ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することによる糖尿病の治療方法
ＨｔｒＡ２と相互作用するＣＲＥＢＬ１およびＨＮＦ−４αを見出し、さらに活性型ＨｔｒＡ２によりＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αが分解されることを初めて明らかにした。 そして、ＨｔｒＡ２の機能を阻害することを特徴とするＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害手段、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止手段および／または治療手段、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害手段（例えば膵臓β細胞の細胞死阻害手段）、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする２型糖尿病の防止手段および／または治療手段、並びに試薬キットを提供した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＲＥＢＬ１（サイクリックＡＭＰ レスポンシブ エレメント バインディング プロテイン ライク １、ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ １）、ＡＴＦ６（アクティベーティング トランスクリプション ファクター ６、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ６）およびＨＮＦ−４α（ヘパトサイト ヌクレアー ファクター ４α、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４α）のうちの少なくとも１の分解阻害方法、並びにＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２（ハイ テンパレイチャー リクワイアメント プロテイン Ａ２、ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２）による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。より具体的には、ＨｔｒＡ２の機能を阻害すること（例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害すること、またはＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害すること）を特徴とするＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法に関する。また、前記分解方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。さらに、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法、並びに該化合物を１つ以上含んでなる糖尿病の防止剤および／または治療剤に関する。また、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解を阻害する化合物の同定方法に関する。さらに、糖尿病の防止剤および／または治療剤の有効成分である化合物の同定方法に関する。また、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害方法に関する。さらに、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする細胞死阻害方法、並びに該化合物を１つ以上含んでなる細胞死阻害剤に関する。また、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする２型糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。さらに、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる２型糖尿病の防止剤および／または治療剤に関する。また、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４α、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチド、およびＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、細胞の生存とアポトーシス（細胞死）を調節することにより外界のストレスから身を守るが、生存とアポトーシス制御機構の調節の乱れによる過剰な細胞死は、種々の疾患を招く可能性がある（非特許文献１）。
【０００３】
近年、ストレスを感知し調節する場としてミトコンドリアや小胞体の研究が進み、ミトコンドリア膜に局在するＨｔｒＡ２蛋白質（以下、ＨｔｒＡ２と称する）は、ＵＶや熱ショック等のストレスによりミトコンドリア膜から細胞質へ移行し（非特許文献２−５）、カスパーゼ依存的な細胞死とカスパーゼ非依存的な細胞死の二つの細胞死を誘導することが報告された（非特許文献６）。ＨｔｒＡ２は、前駆体蛋白質（配列番号２）からＮ末１３３アミノ酸が切り離された成熟型（配列番号４）になり、ミトコンドリアから細胞質に移行する。成熟型ＨｔｒＡ２はプロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有するＨｔｒＡ２を活性型ＨｔｒＡ２と称することもある。
【０００４】
カスパーゼ非依存的な細胞死は、ＨｔｒＡ２自身のセリンプロテアーゼとしての性質に依存し、その前駆体蛋白質のアミノ酸配列中３０６番目（成熟型においては１７４番目に相当する）のセリンをアラニンに置換したＨｔｒＡ２変異体によりカスパーゼ非依存的な細胞死は引き起こされないことが知られている（非特許文献３−５）。かかるＨｔｒＡ２変異体はプロテアーゼ活性を有さない。以下、プロテアーゼ活性を有さないＨｔｒＡ２を不活性型ＨｔｒＡ２と称することもある。このようにＨｔｒＡ２は、カスパーゼ非依存的な細胞死を誘導する機構において重要な役割を担う因子である。
【０００５】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【非特許文献１】「細胞工学」、２００２年、第２１巻、第４号、ｐ．３６０−３９４。
【非特許文献２】ヤマグチ（Ｈ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）ら、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００３年、第６３巻、ｐ．１４８３−１４８９。
【非特許文献３】スズキ（Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ）ら、「モレキュラー セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ）」、２００１年、第８巻、ｐ．６１３−６２１。
【非特許文献４】ヘッジ（Ｒ．Ｈｅｇｄｅ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４３２−４３８。
【非特許文献５】マーチンズ（Ｌ．Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｓ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４３９−４４４。
【非特許文献６】「実験医学」、２００２年、第２０巻、第１号、ｐ．７３−７５。
【非特許文献７】「内科」、２００３年、第９１巻、第１号、ｐ．６３−６７。
【非特許文献８】カウフマン（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ）ら、「ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００２年、第１１０巻、ｐ．１３８９−１３９８。
【非特許文献９】ハゼ（Ｋ．Ｈａｚｅ）ら、「ザ バイオケミカル ジャーナル（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）、２００１年、第３５５巻、ｐ．１９−２８。
【非特許文献１０】「ジャーナル オブ モレキュラー エンドクリノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第２７巻、第１号ｐ．１１−２９。
【非特許文献１１】「臨床病理」、２００１年、第４９巻、第２号、ｐ．１６１−１６４。
【非特許文献１２】ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１。
【非特許文献１３】「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年。
【非特許文献１４】「ペプチド シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９６年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、小胞体ストレスにより膵臓のβ細胞が細胞死を起こし、糖尿病を発症することが報告されている。膵臓β細胞はインスリンの産生分泌を行う細胞で、小胞体が非常に発達しており、小胞体ストレスに感受性が高い。すなわち、小胞体ストレス応答における防御機構の破綻が引き起こす細胞死によりβ細胞が脱落し、その結果インスリン分泌不全により糖尿病が亢進すると考えられている（非特許文献７）。一方、小胞体ストレスによりＨｔｒＡ２の発現が亢進することが報告されている。これらから、ＨｔｒＡ２が、糖尿病の新たな標的となる可能性が高く、また小胞体ストレスによる細胞死を阻害することは、新規な創薬標的になると考えられる。
【０００７】
本発明の課題は、ＨｔｒＡ２によるカスパーゼ非依存的な細胞死の機構およびＨｔｒＡ２の基質が未だ明らかになっていない状況において、ＨｔｒＡ２と相互作用する蛋白質を見出し、ＨｔｒＡ２による該蛋白質の分解に基づく疾患の防止および／または治療を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、ＨｔｒＡ２がＣＲＥＢＬ１およびＨＮＦ−４αと相互作用することをインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で予測し、さらに活性型ＨｔｒＡ２によりＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αが分解されることを実験的に証明して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、ＨｔｒＡ２の機能を阻害することを特徴とするＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法に関する。
【００１０】
また本発明は、ＨｔｒＡ２の機能を阻害することがＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することであり、ここでＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＣＲＥＢＬ１の分解が阻害され、ＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＡＴＦ６の分解が阻害され、および、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＨＮＦ−４αの分解が阻害される前記ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法に関する。
【００１１】
さらに本発明は、ＨｔｒＡ２の機能を阻害することがＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することであり、ここでＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＣＲＥＢＬ１の分解が阻害され、ＡＴＦ６とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＡＴＦ６の分解が阻害され、および、ＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＨＮＦ−４αの分解が阻害される前記ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法に関する。
【００１２】
さらにまた本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
【００１３】
また本発明は、前記ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
【００１４】
さらに本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
【００１５】
さらにまた本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる糖尿病の防止剤および／または治療剤に関する。
【００１６】
また本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２をある化合物（被検化合物）と接触させ、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１を検出し得るシグナルおよび／マーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／マーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、被検化合物がＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
【００１７】
さらに本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２をある化合物（被検化合物）と接触させ、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、あるいはＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、被検化合物がＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
【００１８】
さらにまた本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法が、糖尿病の防止剤および／または治療剤の有効成分である化合物の同定方法である、前記同定方法に関する。
【００１９】
また本発明は、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害方法に関する。
【００２０】
さらに本発明は、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする細胞死阻害方法に関する。
【００２１】
さらにまた本発明は、細胞死が膵臓β細胞の細胞死である前記細胞死阻害方法に関する。
【００２２】
また本発明は、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる細胞死阻害剤に関する。
【００２３】
さらに本発明は、細胞死が膵臓β細胞の細胞死である前記細胞死阻害剤に関する。
【００２４】
さらにまた本発明は、前記細胞死阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
【００２５】
また本発明は、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする２型糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
【００２６】
さらに本発明は、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる２型糖尿病の防止剤および／または治療剤に関する。
【００２７】
さらにまた本発明は、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４α、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチド、およびＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、これら蛋白質のうちの少なくとも１の減少または消失を阻害することができ、その結果、糖尿病の防止および／または治療が可能になる。
【００２９】
ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導し、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献８および９）。また、小胞体ストレスにより膵臓のβ細胞が細胞死を起こし、糖尿病を亢進することが報告されている（非特許文献７）。これらから、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６がＨｔｒＡ２により分解されて減少または消失することにより、ストレス等による細胞死、例えば膵臓β細胞の細胞死が亢進し、その結果、糖尿病が亢進すると考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害してこれら蛋白質の減少または消失を阻害することにより細胞死（例えば膵臓のβ細胞の細胞死）を阻害でき、その結果、糖尿病の防止および／または治療が可能になる。
【００３０】
ＨＮＦ−４αは、その機能欠損が糖代謝の異常を招くこと、および遺伝子２型糖尿病ＭＯＤＹ１の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献１０および１１）。これらから、ＨＮＦ−４αの減少または消失によっても糖代謝の異常が生じ、糖尿病（例えば２型糖尿病）が亢進すると考えられる。すなわち、ＨＮＦ−４αがＨｔｒＡ２により分解されて減少または消失することにより、糖代謝の異常が生じ、その結果、糖尿病（例えば２型糖尿病）が亢進すると考える。したがって、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害してＨＮＦ−４αの減少または消失を阻害することにより糖代謝を正常化することができ、糖尿病（例えば２型糖尿病）の防止および／または治療が可能になる。
【００３１】
ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解の阻害とＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解の阻害とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解とＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解とをいずれも阻害することにより、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および／または治療が達成できるため、高い効果が得られると考える。
【００３２】
また本発明により、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法を実施できる。本同定方法で得られた化合物は、糖尿病の防止および／または治療に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−Ａ】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＣＲＥＢＬ１がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められなかった。（実施例２）
【００３４】
【図１−Ｂ】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＡＴＦ６がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＡＴＦ６を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した。一方不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＡＴＦ６の分解が認められなかった。（実施例２）
【００３５】
【図２−Ａ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＣＲＥＢＬ１が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００３６】
【図２−Ｂ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＡＴＦ６が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００３７】
【図３】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を用いて、ビオチンを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によるＣＲＥＢＬ１の分解が検出されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少し、５０ｋＤａ近辺にＣＲＥＢＬ１分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められず、上記５０ｋＤａ近辺のバンドも検出されなかった。（実施例４）
【００３８】
【図４】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を用いて、Ｎ末に付加されたＴａｇを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＣＲＥＢＬ１が分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、Ｎ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。図３で検出された５０ｋＤａ近辺のＣＲＥＢＬ１分解産物を示すと考えられるバンドは、抗Ｔａｇ抗体では検出されなかった。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解は認められなかった。（実施例４）
【図５】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＣＲＥＢＬ１がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められなかった。（実施例６）
【図６】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＣＲＥＢＬ１が細胞内で分解されたことを説明する図である。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの減少は認められなかった。（実施例７）
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００３−３４２５８７号からの優先権を主張するものである。
【００４０】
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「ポリペプチド」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
【００４１】
本発明においては、ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１およびＨＮＦ−４αとが相互作用することを、国際公開ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット記載の方法に従ってインシリコで予測した。さらに実験的に、ＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリー蛋白質であるＡＴＦ６、およびＨＮＦ−４αが活性型ＨｔｒＡ２により分解されることを初めて明らかにした。
【００４２】
ＣＲＥＢＬ１はＡＴＦ６ファミリーの１つであり、ＡＴＦ６βとも称される。ＣＲＥＢＬ１は小胞体に局在し、小胞体ストレスによりＳ１Ｐ、Ｓ２Ｐによりプロセッシングを受けて一部が核移行し、転写因子として働くことが知られている。ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導し、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献８および９）。また、小胞体ストレスにより膵臓のβ細胞が細胞死を起こし、糖尿病を亢進することが報告されている（非特許文献７）。これらから、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６がＨｔｒＡ２により分解されて減少または消失することにより、ストレス等による細胞死、例えば膵臓β細胞の細胞死が亢進し、その結果、糖尿病が亢進すると考える。
【００４３】
したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、これら蛋白質のうちの少なくとも１の減少または消失を阻害でき、その結果、ストレス等による細胞死、例えば膵臓β細胞の細胞死を阻害できる。さらには、糖尿病の防止および／または治療を実施できる。
【００４４】
ＨＮＦ−４αは、その機能欠損が糖代謝の異常を招くこと、および遺伝子２型糖尿病ＭＯＤＹ１の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献１０および１１）。これらから、ＨＮＦ−４αの減少または消失によっても糖代謝の異常が生じ、糖尿病（例えば２型糖尿病）が亢進すると考えられる。すなわち、ＨＮＦ−４αがＨｔｒＡ２により分解されて減少または消失することにより、糖代謝の異常が生じ、その結果、糖尿病（例えば２型糖尿病）が亢進すると考える。
【００４５】
したがって、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、ＨＮＦ−４αの減少または消失を阻害でき、その結果、糖代謝を正常化することができる。さらには、糖尿病、例えば２型糖尿病の防止および／または治療を実施できる。
【００４６】
このように、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害し、これら蛋白質のうちの少なくとも１の減少または消失を阻害することにより、糖尿病の防止および／または治療を実施できる。これら蛋白質のうちのいずれか１の分解を阻害することにより得られる糖尿病の防止および／または治療の効果と比較して、これら蛋白質のうちの２つまたは３つのＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、より高い効果が得られると考える。
【００４７】
ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解の阻害とＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解の阻害とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解の阻害は、膵臓β細胞の細胞死の阻害を介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。他方、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解の阻害は、糖代謝の正常化を介して糖尿病（例えば２型糖尿病）の防止および／または治療に効果を示すと考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解とＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解とをいずれも阻害することにより、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および／または治療が達成できるため、高い効果が得られると考える。
【００４８】
これら知見に基づいて本発明においては、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害方法を提供する。さらに、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解に基づく疾患、例えば糖尿病の防止方法および／または治療方法を提供する。
【００４９】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法はＨｔｒＡ２の機能を阻害することにより実施できる。
【００５０】
ＨｔｒＡ２の機能として、例えば、そのプロテアーゼ活性によるＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の切断が挙げられる。プロテアーゼによる蛋白質分解においては一般的に、プロテアーゼが蛋白質に作用して蛋白質のペプチド結合を１箇所または２箇所以上で切断することにより蛋白質分解が行われる。実際に、ＨｔｒＡ２はＣＲＥＢＬ１のペプチド結合を数箇所で切断することによりＣＲＥＢＬ１を分解した（実施例４）。同様に、ＨｔｒＡ２は、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのペプチド結合を１箇所または２箇所以上で切断することによりこれら蛋白質を分解すると考える。
【００５１】
したがって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することにより、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法を実施できる。本分解阻害方法においては、ＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＣＲＥＢＬ１の分解が阻害され、ＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＡＴＦ６の分解が阻害され、および、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＨＮＦ−４αの分解が阻害される。
【００５２】
ＨｔｒＡ２の機能としてまた、例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１との相互作用が挙げられる。本明細書中で「ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２が相互作用する」とは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２がある様式により互いに作用を及ぼし、その結果、具体的にはＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１がＨｔｒＡ２により分解されることを意味する。前記「ある様式」とは、結合、接触あるいは近接等を含むものであり、結果として互いに作用を及ぼし得る様式であればいずれのものであってもよい。
【００５３】
したがって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とのＨｔｒＡ２との相互作用を阻害することにより、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法を実施できる。
【００５４】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法は、好ましくは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを少なくとも含む生体外試料において、ＨｔｒＡ２の機能を阻害することにより実施できる。
【００５５】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法は具体的には、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を阻害する化合物が挙げられる。好ましくは、ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を特異的に阻害する化合物が挙げられる。ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を特異的に阻害する化合物とは、ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を強く阻害するが、他の酵素の活性は阻害しないか、弱く阻害する化合物を意味する。ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を阻害する化合物は、例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αを基質として用いてＨｔｒＡ２による当該基質の分解を検出する系にある化合物（以下、被検化合物と称する）を添加し、被検化合物が当該基質の分解を阻害するか否かを判定することにより同定し取得できる。ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を特異的に阻害する化合物は、他の酵素活性に対する阻害効果と比較して、ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を強く阻害するものを、上記のように同定された化合物から選択することにより取得できる。また、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害する化合物として、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２の各アミノ酸配列において、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２とが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。特に、ＨｔｒＡ２の基質となるＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４α由来のかかるポリペプチドは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２との相互作用を競合的に阻害し、ＨｔｒＡ２によるこれら各蛋白質の切断を阻害できる。このようなポリペプチドであって、さらにＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２との相互作用を特異的に阻害するポリペプチドがより好ましく本分解阻害方法に用いられる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を特異的に阻害するポリペプチドとは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を強く阻害するが、他の蛋白質間相互作用は阻害しないか、弱く阻害するポリペプチドを意味する。また、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害する化合物として、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２により分解される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、かかるポリペプチドとして好適である。このようなポリペプチドであって、さらにＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を特異的に阻害するポリペプチドがより好ましく本分解阻害方法に用いられる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を特異的に阻害するポリペプチドとは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を強く阻害するが、ＨｔｒＡ２による他の蛋白質の分解は阻害しないか、弱く阻害するポリペプチドを意味する。
【００５６】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法はまた、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を阻害する化合物を用いて実施できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を阻害する化合物であって、さらに該相互作用を特異的に阻害する化合物がより好ましく本分解阻害方法に用いられる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を特異的に阻害する化合物とは、該相互作用を強く阻害するが、他の蛋白質間相互作用は阻害しないか、弱く阻害する化合物を意味する。このような化合物として、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２の各アミノ酸配列において、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２とが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。特に、ＨｔｒＡ２の基質となるＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４α由来のかかるポリペプチドは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２との相互作用を競合的に阻害し、ひいてはＨｔｒＡ２によるこれら各蛋白質の分解を阻害できる。
【００５７】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法に用い得るポリペプチドは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害するものを選択することにより取得できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのアミノ酸配列において、ＨｔｒＡ２と相互作用する部位またはＨｔｒＡ２により分解される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、かかるポリペプチドとして好適である。このように特定されたポリペプチドに、１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、人工的に変異を導入したものであってもよい。このような変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術（非特許文献１２）を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変できる。
【００５８】
上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、成書（非特許文献１３および１４）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等が挙げられる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて上記ポリペプチドを製造できる。あるいは遺伝子工学的手法により上記ポリペプチドを取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換え発現ベクターを作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造できる。
【００５９】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２を認識する抗体であって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する抗体を用いることによっても実施できる。かかる抗体は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２自体、あるいはＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２とが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチド等を抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。
【００６０】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害する化合物は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を指標にして、医薬品スクリーニングにおいてよく知られている同定方法を用いて取得できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりこれら蛋白質の分解が阻害されることから、これら蛋白質の切断を阻害する化合物はこれら蛋白質の分解を阻害すると考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害する化合物の同定方法により、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物も取得できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断および分解を阻害する化合物の同定方法は、例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断および分解を可能にする条件を選択し、当該条件下でＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２とを調べようとする化合物（以下、被検化合物と称する）と接触させ、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の切断および分解を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断および分解を阻害する化合物を同定できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断および分解を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を用いて、上記化合物の同定方法を実施できる。細胞における共発現は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的方法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、単独で、または組合せて細胞のトランスフェクションに使用できる。細胞は、真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは動物培養細胞株、さらに好ましくは哺乳動物培養細胞株を使用できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２と被検化合物との接触は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断および分解の反応以前に行なってもよいし、該切断および分解の反応に共存させることにより行なってもよい。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指す。ここでマーカーとは、それ自体は物理的または化学的性質により検出され得ないが、化学的反応を経ることにより前記シグナルを生成させるものであって、該生成されるシグナルの物理的、化学的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルおよび／またはマーカーとして、レポーター遺伝子（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等）、放射性同位体、タグペプチド類（Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等）、ＧＳＴ等の酵素類、ビオチン、および蛍光蛋白質等、公知のものが利用できるが、これら例示に限らず、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であれば、いずれも利用できる。これらシグナルおよび／またはマーカーの検出方法は当業者には周知である。簡便には、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の切断および分解は、これら蛋白質量またはこれら蛋白質の分解物量の存在若しくは不存在および／または変化の検出により測定できる。これら蛋白質量またはこれら蛋白質の分解物量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッティング等を用いて実施できる。
【００６１】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を阻害する化合物は、上記同定方法により取得できる。
【００６２】
ＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも公知蛋白質であり、ジェンバンク（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ）にそれぞれアクセッションナンバーＮＭ＿０１３２４７、ＮＭ＿００４３８およびＮＭ＿００７３４８として開示されている。また、ＨＮＦ−４αも公知蛋白質であり、スイスプロットデータベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅ）にアクセッションナンバーＰ４１２３５（登録遺伝子名はＨＮＦ４Ａ）として開示されている。
【００６３】
本実施例において用いたＨｔｒＡ２のアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＨｔｒＡ２ ＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、成熟型ＨｔｒＡ２である。成熟型ＨｔｒＡ２とは、ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質（配列番号２）からＮ末１３３アミノ酸残基が切り離されて生じた成熟型蛋白質であり、プロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有するＨｔｒＡ２を活性型ＨｔｒＡ２と呼称することがある。また、活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた蛋白質（配列番号８、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）と称することがある）または成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した蛋白質（配列番号１０、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）と称することがある）を用いることができる。このような変異を導入したＨｔｒＡ２は、そのプロテアーゼ活性には変化がないため、活性型ＨｔｒＡ２として用いることができる。一方、プロテアーゼ活性を有さないＨｔｒＡ２を不活性型ＨｔｒＡ２と呼称することがある。不活性型ＨｔｒＡ２として、ＨｔｒＡ２のアミノ酸配列においてＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性に必要な部位のアミノ酸残基に変異を有し、該変異の結果プロテアーゼ活性を示さないＨｔｒＡ２変異体が例示できる。ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性に必要な部位として、プロテアーゼ活性ドメイン、より好ましくは成熟型ＨｔｒＡ２（配列番号４）の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリン残基が挙げられる。不活性型ＨｔｒＡ２として、より具体的には、成熟型ＨｔｒＡ２の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリン残基がアラニンに置換したＨｔｒＡ２変異体（配列番号６、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）と呼称する）が例示できる。また、不活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた蛋白質（配列番号１２、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）と称することがある）または成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した蛋白質（配列番号１４、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）と称することがある）を用いることができる。
【００６４】
本実施例において用いたＣＲＥＢＬ１のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。また、配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードするＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列を配列番号１５に示す。配列番号１５に記載の塩基配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿００４３８に開示されたＣＲＥＢＬ１の塩基配列と比較して塩基の１つに相違が認められた（実施例２参照）。
【００６５】
本実施例において用いたＡＴＦ６のアミノ酸配列を配列番号１８に示す。また、配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードするＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列を配列番号１７に示す。配列番号１７に記載の塩基配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿００７３４８に開示されたＡＴＦ６の塩基配列と比較して１５個の塩基に相違が認められた（実施例２参照）。
【００６６】
本実施例において用いたＨＮＦ−４αのアミノ酸配列を配列番号３５に示す。また、配列番号３５に記載のアミノ酸配列をコードするＨＮＦ−４α ＤＮＡの塩基配列を配列番号３４に示す。配列番号３５に記載のアミノ酸配列は、スイスプロットデータベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅ）のアクセッションナンバーＰ４１２３５（登録遺伝子名はＨＮＦ４Ａ）に開示されたＨＮＦ−４αのアミノ酸配列と同一であった（実施例６参照）。
【００６７】
本発明においてＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４α並びにこれら各蛋白質をコードする各遺伝子は、上記例示したアミノ酸配列または塩基配列で表される蛋白質または遺伝子に限定されず、一般的に報告されているＨｔｒＡ２、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１をいずれも含む。
【００６８】
本発明において使用するＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのいずれか１つ以上を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。ＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２との相互作用、およびこれら蛋白質の機能、例えばＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性やＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αの酵素基質としての性質等に影響がなければ、Ｎ末側やＣ末側に別の蛋白質やポリペプチドを、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加したものであってもよい。付加する別の蛋白質やポリペプチドとして、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、ｔａｇペプチド類（Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等）を例示できる。
【００６９】
ＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製できる。ＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、当該ポリヌクレオチドを適当な発現ベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。
【００７０】
被検化合物として、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、あるいはＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αの一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。その他、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のアミノ酸配列において、ＨｔｒＡ２と相互作用する部位またはＨｔｒＡ２により切断される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。
【００７１】
本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを用いたインビトロにおけるプロテアーゼアッセイ（実施例２および６）に被検化合物を添加することにより実施できる。活性型である成熟型ＨｔｒＡ２は、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得した成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした大腸菌から調製できる。ＣＲＥＢＬ１は、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＡＴＦ６は、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＡＴＦ６ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＨＮＦ−４αは、ヒト脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＨＮＦ−４α ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αおよびＨｔｒＡ２は、これら蛋白質をそれぞれ発現させた各細胞の細胞溶解液の可溶性画分に含まれる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αは、好ましくは、それらのＮ末またはＣ末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させ、該タグペプチドに対する抗体で免疫沈降することにより精製して用いることが適当である。例えば、タグペプチドに対する抗体で免疫沈降した後、樹脂（プロテインＧ セファロース等）等に補足したものを使用できる。インビトロにおけるプロテアーゼアッセイは、樹脂等に補足したＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αに、成熟型ＨｔｒＡ２を添加して３７℃で一晩反応させた後、これら蛋白質をウエスタンブロッティングで検出することにより実施できる。ＡＴＦ６については、３７℃で４時間反応させることにより成熟型ＨｔｒＡ２により分解されるため、プロテアーゼアッセイにおける反応時間を４時間にすることもできる。ウエスタンブロッティングによる検出は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αに付加させたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αはＨｔｒＡ２により分解されるため、ウエスタンブロッティングにより検出されるこれら蛋白質の量は、ＨｔｒＡ２を添加しないときと比較して減少または消失する。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αと成熟型ＨｔｒＡ２との反応に被検化合物を添加し、被検化合物を添加しないときと比較してＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αの量の低減または消失が阻害される場合、該被検化合物はＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害すると判定できる。被検化合物は予めＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αと、あるいは成熟型ＨｔｒＡ２と接触させ、その後、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αと成熟型ＨｔｒＡ２を反応させることもできる。
【００７２】
また、本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を用いた細胞内プロテアーゼアッセイ（実施例３および７）に被検化合物を添加することにより実施できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との細胞での共発現は、上記のように作製したＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡ、ＡＴＦ６ ＤＮＡおよびＨＮＦ−４α ＤＮＡのそれぞれを含む適当なベクターとＨｔｒＡ２ ＤＮＡを含む適当なベクターとを、自体公知の遺伝子工学的手法で動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）にトランスフェクションすることにより実施できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αは、これら蛋白質のＮ末またはＣ末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させることが、これら蛋白質の検出を容易にするため、好ましい。ＨｔｒＡ２は、活性型ＨｔｒＡ２を用いる。活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２、好ましくはＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）またはＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）を用いることが適当である。成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）は、アポトーシスの阻害に働くＩＡＰｓ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、ＩＡＰｓと結合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアッセイの検討に影響を与える可能性が考えられるため、ＩＡＰｓと結合しない成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）を使用することが好ましい。細胞内プロテアーゼアッセイは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を被検化合物と共に３７℃で４８時間培養後、該細胞を溶解し、その溶解液中に含まれるＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをウエスタンブロッティングで検出することにより実施できる。ウエスタンブロッティングによる検出は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αに付加させたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αはＨｔｒＡ２により分解されるため、ウエスタンブロッティングにより検出されるこれら蛋白質の量は、ＨｔｒＡ２を添加しないときと比較して減少または消失する。被検化合物を添加した場合のＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αの量の低減または消失が、被検化合物を添加しないときと比較して阻害される場合、該被検化合物はＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害すると判定できる。
【００７３】
本発明に係る化合物の同定方法は、上記インビトロにおけるプロテアーゼアッセイや細胞内プロテアーゼアッセイを用いた具体的例示に限定されず、一般的に用いられている医薬品スクリーニングにおいてよく知られている同定方法を用いて実施できる。
【００７４】
本発明に係る化合物の同定方法で得られた化合物は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害剤として利用できる。当該化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製できる。医薬組成物の調製において、これら化合物は、単独で使用することもできるし、組合せて使用することもできる。
【００７５】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、糖尿病の防止剤および／または治療剤の有効成分として使用できる。すなわち、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いて、糖尿病の防止剤および／または治療剤を調製できる。このような化合物は上記化合物の同定方法により取得できる。ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、過剰な小胞体ストレス等により引き起こされる細胞死（例えば膵臓のβ細胞の細胞死）を阻害でき、その結果、糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。また、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、糖代謝を正常化することができ、糖尿病（例えば２型糖尿病）の防止および／または治療に効果を示すと考える。このように、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物と、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物と、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物とを組合せて含む糖尿病の防止剤および／または治療剤は、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すため、これら化合物のいずれかを含む糖尿病の防止剤および／または治療剤と比較してより効果が高く、より好ましい。
【００７６】
本発明に係る糖尿病の防止方法および／または治療方法は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより実施できる。ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、過剰な小胞体ストレス等により引き起こされる細胞死（例えば膵臓のβ細胞の細胞死）を阻害でき、その結果、糖尿病の防止および／または治療の効果が得られると考える。また、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより糖代謝を正常化することができ、糖尿病（例えば２型糖尿病）の防止および／または治療の効果が得られると考える。このように、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解の阻害と、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解の阻害とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解とＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解とをいずれも阻害することによる糖尿病の防止方法および／または治療方法は、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すため、これら蛋白質の分解の一方を阻害することによる糖尿病の防止方法および／または治療方法と比較してより効果が高く、より好ましい。
【００７７】
本発明に係る糖尿病の防止方法および／または治療方法は、上記したＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を用いて実施できる。また、本糖尿病の防止方法および／または治療方法は、上記したＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法を用いて実施できる。
【００７８】
ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献８および９）ことから、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、細胞死阻害方法を実施できる。また、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、細胞死阻害剤として使用できる。すなわち、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の１つ以上を用いて細胞死阻害剤を調製できる。さらに、小胞体ストレスにより膵臓のβ細胞が細胞死を起こすことが報告されている（非特許文献７）ことから、本発明に係る細胞死阻害方法および細胞死阻害剤は、好ましくは膵臓β細胞の細胞死阻害方法および細胞死阻害剤に使用できる。より好ましくは小胞体ストレスによる膵臓β細胞の細胞死阻害方法および細胞死阻害剤に使用できる。
【００７９】
本発明に係る細胞死阻害方法は、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解の阻害方法を用いて実施できる。ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は上記化合物の同定方法により取得できる。さらに、本細胞死阻害方法および本細胞死阻害剤を用いて、糖尿病の防止方法および／または治療方法を実施できる。本細胞死阻害方法は、好ましくは、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６とＨｔｒＡ２とを少なくとも含む生体外試料においてＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより実施できる。
【００８０】
ＨＮＦ−４αの機能欠損は糖代謝の異常を招くこと、および遺伝子２型糖尿病ＭＯＤＹ１の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献１０および１１）ことから、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、２型糖尿病の防止方法および／または治療方法を実施できる。また、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、２型糖尿病の防止剤および／または治療剤の有効成分として使用できる。すなわち、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の１つ以上を用いて、２型糖尿病の防止剤および／または治療剤を調製できる。
【００８１】
本発明に係る２型糖尿病の防止方法および／または治療方法は、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解の阻害方法を用いて実施できる。ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は上記化合物の同定方法により取得できる。
【００８２】
本発明に係る糖尿病の防止剤および／または治療剤は、上記化合物の１つ以上を有効成分としてその有効量含む医薬として製造できる。通常は、１種または２種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。
【００８３】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００８４】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。
【００８５】
より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。
【００８６】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤等を適宜使用することもできる。
【００８７】
安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。
【００８８】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
【００８９】
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。
【００９０】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。
【００９１】
キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。
【００９２】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。
【００９３】
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ乃至１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量を変更できる。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００９４】
本発明の医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
【００９５】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与することができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施可能である。
【００９６】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００９７】
さらに本発明は、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４α、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチド、およびＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キットを提供する。当該試薬キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。
【００９８】
上記試薬キットは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００９９】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【０１００】
（ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレットに記載の予測方法に従って予測した。すなわち、ＨｔｒＡ２のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＨｔｒＡ２との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＨｔｒＡ２と相互作用すると予測した。
【０１０１】
解析の結果、ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、ＣＲＥＢＬ１を見出した。
【実施例２】
【０１０２】
（インビトロ プロテアーゼアッセイ）
ＣＲＥＢＬ１またはＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６とＨｔｒＡ２の相互作用を実験的に検証するために、インビトロにおけるプロテアーゼアッセイを実施した。
【０１０３】
＜材料およびその調製＞
本実施例においては、活性型ＨｔｒＡ２および不活性型ＨｔｒＡ２としてそれぞれ、いずれもＣ末Ｔａｇとしてヒスチジン（Ｈｉｓ）を付加した成熟型ＨｔｒＡ２（配列番号４）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）（配列番号６）を用いた。また、ＨｔｒＡ２と相互作用すると予想した蛋白質として、いずれもＮ末Ｔａｇとしてｃ−Ｍｙｃを付加したＣＲＥＢＬ１（配列番号１６）およびＡＴＦ６（配列番号１８）を用いた。
【０１０４】
１．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）のクローニングおよび発現プラスミドの作製
成熟型ＨｔｒＡ２（前駆体ＨｔｒＡ２（そのＤＮＡ塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１および配列番号２に記載）のアミノ酸残基１３４−４５８部分）をコードする遺伝子を得るために、Ｈｕｍａｎ Ｋｉｄｎｅｙ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、ＨｔｒＡ２−Ｆ１プライマー（５´側にＮｄｅＩ部位とＡＴＧを付加、配列番号１９）とＨｔｒＡ２−ＲＳプライマー（終止コドンを除いてＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２０）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）により成熟型ＨｔｒＡ２遺伝子を増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。また、シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｈｉｔａｃｈｉ：ＡＢＩ３１００）により塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および配列番号４に記載した。成熟型ＨｔｒＡ２大腸菌発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２遺伝子をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＥＴ２４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組込むことにより取得した。
【０１０５】
成熟型ＨｔｒＡ２の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリンをアラニンに置換した変異体（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））は、プロテアーゼ活性を示さないことが報告されている。そこで、不活性型である成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の大腸菌発現プラスミドを、成熟型ＨｔｒＡ２発現プラスミドを鋳型とし、ＨｔｒＡ２−ＭＦプライマー（配列番号２１）とＨｔｒＡ２−ＭＲプライマー（配列番号２２）を用いてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により作製した。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５および配列番号６に記載した。
【０１０６】
２．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の発現および精製
成熟型ＨｔｒＡ２大腸菌発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した形質転換体を取得した。この形質転換体を、２６℃にて１００ｍｌのＬＢ培地で培養し、吸光度（ＯＤ）が０．６８〜０．８１に達したときにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭ添加することにより成熟型ＨｔｒＡ２蛋白質の発現誘導を行い、一晩培養した後、成熟型ＨｔｒＡ２を発現している大腸菌を遠心処理により分離回収した。得られた大腸菌を、リシスバッファーＡ（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／１％ トライトンＸ−１００、１μｇ／ｍｌ ペプスタチン、５μＭ Ｅ６４）に懸濁し、氷冷下でソニケーター（１５秒×１０回）により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心処理し（１５，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）、可溶性画分（上清）と不溶性画分に分離した。成熟型ＨｔｒＡ２の含まれる可溶性画分を、あらかじめ１％ トライトンＸ−１００、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて平衡化したプロボンドレジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：１ｍｌ ｐｒｅｐａｃｋｅｄ）に加え、４℃で３０分間混和した後、洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）にて３回洗浄した。レジンに吸着した成熟型ＨｔｒＡ２は、５０、１００、２００、３５０、５００ｍＭ イミダゾールをそれぞれ含む溶出バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）にて段階的に溶出した。各溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、成熟型ＨｔｒＡ２を含む画分を特定した。その結果、３５０−５００ｍＭ イミダゾールで成熟型ＨｔｒＡ２が溶出された。成熟型ＨｔｒＡ２を含む画分を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析した後、遠心処理にて不溶物を除去した上清を濃縮し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準蛋白質としてクマシープラスプロテインアッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、ＰＩＥＲＣＥ社製）により蛋白質を定量した。また成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の発現および精製を同様に行った。
【０１０７】
３．ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６のクローニングおよび発現プラスミドの作製
ＣＲＥＢＬ１については、まずＨｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ｃＤＮＡを鋳型とし、８３−Ｆプライマー（ＡＴＧの直前にＥｃｏＲＩ部位とＧＣＣを付加、配列番号２３）と８３−Ｒプライマー（終止コドンを除いてＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２４）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＣＲＥＢＬ１遺伝子を増幅させ、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５にクローニングした。
【０１０８】
次に、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５に組込んだＣＲＥＢＬ１遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６−ＮＦ１プライマー（ＡＴＧを除いてＢａｍＨＩ部位を付加、配列番号２５）とＡＴＦ６−ＮＲ１プライマー（終止コドンの後にＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２６）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＣＲＥＢＬ１遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。本実施例で得られたＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＮＭ＿００４３８として既に登録された塩基配列と比較して塩基の１つに相違が認められた（Ｔ４５０Ｃ）。この相違によるアミノ酸の変化はなかった。また、終止コドンがＴＧＡからＴＡＡに変化した。これらの相違はＰＣＲエラーではないことを確認した。本実施例で得られたＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１５および配列番号１６に記載した。ＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミドは、クローニングしたＣＲＥＢＬ１遺伝子をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３に組込むことにより取得した。
【０１０９】
ＡＴＦ６については、まず、Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆｎプライマー（配列番号２７）とＡＴＦ６Ｒｎプライマー（配列番号２８）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子を増幅させた。次に、この増幅されたＡＴＦ６遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆ１Ｌプライマー（ＡＴＧの直前にＥｃｏＲＶ ｓｉｔｅを付加、配列番号２９）とＡＴＦ６Ｒ１Ｌプライマー（終止コドンの直後にＸｈｏＩ ｓｉｔｅを付加、配列番号３０）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子をさらに増幅させ、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した（配列番号１７）。本実施例で得られたＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＮＭ＿００７３４８として既に登録された塩基配列と比較して１５個の塩基に相違が認められた。相違する１５塩基は全てゲノム配列と一致することが判明した：Ｔ１０５Ｃ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１９９Ａ（ＬｅｕからＭｅｔへのアミノ酸の変化を伴う）；Ａ２０１Ｇ（ＬｅｕからＭｅｔへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｃ２７０Ｔ（アミノ酸の変化なし）；Ａ３０９Ｇ（アミノ酸の変化なし）；Ｃ４３３Ｇ（ＰｒｏからＡｌａへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｔ４６９Ｃ（ＳｅｒからＰｒｏへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｇ１２２８Ａ（ＧｌｙからＳｅｒへのアミノ酸の変化を伴う）；Ａ１２３０Ｃ（ＧｌｙからＳｅｒへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｃ１３８９Ｔ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１４１６Ｃ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１４９１Ａ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１５３８Ｃ（ＶａｌからＡｌａへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｇ１５４０Ｃ（ＶａｌからＬｅｕへのアミノ酸の変化を伴う）；およびＧ１８９６Ａ（アミノ酸の変化なし）。また、全てのアミノ酸の変化に関してＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴではコンフリクトで記載がある。本実施例で得られたＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７および配列番号１８に記載した。
【０１１０】
ＡＴＦ６遺伝子を動物細胞発現ベクターに組込むために、上記のｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングしたＡＴＦ６遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆ２Ｌプライマー（ＡＴＧの直前にＢｇｌＩＩ ｓｉｔｅを付加、配列番号３１）とＡＴＦ６Ｒ１Ｌプライマー（配列番号３０）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子を増幅し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した（配列番号１９）。このクローニングしたＡＴＦ６遺伝子をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで消化し、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化した動物細胞発現ベクターであるｐＣＭＶ−Ｔａｇ３に組込んだ。
【０１１１】
４．ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６の発現
トランスフェクション前日に細胞数１．５×１０６／１０ｃｍ ディッシュ（Ｄｉｓｈ）としたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６の発現プラスミドをＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）にてトランスフェクションした（１０μｇ／Ｄｉｓｈ）。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのリシスバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ トライトンＸ−１００、１％ ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、コンプリートミニ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａ−ａｃｅｔａｔｅ）不含））を添加し氷上で１０分間静置した。その後、スクレーパーで細胞を集め、１．５ｍｌのチューブに入れ、氷冷下でソニケーション処理（１５秒×６回）を行い、氷中で２０分静置後、ピペッティングで懸濁し、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）により可溶性画分と不溶性画分を分離した。検討用試料として、可溶性画分を用いた。
【０１１２】
５．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の活性の検討
カゼインザイモグラフィーおよびカゼインナトリウムのプロテアーゼアッセイにより成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の活性の検討を行った。カゼインザイモグラフィーはプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に従って実施した。具体的には、成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を非還元下で２×ＳＤＳ サンプルバッファーと等量混合し、室温で１０分静置した後、４〜１６％ ザイモグラム（Ｂｌｕｅ ｃａｓｅｉｎ）ゲル（Ｚｙｍｏｇｒａｍ Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）による分離を行った。泳動終了後、２．５％ トライトンＸ−１００にてリネーチャー（ｒｅｎａｔｕｒｅ）した後、ディベロピングバッファー（Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中で３７℃、一晩カゼイン分解反応を行った。
【０１１３】
一方、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアッセイは、反応バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中で成熟型ＨｔｒＡ２あるいは成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を２００μｇ／ｍｌ、カゼインナトリウムを４００μｇ／ｍｌの濃度となるように混合し、３７℃でインキュベーションして反応させることにより行った。反応開始３時間後および一晩後に反応液の一部を採取して、２×ＳＤＳ サンプルバッファーと等量混合し煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によりカゼインナトリウムの分解の有無を検出した。
【０１１４】
上記検討の結果、成熟型ＨｔｒＡ２によるカゼインの分解が認められたが、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ではカゼインの分解が認められなかった。このことから、成熟型ＨｔｒＡ２はプロテアーゼ活性を有する活性型であるが、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）はプロテアーゼ活性を示さない不活性型であることが確認できた。
【０１１５】
＜方法＞
ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６の発現プラスミドをトランスフェクションした細胞から調製した可溶性画分に含まれる夾雑蛋白質の影響を除くために免疫沈降にて樹脂にそれぞれ捕捉したＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６を実験に用いた。ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６の各可溶性画分３００μｌを６本のチューブ（Ｎｏ．１−６）に分注し、各チューブにＢＳＡでブロッキングした５０％スラリーのプロテインＧ セファロース ４ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を２０μｌ添加し、４℃で１時間転倒混和後、遠心処理（１０，０００ｒｐｍ、１０秒間、４℃）にて上清を回収し前処理（ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）を行った。得られた上清に抗Ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１．７μｌ（２μｇ）添加し、４℃で３時間転倒混和後に、ＢＳＡでブロッキングしたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを２０μｌ添加し４℃で１晩転倒混和し、プロテインＧ セファロース ４ ＦＦにＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６をそれぞれ捕捉した。
【０１１６】
次にＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６が捕捉されたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを５００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００）で５回洗浄した後、Ｎｏ．１および２のチューブには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００を、Ｎｏ．３および４のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２溶液１００μｌを、Ｎｏ．５および６のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）溶液１００μｌをそれぞれ加えた。Ｎｏ．１、３および５のチューブは３７℃で４時間、Ｎｏ．２、４および６のチューブは一晩反応させた後、遠心処理により上清を除去して５００μｌの洗浄バッファーにて３回、遠心洗浄を行い、２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を８０μｌ加え煮沸処理した。得られた試料８０μｌのうち１０μｌを使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜へ転写し、ウエスタンブロッティングにより、ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６を検出した。検出用の１次抗体として抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ社製）を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。また、検出はＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて実施した。
【０１１７】
＜結果＞
ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６がいずれも、成熟型ＨｔｒＡ２によりインビトロで分解されることを認めた。図１−Ａに示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。また、図１−Ｂに示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＡＴＦ６を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））によるＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６の分解は認められなかった（図１−Ａおよび図１−Ｂ）。
【実施例３】
【０１１８】
（細胞内におけるプロテアーゼアッセイ）
ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６とＨｔｒＡ２の相互作用を細胞内におけるプロテアーゼアッセイにより検討した。
【０１１９】
＜材料およびその調製＞
成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）は、アポトーシスの阻害に働くＩＡＰｓ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、ＩＡＰｓと結合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアッセイの検討に影響を与える可能性が考えられる。そこで成熟型ＨｔｒＡ２または成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）とＩＡＰｓとの相互作用を阻害するために、Ｎ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させたもの（ΔＡＶＰＳ）または該４残基のうちのアラニンをグリシンに置換したもの（ＡＶＰＳ→ＧＶＰＳ）を成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）についてそれぞれ作製した。これら各種ＨｔｒＡ２はいずれもＣ末ＴａｇとしてＦＬＡＧを付加したものを用いた。
【０１２０】
１．各種ＨｔｒＡ２の調製
成熟型ＨｔｒＡ２の変異体を作製するために、成熟型ＨｔｒＡ２を鋳型とし、センスプライマーとしてＦ１およびＦ２プライマー（ＡＴＧの直前にＳａｃＩ ｓｉｔｅを付加、それぞれ配列番号３２および配列番号３３）を、アンチセンスプライマーとしてＨｔｒＡ２−ＲＳプライマー（配列番号２０）を用い、またＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてＰＣＲ法により、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各動物細胞発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各遺伝子をＳａｃＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に組込むことにより取得した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７および配列番号８に記載した。また、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９および配列番号１０に記載した。
【０１２１】
成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の変異体を作製するために、同様に、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を鋳型とし、ＰＣＲ法により、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各動物細胞発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各遺伝子をＳａｃＩとＸｈｏＩで消化し、それぞれｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に組込むことにより取得した。本実施例で用いた成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１および配列番号１２に記載した。また、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３および配列番号１４に記載した。
【０１２２】
２．各種ＨｔｒＡ２の酵素活性の検討
培養細胞で発現した各種ＨｔｒＡ２に関して、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアッセイにより、その酵素活性を測定した（実施例２参照）。その結果、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）はいずれもプロテアーゼ活性を有する活性型であること、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）はいずれもプロテアーゼ活性を有さない不活性型であることが判明した。
【０１２３】
３．ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６の動物細胞用発現ベクターの作製
実施例２と同様の方法で作製したものを用いた。
【０１２４】
＜方法＞
各種ＨｔｒＡ２発現プラスミドとＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６の発現プラスミドとは、トランスフェクション前日に細胞数５×１０５／６ｃｍ ＤｉｓｈとしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて導入した。各種ＨｔｒＡ２発現プラスミドはそれぞれ、ＣＲＥＢＬ１発現プラスミドまたはＡＴＦ６発現プラスミドと組合せて、いずれも１μｇ／Ｄｉｓｈ添加した。４８時間後、各種ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６とを共発現させた細胞に、２００μｌのリシスバッファーＢに２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を等量加え、ソニケーション後、煮沸処理したものを検討用試料とした。
【０１２５】
上記各検討用試料１０μｌを用いてウエスタンブロッティングにより、ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６の発現並びにこれら蛋白質の分解の有無を検出した。検出用の１次抗体として抗ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）抗体を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。検出は、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。
【０１２６】
＜結果＞
プロテアーゼ活性を有する活性型変異体（成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した（図２−Ａの上図）。また、該活性型変異体とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した（図２−Ｂの上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ａの上図）。また、該不活性型ＨｔｒＡ２変異体とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ｂの上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（図２−ＡおよびＢの下図）。
【０１２７】
このように、ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）により細胞内で分解されることが明らかになった。一方、ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）または不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）では分解されなかった。
【実施例４】
【０１２８】
（ＨｔｒＡ２による分解パターンの検討）
ＨｔｒＡ２によるＣＲＥＢＬ１の分解パターンを検討した。検討は、ビオチン化したＣＲＥＢＬ１を用いて、ＨｔｒＡ２によるインビトロ プロテアーゼアッセイにより行った。
【０１２９】
＜材料およびその調製＞
１．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）
成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）は、実施例２と同様の方法で調製したものを用いた。
【０１３０】
２．ＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミド
ＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミドは、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターに実施例２と同様の方法でクローニングしたＣＲＥＢＬ１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓに組込むことにより取得した。
【０１３１】
３．インビトロ翻訳反応系を用いたビオチン化ＣＲＥＢＬ１の調製
ビオチンで標識されたＣＲＥＢＬ１の調製は、ウサギ網状赤血球ライセート（ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ）を用いたインビトロ翻訳反応系（ＴＮＴ登録商標 Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で行った。
具体的にはまず、インビトロ翻訳反応溶液（ＴＮＴ登録商標 Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）４０μｌにＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミド（１μｇ／μｌ）１．５μｌ、１ｍＭ メチオニン１μｌ、ビオチン化リジンｔＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、ヌクレアーゼを含まない水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）６．５μｌを加えて全量５０μｌとし、３０℃で１．５時間反応させた。その後、反応液５０μｌから１２．５μｌを採取し、２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウエスタンブロッティングにより、ビオチンでラベルされたＣＲＥＢＬ１の発現を検出した。検出は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて行った。その結果、いずれもビオチン化されていることが確認できた。
【０１３２】
＜方法＞
上記反応液をプロテアーゼアッセイの試料として用いた。反応液は１２．５μｌずつ３本のチューブ（Ｎｏ．２−４）に分注した。Ｎｏ．２のチューブにはコントロールとして、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２５μｌ、Ｎｏ．３のチューブには２００μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２溶液を２５μｌ、Ｎｏ．４のチューブには２００μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）溶液２５μｌをそれぞれ加え混合した。各チューブ（Ｎｏ．２−４）をさらに半量ずつ分注し、１つのチューブは３７℃で４時間反応し、もう一方のチューブは、３７℃で一晩反応させた。反応後、各チューブに２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウエスタンブロッティングにより、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１の分解パターンを検出した。
【０１３３】
分解の検出は、ＣＲＥＢＬ１内部のビオチン化されたリジン残基を指標にして、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて行った。
【０１３４】
さらに分解箇所を調べる為、ウエスタンブロッティングに用いたメンブレンから、ストレプトアビジン−ＨＲＰを除去し、ＣＲＥＢＬ１のＮ末に付加されたＴａｇに対する抗体で、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１の分解パターンを検出した。抗体は、１次抗体として抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、２次抗体としてＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。分解の検出は、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて行った。
【０１３５】
＜結果＞
ＣＲＥＢＬ１内部のビオチン化されたリジン残基を指標に、成熟型ＨｔｒＡ２によるＣＲＥＢＬ１の分解パターンを検討した結果を図３に示した。また、ＣＲＥＢＬ１のＮ末に付加されたＴａｇを指標として、ＣＲＥＢＬ１の分解パターンを検討した結果を図４に示した。
【０１３６】
ビオチン化されたリジン残基を指標にした分解パターンの検討において、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの著しい減少が認められ、さらに５０ｋＤａ近辺にＣＲＥＢＬ１分解産物と考えられるバンドが検出された（図３）。しかし、抗Ｔａｇ抗体による分解パターンの検討では、図３で認められた５０ｋＤａ近辺のＣＲＥＢＬ１分解産物と考えられるバンドだけでなく、別のサイズのＣＲＥＢＬ１分解産物を示すバンドも全く検出できなかった（図４）。このことから、ＣＲＥＢＬ１はＨｔｒＡ２により数箇所で切断されて分解されたと考えられる。
【０１３７】
このように、ＣＲＥＢＬ１内部を標識化して標識物質を検出することにより、ＨｔｒＡ２によるＣＲＥＢＬ１の分解が検出された。このことから、ＣＲＥＢＬ１のＮ末に付加したＴａｇの検出により明らかになったＨｔｒＡ２によるＣＲＥＢＬ１の分解（実施例２および３）は、Ｔａｇが切断分離されたことによる見かけ上の分解ではなく、ＨｔｒＡ２がＣＲＥＢＬ１に作用してそのペプチド結合を切断した結果生じた分解であることが判明した。
【実施例５】
【０１３８】
（ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレットに記載の予測方法に従って予測した。すなわち、ＨｔｒＡ２のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＨｔｒＡ２との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＨｔｒＡ２と相互作用すると予測した。
【０１３９】
解析の結果、ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、ＨＮＦ−４αを見出した。
【実施例６】
【０１４０】
（インビトロ プロテアーゼアッセイ）
ＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２の相互作用を実験的に検証するために、インビトロにおけるプロテアーゼアッセイを実施した。
【０１４１】
＜材料およびその調製＞
本実施例においては、活性型ＨｔｒＡ２および不活性型ＨｔｒＡ２としてそれぞれ、いずれもＣ末Ｔａｇとしてヒスチジン（Ｈｉｓ）を付加した成熟型ＨｔｒＡ２（配列番号４）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）（配列番号６）を用いた。また、ＨＮＦ−４αとして、Ｎ末に（６×Ｈｉｓ）−Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇを付加したＨＮＦ−４α（配列番号３５）を用いた。
【０１４２】
１．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）
成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）は、実施例２と同様の方法で調製したものを用いた。
【０１４３】
２．ＨＮＦ−４α発現プラスミドの作製
ＨＮＦ−４αについては、まずＨｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりＨＮＦ−４α遺伝子を増幅させた。ＰＣＲエラーと思われる塩基置換は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により修正した。その後、Ｎ末に（６×Ｈｉｓ）−Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇを付加させる動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込み、ＨＮＦ−４α発現プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ）を構築した。なお、クローニングしたＨＮＦ−４α ＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、スイスプロットデータベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅ）のアクセッションナンバーＰ４１２３５（登録遺伝子名はＨＮＦ４Ａ）に開示されたＨＮＦ−４αのアミノ酸配列と同一であった。本実施例で得られたＨＮＦ−４α ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３４および配列番号３５に記載した。
【０１４４】
上記ＨＮＦ−４α発現プラスミドを用いて、ＥｃｏＲＩサイトで、ＨＮＦ−４αのＤＮＡ配列をＮ末にＦＬＡＧ−ｔａｇを付加させる動物細胞用発現プラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組換えを行い、ＨＮＦ−４α発現プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２）を構築した。
【０１４５】
３．ＨＮＦ−４αの調製
トランスフェクション前日に細胞数１．５×１０６／１０ｃｍ ディッシュ（Ｄｉｓｈ）としたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＨＮＦ−４α発現プラスミドをＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）にて導入した（１０μｇ／Ｄｉｓｈ）。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのリシスバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ トライトンＸ−１００、１％ ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、コンプリートミニ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ不含）を添加し氷上で１０分間静置した。その後、スクレーパーで細胞を集め、１．５ｍｌのチューブに入れ、氷冷下でソニケーション処理（１５秒×６回）を行い、氷中で２０分静置後、ピペッティングで懸濁し、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）により可溶性画分と不溶性画分を分離した。検討用試料として、可溶性画分（以下、ＨＮＦ−４α可溶性画分と称する）を用いた。
【０１４６】
＜方法＞
ＨＮＦ−４α可溶性画分に含まれる夾雑蛋白質の影響を除くために免疫沈降にて樹脂に捕捉したＨＮＦ−４αを実験に用いた。具体的には、まず、ＨＮＦ−４α可溶性画分３００μｌを６本のチューブ（Ｎｏ．１−６）に分注し、各チューブにＢＳＡでブロッキングした５０％スラリーのプロテインＧ セファロース ４ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を２０μｌ添加し、４℃で１時間転倒混和後、遠心処理（１０，０００ｒｐｍ、１０秒間、４℃）にて上清を回収し前処理（ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）を行った。得られた上清に抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を０．４μｌ（２μｇ）添加し、４℃で３時間転倒混和後に、ＢＳＡでブロッキングしたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを２０μｌ添加し４℃で１晩転倒混和し、プロテインＧ セファロース ４ ＦＦにＨＮＦ−４αを捕捉した。
【０１４７】
次にＨＮＦ−４αが捕捉されたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを５００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００）で５回洗浄した後、Ｎｏ．１および２のチューブには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００を、Ｎｏ．３および４のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２溶液１００μｌを、Ｎｏ．５および６のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）溶液１００μｌをそれぞれ加えた。Ｎｏ．１、３および５のチューブは３７℃で４時間、Ｎｏ．２、４および６のチューブは一晩反応させた後、遠心処理により上清を除去して５００μｌの洗浄バッファーにて３回、遠心洗浄を行い、２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を８０μｌ加え煮沸処理した。得られた試料８０μｌのうち１０μｌを使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜へ転写し、ウエスタンブロッティングにより、ＨＮＦ−４αを検出した。検出用の１次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。また、検出はＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて実施した。
【０１４８】
＜結果＞
ＨＮＦ−４αが成熟型ＨｔｒＡ２によりインビトロで分解されることを認めた。図５に示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＨＮＦ−４αを１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＨＮＦ−４αを示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））によるＨＮＦ−４αの分解は認められなかった（図５）。
【実施例７】
【０１４９】
（細胞内におけるプロテアーゼアッセイ）
ＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２の相互作用を細胞内におけるプロテアーゼアッセイにより検討した。
【０１５０】
＜材料およびその調製＞
ＨＮＦ−４α発現用プラスミドとして、実施例６で作製したＨＮＦ−４α動物細胞発現用プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２）を用いた。また、ＨｔｒＡ２発現用プラスミドとして、実施例３で作製した成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）発現用プラスミド、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）発現用プラスミド、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）発現用プラスミドおよび成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）発現用プラスミドを用いた。
【０１５１】
＜方法＞
各種ＨｔｒＡ２発現プラスミドとＨＮＦ−４α発現プラスミドは、トランスフェクション前日に細胞数５×１０５／６ｃｍ ＤｉｓｈとしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて導入した。各種ＨｔｒＡ２発現プラスミドはそれぞれ、ＨＮＦ−４α発現プラスミドと組合せて、いずれも１μｇ／Ｄｉｓｈ添加した。４８時間後、各種ＨｔｒＡ２とＨＮＦ−４αとを共発現させた細胞に、２００μｌのリシスバッファーＢと２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を等量加え、ソニケーション後、煮沸処理したものを検討用試料とした。
【０１５２】
上記各検討用試料１０μｌを用いてウエスタンブロッティングにより、ＨＮＦ−４αの発現並びにＨＮＦ−４αの分解の有無を検出した。検出用の１次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。検出は、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。
【０１５３】
＜結果＞
プロテアーゼ活性を有する活性型変異体（成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））とＨＮＦ−４αとを共発現させた細胞を用いた解析では、ＨＮＦ−４αを示すバンドが著しく減少した（図６）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＨＮＦ−４αとを共発現させた細胞を用いた解析では、ＨＮＦ−４αを示すバンドの減少は認められなかった（図６）。
【０１５４】
このように、ＨＮＦ−４αは活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）により細胞内で分解されることが明らかになった。一方、ＨＮＦ−４αは不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）または不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）では分解されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解に基づく糖尿病の防止および／または治療、並びにＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解に基づく細胞死（例えば膵臓β細胞の細胞死）の阻害のために利用可能であり、医薬分野において非常に有用性が高い。
【配列表フリーテキスト】
【０１５６】
配列番号１：ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質をコードするＤＮＡ。
配列番号２：ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質。
配列番号３：成熟型ＨｔｒＡ２をコードするＤＮＡ。
配列番号４：成熟型ＨｔｒＡ。
配列番号５：配列番号３と同じ塩基配列であってその５２０位の塩基がｇである塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）をコードするＤＮＡ。
配列番号６：配列番号４と同じアミノ酸配列であって１７４番目のアミノ酸残基がＡｌａに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）。
配列番号７：配列番号３と同じ塩基配列であってその４−１５位の塩基を欠失させた塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号８：配列番号４と同じアミノ酸配列であって２−５番目のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）。
配列番号９：配列番号３に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその５位の塩基がｇであるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１０：配列番号４と同じアミノ酸配列であって２番目のアミノ酸残基がＧｌｙに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）。
配列番号１１：配列番号５と同じ塩基配列であってその４−１５位の塩基を欠失させた塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１２：配列番号６と同じアミノ酸配列であって２−５番目のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）。
配列番号１３：配列番号５に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその５位の塩基がｇであるポリヌクレオチド成熟型；ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１４：配列番号６と同じアミノ酸配列であって２番目のアミノ酸残基がＧｌｙに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）。
配列番号１５：ＣＲＥＢＬ１をコードするＤＮＡ。
配列番号１６：ＣＲＥＢＬ１。
配列番号１７：ＡＴＦ６をコードするＤＮＡ。
配列番号１８：ＡＴＦ６。
配列番号１９：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２０：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２１：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２２：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２３：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２４：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２５：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２６：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２７：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２８：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２９：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３０：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３１：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３２：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３３：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３４：ＨＮＦ−４αをコードするＤＮＡ。
配列番号３５：ＨＮＦ−４α。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＲＥＢＬ１（サイクリックＡＭＰ レスポンシブ エレメント バインディング プロテイン ライク １、ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ １）、ＡＴＦ６（アクティベーティング トランスクリプション ファクター ６、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ６）およびＨＮＦ−４α（ヘパトサイト ヌクレアー ファクター ４α、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４α）のうちの少なくとも１の分解阻害方法、並びにＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２（ハイ テンパレイチャー リクワイアメント プロテイン Ａ２、ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２）による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。より具体的には、ＨｔｒＡ２の機能を阻害すること（例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害すること、またはＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害すること）を特徴とするＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法に関する。また、前記分解方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。さらに、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法、並びに該化合物を１つ以上含んでなる糖尿病の防止剤および／または治療剤に関する。また、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解を阻害する化合物の同定方法に関する。さらに、糖尿病の防止剤および／または治療剤の有効成分である化合物の同定方法に関する。また、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害方法に関する。さらに、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする細胞死阻害方法、並びに該化合物を１つ以上含んでなる細胞死阻害剤に関する。また、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする２型糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。さらに、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる２型糖尿病の防止剤および／または治療剤に関する。また、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４α、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチド、およびＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、細胞の生存とアポトーシス（細胞死）を調節することにより外界のストレスから身を守るが、生存とアポトーシス制御機構の調節の乱れによる過剰な細胞死は、種々の疾患を招く可能性がある（非特許文献１）。
【０００３】
近年、ストレスを感知し調節する場としてミトコンドリアや小胞体の研究が進み、ミトコンドリア膜に局在するＨｔｒＡ２蛋白質（以下、ＨｔｒＡ２と称する）は、ＵＶや熱ショック等のストレスによりミトコンドリア膜から細胞質へ移行し（非特許文献２−５）、カスパーゼ依存的な細胞死とカスパーゼ非依存的な細胞死の二つの細胞死を誘導することが報告された（非特許文献６）。ＨｔｒＡ２は、前駆体蛋白質（配列番号２）からＮ末１３３アミノ酸が切り離された成熟型（配列番号４）になり、ミトコンドリアから細胞質に移行する。成熟型ＨｔｒＡ２はプロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有するＨｔｒＡ２を活性型ＨｔｒＡ２と称することもある。
【０００４】
カスパーゼ非依存的な細胞死は、ＨｔｒＡ２自身のセリンプロテアーゼとしての性質に依存し、その前駆体蛋白質のアミノ酸配列中３０６番目（成熟型においては１７４番目に相当する）のセリンをアラニンに置換したＨｔｒＡ２変異体によりカスパーゼ非依存的な細胞死は引き起こされないことが知られている（非特許文献３−５）。かかるＨｔｒＡ２変異体はプロテアーゼ活性を有さない。以下、プロテアーゼ活性を有さないＨｔｒＡ２を不活性型ＨｔｒＡ２と称することもある。このようにＨｔｒＡ２は、カスパーゼ非依存的な細胞死を誘導する機構において重要な役割を担う因子である。
【０００５】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【非特許文献１】「細胞工学」、２００２年、第２１巻、第４号、ｐ．３６０−３９４。
【非特許文献２】ヤマグチ（Ｈ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）ら、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００３年、第６３巻、ｐ．１４８３−１４８９。
【非特許文献３】スズキ（Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ）ら、「モレキュラー セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ）」、２００１年、第８巻、ｐ．６１３−６２１。
【非特許文献４】ヘッジ（Ｒ．Ｈｅｇｄｅ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４３２−４３８。
【非特許文献５】マーチンズ（Ｌ．Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｓ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４３９−４４４。
【非特許文献６】「実験医学」、２００２年、第２０巻、第１号、ｐ．７３−７５。
【非特許文献７】「内科」、２００３年、第９１巻、第１号、ｐ．６３−６７。
【非特許文献８】カウフマン（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ）ら、「ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００２年、第１１０巻、ｐ．１３８９−１３９８。
【非特許文献９】ハゼ（Ｋ．Ｈａｚｅ）ら、「ザ バイオケミカル ジャーナル（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）、２００１年、第３５５巻、ｐ．１９−２８。
【非特許文献１０】「ジャーナル オブ モレキュラー エンドクリノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第２７巻、第１号ｐ．１１−２９。
【非特許文献１１】「臨床病理」、２００１年、第４９巻、第２号、ｐ．１６１−１６４。
【非特許文献１２】ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１。
【非特許文献１３】「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年。
【非特許文献１４】「ペプチド シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９６年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
近年、小胞体ストレスにより膵臓のβ細胞が細胞死を起こし、糖尿病を発症することが報告されている。膵臓β細胞はインスリンの産生分泌を行う細胞で、小胞体が非常に発達しており、小胞体ストレスに感受性が高い。すなわち、小胞体ストレス応答における防御機構の破綻が引き起こす細胞死によりβ細胞が脱落し、その結果インスリン分泌不全により糖尿病が亢進すると考えられている（非特許文献７）。一方、小胞体ストレスによりＨｔｒＡ２の発現が亢進することが報告されている。これらから、ＨｔｒＡ２が、糖尿病の新たな標的となる可能性が高く、また小胞体ストレスによる細胞死を阻害することは、新規な創薬標的になると考えられる。
【０００７】
本発明の課題は、ＨｔｒＡ２によるカスパーゼ非依存的な細胞死の機構およびＨｔｒＡ２の基質が未だ明らかになっていない状況において、ＨｔｒＡ２と相互作用する蛋白質を見出し、ＨｔｒＡ２による該蛋白質の分解に基づく疾患の防止および／または治療を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、ＨｔｒＡ２がＣＲＥＢＬ１およびＨＮＦ−４αと相互作用することをインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で予測し、さらに活性型ＨｔｒＡ２によりＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αが分解されることを実験的に証明して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、ＨｔｒＡ２の機能を阻害することを特徴とするＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法に関する。
【００１０】
また本発明は、ＨｔｒＡ２の機能を阻害することがＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することであり、ここでＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＣＲＥＢＬ１の分解が阻害され、ＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＡＴＦ６の分解が阻害され、および、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＨＮＦ−４αの分解が阻害される前記ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法に関する。
【００１１】
さらに本発明は、ＨｔｒＡ２の機能を阻害することがＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することであり、ここでＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＣＲＥＢＬ１の分解が阻害され、ＡＴＦ６とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＡＴＦ６の分解が阻害され、および、ＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＨＮＦ−４αの分解が阻害される前記ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法に関する。
【００１２】
さらにまた本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
【００１３】
また本発明は、前記ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
【００１４】
さらに本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
【００１５】
さらにまた本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる糖尿病の防止剤および／または治療剤に関する。
【００１６】
また本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２をある化合物（被検化合物）と接触させ、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１を検出し得るシグナルおよび／マーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／マーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、被検化合物がＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
【００１７】
さらに本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２をある化合物（被検化合物）と接触させ、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、あるいはＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、被検化合物がＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
【００１８】
さらにまた本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法が、糖尿病の防止剤および／または治療剤の有効成分である化合物の同定方法である、前記同定方法に関する。
【００１９】
また本発明は、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害方法に関する。
【００２０】
さらに本発明は、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする細胞死阻害方法に関する。
【００２１】
さらにまた本発明は、細胞死が膵臓β細胞の細胞死である前記細胞死阻害方法に関する。
【００２２】
また本発明は、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる細胞死阻害剤に関する。
【００２３】
さらに本発明は、細胞死が膵臓β細胞の細胞死である前記細胞死阻害剤に関する。
【００２４】
さらにまた本発明は、前記細胞死阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
【００２５】
また本発明は、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする２型糖尿病の防止方法および／または治療方法に関する。
【００２６】
さらに本発明は、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる２型糖尿病の防止剤および／または治療剤に関する。
【００２７】
さらにまた本発明は、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４α、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチド、およびＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、これら蛋白質のうちの少なくとも１の減少または消失を阻害することができ、その結果、糖尿病の防止および／または治療が可能になる。
【００２９】
ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導し、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献８および９）。また、小胞体ストレスにより膵臓のβ細胞が細胞死を起こし、糖尿病を亢進することが報告されている（非特許文献７）。これらから、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６がＨｔｒＡ２により分解されて減少または消失することにより、ストレス等による細胞死、例えば膵臓β細胞の細胞死が亢進し、その結果、糖尿病が亢進すると考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害してこれら蛋白質の減少または消失を阻害することにより細胞死（例えば膵臓のβ細胞の細胞死）を阻害でき、その結果、糖尿病の防止および／または治療が可能になる。
【００３０】
ＨＮＦ−４αは、その機能欠損が糖代謝の異常を招くこと、および遺伝子２型糖尿病ＭＯＤＹ１の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献１０および１１）。これらから、ＨＮＦ−４αの減少または消失によっても糖代謝の異常が生じ、糖尿病（例えば２型糖尿病）が亢進すると考えられる。すなわち、ＨＮＦ−４αがＨｔｒＡ２により分解されて減少または消失することにより、糖代謝の異常が生じ、その結果、糖尿病（例えば２型糖尿病）が亢進すると考える。したがって、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害してＨＮＦ−４αの減少または消失を阻害することにより糖代謝を正常化することができ、糖尿病（例えば２型糖尿病）の防止および／または治療が可能になる。
【００３１】
ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解の阻害とＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解の阻害とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解とＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解とをいずれも阻害することにより、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および／または治療が達成できるため、高い効果が得られると考える。
【００３２】
また本発明により、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法を実施できる。本同定方法で得られた化合物は、糖尿病の防止および／または治療に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１−Ａ】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＣＲＥＢＬ１がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められなかった。（実施例２）
【００３４】
【図１−Ｂ】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＡＴＦ６がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＡＴＦ６を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した。一方不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＡＴＦ６の分解が認められなかった。（実施例２）
【００３５】
【図２−Ａ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＣＲＥＢＬ１が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００３６】
【図２−Ｂ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＡＴＦ６が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００３７】
【図３】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を用いて、ビオチンを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によるＣＲＥＢＬ１の分解が検出されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少し、５０ｋＤａ近辺にＣＲＥＢＬ１分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められず、上記５０ｋＤａ近辺のバンドも検出されなかった。（実施例４）
【００３８】
【図４】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を用いて、Ｎ末に付加されたＴａｇを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＣＲＥＢＬ１が分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、Ｎ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。図３で検出された５０ｋＤａ近辺のＣＲＥＢＬ１分解産物を示すと考えられるバンドは、抗Ｔａｇ抗体では検出されなかった。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解は認められなかった。（実施例４）
【図５】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＣＲＥＢＬ１がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められなかった。（実施例６）
【図６】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＣＲＥＢＬ１が細胞内で分解されたことを説明する図である。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの減少は認められなかった。（実施例７）
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００３−３４２５８７号からの優先権を主張するものである。
【００４０】
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「ポリペプチド」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
【００４１】
本発明においては、ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１およびＨＮＦ−４αとが相互作用することを、国際公開ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット記載の方法に従ってインシリコで予測した。さらに実験的に、ＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリー蛋白質であるＡＴＦ６、およびＨＮＦ−４αが活性型ＨｔｒＡ２により分解されることを初めて明らかにした。
【００４２】
ＣＲＥＢＬ１はＡＴＦ６ファミリーの１つであり、ＡＴＦ６βとも称される。ＣＲＥＢＬ１は小胞体に局在し、小胞体ストレスによりＳ１Ｐ、Ｓ２Ｐによりプロセッシングを受けて一部が核移行し、転写因子として働くことが知られている。ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導し、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献８および９）。また、小胞体ストレスにより膵臓のβ細胞が細胞死を起こし、糖尿病を亢進することが報告されている（非特許文献７）。これらから、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６がＨｔｒＡ２により分解されて減少または消失することにより、ストレス等による細胞死、例えば膵臓β細胞の細胞死が亢進し、その結果、糖尿病が亢進すると考える。
【００４３】
したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、これら蛋白質のうちの少なくとも１の減少または消失を阻害でき、その結果、ストレス等による細胞死、例えば膵臓β細胞の細胞死を阻害できる。さらには、糖尿病の防止および／または治療を実施できる。
【００４４】
ＨＮＦ−４αは、その機能欠損が糖代謝の異常を招くこと、および遺伝子２型糖尿病ＭＯＤＹ１の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献１０および１１）。これらから、ＨＮＦ−４αの減少または消失によっても糖代謝の異常が生じ、糖尿病（例えば２型糖尿病）が亢進すると考えられる。すなわち、ＨＮＦ−４αがＨｔｒＡ２により分解されて減少または消失することにより、糖代謝の異常が生じ、その結果、糖尿病（例えば２型糖尿病）が亢進すると考える。
【００４５】
したがって、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、ＨＮＦ−４αの減少または消失を阻害でき、その結果、糖代謝を正常化することができる。さらには、糖尿病、例えば２型糖尿病の防止および／または治療を実施できる。
【００４６】
このように、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害し、これら蛋白質のうちの少なくとも１の減少または消失を阻害することにより、糖尿病の防止および／または治療を実施できる。これら蛋白質のうちのいずれか１の分解を阻害することにより得られる糖尿病の防止および／または治療の効果と比較して、これら蛋白質のうちの２つまたは３つのＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、より高い効果が得られると考える。
【００４７】
ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解の阻害とＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解の阻害とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解の阻害は、膵臓β細胞の細胞死の阻害を介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。他方、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解の阻害は、糖代謝の正常化を介して糖尿病（例えば２型糖尿病）の防止および／または治療に効果を示すと考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解とＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解とをいずれも阻害することにより、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および／または治療が達成できるため、高い効果が得られると考える。
【００４８】
これら知見に基づいて本発明においては、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害方法を提供する。さらに、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解に基づく疾患、例えば糖尿病の防止方法および／または治療方法を提供する。
【００４９】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法はＨｔｒＡ２の機能を阻害することにより実施できる。
【００５０】
ＨｔｒＡ２の機能として、例えば、そのプロテアーゼ活性によるＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の切断が挙げられる。プロテアーゼによる蛋白質分解においては一般的に、プロテアーゼが蛋白質に作用して蛋白質のペプチド結合を１箇所または２箇所以上で切断することにより蛋白質分解が行われる。実際に、ＨｔｒＡ２はＣＲＥＢＬ１のペプチド結合を数箇所で切断することによりＣＲＥＢＬ１を分解した（実施例４）。同様に、ＨｔｒＡ２は、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのペプチド結合を１箇所または２箇所以上で切断することによりこれら蛋白質を分解すると考える。
【００５１】
したがって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することにより、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法を実施できる。本分解阻害方法においては、ＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＣＲＥＢＬ１の分解が阻害され、ＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＡＴＦ６の分解が阻害され、および、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＨＮＦ−４αの分解が阻害される。
【００５２】
ＨｔｒＡ２の機能としてまた、例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１との相互作用が挙げられる。本明細書中で「ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２が相互作用する」とは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２がある様式により互いに作用を及ぼし、その結果、具体的にはＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１がＨｔｒＡ２により分解されることを意味する。前記「ある様式」とは、結合、接触あるいは近接等を含むものであり、結果として互いに作用を及ぼし得る様式であればいずれのものであってもよい。
【００５３】
したがって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とのＨｔｒＡ２との相互作用を阻害することにより、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法を実施できる。
【００５４】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法は、好ましくは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを少なくとも含む生体外試料において、ＨｔｒＡ２の機能を阻害することにより実施できる。
【００５５】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法は具体的には、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害する化合物を用いて実施できる。このような化合物として、ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を阻害する化合物が挙げられる。好ましくは、ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を特異的に阻害する化合物が挙げられる。ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を特異的に阻害する化合物とは、ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を強く阻害するが、他の酵素の活性は阻害しないか、弱く阻害する化合物を意味する。ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を阻害する化合物は、例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αを基質として用いてＨｔｒＡ２による当該基質の分解を検出する系にある化合物（以下、被検化合物と称する）を添加し、被検化合物が当該基質の分解を阻害するか否かを判定することにより同定し取得できる。ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を特異的に阻害する化合物は、他の酵素活性に対する阻害効果と比較して、ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性を強く阻害するものを、上記のように同定された化合物から選択することにより取得できる。また、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害する化合物として、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２の各アミノ酸配列において、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２とが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。特に、ＨｔｒＡ２の基質となるＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４α由来のかかるポリペプチドは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２との相互作用を競合的に阻害し、ＨｔｒＡ２によるこれら各蛋白質の切断を阻害できる。このようなポリペプチドであって、さらにＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２との相互作用を特異的に阻害するポリペプチドがより好ましく本分解阻害方法に用いられる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を特異的に阻害するポリペプチドとは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を強く阻害するが、他の蛋白質間相互作用は阻害しないか、弱く阻害するポリペプチドを意味する。また、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害する化合物として、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２により分解される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、かかるポリペプチドとして好適である。このようなポリペプチドであって、さらにＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を特異的に阻害するポリペプチドがより好ましく本分解阻害方法に用いられる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を特異的に阻害するポリペプチドとは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を強く阻害するが、ＨｔｒＡ２による他の蛋白質の分解は阻害しないか、弱く阻害するポリペプチドを意味する。
【００５６】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法はまた、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を阻害する化合物を用いて実施できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を阻害する化合物であって、さらに該相互作用を特異的に阻害する化合物がより好ましく本分解阻害方法に用いられる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を特異的に阻害する化合物とは、該相互作用を強く阻害するが、他の蛋白質間相互作用は阻害しないか、弱く阻害する化合物を意味する。このような化合物として、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２の各アミノ酸配列において、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２とが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。特に、ＨｔｒＡ２の基質となるＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４α由来のかかるポリペプチドは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２との相互作用を競合的に阻害し、ひいてはＨｔｒＡ２によるこれら各蛋白質の分解を阻害できる。
【００５７】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法に用い得るポリペプチドは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害するものを選択することにより取得できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのアミノ酸配列において、ＨｔｒＡ２と相互作用する部位またはＨｔｒＡ２により分解される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、かかるポリペプチドとして好適である。このように特定されたポリペプチドに、１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、人工的に変異を導入したものであってもよい。このような変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術（非特許文献１２）を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変できる。
【００５８】
上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、成書（非特許文献１３および１４）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等が挙げられる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて上記ポリペプチドを製造できる。あるいは遺伝子工学的手法により上記ポリペプチドを取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換え発現ベクターを作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造できる。
【００５９】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２を認識する抗体であって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する抗体を用いることによっても実施できる。かかる抗体は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２自体、あるいはＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２とが相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチド等を抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。
【００６０】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害する化合物は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を指標にして、医薬品スクリーニングにおいてよく知られている同定方法を用いて取得できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりこれら蛋白質の分解が阻害されることから、これら蛋白質の切断を阻害する化合物はこれら蛋白質の分解を阻害すると考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害する化合物の同定方法により、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物も取得できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断および分解を阻害する化合物の同定方法は、例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断および分解を可能にする条件を選択し、当該条件下でＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２とを調べようとする化合物（以下、被検化合物と称する）と接触させ、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の切断および分解を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断および分解を阻害する化合物を同定できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断および分解を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を用いて、上記化合物の同定方法を実施できる。細胞における共発現は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的方法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αまたはＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、単独で、または組合せて細胞のトランスフェクションに使用できる。細胞は、真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは動物培養細胞株、さらに好ましくは哺乳動物培養細胞株を使用できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２と被検化合物との接触は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断および分解の反応以前に行なってもよいし、該切断および分解の反応に共存させることにより行なってもよい。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを指す。ここでマーカーとは、それ自体は物理的または化学的性質により検出され得ないが、化学的反応を経ることにより前記シグナルを生成させるものであって、該生成されるシグナルの物理的、化学的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルおよび／またはマーカーとして、レポーター遺伝子（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等）、放射性同位体、タグペプチド類（Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等）、ＧＳＴ等の酵素類、ビオチン、および蛍光蛋白質等、公知のものが利用できるが、これら例示に限らず、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であれば、いずれも利用できる。これらシグナルおよび／またはマーカーの検出方法は当業者には周知である。簡便には、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の切断および分解は、これら蛋白質量またはこれら蛋白質の分解物量の存在若しくは不存在および／または変化の検出により測定できる。これら蛋白質量またはこれら蛋白質の分解物量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッティング等を用いて実施できる。
【００６１】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との相互作用を阻害する化合物は、上記同定方法により取得できる。
【００６２】
ＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも公知蛋白質であり、ジェンバンク（Ｇｅｎ Ｂａｎｋ）にそれぞれアクセッションナンバーＮＭ＿０１３２４７、ＮＭ＿００４３８およびＮＭ＿００７３４８として開示されている。また、ＨＮＦ−４αも公知蛋白質であり、スイスプロットデータベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅ）にアクセッションナンバーＰ４１２３５（登録遺伝子名はＨＮＦ４Ａ）として開示されている。
【００６３】
本実施例において用いたＨｔｒＡ２のアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＨｔｒＡ２ ＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、成熟型ＨｔｒＡ２である。成熟型ＨｔｒＡ２とは、ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質（配列番号２）からＮ末１３３アミノ酸残基が切り離されて生じた成熟型蛋白質であり、プロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有するＨｔｒＡ２を活性型ＨｔｒＡ２と呼称することがある。また、活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた蛋白質（配列番号８、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）と称することがある）または成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した蛋白質（配列番号１０、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）と称することがある）を用いることができる。このような変異を導入したＨｔｒＡ２は、そのプロテアーゼ活性には変化がないため、活性型ＨｔｒＡ２として用いることができる。一方、プロテアーゼ活性を有さないＨｔｒＡ２を不活性型ＨｔｒＡ２と呼称することがある。不活性型ＨｔｒＡ２として、ＨｔｒＡ２のアミノ酸配列においてＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性に必要な部位のアミノ酸残基に変異を有し、該変異の結果プロテアーゼ活性を示さないＨｔｒＡ２変異体が例示できる。ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性に必要な部位として、プロテアーゼ活性ドメイン、より好ましくは成熟型ＨｔｒＡ２（配列番号４）の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリン残基が挙げられる。不活性型ＨｔｒＡ２として、より具体的には、成熟型ＨｔｒＡ２の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリン残基がアラニンに置換したＨｔｒＡ２変異体（配列番号６、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）と呼称する）が例示できる。また、不活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた蛋白質（配列番号１２、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）と称することがある）または成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した蛋白質（配列番号１４、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）と称することがある）を用いることができる。
【００６４】
本実施例において用いたＣＲＥＢＬ１のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。また、配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードするＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列を配列番号１５に示す。配列番号１５に記載の塩基配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿００４３８に開示されたＣＲＥＢＬ１の塩基配列と比較して塩基の１つに相違が認められた（実施例２参照）。
【００６５】
本実施例において用いたＡＴＦ６のアミノ酸配列を配列番号１８に示す。また、配列番号１８に記載のアミノ酸配列をコードするＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列を配列番号１７に示す。配列番号１７に記載の塩基配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿００７３４８に開示されたＡＴＦ６の塩基配列と比較して１５個の塩基に相違が認められた（実施例２参照）。
【００６６】
本実施例において用いたＨＮＦ−４αのアミノ酸配列を配列番号３５に示す。また、配列番号３５に記載のアミノ酸配列をコードするＨＮＦ−４α ＤＮＡの塩基配列を配列番号３４に示す。配列番号３５に記載のアミノ酸配列は、スイスプロットデータベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅ）のアクセッションナンバーＰ４１２３５（登録遺伝子名はＨＮＦ４Ａ）に開示されたＨＮＦ−４αのアミノ酸配列と同一であった（実施例６参照）。
【００６７】
本発明においてＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４α並びにこれら各蛋白質をコードする各遺伝子は、上記例示したアミノ酸配列または塩基配列で表される蛋白質または遺伝子に限定されず、一般的に報告されているＨｔｒＡ２、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１をいずれも含む。
【００６８】
本発明において使用するＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのいずれか１つ以上を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。ＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２との相互作用、およびこれら蛋白質の機能、例えばＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性やＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αの酵素基質としての性質等に影響がなければ、Ｎ末側やＣ末側に別の蛋白質やポリペプチドを、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加したものであってもよい。付加する別の蛋白質やポリペプチドとして、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、ｔａｇペプチド類（Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等）を例示できる。
【００６９】
ＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製できる。ＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、当該ポリヌクレオチドを適当な発現ベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。
【００７０】
被検化合物として、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、あるいはＨｔｒＡ２、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αの一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。その他、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のアミノ酸配列において、ＨｔｒＡ２と相互作用する部位またはＨｔｒＡ２により切断される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。
【００７１】
本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを用いたインビトロにおけるプロテアーゼアッセイ（実施例２および６）に被検化合物を添加することにより実施できる。活性型である成熟型ＨｔｒＡ２は、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得した成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした大腸菌から調製できる。ＣＲＥＢＬ１は、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＡＴＦ６は、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＡＴＦ６ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＨＮＦ−４αは、ヒト脳ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＨＮＦ−４α ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４αおよびＨｔｒＡ２は、これら蛋白質をそれぞれ発現させた各細胞の細胞溶解液の可溶性画分に含まれる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αは、好ましくは、それらのＮ末またはＣ末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させ、該タグペプチドに対する抗体で免疫沈降することにより精製して用いることが適当である。例えば、タグペプチドに対する抗体で免疫沈降した後、樹脂（プロテインＧ セファロース等）等に補足したものを使用できる。インビトロにおけるプロテアーゼアッセイは、樹脂等に補足したＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αに、成熟型ＨｔｒＡ２を添加して３７℃で一晩反応させた後、これら蛋白質をウエスタンブロッティングで検出することにより実施できる。ＡＴＦ６については、３７℃で４時間反応させることにより成熟型ＨｔｒＡ２により分解されるため、プロテアーゼアッセイにおける反応時間を４時間にすることもできる。ウエスタンブロッティングによる検出は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αに付加させたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αはＨｔｒＡ２により分解されるため、ウエスタンブロッティングにより検出されるこれら蛋白質の量は、ＨｔｒＡ２を添加しないときと比較して減少または消失する。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αと成熟型ＨｔｒＡ２との反応に被検化合物を添加し、被検化合物を添加しないときと比較してＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αの量の低減または消失が阻害される場合、該被検化合物はＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害すると判定できる。被検化合物は予めＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αと、あるいは成熟型ＨｔｒＡ２と接触させ、その後、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αと成熟型ＨｔｒＡ２を反応させることもできる。
【００７２】
また、本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を用いた細胞内プロテアーゼアッセイ（実施例３および７）に被検化合物を添加することにより実施できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との細胞での共発現は、上記のように作製したＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡ、ＡＴＦ６ ＤＮＡおよびＨＮＦ−４α ＤＮＡのそれぞれを含む適当なベクターとＨｔｒＡ２ ＤＮＡを含む適当なベクターとを、自体公知の遺伝子工学的手法で動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）にトランスフェクションすることにより実施できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αは、これら蛋白質のＮ末またはＣ末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させることが、これら蛋白質の検出を容易にするため、好ましい。ＨｔｒＡ２は、活性型ＨｔｒＡ２を用いる。活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２、好ましくはＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）またはＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）を用いることが適当である。成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）は、アポトーシスの阻害に働くＩＡＰｓ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、ＩＡＰｓと結合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアッセイの検討に影響を与える可能性が考えられるため、ＩＡＰｓと結合しない成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）を使用することが好ましい。細胞内プロテアーゼアッセイは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を被検化合物と共に３７℃で４８時間培養後、該細胞を溶解し、その溶解液中に含まれるＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをウエスタンブロッティングで検出することにより実施できる。ウエスタンブロッティングによる検出は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αに付加させたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αはＨｔｒＡ２により分解されるため、ウエスタンブロッティングにより検出されるこれら蛋白質の量は、ＨｔｒＡ２を添加しないときと比較して減少または消失する。被検化合物を添加した場合のＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αの量の低減または消失が、被検化合物を添加しないときと比較して阻害される場合、該被検化合物はＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害すると判定できる。
【００７３】
本発明に係る化合物の同定方法は、上記インビトロにおけるプロテアーゼアッセイや細胞内プロテアーゼアッセイを用いた具体的例示に限定されず、一般的に用いられている医薬品スクリーニングにおいてよく知られている同定方法を用いて実施できる。
【００７４】
本発明に係る化合物の同定方法で得られた化合物は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害剤として利用できる。当該化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製できる。医薬組成物の調製において、これら化合物は、単独で使用することもできるし、組合せて使用することもできる。
【００７５】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、糖尿病の防止剤および／または治療剤の有効成分として使用できる。すなわち、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いて、糖尿病の防止剤および／または治療剤を調製できる。このような化合物は上記化合物の同定方法により取得できる。ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、過剰な小胞体ストレス等により引き起こされる細胞死（例えば膵臓のβ細胞の細胞死）を阻害でき、その結果、糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。また、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、糖代謝を正常化することができ、糖尿病（例えば２型糖尿病）の防止および／または治療に効果を示すと考える。このように、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物と、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物と、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物とを組合せて含む糖尿病の防止剤および／または治療剤は、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すため、これら化合物のいずれかを含む糖尿病の防止剤および／または治療剤と比較してより効果が高く、より好ましい。
【００７６】
本発明に係る糖尿病の防止方法および／または治療方法は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより実施できる。ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、過剰な小胞体ストレス等により引き起こされる細胞死（例えば膵臓のβ細胞の細胞死）を阻害でき、その結果、糖尿病の防止および／または治療の効果が得られると考える。また、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより糖代謝を正常化することができ、糖尿病（例えば２型糖尿病）の防止および／または治療の効果が得られると考える。このように、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解の阻害と、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解の阻害とは、異なったメカニズムを介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すと考える。したがって、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解とＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解とをいずれも阻害することによる糖尿病の防止方法および／または治療方法は、異なったメカニズムの両方を介して糖尿病の防止および／または治療に効果を示すため、これら蛋白質の分解の一方を阻害することによる糖尿病の防止方法および／または治療方法と比較してより効果が高く、より好ましい。
【００７７】
本発明に係る糖尿病の防止方法および／または治療方法は、上記したＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を用いて実施できる。また、本糖尿病の防止方法および／または治療方法は、上記したＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法を用いて実施できる。
【００７８】
ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献８および９）ことから、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、細胞死阻害方法を実施できる。また、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、細胞死阻害剤として使用できる。すなわち、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の１つ以上を用いて細胞死阻害剤を調製できる。さらに、小胞体ストレスにより膵臓のβ細胞が細胞死を起こすことが報告されている（非特許文献７）ことから、本発明に係る細胞死阻害方法および細胞死阻害剤は、好ましくは膵臓β細胞の細胞死阻害方法および細胞死阻害剤に使用できる。より好ましくは小胞体ストレスによる膵臓β細胞の細胞死阻害方法および細胞死阻害剤に使用できる。
【００７９】
本発明に係る細胞死阻害方法は、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解の阻害方法を用いて実施できる。ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は上記化合物の同定方法により取得できる。さらに、本細胞死阻害方法および本細胞死阻害剤を用いて、糖尿病の防止方法および／または治療方法を実施できる。本細胞死阻害方法は、好ましくは、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６とＨｔｒＡ２とを少なくとも含む生体外試料においてＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより実施できる。
【００８０】
ＨＮＦ−４αの機能欠損は糖代謝の異常を招くこと、および遺伝子２型糖尿病ＭＯＤＹ１の原因遺伝子であることが明らかにされている（非特許文献１０および１１）ことから、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、２型糖尿病の防止方法および／または治療方法を実施できる。また、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、２型糖尿病の防止剤および／または治療剤の有効成分として使用できる。すなわち、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の１つ以上を用いて、２型糖尿病の防止剤および／または治療剤を調製できる。
【００８１】
本発明に係る２型糖尿病の防止方法および／または治療方法は、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解の阻害方法を用いて実施できる。ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は上記化合物の同定方法により取得できる。
【００８２】
本発明に係る糖尿病の防止剤および／または治療剤は、上記化合物の１つ以上を有効成分としてその有効量含む医薬として製造できる。通常は、１種または２種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。
【００８３】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００８４】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。
【００８５】
より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。
【００８６】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤等を適宜使用することもできる。
【００８７】
安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。
【００８８】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
【００８９】
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。
【００９０】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。
【００９１】
キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。
【００９２】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。
【００９３】
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ乃至１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量を変更できる。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００９４】
本発明の医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
【００９５】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与することができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施可能である。
【００９６】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００９７】
さらに本発明は、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４α、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチド、およびＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キットを提供する。当該試薬キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。
【００９８】
上記試薬キットは、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００９９】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【０１００】
（ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレットに記載の予測方法に従って予測した。すなわち、ＨｔｒＡ２のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＨｔｒＡ２との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＨｔｒＡ２と相互作用すると予測した。
【０１０１】
解析の結果、ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、ＣＲＥＢＬ１を見出した。
【実施例２】
【０１０２】
（インビトロ プロテアーゼアッセイ）
ＣＲＥＢＬ１またはＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６とＨｔｒＡ２の相互作用を実験的に検証するために、インビトロにおけるプロテアーゼアッセイを実施した。
【０１０３】
＜材料およびその調製＞
本実施例においては、活性型ＨｔｒＡ２および不活性型ＨｔｒＡ２としてそれぞれ、いずれもＣ末Ｔａｇとしてヒスチジン（Ｈｉｓ）を付加した成熟型ＨｔｒＡ２（配列番号４）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）（配列番号６）を用いた。また、ＨｔｒＡ２と相互作用すると予想した蛋白質として、いずれもＮ末Ｔａｇとしてｃ−Ｍｙｃを付加したＣＲＥＢＬ１（配列番号１６）およびＡＴＦ６（配列番号１８）を用いた。
【０１０４】
１．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）のクローニングおよび発現プラスミドの作製
成熟型ＨｔｒＡ２（前駆体ＨｔｒＡ２（そのＤＮＡ塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１および配列番号２に記載）のアミノ酸残基１３４−４５８部分）をコードする遺伝子を得るために、Ｈｕｍａｎ Ｋｉｄｎｅｙ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、ＨｔｒＡ２−Ｆ１プライマー（５´側にＮｄｅＩ部位とＡＴＧを付加、配列番号１９）とＨｔｒＡ２−ＲＳプライマー（終止コドンを除いてＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２０）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）により成熟型ＨｔｒＡ２遺伝子を増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。また、シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｈｉｔａｃｈｉ：ＡＢＩ３１００）により塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および配列番号４に記載した。成熟型ＨｔｒＡ２大腸菌発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２遺伝子をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＥＴ２４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組込むことにより取得した。
【０１０５】
成熟型ＨｔｒＡ２の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリンをアラニンに置換した変異体（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））は、プロテアーゼ活性を示さないことが報告されている。そこで、不活性型である成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の大腸菌発現プラスミドを、成熟型ＨｔｒＡ２発現プラスミドを鋳型とし、ＨｔｒＡ２−ＭＦプライマー（配列番号２１）とＨｔｒＡ２−ＭＲプライマー（配列番号２２）を用いてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により作製した。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５および配列番号６に記載した。
【０１０６】
２．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の発現および精製
成熟型ＨｔｒＡ２大腸菌発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した形質転換体を取得した。この形質転換体を、２６℃にて１００ｍｌのＬＢ培地で培養し、吸光度（ＯＤ）が０．６８〜０．８１に達したときにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭ添加することにより成熟型ＨｔｒＡ２蛋白質の発現誘導を行い、一晩培養した後、成熟型ＨｔｒＡ２を発現している大腸菌を遠心処理により分離回収した。得られた大腸菌を、リシスバッファーＡ（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／１％ トライトンＸ−１００、１μｇ／ｍｌ ペプスタチン、５μＭ Ｅ６４）に懸濁し、氷冷下でソニケーター（１５秒×１０回）により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心処理し（１５，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）、可溶性画分（上清）と不溶性画分に分離した。成熟型ＨｔｒＡ２の含まれる可溶性画分を、あらかじめ１％ トライトンＸ−１００、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて平衡化したプロボンドレジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：１ｍｌ ｐｒｅｐａｃｋｅｄ）に加え、４℃で３０分間混和した後、洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）にて３回洗浄した。レジンに吸着した成熟型ＨｔｒＡ２は、５０、１００、２００、３５０、５００ｍＭ イミダゾールをそれぞれ含む溶出バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）にて段階的に溶出した。各溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、成熟型ＨｔｒＡ２を含む画分を特定した。その結果、３５０−５００ｍＭ イミダゾールで成熟型ＨｔｒＡ２が溶出された。成熟型ＨｔｒＡ２を含む画分を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析した後、遠心処理にて不溶物を除去した上清を濃縮し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準蛋白質としてクマシープラスプロテインアッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、ＰＩＥＲＣＥ社製）により蛋白質を定量した。また成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の発現および精製を同様に行った。
【０１０７】
３．ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６のクローニングおよび発現プラスミドの作製
ＣＲＥＢＬ１については、まずＨｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ｃＤＮＡを鋳型とし、８３−Ｆプライマー（ＡＴＧの直前にＥｃｏＲＩ部位とＧＣＣを付加、配列番号２３）と８３−Ｒプライマー（終止コドンを除いてＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２４）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＣＲＥＢＬ１遺伝子を増幅させ、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５にクローニングした。
【０１０８】
次に、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５に組込んだＣＲＥＢＬ１遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６−ＮＦ１プライマー（ＡＴＧを除いてＢａｍＨＩ部位を付加、配列番号２５）とＡＴＦ６−ＮＲ１プライマー（終止コドンの後にＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２６）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＣＲＥＢＬ１遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。本実施例で得られたＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＮＭ＿００４３８として既に登録された塩基配列と比較して塩基の１つに相違が認められた（Ｔ４５０Ｃ）。この相違によるアミノ酸の変化はなかった。また、終止コドンがＴＧＡからＴＡＡに変化した。これらの相違はＰＣＲエラーではないことを確認した。本実施例で得られたＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１５および配列番号１６に記載した。ＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミドは、クローニングしたＣＲＥＢＬ１遺伝子をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３に組込むことにより取得した。
【０１０９】
ＡＴＦ６については、まず、Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆｎプライマー（配列番号２７）とＡＴＦ６Ｒｎプライマー（配列番号２８）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子を増幅させた。次に、この増幅されたＡＴＦ６遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆ１Ｌプライマー（ＡＴＧの直前にＥｃｏＲＶ ｓｉｔｅを付加、配列番号２９）とＡＴＦ６Ｒ１Ｌプライマー（終止コドンの直後にＸｈｏＩ ｓｉｔｅを付加、配列番号３０）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子をさらに増幅させ、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した（配列番号１７）。本実施例で得られたＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＮＭ＿００７３４８として既に登録された塩基配列と比較して１５個の塩基に相違が認められた。相違する１５塩基は全てゲノム配列と一致することが判明した：Ｔ１０５Ｃ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１９９Ａ（ＬｅｕからＭｅｔへのアミノ酸の変化を伴う）；Ａ２０１Ｇ（ＬｅｕからＭｅｔへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｃ２７０Ｔ（アミノ酸の変化なし）；Ａ３０９Ｇ（アミノ酸の変化なし）；Ｃ４３３Ｇ（ＰｒｏからＡｌａへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｔ４６９Ｃ（ＳｅｒからＰｒｏへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｇ１２２８Ａ（ＧｌｙからＳｅｒへのアミノ酸の変化を伴う）；Ａ１２３０Ｃ（ＧｌｙからＳｅｒへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｃ１３８９Ｔ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１４１６Ｃ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１４９１Ａ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１５３８Ｃ（ＶａｌからＡｌａへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｇ１５４０Ｃ（ＶａｌからＬｅｕへのアミノ酸の変化を伴う）；およびＧ１８９６Ａ（アミノ酸の変化なし）。また、全てのアミノ酸の変化に関してＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴではコンフリクトで記載がある。本実施例で得られたＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７および配列番号１８に記載した。
【０１１０】
ＡＴＦ６遺伝子を動物細胞発現ベクターに組込むために、上記のｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングしたＡＴＦ６遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆ２Ｌプライマー（ＡＴＧの直前にＢｇｌＩＩ ｓｉｔｅを付加、配列番号３１）とＡＴＦ６Ｒ１Ｌプライマー（配列番号３０）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子を増幅し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した（配列番号１９）。このクローニングしたＡＴＦ６遺伝子をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで消化し、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化した動物細胞発現ベクターであるｐＣＭＶ−Ｔａｇ３に組込んだ。
【０１１１】
４．ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６の発現
トランスフェクション前日に細胞数１．５×１０６／１０ｃｍ ディッシュ（Ｄｉｓｈ）としたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６の発現プラスミドをＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）にてトランスフェクションした（１０μｇ／Ｄｉｓｈ）。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのリシスバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ トライトンＸ−１００、１％ ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、コンプリートミニ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ ｔｅｔｒａ−ａｃｅｔａｔｅ）不含））を添加し氷上で１０分間静置した。その後、スクレーパーで細胞を集め、１．５ｍｌのチューブに入れ、氷冷下でソニケーション処理（１５秒×６回）を行い、氷中で２０分静置後、ピペッティングで懸濁し、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）により可溶性画分と不溶性画分を分離した。検討用試料として、可溶性画分を用いた。
【０１１２】
５．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の活性の検討
カゼインザイモグラフィーおよびカゼインナトリウムのプロテアーゼアッセイにより成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の活性の検討を行った。カゼインザイモグラフィーはプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に従って実施した。具体的には、成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を非還元下で２×ＳＤＳ サンプルバッファーと等量混合し、室温で１０分静置した後、４〜１６％ ザイモグラム（Ｂｌｕｅ ｃａｓｅｉｎ）ゲル（Ｚｙｍｏｇｒａｍ Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）による分離を行った。泳動終了後、２．５％ トライトンＸ−１００にてリネーチャー（ｒｅｎａｔｕｒｅ）した後、ディベロピングバッファー（Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中で３７℃、一晩カゼイン分解反応を行った。
【０１１３】
一方、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアッセイは、反応バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中で成熟型ＨｔｒＡ２あるいは成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を２００μｇ／ｍｌ、カゼインナトリウムを４００μｇ／ｍｌの濃度となるように混合し、３７℃でインキュベーションして反応させることにより行った。反応開始３時間後および一晩後に反応液の一部を採取して、２×ＳＤＳ サンプルバッファーと等量混合し煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によりカゼインナトリウムの分解の有無を検出した。
【０１１４】
上記検討の結果、成熟型ＨｔｒＡ２によるカゼインの分解が認められたが、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ではカゼインの分解が認められなかった。このことから、成熟型ＨｔｒＡ２はプロテアーゼ活性を有する活性型であるが、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）はプロテアーゼ活性を示さない不活性型であることが確認できた。
【０１１５】
＜方法＞
ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６の発現プラスミドをトランスフェクションした細胞から調製した可溶性画分に含まれる夾雑蛋白質の影響を除くために免疫沈降にて樹脂にそれぞれ捕捉したＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６を実験に用いた。ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６の各可溶性画分３００μｌを６本のチューブ（Ｎｏ．１−６）に分注し、各チューブにＢＳＡでブロッキングした５０％スラリーのプロテインＧ セファロース ４ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を２０μｌ添加し、４℃で１時間転倒混和後、遠心処理（１０，０００ｒｐｍ、１０秒間、４℃）にて上清を回収し前処理（ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）を行った。得られた上清に抗Ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１．７μｌ（２μｇ）添加し、４℃で３時間転倒混和後に、ＢＳＡでブロッキングしたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを２０μｌ添加し４℃で１晩転倒混和し、プロテインＧ セファロース ４ ＦＦにＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６をそれぞれ捕捉した。
【０１１６】
次にＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６が捕捉されたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを５００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００）で５回洗浄した後、Ｎｏ．１および２のチューブには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００を、Ｎｏ．３および４のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２溶液１００μｌを、Ｎｏ．５および６のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）溶液１００μｌをそれぞれ加えた。Ｎｏ．１、３および５のチューブは３７℃で４時間、Ｎｏ．２、４および６のチューブは一晩反応させた後、遠心処理により上清を除去して５００μｌの洗浄バッファーにて３回、遠心洗浄を行い、２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を８０μｌ加え煮沸処理した。得られた試料８０μｌのうち１０μｌを使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜へ転写し、ウエスタンブロッティングにより、ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６を検出した。検出用の１次抗体として抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ社製）を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。また、検出はＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて実施した。
【０１１７】
＜結果＞
ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６がいずれも、成熟型ＨｔｒＡ２によりインビトロで分解されることを認めた。図１−Ａに示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。また、図１−Ｂに示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＡＴＦ６を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））によるＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６の分解は認められなかった（図１−Ａおよび図１−Ｂ）。
【実施例３】
【０１１８】
（細胞内におけるプロテアーゼアッセイ）
ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６とＨｔｒＡ２の相互作用を細胞内におけるプロテアーゼアッセイにより検討した。
【０１１９】
＜材料およびその調製＞
成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）は、アポトーシスの阻害に働くＩＡＰｓ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、ＩＡＰｓと結合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアッセイの検討に影響を与える可能性が考えられる。そこで成熟型ＨｔｒＡ２または成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）とＩＡＰｓとの相互作用を阻害するために、Ｎ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させたもの（ΔＡＶＰＳ）または該４残基のうちのアラニンをグリシンに置換したもの（ＡＶＰＳ→ＧＶＰＳ）を成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）についてそれぞれ作製した。これら各種ＨｔｒＡ２はいずれもＣ末ＴａｇとしてＦＬＡＧを付加したものを用いた。
【０１２０】
１．各種ＨｔｒＡ２の調製
成熟型ＨｔｒＡ２の変異体を作製するために、成熟型ＨｔｒＡ２を鋳型とし、センスプライマーとしてＦ１およびＦ２プライマー（ＡＴＧの直前にＳａｃＩ ｓｉｔｅを付加、それぞれ配列番号３２および配列番号３３）を、アンチセンスプライマーとしてＨｔｒＡ２−ＲＳプライマー（配列番号２０）を用い、またＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてＰＣＲ法により、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各動物細胞発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各遺伝子をＳａｃＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に組込むことにより取得した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７および配列番号８に記載した。また、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９および配列番号１０に記載した。
【０１２１】
成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の変異体を作製するために、同様に、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を鋳型とし、ＰＣＲ法により、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各動物細胞発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各遺伝子をＳａｃＩとＸｈｏＩで消化し、それぞれｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に組込むことにより取得した。本実施例で用いた成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１および配列番号１２に記載した。また、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３および配列番号１４に記載した。
【０１２２】
２．各種ＨｔｒＡ２の酵素活性の検討
培養細胞で発現した各種ＨｔｒＡ２に関して、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアッセイにより、その酵素活性を測定した（実施例２参照）。その結果、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）はいずれもプロテアーゼ活性を有する活性型であること、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）はいずれもプロテアーゼ活性を有さない不活性型であることが判明した。
【０１２３】
３．ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６の動物細胞用発現ベクターの作製
実施例２と同様の方法で作製したものを用いた。
【０１２４】
＜方法＞
各種ＨｔｒＡ２発現プラスミドとＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６の発現プラスミドとは、トランスフェクション前日に細胞数５×１０５／６ｃｍ ＤｉｓｈとしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて導入した。各種ＨｔｒＡ２発現プラスミドはそれぞれ、ＣＲＥＢＬ１発現プラスミドまたはＡＴＦ６発現プラスミドと組合せて、いずれも１μｇ／Ｄｉｓｈ添加した。４８時間後、各種ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６とを共発現させた細胞に、２００μｌのリシスバッファーＢに２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を等量加え、ソニケーション後、煮沸処理したものを検討用試料とした。
【０１２５】
上記各検討用試料１０μｌを用いてウエスタンブロッティングにより、ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６の発現並びにこれら蛋白質の分解の有無を検出した。検出用の１次抗体として抗ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）抗体を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。検出は、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。
【０１２６】
＜結果＞
プロテアーゼ活性を有する活性型変異体（成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した（図２−Ａの上図）。また、該活性型変異体とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した（図２−Ｂの上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ａの上図）。また、該不活性型ＨｔｒＡ２変異体とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ｂの上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（図２−ＡおよびＢの下図）。
【０１２７】
このように、ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）により細胞内で分解されることが明らかになった。一方、ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）または不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）では分解されなかった。
【実施例４】
【０１２８】
（ＨｔｒＡ２による分解パターンの検討）
ＨｔｒＡ２によるＣＲＥＢＬ１の分解パターンを検討した。検討は、ビオチン化したＣＲＥＢＬ１を用いて、ＨｔｒＡ２によるインビトロ プロテアーゼアッセイにより行った。
【０１２９】
＜材料およびその調製＞
１．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）
成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）は、実施例２と同様の方法で調製したものを用いた。
【０１３０】
２．ＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミド
ＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミドは、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターに実施例２と同様の方法でクローニングしたＣＲＥＢＬ１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓに組込むことにより取得した。
【０１３１】
３．インビトロ翻訳反応系を用いたビオチン化ＣＲＥＢＬ１の調製
ビオチンで標識されたＣＲＥＢＬ１の調製は、ウサギ網状赤血球ライセート（ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ）を用いたインビトロ翻訳反応系（ＴＮＴ登録商標 Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で行った。
具体的にはまず、インビトロ翻訳反応溶液（ＴＮＴ登録商標 Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）４０μｌにＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミド（１μｇ／μｌ）１．５μｌ、１ｍＭ メチオニン１μｌ、ビオチン化リジンｔＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、ヌクレアーゼを含まない水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）６．５μｌを加えて全量５０μｌとし、３０℃で１．５時間反応させた。その後、反応液５０μｌから１２．５μｌを採取し、２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウエスタンブロッティングにより、ビオチンでラベルされたＣＲＥＢＬ１の発現を検出した。検出は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて行った。その結果、いずれもビオチン化されていることが確認できた。
【０１３２】
＜方法＞
上記反応液をプロテアーゼアッセイの試料として用いた。反応液は１２．５μｌずつ３本のチューブ（Ｎｏ．２−４）に分注した。Ｎｏ．２のチューブにはコントロールとして、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２５μｌ、Ｎｏ．３のチューブには２００μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２溶液を２５μｌ、Ｎｏ．４のチューブには２００μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）溶液２５μｌをそれぞれ加え混合した。各チューブ（Ｎｏ．２−４）をさらに半量ずつ分注し、１つのチューブは３７℃で４時間反応し、もう一方のチューブは、３７℃で一晩反応させた。反応後、各チューブに２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウエスタンブロッティングにより、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１の分解パターンを検出した。
【０１３３】
分解の検出は、ＣＲＥＢＬ１内部のビオチン化されたリジン残基を指標にして、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて行った。
【０１３４】
さらに分解箇所を調べる為、ウエスタンブロッティングに用いたメンブレンから、ストレプトアビジン−ＨＲＰを除去し、ＣＲＥＢＬ１のＮ末に付加されたＴａｇに対する抗体で、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１の分解パターンを検出した。抗体は、１次抗体として抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、２次抗体としてＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。分解の検出は、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて行った。
【０１３５】
＜結果＞
ＣＲＥＢＬ１内部のビオチン化されたリジン残基を指標に、成熟型ＨｔｒＡ２によるＣＲＥＢＬ１の分解パターンを検討した結果を図３に示した。また、ＣＲＥＢＬ１のＮ末に付加されたＴａｇを指標として、ＣＲＥＢＬ１の分解パターンを検討した結果を図４に示した。
【０１３６】
ビオチン化されたリジン残基を指標にした分解パターンの検討において、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの著しい減少が認められ、さらに５０ｋＤａ近辺にＣＲＥＢＬ１分解産物と考えられるバンドが検出された（図３）。しかし、抗Ｔａｇ抗体による分解パターンの検討では、図３で認められた５０ｋＤａ近辺のＣＲＥＢＬ１分解産物と考えられるバンドだけでなく、別のサイズのＣＲＥＢＬ１分解産物を示すバンドも全く検出できなかった（図４）。このことから、ＣＲＥＢＬ１はＨｔｒＡ２により数箇所で切断されて分解されたと考えられる。
【０１３７】
このように、ＣＲＥＢＬ１内部を標識化して標識物質を検出することにより、ＨｔｒＡ２によるＣＲＥＢＬ１の分解が検出された。このことから、ＣＲＥＢＬ１のＮ末に付加したＴａｇの検出により明らかになったＨｔｒＡ２によるＣＲＥＢＬ１の分解（実施例２および３）は、Ｔａｇが切断分離されたことによる見かけ上の分解ではなく、ＨｔｒＡ２がＣＲＥＢＬ１に作用してそのペプチド結合を切断した結果生じた分解であることが判明した。
【実施例５】
【０１３８】
（ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレットに記載の予測方法に従って予測した。すなわち、ＨｔｒＡ２のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＨｔｒＡ２との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＨｔｒＡ２と相互作用すると予測した。
【０１３９】
解析の結果、ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、ＨＮＦ−４αを見出した。
【実施例６】
【０１４０】
（インビトロ プロテアーゼアッセイ）
ＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２の相互作用を実験的に検証するために、インビトロにおけるプロテアーゼアッセイを実施した。
【０１４１】
＜材料およびその調製＞
本実施例においては、活性型ＨｔｒＡ２および不活性型ＨｔｒＡ２としてそれぞれ、いずれもＣ末Ｔａｇとしてヒスチジン（Ｈｉｓ）を付加した成熟型ＨｔｒＡ２（配列番号４）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）（配列番号６）を用いた。また、ＨＮＦ−４αとして、Ｎ末に（６×Ｈｉｓ）−Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇを付加したＨＮＦ−４α（配列番号３５）を用いた。
【０１４２】
１．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）
成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）は、実施例２と同様の方法で調製したものを用いた。
【０１４３】
２．ＨＮＦ−４α発現プラスミドの作製
ＨＮＦ−４αについては、まずＨｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりＨＮＦ−４α遺伝子を増幅させた。ＰＣＲエラーと思われる塩基置換は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）により修正した。その後、Ｎ末に（６×Ｈｉｓ）−Ｘｐｒｅｓｓ−ｔａｇを付加させる動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に組込み、ＨＮＦ−４α発現プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ）を構築した。なお、クローニングしたＨＮＦ−４α ＤＮＡによりコードされる推定アミノ酸配列は、スイスプロットデータベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｄａｔａｂａｓｅ）のアクセッションナンバーＰ４１２３５（登録遺伝子名はＨＮＦ４Ａ）に開示されたＨＮＦ−４αのアミノ酸配列と同一であった。本実施例で得られたＨＮＦ−４α ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３４および配列番号３５に記載した。
【０１４４】
上記ＨＮＦ−４α発現プラスミドを用いて、ＥｃｏＲＩサイトで、ＨＮＦ−４αのＤＮＡ配列をＮ末にＦＬＡＧ−ｔａｇを付加させる動物細胞用発現プラスミドｐＣＭＶ−Ｔａｇ２（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）に組換えを行い、ＨＮＦ−４α発現プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２）を構築した。
【０１４５】
３．ＨＮＦ−４αの調製
トランスフェクション前日に細胞数１．５×１０６／１０ｃｍ ディッシュ（Ｄｉｓｈ）としたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＨＮＦ−４α発現プラスミドをＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）にて導入した（１０μｇ／Ｄｉｓｈ）。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのリシスバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ トライトンＸ−１００、１％ ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、コンプリートミニ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ不含）を添加し氷上で１０分間静置した。その後、スクレーパーで細胞を集め、１．５ｍｌのチューブに入れ、氷冷下でソニケーション処理（１５秒×６回）を行い、氷中で２０分静置後、ピペッティングで懸濁し、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）により可溶性画分と不溶性画分を分離した。検討用試料として、可溶性画分（以下、ＨＮＦ−４α可溶性画分と称する）を用いた。
【０１４６】
＜方法＞
ＨＮＦ−４α可溶性画分に含まれる夾雑蛋白質の影響を除くために免疫沈降にて樹脂に捕捉したＨＮＦ−４αを実験に用いた。具体的には、まず、ＨＮＦ−４α可溶性画分３００μｌを６本のチューブ（Ｎｏ．１−６）に分注し、各チューブにＢＳＡでブロッキングした５０％スラリーのプロテインＧ セファロース ４ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を２０μｌ添加し、４℃で１時間転倒混和後、遠心処理（１０，０００ｒｐｍ、１０秒間、４℃）にて上清を回収し前処理（ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）を行った。得られた上清に抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を０．４μｌ（２μｇ）添加し、４℃で３時間転倒混和後に、ＢＳＡでブロッキングしたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを２０μｌ添加し４℃で１晩転倒混和し、プロテインＧ セファロース ４ ＦＦにＨＮＦ−４αを捕捉した。
【０１４７】
次にＨＮＦ−４αが捕捉されたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを５００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００）で５回洗浄した後、Ｎｏ．１および２のチューブには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００を、Ｎｏ．３および４のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２溶液１００μｌを、Ｎｏ．５および６のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）溶液１００μｌをそれぞれ加えた。Ｎｏ．１、３および５のチューブは３７℃で４時間、Ｎｏ．２、４および６のチューブは一晩反応させた後、遠心処理により上清を除去して５００μｌの洗浄バッファーにて３回、遠心洗浄を行い、２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を８０μｌ加え煮沸処理した。得られた試料８０μｌのうち１０μｌを使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜へ転写し、ウエスタンブロッティングにより、ＨＮＦ−４αを検出した。検出用の１次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。また、検出はＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて実施した。
【０１４８】
＜結果＞
ＨＮＦ−４αが成熟型ＨｔｒＡ２によりインビトロで分解されることを認めた。図５に示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＨＮＦ−４αを１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＨＮＦ−４αを示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））によるＨＮＦ−４αの分解は認められなかった（図５）。
【実施例７】
【０１４９】
（細胞内におけるプロテアーゼアッセイ）
ＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２の相互作用を細胞内におけるプロテアーゼアッセイにより検討した。
【０１５０】
＜材料およびその調製＞
ＨＮＦ−４α発現用プラスミドとして、実施例６で作製したＨＮＦ−４α動物細胞発現用プラスミド（ＨＮＦ−４α／ｐＣＭＶ−Ｔａｇ２）を用いた。また、ＨｔｒＡ２発現用プラスミドとして、実施例３で作製した成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）発現用プラスミド、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）発現用プラスミド、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）発現用プラスミドおよび成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）発現用プラスミドを用いた。
【０１５１】
＜方法＞
各種ＨｔｒＡ２発現プラスミドとＨＮＦ−４α発現プラスミドは、トランスフェクション前日に細胞数５×１０５／６ｃｍ ＤｉｓｈとしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて導入した。各種ＨｔｒＡ２発現プラスミドはそれぞれ、ＨＮＦ−４α発現プラスミドと組合せて、いずれも１μｇ／Ｄｉｓｈ添加した。４８時間後、各種ＨｔｒＡ２とＨＮＦ−４αとを共発現させた細胞に、２００μｌのリシスバッファーＢと２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を等量加え、ソニケーション後、煮沸処理したものを検討用試料とした。
【０１５２】
上記各検討用試料１０μｌを用いてウエスタンブロッティングにより、ＨＮＦ−４αの発現並びにＨＮＦ−４αの分解の有無を検出した。検出用の１次抗体として抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ社製）を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。検出は、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。
【０１５３】
＜結果＞
プロテアーゼ活性を有する活性型変異体（成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））とＨＮＦ−４αとを共発現させた細胞を用いた解析では、ＨＮＦ−４αを示すバンドが著しく減少した（図６）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＨＮＦ−４αとを共発現させた細胞を用いた解析では、ＨＮＦ−４αを示すバンドの減少は認められなかった（図６）。
【０１５４】
このように、ＨＮＦ−４αは活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）により細胞内で分解されることが明らかになった。一方、ＨＮＦ−４αは不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）または不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）では分解されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明は、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解に基づく糖尿病の防止および／または治療、並びにＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解に基づく細胞死（例えば膵臓β細胞の細胞死）の阻害のために利用可能であり、医薬分野において非常に有用性が高い。
【配列表フリーテキスト】
【０１５６】
配列番号１：ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質をコードするＤＮＡ。
配列番号２：ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質。
配列番号３：成熟型ＨｔｒＡ２をコードするＤＮＡ。
配列番号４：成熟型ＨｔｒＡ。
配列番号５：配列番号３と同じ塩基配列であってその５２０位の塩基がｇである塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）をコードするＤＮＡ。
配列番号６：配列番号４と同じアミノ酸配列であって１７４番目のアミノ酸残基がＡｌａに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）。
配列番号７：配列番号３と同じ塩基配列であってその４−１５位の塩基を欠失させた塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号８：配列番号４と同じアミノ酸配列であって２−５番目のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）。
配列番号９：配列番号３に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその５位の塩基がｇであるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１０：配列番号４と同じアミノ酸配列であって２番目のアミノ酸残基がＧｌｙに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）。
配列番号１１：配列番号５と同じ塩基配列であってその４−１５位の塩基を欠失させた塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１２：配列番号６と同じアミノ酸配列であって２−５番目のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）。
配列番号１３：配列番号５に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその５位の塩基がｇであるポリヌクレオチド成熟型；ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１４：配列番号６と同じアミノ酸配列であって２番目のアミノ酸残基がＧｌｙに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）。
配列番号１５：ＣＲＥＢＬ１をコードするＤＮＡ。
配列番号１６：ＣＲＥＢＬ１。
配列番号１７：ＡＴＦ６をコードするＤＮＡ。
配列番号１８：ＡＴＦ６。
配列番号１９：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２０：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２１：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２２：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２３：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２４：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２５：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２６：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２７：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２８：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２９：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３０：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３１：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３２：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３３：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３４：ＨＮＦ−４αをコードするＤＮＡ。
配列番号３５：ＨＮＦ−４α。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨｔｒＡ２（ハイ テンパレイチャー リクワイアメント プロテイン Ａ２、ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２）の機能を阻害することを特徴とする、ＣＲＥＢＬ１（サイクリックＡＭＰ レスポンシブ エレメント バインディング プロテイン ライク １、ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ １）、ＡＴＦ６（アクティベーティング トランスクリプション ファクター ６、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ６）およびＨＮＦ−４α（ヘパトサイト ヌクレアー ファクター ４α、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４α）のうちの少なくとも１の分解阻害方法。
【請求項２】
ＨｔｒＡ２の機能を阻害することがＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することであり、ここでＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＣＲＥＢＬ１の分解が阻害され、ＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＡＴＦ６の分解が阻害され、および、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＨＮＦ−４αの分解が阻害される請求項１に記載のＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法。
【請求項３】
ＨｔｒＡ２の機能を阻害することがＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することであり、ここでＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＣＲＥＢＬ１の分解が阻害され、ＡＴＦ６とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＡＴＦ６の分解が阻害され、および、ＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＨＮＦ−４αの分解が阻害される請求項１に記載のＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法。
【請求項４】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項６】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項７】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる糖尿病の防止剤および／または治療剤。
【請求項８】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２をある化合物（被検化合物）と接触させ、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１を検出することができるシグナルおよび／マーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／マーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、被検化合物がＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項９】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２をある化合物（被検化合物）と接触させ、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、あるいはＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、被検化合物がＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項１０】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法が、糖尿病の防止剤および／または治療剤の有効成分である化合物の同定方法である、請求項８または９に記載の同定方法。
【請求項１１】
ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害方法。
【請求項１２】
ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする細胞死阻害方法。
【請求項１３】
細胞死が膵臓β細胞の細胞死である請求項１１または１２に記載の細胞死阻害方法。
【請求項１４】
ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる細胞死阻害剤。
【請求項１５】
細胞死が膵臓β細胞の細胞死である請求項１４に記載の細胞死阻害剤。
【請求項１６】
請求項１１から１３のいずれか１項に記載の細胞死阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項１７】
ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする２型糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項１８】
ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる２型糖尿病の防止剤および／または治療剤。
【請求項１９】
ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４α、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチド、およびＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キット。
【請求項１】
ＨｔｒＡ２（ハイ テンパレイチャー リクワイアメント プロテイン Ａ２、ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２）の機能を阻害することを特徴とする、ＣＲＥＢＬ１（サイクリックＡＭＰ レスポンシブ エレメント バインディング プロテイン ライク １、ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ １）、ＡＴＦ６（アクティベーティング トランスクリプション ファクター ６、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ６）およびＨＮＦ−４α（ヘパトサイト ヌクレアー ファクター ４α、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ４α）のうちの少なくとも１の分解阻害方法。
【請求項２】
ＨｔｒＡ２の機能を阻害することがＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することであり、ここでＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＣＲＥＢＬ１の分解が阻害され、ＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＡＴＦ６の分解が阻害され、および、ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による切断を阻害することによりＨＮＦ−４αの分解が阻害される請求項１に記載のＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法。
【請求項３】
ＨｔｒＡ２の機能を阻害することがＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することであり、ここでＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＣＲＥＢＬ１の分解が阻害され、ＡＴＦ６とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＡＴＦ６の分解が阻害され、および、ＨＮＦ−４αとＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することによりＨＮＦ−４αの分解が阻害される請求項１に記載のＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法。
【請求項４】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項６】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項７】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる糖尿病の防止剤および／または治療剤。
【請求項８】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２をある化合物（被検化合物）と接触させ、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１を検出することができるシグナルおよび／マーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／マーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、被検化合物がＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項９】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２をある化合物（被検化合物）と接触させ、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、あるいはＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、被検化合物がＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項１０】
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨＮＦ−４αのうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法が、糖尿病の防止剤および／または治療剤の有効成分である化合物の同定方法である、請求項８または９に記載の同定方法。
【請求項１１】
ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする細胞死阻害方法。
【請求項１２】
ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする細胞死阻害方法。
【請求項１３】
細胞死が膵臓β細胞の細胞死である請求項１１または１２に記載の細胞死阻害方法。
【請求項１４】
ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる細胞死阻害剤。
【請求項１５】
細胞死が膵臓β細胞の細胞死である請求項１４に記載の細胞死阻害剤。
【請求項１６】
請求項１１から１３のいずれか１項に記載の細胞死阻害方法を用いることを特徴とする糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項１７】
ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする２型糖尿病の防止方法および／または治療方法。
【請求項１８】
ＨＮＦ−４αのＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる２型糖尿病の防止剤および／または治療剤。
【請求項１９】
ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＨＮＦ−４α、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチド、およびＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６またはＨＮＦ−４αをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キット。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図１−Ｂ】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０２５５
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４２７９（Ｐ２００５−５１４２７９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４３７７
【国際出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４３７７
【国際出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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