３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸及びその製造方法、並びに５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの製造方法
【課題】 ３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸及びその製造方法、並びに５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの製造方法を提供する。
【解決手段】 ３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼにより加水分解して５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を製造することとした。
【解決手段】 ３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼにより加水分解して５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を製造することとした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ、新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸及びその製造方法、並びに５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの製造方法に関する。すなわち、本発明は、配列番号１で示されるタンパク質の３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに対するハイドロラーゼとしての新規な作用に基づくものであり、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの中間体である新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株の全塩基配列が公開され、この中のイノシトール代謝オペロン内には１０種類のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在することが判明している。例えば、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ（ＥＣ．４．２．１．４４）は、このオペロン内に存在するｉｏｌＥ遺伝子産物に相当する。２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ（ＥＣ．４．２．１．４４）は、１９６６年、Ｂｅｒｍａｎら（非特許文献１参照）によって、アエロバクターエアロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）から２０倍に精製されている酵素と同一の作用を有する酵素と推定されている。その作用としては、２−ケト−ミオ−イノシトールに作用し、脱水反応により、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを与えることが実証されている。
【０００３】
脱水反応により得られた３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンは、代謝を受けてグルクロン酸類縁体に変換されると推測されていた。しかしながら、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンから変換される物質の詳細はこれまで解明されておらず、代謝経路の詳細も不明であった。
【０００４】
一方、γ−ラクトンは、抗腫瘍活性、抗ウィルス活性等を有するスチルラクトン化合物〔例えばゴニオフフロン[下記（Ｖ）]等〕の構造単位を有しており、この構造単位を有
した合成中間体として期待されている物質である。
【化１】
【０００５】
γ−ラクトンの有機合成例として、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４等の方法が知られている。
【０００６】
しかしながら、上記の文献記載の方法は、γ−ラクトン〔下式（ＩＶ）〕を、グルクロノラクトン（脱水グルコン酸）から、保護、脱保護、還元剤を用いた還元等の４工程で製造するものであり、工業的に有利な方法ではなかった。
【化２】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｅｒｍａｎ，Ｔ． ｅｔ ａｌ、１９６６年、２４１巻、８００頁
【非特許文献２】Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｂｅｒｉｃｈｔｅ， Ｈａｎｓ Ｐａｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ、１９６６年、９９巻、９０８頁
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｘｉａｎｇ−Ｈｕｉ Ｙｉ ｅｔ ａｌ、１９９８年、６３巻、７４７２頁
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍｅｒｅｙａｌａ，Ｈ．Ｂ． ｅｔ ａｌ、２００１年、８１巻、４５３頁
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ． ｅｔ ａｌ、１９７１年、２４６巻、５６５３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものである。
前記したように、イノシトール代謝オペロン内には少なくとも１０種類のＯＲＦが存在する。そのうち、ｉｏｌＥ遺伝子産物に相当する２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼは、２−ケト−ミオ−イノシトールに作用し、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを与える。なお、２−ケト−ミオ−イノシトールは、安価な原料であるミオ−イノシトールから微生物変換により定量的に得られる。
本発明者らは、上記オペロン内に存在する上記ｉｏｌＥ遺伝子産物とは別異のｉｏｌＤ遺伝子産物が、上記３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに対し、ハイドロラーゼとしてその代謝に直接かかわっているという知見を得た。
本発明は、かかる知見に基づき、γ−ラクトンの前駆物質として、新規物質として、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を提供することを目的とするものであり、さらに、その製造方法、並びにγ−ラクトンの新規な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、既述したように、ｉｏｌＤ遺伝子産物が３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに対してハイドロラーゼとして作用する酵素タンパク質であることを見出した。さらにこの酵素の加水分解反応により３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンから生成される物質は、２−デオキシ−５−ケト−グルコン酸ではなく、その異性体である新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、その一つの側面で、下記化学式で示される３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン（Ｉ）から、５−デオキシ−Ｄ−グ
ルクロン酸（ＩＩ）への加水分解反応を触媒する、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼである。
【化３】
【００１１】
また、本発明は、その一つの側面で、下記の化学式：
【化４】
で表される、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸、又はその金属塩である。
【００１２】
また、本発明は別の側面で５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法であり、
下記の化学式：
【化５】
で表される、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼを作用させることにより、水溶液中で加水分解して５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸（Ｉ）を得ることを特徴とする。
ここで、本発明に係る５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法は、別の形態で、２−ケト−ミオ−イノシトールに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼとを同時に作用させて５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を製造することを特徴とする。
【００１３】
さらに、本発明は、γ−ラクトンの製造方法に係るものであり、該製造方法は、新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を、酸触媒存在下、脱水反応を行ない、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンに変換させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、安価なミオ−イノシトールから定量的に製造される２−ケト−ミオ−イノシトールを原料にして、新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸、及び５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンを製造することができる。この新規物質は、医農薬合成中間体として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼにより加水分解して５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を製造する方法。
既述したように、本発明では、ｉｏｌＤ遺伝子産物が持つ、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに対するハイドロラーゼとしての作用を活用している。
３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、バチルス・ズブチリス１６８株から、それをコードするＤＮＡにより遺伝子工学的手法を経て調製することができる。すなわち、該ＤＮＡの菌体への導入により細菌形質転換体を作製し、その細菌形質転換体を培養し、その培養された菌体、又は、培養液から、既知の酵素分離法により目的とする酵素を回収することができる。
【００１６】
このような３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼを製造する方法においては、ｉｏｌＤ遺伝子のＤＮＡの導入で形質転換された細菌、特に大腸菌を、既知の細菌培養用液体培地中で３０℃〜４０℃の培養温度で培養したものを用いることが好適である。
得られた培養液からは、培養された形質転換菌の菌体をろ過又は遠心分離法により分離できる。分離されたペレット状の菌体を水で洗浄後、遠心分離し、洗浄菌体を得ることができる。
この洗浄菌体を例えば、０．６％トライトンＸ−１００を含む１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁させ、超音波によって菌体を破砕する。
菌体の破砕後、遠心分離し、上清にある酵素抽出液を得る。
その後、酵素抽出液に、例えば、５０％になるように硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を塩析させる。
このようにして調製したタンパク溶液をさらに遠心分離し、タンパク質沈殿として目的の酵素を得る。これを例えば、１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．５）、又は、５０％グリセロール溶液として保存できる。
【００１７】
また、菌体から酵素抽出液に硫酸アンモニウムを加えてタンパク質を析出させる前記した方法の他に、酵素抽出液から目的の酵素を回収する方法としては、酵素抽出液をイオン交換樹脂に吸着後、塩濃度による直線濃度勾配を利用したカラムクロマトグラフィーにかけて分離して精製する方法を用いることもできる。また、その他、ゲルろ過カラムによる分子量分画によって精製することもできる。
【００１８】
またさらに、別の方法として、用いた菌体から培養液に分泌させる場合には、上記の形質転換細菌の培養液から目的の酵素を回収するためには、培養液から培養細胞の菌体を分離した後に、得られた培養液上清を濃縮し、その濃縮液から、硫安分画によって目的の酵素を回収し、さらに、精製するといったステップにより目的とする酵素を得ることができる。
【００１９】
このようにして得られた、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、これを３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに作用させると、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸に変換できることから、新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造が可能になる。
【００２０】
すなわち、本発明では、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを含有する水溶液中で、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼにより加水分解して５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸へ変換させ、これを精製し、単離することにより、新規物質である５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることができる。
【００２１】
本発明に使用する３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンの水溶液は後述する２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼを２−ケト−ミオ−イノシトールに作用させて得られた３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを使用することができる。３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンは反応開始時の濃度が１％〜１５％、好ましくは１０％であるのが望ましい。
【００２２】
上記３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなるものが使用できるほか、イノシトールを代謝する能力を持つ菌に存在する、同様な作用を有する酵素であれば使用することができる。すなわち、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、上記アミノ酸配列からなるものの他、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列のタンパク質と同じ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００２３】
この３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン水溶液に作用させる３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、単離された３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼであることもでき、又は、これを含む粗酵素液であってもよい。
【００２４】
さらに、使用される３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、固定化酵素としても使用可能である。酵素固定化法としては、ゲル抱埋法、イオン交換樹脂吸着法等、既知の酵素固定化法が適用できる。
【００２５】
補酵素としてチアミンピロリン酸を用いることが好適であるが、酵素調製時に培地から得られるため、特に添加する必要はない。もっとも添加する場合、０．００１〜１ｍＭが好ましく、さらに好ましくは、０．０１ｍＭである。
【００２６】
使用される３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン溶液のｐＨは、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの至適ｐＨであるｐＨ７〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ８．５に調整するのが好ましい。また、反応により、カルボン酸が生じ、ｐＨは低下していくため、ｐＨスタット等のｐＨ制御装置を用いて、反応ｐＨを維持しながら反応させることが好ましい。ｐＨの維持に使用されるアルカリ水溶液としては、ＮａＯＨ水溶液、ＫＯＨ水溶液、アンモニア水溶液、トリメチルアミン水溶液、水酸化バリウム水溶液等を例示することができる。また、反応温度は、２０℃〜５０℃、好ましくは３０℃である。
【００２７】
反応終了後、可溶性酵素を使用した場合は、限外ろ過等により、高分子量の酵素を回収できる。固定化された酵素を使用した場合、反応溶液を遠心分離、あるいはろ過することによって、固定化酵素を回収することができる。またさらに、回収する必要がない場合、加熱による変性沈殿後、遠心分離により酵素を除去することができる。
【００２８】
このようにして酵素を除いた後の残液である反応溶液は、生成した５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を含んでいる。次に、この溶液から、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を精製するには、イオン交換樹脂による精製の他、溶媒抽出法が使用できる。イオン交換樹脂を用いる場合、得られた溶液は強塩基性イオン交換樹脂カラムを通過させ、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸をイオン交換樹脂に吸着させた後、水でイオン交換樹脂を洗浄し、鉱酸、あるいは酢酸やギ酸等の有機酸によって、カラムから溶出させることができる他、ＮａＣｌ等の塩によってもカラムから溶出させることができる。カラムから溶出する溶液は、分画し、不要な酸や、塩を含まない画分を集めて、濃縮し、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることができる。
【００２９】
溶媒抽出法の場合、得られた溶液を鉱酸でｐＨ２〜３に調整し、この溶液を濃縮する。濃縮後、メタノールを加えて、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸をメタノール層に溶解させることができる。次にメタノール溶液を濃縮し、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることができる。
【００３０】
２−ケト−ミオ−イノシトールに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの２つの酵素を作用させて、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を製造する方法
さらに、本発明者らは、本発明で反応の原料として使用する３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンは、２−ケト−ミオ−イノシトールに２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼを作用させて変換させることができる。したがって、同一溶液中に、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼが共存する場合、２−ケト−ミオ−イノシトールは、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを経由して、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸まで反応させることができる。本発明にはこのような製造方法も含む。
【００３１】
したがって、本発明においては、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸は、２−ケト−ミオ−イノシトールに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの２つの酵素を作用させて、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸へ変換させ、これを精製し、単離して得ることができる。
【００３２】
このように両酵素を用いて、得られる５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を含有する反応溶液からの５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の精製は、前述と同様の要領で実施できる。
【００３３】
２−ケト−ミオ−イノシトールの水溶液は、ミオ−イノシトールから微生物的変換により生成した２−ケト−ミオ−イノシトールの水溶液、あるいは、ミオ−イノシトールを酸化白金により酸化した２−ケト−ミオ−イノシトールの水溶液であることができる。２−ケト−ミオ−イノシトールの水溶液は、反応開始時の２−ケト−ミオ−イノシトール濃度が１％〜１５％、好ましくは１５％である。
【００３４】
２−ケト−ミオ−イノシトールに作用させる、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼは、前述したバチルス・ズブチリス１６８株から、ｉｏｌＥ遺伝子をコードするＤＮＡを遺伝子工学的手法により作成し、該ＤＮＡの導入により細菌形質転換体を作り、その細菌形質転換体を培養し、その培養された菌体から、又は、培養液から、既知の酵素分離法により回収することができる。
【００３５】
２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの２つの酵素は、単離された２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼであることもでき、又はこれらを含む粗酵素液であることもできる。
【００３６】
さらに、使用される２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの２つの酵素は、固定化酵素としても使用可能である。酵素固定化法としては、ゲル抱埋法、イオン交換樹脂吸着法等、既知の酵素固定化法が適用できる。
【００３７】
補酵素としてチアミンピロリン酸を用いることが好適である、酵素調製時に培地から得られるため、特に添加する必要はない。添加する場合の濃度は、好ましくは０．００１〜１ｍＭ、さらに好ましくは０．０１ｍＭである。
【００３８】
使用される２−ケト−ミオ−イノシトール水溶液のｐＨは、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの至適ｐＨが一致するため、ｐＨ７〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ８．５に調整するのが好ましい。また、反応により、カルボン酸が生じ、ｐＨは低下していくため、ｐＨスタット等のｐＨ制御装置を用いて、反応ｐＨを維持しながら反応させることが好ましい。ｐＨの維持に使用されるアルカリ水溶液としては、ＮａＯＨ水溶液、ＫＯＨ水溶液、アンモニア水溶液、トリメチルアミン水溶液、水酸化バリウム水溶液等を例示することができる。また、反応温度は、２０℃〜５０℃、好ましくは３０℃である。
【００３９】
５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの製造方法
このようにして製造された５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸は、次に酸触媒存在下に、有機化学的な脱水反応により、容易にγ−ラクトンに変換することができる。
【００４０】
すなわち、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を酸触媒存在下、脱水反応を行ない、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンに変換させ、これを精製し、単離することからなる５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンを製造することも本発明の概念に含まれる。
【００４１】
本発明に係るγ−ラクトンの製造方法に使用する５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸は、遊離の酸、又は金属塩であっても使用できるが、好ましくは、遊離の酸の状態である。また、完全に水分が除去されず、結晶化していない状態の物であっても使用することができる。
【００４２】
５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸をγ−ラクトンに変換させるために使用される酸触媒は、酸であれば特に限定されない。例えば、硫酸、塩酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を例示することができる。酸触媒の量は反応系の酸の規定度が０．０１Ｎ〜１０Ｎ、好ましくは１Ｎ〜３Ｎである。
【００４３】
使用される溶媒は、水、及び、アルコール類が使用でき、さらに好ましくは、水である。
【００４４】
γ−ラクトンの生成反応は、加熱することによって反応が促進されるため、加熱するのが好ましく、また、均一な熱で反応させるため攪拌を必要とする。加熱温度は、反応が進めば、特に限定されないが、水を溶媒とする場合、好ましくは、３０℃〜１００℃、また、反応時間を長く取るのであれば、３０℃〜５０℃でも反応させることができる。
【００４５】
反応後の溶液からの５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの精製は、溶媒を留去した後、水に溶解し、強酸性又は弱酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ+タイプ）を通過させた後、強塩基性又は弱塩基性陰イオン交換樹脂（ＯＨ-タイプ）を通過させることで、不要なイオン性物質を除去し、さらに活性炭カラムを通過させることで、脱色し、精製することができる。最後に通過溶液を濃縮することで５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンを単離することができる。
【００４６】
その他、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸とそのγ−ラクトンは大きく極性に差があるため、酢酸エチル等の有機溶媒抽出によっても、精製することができる。
【００４７】
このように、本発明は、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン又はその前駆物質から、炭素−炭素開裂を伴う加水分解反応を触媒するハイドロラーゼ（新規に見い出された活性）により新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることができる。
【００４８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００４９】
３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ遺伝子の発現
（ａ）バチルス・ズブチリスのゲノムＤＮＡの調製
ＬＢフラスコ培地１００ｍｌ（１％バクト-トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）にＬＢスラント培地（１％バクト-トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）で培養したバチルス・ズブチリス１６８株を一白金耳接種し、４時間、３６℃で好気的に培養し、これを集菌した。この菌体ペレットに、１５ｍｌのＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）とリゾチーム５０ｍｇを加えて懸濁し、３７℃、２時間作用させた。処理後、この溶液に２５％ＳＤＳ溶液を０．５ｍｌ加えて完全に溶菌させ、フェノールを３ｍｌ加えて、タンパク質を変性させた後に、遠心分離し、上清を取り出し、この溶液に２０ｍｌの２−プロパノールを加えて、粗ゲノムＤＮＡを析出させた。析出した粗ゲノムＤＮＡを遠心分離し、沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥した粗ゲノムＤＮＡは、さらに３ｍｌＴＥ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解後、０．０１ｍｇのＲＮＡａｓｅを加え、３６℃、２時間反応させ、ＲＮＡを分解させた。さらに、０．０１ｍｇのプロテイナーゼＫを加えて、３６℃、２時間反応させ、タンパク質を分解させた。次に、1ｍｌのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加えて、ゆっくりと攪拌し、ＲＮＡａｓｅと、プロテイナーゼＫを変性させ、遠心分離し、２相に分離した内の水相である上層を取り出し、これに３Ｍ酢酸Ｎａ溶液を０．３ｍｌ加えて、ｐＨ５．２に調整した。これに３ｍｌの２−プロパノールを加えて、ゲノムＤＮＡを析出させた。析出したゲノムＤＮＡを遠心分離し、沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムＤＮＡは、３ｍｌＴＥ液に溶解させ、これに１ｍｌのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加える操作から、３ｍｌＴＥ液に溶解させる過程までを、再度繰り返して、遠心分離を行い、同様にｐＨ５．２にて、上清に等量の２−プロパノールを加えて、バチルス・ズブチリスのゲノムＤＮＡ溶液を調製した。このようにして得られたゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００５０】
（ｂ）３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ配列のクローニング
バチルス・ズブチリス由来３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ遺伝子配列（ｉｏｌＤ遺伝子配列）のクローニング、かつ、リコンビナント酵素として発現させるために、以下の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
配列３：iolＤ-F 5'-ccggaattcaaagatcgagtaaaggtggg-3'
配列４：iolＤ-R 5'-cgcggatcctttcatttttgcccatctatgg-3'
ＰＣＲ反応は宝酒造社のＥｘ ｔａｑ反応用液を使用し、組成はＴａｋａｒａ ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ×１０倍液 ５μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌ、鋳型ＤＮＡ ３０ｎｇ、１０μＭ プライマー溶液 各１μｌ、Ｔａｋａｒａ ＥｘＴａｑ ０．５μｌを５０μｌになるように水を加え、３０μｌのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、ＰＣＲ増幅装置（ＡＳＴＥＣ社 ＰＣ−７００）を用い、変性を９４℃３０秒、アニーリングを５０℃１分、伸長を７２℃２分、の３段階の反応を３０回繰返し行った。上記のＰＣＲ反応によって、約２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅した。
反応後、重層したミネラルオイルを０．３ｍｌのヘキサンで抽出し、ヘキサン層を除去する操作を３回繰返し、1分間減圧することで、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた反応液５０μｌからジーンクリーン（Ｂｉｏ１０１社製）を用いてＰＣＲ断片を精製した。すなわち、キット添付のＮａＩ溶液を３００μｌ加えて混合し、１０μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、４℃、１５分静置した後に、遠心分離し、ＤＮＡ断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のＮｅｗ ｗａｓｈ溶液５００μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このＮｅｗ ｗａｓｈ溶液による洗浄操作は３回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、１５μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、５５℃で、１５分加温した後、遠心分離を行い、ＤＮＡ断片を含む上清１２μｌを得た。
【００５１】
（ｃ）３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの発現ベクターの調製
精製されたＤＮＡ断片を発現ベクターに組み込む操作は以下のように行った。すなわち、ＤＮＡ断片溶液１０μｌに、発現用プラスミド（ｐＵＣ１８）を０．５μｇ、宝酒造社の制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを各１μｌ、宝酒造社の制限酵素用緩衝液Ｋ ｂｕｆｆｅｒ×１０倍液 ２μｌを加え、２０μｌになるように滅菌水を加え、混合した。この反応液を３６℃、2時間反応した。
制限酵素反応後、ジーンクリーンを用いて、ＤＮＡ断片と発現ベクターを単離し、これらをライゲーションさせた。すなわち、制限酵素反応液２０μｌにキット添付のＮａＩ溶液を３００μｌ加えて混合し、１０μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、４℃、１５分静置した後に、遠心分離し、ＤＮＡ断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のＮｅｗ ｗａｓｈ溶液５００μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このＮｅｗ ｗａｓｈ溶液による洗浄操作は３回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、１５μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、５５℃で、１５分加温した後、遠心分離を行い、ＤＮＡ断片と発現ベクターを含む上清１２μｌを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約５０ｂｐ以下の小さなＤＮＡ断片は取り除かれ、目的とするＤＮＡ断片と、発現ベクターが得られた。
このようにして調製した溶液１０μｌにＴａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ−Ｉ溶液（宝酒造社）を１０μｌ加え、１６℃、１時間反応させた。この溶液を、コンピテントセル（宝酒造社ＪＭ１０９）に形質転換させた。すなわち、４℃で解凍したコンピテントセル溶液６０μｌにライゲーション反応溶液を５μｌ加え、混合し、０℃３０分後、４２℃４５秒、０℃２分の処理を行い、これに５００μｌＳＯＣ溶液（２％バクト-トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、10ｍＭ ＭｇＣｌ2）を加えて、３６℃で１時間回復培養させ、この培養液１００μｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、４０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布した。さらに３７℃、１６時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドの導入で形質転換された大腸菌が得られるため、これを選択した。こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ, ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡの分離及び精製を行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡは、目的とする３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼに相当する約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を有することが確認された。
【００５２】
（ｄ）３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの発現
コロニーとして単離した菌株を５０μｇ/ｍｌアンピシリンを含む１００ｍｌＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に移植し、３６℃７時間培養し、この培養液に２００ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド溶液を０．３ｍｌ加え、さらに３６℃３時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集め、これを生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を０．６％トライトンＸ１００溶液３ｍｌに懸濁し４℃で超音波により菌を破砕した。この溶液を遠心分離し、上清の酵素溶液２．８ｍｌを取り出し、上清に１．２ｇ硫安を加え、４℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去し、この沈殿物を２．５ｍｌの２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０に溶解させ、再度遠心分離を行い、上清を２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（１４ｍｌ）にアプライし、２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの粗酵素液３．５ｍｌを得た。
３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ活性の測定は、粗酵素液１００μｌ、０．１％３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン１００μｌ、１Ｍトリス緩衝液 ｐＨ８．０ ５０μｌからなる組成に水を加えて１ｍｌになるように調製した後、この基本反応液をUV測定用装置にセットし、２７℃における２６０ｎｍの吸収の減少を測定した。
【００５３】
さらに、上記の基本反応液の組成の内、１Ｍトリス緩衝液 ｐＨ８．０ ５０μｌに代えて、ｐＨ４．０、５．０、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０の１Ｍリン酸緩衝液５０μｌ、ｐＨ７．０、８．５、９．０の１Ｍトリス緩衝液５０μｌ、あるいは、ｐＨ８．０、９．０、１０．０、１１．０の１Ｍ炭酸緩衝液５０μｌを用いて、変換活性を測定したところ、ｐＨ７．５〜８．５に最大活性を有していたことから、本酵素の至適ｐＨはｐＨ７．５〜８．５であることが判った。
【実施例２】
【００５４】
３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼを作用させて得られる生成物の単離と、構造確認
上記実施例１で得られた粗酵素液３．０ｍｌ、５％３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン溶液１０ｍｌを混和し、水を１５ｍｌになるように加え、ｐＨ８．０に調製し、反応溶液のｐＨが低下しないように１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨを随時ｐＨ８．０に調整しながら、２７℃、１６時間反応させた。得られた酵素反応液を塩酸でｐＨ3．０に調整し、８０℃で１０分間加温し、不溶化したタンパク質を遠心分離により沈殿させた。上清を、濃縮乾固し、これにメタノール１５０ｍｌを加え、固体からメタノール抽出物を得ることができた。さらにメタノール抽出物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０ｍｌ、溶離液組成 酢酸エチル：メタノール＝1：1）により、不要な塩と、色素成分を除去し、目的物を含む溶出画分を濃縮すると、白色固体が得られた。この白色固体を水に溶解し、ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨ７．５に調整し、さらに濃縮すると、濃縮中に白色結晶２２０ｍｇが得られた。この白色物質のＮＭＲ測定すると、本物質は、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸Ｎａ塩であることが判明した。また、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸Ｎａ塩は、水溶液中ではフラノースであり、β：α＝１：０．８５の比率であった。
βアノマー 1H-NMR（300MHz,D2O）δ2.69（2H,m）,δ4.13（1H,t）,δ4.28（1H,dd）,δ4.62（1H,dt）,δ5.43（1H,d,J=4.2Hz）
αアノマー 1H-NMR（300MHz,D2O）δ2.56（2H,m）,δ4.11（1H,t）,δ4.19（1H,dd）,δ4.58（1H,dt）,δ5.20（1H,d）
【実施例３】
【００５５】
２−ケト−ミオ−イノシトールから５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸への１バッチ変換
２−ケト−ミオ−イノシトールから５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸への１バッチ変換は、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼを共役させた反応により、行なうことができる。
はじめに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼの調製は以下のように行なった
【００５６】
（ａ）２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ配列のクローニング
バチルス・ズブチリス由来２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ配列（iolE遺伝子配列）のクローニング、かつ、リコンビナント酵素として発現させるために、以下の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
配列5：iolE-F 5'-ccggaattctctgcgaagcagtattagag-3'
配列6：iolE-R 5'-cgcggatccccattggtattgcccatatg-3'
ＰＣＲ反応はアニーリングを５２℃１分、伸長を７２℃１分にした以外は、実施例１と同様の操作を行なった。結果として、このＰＣＲ反応によって、約０．９ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅した。反応後、実施例1と同様の操作で、ＰＣＲ断片の精製を行い、ＤＮＡ断片を含む上清１２μｌを得た。
【００５７】
（ｂ）２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼの発現ベクターの調製
精製されたＤＮＡ断片を発現ベクターに組み込む操作は、実施例１と制限酵素サイトが一致するので、同様の操作を行ない、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼの発現ベクターを有する大腸菌株を得て、形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ, ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡの分離及び精製を行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡは、目的とする２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼに相当する約０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を有することが確認された。
【００５８】
（ｃ）２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼの発現
コロニーとして単離した菌株を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１００ｍｌＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に移植し、３６℃で７時間培養し、この培養液に２００ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド溶液を０．３ｍｌ加え、さらに３６℃３時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集め、これを生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を０．６％トライトンＸ１００溶液３ｍｌに懸濁し４℃で超音波により菌を破砕した。この溶液を遠心分離し、上清の酵素溶液２．８ｍｌを取り出し、上清に１．２ｇ硫安を加え、４℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去し、この沈殿物を２．５ｍｌの２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０に溶解させ、再度遠心分離を行い、上清を２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（１４ｍｌ）にアプライし、２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼの粗酵素液３．５ｍｌを得た。
【００５９】
上記（ａ）〜（ｃ）の操作で得られた２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ粗酵素液と、実施例１の方法により得られた３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの酵素液を用いて、共役反応を行なった。
【００６０】
２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ粗酵素液３．０ｍｌ、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ粗酵素液３．０ｍｌ、５％２−ケト−ミオ−イノシトール溶液１０ｍｌ、１ｍＭ ＣｏＣｌ2溶液 ７５０μｌを混和し、水を２０ｍｌになるように加え、ｐＨ８．０に調製し、反応溶液のｐＨが低下しないように１ＮのＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨを随時ｐＨ８．０に調整しながら、２７℃、２４時間反応させた。得られた酵素反応液を塩酸でｐＨ３．０に調整し、８０℃で１０分間加温し、不溶化したタンパク質を遠心分離により沈殿させた。上清を、濃縮乾固し、これにメタノール２００ｍｌを加え、固体からメタノール抽出物を得ることができた。さらにメタノール抽出物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル９０ｍｌ、溶離液組成 酢酸エチル：メタノール＝１：１）により、不要な塩と、色素成分を除去し、目的物を含む溶出画分を濃縮すると、白色固体が得られた。この白色固体を水に溶解し、ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨ７．５に調整し、さらに濃縮すると、濃縮中に５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸 Na塩２５０ｍｇが得られた。
【実施例４】
【００６１】
５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸からの５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの製造と単離
実施例３の途中に生成する中和する前の白色固体は５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸であり、本物質を出発原料とした。５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸 １００ｍｇを水１．０ｍｌに溶解し、これに攪拌しながら、濃硫酸２０μｌを加えて、攪拌下、５０℃で反応させた。１６時間後、反応液は５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンが不溶物として壁面に生じた状態であった。反応停止は、反応溶液を室温まで冷却後、これに３０％水酸化バリウム懸濁液をｐＨ８になるように加えた（約６０μｌ）。その後、反応停止した溶液をろ過し、ろ液を濃縮乾固した。濃縮物に酢酸エチル３ｍｌを加えて攪拌し、再度、ろ過を行ない、残った固体を酢酸エチルで洗浄し、酢酸エチル溶液を得た。次に、最初のろ液と、洗浄液を一緒にし、この溶液を濃縮し、粗５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンを得た。さらに、この物質を少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｍｌ、溶離液組成 酢酸エチル）により、分画し、目的物を含む溶出画分を濃縮すると、白色固体３１ｍｇが得られた。この白色固体のＮＭＲ測定により、本物質は、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンであることが判明した。また、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンは、水溶液中ではフラノースであり、β：α＝０．２６：1の比率であった。
βアノマー 1H-NMR (300MHz, D2O) δ2.77 (1H, dd）、δ3.06 (1H, dd）、δ4.44(1H, d）、δ5.12 (1H, dd）、δ5.26(1H, dt）、δ5.56(1H, d）
αアノマー 1H-NMR (300MHz, D2O) δ2.79(1H, dd）、δ3.11 (1H, dd）、δ4.43(1H, d）、δ5.10 (1H, dd）、δ5.23(1H, dt）、δ5.47(1H, d）
【技術分野】
【０００１】
本発明は、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ、新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸及びその製造方法、並びに５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの製造方法に関する。すなわち、本発明は、配列番号１で示されるタンパク質の３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに対するハイドロラーゼとしての新規な作用に基づくものであり、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの中間体である新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８株の全塩基配列が公開され、この中のイノシトール代謝オペロン内には１０種類のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在することが判明している。例えば、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ（ＥＣ．４．２．１．４４）は、このオペロン内に存在するｉｏｌＥ遺伝子産物に相当する。２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ（ＥＣ．４．２．１．４４）は、１９６６年、Ｂｅｒｍａｎら（非特許文献１参照）によって、アエロバクターエアロゲネス（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）から２０倍に精製されている酵素と同一の作用を有する酵素と推定されている。その作用としては、２−ケト−ミオ−イノシトールに作用し、脱水反応により、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを与えることが実証されている。
【０００３】
脱水反応により得られた３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンは、代謝を受けてグルクロン酸類縁体に変換されると推測されていた。しかしながら、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンから変換される物質の詳細はこれまで解明されておらず、代謝経路の詳細も不明であった。
【０００４】
一方、γ−ラクトンは、抗腫瘍活性、抗ウィルス活性等を有するスチルラクトン化合物〔例えばゴニオフフロン[下記（Ｖ）]等〕の構造単位を有しており、この構造単位を有
した合成中間体として期待されている物質である。
【化１】
【０００５】
γ−ラクトンの有機合成例として、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４等の方法が知られている。
【０００６】
しかしながら、上記の文献記載の方法は、γ−ラクトン〔下式（ＩＶ）〕を、グルクロノラクトン（脱水グルコン酸）から、保護、脱保護、還元剤を用いた還元等の４工程で製造するものであり、工業的に有利な方法ではなかった。
【化２】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｅｒｍａｎ，Ｔ． ｅｔ ａｌ、１９６６年、２４１巻、８００頁
【非特許文献２】Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｂｅｒｉｃｈｔｅ， Ｈａｎｓ Ｐａｕｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ、１９６６年、９９巻、９０８頁
【非特許文献３】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｘｉａｎｇ−Ｈｕｉ Ｙｉ ｅｔ ａｌ、１９９８年、６３巻、７４７２頁
【非特許文献４】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｄｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍｅｒｅｙａｌａ，Ｈ．Ｂ． ｅｔ ａｌ、２００１年、８１巻、４５３頁
【非特許文献５】Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ． ｅｔ ａｌ、１９７１年、２４６巻、５６５３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものである。
前記したように、イノシトール代謝オペロン内には少なくとも１０種類のＯＲＦが存在する。そのうち、ｉｏｌＥ遺伝子産物に相当する２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼは、２−ケト−ミオ−イノシトールに作用し、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを与える。なお、２−ケト−ミオ−イノシトールは、安価な原料であるミオ−イノシトールから微生物変換により定量的に得られる。
本発明者らは、上記オペロン内に存在する上記ｉｏｌＥ遺伝子産物とは別異のｉｏｌＤ遺伝子産物が、上記３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに対し、ハイドロラーゼとしてその代謝に直接かかわっているという知見を得た。
本発明は、かかる知見に基づき、γ−ラクトンの前駆物質として、新規物質として、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を提供することを目的とするものであり、さらに、その製造方法、並びにγ−ラクトンの新規な製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は鋭意検討を重ねた結果、既述したように、ｉｏｌＤ遺伝子産物が３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに対してハイドロラーゼとして作用する酵素タンパク質であることを見出した。さらにこの酵素の加水分解反応により３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンから生成される物質は、２−デオキシ−５−ケト−グルコン酸ではなく、その異性体である新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸であることを見出した。
【００１０】
すなわち、本発明は、その一つの側面で、下記化学式で示される３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン（Ｉ）から、５−デオキシ−Ｄ−グ
ルクロン酸（ＩＩ）への加水分解反応を触媒する、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼである。
【化３】
【００１１】
また、本発明は、その一つの側面で、下記の化学式：
【化４】
で表される、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸、又はその金属塩である。
【００１２】
また、本発明は別の側面で５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法であり、
下記の化学式：
【化５】
で表される、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼを作用させることにより、水溶液中で加水分解して５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸（Ｉ）を得ることを特徴とする。
ここで、本発明に係る５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法は、別の形態で、２−ケト−ミオ−イノシトールに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼとを同時に作用させて５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を製造することを特徴とする。
【００１３】
さらに、本発明は、γ−ラクトンの製造方法に係るものであり、該製造方法は、新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を、酸触媒存在下、脱水反応を行ない、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンに変換させることを特徴とする。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、安価なミオ−イノシトールから定量的に製造される２−ケト−ミオ−イノシトールを原料にして、新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸、及び５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンを製造することができる。この新規物質は、医農薬合成中間体として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼにより加水分解して５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を製造する方法。
既述したように、本発明では、ｉｏｌＤ遺伝子産物が持つ、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに対するハイドロラーゼとしての作用を活用している。
３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、バチルス・ズブチリス１６８株から、それをコードするＤＮＡにより遺伝子工学的手法を経て調製することができる。すなわち、該ＤＮＡの菌体への導入により細菌形質転換体を作製し、その細菌形質転換体を培養し、その培養された菌体、又は、培養液から、既知の酵素分離法により目的とする酵素を回収することができる。
【００１６】
このような３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼを製造する方法においては、ｉｏｌＤ遺伝子のＤＮＡの導入で形質転換された細菌、特に大腸菌を、既知の細菌培養用液体培地中で３０℃〜４０℃の培養温度で培養したものを用いることが好適である。
得られた培養液からは、培養された形質転換菌の菌体をろ過又は遠心分離法により分離できる。分離されたペレット状の菌体を水で洗浄後、遠心分離し、洗浄菌体を得ることができる。
この洗浄菌体を例えば、０．６％トライトンＸ−１００を含む１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．５）に懸濁させ、超音波によって菌体を破砕する。
菌体の破砕後、遠心分離し、上清にある酵素抽出液を得る。
その後、酵素抽出液に、例えば、５０％になるように硫酸アンモニウムを加えて、タンパク質を塩析させる。
このようにして調製したタンパク溶液をさらに遠心分離し、タンパク質沈殿として目的の酵素を得る。これを例えば、１００ｍＭトリスバッファー（ｐＨ７．５）、又は、５０％グリセロール溶液として保存できる。
【００１７】
また、菌体から酵素抽出液に硫酸アンモニウムを加えてタンパク質を析出させる前記した方法の他に、酵素抽出液から目的の酵素を回収する方法としては、酵素抽出液をイオン交換樹脂に吸着後、塩濃度による直線濃度勾配を利用したカラムクロマトグラフィーにかけて分離して精製する方法を用いることもできる。また、その他、ゲルろ過カラムによる分子量分画によって精製することもできる。
【００１８】
またさらに、別の方法として、用いた菌体から培養液に分泌させる場合には、上記の形質転換細菌の培養液から目的の酵素を回収するためには、培養液から培養細胞の菌体を分離した後に、得られた培養液上清を濃縮し、その濃縮液から、硫安分画によって目的の酵素を回収し、さらに、精製するといったステップにより目的とする酵素を得ることができる。
【００１９】
このようにして得られた、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、これを３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに作用させると、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸に変換できることから、新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造が可能になる。
【００２０】
すなわち、本発明では、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを含有する水溶液中で、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼにより加水分解して５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸へ変換させ、これを精製し、単離することにより、新規物質である５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることができる。
【００２１】
本発明に使用する３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンの水溶液は後述する２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼを２−ケト−ミオ−イノシトールに作用させて得られた３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを使用することができる。３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンは反応開始時の濃度が１％〜１５％、好ましくは１０％であるのが望ましい。
【００２２】
上記３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなるものが使用できるほか、イノシトールを代謝する能力を持つ菌に存在する、同様な作用を有する酵素であれば使用することができる。すなわち、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、上記アミノ酸配列からなるものの他、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ該アミノ酸配列のタンパク質と同じ活性を有するタンパク質であってもよい。
【００２３】
この３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン水溶液に作用させる３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、単離された３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼであることもでき、又は、これを含む粗酵素液であってもよい。
【００２４】
さらに、使用される３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼは、固定化酵素としても使用可能である。酵素固定化法としては、ゲル抱埋法、イオン交換樹脂吸着法等、既知の酵素固定化法が適用できる。
【００２５】
補酵素としてチアミンピロリン酸を用いることが好適であるが、酵素調製時に培地から得られるため、特に添加する必要はない。もっとも添加する場合、０．００１〜１ｍＭが好ましく、さらに好ましくは、０．０１ｍＭである。
【００２６】
使用される３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン溶液のｐＨは、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの至適ｐＨであるｐＨ７〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ８．５に調整するのが好ましい。また、反応により、カルボン酸が生じ、ｐＨは低下していくため、ｐＨスタット等のｐＨ制御装置を用いて、反応ｐＨを維持しながら反応させることが好ましい。ｐＨの維持に使用されるアルカリ水溶液としては、ＮａＯＨ水溶液、ＫＯＨ水溶液、アンモニア水溶液、トリメチルアミン水溶液、水酸化バリウム水溶液等を例示することができる。また、反応温度は、２０℃〜５０℃、好ましくは３０℃である。
【００２７】
反応終了後、可溶性酵素を使用した場合は、限外ろ過等により、高分子量の酵素を回収できる。固定化された酵素を使用した場合、反応溶液を遠心分離、あるいはろ過することによって、固定化酵素を回収することができる。またさらに、回収する必要がない場合、加熱による変性沈殿後、遠心分離により酵素を除去することができる。
【００２８】
このようにして酵素を除いた後の残液である反応溶液は、生成した５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を含んでいる。次に、この溶液から、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を精製するには、イオン交換樹脂による精製の他、溶媒抽出法が使用できる。イオン交換樹脂を用いる場合、得られた溶液は強塩基性イオン交換樹脂カラムを通過させ、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸をイオン交換樹脂に吸着させた後、水でイオン交換樹脂を洗浄し、鉱酸、あるいは酢酸やギ酸等の有機酸によって、カラムから溶出させることができる他、ＮａＣｌ等の塩によってもカラムから溶出させることができる。カラムから溶出する溶液は、分画し、不要な酸や、塩を含まない画分を集めて、濃縮し、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることができる。
【００２９】
溶媒抽出法の場合、得られた溶液を鉱酸でｐＨ２〜３に調整し、この溶液を濃縮する。濃縮後、メタノールを加えて、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸をメタノール層に溶解させることができる。次にメタノール溶液を濃縮し、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることができる。
【００３０】
２−ケト−ミオ−イノシトールに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの２つの酵素を作用させて、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を製造する方法
さらに、本発明者らは、本発明で反応の原料として使用する３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンは、２−ケト−ミオ−イノシトールに２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼを作用させて変換させることができる。したがって、同一溶液中に、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼが共存する場合、２−ケト−ミオ−イノシトールは、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを経由して、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸まで反応させることができる。本発明にはこのような製造方法も含む。
【００３１】
したがって、本発明においては、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸は、２−ケト−ミオ−イノシトールに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの２つの酵素を作用させて、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸へ変換させ、これを精製し、単離して得ることができる。
【００３２】
このように両酵素を用いて、得られる５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を含有する反応溶液からの５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の精製は、前述と同様の要領で実施できる。
【００３３】
２−ケト−ミオ−イノシトールの水溶液は、ミオ−イノシトールから微生物的変換により生成した２−ケト−ミオ−イノシトールの水溶液、あるいは、ミオ−イノシトールを酸化白金により酸化した２−ケト−ミオ−イノシトールの水溶液であることができる。２−ケト−ミオ−イノシトールの水溶液は、反応開始時の２−ケト−ミオ−イノシトール濃度が１％〜１５％、好ましくは１５％である。
【００３４】
２−ケト−ミオ−イノシトールに作用させる、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼは、前述したバチルス・ズブチリス１６８株から、ｉｏｌＥ遺伝子をコードするＤＮＡを遺伝子工学的手法により作成し、該ＤＮＡの導入により細菌形質転換体を作り、その細菌形質転換体を培養し、その培養された菌体から、又は、培養液から、既知の酵素分離法により回収することができる。
【００３５】
２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの２つの酵素は、単離された２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼであることもでき、又はこれらを含む粗酵素液であることもできる。
【００３６】
さらに、使用される２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの２つの酵素は、固定化酵素としても使用可能である。酵素固定化法としては、ゲル抱埋法、イオン交換樹脂吸着法等、既知の酵素固定化法が適用できる。
【００３７】
補酵素としてチアミンピロリン酸を用いることが好適である、酵素調製時に培地から得られるため、特に添加する必要はない。添加する場合の濃度は、好ましくは０．００１〜１ｍＭ、さらに好ましくは０．０１ｍＭである。
【００３８】
使用される２−ケト−ミオ−イノシトール水溶液のｐＨは、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの至適ｐＨが一致するため、ｐＨ７〜ｐＨ９、好ましくはｐＨ７．５〜ｐＨ８．５に調整するのが好ましい。また、反応により、カルボン酸が生じ、ｐＨは低下していくため、ｐＨスタット等のｐＨ制御装置を用いて、反応ｐＨを維持しながら反応させることが好ましい。ｐＨの維持に使用されるアルカリ水溶液としては、ＮａＯＨ水溶液、ＫＯＨ水溶液、アンモニア水溶液、トリメチルアミン水溶液、水酸化バリウム水溶液等を例示することができる。また、反応温度は、２０℃〜５０℃、好ましくは３０℃である。
【００３９】
５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの製造方法
このようにして製造された５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸は、次に酸触媒存在下に、有機化学的な脱水反応により、容易にγ−ラクトンに変換することができる。
【００４０】
すなわち、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を酸触媒存在下、脱水反応を行ない、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンに変換させ、これを精製し、単離することからなる５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンを製造することも本発明の概念に含まれる。
【００４１】
本発明に係るγ−ラクトンの製造方法に使用する５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸は、遊離の酸、又は金属塩であっても使用できるが、好ましくは、遊離の酸の状態である。また、完全に水分が除去されず、結晶化していない状態の物であっても使用することができる。
【００４２】
５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸をγ−ラクトンに変換させるために使用される酸触媒は、酸であれば特に限定されない。例えば、硫酸、塩酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、リン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等を例示することができる。酸触媒の量は反応系の酸の規定度が０．０１Ｎ〜１０Ｎ、好ましくは１Ｎ〜３Ｎである。
【００４３】
使用される溶媒は、水、及び、アルコール類が使用でき、さらに好ましくは、水である。
【００４４】
γ−ラクトンの生成反応は、加熱することによって反応が促進されるため、加熱するのが好ましく、また、均一な熱で反応させるため攪拌を必要とする。加熱温度は、反応が進めば、特に限定されないが、水を溶媒とする場合、好ましくは、３０℃〜１００℃、また、反応時間を長く取るのであれば、３０℃〜５０℃でも反応させることができる。
【００４５】
反応後の溶液からの５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの精製は、溶媒を留去した後、水に溶解し、強酸性又は弱酸性陽イオン交換樹脂（Ｈ+タイプ）を通過させた後、強塩基性又は弱塩基性陰イオン交換樹脂（ＯＨ-タイプ）を通過させることで、不要なイオン性物質を除去し、さらに活性炭カラムを通過させることで、脱色し、精製することができる。最後に通過溶液を濃縮することで５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンを単離することができる。
【００４６】
その他、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸とそのγ−ラクトンは大きく極性に差があるため、酢酸エチル等の有機溶媒抽出によっても、精製することができる。
【００４７】
このように、本発明は、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン又はその前駆物質から、炭素−炭素開裂を伴う加水分解反応を触媒するハイドロラーゼ（新規に見い出された活性）により新規物質５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることができる。
【００４８】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【実施例１】
【００４９】
３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ遺伝子の発現
（ａ）バチルス・ズブチリスのゲノムＤＮＡの調製
ＬＢフラスコ培地１００ｍｌ（１％バクト-トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）にＬＢスラント培地（１％バクト-トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）で培養したバチルス・ズブチリス１６８株を一白金耳接種し、４時間、３６℃で好気的に培養し、これを集菌した。この菌体ペレットに、１５ｍｌのＳａｌｉｎｅ−ＥＤＴＡ溶液（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）とリゾチーム５０ｍｇを加えて懸濁し、３７℃、２時間作用させた。処理後、この溶液に２５％ＳＤＳ溶液を０．５ｍｌ加えて完全に溶菌させ、フェノールを３ｍｌ加えて、タンパク質を変性させた後に、遠心分離し、上清を取り出し、この溶液に２０ｍｌの２−プロパノールを加えて、粗ゲノムＤＮＡを析出させた。析出した粗ゲノムＤＮＡを遠心分離し、沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥した粗ゲノムＤＮＡは、さらに３ｍｌＴＥ液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解後、０．０１ｍｇのＲＮＡａｓｅを加え、３６℃、２時間反応させ、ＲＮＡを分解させた。さらに、０．０１ｍｇのプロテイナーゼＫを加えて、３６℃、２時間反応させ、タンパク質を分解させた。次に、1ｍｌのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加えて、ゆっくりと攪拌し、ＲＮＡａｓｅと、プロテイナーゼＫを変性させ、遠心分離し、２相に分離した内の水相である上層を取り出し、これに３Ｍ酢酸Ｎａ溶液を０．３ｍｌ加えて、ｐＨ５．２に調整した。これに３ｍｌの２−プロパノールを加えて、ゲノムＤＮＡを析出させた。析出したゲノムＤＮＡを遠心分離し、沈殿させ、上清を取り除いた後、減圧下で乾燥させた。乾燥したゲノムＤＮＡは、３ｍｌＴＥ液に溶解させ、これに１ｍｌのフェノール−クロロホルム（１：１）混液を加える操作から、３ｍｌＴＥ液に溶解させる過程までを、再度繰り返して、遠心分離を行い、同様にｐＨ５．２にて、上清に等量の２−プロパノールを加えて、バチルス・ズブチリスのゲノムＤＮＡ溶液を調製した。このようにして得られたゲノムＤＮＡをＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００５０】
（ｂ）３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ配列のクローニング
バチルス・ズブチリス由来３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ遺伝子配列（ｉｏｌＤ遺伝子配列）のクローニング、かつ、リコンビナント酵素として発現させるために、以下の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
配列３：iolＤ-F 5'-ccggaattcaaagatcgagtaaaggtggg-3'
配列４：iolＤ-R 5'-cgcggatcctttcatttttgcccatctatgg-3'
ＰＣＲ反応は宝酒造社のＥｘ ｔａｑ反応用液を使用し、組成はＴａｋａｒａ ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ×１０倍液 ５μｌ、ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌ、鋳型ＤＮＡ ３０ｎｇ、１０μＭ プライマー溶液 各１μｌ、Ｔａｋａｒａ ＥｘＴａｑ ０．５μｌを５０μｌになるように水を加え、３０μｌのミネラルオイルを重層し、調製した。反応条件は、ＰＣＲ増幅装置（ＡＳＴＥＣ社 ＰＣ−７００）を用い、変性を９４℃３０秒、アニーリングを５０℃１分、伸長を７２℃２分、の３段階の反応を３０回繰返し行った。上記のＰＣＲ反応によって、約２ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅した。
反応後、重層したミネラルオイルを０．３ｍｌのヘキサンで抽出し、ヘキサン層を除去する操作を３回繰返し、1分間減圧することで、ミネラルオイルを除去した。この様にして得られた反応液５０μｌからジーンクリーン（Ｂｉｏ１０１社製）を用いてＰＣＲ断片を精製した。すなわち、キット添付のＮａＩ溶液を３００μｌ加えて混合し、１０μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、４℃、１５分静置した後に、遠心分離し、ＤＮＡ断片の吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のＮｅｗ ｗａｓｈ溶液５００μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このＮｅｗ ｗａｓｈ溶液による洗浄操作は３回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、１５μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、５５℃で、１５分加温した後、遠心分離を行い、ＤＮＡ断片を含む上清１２μｌを得た。
【００５１】
（ｃ）３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの発現ベクターの調製
精製されたＤＮＡ断片を発現ベクターに組み込む操作は以下のように行った。すなわち、ＤＮＡ断片溶液１０μｌに、発現用プラスミド（ｐＵＣ１８）を０．５μｇ、宝酒造社の制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩを各１μｌ、宝酒造社の制限酵素用緩衝液Ｋ ｂｕｆｆｅｒ×１０倍液 ２μｌを加え、２０μｌになるように滅菌水を加え、混合した。この反応液を３６℃、2時間反応した。
制限酵素反応後、ジーンクリーンを用いて、ＤＮＡ断片と発現ベクターを単離し、これらをライゲーションさせた。すなわち、制限酵素反応液２０μｌにキット添付のＮａＩ溶液を３００μｌ加えて混合し、１０μｌガラスビーズ溶液を加えて混合し、４℃、１５分静置した後に、遠心分離し、ＤＮＡ断片と発現ベクターの吸着したガラスビーズを沈殿させ、上清を除去した。さらに、キット添付のＮｅｗ ｗａｓｈ溶液５００μｌを加えて、ガラスビーズを懸濁させ、遠心分離し、上清を除去した。このＮｅｗ ｗａｓｈ溶液による洗浄操作は３回繰り返した。次に、ガラスビーズを減圧下で乾燥させ、乾燥後、１５μｌの滅菌水を加えて、懸濁し、５５℃で、１５分加温した後、遠心分離を行い、ＤＮＡ断片と発現ベクターを含む上清１２μｌを得た。この操作により、制限酵素によって生じた約５０ｂｐ以下の小さなＤＮＡ断片は取り除かれ、目的とするＤＮＡ断片と、発現ベクターが得られた。
このようにして調製した溶液１０μｌにＴａｋａｒａ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ−Ｉ溶液（宝酒造社）を１０μｌ加え、１６℃、１時間反応させた。この溶液を、コンピテントセル（宝酒造社ＪＭ１０９）に形質転換させた。すなわち、４℃で解凍したコンピテントセル溶液６０μｌにライゲーション反応溶液を５μｌ加え、混合し、０℃３０分後、４２℃４５秒、０℃２分の処理を行い、これに５００μｌＳＯＣ溶液（２％バクト-トリプトン、０．５％酵母エキス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ ＭｇＳＯ4、10ｍＭ ＭｇＣｌ2）を加えて、３６℃で１時間回復培養させ、この培養液１００μｌを、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、４０μｇ／ｍｌ Ｘ−Ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトピラノシド）を含むＬＢ寒天培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、１．５％寒天）に塗布した。さらに３７℃、１６時間培養した。この培養により白色に発色したコロニーとして前記のプラスミドの導入で形質転換された大腸菌が得られるため、これを選択した。こうして分離した形質転換大腸菌コロニーをアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地で培養した。増殖した形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ, ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡの分離及び精製を行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡは、目的とする３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼに相当する約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を有することが確認された。
【００５２】
（ｄ）３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの発現
コロニーとして単離した菌株を５０μｇ/ｍｌアンピシリンを含む１００ｍｌＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に移植し、３６℃７時間培養し、この培養液に２００ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド溶液を０．３ｍｌ加え、さらに３６℃３時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集め、これを生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を０．６％トライトンＸ１００溶液３ｍｌに懸濁し４℃で超音波により菌を破砕した。この溶液を遠心分離し、上清の酵素溶液２．８ｍｌを取り出し、上清に１．２ｇ硫安を加え、４℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去し、この沈殿物を２．５ｍｌの２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０に溶解させ、再度遠心分離を行い、上清を２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（１４ｍｌ）にアプライし、２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの粗酵素液３．５ｍｌを得た。
３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ活性の測定は、粗酵素液１００μｌ、０．１％３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン１００μｌ、１Ｍトリス緩衝液 ｐＨ８．０ ５０μｌからなる組成に水を加えて１ｍｌになるように調製した後、この基本反応液をUV測定用装置にセットし、２７℃における２６０ｎｍの吸収の減少を測定した。
【００５３】
さらに、上記の基本反応液の組成の内、１Ｍトリス緩衝液 ｐＨ８．０ ５０μｌに代えて、ｐＨ４．０、５．０、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０の１Ｍリン酸緩衝液５０μｌ、ｐＨ７．０、８．５、９．０の１Ｍトリス緩衝液５０μｌ、あるいは、ｐＨ８．０、９．０、１０．０、１１．０の１Ｍ炭酸緩衝液５０μｌを用いて、変換活性を測定したところ、ｐＨ７．５〜８．５に最大活性を有していたことから、本酵素の至適ｐＨはｐＨ７．５〜８．５であることが判った。
【実施例２】
【００５４】
３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼを作用させて得られる生成物の単離と、構造確認
上記実施例１で得られた粗酵素液３．０ｍｌ、５％３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン溶液１０ｍｌを混和し、水を１５ｍｌになるように加え、ｐＨ８．０に調製し、反応溶液のｐＨが低下しないように１Ｎ ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨを随時ｐＨ８．０に調整しながら、２７℃、１６時間反応させた。得られた酵素反応液を塩酸でｐＨ3．０に調整し、８０℃で１０分間加温し、不溶化したタンパク質を遠心分離により沈殿させた。上清を、濃縮乾固し、これにメタノール１５０ｍｌを加え、固体からメタノール抽出物を得ることができた。さらにメタノール抽出物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０ｍｌ、溶離液組成 酢酸エチル：メタノール＝1：1）により、不要な塩と、色素成分を除去し、目的物を含む溶出画分を濃縮すると、白色固体が得られた。この白色固体を水に溶解し、ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨ７．５に調整し、さらに濃縮すると、濃縮中に白色結晶２２０ｍｇが得られた。この白色物質のＮＭＲ測定すると、本物質は、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸Ｎａ塩であることが判明した。また、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸Ｎａ塩は、水溶液中ではフラノースであり、β：α＝１：０．８５の比率であった。
βアノマー 1H-NMR（300MHz,D2O）δ2.69（2H,m）,δ4.13（1H,t）,δ4.28（1H,dd）,δ4.62（1H,dt）,δ5.43（1H,d,J=4.2Hz）
αアノマー 1H-NMR（300MHz,D2O）δ2.56（2H,m）,δ4.11（1H,t）,δ4.19（1H,dd）,δ4.58（1H,dt）,δ5.20（1H,d）
【実施例３】
【００５５】
２−ケト−ミオ−イノシトールから５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸への１バッチ変換
２−ケト−ミオ−イノシトールから５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸への１バッチ変換は、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼを共役させた反応により、行なうことができる。
はじめに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼの調製は以下のように行なった
【００５６】
（ａ）２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ配列のクローニング
バチルス・ズブチリス由来２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ配列（iolE遺伝子配列）のクローニング、かつ、リコンビナント酵素として発現させるために、以下の配列を有するプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行った。
配列5：iolE-F 5'-ccggaattctctgcgaagcagtattagag-3'
配列6：iolE-R 5'-cgcggatccccattggtattgcccatatg-3'
ＰＣＲ反応はアニーリングを５２℃１分、伸長を７２℃１分にした以外は、実施例１と同様の操作を行なった。結果として、このＰＣＲ反応によって、約０．９ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅した。反応後、実施例1と同様の操作で、ＰＣＲ断片の精製を行い、ＤＮＡ断片を含む上清１２μｌを得た。
【００５７】
（ｂ）２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼの発現ベクターの調製
精製されたＤＮＡ断片を発現ベクターに組み込む操作は、実施例１と制限酵素サイトが一致するので、同様の操作を行ない、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼの発現ベクターを有する大腸菌株を得て、形質転換大腸菌の菌体からプラスミド精製キット（ＱＩＡ ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ, ＱＩＡＧＥＮ社）によりプラスミドＤＮＡの分離及び精製を行った。こうして得られたプラスミドＤＮＡは、目的とする２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼに相当する約０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を有することが確認された。
【００５８】
（ｃ）２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼの発現
コロニーとして単離した菌株を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含む１００ｍｌＬＢ培地（１％バクトトリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に移植し、３６℃で７時間培養し、この培養液に２００ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド溶液を０．３ｍｌ加え、さらに３６℃３時間培養した。培養終了後、遠心分離により、菌体を集め、これを生理食塩水で1回洗浄した。さらに、洗浄菌体を０．６％トライトンＸ１００溶液３ｍｌに懸濁し４℃で超音波により菌を破砕した。この溶液を遠心分離し、上清の酵素溶液２．８ｍｌを取り出し、上清に１．２ｇ硫安を加え、４℃でタンパク質を塩析させた。塩析したタンパク質を遠心分離で集め、上清を除去し、この沈殿物を２．５ｍｌの２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０に溶解させ、再度遠心分離を行い、上清を２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（１４ｍｌ）にアプライし、２０ｍＭトリス緩衝液 ｐＨ７．０で溶出させ、脱塩を行なった。この操作により、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼの粗酵素液３．５ｍｌを得た。
【００５９】
上記（ａ）〜（ｃ）の操作で得られた２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ粗酵素液と、実施例１の方法により得られた３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼの酵素液を用いて、共役反応を行なった。
【００６０】
２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼ粗酵素液３．０ｍｌ、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ粗酵素液３．０ｍｌ、５％２−ケト−ミオ−イノシトール溶液１０ｍｌ、１ｍＭ ＣｏＣｌ2溶液 ７５０μｌを混和し、水を２０ｍｌになるように加え、ｐＨ８．０に調製し、反応溶液のｐＨが低下しないように１ＮのＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨを随時ｐＨ８．０に調整しながら、２７℃、２４時間反応させた。得られた酵素反応液を塩酸でｐＨ３．０に調整し、８０℃で１０分間加温し、不溶化したタンパク質を遠心分離により沈殿させた。上清を、濃縮乾固し、これにメタノール２００ｍｌを加え、固体からメタノール抽出物を得ることができた。さらにメタノール抽出物を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル９０ｍｌ、溶離液組成 酢酸エチル：メタノール＝１：１）により、不要な塩と、色素成分を除去し、目的物を含む溶出画分を濃縮すると、白色固体が得られた。この白色固体を水に溶解し、ＮａＯＨ水溶液を用いて、ｐＨ７．５に調整し、さらに濃縮すると、濃縮中に５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸 Na塩２５０ｍｇが得られた。
【実施例４】
【００６１】
５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸からの５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの製造と単離
実施例３の途中に生成する中和する前の白色固体は５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸であり、本物質を出発原料とした。５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸 １００ｍｇを水１．０ｍｌに溶解し、これに攪拌しながら、濃硫酸２０μｌを加えて、攪拌下、５０℃で反応させた。１６時間後、反応液は５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンが不溶物として壁面に生じた状態であった。反応停止は、反応溶液を室温まで冷却後、これに３０％水酸化バリウム懸濁液をｐＨ８になるように加えた（約６０μｌ）。その後、反応停止した溶液をろ過し、ろ液を濃縮乾固した。濃縮物に酢酸エチル３ｍｌを加えて攪拌し、再度、ろ過を行ない、残った固体を酢酸エチルで洗浄し、酢酸エチル溶液を得た。次に、最初のろ液と、洗浄液を一緒にし、この溶液を濃縮し、粗５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンを得た。さらに、この物質を少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｍｌ、溶離液組成 酢酸エチル）により、分画し、目的物を含む溶出画分を濃縮すると、白色固体３１ｍｇが得られた。この白色固体のＮＭＲ測定により、本物質は、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンであることが判明した。また、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンは、水溶液中ではフラノースであり、β：α＝０．２６：1の比率であった。
βアノマー 1H-NMR (300MHz, D2O) δ2.77 (1H, dd）、δ3.06 (1H, dd）、δ4.44(1H, d）、δ5.12 (1H, dd）、δ5.26(1H, dt）、δ5.56(1H, d）
αアノマー 1H-NMR (300MHz, D2O) δ2.79(1H, dd）、δ3.11 (1H, dd）、δ4.43(1H, d）、δ5.10 (1H, dd）、δ5.23(1H, dt）、δ5.47(1H, d）
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式で示される３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン（Ｉ）から、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸（ＩＩ）への加水分解反応を触媒する、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ。
【化１】
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに対するハイドロラーゼ活性を有する請求項１に記載の３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ。
【請求項３】
下記の化学式：
【化２】
で表される、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸、又はその金属塩。
【請求項４】
下記の化学式：
【化３】
で表される、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼにより反応溶液中で加水分解して５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることを特徴とする５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法。
【請求項５】
反応溶液中で２−ケト−ミオ−イノシトールに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼとを同時に作用させ、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることを特徴とする５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法。
【請求項６】
上記３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼが配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項４又は５に記載の５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法。
【請求項７】
上記反応溶液のｐＨをｐＨ７〜９に維持するためにアルカリ液を添加することを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法。
【請求項８】
上記反応溶液のｐＨをｐＨ７．５〜８．５に維持するためにアルカリ液を添加することを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法。
【請求項９】
５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を、酸触媒存在下、脱水反応させ、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトン〔下式（ＩＶ）〕に変換させることを特徴とする、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの製造方法。
【化４】
【請求項１】
下記一般式で示される３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオン（Ｉ）から、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸（ＩＩ）への加水分解反応を触媒する、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ。
【化１】
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列からなり、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンに対するハイドロラーゼ活性を有する請求項１に記載の３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼ。
【請求項３】
下記の化学式：
【化２】
で表される、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸、又はその金属塩。
【請求項４】
下記の化学式：
【化３】
で表される、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンを、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼにより反応溶液中で加水分解して５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることを特徴とする５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法。
【請求項５】
反応溶液中で２−ケト−ミオ−イノシトールに、２−ケト−ミオ−イノシトールデヒドラターゼと、３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼとを同時に作用させ、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を得ることを特徴とする５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法。
【請求項６】
上記３Ｄ−（３，５／４）−トリハイドロキシシクロヘキサン−１，２−ジオンハイドロラーゼが配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする、請求項４又は５に記載の５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法。
【請求項７】
上記反応溶液のｐＨをｐＨ７〜９に維持するためにアルカリ液を添加することを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法。
【請求項８】
上記反応溶液のｐＨをｐＨ７．５〜８．５に維持するためにアルカリ液を添加することを特徴とする請求項４〜６のいずれかに記載の５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸の製造方法。
【請求項９】
５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸を、酸触媒存在下、脱水反応させ、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトン〔下式（ＩＶ）〕に変換させることを特徴とする、５−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸由来のγ−ラクトンの製造方法。
【化４】
【公開番号】特開２００７−２３６２６４（Ｐ２００７−２３６２６４Ａ）
【公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−６２４６６（Ｐ２００６−６２４６６）
【出願日】平成１８年３月８日（２００６．３．８）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月８日（２００６．３．８）
【出願人】（０００２４２００２）北興化学工業株式会社 (182)
【Ｆターム（参考）】
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