高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及び該タンパク質を用いた核酸の等温増幅方法
【課題】 増幅精度を向上するべく、等温増幅反応における核酸増幅において非特異的増幅を制御できる技術を確立する。
【解決手段】 鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系における鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能を発現するアミノ酸配列を有する高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であって、１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加及び挿入の少なくとも１つからなる改変が生じている改変部位をアミノ酸配列中に有する高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及びその利用方法。
【解決手段】 鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系における鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能を発現するアミノ酸配列を有する高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であって、１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加及び挿入の少なくとも１つからなる改変が生じている改変部位をアミノ酸配列中に有する高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及びその利用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及びその利用方法に関する。詳細には、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅系において鋳型核酸の増幅効率を向上できる高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、種々の核酸の指数関数的増幅方法が開発されているが、特に核酸を効率的に増幅する方法としては、概して反応温度を変動させる熱サイクルを用いるもの、及び反応が等温であるものに分類される。
【０００３】
熱サイクルを用いる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応、即ちＰＣＲ（例えば、非特許文献１参照）が知られている。ＰＣＲにおいては、標的となる鋳型核酸の相対する鎖に相補的な塩基配列を有する２つのプライマーを、鋳型核酸と混合する。そして、鋳型核酸の変性、プライマーの鋳型核酸へのアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸張（ＤＮＡ複製）を１ラウンドとした通常２０〜３０回のサイクルにより、鋳型核酸にアニールした２つのプライマーの間に位置する鋳型核酸の相補鎖の合成が行われる。この方法では合成鎖を新たな鋳型核酸とできるため、同一のプライマーセットを用いた別ラウンドの複製により、鋳型核酸の指数関数的な増幅が可能となる。そして、各サイクルで鋳型核酸を変性するのに必要な高温に耐えるために、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用することが必要である。さらに、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は増幅反応が連続的に進行しないので、核酸サンプルである鋳型核酸を一連の複数のサイクルに供して行わなければならない。
【０００４】
一方、鋳型核酸の増幅反応を等温で行う方法として、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、非特許文献２参照）やローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、非特許文献３、４及び５参照）等が知られている。ＳＤＡ法は、鋳型核酸に制限酵素でニックを入れ、このニックをもつＤＮＡ断片を順番に置換していくＤＮＡポリメラーゼ（鎖置換ポリメラーゼ）の作用を用いてＤＮＡを増幅する。一方、ＲＣＡ法は鋳型核酸にアニールしたプライマーを基点として合成された伸長鎖の先端で、鎖置換ポリメラーゼがその前の鎖を置換してハイブリッド形成を行う。そのため、これら方法では標的ＤＮＡ配列の増幅は等温で連続的に行われるため熱サイクルが不要となる。
【０００５】
このような鎖置換により、等温条件下で連続的に鋳型核酸の直線的または指数関数的な増幅が可能となる。従って、例えばＲＣＡ法では、熱サイクルを用いる方法と比べて、鋳型核酸の増幅過程をより単純にしたため増幅産物の産生量を効率よく増加できる、有効に増幅することができる鋳型核酸の長さが制限されない、熱サイクルを行う設備が不要となる等の利点を有する。
【０００６】
ここで、鋳型核酸の増幅反応において、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（single-strand DNA binding protein：以下、「ＳＳＢタンパク質」と略する場合がある。）が鋳型核酸の増幅反応効率等に関与していることが知られている。
【０００７】
ＳＳＢタンパク質は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に対する配列非特異的に親和性が高い。通常、ＤＮＡ複製、組換え、及び生物ゲノムの修復にはＳＳＢタンパク質が必要である。ＳＳＢタンパク質はその同族ＤＮＡポリメラーゼを特異的に刺激し、ＤＮＡ合成の忠実度を高め、螺旋の不安定化によりＤＮＡポリメラーゼの前進性を改善すると共にＤＮＡポリメラーゼ結合を促進し、複製開始点を組織化及び安定化する。つまり、ＳＳＢタンパク質は複製補助タンパク質として作用することが知られている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００８】
ＳＳＢタンパク質は、バクテリオファージから真核生物まで、広く様々な起源から多数のＳＳＢタンパク質の例が分離されている。例えば、特許文献１には、ビール酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来の複製タンパク質Ａ−１（ｒｐａ−１）、ミトコンドリアタンパク質由来の複製タンパク質（ｒｉｍ−１）、Ｔ７由来の遺伝子２．５タンパク質（ｇｐ２．５）、バクテリオファージＰｈｉ２９のタンパク質ｐ５（ｐ５）、Ｔ４の遺伝子３２タンパク質（ｇｐ３２）及び大腸菌のＳＳＢタンパク質が開示されている。また、高度好熱菌からもＳＳＢタンパク質が分離されていることが知られている（例えば、非特許文献６及び７参照）。
【０００９】
そして、特許文献１には、鋳型核酸の増幅効率を改善するためにＳＳＢタンパク質を等温増幅反応系に添加することが記載されている。さらに、特許文献２において、鋳型核酸の鎖置換複製に有用な鎖置換因子として大腸菌由来のＳＳＢタンパク質が利用されている。つまり、当該鎖置換因子存在下で、鎖置換複製を実行できる鎖置換ポリメラーゼ（バクテリオファージ由来Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ等）により鋳型核酸のＲＣＡ増幅を行っていることが開示されている。
【００１０】
これら鎖置換ポリメラーゼを用いる鋳型核酸の増幅方法は、鋳型核酸を変性する当該鎖置換ポリメラーゼの鎖置換能力に依存している。そして、この鎖置換は、複製補助タンパク質や鎖置換因子により促進することができるため、複製補助タンパク質や鎖置換因子の存在により、鋳型核酸に特異的なＤＮＡ断片を効率よく増幅できると考えられていた。
【００１１】
【特許文献１】特開平１０−２３４３８９号公報（段落０００７、００１４等参照）
【特許文献２】特表２００２−５２５０７８号公報（段落００５９〜００６２等参照）
【非特許文献１】Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０-１３５４，１９８５
【非特許文献２】Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６，１９９２
【非特許文献３】Amersham Biosciences社、“製品カタログ：GenomiPhi DNA Amplification Kit”、［online］、［平成１７年４月２８日検索］、インターネット、<URL：http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=912&goods_name=GenomiPhi+DNA+Amplification+Kit>
【非特許文献４】Ｄｅａｎ他、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １１（６）、第１０９５頁〜第１０９９頁、２００１年６月
【非特許文献５】Ｌｉｚａｒｄｉ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（３）、第２２５頁〜第２３２頁，１９９８年７月
【非特許文献６】Ｄａｂｒｏｗｓｋｉ他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４８（Ｐｔ１０）、第３３０７頁〜第３３１５頁、２００２年１０月
【非特許文献７】Ｐｅｒａｌｅｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１（２２）、第６４７３頁〜第６４８０頁、２００３年１１月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、鎖置換ポリメラーゼを使用した等温増幅反応系においては、鋳型核酸に特異的なＤＮＡ断片が効率よく増幅されるだけでなく、鋳型核酸に非特異的なＤＮＡ断片も増幅され易いという問題点があった。大腸菌や酵母等由来のＳＳＢタンパク質を添加して等温増幅反応を行う特許文献１及び２に開示の方法においても、非特異的なＤＮＡ断片の増幅を抑制できない問題点があった。
【００１３】
この理由の一つとして、等温増幅における温度が通常３０〜６０℃程度であるためプライマーダイマーが形成され易くなり、このプライマーダイマー形成の結果、鋳型核酸に非特異的なＤＮＡ断片が増幅され易くなるということが考えられる。つまり、鋳型核酸の不在下であってもプライマーダイマーが形成され、非特異的な核酸が増幅される。鋳型核酸に非特異的なＤＮＡ断片は、増幅精度が低下する要因となり、後の実験に支障を来たすバックグラウンドノイズとなる。そして、増幅にランダムな配列を有するプライマーを使用することから、非特異的増幅を制御することは困難であるとされてきた。
【００１４】
かかる理由により、鋳型核酸の等温増幅方法はＰＣＲのように熱サイクルを不要とする等から汎用性の高い技術として期待されているが、上述した非特異的増幅による増幅精度の問題からその用途が限定されているのが現状であった。
【００１５】
従って、本発明は、増幅精度を向上するべく、等温増幅反応における鋳型核酸の増幅において非特異的増幅を制御できる技術を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者が鋭意検討を行った結果、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が有するアミノ酸配列において、ある特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位をアミノ酸配列中に有する高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を構築した。かかる高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅系に添加したところ、鋳型核酸に特異的な増幅産物が得られ、非特異的増幅が生じない、精度の高い増幅産物が得られることを見出した。これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１７】
上記目的を達成するため本発明は、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系における鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能を発現するアミノ酸配列を有する高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であって、１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加及び挿入の少なくとも１つからなる改変が生じている改変部位をアミノ酸配列中に有する高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を提供し、好ましくは、前記高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、又は、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である。
【００１８】
そして、好ましくは、前記改変が、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の鎖置換ポリメラーゼとの相互作用に変化が生じる改変であり、また、前記改変が、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合能に変化が生じる改変である。
【００１９】
また、好ましくは、前記改変が、少なくとも３個以上連続するプロリンを有するように高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列が改変されている。
【００２０】
具体的には、前記改変が、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を示す配列番号１のアミノ酸配列のうち、２５５番目のフェニールアラニンが他のアミノ酸に置換されているものが好ましく、また、前記改変が、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を示す配列番号４のアミノ酸配列のうち、２５６番目のフェニールアラニンが他のアミノ酸に置換されているものが好ましい。特には、前記他のアミノ酸がプロリンである。
【００２１】
また、上記目的を達成するため本発明は、鎖置換ポリメラーゼを用いた核酸の等温増幅方法であって、本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を添加して増幅反応を行う核酸の増幅方法を提供し、好ましくは、前記鎖置換ポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、鎖置換ポリメラーゼを用いたＤＮＡの等温増幅系に添加することにより、改変部位を有しない高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質及び他の組換え関連タンパク質では奏することができない、特異的なＤＮＡ断片の効率的な増幅が可能となる。つまり、非特異的増幅を抑制でき、バックグラウンドノイズの影響を受けないＤＮＡ断片の増幅が可能となり、増幅効率の向上に寄与し得る。
したがって、本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を利用した増幅方法は、一般的な分子生物学の方法に幅広く利用可能である。例えば、遺伝子型分析のために、環境中より採収した微量の微生物から抽出した少量の試料から大量のＤＮＡを調製する有用な方法として、或いは、ＤＮＡシークエンシングのためのＤＮＡの調製方法として、有用である。さらに、動物或いは植物細胞から抽出した少量の試料からＤＮＡチップ固定用ＤＮＡを調製する等、種々の用途に適用できる汎用性の高いＤＮＡの調製方法として利用価値が高い。
【００２３】
更に、本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡライブラリーからの標的cＤＮＡクローンのクローニング系に適用することができる。これにより、特異的かつ効率的な標的ｃＤＮＡクローンのＤＮＡライブラリーからの濃縮又は単離が達成される。特異的かつ効率的なｃＤＮＡクローニングは、遺伝子発現、発生、分化等の解析、並びに有用物質の産生の分野において大いに貢献し得る。
【００２４】
また、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢは、ＲＮＡからＤＮＡの逆転写反応系に適用することができ、これにより、所望の標的ＲＮＡの特異的、かつ、効率的なｃＤＮＡへの転換が達成される。ＲＮＡからｃＤＮＡへの変換は遺伝子工学上不可欠な手法であることから、遺伝子発現検出とその定量、ＲＮＡの構造解析、ｃＤＮＡクローニング等、その利用価値は高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質には、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系における鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能を発現する、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質における、すべての改変型が含まれる。つまり、本発明の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と比較して鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系において鋳型核酸に対する特異性が向上している。そして、高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位を有する。ここで、改変とは、改変の基礎となるタンパク質のアミノ酸配列のうち、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および付加の少なくとも１つからなる改変が生じていることを意味する。そして、「１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする遺伝子に対する公知のＤＮＡ組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換、挿入又は付加することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。
【００２６】
このような改変は、人為的に導入することもできるし、また、自然界において非意図的に生じることもある。本発明における高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質には、これら双方の改変型が含まれる。
【００２７】
以下、本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を「高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質」と略する場合がある。また、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を「高度好熱菌ＳＳＢタンパク質」と略する場合がある。そして、ここで、単に「高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質」、「高度好熱菌ＳＳＢタンパク質」と称する場合は、アミノ酸配列中に上述したような改変部位を有するものを含むものではない。
【００２８】
そして、改変型の基礎となる、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質としては、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）等に由来する高度好熱菌ＳＳＢタンパク質が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではない。なお、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質は、自然界より分離された高度好熱菌に保持されているＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列、及びＳＳＢタンパク質をコードする塩基配列が、意図的もしくは非意図的に改変が生じている改変部位を有していないことを意味する。
【００２９】
本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質は公知の方法によって取得することができる。例えば、改変の基礎となる高度好熱菌ＳＳＢタンパク質をコードする遺伝子に対して改変を施し、得られた改変遺伝子を用いて宿主細胞を形質転換し、かかる形質転換体の培養物から高度好熱菌ＳＳＢタンパク質を採取することによって取得することができる。
【００３０】
かかる高度好熱菌ＳＳＢタンパク質の遺伝子は、公知の遺伝子クローニング技術を用いて取得することができる。また、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースより検索することによって取得することができる遺伝子情報に基づいて、常法のホスホルアミダイト（phosphoramidite）法等のＤＮＡ合成法により合成することによっても取得するができる。ここで、本発明の改変型の基礎として好適な高度好熱菌ＳＳＢタンパク質の配列情報として、サーマス・サーモフィラス由来のＳＳＢのアミノ酸配列を配列番号１に、該ＳＳＢタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ５６４６２６）。また、サーマス・アクアティカス由来のＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に、該ＳＳＢタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５に示す（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２７６７０５）。
【００３１】
高度好熱菌ＳＳＢタンパク質をコードする遺伝子に改変を施す方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の改変タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して点変異を導入するＰＣＲ突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。例えば、大腸菌由来のＳＳＢタンパク質に対する変異導入に関する公知文献（例えば、Ｃｈａｓｅ ＪＷ他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５９（２）、第８０５頁〜第８１４頁、１９８４年１月２５日）を参照することができる。また、市販の変異導入用キット（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標） Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製））を利用してもよい。また、一旦、目的とする高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列が定まれば、それをコードする適当な塩基配列を決定することができ、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して本発明の高度好熱菌由来の改変型ＳＳＢタンパク質をコードするＤＮＡを合成することができる。
【００３２】
得られた改変遺伝子を用いて宿主細胞を形質転換するためには、公知の大腸菌等の宿主・発現ベクターシステムを利用することができる。例えば、該高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させ、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を効率的に発現できる大腸菌に導入する。そして、炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地に接種し、常法に従って培養して該高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を発現させる。
【００３３】
このようにして得られた形質転換体の培養物からのＳＳＢタンパク質の採取、精製は、常法に従って行なえばよい。例えば、宿主の大腸菌を破砕して熱処理を行うことにより、当該ＳＳＢタンパク質以外の大腸菌由来タンパク質は熱変性して熱凝集するため、遠心分離等により分離除去できる。これにより熱変性しない当該ＳＳＢタンパク質を可溶画分として大腸菌由来タンパク質と分離し、親和性クロマトグラフィー等を用いて精製できる。
【００３４】
このとき、当該ＳＳＢタンパク質は高度好熱菌由来であるため室温で構造が安定しており、さらに有機溶剤に対しても高い安定性を有している。そのため、上記精製工程は室温で行うことが可能である。
【００３５】
なお、発現ベクターは、プロモーター配列、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質をコードする遺伝子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素サイトを有するマルチクローニングサイト等の配列を含み、かつ、上記宿主細胞で発現できるものであれば、何れの発現ベクターを用いることができる。好適なプロモーターとしては、例えば、Ｔ７ｌａｃプロモーターを利用するのが好ましい。
【００３６】
さらに、この発現ベクターには他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。他の公知の塩基配列としては特に限定されない。例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列が挙げられる。また、ネオマイシン耐性遺伝子・カナマイシン耐性遺伝子・クロラムフェニコール耐性遺伝子・アンピシリン耐性遺伝子・ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。
【００３７】
このような発現ベクターは、市販の大腸菌用発現ベクター（例えばｐＥＴタンパク質発現システム：ノバジェン社製）を用いることが可能であり、さらに、適宜所望の配列を組み込んだ発現ベクターを作製して使用することが可能である。
【００３８】
また、宿主細胞としては、大腸菌に限定されず、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、Saccharomyces cerevisiae等の酵母、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞等の動物細胞等を好適に利用することが可能である。
【００３９】
そして、精製されたＳＳＢタンパク質が所望の改変が生じている改変部位を有する高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質であるか否かの確認は、公知のアミノ酸分析法によって行うことができる。例えば、エドマン分解法に基づく自動アミノ酸決定法が利用できる。また、精製されたＳＳＢタンパク質を、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応に供して改変部位を有しない高度好熱菌ＳＳＢタンパク質と比較して、鋳型核酸に対する特異性が向上しているか否かを確認することによって行うことができる。確認方法としては、例えば、本発明の実施例に示す方法によって行うことができる。
【００４０】
ここで、上記の「鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能」とは、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応において、鋳型核酸に関連のない非特異的増幅がほとんど認められず、かつ、鋳型核酸を高い収率で増幅できることを意味する。そして、好ましくは、鋳型核酸の増幅効率を５〜１０倍向上させ得る機能を意味する。例えば、配列番号３若しくは６に表すアミノ酸配列を有するタンパク質が有する、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系における、鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能と実質的に同等であることをいう。
【００４１】
本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質としては、そのアミノ酸配列中に、前記高度好熱菌ＳＳＢタンパク質の鎖置換ポリメラーゼとの相互作用に変化を生じさせる改変を有しているものを好適に利用することができる。さらには、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質のＤＮＡ結合能に変化を生じさせる改変を有しているものをも好適に利用することができる。
【００４２】
つまり、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質が、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼとの相互作用に何らかの影響を与える可能性がある。ここで、「鎖置換ポリメラーゼとの相互作用」とは、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質−鎖置換ポリメラーゼ、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質−ＤＮＡ、若しくは高度好熱菌ＳＳＢタンパク質−鎖置換ポリメラーゼ−ＤＮＡとの相互作用を意味する。ここで、ＤＮＡとは一本鎖ＤＮＡであり、プライマー若しくは鋳型核酸の一本鎖部分のいずれか一方、若しくは、その両方を意味する。そして、「前記高度好熱菌ＳＳＢタンパク質の鎖置換ポリメラーゼとの相互作用に変化が生じる」とは、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質が元来有していた鎖置換ポリメラーゼに対する作用に変化が生じることを意味する。ここで、大腸菌、Sulfolobus sulfataricus等由来のＳＳＢタンパク質が、一本鎖ＤＮＡのみならず、プライマーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ等のポリメラーゼにも結合することが報告されている（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄ ＤＪ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００４ Ｆｅｂ １０；３２（３）：１０６５−７４、Ｓｕｎ Ｗ, ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９６ Ｄｅｃ；１７８（２３）：６７０１−５、Ｆｒａｄｋｉｎ ＧＥ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （Ｍｏｓｋ）． １９８８ Ｊａｎ−Ｆｅｂ；２２（１）：１１１−６等を参照のこと。）。これにより、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅系にＳＳＢタンパク質を添加した場合、ＳＳＢタンパク質は鎖置換反応を補助する一方で、ポリメラーゼ活性の低下による増幅効率の低下という望ましくない作用を奏することが推定される。そして、かかる推定は、下記で説明する実施例における大腸菌由来ＳＳＢ、高度好熱菌ＳＳＢ等の存在下では増幅効率の低下を招いたとの結果に合致する。そこで、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質として、ＳＳＢタンパク質が元来有するポリラーゼに対する結合能を有する領域におけるアミノ酸配列が崩壊したものが好ましく例示される。そして、上記した「前記高度好熱菌ＳＳＢタンパク質の鎖置換ポリメラーゼとの相互作用に変化」には、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質が元来有している鎖置換ポリメラーゼに対する結合能が低下、若しくは消失するような変化が含まれることが推定される。
【００４３】
具体的には、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質としては、少なくとも３個以上連続するプロリンを有するように前記高度好熱菌ＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列が改変されたものが例示される。つまり、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質は、そのアミノ酸配列中に、配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを有するものが好適に例示され、更に、かかる配列の前後に１若しくは数個のプロリン残基を有するものであってもよい。
【００４４】
本発明においては、特に、例えば、サーマス・サーモフィラス由来のＳＳＢタンパク質を表す配列番号１の２５５番目のフェニールアラニン、サーマス・アクアティカス由来のＳＳＢタンパク質を表す配列番号４の２５６番目のフェニールアラニンが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。そのようなアミノ酸としては、プロリンが特に、好適に例示される。サーマス・サーモフィラス由来のＳＳＢタンパク質を表す配列番号１の２５５番目のフェニールアラニンをプロリンに置換した本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。また、サーマス・アクアティカス由来のＳＳＢタンパク質を表す配列番号４の２５６番目のフェニールアラニンをプロリンに置換した本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００４５】
本発明は更に、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を用いた、等温増幅可能な鎖置換ポリメラーゼを用いた鋳型核酸の等温増幅方法を提供する。本発明の増幅方法は、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を添加して増幅反応を行うものである。
【００４６】
ここで、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅方法は、高熱による熱変性を必要としない等温条件下で、鎖置換ポリメラーゼの鎖置換活性により核酸を指数対数的に増幅する方法である。このような鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅方法としては、ローリングサークル増幅（以下、「ＲＣＡ」と略する場合がある）法が好適に例示される。ＲＣＡ法の原理は以下の通りである。ＲＣＡ法による鋳型核酸の等温増幅方法は、例えば、等温条件下において、鋳型核酸である環状ＤＮＡにアニールした複数のランダムプライマーを基点にして、鎖置換ポリメラーゼが環状ＤＮＡの相補鎖を伸長する。そして、合成鎖の伸長に伴い、他のランダムプライマーの複製基点に達しても、当該鎖置換ポリメラーゼの鎖置換活性により他の合成鎖を剥がしながら鎖の伸長を継続する（ブランチング）。このとき、剥がされた合成鎖にはランダムプライマーがアニールできる部位が露出する。つまり、環状ＤＮＡだけでなく、この剥がされた合成鎖をも鋳型核酸として新たなＤＮＡ合成鎖を形成できるため、指数関数的な増幅となる。
【００４７】
このときに用いられるランダムプライマーは、ランダムヘキサマー等が好適に利用できる。その他のプライマーの例としては、鋳型核酸の標的部位に設定温度で特異的にアニールするプライマーを適用できる。このプライマーは、当該プライマー単独、或いは、上記ランダムプライマーと混合した状態で使用することが可能である。
【００４８】
プライマーの設計は、標的となる核酸配列に基づいて所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等により設計されるが、ランダムプライマーの場合、ランダムな配列を有するように設計される。 このように設計されたプライマーは化学的に合成することが可能である。例えば、公知のホスホルアミダイト法を用いて固相合成により化学合成することができ、市販されている自動核酸合成装置により所望の塩基配列からなるプライマーを自動的に合成することも可能である。合成後のプライマーは、必要に応じてＨＰＬＣ等の公知の方法により精製される。
【００４９】
ここで、等温増幅における「等温」とは、ＰＣＲ法のようにＤＮＡ変性、アニール、鎖伸長の各工程で反応温度を変化させるのに対して、一定温度で制御して増幅反応を行うことを指す。増幅反応を行う一定温度は、好ましくは６０℃未満、より好ましくは４５℃未満、さらに好ましくは３７℃未満である。この温度は、適用する鎖置換ポリメラーゼにより適宜決定する。例えば、後述するバクテリオファージ由来Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、増幅反応を行う好適な温度範囲は２５〜４２℃であり、好ましくは３０〜３７℃、更に好ましくは３０〜３４℃である。当該一定温度になるように設定したインキュベーター等の恒温チャンバーにおいて、サンプルを、４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間、更に好ましくは１５〜２４時間程度インキュベートし、鋳型核酸の増幅反応を行う。
【００５０】
そして、鎖置換ポリメラーゼとしては、バクテリオファージ由来Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第5,198,543号及び米国特許第5,001、050号、Ｂｌａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．）が好適に例示される。しかしながら、これに限定されるものではない。例えば、Bst大断片のＤＮＡポリメラーゼ（Exo(-)Bst（Aliotta等、Genet. Anal.（オランダ国）12:185〜195（1996年））及びExo(-)BcaDNAポリメラーゼ（Walker及びLinn, Clinical Chemistry42:1604〜1608(1996年)）、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ８４：２４７ （１９８９））、ファージφＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：８２８７ （１９８７））、ＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１９６５−１９７５ （１９９３））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４５：６２３−６２７ （１９７４））、Ｔ５ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ９７：１３−１９ （１９９１））、シーケナーゼ（登録商標）（米国バイオケミカルズ社製）、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚｈｕ ａｎｄ Ｉｔｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １２１９：２６７−２７６ （１９９４））及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（Ｋａｂｏｏｒｄ ａｎｄ Ｂｅｎｋｏｖｉｃ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ５：１４９−１５７ （１９９５））等が挙げられる。
【００５１】
また、鋳型核酸としては、環状ＤＮＡが好適に例示されるがこれに限られるものではなく、直鎖状ＤＮＡを用いてもよい。ＲＣＡ法の場合、増幅効率の点から環状ＤＮＡが好ましい。鋳型核酸は一本鎖及び二本鎖が適用可能である。また、天然のＤＮＡとしてプラスミドＤＮＡ・真核及び原核生物のゲノムＤＮＡ、及び、人工的に作成したＤＮＡ分子として、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ・ファージミド・コスミド等の種々のＤＮＡ分子が鋳型核酸となりうる。さらに、オリゴヌクレオチド等の合成ＤＮＡも鋳型核酸とすることができる。
【００５２】
以上のように構成することにより、鋳型核酸に特異的なＤＮＡ断片の効率的な増幅が可能となる。つまり、鋳型核酸に関連のない非特異的増幅を抑制でき、バックグラウンドノイズの影響を受けないＤＮＡ断片の増幅が可能となる。
【００５３】
更に、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢは、ＤＮＡライブラリーからの標的ｃＤＮＡクローンの濃縮又は単離に適用することができる。詳細には、濃縮又は単離を所望する標的ｃＤＮＡの一部の配列をプライマーとして使用し、ＤＮＡライブラリーを鋳型として増幅反応を行う際に、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢを適用できる。ここで、増幅反応に際しては、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系の他、通常のＰＣＲ反応系等を利用することが可能である。これにより、標的ｃＤＮＡと関連のない非特異的な増幅を抑制でき、標的ｃＤＮＡのみを特異的に増幅可能となる。したがって、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢの、ＤＮＡライブラリーからの標的ＤＮＡクローンのクローニング系への適用により、所望の標的ｃＤＮＡクローンを特異的、かつ、効率的に濃縮、単離することが可能となる。
【００５４】
ここで、ＤＮＡライブラリーとしては、濃縮若しくは単離を所望する標的のＤＮＡ領域を含む、又は、含み得ることが期待されるＤＮＡライブラリーが使用される。そして、ＤＮＡライブラリーは、遺伝子ライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーのいずれでもよいが、特にはｃＤＮＡライブラリーが好ましい。なお、本明細書において、遺伝子ライブラリーとは、特定の単一生物種の全ゲノムＤＮＡを無作為にベクターに組み込んだクローン化されたＤＮＡの集合体を意味する概念として使用した。一方、ｃＤＮＡライブラリーとは、特定の組織、細胞、生物由来のｍＲＮＡを逆転写反応によってｃＤＮＡ化し、ベクターに組み込んで作成したｃＤＮＡ断片の集合体を意味する概念として使用した。
【００５５】
プライマーは、通常、標的核酸の特定配列に対して相補的になるように設計されるものである。特には、増幅すべき標的配列のその両端に相補的な塩基配列を有するものであることが好ましく、本発明においては濃縮又は単離を所望する標的ｃＤＮＡの一部の配列が好適に利用できる。なお、プライマーの設計は公知であり、標的となるｃＤＮＡの塩基配列に基づいて設計され、例えば、プライマー設計支援ソフト等を利用することができる。このように設計されたプライマーは化学的に合成することが可能である。例えば、公知のホスホルアミダイト法を用いて固相合成により化学合成することができ、市販の自動核酸合成装置により所望の塩基配列からなるプライマーを自動的に合成することも可能である。合成後のプライマーは、必要に応じてＨＰＬＣ等の公知の方法により精製される。
【００５６】
また、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢは、ＲＮＡからＤＮＡの逆転写反応に適用することができる。詳細には、逆転写酵素の存在下、ランダムへキサマープライマー、オリゴｄＴプライマー、標的遺伝子特異的プライマーを用いて、逆転写反応によりＲＮＡからのｃＤＮＡの合成反応を行う際に本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢを適用することができる。更には、合成されたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う際にも適用することができる。ここで、増幅反応に際しては、置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系の他、通常のＰＣＲ反応系等を利用することが可能である。これにより、標的ＲＮＡに関連のない非特異的なｃＤＮＡの合成を抑制でき、所望の標的ＲＮＡに対するｃＤＮＡの特異的な合成が可能となる。したがって、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢの逆転写反応系への適用により、所望の標的ＲＮＡに対するｃＤＮＡを特異的、かつ、効率的に合成することが可能となる。
【００５７】
ここで、ＲＮＡとしては、全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等、特に制限はない。所望の遺伝子が発現若しくは発現していることが期待される細胞、組織から、公知の方法を用いて調製される。例えば、グアニジン／セシウムＴＦＡ法、塩化リチウム／尿素法、ＡＧＰＣ法等を利用できる。また、プライマーとして、適用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニールするものであれば特に制限はなく、上記したようにランダムへキサマープライマー、オリゴｄＴプライマー、標的遺伝子特異的プライマーを使用できる。ここで、標的遺伝子特異的プライマーとは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するものであり、好適には、通常のＰＣＲ反応系で使用されるプライマーの３´側が利用される。
【実施例】
【００５８】
〔実施例１〕
高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響−１
高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質が鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系に与える影響を、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質における場合とで比較検討し、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質が、鋳型核酸に対する特異性を向上できることを確認する実験を行った。
【００５９】
（方法）
高度好熱菌ＳＳＢタンパク質、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の存在下で、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応を行い、鋳型核酸の増幅に与える影響を比較した。反応液（１０μｌ）としては、鋳型核酸を１ｎｇ、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質若しくは高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を夫々３．０μｇずつ添加したサンプルを１０本ずつ調製した。
【００６０】
ここでは、鋳型核酸として、ｐＵＣ１９ＤＮＡ（ＴｍｐｌｉＰｈｉ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔに添付のポジティブコントロール用（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。
【００６１】
また、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質として、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するサーマス・サーモフィラス由来の高度好熱菌ＳＳＢタンパク質を使用した。以下、かかる改変のないサーマス・サーモフィラス由来のＳＳＢタンパク質を「Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質」と略する場合がある。
【００６２】
そして、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する改変型を使用した。これは、ここで比較の対象とした配列番号１で示されるサーマス・サーモフィラス由来のＳＳＢタンパク質における２５５番目のフェニールアラニンがプロリンに置換されている。以下、かかる改変型を「Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐ」と略する場合がある。
【００６３】
各サンプルにつき、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間の増幅を行った。等温増幅反応は、ＲＣＡ法に基づいて行い、鎖置換ポリメラーゼとしてＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを、ランダムプライマーとしてランダムヘキサマーをそれぞれ使用した。詳細には、ＴｍｐｌｉＰｈｉ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて製造業者の指示に従って増幅反応を行った。
【００６４】
増幅後、各増幅反応液を２μｌずつ分取して、１．２％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後のゲルをエチジウムブロミドで染色し、核酸のバンドを可視化した。
【００６５】
また、ＳＳＢタンパク質を含む他の何らの組換え関連タンパク質をも添加せず、上記と同様に実験を行ったサンプルをコントロールとした。
【００６６】
（結果）
結果を図１に示す。
図１中、レーン１〜１０は、コントロールである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間増幅反応を行った結果を示す。
図１中、レーン１１〜２０は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質の存在下で増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間増幅反応を行った結果を示す。
図１中、レーン２１〜３０は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐの存在下で増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間増幅反応を行った結果を示す。
【００６７】
Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加して増幅を行なった場合に、鋳型核酸であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が増幅できることが確認された（図１、レーン２１〜３０）。一方、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質を添加して増幅を行なった場合に確認された増幅産物は、鋳型核酸に関連しないバックグラウンドノイズである可能性が高いと思われた（図１、レーン１１〜２１）。以上の結果を更に確証すべく、更に実施例２において検討を行った。
【００６８】
〔実施例２〕
高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響−２
高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質が等温増幅反応系における非特異的増幅に与える影響について、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質における場合とで比較検討する実験を行った。
【００６９】
（方法）
高度好熱菌ＳＳＢタンパク質（Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質）、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質（Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐ）の存在下で、等温増幅反応を行い、これらが非特異的増幅に与える影響を比較した。鋳型としてｐＵＣ１９ＤＮＡを添加しなかったことを除いては実施例１と同様に実験を行った。
【００７０】
（結果）
結果を図２に示す。
図２中、レーン１〜１０は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質の存在下で等温増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間増幅反応を行った結果を示す。
図２中、レーン１１〜２０は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐの存在下で等温増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間増幅反応を行った結果を示す。
【００７１】
Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加して増幅を行なった場合には、増幅産物は確認されなかった（図２、レーン１１〜２０）。一方、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質を添加して増幅を行なった場合には、鋳型核酸を添加しなかったにもかかわらず、増幅産物が確認された（図２、レーン１〜１１）。ここで確認された増幅産物は、鋳型核酸とは関係のない増幅産物であり、例えばプライマーダイマーの形成が原因とされるバックグラウンドノイズであると考えられる。したがって、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加することによって非特異的な増幅は抑制することができるが、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質では非特異的な増幅を抑制できないことが確認された。
【００７２】
実施例１の結果とを併せて鑑みると、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加した場合には、鋳型核酸の存在下でのみ増幅産物が得られた（図１、レーン２１〜３０、及び図２、レーン１１〜２０の比較）ことから、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐが鋳型核酸の特異的増幅に貢献していることが導かれる。また、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質に関して、実施例１において鋳型核酸の存在下で得られた増幅パターン（図１、レーン１１〜２０）と、鋳型核酸の不在下での本実施例２において得られた増幅パターン（図２、レーン１〜１０）とは、ほぼ同一であった。つまり、実施例１で得られた増幅産物についても、鋳型核酸とは関連のない非特異的な増幅の結果生じたものが多く含まれることが確認された。
【００７３】
以上の結果より、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を添加した場合には、鋳型核酸に関連のない非特異的な増幅を抑制し、かつ、鋳型核酸の特異的な増幅を効率的に行うことができ、増幅効率の向上に寄与し得ることが判明した。しかしながら、改変のない高度好熱菌ＳＳＢタンパク質を添加した場合には、非特異的な増幅を抑制できず、鋳型核酸の特異的な増幅を行うには適しないことが判明した。
【００７４】
〔実施例３〕
高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響−３
次に、実施例１及び２の増幅反応液を１．５μｌずつ分取して、ナイロンメンブランフィルターにスポットし、フィルター上に固定化した。固定化後、３２Ｐで標識したｐＵＣ１９鋳型核酸をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った後、スポットを可視化し、増幅産物量を確認した。結果を図３に示す。
【００７５】
増幅産物量の比較においても、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐの方は、鋳型核酸の不在下では増幅産物はほとんど得られず、鋳型核酸の存在下でのみ増幅産物が得られることが確証された。しかしながら、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質の方は、鋳型核酸の存在下及び不在下の双方において、ほぼ同量の増幅産物が得られた。つまり、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質を添加して増幅反応を行った場合得られる増幅産物は、鋳型核酸に関連のない非特異的な増幅産物であると考えられる。したがって、鋳型核酸存在下で確認されている増幅産物の、ほとんどはバックグラウンドノイズある蓋然性が高いことが判明した。
【００７６】
以上の結果より、改変のない高度好熱菌ＳＳＢタンパク質は、鋳型核酸の特異的な増幅を抑制していることが考えられる。したがって、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の添加下で確認されている鋳型核酸の増幅効率の向上は、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質特有の効果であることが判明した。
【００７７】
〔実施例４〕
ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液が等温増幅反応系に与える影響
ＳＳＢタンパク質を貯蔵するのに用いられるＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液が、等温増幅反応系に影響を与えるか否かを検討する実験を行った。
【００７８】
（方法）
実施例１〜３より、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を等温増幅系に添加した場合に効率的な特異的増幅産物の産生を導けることが確認された。本実施例においては、かかる効果がＳＳＢタンパク質を貯蔵するために使われるＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液の含有成分に起因するものではないか否かを検討した。反応液（１０μｌ）としては、ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液０．５μlを添加したサンプルと、ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液と高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を０．３μｇ（０．５μｌ）を添加したサンプルを、夫々１４本ずつ調製した。
【００７９】
ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液は、１．５Ｍ ＫＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロールに調製したものを使用した。また、鋳型核酸及び高度好熱菌改変型ＳＳＢ（Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐ）は、実施例１〜２で使用したものと同じものを使用し、実施例１、２と同様にして増幅反応を行った。なお、増幅反応は、各サンプルにつき、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．５、及び７．０時間行った。
【００８０】
また、ＳＳＢタンパク質を含む他の何らの組換え関連タンパク質をも添加せず、上記と同様に実験を行ったサンプルをコントロールとした。
【００８１】
（結果）
結果を図４に示す。
図４中、レーン１〜１４はコントロールであり、夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５及び７．０時間増幅反応を行った結果を示す。
図４中、レーン１５〜２８はＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液の存在下で等温増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、及び７．０時間増幅反応を行った結果を示す。
図４中、レーン２９〜４２はＴｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐ及びＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液の存在下で等温増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、及び７．０時間増幅反応を行った結果を示す。
【００８２】
次に、実施例３の増幅反応液のうち、増幅時間０、１．０、２．０、３．０、４．０、及び５．０の反応液を１．５μｌずつ分取して、ナイロンメンブランフィルターにスポットし、フィルター上に固定化した。固定化後、３２Ｐで標識したｐＵＣ１９鋳型核酸をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った後、スポットを可視化し、増幅産物量を確認した。結果を図５に示す。
【００８３】
貯蔵緩衝液を添加した場合の増幅産物量は、コントロールと大きな相違は認められなかった（図４のレーン１〜１４とレーン１５〜２８の比較、及び図５）。Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加した場合の増幅産物量は、特に、増幅時間３時間以上で、コントロール及び貯蔵緩衝液のみの場合と比較して、有意に増幅産物量が増加していることが確認された（図４のレーン２９〜４２と他のレーンとの比較、及び図５）。
【００８４】
以上の結果より、実施例１〜３に確認された高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質添加による特異的増幅産物の産生において、ＳＳＢタンパク質貯蔵溶液の影響を受けたものではなく、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質による作用であることが判明した。
【００８５】
〔実施例５〕
種々の組換え関連タンパク質が等温増幅反応系に与える影響−１
上述の実施例１〜３において、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質が等温増幅反応において鎖置換ポリメラーゼの鋳型核酸に対する特異性を向上させることが確認された。以下の実施例５〜７においては、他の種々の組換え関連タンパク質が、等温増幅反応系に影響を与えるか否かを比較検討する実験を行った。
【００８６】
（方法）
等温増幅反応系に、鎖置換因子或いは複製補助タンパク質として知られる種々の組換え関連タンパク質を何れか１種類添加することによって標的ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片の増幅状況とバックグラウンドノイズの発生状況を確認した。ここで、実験に供した組換え関連タンパク質は以下の通りであった。
【００８７】
・サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ８由来のＲｅｃＯタンパク質（以下、「Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質」と略する場合がある）
・大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）由来のＲｅｃＡタンパク質（以下、「Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＯタンパク質」と略する場合がある）
・ サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ８由来のＲｅｃＡタンパク質（以下、「Ｔｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質」と略する場合がある）
・ Ｅ.ｃｏｌｉ由来のＳＳＢタンパク質（以下、「Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質」と略する場合がある）
・ サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ８由来の改変型ＳＳＢタンパク質（かかる改変型は、実施例１〜４で使用したＴｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐである。）
・Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質
【００８８】
反応液（１０μｌ）を、鋳型核酸を１ｎｇと、上記組換えタンパク質を夫々３．０μｇずつ１種類添加したサンプルを各組換えタンパク質につき１本ずつ調製した。更に、鋳型核酸を添加しないことを除いては同様に調製したサンプルを各組換えタンパク質につき１本ずつ調製した。ここでは、鋳型核酸及び等温増幅反応は実施例１〜３と同様に行った。増幅反応を２４時間行った後、６５℃で１０分間熱変性することにより増幅反応を停止した。増幅反応後の反応液を５μＬずつ分取し、１％アガロース電気泳動に供した。電気泳動は定法に従って４．５Ｖ/ｃｍで４５分行った。電気泳動後、エチジウムブロミド染色を行って増幅産物を可視化した。
【００８９】
また、コントロールとして、何れの組換え関連タンパク質をも添加せず、上記と同様に実験を行った。
【００９０】
（結果）
結果を図６に示す。
図６中、レーン１〜７は鋳型核酸の存在下で増幅反応を行った結果を示す。レーン１は、コントロールである。
レーン２は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質を、
レーン３は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン４は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質を
レーン５は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を、
レーン６は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを、
レーン７は、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質を添加した場合の結果を示す。
図６中、レーン８〜１４は鋳型核酸の不存在下で増幅反応を行った結果を示す。
レーン８は、コントロールである。
レーン９は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質を、
レーン１０は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン１１は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質を
レーン１２は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を、
レーン１３は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを、
レーン１４は、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質を添加した場合の結果を示す。
【００９１】
Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加して増幅反応を行った場合（図６、レーン６）、目的とするｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が増幅できることが確認された。そして、鋳型核酸の不在下では増幅産物が確認されなかった（図６、レーン１３）ことから、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加により鋳型核酸の特異的な増幅が行われていることが確認された。
【００９２】
その一方で、コントロールは、ｐＵＣ１９ＤＮＡ由来の増幅産物も確認されたが（図６、レーン１）、鋳型核酸を添加しないで増幅反応を行った場合においても増幅産物が認められた（図６、レーン８）。これは、例えばプライマーダイマーの形成が原因とされる鋳型核酸に関連しない非特異的増幅が生じたものであり、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を添加した場合にも同様の非特異的増幅が確認された（図６、レーン１０〜１２）。そして、これらのＥ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質で確認された鋳型不在下での増幅パターンは、これらのタンパク質の存在下で鋳型核酸を添加して増幅した場合に得られた増幅パターンと相似していた。このことから、鋳型核酸添加下で得られた増幅産物も鋳型核酸に関連する増幅産物ではなく、非特異的増幅の結果得られた増幅産物であると考えられる。一方で、鋳型核酸の増幅は抑制されていることが考えられる。また、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質及びＴ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質を添加した場合には、鋳型核酸の存在下ならびに不在下に関わらず、増幅産物を得ることが出来ず、増幅が阻害された（図６、レーン２とレーン９、及びレーン７とレーン１４）。
【００９３】
以上の結果より、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を添加した場合には、鋳型核酸に関連のない非特異的な増幅を抑制できることが確認された。かかる知見より、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を等温増幅系に添加することにより、鋳型核酸の特異的な増幅を効率的かつ高精度に行うことができることが判明した。また、本発明の高度好熱菌由来改変型のＳＳＢタンパク質以外の組換え関連タンパク質を添加して増幅反応を行った場合には、非特異的な増幅を抑制できないばかりか、鋳型核酸の増幅阻害が起きていると考えられるが、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を添加して増幅反応を行った場合には、このような増幅阻害を抑制できるものと考えられる。また、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質を添加した場合には、非特異的な増幅を抑制することができる一方で、鋳型核酸の増幅をも阻害することが確認された。つまり、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質の使用は、反応系に対して添加量等を適切に制御する必要があり、手順が煩雑となるという欠点を有することが判明した。
【００９４】
〔実施例６〕
種々の組換え関連タンパク質が等温増幅反応系に与える影響−２
実施例５に続き、種々の組換え関連タンパク質が、等温増幅反応系に影響を与えるか影響を比較検討する実験を行った。
【００９５】
（方法）
実施例５と同様にして、増幅時間を１８時間として種々の組換え関連タンパク質が、等温増幅反応系に影響を検討した。
【００９６】
（結果）
結果を図７に示す
図７、レーン１〜７は鋳型核酸の存在下で増幅反応を行った結果を示す。
レーン１は、コントロールである。
レーン２は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質を、
レーン３は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン４は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン５は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを、
レーン６は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を、
レーン７は、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質を添加した場合の結果を示す。
図７、レーン８〜１４は、鋳型核酸の不存在下で増幅反応を行った結果を示す。
レーン８は、コントロールである。
レーン９は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質を、
レーン１０は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン１１は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン１２は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを、
レーン１３は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を、
レーン１４は、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質を添加した場合の結果を示す。
【００９７】
実施例５と同様に、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加して増幅反応を行った場合において、鋳型核酸であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が増幅することが判明した（図７、レーン５とレーン１２の比較）。
【００９８】
一方、鋳型核酸の存在下、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、及びＥ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を添加した場合（図７、レーン３、４及び６）においては、鋳型核酸を添加しないで増幅反応を行って得られた増幅産物と同じサイズの増幅産物が認められた（図７、レーン１０、１１及び１３）。鋳型核酸不在下で増幅される増幅産物は、プライマーダイマー等が原因とされるバックグラウンドノイズと考えられ、鋳型核酸に特異的なＤＮＡ断片ではない。したがって、これらのタンパク質の添加は、非特異的増幅の抑制効果を発揮し得るものではないと判明した。
【００９９】
以上の結果を、実施例５の結果と併せて鑑みると、反応時間が変化しても同様の結果が得られたことから、反応時間の変化により高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の作用に変化は認められないことが判明した。
【０１００】
〔実施例７〕
種々の組換え関連タンパク質が等温増幅反応系に与える影響（制限酵素処理）−３
実施例６で使用した等温増幅後の反応液から５μＬずつ分取して、制限酵素処理を行った。制限酵素処理は、１０ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＩを使用し、３７℃で２時間反応させた。
【０１０１】
制限酵素処理後、１％アガロース電気泳動に供した。電気泳動は、実施例５〜６と同様の方法によって行った。
【０１０２】
結果を図８に示した。
図８中、レーン１〜１４は、図６のレーン１〜１４に対応する。
【０１０３】
コントロール、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐ、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質の存在下であっては、鋳型核酸であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が含まれていることが確認された（図８、レーン１、３〜６）。
しかしながら、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質に関しては、鋳型核酸を添加しないで増幅反応を行った場合にも、増幅産物のバンドが確認された（図８、レーン１０）。これにより、増幅反応によって得られた増幅産物中に、鋳型核酸に非特異的なＤＮＡ断片が含まれることを意味する。さらに、鋳型核酸を添加した場合においても、電気泳動ゲル上には、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断されないＤＮＡ分子の存在が確認された。これは、鋳型核酸に対して非特異的な増幅が行われた結果生じたＤＮＡ断片であると考えられた。
尚、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質においても同様に非特異的な増幅産物が検出された（図８、レーン４と１１の比較、レーン６と１３の比較）。
【０１０４】
以上の結果より、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を添加したサンプルのみが鋳型核酸であるｐＵＣ１９ＤＮＡに非特異的なＤＮＡ断片の増幅を抑制できることが判明した。一方、他の組換えタンパク質の存在下では、そのような効果を得ることができないことが判明した。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】高度好熱菌ＳＳＢタンパク質、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響を、鋳型核酸の存在下で比較検討した実施例１の結果を示す電気泳動パターン
【図２】高度好熱菌ＳＳＢタンパク質、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響を、鋳型核酸の不在下で比較検討した実施例２の結果を示す電気泳動パターン
【図３】高度好熱菌ＳＳＢタンパク質、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響をハイブリダイゼーションにより検討した実施例３の結果を示す部ロット
【図４】ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液が等温増幅反応系に与える影響を検討した実施例４の結果を示す電気泳動パターン
【図５】ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液が等温増幅反応系に与える影響をハイブリダイゼーションにより検討した実施例４の結果を示すブロット
【図６】鎖置換因子として知られる種々のタンパク質を何れか１種類添加することによって等温増幅反応を２４時間行い、目的のＤＮＡ断片の増幅状況とバックグラウンドノイズの発生状況を確認した実施例５の結果を示す電気泳動パターン
【図７】鎖置換因子として知られる種々のタンパク質を何れか１種類添加することによって等温増幅反応を１８時間行い、目的のＤＮＡ断片の増幅状況とバックグラウンドノイズの発生状況を確認した実施例６の結果を示す電気泳動パターン
【図８】実施例６で使用したサンプルを制限酵素処理し、電気泳動を行った実施例７の結果を示す電気泳動パターン
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及びその利用方法に関する。詳細には、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅系において鋳型核酸の増幅効率を向上できる高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、及びその利用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、種々の核酸の指数関数的増幅方法が開発されているが、特に核酸を効率的に増幅する方法としては、概して反応温度を変動させる熱サイクルを用いるもの、及び反応が等温であるものに分類される。
【０００３】
熱サイクルを用いる方法は、ポリメラーゼ連鎖反応、即ちＰＣＲ（例えば、非特許文献１参照）が知られている。ＰＣＲにおいては、標的となる鋳型核酸の相対する鎖に相補的な塩基配列を有する２つのプライマーを、鋳型核酸と混合する。そして、鋳型核酸の変性、プライマーの鋳型核酸へのアニーリング、及びＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸張（ＤＮＡ複製）を１ラウンドとした通常２０〜３０回のサイクルにより、鋳型核酸にアニールした２つのプライマーの間に位置する鋳型核酸の相補鎖の合成が行われる。この方法では合成鎖を新たな鋳型核酸とできるため、同一のプライマーセットを用いた別ラウンドの複製により、鋳型核酸の指数関数的な増幅が可能となる。そして、各サイクルで鋳型核酸を変性するのに必要な高温に耐えるために、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用することが必要である。さらに、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は増幅反応が連続的に進行しないので、核酸サンプルである鋳型核酸を一連の複数のサイクルに供して行わなければならない。
【０００４】
一方、鋳型核酸の増幅反応を等温で行う方法として、鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、非特許文献２参照）やローリングサークル増幅（ＲＣＡ）（例えば、非特許文献３、４及び５参照）等が知られている。ＳＤＡ法は、鋳型核酸に制限酵素でニックを入れ、このニックをもつＤＮＡ断片を順番に置換していくＤＮＡポリメラーゼ（鎖置換ポリメラーゼ）の作用を用いてＤＮＡを増幅する。一方、ＲＣＡ法は鋳型核酸にアニールしたプライマーを基点として合成された伸長鎖の先端で、鎖置換ポリメラーゼがその前の鎖を置換してハイブリッド形成を行う。そのため、これら方法では標的ＤＮＡ配列の増幅は等温で連続的に行われるため熱サイクルが不要となる。
【０００５】
このような鎖置換により、等温条件下で連続的に鋳型核酸の直線的または指数関数的な増幅が可能となる。従って、例えばＲＣＡ法では、熱サイクルを用いる方法と比べて、鋳型核酸の増幅過程をより単純にしたため増幅産物の産生量を効率よく増加できる、有効に増幅することができる鋳型核酸の長さが制限されない、熱サイクルを行う設備が不要となる等の利点を有する。
【０００６】
ここで、鋳型核酸の増幅反応において、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（single-strand DNA binding protein：以下、「ＳＳＢタンパク質」と略する場合がある。）が鋳型核酸の増幅反応効率等に関与していることが知られている。
【０００７】
ＳＳＢタンパク質は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に対する配列非特異的に親和性が高い。通常、ＤＮＡ複製、組換え、及び生物ゲノムの修復にはＳＳＢタンパク質が必要である。ＳＳＢタンパク質はその同族ＤＮＡポリメラーゼを特異的に刺激し、ＤＮＡ合成の忠実度を高め、螺旋の不安定化によりＤＮＡポリメラーゼの前進性を改善すると共にＤＮＡポリメラーゼ結合を促進し、複製開始点を組織化及び安定化する。つまり、ＳＳＢタンパク質は複製補助タンパク質として作用することが知られている（例えば、特許文献１及び２参照）。
【０００８】
ＳＳＢタンパク質は、バクテリオファージから真核生物まで、広く様々な起源から多数のＳＳＢタンパク質の例が分離されている。例えば、特許文献１には、ビール酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来の複製タンパク質Ａ−１（ｒｐａ−１）、ミトコンドリアタンパク質由来の複製タンパク質（ｒｉｍ−１）、Ｔ７由来の遺伝子２．５タンパク質（ｇｐ２．５）、バクテリオファージＰｈｉ２９のタンパク質ｐ５（ｐ５）、Ｔ４の遺伝子３２タンパク質（ｇｐ３２）及び大腸菌のＳＳＢタンパク質が開示されている。また、高度好熱菌からもＳＳＢタンパク質が分離されていることが知られている（例えば、非特許文献６及び７参照）。
【０００９】
そして、特許文献１には、鋳型核酸の増幅効率を改善するためにＳＳＢタンパク質を等温増幅反応系に添加することが記載されている。さらに、特許文献２において、鋳型核酸の鎖置換複製に有用な鎖置換因子として大腸菌由来のＳＳＢタンパク質が利用されている。つまり、当該鎖置換因子存在下で、鎖置換複製を実行できる鎖置換ポリメラーゼ（バクテリオファージ由来Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ等）により鋳型核酸のＲＣＡ増幅を行っていることが開示されている。
【００１０】
これら鎖置換ポリメラーゼを用いる鋳型核酸の増幅方法は、鋳型核酸を変性する当該鎖置換ポリメラーゼの鎖置換能力に依存している。そして、この鎖置換は、複製補助タンパク質や鎖置換因子により促進することができるため、複製補助タンパク質や鎖置換因子の存在により、鋳型核酸に特異的なＤＮＡ断片を効率よく増幅できると考えられていた。
【００１１】
【特許文献１】特開平１０−２３４３８９号公報（段落０００７、００１４等参照）
【特許文献２】特表２００２−５２５０７８号公報（段落００５９〜００６２等参照）
【非特許文献１】Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０-１３５４，１９８５
【非特許文献２】Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：３９２−３９６，１９９２
【非特許文献３】Amersham Biosciences社、“製品カタログ：GenomiPhi DNA Amplification Kit”、［online］、［平成１７年４月２８日検索］、インターネット、<URL：http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=912&goods_name=GenomiPhi+DNA+Amplification+Kit>
【非特許文献４】Ｄｅａｎ他、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． １１（６）、第１０９５頁〜第１０９９頁、２００１年６月
【非特許文献５】Ｌｉｚａｒｄｉ他、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９（３）、第２２５頁〜第２３２頁，１９９８年７月
【非特許文献６】Ｄａｂｒｏｗｓｋｉ他、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４８（Ｐｔ１０）、第３３０７頁〜第３３１５頁、２００２年１０月
【非特許文献７】Ｐｅｒａｌｅｓ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３１（２２）、第６４７３頁〜第６４８０頁、２００３年１１月
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、鎖置換ポリメラーゼを使用した等温増幅反応系においては、鋳型核酸に特異的なＤＮＡ断片が効率よく増幅されるだけでなく、鋳型核酸に非特異的なＤＮＡ断片も増幅され易いという問題点があった。大腸菌や酵母等由来のＳＳＢタンパク質を添加して等温増幅反応を行う特許文献１及び２に開示の方法においても、非特異的なＤＮＡ断片の増幅を抑制できない問題点があった。
【００１３】
この理由の一つとして、等温増幅における温度が通常３０〜６０℃程度であるためプライマーダイマーが形成され易くなり、このプライマーダイマー形成の結果、鋳型核酸に非特異的なＤＮＡ断片が増幅され易くなるということが考えられる。つまり、鋳型核酸の不在下であってもプライマーダイマーが形成され、非特異的な核酸が増幅される。鋳型核酸に非特異的なＤＮＡ断片は、増幅精度が低下する要因となり、後の実験に支障を来たすバックグラウンドノイズとなる。そして、増幅にランダムな配列を有するプライマーを使用することから、非特異的増幅を制御することは困難であるとされてきた。
【００１４】
かかる理由により、鋳型核酸の等温増幅方法はＰＣＲのように熱サイクルを不要とする等から汎用性の高い技術として期待されているが、上述した非特異的増幅による増幅精度の問題からその用途が限定されているのが現状であった。
【００１５】
従って、本発明は、増幅精度を向上するべく、等温増幅反応における鋳型核酸の増幅において非特異的増幅を制御できる技術を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者が鋭意検討を行った結果、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が有するアミノ酸配列において、ある特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位をアミノ酸配列中に有する高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を構築した。かかる高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅系に添加したところ、鋳型核酸に特異的な増幅産物が得られ、非特異的増幅が生じない、精度の高い増幅産物が得られることを見出した。これらの知見に基づいて本発明を完成するに至った。
【００１７】
上記目的を達成するため本発明は、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系における鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能を発現するアミノ酸配列を有する高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であって、１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加及び挿入の少なくとも１つからなる改変が生じている改変部位をアミノ酸配列中に有する高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を提供し、好ましくは、前記高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、又は、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である。
【００１８】
そして、好ましくは、前記改変が、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の鎖置換ポリメラーゼとの相互作用に変化が生じる改変であり、また、前記改変が、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合能に変化が生じる改変である。
【００１９】
また、好ましくは、前記改変が、少なくとも３個以上連続するプロリンを有するように高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列が改変されている。
【００２０】
具体的には、前記改変が、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を示す配列番号１のアミノ酸配列のうち、２５５番目のフェニールアラニンが他のアミノ酸に置換されているものが好ましく、また、前記改変が、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を示す配列番号４のアミノ酸配列のうち、２５６番目のフェニールアラニンが他のアミノ酸に置換されているものが好ましい。特には、前記他のアミノ酸がプロリンである。
【００２１】
また、上記目的を達成するため本発明は、鎖置換ポリメラーゼを用いた核酸の等温増幅方法であって、本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を添加して増幅反応を行う核酸の増幅方法を提供し、好ましくは、前記鎖置換ポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、鎖置換ポリメラーゼを用いたＤＮＡの等温増幅系に添加することにより、改変部位を有しない高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質及び他の組換え関連タンパク質では奏することができない、特異的なＤＮＡ断片の効率的な増幅が可能となる。つまり、非特異的増幅を抑制でき、バックグラウンドノイズの影響を受けないＤＮＡ断片の増幅が可能となり、増幅効率の向上に寄与し得る。
したがって、本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を利用した増幅方法は、一般的な分子生物学の方法に幅広く利用可能である。例えば、遺伝子型分析のために、環境中より採収した微量の微生物から抽出した少量の試料から大量のＤＮＡを調製する有用な方法として、或いは、ＤＮＡシークエンシングのためのＤＮＡの調製方法として、有用である。さらに、動物或いは植物細胞から抽出した少量の試料からＤＮＡチップ固定用ＤＮＡを調製する等、種々の用途に適用できる汎用性の高いＤＮＡの調製方法として利用価値が高い。
【００２３】
更に、本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、ＤＮＡライブラリーからの標的cＤＮＡクローンのクローニング系に適用することができる。これにより、特異的かつ効率的な標的ｃＤＮＡクローンのＤＮＡライブラリーからの濃縮又は単離が達成される。特異的かつ効率的なｃＤＮＡクローニングは、遺伝子発現、発生、分化等の解析、並びに有用物質の産生の分野において大いに貢献し得る。
【００２４】
また、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢは、ＲＮＡからＤＮＡの逆転写反応系に適用することができ、これにより、所望の標的ＲＮＡの特異的、かつ、効率的なｃＤＮＡへの転換が達成される。ＲＮＡからｃＤＮＡへの変換は遺伝子工学上不可欠な手法であることから、遺伝子発現検出とその定量、ＲＮＡの構造解析、ｃＤＮＡクローニング等、その利用価値は高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質には、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系における鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能を発現する、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質における、すべての改変型が含まれる。つまり、本発明の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質と比較して鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系において鋳型核酸に対する特異性が向上している。そして、高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列において、特定のアミノ酸に改変が生じている改変部位を有する。ここで、改変とは、改変の基礎となるタンパク質のアミノ酸配列のうち、１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入および付加の少なくとも１つからなる改変が生じていることを意味する。そして、「１個以上のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び付加の少なくとも１つからなる改変」とは、改変の基礎となるタンパク質をコードする遺伝子に対する公知のＤＮＡ組換え技術、点変異導入方法等によって、欠失、置換、挿入又は付加することができる程度の数のアミノ酸が、欠失、置換、挿入又は付加されることを意味し、これらの組み合わせをも含む。
【００２６】
このような改変は、人為的に導入することもできるし、また、自然界において非意図的に生じることもある。本発明における高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質には、これら双方の改変型が含まれる。
【００２７】
以下、本発明の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を「高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質」と略する場合がある。また、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を「高度好熱菌ＳＳＢタンパク質」と略する場合がある。そして、ここで、単に「高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質」、「高度好熱菌ＳＳＢタンパク質」と称する場合は、アミノ酸配列中に上述したような改変部位を有するものを含むものではない。
【００２８】
そして、改変型の基礎となる、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質としては、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）等に由来する高度好熱菌ＳＳＢタンパク質が好適に例示される。しかしながら、これに限定するものではない。なお、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質は、自然界より分離された高度好熱菌に保持されているＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列、及びＳＳＢタンパク質をコードする塩基配列が、意図的もしくは非意図的に改変が生じている改変部位を有していないことを意味する。
【００２９】
本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質は公知の方法によって取得することができる。例えば、改変の基礎となる高度好熱菌ＳＳＢタンパク質をコードする遺伝子に対して改変を施し、得られた改変遺伝子を用いて宿主細胞を形質転換し、かかる形質転換体の培養物から高度好熱菌ＳＳＢタンパク質を採取することによって取得することができる。
【００３０】
かかる高度好熱菌ＳＳＢタンパク質の遺伝子は、公知の遺伝子クローニング技術を用いて取得することができる。また、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースより検索することによって取得することができる遺伝子情報に基づいて、常法のホスホルアミダイト（phosphoramidite）法等のＤＮＡ合成法により合成することによっても取得するができる。ここで、本発明の改変型の基礎として好適な高度好熱菌ＳＳＢタンパク質の配列情報として、サーマス・サーモフィラス由来のＳＳＢのアミノ酸配列を配列番号１に、該ＳＳＢタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号２に示す（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＪ５６４６２６）。また、サーマス・アクアティカス由来のＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号４に、該ＳＳＢタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号５に示す（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ２７６７０５）。
【００３１】
高度好熱菌ＳＳＢタンパク質をコードする遺伝子に改変を施す方法としては、特に制限はなく、当業者に公知の改変タンパク質作製のための変異導入技術を利用することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ法等を利用して点変異を導入するＰＣＲ突然誘発法、あるいは、トランスポゾン挿入突然変異誘発法などの公知の変異導入技術を利用することができる。例えば、大腸菌由来のＳＳＢタンパク質に対する変異導入に関する公知文献（例えば、Ｃｈａｓｅ ＪＷ他、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５９（２）、第８０５頁〜第８１４頁、１９８４年１月２５日）を参照することができる。また、市販の変異導入用キット（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標） Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製））を利用してもよい。また、一旦、目的とする高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列が定まれば、それをコードする適当な塩基配列を決定することができ、常法のホスホルアミダイト法等のＤＮＡ合成法を利用して本発明の高度好熱菌由来の改変型ＳＳＢタンパク質をコードするＤＮＡを合成することができる。
【００３２】
得られた改変遺伝子を用いて宿主細胞を形質転換するためには、公知の大腸菌等の宿主・発現ベクターシステムを利用することができる。例えば、該高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させ、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を効率的に発現できる大腸菌に導入する。そして、炭素源、窒素源その他必須の栄養素を含む培地に接種し、常法に従って培養して該高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を発現させる。
【００３３】
このようにして得られた形質転換体の培養物からのＳＳＢタンパク質の採取、精製は、常法に従って行なえばよい。例えば、宿主の大腸菌を破砕して熱処理を行うことにより、当該ＳＳＢタンパク質以外の大腸菌由来タンパク質は熱変性して熱凝集するため、遠心分離等により分離除去できる。これにより熱変性しない当該ＳＳＢタンパク質を可溶画分として大腸菌由来タンパク質と分離し、親和性クロマトグラフィー等を用いて精製できる。
【００３４】
このとき、当該ＳＳＢタンパク質は高度好熱菌由来であるため室温で構造が安定しており、さらに有機溶剤に対しても高い安定性を有している。そのため、上記精製工程は室温で行うことが可能である。
【００３５】
なお、発現ベクターは、プロモーター配列、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質をコードする遺伝子を挿入できる少なくとも１つの制限酵素サイトを有するマルチクローニングサイト等の配列を含み、かつ、上記宿主細胞で発現できるものであれば、何れの発現ベクターを用いることができる。好適なプロモーターとしては、例えば、Ｔ７ｌａｃプロモーターを利用するのが好ましい。
【００３６】
さらに、この発現ベクターには他の公知の塩基配列が含まれていてもよい。他の公知の塩基配列としては特に限定されない。例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列が挙げられる。また、ネオマイシン耐性遺伝子・カナマイシン耐性遺伝子・クロラムフェニコール耐性遺伝子・アンピシリン耐性遺伝子・ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等をも含ませることができる。
【００３７】
このような発現ベクターは、市販の大腸菌用発現ベクター（例えばｐＥＴタンパク質発現システム：ノバジェン社製）を用いることが可能であり、さらに、適宜所望の配列を組み込んだ発現ベクターを作製して使用することが可能である。
【００３８】
また、宿主細胞としては、大腸菌に限定されず、バシラス属細菌、シュードモナス属細菌等をも利用できる。更に、原核生物に限定されず真核生物細胞を利用することが可能である。例えば、Saccharomyces cerevisiae等の酵母、Ｓｆ９細胞等の昆虫細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−７細胞等の動物細胞等を好適に利用することが可能である。
【００３９】
そして、精製されたＳＳＢタンパク質が所望の改変が生じている改変部位を有する高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質であるか否かの確認は、公知のアミノ酸分析法によって行うことができる。例えば、エドマン分解法に基づく自動アミノ酸決定法が利用できる。また、精製されたＳＳＢタンパク質を、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応に供して改変部位を有しない高度好熱菌ＳＳＢタンパク質と比較して、鋳型核酸に対する特異性が向上しているか否かを確認することによって行うことができる。確認方法としては、例えば、本発明の実施例に示す方法によって行うことができる。
【００４０】
ここで、上記の「鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能」とは、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応において、鋳型核酸に関連のない非特異的増幅がほとんど認められず、かつ、鋳型核酸を高い収率で増幅できることを意味する。そして、好ましくは、鋳型核酸の増幅効率を５〜１０倍向上させ得る機能を意味する。例えば、配列番号３若しくは６に表すアミノ酸配列を有するタンパク質が有する、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系における、鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能と実質的に同等であることをいう。
【００４１】
本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質としては、そのアミノ酸配列中に、前記高度好熱菌ＳＳＢタンパク質の鎖置換ポリメラーゼとの相互作用に変化を生じさせる改変を有しているものを好適に利用することができる。さらには、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質のＤＮＡ結合能に変化を生じさせる改変を有しているものをも好適に利用することができる。
【００４２】
つまり、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質が、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼとの相互作用に何らかの影響を与える可能性がある。ここで、「鎖置換ポリメラーゼとの相互作用」とは、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質−鎖置換ポリメラーゼ、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質−ＤＮＡ、若しくは高度好熱菌ＳＳＢタンパク質−鎖置換ポリメラーゼ−ＤＮＡとの相互作用を意味する。ここで、ＤＮＡとは一本鎖ＤＮＡであり、プライマー若しくは鋳型核酸の一本鎖部分のいずれか一方、若しくは、その両方を意味する。そして、「前記高度好熱菌ＳＳＢタンパク質の鎖置換ポリメラーゼとの相互作用に変化が生じる」とは、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質が元来有していた鎖置換ポリメラーゼに対する作用に変化が生じることを意味する。ここで、大腸菌、Sulfolobus sulfataricus等由来のＳＳＢタンパク質が、一本鎖ＤＮＡのみならず、プライマーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩ等のポリメラーゼにも結合することが報告されている（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄ ＤＪ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２００４ Ｆｅｂ １０；３２（３）：１０６５−７４、Ｓｕｎ Ｗ, ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９６ Ｄｅｃ；１７８（２３）：６７０１−５、Ｆｒａｄｋｉｎ ＧＥ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （Ｍｏｓｋ）． １９８８ Ｊａｎ−Ｆｅｂ；２２（１）：１１１−６等を参照のこと。）。これにより、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅系にＳＳＢタンパク質を添加した場合、ＳＳＢタンパク質は鎖置換反応を補助する一方で、ポリメラーゼ活性の低下による増幅効率の低下という望ましくない作用を奏することが推定される。そして、かかる推定は、下記で説明する実施例における大腸菌由来ＳＳＢ、高度好熱菌ＳＳＢ等の存在下では増幅効率の低下を招いたとの結果に合致する。そこで、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質として、ＳＳＢタンパク質が元来有するポリラーゼに対する結合能を有する領域におけるアミノ酸配列が崩壊したものが好ましく例示される。そして、上記した「前記高度好熱菌ＳＳＢタンパク質の鎖置換ポリメラーゼとの相互作用に変化」には、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質が元来有している鎖置換ポリメラーゼに対する結合能が低下、若しくは消失するような変化が含まれることが推定される。
【００４３】
具体的には、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質としては、少なくとも３個以上連続するプロリンを有するように前記高度好熱菌ＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列が改変されたものが例示される。つまり、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質は、そのアミノ酸配列中に、配列Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを有するものが好適に例示され、更に、かかる配列の前後に１若しくは数個のプロリン残基を有するものであってもよい。
【００４４】
本発明においては、特に、例えば、サーマス・サーモフィラス由来のＳＳＢタンパク質を表す配列番号１の２５５番目のフェニールアラニン、サーマス・アクアティカス由来のＳＳＢタンパク質を表す配列番号４の２５６番目のフェニールアラニンが他のアミノ酸に置換されていることが好ましい。そのようなアミノ酸としては、プロリンが特に、好適に例示される。サーマス・サーモフィラス由来のＳＳＢタンパク質を表す配列番号１の２５５番目のフェニールアラニンをプロリンに置換した本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列を、配列番号３に示す。また、サーマス・アクアティカス由来のＳＳＢタンパク質を表す配列番号４の２５６番目のフェニールアラニンをプロリンに置換した本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質のアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００４５】
本発明は更に、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を用いた、等温増幅可能な鎖置換ポリメラーゼを用いた鋳型核酸の等温増幅方法を提供する。本発明の増幅方法は、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を添加して増幅反応を行うものである。
【００４６】
ここで、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅方法は、高熱による熱変性を必要としない等温条件下で、鎖置換ポリメラーゼの鎖置換活性により核酸を指数対数的に増幅する方法である。このような鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅方法としては、ローリングサークル増幅（以下、「ＲＣＡ」と略する場合がある）法が好適に例示される。ＲＣＡ法の原理は以下の通りである。ＲＣＡ法による鋳型核酸の等温増幅方法は、例えば、等温条件下において、鋳型核酸である環状ＤＮＡにアニールした複数のランダムプライマーを基点にして、鎖置換ポリメラーゼが環状ＤＮＡの相補鎖を伸長する。そして、合成鎖の伸長に伴い、他のランダムプライマーの複製基点に達しても、当該鎖置換ポリメラーゼの鎖置換活性により他の合成鎖を剥がしながら鎖の伸長を継続する（ブランチング）。このとき、剥がされた合成鎖にはランダムプライマーがアニールできる部位が露出する。つまり、環状ＤＮＡだけでなく、この剥がされた合成鎖をも鋳型核酸として新たなＤＮＡ合成鎖を形成できるため、指数関数的な増幅となる。
【００４７】
このときに用いられるランダムプライマーは、ランダムヘキサマー等が好適に利用できる。その他のプライマーの例としては、鋳型核酸の標的部位に設定温度で特異的にアニールするプライマーを適用できる。このプライマーは、当該プライマー単独、或いは、上記ランダムプライマーと混合した状態で使用することが可能である。
【００４８】
プライマーの設計は、標的となる核酸配列に基づいて所望の領域を増幅するように、例えばプライマー設計支援ソフト等により設計されるが、ランダムプライマーの場合、ランダムな配列を有するように設計される。 このように設計されたプライマーは化学的に合成することが可能である。例えば、公知のホスホルアミダイト法を用いて固相合成により化学合成することができ、市販されている自動核酸合成装置により所望の塩基配列からなるプライマーを自動的に合成することも可能である。合成後のプライマーは、必要に応じてＨＰＬＣ等の公知の方法により精製される。
【００４９】
ここで、等温増幅における「等温」とは、ＰＣＲ法のようにＤＮＡ変性、アニール、鎖伸長の各工程で反応温度を変化させるのに対して、一定温度で制御して増幅反応を行うことを指す。増幅反応を行う一定温度は、好ましくは６０℃未満、より好ましくは４５℃未満、さらに好ましくは３７℃未満である。この温度は、適用する鎖置換ポリメラーゼにより適宜決定する。例えば、後述するバクテリオファージ由来Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合、増幅反応を行う好適な温度範囲は２５〜４２℃であり、好ましくは３０〜３７℃、更に好ましくは３０〜３４℃である。当該一定温度になるように設定したインキュベーター等の恒温チャンバーにおいて、サンプルを、４〜２４時間、好ましくは６〜２４時間、更に好ましくは１５〜２４時間程度インキュベートし、鋳型核酸の増幅反応を行う。
【００５０】
そして、鎖置換ポリメラーゼとしては、バクテリオファージ由来Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第5,198,543号及び米国特許第5,001、050号、Ｂｌａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．）が好適に例示される。しかしながら、これに限定されるものではない。例えば、Bst大断片のＤＮＡポリメラーゼ（Exo(-)Bst（Aliotta等、Genet. Anal.（オランダ国）12:185〜195（1996年））及びExo(-)BcaDNAポリメラーゼ（Walker及びLinn, Clinical Chemistry42:1604〜1608(1996年)）、ファージＭ２ＤＮＡポリメラーゼ（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ８４：２４７ （１９８９））、ファージφＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：８２８７ （１９８７））、ＶＥＮＴ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：１９６５−１９７５ （１９９３））、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４５：６２３−６２７ （１９７４））、Ｔ５ ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ９７：１３−１９ （１９９１））、シーケナーゼ（登録商標）（米国バイオケミカルズ社製）、ＰＲＤ１ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｚｈｕ ａｎｄ Ｉｔｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １２１９：２６７−２７６ （１９９４））及びＴ４ ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素（Ｋａｂｏｏｒｄ ａｎｄ Ｂｅｎｋｏｖｉｃ， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ． ５：１４９−１５７ （１９９５））等が挙げられる。
【００５１】
また、鋳型核酸としては、環状ＤＮＡが好適に例示されるがこれに限られるものではなく、直鎖状ＤＮＡを用いてもよい。ＲＣＡ法の場合、増幅効率の点から環状ＤＮＡが好ましい。鋳型核酸は一本鎖及び二本鎖が適用可能である。また、天然のＤＮＡとしてプラスミドＤＮＡ・真核及び原核生物のゲノムＤＮＡ、及び、人工的に作成したＤＮＡ分子として、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ・ファージミド・コスミド等の種々のＤＮＡ分子が鋳型核酸となりうる。さらに、オリゴヌクレオチド等の合成ＤＮＡも鋳型核酸とすることができる。
【００５２】
以上のように構成することにより、鋳型核酸に特異的なＤＮＡ断片の効率的な増幅が可能となる。つまり、鋳型核酸に関連のない非特異的増幅を抑制でき、バックグラウンドノイズの影響を受けないＤＮＡ断片の増幅が可能となる。
【００５３】
更に、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢは、ＤＮＡライブラリーからの標的ｃＤＮＡクローンの濃縮又は単離に適用することができる。詳細には、濃縮又は単離を所望する標的ｃＤＮＡの一部の配列をプライマーとして使用し、ＤＮＡライブラリーを鋳型として増幅反応を行う際に、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢを適用できる。ここで、増幅反応に際しては、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系の他、通常のＰＣＲ反応系等を利用することが可能である。これにより、標的ｃＤＮＡと関連のない非特異的な増幅を抑制でき、標的ｃＤＮＡのみを特異的に増幅可能となる。したがって、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢの、ＤＮＡライブラリーからの標的ＤＮＡクローンのクローニング系への適用により、所望の標的ｃＤＮＡクローンを特異的、かつ、効率的に濃縮、単離することが可能となる。
【００５４】
ここで、ＤＮＡライブラリーとしては、濃縮若しくは単離を所望する標的のＤＮＡ領域を含む、又は、含み得ることが期待されるＤＮＡライブラリーが使用される。そして、ＤＮＡライブラリーは、遺伝子ライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーのいずれでもよいが、特にはｃＤＮＡライブラリーが好ましい。なお、本明細書において、遺伝子ライブラリーとは、特定の単一生物種の全ゲノムＤＮＡを無作為にベクターに組み込んだクローン化されたＤＮＡの集合体を意味する概念として使用した。一方、ｃＤＮＡライブラリーとは、特定の組織、細胞、生物由来のｍＲＮＡを逆転写反応によってｃＤＮＡ化し、ベクターに組み込んで作成したｃＤＮＡ断片の集合体を意味する概念として使用した。
【００５５】
プライマーは、通常、標的核酸の特定配列に対して相補的になるように設計されるものである。特には、増幅すべき標的配列のその両端に相補的な塩基配列を有するものであることが好ましく、本発明においては濃縮又は単離を所望する標的ｃＤＮＡの一部の配列が好適に利用できる。なお、プライマーの設計は公知であり、標的となるｃＤＮＡの塩基配列に基づいて設計され、例えば、プライマー設計支援ソフト等を利用することができる。このように設計されたプライマーは化学的に合成することが可能である。例えば、公知のホスホルアミダイト法を用いて固相合成により化学合成することができ、市販の自動核酸合成装置により所望の塩基配列からなるプライマーを自動的に合成することも可能である。合成後のプライマーは、必要に応じてＨＰＬＣ等の公知の方法により精製される。
【００５６】
また、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢは、ＲＮＡからＤＮＡの逆転写反応に適用することができる。詳細には、逆転写酵素の存在下、ランダムへキサマープライマー、オリゴｄＴプライマー、標的遺伝子特異的プライマーを用いて、逆転写反応によりＲＮＡからのｃＤＮＡの合成反応を行う際に本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢを適用することができる。更には、合成されたｃＤＮＡを鋳型として増幅反応を行う際にも適用することができる。ここで、増幅反応に際しては、置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系の他、通常のＰＣＲ反応系等を利用することが可能である。これにより、標的ＲＮＡに関連のない非特異的なｃＤＮＡの合成を抑制でき、所望の標的ＲＮＡに対するｃＤＮＡの特異的な合成が可能となる。したがって、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢの逆転写反応系への適用により、所望の標的ＲＮＡに対するｃＤＮＡを特異的、かつ、効率的に合成することが可能となる。
【００５７】
ここで、ＲＮＡとしては、全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等、特に制限はない。所望の遺伝子が発現若しくは発現していることが期待される細胞、組織から、公知の方法を用いて調製される。例えば、グアニジン／セシウムＴＦＡ法、塩化リチウム／尿素法、ＡＧＰＣ法等を利用できる。また、プライマーとして、適用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニールするものであれば特に制限はなく、上記したようにランダムへキサマープライマー、オリゴｄＴプライマー、標的遺伝子特異的プライマーを使用できる。ここで、標的遺伝子特異的プライマーとは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するものであり、好適には、通常のＰＣＲ反応系で使用されるプライマーの３´側が利用される。
【実施例】
【００５８】
〔実施例１〕
高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響−１
高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質が鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系に与える影響を、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質における場合とで比較検討し、本発明の高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質が、鋳型核酸に対する特異性を向上できることを確認する実験を行った。
【００５９】
（方法）
高度好熱菌ＳＳＢタンパク質、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の存在下で、鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応を行い、鋳型核酸の増幅に与える影響を比較した。反応液（１０μｌ）としては、鋳型核酸を１ｎｇ、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質若しくは高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を夫々３．０μｇずつ添加したサンプルを１０本ずつ調製した。
【００６０】
ここでは、鋳型核酸として、ｐＵＣ１９ＤＮＡ（ＴｍｐｌｉＰｈｉ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔに添付のポジティブコントロール用（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。
【００６１】
また、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質として、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するサーマス・サーモフィラス由来の高度好熱菌ＳＳＢタンパク質を使用した。以下、かかる改変のないサーマス・サーモフィラス由来のＳＳＢタンパク質を「Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質」と略する場合がある。
【００６２】
そして、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質としては、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する改変型を使用した。これは、ここで比較の対象とした配列番号１で示されるサーマス・サーモフィラス由来のＳＳＢタンパク質における２５５番目のフェニールアラニンがプロリンに置換されている。以下、かかる改変型を「Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐ」と略する場合がある。
【００６３】
各サンプルにつき、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間の増幅を行った。等温増幅反応は、ＲＣＡ法に基づいて行い、鎖置換ポリメラーゼとしてＰｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼを、ランダムプライマーとしてランダムヘキサマーをそれぞれ使用した。詳細には、ＴｍｐｌｉＰｈｉ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて製造業者の指示に従って増幅反応を行った。
【００６４】
増幅後、各増幅反応液を２μｌずつ分取して、１．２％アガロースゲル電気泳動に供した。電気泳動後のゲルをエチジウムブロミドで染色し、核酸のバンドを可視化した。
【００６５】
また、ＳＳＢタンパク質を含む他の何らの組換え関連タンパク質をも添加せず、上記と同様に実験を行ったサンプルをコントロールとした。
【００６６】
（結果）
結果を図１に示す。
図１中、レーン１〜１０は、コントロールである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間増幅反応を行った結果を示す。
図１中、レーン１１〜２０は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質の存在下で増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間増幅反応を行った結果を示す。
図１中、レーン２１〜３０は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐの存在下で増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間増幅反応を行った結果を示す。
【００６７】
Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加して増幅を行なった場合に、鋳型核酸であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が増幅できることが確認された（図１、レーン２１〜３０）。一方、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質を添加して増幅を行なった場合に確認された増幅産物は、鋳型核酸に関連しないバックグラウンドノイズである可能性が高いと思われた（図１、レーン１１〜２１）。以上の結果を更に確証すべく、更に実施例２において検討を行った。
【００６８】
〔実施例２〕
高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響−２
高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質が等温増幅反応系における非特異的増幅に与える影響について、高度好熱菌ＳＳＢタンパク質における場合とで比較検討する実験を行った。
【００６９】
（方法）
高度好熱菌ＳＳＢタンパク質（Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質）、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質（Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐ）の存在下で、等温増幅反応を行い、これらが非特異的増幅に与える影響を比較した。鋳型としてｐＵＣ１９ＤＮＡを添加しなかったことを除いては実施例１と同様に実験を行った。
【００７０】
（結果）
結果を図２に示す。
図２中、レーン１〜１０は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質の存在下で等温増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間増幅反応を行った結果を示す。
図２中、レーン１１〜２０は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐの存在下で等温増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、及び４．５時間増幅反応を行った結果を示す。
【００７１】
Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加して増幅を行なった場合には、増幅産物は確認されなかった（図２、レーン１１〜２０）。一方、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質を添加して増幅を行なった場合には、鋳型核酸を添加しなかったにもかかわらず、増幅産物が確認された（図２、レーン１〜１１）。ここで確認された増幅産物は、鋳型核酸とは関係のない増幅産物であり、例えばプライマーダイマーの形成が原因とされるバックグラウンドノイズであると考えられる。したがって、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加することによって非特異的な増幅は抑制することができるが、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質では非特異的な増幅を抑制できないことが確認された。
【００７２】
実施例１の結果とを併せて鑑みると、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加した場合には、鋳型核酸の存在下でのみ増幅産物が得られた（図１、レーン２１〜３０、及び図２、レーン１１〜２０の比較）ことから、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐが鋳型核酸の特異的増幅に貢献していることが導かれる。また、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質に関して、実施例１において鋳型核酸の存在下で得られた増幅パターン（図１、レーン１１〜２０）と、鋳型核酸の不在下での本実施例２において得られた増幅パターン（図２、レーン１〜１０）とは、ほぼ同一であった。つまり、実施例１で得られた増幅産物についても、鋳型核酸とは関連のない非特異的な増幅の結果生じたものが多く含まれることが確認された。
【００７３】
以上の結果より、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を添加した場合には、鋳型核酸に関連のない非特異的な増幅を抑制し、かつ、鋳型核酸の特異的な増幅を効率的に行うことができ、増幅効率の向上に寄与し得ることが判明した。しかしながら、改変のない高度好熱菌ＳＳＢタンパク質を添加した場合には、非特異的な増幅を抑制できず、鋳型核酸の特異的な増幅を行うには適しないことが判明した。
【００７４】
〔実施例３〕
高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響−３
次に、実施例１及び２の増幅反応液を１．５μｌずつ分取して、ナイロンメンブランフィルターにスポットし、フィルター上に固定化した。固定化後、３２Ｐで標識したｐＵＣ１９鋳型核酸をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った後、スポットを可視化し、増幅産物量を確認した。結果を図３に示す。
【００７５】
増幅産物量の比較においても、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐの方は、鋳型核酸の不在下では増幅産物はほとんど得られず、鋳型核酸の存在下でのみ増幅産物が得られることが確証された。しかしながら、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質の方は、鋳型核酸の存在下及び不在下の双方において、ほぼ同量の増幅産物が得られた。つまり、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質を添加して増幅反応を行った場合得られる増幅産物は、鋳型核酸に関連のない非特異的な増幅産物であると考えられる。したがって、鋳型核酸存在下で確認されている増幅産物の、ほとんどはバックグラウンドノイズある蓋然性が高いことが判明した。
【００７６】
以上の結果より、改変のない高度好熱菌ＳＳＢタンパク質は、鋳型核酸の特異的な増幅を抑制していることが考えられる。したがって、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の添加下で確認されている鋳型核酸の増幅効率の向上は、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質特有の効果であることが判明した。
【００７７】
〔実施例４〕
ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液が等温増幅反応系に与える影響
ＳＳＢタンパク質を貯蔵するのに用いられるＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液が、等温増幅反応系に影響を与えるか否かを検討する実験を行った。
【００７８】
（方法）
実施例１〜３より、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を等温増幅系に添加した場合に効率的な特異的増幅産物の産生を導けることが確認された。本実施例においては、かかる効果がＳＳＢタンパク質を貯蔵するために使われるＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液の含有成分に起因するものではないか否かを検討した。反応液（１０μｌ）としては、ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液０．５μlを添加したサンプルと、ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液と高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を０．３μｇ（０．５μｌ）を添加したサンプルを、夫々１４本ずつ調製した。
【００７９】
ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液は、１．５Ｍ ＫＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、５０％グリセロールに調製したものを使用した。また、鋳型核酸及び高度好熱菌改変型ＳＳＢ（Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐ）は、実施例１〜２で使用したものと同じものを使用し、実施例１、２と同様にして増幅反応を行った。なお、増幅反応は、各サンプルにつき、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．５、及び７．０時間行った。
【００８０】
また、ＳＳＢタンパク質を含む他の何らの組換え関連タンパク質をも添加せず、上記と同様に実験を行ったサンプルをコントロールとした。
【００８１】
（結果）
結果を図４に示す。
図４中、レーン１〜１４はコントロールであり、夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５及び７．０時間増幅反応を行った結果を示す。
図４中、レーン１５〜２８はＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液の存在下で等温増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、及び７．０時間増幅反応を行った結果を示す。
図４中、レーン２９〜４２はＴｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐ及びＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液の存在下で等温増幅反応を行ったサンプルである。夫々、０、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、及び７．０時間増幅反応を行った結果を示す。
【００８２】
次に、実施例３の増幅反応液のうち、増幅時間０、１．０、２．０、３．０、４．０、及び５．０の反応液を１．５μｌずつ分取して、ナイロンメンブランフィルターにスポットし、フィルター上に固定化した。固定化後、３２Ｐで標識したｐＵＣ１９鋳型核酸をプローブとしてハイブリダイゼーションを行った後、スポットを可視化し、増幅産物量を確認した。結果を図５に示す。
【００８３】
貯蔵緩衝液を添加した場合の増幅産物量は、コントロールと大きな相違は認められなかった（図４のレーン１〜１４とレーン１５〜２８の比較、及び図５）。Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加した場合の増幅産物量は、特に、増幅時間３時間以上で、コントロール及び貯蔵緩衝液のみの場合と比較して、有意に増幅産物量が増加していることが確認された（図４のレーン２９〜４２と他のレーンとの比較、及び図５）。
【００８４】
以上の結果より、実施例１〜３に確認された高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質添加による特異的増幅産物の産生において、ＳＳＢタンパク質貯蔵溶液の影響を受けたものではなく、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質による作用であることが判明した。
【００８５】
〔実施例５〕
種々の組換え関連タンパク質が等温増幅反応系に与える影響−１
上述の実施例１〜３において、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質が等温増幅反応において鎖置換ポリメラーゼの鋳型核酸に対する特異性を向上させることが確認された。以下の実施例５〜７においては、他の種々の組換え関連タンパク質が、等温増幅反応系に影響を与えるか否かを比較検討する実験を行った。
【００８６】
（方法）
等温増幅反応系に、鎖置換因子或いは複製補助タンパク質として知られる種々の組換え関連タンパク質を何れか１種類添加することによって標的ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片の増幅状況とバックグラウンドノイズの発生状況を確認した。ここで、実験に供した組換え関連タンパク質は以下の通りであった。
【００８７】
・サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ８由来のＲｅｃＯタンパク質（以下、「Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質」と略する場合がある）
・大腸菌（Ｅ.ｃｏｌｉ）由来のＲｅｃＡタンパク質（以下、「Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＯタンパク質」と略する場合がある）
・ サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ８由来のＲｅｃＡタンパク質（以下、「Ｔｔｈ．ＲｅｃＡタンパク質」と略する場合がある）
・ Ｅ.ｃｏｌｉ由来のＳＳＢタンパク質（以下、「Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質」と略する場合がある）
・ サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）ＨＢ８由来の改変型ＳＳＢタンパク質（かかる改変型は、実施例１〜４で使用したＴｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐである。）
・Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質
【００８８】
反応液（１０μｌ）を、鋳型核酸を１ｎｇと、上記組換えタンパク質を夫々３．０μｇずつ１種類添加したサンプルを各組換えタンパク質につき１本ずつ調製した。更に、鋳型核酸を添加しないことを除いては同様に調製したサンプルを各組換えタンパク質につき１本ずつ調製した。ここでは、鋳型核酸及び等温増幅反応は実施例１〜３と同様に行った。増幅反応を２４時間行った後、６５℃で１０分間熱変性することにより増幅反応を停止した。増幅反応後の反応液を５μＬずつ分取し、１％アガロース電気泳動に供した。電気泳動は定法に従って４．５Ｖ/ｃｍで４５分行った。電気泳動後、エチジウムブロミド染色を行って増幅産物を可視化した。
【００８９】
また、コントロールとして、何れの組換え関連タンパク質をも添加せず、上記と同様に実験を行った。
【００９０】
（結果）
結果を図６に示す。
図６中、レーン１〜７は鋳型核酸の存在下で増幅反応を行った結果を示す。レーン１は、コントロールである。
レーン２は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質を、
レーン３は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン４は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質を
レーン５は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を、
レーン６は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを、
レーン７は、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質を添加した場合の結果を示す。
図６中、レーン８〜１４は鋳型核酸の不存在下で増幅反応を行った結果を示す。
レーン８は、コントロールである。
レーン９は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質を、
レーン１０は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン１１は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質を
レーン１２は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を、
レーン１３は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを、
レーン１４は、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質を添加した場合の結果を示す。
【００９１】
Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加して増幅反応を行った場合（図６、レーン６）、目的とするｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が増幅できることが確認された。そして、鋳型核酸の不在下では増幅産物が確認されなかった（図６、レーン１３）ことから、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加により鋳型核酸の特異的な増幅が行われていることが確認された。
【００９２】
その一方で、コントロールは、ｐＵＣ１９ＤＮＡ由来の増幅産物も確認されたが（図６、レーン１）、鋳型核酸を添加しないで増幅反応を行った場合においても増幅産物が認められた（図６、レーン８）。これは、例えばプライマーダイマーの形成が原因とされる鋳型核酸に関連しない非特異的増幅が生じたものであり、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を添加した場合にも同様の非特異的増幅が確認された（図６、レーン１０〜１２）。そして、これらのＥ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質で確認された鋳型不在下での増幅パターンは、これらのタンパク質の存在下で鋳型核酸を添加して増幅した場合に得られた増幅パターンと相似していた。このことから、鋳型核酸添加下で得られた増幅産物も鋳型核酸に関連する増幅産物ではなく、非特異的増幅の結果得られた増幅産物であると考えられる。一方で、鋳型核酸の増幅は抑制されていることが考えられる。また、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質及びＴ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質を添加した場合には、鋳型核酸の存在下ならびに不在下に関わらず、増幅産物を得ることが出来ず、増幅が阻害された（図６、レーン２とレーン９、及びレーン７とレーン１４）。
【００９３】
以上の結果より、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を添加した場合には、鋳型核酸に関連のない非特異的な増幅を抑制できることが確認された。かかる知見より、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を等温増幅系に添加することにより、鋳型核酸の特異的な増幅を効率的かつ高精度に行うことができることが判明した。また、本発明の高度好熱菌由来改変型のＳＳＢタンパク質以外の組換え関連タンパク質を添加して増幅反応を行った場合には、非特異的な増幅を抑制できないばかりか、鋳型核酸の増幅阻害が起きていると考えられるが、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を添加して増幅反応を行った場合には、このような増幅阻害を抑制できるものと考えられる。また、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質を添加した場合には、非特異的な増幅を抑制することができる一方で、鋳型核酸の増幅をも阻害することが確認された。つまり、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質の使用は、反応系に対して添加量等を適切に制御する必要があり、手順が煩雑となるという欠点を有することが判明した。
【００９４】
〔実施例６〕
種々の組換え関連タンパク質が等温増幅反応系に与える影響−２
実施例５に続き、種々の組換え関連タンパク質が、等温増幅反応系に影響を与えるか影響を比較検討する実験を行った。
【００９５】
（方法）
実施例５と同様にして、増幅時間を１８時間として種々の組換え関連タンパク質が、等温増幅反応系に影響を検討した。
【００９６】
（結果）
結果を図７に示す
図７、レーン１〜７は鋳型核酸の存在下で増幅反応を行った結果を示す。
レーン１は、コントロールである。
レーン２は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質を、
レーン３は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン４は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン５は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを、
レーン６は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を、
レーン７は、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質を添加した場合の結果を示す。
図７、レーン８〜１４は、鋳型核酸の不存在下で増幅反応を行った結果を示す。
レーン８は、コントロールである。
レーン９は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＯタンパク質を、
レーン１０は、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン１１は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質を、
レーン１２は、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを、
レーン１３は、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を、
レーン１４は、Ｔ４ ｇｅｎｅ３２タンパク質を添加した場合の結果を示す。
【００９７】
実施例５と同様に、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐを添加して増幅反応を行った場合において、鋳型核酸であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が増幅することが判明した（図７、レーン５とレーン１２の比較）。
【００９８】
一方、鋳型核酸の存在下、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、及びＥ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質を添加した場合（図７、レーン３、４及び６）においては、鋳型核酸を添加しないで増幅反応を行って得られた増幅産物と同じサイズの増幅産物が認められた（図７、レーン１０、１１及び１３）。鋳型核酸不在下で増幅される増幅産物は、プライマーダイマー等が原因とされるバックグラウンドノイズと考えられ、鋳型核酸に特異的なＤＮＡ断片ではない。したがって、これらのタンパク質の添加は、非特異的増幅の抑制効果を発揮し得るものではないと判明した。
【００９９】
以上の結果を、実施例５の結果と併せて鑑みると、反応時間が変化しても同様の結果が得られたことから、反応時間の変化により高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の作用に変化は認められないことが判明した。
【０１００】
〔実施例７〕
種々の組換え関連タンパク質が等温増幅反応系に与える影響（制限酵素処理）−３
実施例６で使用した等温増幅後の反応液から５μＬずつ分取して、制限酵素処理を行った。制限酵素処理は、１０ユニットの制限酵素ＥｃｏＲＩを使用し、３７℃で２時間反応させた。
【０１０１】
制限酵素処理後、１％アガロース電気泳動に供した。電気泳動は、実施例５〜６と同様の方法によって行った。
【０１０２】
結果を図８に示した。
図８中、レーン１〜１４は、図６のレーン１〜１４に対応する。
【０１０３】
コントロール、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、Ｔｔｈ.ＳＳＢタンパク質 Ｆ２５５Ｐ、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質の存在下であっては、鋳型核酸であるｐＵＣ１９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ断片が含まれていることが確認された（図８、レーン１、３〜６）。
しかしながら、Ｔｔｈ.ＲｅｃＡタンパク質に関しては、鋳型核酸を添加しないで増幅反応を行った場合にも、増幅産物のバンドが確認された（図８、レーン１０）。これにより、増幅反応によって得られた増幅産物中に、鋳型核酸に非特異的なＤＮＡ断片が含まれることを意味する。さらに、鋳型核酸を添加した場合においても、電気泳動ゲル上には、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断されないＤＮＡ分子の存在が確認された。これは、鋳型核酸に対して非特異的な増幅が行われた結果生じたＤＮＡ断片であると考えられた。
尚、Ｅ.ｃｏｌｉ ＲｅｃＡタンパク質、Ｅ.ｃｏｌｉ ＳＳＢタンパク質においても同様に非特異的な増幅産物が検出された（図８、レーン４と１１の比較、レーン６と１３の比較）。
【０１０４】
以上の結果より、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質を添加したサンプルのみが鋳型核酸であるｐＵＣ１９ＤＮＡに非特異的なＤＮＡ断片の増幅を抑制できることが判明した。一方、他の組換えタンパク質の存在下では、そのような効果を得ることができないことが判明した。
【図面の簡単な説明】
【０１０５】
【図１】高度好熱菌ＳＳＢタンパク質、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響を、鋳型核酸の存在下で比較検討した実施例１の結果を示す電気泳動パターン
【図２】高度好熱菌ＳＳＢタンパク質、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響を、鋳型核酸の不在下で比較検討した実施例２の結果を示す電気泳動パターン
【図３】高度好熱菌ＳＳＢタンパク質、高度好熱菌改変型ＳＳＢタンパク質の等温増幅反応系に与える影響をハイブリダイゼーションにより検討した実施例３の結果を示す部ロット
【図４】ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液が等温増幅反応系に与える影響を検討した実施例４の結果を示す電気泳動パターン
【図５】ＳＳＢタンパク質貯蔵緩衝液が等温増幅反応系に与える影響をハイブリダイゼーションにより検討した実施例４の結果を示すブロット
【図６】鎖置換因子として知られる種々のタンパク質を何れか１種類添加することによって等温増幅反応を２４時間行い、目的のＤＮＡ断片の増幅状況とバックグラウンドノイズの発生状況を確認した実施例５の結果を示す電気泳動パターン
【図７】鎖置換因子として知られる種々のタンパク質を何れか１種類添加することによって等温増幅反応を１８時間行い、目的のＤＮＡ断片の増幅状況とバックグラウンドノイズの発生状況を確認した実施例６の結果を示す電気泳動パターン
【図８】実施例６で使用したサンプルを制限酵素処理し、電気泳動を行った実施例７の結果を示す電気泳動パターン
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系における鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能を発現するアミノ酸配列を有する高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であって、１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加及び挿入の少なくとも１つからなる改変が生じている改変部位をアミノ酸配列中に有する高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項２】
前記高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、又は、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である請求項１に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項３】
前記改変が、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の鎖置換ポリメラーゼとの相互作用に変化が生じる改変である請求項１又は２に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項４】
前記改変が、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合能に変化が生じる改変である請求項１〜３のいずれか一項に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項５】
前記改変が、少なくとも３個以上連続するプロリンを有するように高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列が改変されている請求項１〜４のいずれか一項に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項６】
前記改変が、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を示す配列番号１のアミノ酸配列のうち、２５５番目のフェニールアラニンが他のアミノ酸に置換されている請求項２〜５のいずれか一項に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項７】
前記改変が、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を示す配列番号４のアミノ酸配列のうち、２５６番目のフェニールアラニンが他のアミノ酸に置換されている請求項２〜５のいずれか一項に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項８】
前記他のアミノ酸がプロリンである請求項６又は７に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項９】
鎖置換ポリメラーゼを用いた核酸の等温増幅方法であって、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を添加して増幅反応を行う核酸の増幅方法。
【請求項１０】
前記鎖置換ポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである請求項９に記載の核酸の増幅方法。
【請求項１】
鎖置換ポリメラーゼを用いた等温増幅反応系における鋳型核酸の増幅効率の向上に寄与し得る機能を発現するアミノ酸配列を有する高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質であって、１個以上のアミノ酸の欠失、置換、付加及び挿入の少なくとも１つからなる改変が生じている改変部位をアミノ酸配列中に有する高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項２】
前記高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）、又は、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質である請求項１に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項３】
前記改変が、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の鎖置換ポリメラーゼとの相互作用に変化が生じる改変である請求項１又は２に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項４】
前記改変が、高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のＤＮＡ結合能に変化が生じる改変である請求項１〜３のいずれか一項に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項５】
前記改変が、少なくとも３個以上連続するプロリンを有するように高度好熱菌由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質のアミノ酸配列が改変されている請求項１〜４のいずれか一項に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項６】
前記改変が、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を示す配列番号１のアミノ酸配列のうち、２５５番目のフェニールアラニンが他のアミノ酸に置換されている請求項２〜５のいずれか一項に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項７】
前記改変が、サーマス・アクアティカス（Thermus aquaticus）由来の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を示す配列番号４のアミノ酸配列のうち、２５６番目のフェニールアラニンが他のアミノ酸に置換されている請求項２〜５のいずれか一項に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項８】
前記他のアミノ酸がプロリンである請求項６又は７に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質。
【請求項９】
鎖置換ポリメラーゼを用いた核酸の等温増幅方法であって、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の高度好熱菌由来の改変型一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を添加して増幅反応を行う核酸の増幅方法。
【請求項１０】
前記鎖置換ポリメラーゼが、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼである請求項９に記載の核酸の増幅方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２００７−３１４０６（Ｐ２００７−３１４０６Ａ）
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２２０５８０（Ｐ２００５−２２０５８０）
【出願日】平成１７年７月２９日（２００５．７．２９）
【出願人】（０００００００１１）アイシン精機株式会社 (5,421)
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月２９日（２００５．７．２９）
【出願人】（０００００００１１）アイシン精機株式会社 (5,421)
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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