタノール溶液へ１００ｍＭジチオスレイトール溶液を加えて窒素雰囲気下で６０分攪拌した。６０分撹拌後の分子量はポリエチレングリコール換算のＧＰＣにより２９，０００（Ｍｗ／Ｍｎ＝１．６）と測定された。この結果より、架橋体が架橋前の４分岐型スター型重合体の単量体の状態に戻ったことがわかる。これは、ジチオスレイトールにより分岐型重合体間のＳ−Ｓ結合が還元され、架橋体同士が解離した結果であると考えられる。即ち、この架橋体は、生体内おいても還元性物質の存在下であれば、架橋体のＳ−Ｓ結合が解離し、低分子量体になることがわかる。
【００９１】
vi）遺伝子導入活性
細胞にはアフリカミドリサル腎細胞の由来のＣＯＳ-１を使用し、ＤＮＡにはｐＧＬ３コントロールベクターを使用した。ＣＯＳ-１細胞は細胞数を４万個／ｍＬへ調整して２４Ｗｅｌｌ培養皿へ播種し、培養２４時間後に遺伝子導入を行った。
【００９２】
遺伝子導入剤としては、上記iv）において、反応時間２４０分で得られた分子量が４０，０００の架橋体を実施例１の遺伝子導入剤とし、上記ii)で合成した４分岐型スター型重合体を比較例１の遺伝子導入剤とし、上記v)において実施例１の遺伝子導入剤の架橋体を再解離した４分岐型スター型重合体を参考例１の遺伝子導入剤として使用した。
【００９３】
遺伝子導入剤中の単位重量あたりの陽電荷数はカチオン性ポリマーのモノマー単位の分子量１５６から計算して求めた。ＤＮＡ中の単位重量あたりの陰電荷数は配列マップによる塩基対数と核酸塩基の平均的分子量６６０とから計算した。
【００９４】
この遺伝子導入剤をＤＮＡと１５０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で３０分間インキュベートした。混合比は電荷数の関係が陽電荷数が陰電荷数の２０倍となるように調整し、０．５μｇのＤＮＡが各Ｗｅｌｌへ投与されるように溶液を調整し、培養細胞へ加えた。３時間の培養の後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭを除去し、ＰＢＳで洗浄した後に完全培地を加えてさらに４８時間培養を行った。トランスフェクションの４８時間後にルシフェラーゼアッセにより遺伝子導入活性の評価を行った（プロメガ社、アッセイキット試薬)。補正はタンパク濃度で行い、タンパク定量はＢｉｏＲａｄ社のＢｒａｄｆｏｒｄ試薬で行った。結果を図１に示す。
【００９５】
［考察］
図１より、実施例１の遺伝子導入剤の遺伝子導入活性が、比較例１及び参考例１の遺伝子導入剤の遺伝子導入活性に比べて高いことが分かる。これは、実施例１の遺伝子導入剤が、複数の分岐型重合体同士の架橋による複雑なネットワーク構造を有しているためであると考えられる。実施例１の遺伝子導入剤をジチオスレイトールで処理を行った参考例１の遺伝子導入剤は、実施例１の遺伝子導入剤のＳ−Ｓ結合が解離したものであると考えられるため、架橋構造の構造的優位性を失い、架橋前の４分岐型スター型重合体である比較例１の遺伝子導入剤と同程度の活性しか示さなかったと考えられる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
芳香環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、
複数の分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤において、
該分岐鎖の末端はＳＨ基であり、
該架橋体は、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士が結合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項２において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項２又は３において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項２ないし４のいずれか１項において、該分岐鎖は１種類のモノマーよりなるホモポリマーであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項２ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記２種以上のモノマーのランダムコポリマー又はブロックコポリマーであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記分岐鎖の１本当たりの分子量が、３００〜６，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記架橋体の分子量が、１，０００〜６０，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤を製造する方法であって、
芳香環に該芳香環から放射状に伸延する複数の分岐鎖を導入する分岐型重合体製造工程と、
得られた分岐型重合体を加水分解することにより該分岐型重合体の分岐鎖の末端をＳＨ基に変換する加水分解工程と、
該分岐鎖の末端のＳＨ基同士を反応させることにより分岐型重合体同士を架橋する架橋工程と
を有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【請求項１】
芳香環を核とし、それから放射状に伸延した複数の分岐鎖を有する分岐型重合体を有する遺伝子導入剤であって、
複数の分岐型重合体同士が架橋した架橋体よりなる遺伝子導入剤において、
該分岐鎖の末端はＳＨ基であり、
該架橋体は、該分岐鎖の末端のＳＨ基同士が結合したものであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項２】
請求項１において、前記分岐型重合体は、Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物をイニファターとし、これにビニル系モノマーを光照射リビング重合させた分岐型重合体であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項３】
請求項２において、前記Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基を同一分子内に３個以上有する化合物は、ベンゼン環を核とし、この核に分岐鎖として３個以上の該Ｎ，Ｎ−ジ置換ジチオカルバミルメチル基が結合していることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項４】
請求項２又は３において、ビニル系モノマーが３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロピルアクリルアミド、２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、Ｎ，Ｎ-ジメチルアクリルアミド、メトキシエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、及びＮ−イソプロピルアクリルアミドの誘導体からなる群から選択される少なくとも１種であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項５】
請求項２ないし４のいずれか１項において、該分岐鎖は１種類のモノマーよりなるホモポリマーであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項６】
請求項２ないし５のいずれか１項において、前記分岐鎖は、前記２種以上のモノマーのランダムコポリマー又はブロックコポリマーであることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項において、前記分岐鎖の１本当たりの分子量が、３００〜６，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項８】
請求項１ないし７のいずれか１項において、前記架橋体の分子量が、１，０００〜６０，０００であることを特徴とする遺伝子導入剤。
【請求項９】
請求項１ないし８のいずれか１項に記載の遺伝子導入剤を製造する方法であって、
芳香環に該芳香環から放射状に伸延する複数の分岐鎖を導入する分岐型重合体製造工程と、
得られた分岐型重合体を加水分解することにより該分岐型重合体の分岐鎖の末端をＳＨ基に変換する加水分解工程と、
該分岐鎖の末端のＳＨ基同士を反応させることにより分岐型重合体同士を架橋する架橋工程と
を有することを特徴とする遺伝子導入剤の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２０１０−２７３５６４（Ｐ２０１０−２７３５６４Ａ）
【公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１２６７１６（Ｐ２００９−１２６７１６）
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１２月９日（２０１０．１２．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２６日（２００９．５．２６）
【出願人】（５９１１０８８８０）国立循環器病センター総長 (159)
【出願人】（０００００５２７８）株式会社ブリヂストン (11,469)
【Ｆターム（参考）】
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