ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することによる神経細胞死阻害および神経変性疾患の改善方法
ＨｔｒＡ２と相互作用するＣＲＥＢＬ１およびＳＨＣ１を見出し、さらに活性型ＨｔｒＡ２により、ＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６、およびＳＨＣ１のファミリーであるＳＨＣ３が分解されることを初めて明らかにした。 そして、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＳＨＣ３のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする神経細胞の細胞死の阻害手段、前記分解の阻害を特徴とする神経細胞の細胞死を伴う疾患（例えば神経変性疾患または脳虚血障害）の防止、治療または改善のための手段、ＣＲＥＢＬ１および／またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法、並びに試薬キットを提供した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＨＣ３（サーク ホモロジー ２ ドメイン コンテイニング トランスフォーミング プロテイン Ｃ３、ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ３）、ＡＴＦ６（アクティベーティング トランスクリプション ファクター ６、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ６）およびＣＲＥＢＬ１（サイクリックＡＭＰ レスポンシブ エレメント バインディング プロテイン ライク １、ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ １）のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２（ハイ テンパレイチャー リクワイアメント プロテイン Ａ２、ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２）による分解の阻害に関する。より具体的には、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする神経細胞死阻害方法、あるいは該分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする神経細胞死阻害方法に関する。また、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする脳虚血障害または神経変性疾患の防止方法、治療方法または改善方法に関する。さらに、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法に関する。また、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる神経細胞死阻害剤に関する。さらに、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる脳虚血障害または神経変性疾患の防止剤、治療剤または改善剤に関する。また、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢＬ１、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチド、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、細胞の生存とアポトーシス（細胞死）を調節することにより外界のストレスから身を守るが、生存とアポトーシス制御機構の調節の乱れによる過剰な細胞死は、種々の疾患を招く可能性がある（非特許文献１）。
【０００３】
近年、ストレスを感知し調節する場としてミトコンドリアや小胞体の研究が進み、ミトコンドリア膜に局在するＨｔｒＡ２蛋白質（以下、ＨｔｒＡ２と称する）は、ＵＶや熱ショック等のストレスによりミトコンドリア膜から細胞質へ移行し（非特許文献２−５）、カスパーゼ依存的な細胞死とカスパーゼ非依存的な細胞死の二つの細胞死を誘導することが報告された（非特許文献６）。ＨｔｒＡ２は、前駆体蛋白質（配列番号２）からＮ末１３３アミノ酸が切り離された成熟型（配列番号４）になり、ミトコンドリアから細胞質に移行する。成熟型ＨｔｒＡ２はプロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有するＨｔｒＡ２を活性型ＨｔｒＡ２と称することもある。
【０００４】
カスパーゼ非依存的な細胞死は、ＨｔｒＡ２自身のセリンプロテアーゼとしての性質に依存し、その前駆体蛋白質のアミノ酸配列中３０６番目（成熟型においては１７４番目に相当する）のセリンをアラニンに置換したＨｔｒＡ２変異体によりカスパーゼ非依存的な細胞死は引き起こされないことが知られている（非特許文献３−５）。かかるＨｔｒＡ２変異体はプロテアーゼ活性を有さない。以下、プロテアーゼ活性を有さないＨｔｒＡ２を不活性型ＨｔｒＡ２と称することもある。このようにＨｔｒＡ２は、カスパーゼ非依存的な細胞死を誘導する機構において重要な役割を担う因子である。
【０００５】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【非特許文献１】「細胞工学」、２００２年、第２１巻、第４号、ｐ．３６０−３９４。
【非特許文献２】ヤマグチ（Ｈ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）ら、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００３年、第６３巻、ｐ．１４８３−１４８９。
【非特許文献３】スズキ（Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ）ら、「モレキュラー セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ）」、２００１年、第８巻、ｐ．６１３−６２１。
【非特許文献４】ヘッジ（Ｒ．Ｈｅｇｄｅ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４３２−４３８。
【非特許文献５】マーチンズ（Ｌ．Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｓ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４３９−４４４。
【非特許文献６】「実験医学」、２００２年、第２０巻、第１号、ｐ．７３−７５。
【非特許文献７】コンティ（Ｌ．Ｃｏｎｔｉ）ら、「ネイチャー ニューロサイエンス（Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００１年、第４巻、ｐ．５７９−５８６。
【非特許文献８】「生化学」、２００１年、第７３巻、第１１号、ｐ．１３２２−１３２５。
【非特許文献９】カウフマン（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ）ら、「ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００２年、第１１０巻、ｐ．１３８９−１３９８。
【非特許文献１０】ハゼ（Ｋ．Ｈａｚｅ）ら、「ザ バイオケミカル ジャーナル（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）、２００１年、第３５５巻、ｐ．１９−２８。
【非特許文献１１】ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１。
【非特許文献１２】「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年。
【非特許文献１３】「ペプチド シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９６年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでに神経変性疾患におけるカスパーゼ非依存的な細胞死についての報告が多数公表されている。一方、脳虚血においては、小胞体ストレスを介して神経細胞死が引き起こされることが報告されている。カスパーゼ非依存的な細胞死を誘導する機構において、ＨｔｒＡ２が重要な役割を担うと考えられている。これらからＨｔｒＡ２が、神経変性疾患の新たな標的となる可能性が高く、また小胞体ストレスによる神経細胞死を阻害することは、新規な創薬標的になると考えられる。
【０００７】
本発明の課題は、ＨｔｒＡ２によるカスパーゼ非依存的な細胞死の機構およびＨｔｒＡ２の基質が未だ明らかになっていない状況において、ＨｔｒＡ２と相互作用する蛋白質を見出し、ＨｔｒＡ２による該蛋白質の分解に基づく疾患の防止および／または治療を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、ＨｔｒＡ２がＣＲＥＢＬ１およびＳＨＣ１と相互作用することをインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で予測し、さらに活性型ＨｔｒＡ２によりＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６、およびＳＨＣ１のファミリーであるＳＨＣ３が分解されることを実験的に証明して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする神経細胞死阻害方法に関する。
【００１０】
また本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする神経細胞死阻害方法に関する。
【００１１】
さらに本発明は、神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である前記神経細胞死阻害方法に関する。
【００１２】
さらにまた本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする脳虚血障害または神経変性疾患の防止方法、治療方法または改善方法に関する。
【００１３】
また本発明は、神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病または筋萎縮性側索硬化症である前記防止方法、治療方法または改善方法に関する。
【００１４】
さらに本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを化合物と接触させ、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１を検出することができるシグナルおよび／マーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／マーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、化合物が、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
【００１５】
さらにまた本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを化合物と接触させ、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、あるいは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、化合物が、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
【００１６】
また本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる神経細胞死阻害剤に関する。
【００１７】
さらに本発明は、神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である前記神経細胞死阻害剤に関する。
【００１８】
さらにまた本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる脳虚血障害または神経変性疾患の防止剤、治療剤または改善剤に関する。
【００１９】
また本発明は、神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病または筋萎縮性側索硬化症である前記神経変性疾患の防止剤、治療剤または改善剤に関する。
【００２０】
さらに本発明は、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢＬ１、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチド、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、これら蛋白質のうちの少なくとも１の減少または消失を阻害することができ、その結果、細胞死（例えば神経細胞の細胞死）の阻害並びに細胞死を伴う疾患（例えば脳虚血障害や神経変性疾患）の防止、治療または改善が可能になる。
【００２２】
ＳＨＣ３は成熟した中枢神経細胞に特異的に発現し、神経細胞の分化と生存に重要な役割を果たしていると考えられる（非特許文献７および８）。ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１は、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導し、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献９および１０）。これらから、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１がＨｔｒＡ２により分解されて減少または消失することにより、ストレス等による細胞死、例えば神経細胞の細胞死が亢進すると考えられる。したがって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害してその減少または消失を阻害することにより、細胞死（例えば神経細胞の細胞死）の阻害並びに細胞死を伴う疾患（例えば脳虚血障害や神経変性疾患）の防止、治療または改善が可能になる。
【００２３】
また本発明により、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法を実施できる。本同定方法で得られた化合物は、細胞死（例えば神経細胞の細胞死）の阻害糖尿病の並びに細胞死を伴う疾患（例えば脳虚血障害や神経変性疾患）の防止、治療または改善に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−Ａ】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＣＲＥＢＬ１がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められなかった。（実施例２）
【００２５】
【図１−Ｂ】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＡＴＦ６がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＡＴＦ６を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＡＴＦ６の分解が認められなかった。（実施例２）
【００２６】
【図１−Ｃ】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＳＨＣ３（ｐ６４）がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ６４）を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＳＨＣ３（ｐ６４）の分解が認められなかった。（実施例２）
【００２７】
【図２−Ａ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＣＲＥＢＬ１が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００２８】
【図２−Ｂ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＡＴＦ６が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００２９】
【図２−Ｃ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＳＨＣ３（ｐ６４）が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＳＨＣ３（ｐ６４）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＳＨＣ３（ｐ６４）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００３０】
【図２−Ｄ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＳＨＣ３（ｐ５２）が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＳＨＣ３（ｐ５２）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＳＨＣ３（ｐ５２）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００３１】
【図３−Ａ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を用いて、ビオチンを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によるＣＲＥＢＬ１の分解が検出されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少し、５０ｋＤａ近辺にＣＲＥＢＬ１分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められず、上記５０ｋＤａ近辺のバンドも検出されなかった。（実施例４）
【００３２】
【図３−Ｂ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ６４）を用いて、ビオチンを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によるＳＨＣ３（ｐ６４）の分解が検出されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ６４）を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ビオチン化ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少し、７０ｋＤａ、４０ｋＤａおよび３０ｋＤａ近辺にＳＨＣ３（ｐ６４）分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＳＨＣ３（ｐ６４）の分解が認められず、上記７０ｋＤａ、４０ｋＤａおよび３０ｋＤａ近辺のバンドも検出されなかった。（実施例４）
【００３３】
【図３−Ｃ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ５２）を用いて、ビオチンを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によるＳＨＣ３（ｐ５２）の分解が検出されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ５２）を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ビオチン化ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドが著しく減少したが、ＳＨＣ３（ｐ５２）分解産物を示すと考えられるバンドは検出されなかった。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＳＨＣ３（ｐ５２）の分解が認められなかった。（実施例４）
【００３４】
【図４−Ａ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を用いて、Ｎ末に付加されたＴａｇを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＣＲＥＢＬ１が分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、Ｎ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。図３で検出された５０ｋＤａ近辺のＣＲＥＢＬ１分解産物を示すと考えられるバンドは、抗Ｔａｇ抗体では検出されなかった。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められなかった。（実施例４）
【００３５】
【図４−Ｂ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＣ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ６４）を用いて、Ｃ末に付加されたＴａｇを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＳＨＣ３（ｐ６４）が分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ６４）を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、Ｃ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少し、７０ｋＤａ、４０ｋＤａおよび３０ｋＤａ近辺にＳＨＣ３（ｐ６４）分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＳＨＣ３（ｐ６４）の分解は認められなかった。（実施例４）
【００３６】
【図４−Ｃ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＣ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ５２）を用いて、Ｃ末に付加されたＴａｇを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＳＨＣ３（ｐ５２）が分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ５２）を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、Ｃ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドが著しく減少し、４０ｋＤａ近辺にＳＨＣ３（ｐ５２）分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＳＨＣ３（ｐ５２）の分解は認められなかった。（実施例４）
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００３−３４２５８８号からの優先権を主張するものである。
【００３８】
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「ポリペプチド」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
【００３９】
本発明においては、ＨｔｒＡ２がＣＲＥＢＬ１およびＳＨＣ１と相互作用することを、国際公開ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット記載の方法に従ってインシリコで予測した。さらに実験的に、ＨｔｒＡ２によりＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６、およびＳＨＣ１のファミリーであるＳＨＣ３が分解されることを初めて明らかにした。
【００４０】
ＳＨＣ３は、Ｎ−ＳｈｃあるいはＳｈｃＣとも称され、成熟した中枢神経細胞に特異的に発現している。ＳＨＣ３は、神経栄養因子（ＮＧＦやＥＧＦ等）により活性化されたレセプターチロシンキナーゼであるＴｒｋファミリー（Ｔｒｋ ｆａｍｉｌｙ）からのシグナルを伝達し、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−Ｂａｄ経路を通じて神経細胞の分化と生存に重要な役割を果たしていると考えられている。またＳＨＣ３のＳＨドメインのみ（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）を発現させた細胞では、細胞死が引き起こされ、神経突起の伸長が妨げられることが報告されている（非特許文献７および８）。
【００４１】
ＣＲＥＢＬ１は、ＡＴＦ６ファミリーの１つであり、ＡＴＦ６βとも称される。ＣＲＥＢＬ１は小胞体に局在し、小胞体ストレスによりＳ１Ｐ、Ｓ２Ｐによりプロセッシングを受けて一部が核移行し、転写因子として働くことが知られている。
【００４２】
ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導することによりストレスに対する細胞の回復と生存に寄与することが知られている（非特許文献９および１０）。また、小胞体ストレスと神経変性疾患の関連性がいくつかの論文で報告されている（非特許文献１）。
【００４３】
これらから、神経細胞において過剰なストレス（例えば小胞体ストレス）により活性化されたＨｔｒＡ２により、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１が分解されて減少または消失することにより、神経細胞の分化・生存シグナル経路の破綻が生じ、その結果、神経細胞死が亢進されると考える。
【００４４】
したがって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより細胞死を阻害できる。さらに、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより細胞死を伴う疾患の防止および／または治療が可能になる。例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、神経細胞の細胞死、例えば小胞体ストレスによる神経細胞死を阻害できる。さらには神経細胞死を伴う疾患、例えば神経変性疾患や脳虚血障害の防止、治療または改善が可能になる。また、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害剤は、神経変性疾患や脳虚血障害の治療薬になる可能性が考えられる。
【００４５】
これら知見に基づいて本発明においては、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害方法を提供する。さらに、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする神経細胞死阻害方法を提供する。本発明に係る神経細胞死阻害方法は、好ましくはインビトロで実施することができる。本発明においてはまた、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解に基づく疾患の防止方法、治療方法または改善方法を提供する。
【００４６】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害はＨｔｒＡ２の作用を阻害することにより実施できる。例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することにより実施できる。あるいは、ＨｔｒＡ２の酵素活性を阻害することにより実施できる。好ましくは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを含む生体外試料において、ＨｔｒＡ２の作用を阻害することによりＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害できる。ここでは、このような阻害効果を有する物質（後述する例として競合阻害効果を有するポリペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる）を阻害剤と称する。また、本明細書中で、「ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２が相互作用する」とは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２がある様式により互いに作用を及ぼし、その結果、具体的にはＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１がＨｔｒＡ２により分解されることを意味する。前記「ある様式」とは、結合、接触あるいは近接等を含むものであり、結果として互いに作用を及ぼし得る様式であればいずれのものであってもよい。
【００４７】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害は具体的には、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害する化合物を用いて実施できる。かかる化合物として、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢＬ１またはＨｔｒＡ２の各アミノ酸配列においてＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。特に、ＨｔｒＡ２の基質となるＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１由来のかかるポリペプチドは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２の蛋白質間相互作用を競合的に阻害し、ＨｔｒＡ２によるこれら各蛋白質の分解を阻害できる。このようなポリペプチドは、ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害するものを選択することにより取得できる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２により分解される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、かかるポリペプチドとして好適である。このように特定されたポリペプチドに、１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術（非特許文献１１）を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変できる。
【００４８】
上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、成書（非特許文献１２および１３）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等が挙げられる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて上記ポリペプチドを製造できる。あるいは遺伝子工学的手法により上記ポリペプチドを取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換え発現ベクターを作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造できる。
【００４９】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解の阻害は、ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１を認識する抗体であって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する抗体を用いることによっても実施できる。かかる抗体は、ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１自体、あるいはＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。
【００５０】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解の阻害は、ＨｔｒＡ２の酵素活性を阻害する化合物、好ましくは特異的に阻害する化合物により実施できる。かかる化合物は、例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１を基質として、ＨｔｒＡ２による当該基質の分解を阻害するものを同定することにより取得できる。ＨｔｒＡ２を特異的に阻害するとは、ＨｔｒＡ２を強く阻害するが、他の酵素は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。
【００５１】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築できる。例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件を選択し、当該条件下でＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２を、調べようとする化合物（被検化合物）と接触させ、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を同定できる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を用いることもできる。細胞における共発現は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、単独で用いることができるし、組合せて用いることもできる。細胞は、真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは動物培養細胞株、さらに好ましくは哺乳動物培養細胞株を用いることができる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２と被検化合物との接触は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の反応以前に行なってもよいし、該分解の反応に共存させることにより行なってもよい。ここでマーカーとは、それ自体は物理的または化学的性質により検出され得ないが、化学的反応を経ることにより前記シグナルを生成させるものであって、該生成されるシグナルの物理的、化学的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルおよび／またはマーカーとして、レポーター遺伝子（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等）、放射性同位体、タグペプチド類（Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等）、ＧＳＴ等の酵素類、ビオチン、および蛍光蛋白質等、公知のものが利用できるが、これら例示に限らず、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であれば、いずれも利用できる。これらシグナルおよび／またはマーカーの検出方法は当業者には周知である。簡便には、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解は、これら蛋白質またはこれら蛋白質の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の検出により測定できる。これら蛋白質量またはこれら蛋白質の分解物量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッティング等を用いて実施できる。
【００５２】
ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１はいずれも公知蛋白質であり、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）にそれぞれアクセッションナンバーＮＭ＿０１３２４７、ＮＭ＿０１６８４８、ＮＭ＿００７３４８およびＮＭ＿００４３８として開示されている。
【００５３】
本実施例において用いたＨｔｒＡ２のアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＨｔｒＡ２ ＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、成熟型ＨｔｒＡ２である。成熟型ＨｔｒＡ２とは、ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質（配列番号２）からＮ末１３３アミノ酸残基が切り離されて生じた成熟型蛋白質であり、プロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有するＨｔｒＡ２を活性型ＨｔｒＡ２と呼称することがある。また、活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた蛋白質（配列番号８、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）と称することがある）または成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した蛋白質（配列番号１０、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）と称することがある）を用いることができる。このような変異を導入したＨｔｒＡ２は、そのプロテアーゼ活性には変化がないため、活性型ＨｔｒＡ２として用いることができる。一方、プロテアーゼ活性を有さないＨｔｒＡ２を不活性型ＨｔｒＡ２と呼称することがある。不活性型ＨｔｒＡ２として、ＨｔｒＡ２のアミノ酸配列においてＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性に必要な部位のアミノ酸残基に変異を有し、該変異の結果プロテアーゼ活性を示さないＨｔｒＡ２変異体が例示できる。ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性に必要な部位として、プロテアーゼ活性ドメイン、より好ましくは成熟型ＨｔｒＡ２（配列番号４）の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリン残基が挙げられる。不活性型ＨｔｒＡ２として、より具体的には、成熟型ＨｔｒＡ２の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリン残基がアラニンに置換したＨｔｒＡ２変異体（配列番号６、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）と呼称する）が例示できる。また、不活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた蛋白質（配列番号１２、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）と称することがある）または成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した蛋白質（配列番号１４、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）と称することがある）を用いることができる。
【００５４】
本実施例において用いたＳＨＣ３のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。以下、配列番号１６に記載のアミノ酸配列で表されるＳＨＣ３蛋白質を、ＳＨＣ３（ｐ６４）と称することがある。また、ＳＨＣ３（ｐ６４）ＤＮＡの塩基配列を配列番号１５に示す。配列番号１５に記載の塩基配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿０１６８４８に開示されたＳＨＣ３の塩基配列と比較して６つの塩基に相違が認められた（実施例２参照）。また、本発明においては、ＳＨＣ３のスプライシングバリアントであるＳＨＣ３（ｐ５２）を使用した。ＳＨＣ３（ｐ５２）は、ＳＨＣ３遺伝子のコード領域内の２番目のＡＴＧ（１番目のＡＴＧより３６０ｂａｓｅ下流）からコードされる蛋白質である。
【００５５】
本実施例において用いたＡＴＦ６のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。また、ＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列を配列番号１９に示す。配列番号１９に記載の塩基配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿００７３４８に開示されたＡＴＦ６の塩基配列と比較して１５個の塩基に相違が認められた（実施例２参照）。
【００５６】
本実施例において用いたＣＲＥＢＬ１の塩基配列を配列番号１８に示す。また、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列を配列番号１７に示す。配列番号１７に記載の塩基配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿００４３８に開示されたＣＲＥＢＬ１の塩基配列と比較して塩基の１つに相違が認められた（実施例２参照）。
【００５７】
本発明においてＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１並びにこれら各蛋白質をコードする各遺伝子は、上記例示したアミノ酸配列または塩基配列で表される蛋白質または遺伝子に限定されず、一般的に報告されているＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１をいずれも含む。
【００５８】
本発明において使用するＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２との相互作用、およびこれら蛋白質の機能、例えばＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性やＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１の酵素基質としての性質等に影響がなければ、Ｎ末側やＣ末側に別の蛋白質やポリペプチドを、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加したものであってもよい。付加する別の蛋白質やポリペプチドとして、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、ｔａｇペプチド類（Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等）を例示できる。
【００５９】
ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製できる。ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、当該ポリヌクレオチドを適当な発現ＤＮＡベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。
【００６０】
被検化合物として、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、あるいはＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。その他、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２により分解される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。
【００６１】
本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを用いたインビトロにおけるプロテアーゼアッセイ（実施例２）に被検化合物を添加することにより実施できる。活性型である成熟型ＨｔｒＡ２は、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得した成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした大腸菌から調製できる。ＳＨＣ３は、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＳＨＣ３ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＣＲＥＢＬ１は、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＡＴＦ６は、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＡＴＦ６ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨｔｒＡ２は、これら蛋白質をそれぞれ発現させた各細胞の細胞溶解液の可溶性画分に含まれる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１は、好ましくは、それらのＮ末またはＣ末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させ、該タグペプチドに対する抗体で免疫沈降することにより精製して用いることが適当である。例えば、タグペプチドに対する抗体で免疫沈降した後、樹脂（プロテインＧ セファロース等）等に補足したものを使用できる。インビトロにおけるプロテアーゼアッセイは、樹脂等に補足したＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６に、成熟型ＨｔｒＡ２を添加して３７℃で一晩反応させた後、これら蛋白質をウエスタンブロッティングで検出することにより実施できる。ＳＨＣ３およびＡＴＦ６については、３７℃で４時間反応させることにより成熟型ＨｔｒＡ２により分解されるため、プロテアーゼアッセイにおける反応時間を４時間にすることもできる。ウエスタンブロッティングによる検出は、ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６に付加させたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６はＨｔｒＡ２により分解されるため、ウエスタンブロッティングにより検出されるこれら蛋白質の量は、ＨｔｒＡ２を添加しないときと比較して減少または消失する。ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６と成熟型ＨｔｒＡ２との反応に被検化合物を添加し、被検化合物を添加しないときと比較してＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６の量の低減または消失が阻害される場合、該被検化合物はＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害すると判定できる。被検化合物は予めＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６と、あるいは成熟型ＨｔｒＡ２と接触させ、その後、ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６と成熟型ＨｔｒＡ２を反応させることもできる。
【００６２】
また、本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を用いた細胞内プロテアーゼアッセイ（実施例３）に被検化合物を添加することにより実施できる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との細胞での共発現は、上記のように作製したＳＨＣ３ ＤＮＡ、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡおよびＡＴＦ６ ＤＮＡのそれぞれを含む適当なベクターとＨｔｒＡ２ ＤＮＡを含む適当なベクターとを、自体公知の遺伝子工学的手法で動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）にトランスフェクションすることにより実施できる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１は、これら蛋白質のＮ末またはＣ末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させることが、これら蛋白質の検出を容易にするため、好ましい。ＨｔｒＡ２は、活性型ＨｔｒＡ２を用いる。活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２、好ましくはＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）またはＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）を用いることが適当である。成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）は、アポトーシスの阻害に働くＩＡＰｓ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、ＩＡＰｓと結合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアッセイの検討に影響を与える可能性が考えられるため、ＩＡＰｓと結合しない成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）を使用することが好ましい。細胞内プロテアーゼアッセイは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を被検化合物と共に３７℃で４８時間培養後、該細胞を溶解し、その溶解液中に含まれるＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６をウエスタンブロッティングで検出することにより実施できる。ウエスタンブロッティングによる検出は、ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６に付加させたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６はＨｔｒＡ２により分解されるため、ウエスタンブロッティングにより検出されるこれら蛋白質の量は、ＨｔｒＡ２を添加しないときと比較して減少または消失する。被検化合物を添加した場合のＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６の量の低減または消失が、被検化合物を添加しないときと比較して阻害される場合、該被検化合物はＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害すると判定できる。
【００６３】
本発明に係る化合物の同定方法は、上記インビトロにおけるプロテアーゼアッセイや細胞内プロテアーゼアッセイを用いた具体的例示に限定されず、一般的に用いられている医薬品スクリーニングにおいてよく知られている同定方法を用いて実施できる。
【００６４】
本発明に係る化合物の同定方法で得られた化合物は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害剤として利用できる。当該化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製できる。医薬組成物の調製において、これら化合物は、単独で使用することもできるし、組合せて使用することもできる。
【００６５】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解に基づく細胞死の阻害剤に利用できる。好ましくは小胞体ストレスによるの細胞死の阻害剤として有用である。より好ましくは、神経細胞死の阻害剤、さらに好ましくは小胞体ストレスによる神経細胞死の阻害剤として有用である。また、上記化合物は、脳虚血による神経細胞死の阻害剤に利用できる。さらに、これら阻害剤を用いて、小胞体ストレスによる細胞死の阻害方法を実施できる。好ましくは、小胞体ストレスや脳虚血による神経細胞死の阻害方法を実施できる。
【００６６】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解に基づく疾患の防止剤、改善剤および／または治療剤を調製できる。かかる疾患としては、例えば神経細胞死を伴う疾患、より具体的にはアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等を挙げることができる。これら疾患は多くの場合、神経細胞内に異常な蛋白質が凝集体を形成していることが認められており、またこれら疾患における神経細胞死と小胞体ストレスとの関連が報告されている（非特許文献１）。また、上記化合物を用いて、このような疾患の防止方法、改善方法および／または治療方法を実施できる。
【００６７】
本発明に係る疾患の防止剤、治療剤および／または改善剤は、上記化合物、上記分解阻害剤および上記細胞死阻害剤のうち少なくともいずれか１を有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。
【００６８】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００６９】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。
【００７０】
より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。
【００７１】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤等を適宜使用することもできる。
【００７２】
安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。
【００７３】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
【００７４】
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。
【００７５】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。
【００７６】
キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。
【００７７】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。
【００７８】
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ乃至１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００７９】
本発明の医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
【００８０】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与することができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施可能である。
【００８１】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００８２】
さらに本発明は、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢＬ、ＳＨＣ３またはＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチド、およびＳＨＣ３またはＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなるキットを提供する。当該キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。
【００８３】
上記キットは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００８４】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【００８５】
（ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレットに記載の予測方法に従って予測した。すなわち、ＨｔｒＡ２のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＨｔｒＡ２との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＨｔｒＡ２と相互作用すると予測した。
【００８６】
解析の結果、ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、ＣＲＥＢＬ１およびＳＨＣ１を見出した。
【実施例２】
【００８７】
（インビトロ プロテアーゼアッセイ）
ＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６、またはＳＨＣ１のファミリーであるＳＨＣ３とＨｔｒＡ２の相互作用を実験的に検証するために、インビトロにおけるプロテアーゼアッセイを実施した。
【００８８】
＜材料およびその調製＞
本実施例においては、活性型ＨｔｒＡ２および不活性型ＨｔｒＡ２としてそれぞれ、いずれもＣ末Ｔａｇとしてヒスチジン（Ｈｉｓ）を付加した成熟型ＨｔｒＡ２（配列番号４）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）（配列番号６）を用いた。また、ＨｔｒＡ２と相互作用すると予想した蛋白質として、いずれもＣ末Ｔａｇとしてｃ−Ｍｙｃを付加したＳＨＣ３（ｐ６４）（配列番号１６）およびＳＨＣ３（ｐ５２）、並びにいずれもＮ末Ｔａｇとしてｃ−Ｍｙｃを付加したＣＲＥＢＬ１（配列番号１８）およびＡＴＦ６（配列番号２０）を用いた。
【００８９】
１．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）のクローニングおよび発現プラスミドの作製
成熟型ＨｔｒＡ２（前駆体ＨｔｒＡ２（そのＤＮＡ塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１および配列番号２に記載）のアミノ酸残基１３４−４５８部分）をコードする遺伝子を得るために、Ｈｕｍａｎ Ｋｉｄｎｅｙ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、ＨｔｒＡ２−Ｆ１プライマー（５´側にＮｄｅＩ部位とＡＴＧを付加、配列番号２１）とＨｔｒＡ２−ＲＳプライマー（終止コドンを除いてＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２２）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）により成熟型ＨｔｒＡ２遺伝子を増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。また、シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｈｉｔａｃｈｉ：ＡＢＩ３１００）により塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および配列番号４に記載した。成熟型ＨｔｒＡ２大腸菌発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２の遺伝子をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＥＴ２４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組込むことにより取得した。
【００９０】
成熟型ＨｔｒＡ２の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリンをアラニンに置換した変異体（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））は、プロテアーゼ活性を示さないことが報告されている。そこで、不活性型である成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の大腸菌発現プラスミドを、成熟型ＨｔｒＡ２発現プラスミドを鋳型とし、ＨｔｒＡ２−ＭＦプライマー（配列番号２３）とＨｔｒＡ２−ＭＲプライマー（配列番号２４）を用いてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により作製した。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５および配列番号６に記載した。
【００９１】
２．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の発現および精製
成熟型ＨｔｒＡ２大腸菌発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した形質転換体を取得した。この形質転換体を、２６℃にて１００ｍｌのＬＢ培地で培養し、吸光度（ＯＤ）が０．６８〜０．８１に達したときにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭ添加することにより成熟型ＨｔｒＡ２蛋白質の発現誘導を行い、一晩培養した後、成熟型ＨｔｒＡ２を発現している大腸菌を遠心処理により分離回収した。得られた大腸菌を、リシスバッファーＡ（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／１％ トライトンＸ−１００、１μｇ／ｍｌ ペプスタチン、５μＭ Ｅ６４）に懸濁し、氷冷下でソニケーター（１５秒×１０回）により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心処理し（１５，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）、可溶性画分（上清）と不溶性画分に分離した。成熟型ＨｔｒＡ２の含まれる可溶性画分を、あらかじめ１％ トライトンＸ−１００、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて平衡化したプロボンドレジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：１ｍｌ ｐｒｅｐａｃｋｅｄ）に加え、４℃で３０分間混和した後、洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）にて３回洗浄した。レジンに吸着した成熟型ＨｔｒＡ２は、５０、１００、２００、３５０、５００ｍＭ イミダゾールをそれぞれ含む溶出バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）にて段階的に溶出した。各溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、成熟型ＨｔｒＡ２を含む画分を特定した。その結果、３５０−５００ｍＭ イミダゾールで成熟型ＨｔｒＡ２が溶出された。成熟型ＨｔｒＡ２を含む画分を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析した後、遠心処理にて不溶物を除去した上清を濃縮し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準蛋白質としてクマシープラスプロテインアッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、ＰＩＥＲＣＥ社製）により蛋白質を定量した。また成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の発現および精製についても同様に行った。
【００９２】
３．ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のクローニングおよび発現プラスミドの作製
ＳＨＣ３（ｐ６４）については、Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、ＳＨＣ３Ｆ１プライマー（ＡＴＧの直前にＢａｍＨＩ部位とＧＣＣを付加、配列番号２５）とＳＨＣ３Ｒ１プライマー（終止コドンを除いてＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２６）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＳＨＣ３（ｐ６４）遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。本実施例で得られたＳＨＣ３（ｐ６４）ＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＮＭ＿０１６８４８として既に登録された塩基配列と比較して６つの塩基に相違が認められた。相違する６塩基のうち、次の４つはゲノム配列と一致することが判明した：Ｔ１７３Ａ（ＶａｌからＡｓｐへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｇ７８９Ａ（アミノ酸の変化なし）；Ａ８１１Ｇ（ＴｈｒからＡｌａへのアミノ酸の変化を伴う）；およびＡ１６６１Ｇ（ＧｌｎからＡｒｇへのアミノ酸の変化を伴う）。他の２つの相違する塩基は、Ｇ２９１ＣおよびＡ１３３８Ｇであり、これらによるアミノ酸の変化はなかった。本実施例で得られたＳＨＣ３ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１５および配列番号１６に記載した。ＳＨＣ３動物細胞発現プラスミドは、クローニングしたＳＨＣ３遺伝子をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５に組み換えることにより取得した。
【００９３】
ＳＨＣ３のスプライシングバリアントであるＳＨＣ３（ｐ５２）は、ＳＨＣ３遺伝子のコード領域内の２番目のＡＴＧ（１番目のＡＴＧより３６０ｂａｓｅ下流）からコードされる蛋白質である。ＳＨＣ３（ｐ５２）については、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５ＡにクローニングされているＳＨＣ３（ｐ６４）プラスミドをＳａｃＩＩとＸｈｏＩで消化し、ＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＣＭＶ−Ｔａｇ５Ａベクターに挿入し、発現プラスミドを構築した。また発現プラスミドにＳＨＣ３（ｐ５２）遺伝子が挿入されていることを制限酵素で消化することにより確認した。
【００９４】
ＣＲＥＢＬ１については、まずＨｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ｃＤＮＡを鋳型とし、８３−Ｆプライマー（ＡＴＧの直前にＥｃｏＲＩ部位とＧＣＣを付加、配列番号２７）と８３−Ｒプライマー（終止コドンを除いてＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２８）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＣＲＥＢＬ１遺伝子を増幅させ、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５にクローニングした。
【００９５】
次に、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５に組込んだＣＲＥＢＬ１遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６−ＮＦ１プライマー（ＡＴＧを除いてＢａｍＨＩ部位を付加、配列番号２９）とＡＴＦ６−ＮＲ１プライマー（終止コドンの後にＸｈｏＩ部位を付加、配列番号３０）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＣＲＥＢＬ１遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。本実施例で得られたＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＮＭ＿００４３８として既に登録された塩基配列と比較して塩基の１つに相違が認められた（Ｔ４５０Ｃ）。この相違によるアミノ酸の変化はなかった。また、終止コドンがＴＧＡからＴＡＡに変化した。これらの相違はＰＣＲエラーではないことを確認した。本実施例で得られたＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７および配列番号１８に記載した。ＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミドは、クローニングしたＣＲＥＢＬ１遺伝子をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３に組込むことにより取得した。
【００９６】
ＡＴＦ６については、まず、Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆｎプライマー（配列番号３１）とＡＴＦ６Ｒｎプライマー（配列番号３２）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子を増幅させた。次に、この増幅されたＡＴＦ６遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆ１Ｌプライマー（ＡＴＧの直前にＥｃｏＲＶ ｓｉｔｅを付加、配列番号３３）とＡＴＦ６Ｒ１Ｌプライマー（終止コドンの直後にＸｈｏＩ ｓｉｔｅを付加、配列番号３４）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子をさらに増幅させ、ｐｃＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した（配列番号１９）。本実施例で得られたＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＮＭ＿００７３４８として既に登録された塩基配列と比較して１５個の塩基に相違が認められた。相違する１５塩基は全てゲノム配列と一致することが判明した：Ｔ１０５Ｃ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１９９Ａ（ＬｅｕからＭｅｔへのアミノ酸の変化を伴う）；Ａ２０１Ｇ（ＬｅｕからＭｅｔへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｃ２７０Ｔ（アミノ酸の変化なし）；Ａ３０９Ｇ（アミノ酸の変化なし）；Ｃ４３３Ｇ（ＰｒｏからＡｌａへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｔ４６９Ｃ（ＳｅｒからＰｒｏへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｇ１２２８Ａ（ＧｌｙからＳｅｒへのアミノ酸の変化を伴う）；Ａ１２３０Ｃ（ＧｌｙからＳｅｒへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｃ１３８９Ｔ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１４１６Ｃ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１４９１Ａ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１５３８Ｃ（ＶａｌからＡｌａへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｇ１５４０Ｃ（ＶａｌからＬｅｕへのアミノ酸の変化を伴う）；およびＧ１８９６Ａ（アミノ酸の変化なし）。また、全てのアミノ酸の変化に関してＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴではコンフリクトで記載がある。本実施例で得られたＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１９および配列番号２０に記載した。
【００９７】
ＡＴＦ６遺伝子を動物細胞発現ベクターに組込むために、上記のｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングしたＡＴＦ６遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆ２Ｌプライマー（ＡＴＧの直前にＢｇｌＩＩ ｓｉｔｅを付加、配列番号３５）とＡＴＦ６Ｒ１Ｌプライマー（配列番号３４）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子を増幅し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した（配列番号１９）。このクローニングしたＡＴＦ６遺伝子をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで消化し、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化した動物細胞発現ベクターであるｐＣＭＶ−Ｔａｇ３に組込んだ。
【００９８】
４．ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１の発現
トランスフェクション前日に細胞数１．５×１０６／１０ｃｍ ディッシュ（Ｄｉｓｈ）としたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６の各発現プラスミドをＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）にて導入した（１０μｇ／Ｄｉｓｈ）。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのリシスバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ トライトンＸ−１００、１％ ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、コンプリートミニ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ不含））を添加し氷上で１０分間静置した。その後、スクレーパーで細胞を集め、１．５ｍｌのチューブに入れ、氷冷下でソニケーション処理（１５秒×６回）を行い、氷中で２０分静置後、ピペッティングで懸濁し、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）により可溶性画分と不溶性画分を分離した。検討用試料として、可溶性画分を用いた。
【００９９】
５．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の活性の検討
カゼインザイモグラフィーおよびカゼインナトリウムのプロテアーゼアッセイにより成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の活性の検討を行った。カゼインザイモグラフィーはプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に従って実施した。具体的には、成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を非還元下で２×ＳＤＳ サンプルバッファーと等量混合し、室温で１０分静置した後、４〜１６％ ザイモグラム（Ｂｌｕｅ ｃａｓｅｉｎ）ゲル（Ｚｙｍｏｇｒａｍ Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）による分離を行った。泳動終了後、２．５％トライトンＸ−１００にてリネーチャー（ｒｅｎａｔｕｒｅ）した後、ディベロピングバッファー（Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中で３７℃、一晩カゼイン分解反応を行った。
【０１００】
一方、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアッセイは、反応バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中で成熟型ＨｔｒＡ２あるいは成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を２００μｇ／ｍｌ、カゼインナトリウムを４００μｇ／ｍｌの濃度となるように混合し、３７℃でインキュベーションして反応させることにより行った。反応開始３時間後および一晩後に反応液の一部を採取して、２×ＳＤＳ サンプルバッファーと等量混合し煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によりカゼインナトリウムの分解の有無を検出した。
【０１０１】
上記検討の結果、成熟型ＨｔｒＡ２によるカゼインの分解が認められたが、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ではカゼインの分解が認められなかった。このことから、成熟型ＨｔｒＡ２はプロテアーゼ活性を有する活性型であるが、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）はプロテアーゼ活性を示さない不活性型であることが確認できた。
【０１０２】
＜方法＞
可溶性画分に含まれる夾雑蛋白質の影響を除くために免疫沈降にて樹脂にそれぞれ捕捉したＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１を実験に用いた。ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１の各可溶性画分３００μｌを６本のチューブ（Ｎｏ．１−６）に分注し、各チューブにＢＳＡでブロッキングした５０％スラリーのプロテインＧ セファロース ４ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を２０μｌ添加し、４℃で１時間転倒混和後、遠心処理（１０，０００ｒｐｍ、１０秒間、４℃）にて上清を回収し前処理（ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）を行った。
【０１０３】
得られた上清に抗Ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１．７μｌ（２μｇ）添加し、４℃で３時間転倒混和後に、ＢＳＡでブロッキングしたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを２０μｌ添加し４℃で１晩転倒混和し、プロテインＧ セファロース ４ ＦＦにＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１をそれぞれ捕捉した。つぎにＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６が捕捉されたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを５００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００）で５回洗浄した後、Ｎｏ．１および２のチューブには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００を、Ｎｏ．３および４のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２溶液１００μｌを、Ｎｏ．５および６のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）溶液１００μｌをそれぞれ加えた。Ｎｏ．１、３および５のチューブは３７℃で４時間、Ｎｏ．２、４および６のチューブは一晩反応させた後、遠心処理により上清を除去して５００μｌの洗浄バッファーにて３回、遠心洗浄を行い、２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を８０μｌ加え煮沸処理した。得られた試料８０μｌのうち１０μｌを使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜へ転写し、ウエスタンブロッティングにより、ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１を検出した。検出用の１次抗体として抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ社製）を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。また、検出はＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて実施した。
【０１０４】
＜結果＞
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＳＨＣ３（ｐ６４）がいずれも、成熟型ＨｔｒＡ２によりインビトロで分解されることを認めた。図１−Ａに示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。図１−Ｂに示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＡＴＦ６を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した。図１−Ｃに示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ６４）を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少した。また、ＳＨＣ３（ｐ５２）も同様に成熟型ＨｔｒＡ２によりインビトロで分解されることを認めた。
【０１０５】
一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））によるＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＳＨＣ３（ｐ６４）の分解は認められなかった（図１−Ａ、図１−Ｂおよび図１−Ｃ）。また、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））によるＳＨＣ３（ｐ５２）の分解も認められなかった。
【実施例３】
【０１０６】
（細胞内におけるプロテアーゼアッセイ）
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＳＨＣ３（ｐ６４）またはＳＨＣ３（ｐ５２）とＨｔｒＡ２の相互作用を細胞内におけるプロテアーゼアッセイにより検討した。
【０１０７】
＜材料およびその調製＞
成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）は、アポトーシスの阻害に働くＩＡＰｓ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、ＩＡＰｓと結合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアッセイの検討に影響を与える可能性が考えられる。そこで成熟型ＨｔｒＡ２または成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）とＩＡＰｓとの相互作用を阻害するために、Ｎ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させたもの（ΔＡＶＰＳ）または該４残基のうちのアラニンをグリシンに置換したもの（ＡＶＰＳ→ＧＶＰＳ）を成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）についてそれぞれ作製した。これら各種ＨｔｒＡ２はいずれもＣ末ＴａｇとしてＦＬＡＧを付加したものを用いた。
【０１０８】
１．各種ＨｔｒＡ２の調製
成熟型ＨｔｒＡ２の変異体を作製するために、成熟型ＨｔｒＡ２を鋳型とし、センスプライマーとしてＦ１およびＦ２プライマー（ＡＴＧの直前にＳａｃＩ ｓｉｔｅを付加、それぞれ配列番号３６および配列番号３７）を、アンチセンスプライマーには、ＨｔｒＡ２−ＲＳプライマー（配列番号２２）を用い、またＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてＰＣＲ法により、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各動物細胞発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各遺伝子をＳａｃＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に組込むことにより取得した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７および配列番号８に記載した。また、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９および配列番号１０に記載した。
【０１０９】
成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の変異体を作製するために、同様に、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を鋳型とし、ＰＣＲ法により、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各動物細胞発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各遺伝子をＳａｃＩとＸｈｏＩで消化し、それぞれｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に組込むことにより取得した。本実施例で用いた成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１および配列番号１２に記載した。また、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３および配列番号１４に記載した。
【０１１０】
２．各種ＨｔｒＡ２の酵素活性の検討
培養細胞で発現した各種ＨｔｒＡ２に関して、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアッセイにより、その酵素活性を測定した（実施例２参照）。その結果、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）はいずれもプロテアーゼ活性を有する活性型であること、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）はいずれもプロテアーゼ活性を持たない不活性型であることが判明した。
【０１１１】
３．ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１の動物細胞用発現ベクターの作製
実施例２と同様の方法で作製したものを用いた。
【０１１２】
＜方法＞
各種ＨｔｒＡ２と各候補蛋白質（ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１）の発現プラスミドとは、トランスフェクション前日に細胞数５×１０５／６ｃｍ ＤｉｓｈとしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて導入した。各種ＨｔｒＡ２発現プラスミドは各候補蛋白質発現プラスミドのいずれかと組合せて、いずれも１μｇ／Ｄｉｓｈ添加した。４８時間後、各種ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ６４）またはＳＨＣ３（ｐ５２）とを共発現させた細胞は、４００μｌのリシスバッファーＢにより溶解し、遠心処理後、上清に２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を等量加え検討用試料として用いた。一方、各種ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６とを共発現させた細胞は、２００μｌのリシスバッファーＢに２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を等量加え、ソニケーション後、煮沸処理した後に検討用試料として用いた。
【０１１３】
上記各検討用試料１０μｌを用いてウエスタンブロッティングにより、ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１の発現、並びにこれら蛋白質の分解の有無を検出した。検出用の１次抗体として抗ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）抗体を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。検出は、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。
【０１１４】
＜結果＞
プロテアーゼ活性を有する活性型変異体（成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した（図２−Ａの上図）。該活性型変異体とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した（図２−Ｂの上図）。該活性型変異体とＳＨＣ３（ｐ６４）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少した（図２−Ｃの上図）。該活性型変異体とＳＨＣ３（ｐ５２）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドが著しく減少した（図２−Ｄの上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ａの上図）。該不活性型ＨｔｒＡ２変異体とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ｂの上図）。該不活性型ＨｔｒＡ２変異体とＳＨＣ３（ｐ６４）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ｃの上図）。該不活性型ＨｔｒＡ２変異体とＳＨＣ３（ｐ５２）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ｄの上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（図２−ＡおよびＢの下図）。
【０１１５】
このように、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）はいずれも、活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）により細胞内で分解されることが明らかになった。一方、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）はいずれも、不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）または不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）では分解されなかった。
【実施例４】
【０１１６】
（ＨｔｒＡ２による分解パターンの検討）
ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）またはＳＨＣ３（ｐ５２）のＨｔｒＡ２による分解パターンを検討した。検討は、ビオチン化したＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）またはＳＨＣ３（ｐ５２）を用いて、ＨｔｒＡ２によるインビトロプロテアーゼアッセイにより行った。
【０１１７】
＜材料およびその調製＞
１．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）
成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）は、実施例２と同様の方法で調製したものを用いた。
【０１１８】
２．ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の各動物細胞発現プラスミド
ＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミドは、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターに実施例２と同様の方法でクローニングしたＣＲＥＢＬ１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓに組込むことにより取得した。
ＳＨＣ３（ｐ６４）動物細胞発現プラスミドは、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターに実施例２と同様の方法でクローニングしたＳＨＣ３（ｐ６４）をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓに組込むことにより取得した。
ＳＨＣ３（ｐ５２）動物細胞発現プラスミドは、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５に実施例２と同様の方法で組込んだＳＨＣ３（ｐ５２）をＰｖｕＩＩとＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓにライゲーションすることにより取得した。
【０１１９】
３．インビトロ翻訳反応系を用いたビオチン化ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の調製
ビオチンで標識されたＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の調製は、ウサギ網状赤血球ライセート（ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ）を用いたインビトロ翻訳反応系（ＴＮＴ登録商標 Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で行った。
具体的にはまず、インビトロ翻訳反応溶液（ＴＮＴ登録商標 Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）４０μｌに各発現プラスミド（１μｇ／μｌ）１．５μｌ、１ｍＭ メチオニン１μｌ、ビオチン化リジンｔＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、ヌクレアーゼを含まない水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）６．５μｌを加えて全量５０μｌとし、３０℃で１．５時間反応させた。その後、反応液５０μｌから１２．５μｌを採取し、２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウエスタンブロッティングにより、ビオチンでラベルされたＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の発現を検出した。検出は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて行った。その結果、いずれもビオチン化されていることが確認できた。
【０１２０】
＜方法＞
上記反応液をプロテアーゼアッセイの試料として用いた。反応液を１２．５μｌずつ３本のチューブ（Ｎｏ．２−４）に分注した。Ｎｏ．２のチューブにはコントロールとして、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２５μｌ、Ｎｏ．３のチューブには２００μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２溶液を２５μｌ、Ｎｏ．４のチューブには２００μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）溶液２５μｌをそれぞれ加え混合した。各チューブ（Ｎｏ．２−４）をさらに半量ずつ分注し、１つのチューブは３７℃で４時間反応し、もう一方のチューブは、３７℃で一晩反応させた。反応後、各チューブに２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウエスタンブロッティングにより、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）の分解パターンを検出した。
【０１２１】
分解の検出は、各蛋白質内部のビオチン化されたリジン残基を指標にして、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて行った。
【０１２２】
さらに分解箇所を調べる為、ウエスタンブロッティングに用いたメンブレンから、ストレプトアビジン−ＨＲＰを除去し、各蛋白質に付加されたＴａｇに対する抗体で、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の分解パターンを検出した。ＳＨＣ３の検出には、１次抗体として抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、２次抗体としてＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。ＣＲＥＢＬ１の検出には、１次抗体として抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、２次抗体としてＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。分解の検出は、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて行った。
【０１２３】
＜結果＞
蛋白質内部のビオチン化されたリジン残基を指標に、成熟型ＨｔｒＡ２によるＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）またはＳＨＣ３（ｐ５２）の分解パターンを検討した結果を、それぞれ図３−Ａ、図３−Ｂおよび図３−Ｃに示した。また、それぞれの蛋白質のＮ末またはＣ末に付加されたＴａｇを指標として、ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の分解パターンを検討した結果を、それぞれ図４−Ａ、図４−Ｂおよび図４−Ｃに示した。
【０１２４】
ＣＲＥＢＬ１については、ビオチン化されたリジン残基を指標にした分解パターンの検討において、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの著しい減少が認められ、さらに５０ｋＤａ近辺にＣＲＥＢＬ１分解産物と考えられるバンドが検出された（図３−Ａ）。しかし、抗Ｔａｇ抗体による分解パターンの検討では、図３−Ａで認められた５０ｋＤａ近辺のＣＲＥＢＬ１分解産物と考えられるバンドだけでなく、別のサイズのＣＲＥＢＬ１分解産物を示すバンドも全く検出できなかった（図４−Ａ）。このことから、ＣＲＥＢＬ１はＨｔｒＡ２により数箇所で分解されたと考えられる。
【０１２５】
ＳＨＣ３（ｐ６４）については、ビオチン化されたリジン残基を指標にした分解パターンの検討において、ビオチン化ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドの著しい減少が認められ、さらに７０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ近辺にＳＨＣ３（ｐ６４）分解産物と考えられるバンドが検出された（図３−Ｂ）。抗Ｔａｇ抗体による分解パターンの検討においても、同様のバンドが検出された（図４−Ｂ）。このことから、ＳＨＣ３（ｐ６４）は、２箇所以上で成熟型ＨｔｒＡ２により分解された可能性がある。
【０１２６】
ＳＨＣ３（ｐ５２）については、ビオチン化されたリジン残基を指標にした分解パターンの検討において、ビオチン化ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドの著しい減少が認められたが、ＳＨＣ３（ｐ５２）分解産物と考えられるバンドは検出できなかった（図３−Ｃ）。しかし、抗Ｔａｇ抗体による分解パターンの検討において、４０ｋＤａ近辺にＳＨＣ３（ｐ５２）分解産物と考えられるバンドが検出された（図４−Ｃ）。このことから、ＳＨＣ３（ｐ５２）はＨｔｒＡ２により数箇所で分解されたと考えられる。
【０１２７】
このように、蛋白質内部を標識化して標識物質を検出することにより、ＨｔｒＡ２による上記蛋白質の分解が検出された。このことから、各蛋白質のＮ末またはＣ末に付加したＴａｇの検出により明らかになったＨｔｒＡ２による蛋白質の分解（実施例２および３）は、Ｔａｇが切断分離されたことによる見かけ上の分解ではなく、ＨｔｒＡ２が各蛋白質の内部に作用した結果生じた分解であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解に基づく細胞死の阻害、例えば神経細胞の細胞死の阻害、並びに神経細胞死を伴う疾患、例えば神経変性疾患の防止、治療または改善のために利用可能であり、医薬分野において非常に有用性が高い。さらにＨｔｒＡ２による細胞死、例えば小胞体ストレスによる細胞死、例えば神経細胞死の解明等の研究分野にも利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２９】
配列番号１：ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質をコードするＤＮＡ。
配列番号２：ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質。
配列番号３：成熟型ＨｔｒＡ２をコードするＤＮＡ。
配列番号４：成熟型ＨｔｒＡ。
配列番号５：配列番号３と同じ塩基配列であってその５２０位の塩基がｇである塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）をコードするＤＮＡ。
配列番号６：配列番号４と同じアミノ酸配列であって１７４番目のアミノ酸残基がＡｌａに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）。
配列番号７：配列番号３と同じ塩基配列であってその４−１５位の塩基を欠失させた塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号８：配列番号４と同じアミノ酸配列であって２−５番目のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）。
配列番号９：配列番号３に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその５位の塩基がｇであるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１０：配列番号４と同じアミノ酸配列であって２番目のアミノ酸残基がＧｌｙに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）。
配列番号１１：配列番号５と同じ塩基配列であってその４−１５位の塩基を欠失させた塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１２：配列番号６と同じアミノ酸配列であって２−５番目のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）。
配列番号１３：配列番号５に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその５位の塩基がｇであるポリヌクレオチド成熟型；ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１４：配列番号６と同じアミノ酸配列であって２番目のアミノ酸残基がＧｌｙに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）。
配列番号１５：ＳＨＣ３をコードするＤＮＡ。
配列番号１６：ＳＨＣ３。
配列番号１７：ＣＲＥＢＬ１をコードするＤＮＡ。
配列番号１８：ＣＲＥＢＬ１。
配列番号１９：ＡＴＦ６をコードするＤＮＡ。
配列番号２０：ＡＴＦ６。
配列番号２１：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２２：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２３：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２４：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２５：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＳＨＣ３ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２６：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＳＨＣ３ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２７：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２８：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２９：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３０：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３１：配列番号１９に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３２：配列番号１９に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３３：配列番号１９に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３４：配列番号１９に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３５：配列番号１９に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３６：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３７：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＨＣ３（サーク ホモロジー ２ ドメイン コンテイニング トランスフォーミング プロテイン Ｃ３、ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ３）、ＡＴＦ６（アクティベーティング トランスクリプション ファクター ６、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ６）およびＣＲＥＢＬ１（サイクリックＡＭＰ レスポンシブ エレメント バインディング プロテイン ライク １、ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ １）のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２（ハイ テンパレイチャー リクワイアメント プロテイン Ａ２、ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２）による分解の阻害に関する。より具体的には、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする神経細胞死阻害方法、あるいは該分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする神経細胞死阻害方法に関する。また、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする脳虚血障害または神経変性疾患の防止方法、治療方法または改善方法に関する。さらに、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法に関する。また、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる神経細胞死阻害剤に関する。さらに、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる脳虚血障害または神経変性疾患の防止剤、治療剤または改善剤に関する。また、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢＬ１、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチド、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
生物は、細胞の生存とアポトーシス（細胞死）を調節することにより外界のストレスから身を守るが、生存とアポトーシス制御機構の調節の乱れによる過剰な細胞死は、種々の疾患を招く可能性がある（非特許文献１）。
【０００３】
近年、ストレスを感知し調節する場としてミトコンドリアや小胞体の研究が進み、ミトコンドリア膜に局在するＨｔｒＡ２蛋白質（以下、ＨｔｒＡ２と称する）は、ＵＶや熱ショック等のストレスによりミトコンドリア膜から細胞質へ移行し（非特許文献２−５）、カスパーゼ依存的な細胞死とカスパーゼ非依存的な細胞死の二つの細胞死を誘導することが報告された（非特許文献６）。ＨｔｒＡ２は、前駆体蛋白質（配列番号２）からＮ末１３３アミノ酸が切り離された成熟型（配列番号４）になり、ミトコンドリアから細胞質に移行する。成熟型ＨｔｒＡ２はプロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有するＨｔｒＡ２を活性型ＨｔｒＡ２と称することもある。
【０００４】
カスパーゼ非依存的な細胞死は、ＨｔｒＡ２自身のセリンプロテアーゼとしての性質に依存し、その前駆体蛋白質のアミノ酸配列中３０６番目（成熟型においては１７４番目に相当する）のセリンをアラニンに置換したＨｔｒＡ２変異体によりカスパーゼ非依存的な細胞死は引き起こされないことが知られている（非特許文献３−５）。かかるＨｔｒＡ２変異体はプロテアーゼ活性を有さない。以下、プロテアーゼ活性を有さないＨｔｒＡ２を不活性型ＨｔｒＡ２と称することもある。このようにＨｔｒＡ２は、カスパーゼ非依存的な細胞死を誘導する機構において重要な役割を担う因子である。
【０００５】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【非特許文献１】「細胞工学」、２００２年、第２１巻、第４号、ｐ．３６０−３９４。
【非特許文献２】ヤマグチ（Ｈ．Ｙａｍａｇｕｃｈｉ）ら、「キャンサー リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２００３年、第６３巻、ｐ．１４８３−１４８９。
【非特許文献３】スズキ（Ｙ．Ｓｕｚｕｋｉ）ら、「モレキュラー セル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ）」、２００１年、第８巻、ｐ．６１３−６２１。
【非特許文献４】ヘッジ（Ｒ．Ｈｅｇｄｅ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４３２−４３８。
【非特許文献５】マーチンズ（Ｌ．Ｍ．Ｍａｒｔｉｎｓ）ら、「ザ ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、２００２年、第２７７巻、ｐ．４３９−４４４。
【非特許文献６】「実験医学」、２００２年、第２０巻、第１号、ｐ．７３−７５。
【非特許文献７】コンティ（Ｌ．Ｃｏｎｔｉ）ら、「ネイチャー ニューロサイエンス（Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）」、２００１年、第４巻、ｐ．５７９−５８６。
【非特許文献８】「生化学」、２００１年、第７３巻、第１１号、ｐ．１３２２−１３２５。
【非特許文献９】カウフマン（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ）ら、「ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）」、２００２年、第１１０巻、ｐ．１３８９−１３９８。
【非特許文献１０】ハゼ（Ｋ．Ｈａｚｅ）ら、「ザ バイオケミカル ジャーナル（Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）、２００１年、第３５５巻、ｐ．１９−２８。
【非特許文献１１】ウルマー（Ｋ．Ｍ．Ｕｌｍｅｒ）、「サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）」、１９８３年、第２１９巻、ｐ．６６６−６７１。
【非特許文献１２】「ペプチド合成」、丸善株式会社、１９７５年。
【非特許文献１３】「ペプチド シンテシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、インターサイエンス（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、１９９６年。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これまでに神経変性疾患におけるカスパーゼ非依存的な細胞死についての報告が多数公表されている。一方、脳虚血においては、小胞体ストレスを介して神経細胞死が引き起こされることが報告されている。カスパーゼ非依存的な細胞死を誘導する機構において、ＨｔｒＡ２が重要な役割を担うと考えられている。これらからＨｔｒＡ２が、神経変性疾患の新たな標的となる可能性が高く、また小胞体ストレスによる神経細胞死を阻害することは、新規な創薬標的になると考えられる。
【０００７】
本発明の課題は、ＨｔｒＡ２によるカスパーゼ非依存的な細胞死の機構およびＨｔｒＡ２の基質が未だ明らかになっていない状況において、ＨｔｒＡ２と相互作用する蛋白質を見出し、ＨｔｒＡ２による該蛋白質の分解に基づく疾患の防止および／または治療を可能にする手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、ＨｔｒＡ２がＣＲＥＢＬ１およびＳＨＣ１と相互作用することをインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で予測し、さらに活性型ＨｔｒＡ２によりＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６、およびＳＨＣ１のファミリーであるＳＨＣ３が分解されることを実験的に証明して本発明を完成した。
【０００９】
すなわち本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする神経細胞死阻害方法に関する。
【００１０】
また本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする神経細胞死阻害方法に関する。
【００１１】
さらに本発明は、神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である前記神経細胞死阻害方法に関する。
【００１２】
さらにまた本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする脳虚血障害または神経変性疾患の防止方法、治療方法または改善方法に関する。
【００１３】
また本発明は、神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病または筋萎縮性側索硬化症である前記防止方法、治療方法または改善方法に関する。
【００１４】
さらに本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを化合物と接触させ、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１を検出することができるシグナルおよび／マーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／マーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、化合物が、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
【００１５】
さらにまた本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを化合物と接触させ、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、あるいは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、化合物が、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法に関する。
【００１６】
また本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる神経細胞死阻害剤に関する。
【００１７】
さらに本発明は、神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である前記神経細胞死阻害剤に関する。
【００１８】
さらにまた本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる脳虚血障害または神経変性疾患の防止剤、治療剤または改善剤に関する。
【００１９】
また本発明は、神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病または筋萎縮性側索硬化症である前記神経変性疾患の防止剤、治療剤または改善剤に関する。
【００２０】
さらに本発明は、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢＬ１、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチド、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、これら蛋白質のうちの少なくとも１の減少または消失を阻害することができ、その結果、細胞死（例えば神経細胞の細胞死）の阻害並びに細胞死を伴う疾患（例えば脳虚血障害や神経変性疾患）の防止、治療または改善が可能になる。
【００２２】
ＳＨＣ３は成熟した中枢神経細胞に特異的に発現し、神経細胞の分化と生存に重要な役割を果たしていると考えられる（非特許文献７および８）。ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１は、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導し、細胞における小胞体ストレスの回復とその生存に関与していると考えられている（非特許文献９および１０）。これらから、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１がＨｔｒＡ２により分解されて減少または消失することにより、ストレス等による細胞死、例えば神経細胞の細胞死が亢進すると考えられる。したがって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害してその減少または消失を阻害することにより、細胞死（例えば神経細胞の細胞死）の阻害並びに細胞死を伴う疾患（例えば脳虚血障害や神経変性疾患）の防止、治療または改善が可能になる。
【００２３】
また本発明により、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法を実施できる。本同定方法で得られた化合物は、細胞死（例えば神経細胞の細胞死）の阻害糖尿病の並びに細胞死を伴う疾患（例えば脳虚血障害や神経変性疾患）の防止、治療または改善に使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−Ａ】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＣＲＥＢＬ１がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められなかった。（実施例２）
【００２５】
【図１−Ｂ】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＡＴＦ６がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＡＴＦ６を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＡＴＦ６の分解が認められなかった。（実施例２）
【００２６】
【図１−Ｃ】活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＳＨＣ３（ｐ６４）がインビトロで分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ６４）を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少した。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＳＨＣ３（ｐ６４）の分解が認められなかった。（実施例２）
【００２７】
【図２−Ａ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＣＲＥＢＬ１が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００２８】
【図２−Ｂ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＡＴＦ６が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００２９】
【図２−Ｃ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＳＨＣ３（ｐ６４）が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＳＨＣ３（ｐ６４）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＳＨＣ３（ｐ６４）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００３０】
【図２−Ｄ】活性型ＨｔｒＡ２変異体（活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）のＮ末４アミノ酸残基を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型ＨｔｒＡ２のＮ末のアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））により、ＳＨＣ３（ｐ５２）が細胞内で分解されたことを説明する図である（上図）。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）とＳＨＣ３（ｐ５２）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドが著しく減少した（上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＳＨＣ３（ｐ５２）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドの減少は認められなかった（上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（下図）。（実施例３）
【００３１】
【図３−Ａ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を用いて、ビオチンを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によるＣＲＥＢＬ１の分解が検出されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少し、５０ｋＤａ近辺にＣＲＥＢＬ１分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められず、上記５０ｋＤａ近辺のバンドも検出されなかった。（実施例４）
【００３２】
【図３−Ｂ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ６４）を用いて、ビオチンを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によるＳＨＣ３（ｐ６４）の分解が検出されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ６４）を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ビオチン化ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少し、７０ｋＤａ、４０ｋＤａおよび３０ｋＤａ近辺にＳＨＣ３（ｐ６４）分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＳＨＣ３（ｐ６４）の分解が認められず、上記７０ｋＤａ、４０ｋＤａおよび３０ｋＤａ近辺のバンドも検出されなかった。（実施例４）
【００３３】
【図３−Ｃ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ５２）を用いて、ビオチンを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によるＳＨＣ３（ｐ５２）の分解が検出されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ５２）を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ビオチン化ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドが著しく減少したが、ＳＨＣ３（ｐ５２）分解産物を示すと考えられるバンドは検出されなかった。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＳＨＣ３（ｐ５２）の分解が認められなかった。（実施例４）
【００３４】
【図４−Ａ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＮ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を用いて、Ｎ末に付加されたＴａｇを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＣＲＥＢＬ１が分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、Ｎ末にＴａｇが付加されたＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。図３で検出された５０ｋＤａ近辺のＣＲＥＢＬ１分解産物を示すと考えられるバンドは、抗Ｔａｇ抗体では検出されなかった。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＣＲＥＢＬ１の分解が認められなかった。（実施例４）
【００３５】
【図４−Ｂ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＣ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ６４）を用いて、Ｃ末に付加されたＴａｇを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＳＨＣ３（ｐ６４）が分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ６４）を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、Ｃ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少し、７０ｋＤａ、４０ｋＤａおよび３０ｋＤａ近辺にＳＨＣ３（ｐ６４）分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＳＨＣ３（ｐ６４）の分解は認められなかった。（実施例４）
【００３６】
【図４−Ｃ】蛋白質内部のリジン残基がビオチン化され且つＣ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ５２）を用いて、Ｃ末に付加されたＴａｇを検出することにより、活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２）によりＳＨＣ３（ｐ５２）が分解されたことを説明する図である。活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ５２）を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、Ｃ末にＴａｇが付加されたＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドが著しく減少し、４０ｋＤａ近辺にＳＨＣ３（ｐ５２）分解産物を示すと考えられるバンドが検出された。一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））ではＳＨＣ３（ｐ５２）の分解は認められなかった。（実施例４）
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第２００３−３４２５８８号からの優先権を主張するものである。
【００３８】
本明細書においては単離された若しくは合成の完全長蛋白質；単離された若しくは合成の完全長ポリペプチド；または単離された若しくは合成の完全長オリゴペプチドを意味する総称的用語として「ポリペプチド」という用語を使用することがある。ここで蛋白質、ポリペプチド若しくはオリゴペプチドはペプチド結合または修飾されたペプチド結合により互いに結合している２個以上のアミノ酸を含むものである。以降、アミノ酸を表記する場合、１文字または３文字にて表記することがある。
【００３９】
本発明においては、ＨｔｒＡ２がＣＲＥＢＬ１およびＳＨＣ１と相互作用することを、国際公開ＷＯ０１／６７２９９号パンフレット記載の方法に従ってインシリコで予測した。さらに実験的に、ＨｔｒＡ２によりＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６、およびＳＨＣ１のファミリーであるＳＨＣ３が分解されることを初めて明らかにした。
【００４０】
ＳＨＣ３は、Ｎ−ＳｈｃあるいはＳｈｃＣとも称され、成熟した中枢神経細胞に特異的に発現している。ＳＨＣ３は、神経栄養因子（ＮＧＦやＥＧＦ等）により活性化されたレセプターチロシンキナーゼであるＴｒｋファミリー（Ｔｒｋ ｆａｍｉｌｙ）からのシグナルを伝達し、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−Ｂａｄ経路を通じて神経細胞の分化と生存に重要な役割を果たしていると考えられている。またＳＨＣ３のＳＨドメインのみ（ｄｏｍｉｎａｎｔ ｎｅｇａｔｉｖｅ）を発現させた細胞では、細胞死が引き起こされ、神経突起の伸長が妨げられることが報告されている（非特許文献７および８）。
【００４１】
ＣＲＥＢＬ１は、ＡＴＦ６ファミリーの１つであり、ＡＴＦ６βとも称される。ＣＲＥＢＬ１は小胞体に局在し、小胞体ストレスによりＳ１Ｐ、Ｓ２Ｐによりプロセッシングを受けて一部が核移行し、転写因子として働くことが知られている。
【００４２】
ＣＲＥＢＬ１およびＡＴＦ６はいずれも、小胞体ストレスを感知してシャペロン遺伝子群の転写を誘導することによりストレスに対する細胞の回復と生存に寄与することが知られている（非特許文献９および１０）。また、小胞体ストレスと神経変性疾患の関連性がいくつかの論文で報告されている（非特許文献１）。
【００４３】
これらから、神経細胞において過剰なストレス（例えば小胞体ストレス）により活性化されたＨｔｒＡ２により、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１が分解されて減少または消失することにより、神経細胞の分化・生存シグナル経路の破綻が生じ、その結果、神経細胞死が亢進されると考える。
【００４４】
したがって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより細胞死を阻害できる。さらに、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより細胞死を伴う疾患の防止および／または治療が可能になる。例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することにより、神経細胞の細胞死、例えば小胞体ストレスによる神経細胞死を阻害できる。さらには神経細胞死を伴う疾患、例えば神経変性疾患や脳虚血障害の防止、治療または改善が可能になる。また、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害剤は、神経変性疾患や脳虚血障害の治療薬になる可能性が考えられる。
【００４５】
これら知見に基づいて本発明においては、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害方法を提供する。さらに、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする神経細胞死阻害方法を提供する。本発明に係る神経細胞死阻害方法は、好ましくはインビトロで実施することができる。本発明においてはまた、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解に基づく疾患の防止方法、治療方法または改善方法を提供する。
【００４６】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害はＨｔｒＡ２の作用を阻害することにより実施できる。例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害することにより実施できる。あるいは、ＨｔｒＡ２の酵素活性を阻害することにより実施できる。好ましくは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを含む生体外試料において、ＨｔｒＡ２の作用を阻害することによりＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害できる。ここでは、このような阻害効果を有する物質（後述する例として競合阻害効果を有するポリペプチド類、抗体および低分子化合物等が挙げられる）を阻害剤と称する。また、本明細書中で、「ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２が相互作用する」とは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２がある様式により互いに作用を及ぼし、その結果、具体的にはＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１がＨｔｒＡ２により分解されることを意味する。前記「ある様式」とは、結合、接触あるいは近接等を含むものであり、結果として互いに作用を及ぼし得る様式であればいずれのものであってもよい。
【００４７】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害は具体的には、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２の相互作用を阻害する化合物を用いて実施できる。かかる化合物として、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢＬ１またはＨｔｒＡ２の各アミノ酸配列においてＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを例示できる。特に、ＨｔｒＡ２の基質となるＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１由来のかかるポリペプチドは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２の蛋白質間相互作用を競合的に阻害し、ＨｔｒＡ２によるこれら各蛋白質の分解を阻害できる。このようなポリペプチドは、ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のアミノ酸配列から設計し、自体公知のペプチド合成法により合成したものから、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害するものを選択することにより取得できる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２により分解される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、かかるポリペプチドとして好適である。このように特定されたポリペプチドに、１個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入したものも本発明の範囲に包含される。このような変異を導入したポリペプチドは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害するものが好ましい。変異を有するポリペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。欠失、置換、付加または挿入等の変異を導入する手段は自体公知であり、例えばウルマー（Ｕｌｍｅｒ）の技術（非特許文献１１）を利用して実施できる。このような変異の導入において、当該ポリペプチドの基本的な性質（物性、機能または免疫学的活性等）を変化させないという観点から、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。さらに、これら利用できるポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変できる。
【００４８】
上記ポリペプチドは、ペプチド化学において知られる一般的な方法で製造できる。例えば、成書（非特許文献１２および１３）に記載の方法が例示されるが、これらに限らず公知の方法が広く利用できる。具体的には、通常の液相法および固相法によるペプチド合成法、例えばＦｍｏｃ法等が挙げられる。または市販のアミノ酸合成装置を用いて上記ポリペプチドを製造できる。あるいは遺伝子工学的手法により上記ポリペプチドを取得することもできる。例えば目的とするポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現できる組換え発現ベクターを作成し、これを適当な宿主細胞、例えば大腸菌にトランスフェクションして形質転換した後に該形質転換体を培養し、次いで得られる培養物から目的とするポリペプチドを回収することにより製造できる。
【００４９】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解の阻害は、ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１を認識する抗体であって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する抗体を用いることによっても実施できる。かかる抗体は、ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１自体、あるいはＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２が相互作用する部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドを抗原として自体公知の抗体作製法により取得できる。
【００５０】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解の阻害は、ＨｔｒＡ２の酵素活性を阻害する化合物、好ましくは特異的に阻害する化合物により実施できる。かかる化合物は、例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１を基質として、ＨｔｒＡ２による当該基質の分解を阻害するものを同定することにより取得できる。ＨｔｒＡ２を特異的に阻害するとは、ＨｔｒＡ２を強く阻害するが、他の酵素は阻害しないか、弱く阻害することを意味する。
【００５１】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して構築できる。例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件を選択し、当該条件下でＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２を、調べようとする化合物（被検化合物）と接触させ、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解を検出し得るシグナルおよび／またはマーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／またはマーカーの存在若しくは不存在または変化を検出することにより、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を同定できる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件は、インビトロのものであってよく、インビボのものであってもよい。例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を用いることもできる。細胞における共発現は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターとを用いて慣用の遺伝子工学的手法でこれらを細胞にトランスフェクションすることにより達成できる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、単独で用いることができるし、組合せて用いることもできる。細胞は、真核細胞、好ましくは動物細胞、より好ましくは動物培養細胞株、さらに好ましくは哺乳動物培養細胞株を用いることができる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１および／またはＨｔｒＡ２と被検化合物との接触は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の反応以前に行なってもよいし、該分解の反応に共存させることにより行なってもよい。ここでマーカーとは、それ自体は物理的または化学的性質により検出され得ないが、化学的反応を経ることにより前記シグナルを生成させるものであって、該生成されるシグナルの物理的、化学的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを指す。シグナルおよび／またはマーカーとして、レポーター遺伝子（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等）、放射性同位体、タグペプチド類（Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇまたはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等）、ＧＳＴ等の酵素類、ビオチン、および蛍光蛋白質等、公知のものが利用できるが、これら例示に限らず、一般的に化合物の同定方法に用いられている標識物質であれば、いずれも利用できる。これらシグナルおよび／またはマーカーの検出方法は当業者には周知である。簡便には、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解は、これら蛋白質またはこれら蛋白質の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の検出により測定できる。これら蛋白質量またはこれら蛋白質の分解物量の定量は、自体公知の蛋白質またはペプチドの検出方法、例えばウェスタンブロッティング等を用いて実施できる。
【００５２】
ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１はいずれも公知蛋白質であり、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）にそれぞれアクセッションナンバーＮＭ＿０１３２４７、ＮＭ＿０１６８４８、ＮＭ＿００７３４８およびＮＭ＿００４３８として開示されている。
【００５３】
本実施例において用いたＨｔｒＡ２のアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＨｔｒＡ２ ＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示す。配列番号４に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドは、成熟型ＨｔｒＡ２である。成熟型ＨｔｒＡ２とは、ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質（配列番号２）からＮ末１３３アミノ酸残基が切り離されて生じた成熟型蛋白質であり、プロテアーゼ活性を有する。以下、プロテアーゼ活性を有するＨｔｒＡ２を活性型ＨｔｒＡ２と呼称することがある。また、活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた蛋白質（配列番号８、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）と称することがある）または成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した蛋白質（配列番号１０、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）と称することがある）を用いることができる。このような変異を導入したＨｔｒＡ２は、そのプロテアーゼ活性には変化がないため、活性型ＨｔｒＡ２として用いることができる。一方、プロテアーゼ活性を有さないＨｔｒＡ２を不活性型ＨｔｒＡ２と呼称することがある。不活性型ＨｔｒＡ２として、ＨｔｒＡ２のアミノ酸配列においてＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性に必要な部位のアミノ酸残基に変異を有し、該変異の結果プロテアーゼ活性を示さないＨｔｒＡ２変異体が例示できる。ＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性に必要な部位として、プロテアーゼ活性ドメイン、より好ましくは成熟型ＨｔｒＡ２（配列番号４）の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリン残基が挙げられる。不活性型ＨｔｒＡ２として、より具体的には、成熟型ＨｔｒＡ２の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリン残基がアラニンに置換したＨｔｒＡ２変異体（配列番号６、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）と呼称する）が例示できる。また、不活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた蛋白質（配列番号１２、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）と称することがある）または成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した蛋白質（配列番号１４、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）と称することがある）を用いることができる。
【００５４】
本実施例において用いたＳＨＣ３のアミノ酸配列を配列番号１６に示す。以下、配列番号１６に記載のアミノ酸配列で表されるＳＨＣ３蛋白質を、ＳＨＣ３（ｐ６４）と称することがある。また、ＳＨＣ３（ｐ６４）ＤＮＡの塩基配列を配列番号１５に示す。配列番号１５に記載の塩基配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿０１６８４８に開示されたＳＨＣ３の塩基配列と比較して６つの塩基に相違が認められた（実施例２参照）。また、本発明においては、ＳＨＣ３のスプライシングバリアントであるＳＨＣ３（ｐ５２）を使用した。ＳＨＣ３（ｐ５２）は、ＳＨＣ３遺伝子のコード領域内の２番目のＡＴＧ（１番目のＡＴＧより３６０ｂａｓｅ下流）からコードされる蛋白質である。
【００５５】
本実施例において用いたＡＴＦ６のアミノ酸配列を配列番号２０に示す。また、ＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列を配列番号１９に示す。配列番号１９に記載の塩基配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿００７３４８に開示されたＡＴＦ６の塩基配列と比較して１５個の塩基に相違が認められた（実施例２参照）。
【００５６】
本実施例において用いたＣＲＥＢＬ１の塩基配列を配列番号１８に示す。また、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列を配列番号１７に示す。配列番号１７に記載の塩基配列は、アクセッションナンバーＮＭ＿００４３８に開示されたＣＲＥＢＬ１の塩基配列と比較して塩基の１つに相違が認められた（実施例２参照）。
【００５７】
本発明においてＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１並びにこれら各蛋白質をコードする各遺伝子は、上記例示したアミノ酸配列または塩基配列で表される蛋白質または遺伝子に限定されず、一般的に報告されているＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１をいずれも含む。
【００５８】
本発明において使用するＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１は、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞や生体試料から調製したもの、無細胞系合成産物または化学合成産物であってよく、あるいはこれらからさらに精製されたものであってもよい。また、ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１を遺伝子工学的手法で発現させた細胞を使用することもできる。ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１とＨｔｒＡ２との相互作用、およびこれら蛋白質の機能、例えばＨｔｒＡ２のプロテアーゼ活性やＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１の酵素基質としての性質等に影響がなければ、Ｎ末側やＣ末側に別の蛋白質やポリペプチドを、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加したものであってもよい。付加する別の蛋白質やポリペプチドとして、β−ガラクトシダーゼ、ＩｇＧ等の免疫グロブリンＦｃ断片、ｔａｇペプチド類（Ｈｉｓ−ｔａｇ、Ｍｙｃ−ｔａｇ、ＨＡ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、またはＸｐｒｅｓｓ−ｔａｇ等）を例示できる。
【００５９】
ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチドは、ヒトｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により調製できる。ＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、当該ポリヌクレオチドを適当な発現ＤＮＡベクター、例えば細菌プラスミド由来のベクターに自体公知の遺伝子工学的手法で導入することにより得られる。
【００６０】
被検化合物として、例えば化学ライブラリーや天然物由来の化合物、あるいはＨｔｒＡ２、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１の一次構造や立体構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等が挙げられる。その他、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２により分解される部位のアミノ酸配列からなるポリペプチドの構造に基づいてドラッグデザインして得られた化合物等も被検化合物として好適である。
【００６１】
本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを用いたインビトロにおけるプロテアーゼアッセイ（実施例２）に被検化合物を添加することにより実施できる。活性型である成熟型ＨｔｒＡ２は、ヒト腎臓ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得した成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした大腸菌から調製できる。ＳＨＣ３は、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＳＨＣ３ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＣＲＥＢＬ１は、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＡＴＦ６は、ヒト乳腺ｃＤＮＡライブラリーから自体公知の遺伝子工学的手法により取得したＡＴＦ６ ＤＮＡを含む適当なベクターをトランスフェクションした動物細胞（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）から調製できる。ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＨｔｒＡ２は、これら蛋白質をそれぞれ発現させた各細胞の細胞溶解液の可溶性画分に含まれる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１は、好ましくは、それらのＮ末またはＣ末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させ、該タグペプチドに対する抗体で免疫沈降することにより精製して用いることが適当である。例えば、タグペプチドに対する抗体で免疫沈降した後、樹脂（プロテインＧ セファロース等）等に補足したものを使用できる。インビトロにおけるプロテアーゼアッセイは、樹脂等に補足したＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６に、成熟型ＨｔｒＡ２を添加して３７℃で一晩反応させた後、これら蛋白質をウエスタンブロッティングで検出することにより実施できる。ＳＨＣ３およびＡＴＦ６については、３７℃で４時間反応させることにより成熟型ＨｔｒＡ２により分解されるため、プロテアーゼアッセイにおける反応時間を４時間にすることもできる。ウエスタンブロッティングによる検出は、ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６に付加させたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６はＨｔｒＡ２により分解されるため、ウエスタンブロッティングにより検出されるこれら蛋白質の量は、ＨｔｒＡ２を添加しないときと比較して減少または消失する。ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６と成熟型ＨｔｒＡ２との反応に被検化合物を添加し、被検化合物を添加しないときと比較してＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６の量の低減または消失が阻害される場合、該被検化合物はＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害すると判定できる。被検化合物は予めＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６と、あるいは成熟型ＨｔｒＡ２と接触させ、その後、ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６と成熟型ＨｔｒＡ２を反応させることもできる。
【００６２】
また、本発明に係る化合物の同定方法は具体的には、例えば、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を用いた細胞内プロテアーゼアッセイ（実施例３）に被検化合物を添加することにより実施できる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２との細胞での共発現は、上記のように作製したＳＨＣ３ ＤＮＡ、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡおよびＡＴＦ６ ＤＮＡのそれぞれを含む適当なベクターとＨｔｒＡ２ ＤＮＡを含む適当なベクターとを、自体公知の遺伝子工学的手法で動物細胞培養株（例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞）にトランスフェクションすることにより実施できる。ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１は、これら蛋白質のＮ末またはＣ末にタグペプチド等が付加された蛋白質として発現させることが、これら蛋白質の検出を容易にするため、好ましい。ＨｔｒＡ２は、活性型ＨｔｒＡ２を用いる。活性型ＨｔｒＡ２として、成熟型ＨｔｒＡ２、好ましくはＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）またはＮ末の４残基のうちのアラニンをグリシンに置換した成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）を用いることが適当である。成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）は、アポトーシスの阻害に働くＩＡＰｓ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、ＩＡＰｓと結合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアッセイの検討に影響を与える可能性が考えられるため、ＩＡＰｓと結合しない成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）を使用することが好ましい。細胞内プロテアーゼアッセイは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを共発現させた細胞を被検化合物と共に３７℃で４８時間培養後、該細胞を溶解し、その溶解液中に含まれるＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６をウエスタンブロッティングで検出することにより実施できる。ウエスタンブロッティングによる検出は、ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６に付加させたタグペプチドに対する抗体を用いて実施できる。ＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６はＨｔｒＡ２により分解されるため、ウエスタンブロッティングにより検出されるこれら蛋白質の量は、ＨｔｒＡ２を添加しないときと比較して減少または消失する。被検化合物を添加した場合のＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６の量の低減または消失が、被検化合物を添加しないときと比較して阻害される場合、該被検化合物はＳＨＣ３、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６のＨｔｒＡ２による分解を阻害すると判定できる。
【００６３】
本発明に係る化合物の同定方法は、上記インビトロにおけるプロテアーゼアッセイや細胞内プロテアーゼアッセイを用いた具体的例示に限定されず、一般的に用いられている医薬品スクリーニングにおいてよく知られている同定方法を用いて実施できる。
【００６４】
本発明に係る化合物の同定方法で得られた化合物は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解の阻害剤として利用できる。当該化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮して選別することにより、医薬組成物として調製できる。医薬組成物の調製において、これら化合物は、単独で使用することもできるし、組合せて使用することもできる。
【００６５】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解に基づく細胞死の阻害剤に利用できる。好ましくは小胞体ストレスによるの細胞死の阻害剤として有用である。より好ましくは、神経細胞死の阻害剤、さらに好ましくは小胞体ストレスによる神経細胞死の阻害剤として有用である。また、上記化合物は、脳虚血による神経細胞死の阻害剤に利用できる。さらに、これら阻害剤を用いて、小胞体ストレスによる細胞死の阻害方法を実施できる。好ましくは、小胞体ストレスや脳虚血による神経細胞死の阻害方法を実施できる。
【００６６】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解に基づく疾患の防止剤、改善剤および／または治療剤を調製できる。かかる疾患としては、例えば神経細胞死を伴う疾患、より具体的にはアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等を挙げることができる。これら疾患は多くの場合、神経細胞内に異常な蛋白質が凝集体を形成していることが認められており、またこれら疾患における神経細胞死と小胞体ストレスとの関連が報告されている（非特許文献１）。また、上記化合物を用いて、このような疾患の防止方法、改善方法および／または治療方法を実施できる。
【００６７】
本発明に係る疾患の防止剤、治療剤および／または改善剤は、上記化合物、上記分解阻害剤および上記細胞死阻害剤のうち少なくともいずれか１を有効成分としてその有効量含む医薬となしてもよいが、通常は、１種または２種以上の医薬用担体を用いて医薬組成物として製造することが好ましい。
【００６８】
本発明に係る医薬製剤中に含まれる有効成分の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．００００１〜７０重量％、好ましくは０．０００１〜５重量％程度の範囲とするのが適当である。
【００６９】
医薬用担体は、製剤の使用形態に応じて一般的に使用される、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤および賦形剤等を例示できる。これらは得られる製剤の投与形態に応じて適宜選択して使用される。
【００７０】
より具体的には、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール、ラクトース等が挙げられる。これらは、本医薬組成物の剤形に応じて適宜１種類または２種類以上を組合せて使用される。
【００７１】
所望により、通常の蛋白質製剤に使用され得る各種の成分、例えば安定化剤、殺菌剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、界面活性剤、およびｐＨ調整剤等を適宜使用することもできる。
【００７２】
安定化剤は、例えばヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等を例示できる。これらは単独でまたは界面活性剤等と組合せて使用できる。特にこの組合せによれば、有効成分の安定性をより向上させ得る場合がある。Ｌ−アミノ酸は、特に限定はなく、例えばグリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよい。糖類も特に限定はなく、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等およびそれらの誘導体等のいずれでもよい。セルロース誘導体も特に限定はなく、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよい。
【００７３】
界面活性剤も特に限定はなく、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤のいずれも使用できる。界面活性剤には、例えばポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル系、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系、ソルビタンモノアシルエステル系、脂肪酸グリセリド系等が包含される。
【００７４】
緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、ε−アミノカプロン酸、グルタミン酸および／またはそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等を例示できる。
【００７５】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等を例示できる。
【００７６】
キレート剤は、例えばエデト酸ナトリウム、クエン酸等を例示できる。
【００７７】
本発明に係る医薬および医薬組成物は、溶液製剤として使用できる他に、これを凍結乾燥化し保存し得る状態にした後、用時、水や生理的食塩水等を含む緩衝液等で溶解して適当な濃度に調製した後に使用することもできる。
【００７８】
医薬組成物の用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。一般的には適当な用量は、例えば対象の体重１ｋｇあたり約０．０１μｇ乃至１００ｍｇ程度、好ましくは約０．１μｇ乃至１ｍｇ程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は１日１回乃至数回に分けて投与することができ、数日または数週間に１回の割合で間欠的に投与してもよい。
【００７９】
本発明の医薬組成物を投与するときには、該医薬組成物を単独で使用してもよく、あるいは目的の疾患の防止および／または治療に必要な他の化合物または医薬と共に使用してもよい。
【００８０】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択できる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。例えば、非経口経路として、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与が挙げられる。あるいは経口経路で投与することができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与も実施可能である。
【００８１】
投与形態は、各種の形態が目的に応じて選択できる。その代表的なものは、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤等の固体投与形態や、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、懸濁剤、脂肪乳剤、リポソーム製剤、シクロデキストリン等の包接体、シロップ、エリキシル等の液剤投与形態が含まれる。これらは更に投与経路に応じて経口剤、非経口剤（点滴剤、注射剤）、経鼻剤、吸入剤、経膣剤、坐剤、舌下剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤等に分類され、それぞれ通常の方法に従い、調合、成形、調製することができる。
【００８２】
さらに本発明は、ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢＬ、ＳＨＣ３またはＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチド、およびＳＨＣ３またはＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなるキットを提供する。当該キットは、例えば本発明に係る同定方法に使用できる。
【００８３】
上記キットは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６またはＣＲＥＢＬ１のＨｔｒＡ２による分解を検出するためのシグナルおよび／またはマーカー、緩衝液、並びに塩等、必要とされる物質を含むことができる。さらに、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。製剤化にあたっては、使用する各物質それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。
【００８４】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【００８５】
（ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質のインシリコでの探索）
ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有する蛋白質を、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号パンフレットに記載の予測方法に従って予測した。すなわち、ＨｔｒＡ２のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＨｔｒＡ２との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＨｔｒＡ２と相互作用すると予測した。
【００８６】
解析の結果、ＨｔｒＡ２と相互作用する機能を有すると予測される蛋白質として、ＣＲＥＢＬ１およびＳＨＣ１を見出した。
【実施例２】
【００８７】
（インビトロ プロテアーゼアッセイ）
ＣＲＥＢＬ１、ＣＲＥＢＬ１のファミリーであるＡＴＦ６、またはＳＨＣ１のファミリーであるＳＨＣ３とＨｔｒＡ２の相互作用を実験的に検証するために、インビトロにおけるプロテアーゼアッセイを実施した。
【００８８】
＜材料およびその調製＞
本実施例においては、活性型ＨｔｒＡ２および不活性型ＨｔｒＡ２としてそれぞれ、いずれもＣ末Ｔａｇとしてヒスチジン（Ｈｉｓ）を付加した成熟型ＨｔｒＡ２（配列番号４）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）（配列番号６）を用いた。また、ＨｔｒＡ２と相互作用すると予想した蛋白質として、いずれもＣ末Ｔａｇとしてｃ−Ｍｙｃを付加したＳＨＣ３（ｐ６４）（配列番号１６）およびＳＨＣ３（ｐ５２）、並びにいずれもＮ末Ｔａｇとしてｃ−Ｍｙｃを付加したＣＲＥＢＬ１（配列番号１８）およびＡＴＦ６（配列番号２０）を用いた。
【００８９】
１．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）のクローニングおよび発現プラスミドの作製
成熟型ＨｔｒＡ２（前駆体ＨｔｒＡ２（そのＤＮＡ塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列は配列番号１および配列番号２に記載）のアミノ酸残基１３４−４５８部分）をコードする遺伝子を得るために、Ｈｕｍａｎ Ｋｉｄｎｅｙ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、ＨｔｒＡ２−Ｆ１プライマー（５´側にＮｄｅＩ部位とＡＴＧを付加、配列番号２１）とＨｔｒＡ２−ＲＳプライマー（終止コドンを除いてＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２２）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓ（Ｔｏｙｏｂｏ社製）を用いてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）により成熟型ＨｔｒＡ２遺伝子を増幅し、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。また、シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｈｉｔａｃｈｉ：ＡＢＩ３１００）により塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および配列番号４に記載した。成熟型ＨｔｒＡ２大腸菌発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２の遺伝子をＮｄｅＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＥＴ２４ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に組込むことにより取得した。
【００９０】
成熟型ＨｔｒＡ２の１７４番目（前駆体蛋白質（配列番号２）では３０６番目に相当）のセリンをアラニンに置換した変異体（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））は、プロテアーゼ活性を示さないことが報告されている。そこで、不活性型である成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の大腸菌発現プラスミドを、成熟型ＨｔｒＡ２発現プラスミドを鋳型とし、ＨｔｒＡ２−ＭＦプライマー（配列番号２３）とＨｔｒＡ２−ＭＲプライマー（配列番号２４）を用いてＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＸＬ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）により作製した。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５および配列番号６に記載した。
【００９１】
２．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の発現および精製
成熟型ＨｔｒＡ２大腸菌発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に導入した形質転換体を取得した。この形質転換体を、２６℃にて１００ｍｌのＬＢ培地で培養し、吸光度（ＯＤ）が０．６８〜０．８１に達したときにイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．１ｍＭ添加することにより成熟型ＨｔｒＡ２蛋白質の発現誘導を行い、一晩培養した後、成熟型ＨｔｒＡ２を発現している大腸菌を遠心処理により分離回収した。得られた大腸菌を、リシスバッファーＡ（Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／１％ トライトンＸ−１００、１μｇ／ｍｌ ペプスタチン、５μＭ Ｅ６４）に懸濁し、氷冷下でソニケーター（１５秒×１０回）により菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心処理し（１５，０００ｒｐｍ、３０分、４℃）、可溶性画分（上清）と不溶性画分に分離した。成熟型ＨｔｒＡ２の含まれる可溶性画分を、あらかじめ１％ トライトンＸ−１００、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にて平衡化したプロボンドレジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：１ｍｌ ｐｒｅｐａｃｋｅｄ）に加え、４℃で３０分間混和した後、洗浄バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）にて３回洗浄した。レジンに吸着した成熟型ＨｔｒＡ２は、５０、１００、２００、３５０、５００ｍＭ イミダゾールをそれぞれ含む溶出バッファー（２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）にて段階的に溶出した。各溶出液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、成熟型ＨｔｒＡ２を含む画分を特定した。その結果、３５０−５００ｍＭ イミダゾールで成熟型ＨｔｒＡ２が溶出された。成熟型ＨｔｒＡ２を含む画分を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析した後、遠心処理にて不溶物を除去した上清を濃縮し、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準蛋白質としてクマシープラスプロテインアッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ、ＰＩＥＲＣＥ社製）により蛋白質を定量した。また成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の発現および精製についても同様に行った。
【００９２】
３．ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のクローニングおよび発現プラスミドの作製
ＳＨＣ３（ｐ６４）については、Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、ＳＨＣ３Ｆ１プライマー（ＡＴＧの直前にＢａｍＨＩ部位とＧＣＣを付加、配列番号２５）とＳＨＣ３Ｒ１プライマー（終止コドンを除いてＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２６）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＳＨＣ３（ｐ６４）遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。本実施例で得られたＳＨＣ３（ｐ６４）ＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＮＭ＿０１６８４８として既に登録された塩基配列と比較して６つの塩基に相違が認められた。相違する６塩基のうち、次の４つはゲノム配列と一致することが判明した：Ｔ１７３Ａ（ＶａｌからＡｓｐへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｇ７８９Ａ（アミノ酸の変化なし）；Ａ８１１Ｇ（ＴｈｒからＡｌａへのアミノ酸の変化を伴う）；およびＡ１６６１Ｇ（ＧｌｎからＡｒｇへのアミノ酸の変化を伴う）。他の２つの相違する塩基は、Ｇ２９１ＣおよびＡ１３３８Ｇであり、これらによるアミノ酸の変化はなかった。本実施例で得られたＳＨＣ３ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１５および配列番号１６に記載した。ＳＨＣ３動物細胞発現プラスミドは、クローニングしたＳＨＣ３遺伝子をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５に組み換えることにより取得した。
【００９３】
ＳＨＣ３のスプライシングバリアントであるＳＨＣ３（ｐ５２）は、ＳＨＣ３遺伝子のコード領域内の２番目のＡＴＧ（１番目のＡＴＧより３６０ｂａｓｅ下流）からコードされる蛋白質である。ＳＨＣ３（ｐ５２）については、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５ＡにクローニングされているＳＨＣ３（ｐ６４）プラスミドをＳａｃＩＩとＸｈｏＩで消化し、ＳａｃＩＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＣＭＶ−Ｔａｇ５Ａベクターに挿入し、発現プラスミドを構築した。また発現プラスミドにＳＨＣ３（ｐ５２）遺伝子が挿入されていることを制限酵素で消化することにより確認した。
【００９４】
ＣＲＥＢＬ１については、まずＨｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ ｃＤＮＡを鋳型とし、８３−Ｆプライマー（ＡＴＧの直前にＥｃｏＲＩ部位とＧＣＣを付加、配列番号２７）と８３−Ｒプライマー（終止コドンを除いてＸｈｏＩ部位を付加、配列番号２８）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＣＲＥＢＬ１遺伝子を増幅させ、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５にクローニングした。
【００９５】
次に、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５に組込んだＣＲＥＢＬ１遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６−ＮＦ１プライマー（ＡＴＧを除いてＢａｍＨＩ部位を付加、配列番号２９）とＡＴＦ６−ＮＲ１プライマー（終止コドンの後にＸｈｏＩ部位を付加、配列番号３０）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＣＲＥＢＬ１遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。本実施例で得られたＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＮＭ＿００４３８として既に登録された塩基配列と比較して塩基の１つに相違が認められた（Ｔ４５０Ｃ）。この相違によるアミノ酸の変化はなかった。また、終止コドンがＴＧＡからＴＡＡに変化した。これらの相違はＰＣＲエラーではないことを確認した。本実施例で得られたＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１７および配列番号１８に記載した。ＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミドは、クローニングしたＣＲＥＢＬ１遺伝子をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ３に組込むことにより取得した。
【００９６】
ＡＴＦ６については、まず、Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ ＱＵＩＣＫ−Ｃｌｏｎｅ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆｎプライマー（配列番号３１）とＡＴＦ６Ｒｎプライマー（配列番号３２）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子を増幅させた。次に、この増幅されたＡＴＦ６遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆ１Ｌプライマー（ＡＴＧの直前にＥｃｏＲＶ ｓｉｔｅを付加、配列番号３３）とＡＴＦ６Ｒ１Ｌプライマー（終止コドンの直後にＸｈｏＩ ｓｉｔｅを付加、配列番号３４）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子をさらに増幅させ、ｐｃＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した（配列番号１９）。本実施例で得られたＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッションナンバーＮＭ＿００７３４８として既に登録された塩基配列と比較して１５個の塩基に相違が認められた。相違する１５塩基は全てゲノム配列と一致することが判明した：Ｔ１０５Ｃ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１９９Ａ（ＬｅｕからＭｅｔへのアミノ酸の変化を伴う）；Ａ２０１Ｇ（ＬｅｕからＭｅｔへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｃ２７０Ｔ（アミノ酸の変化なし）；Ａ３０９Ｇ（アミノ酸の変化なし）；Ｃ４３３Ｇ（ＰｒｏからＡｌａへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｔ４６９Ｃ（ＳｅｒからＰｒｏへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｇ１２２８Ａ（ＧｌｙからＳｅｒへのアミノ酸の変化を伴う）；Ａ１２３０Ｃ（ＧｌｙからＳｅｒへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｃ１３８９Ｔ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１４１６Ｃ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１４９１Ａ（アミノ酸の変化なし）；Ｔ１５３８Ｃ（ＶａｌからＡｌａへのアミノ酸の変化を伴う）；Ｇ１５４０Ｃ（ＶａｌからＬｅｕへのアミノ酸の変化を伴う）；およびＧ１８９６Ａ（アミノ酸の変化なし）。また、全てのアミノ酸の変化に関してＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴではコンフリクトで記載がある。本実施例で得られたＡＴＦ６ ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡにコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１９および配列番号２０に記載した。
【００９７】
ＡＴＦ６遺伝子を動物細胞発現ベクターに組込むために、上記のｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングしたＡＴＦ６遺伝子を鋳型とし、ＡＴＦ６Ｆ２Ｌプライマー（ＡＴＧの直前にＢｇｌＩＩ ｓｉｔｅを付加、配列番号３５）とＡＴＦ６Ｒ１Ｌプライマー（配列番号３４）およびＤＮＡポリメラーゼとしてＫＯＤ−ｐｌｕｓを用いてＰＣＲ法によりＡＴＦ６遺伝子を増幅し、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した（配列番号１９）。このクローニングしたＡＴＦ６遺伝子をＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで消化し、ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化した動物細胞発現ベクターであるｐＣＭＶ−Ｔａｇ３に組込んだ。
【００９８】
４．ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１の発現
トランスフェクション前日に細胞数１．５×１０６／１０ｃｍ ディッシュ（Ｄｉｓｈ）としたＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６の各発現プラスミドをＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）にて導入した（１０μｇ／Ｄｉｓｈ）。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌのリシスバッファーＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ トライトンＸ−１００、１％ ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）、コンプリートミニ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｍｉｎｉ、ＥＤＴＡ不含））を添加し氷上で１０分間静置した。その後、スクレーパーで細胞を集め、１．５ｍｌのチューブに入れ、氷冷下でソニケーション処理（１５秒×６回）を行い、氷中で２０分静置後、ピペッティングで懸濁し、遠心処理（１５，０００ｒｐｍ、３０分間、４℃）により可溶性画分と不溶性画分を分離した。検討用試料として、可溶性画分を用いた。
【００９９】
５．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の活性の検討
カゼインザイモグラフィーおよびカゼインナトリウムのプロテアーゼアッセイにより成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の活性の検討を行った。カゼインザイモグラフィーはプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に従って実施した。具体的には、成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を非還元下で２×ＳＤＳ サンプルバッファーと等量混合し、室温で１０分静置した後、４〜１６％ ザイモグラム（Ｂｌｕｅ ｃａｓｅｉｎ）ゲル（Ｚｙｍｏｇｒａｍ Ｇｅｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）による分離を行った。泳動終了後、２．５％トライトンＸ−１００にてリネーチャー（ｒｅｎａｔｕｒｅ）した後、ディベロピングバッファー（Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）中で３７℃、一晩カゼイン分解反応を行った。
【０１００】
一方、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアッセイは、反応バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））中で成熟型ＨｔｒＡ２あるいは成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を２００μｇ／ｍｌ、カゼインナトリウムを４００μｇ／ｍｌの濃度となるように混合し、３７℃でインキュベーションして反応させることにより行った。反応開始３時間後および一晩後に反応液の一部を採取して、２×ＳＤＳ サンプルバッファーと等量混合し煮沸処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色によりカゼインナトリウムの分解の有無を検出した。
【０１０１】
上記検討の結果、成熟型ＨｔｒＡ２によるカゼインの分解が認められたが、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ではカゼインの分解が認められなかった。このことから、成熟型ＨｔｒＡ２はプロテアーゼ活性を有する活性型であるが、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）はプロテアーゼ活性を示さない不活性型であることが確認できた。
【０１０２】
＜方法＞
可溶性画分に含まれる夾雑蛋白質の影響を除くために免疫沈降にて樹脂にそれぞれ捕捉したＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１を実験に用いた。ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１の各可溶性画分３００μｌを６本のチューブ（Ｎｏ．１−６）に分注し、各チューブにＢＳＡでブロッキングした５０％スラリーのプロテインＧ セファロース ４ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を２０μｌ添加し、４℃で１時間転倒混和後、遠心処理（１０，０００ｒｐｍ、１０秒間、４℃）にて上清を回収し前処理（ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）を行った。
【０１０３】
得られた上清に抗Ｍｙｃ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を１．７μｌ（２μｇ）添加し、４℃で３時間転倒混和後に、ＢＳＡでブロッキングしたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを２０μｌ添加し４℃で１晩転倒混和し、プロテインＧ セファロース ４ ＦＦにＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１をそれぞれ捕捉した。つぎにＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６が捕捉されたプロテインＧ セファロース ４ ＦＦを５００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００）で５回洗浄した後、Ｎｏ．１および２のチューブには５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ トライトンＸ−１００を、Ｎｏ．３および４のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２溶液１００μｌを、Ｎｏ．５および６のチューブには５０μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）溶液１００μｌをそれぞれ加えた。Ｎｏ．１、３および５のチューブは３７℃で４時間、Ｎｏ．２、４および６のチューブは一晩反応させた後、遠心処理により上清を除去して５００μｌの洗浄バッファーにて３回、遠心洗浄を行い、２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を８０μｌ加え煮沸処理した。得られた試料８０μｌのうち１０μｌを使用し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ＰＶＤＦ膜へ転写し、ウエスタンブロッティングにより、ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１を検出した。検出用の１次抗体として抗ｃ−Ｍｙｃ抗体（９Ｅ１０）（Ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ社製）を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。また、検出はＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて実施した。
【０１０４】
＜結果＞
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＳＨＣ３（ｐ６４）がいずれも、成熟型ＨｔｒＡ２によりインビトロで分解されることを認めた。図１−Ａに示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１を１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した。図１−Ｂに示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＡＴＦ６を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した。図１−Ｃに示すように、活性型ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ６４）を４時間（４ｈ）または１晩（Ｏ／Ｎ）反応させることにより、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少した。また、ＳＨＣ３（ｐ５２）も同様に成熟型ＨｔｒＡ２によりインビトロで分解されることを認めた。
【０１０５】
一方、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））によるＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６およびＳＨＣ３（ｐ６４）の分解は認められなかった（図１−Ａ、図１−Ｂおよび図１−Ｃ）。また、不活性型ＨｔｒＡ２（成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ））によるＳＨＣ３（ｐ５２）の分解も認められなかった。
【実施例３】
【０１０６】
（細胞内におけるプロテアーゼアッセイ）
ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＳＨＣ３（ｐ６４）またはＳＨＣ３（ｐ５２）とＨｔｒＡ２の相互作用を細胞内におけるプロテアーゼアッセイにより検討した。
【０１０７】
＜材料およびその調製＞
成熟型ＨｔｒＡ２のＮ末の４残基（ＡＶＰＳ）は、アポトーシスの阻害に働くＩＡＰｓ（Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）ファミリー蛋白質との結合モチーフであり、ＩＡＰｓと結合してその作用を阻害することによりカスパーゼ依存的な細胞死を促進すると報告されている。この作用は、細胞内でのプロテアーゼアッセイの検討に影響を与える可能性が考えられる。そこで成熟型ＨｔｒＡ２または成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）とＩＡＰｓとの相互作用を阻害するために、Ｎ末の４残基（ＡＶＰＳ）を欠失させたもの（ΔＡＶＰＳ）または該４残基のうちのアラニンをグリシンに置換したもの（ＡＶＰＳ→ＧＶＰＳ）を成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）についてそれぞれ作製した。これら各種ＨｔｒＡ２はいずれもＣ末ＴａｇとしてＦＬＡＧを付加したものを用いた。
【０１０８】
１．各種ＨｔｒＡ２の調製
成熟型ＨｔｒＡ２の変異体を作製するために、成熟型ＨｔｒＡ２を鋳型とし、センスプライマーとしてＦ１およびＦ２プライマー（ＡＴＧの直前にＳａｃＩ ｓｉｔｅを付加、それぞれ配列番号３６および配列番号３７）を、アンチセンスプライマーには、ＨｔｒＡ２−ＲＳプライマー（配列番号２２）を用い、またＤＮＡポリメラーゼとしてＰｆｕ ｔｕｒｂｏ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてＰＣＲ法により、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。また、シークエンサーにより塩基配列を決定した。成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各動物細胞発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）の各遺伝子をＳａｃＩとＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に組込むことにより取得した。本実施例で得られた成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号７および配列番号８に記載した。また、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号９および配列番号１０に記載した。
【０１０９】
成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）の変異体を作製するために、同様に、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）を鋳型とし、ＰＣＲ法により、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各遺伝子を増幅させ、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各動物細胞発現プラスミドは、クローニングした成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）の各遺伝子をＳａｃＩとＸｈｏＩで消化し、それぞれｐＣＭＶ−Ｔａｇ４に組込むことにより取得した。本実施例で用いた成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１１および配列番号１２に記載した。また、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）ＤＮＡの塩基配列および該ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１３および配列番号１４に記載した。
【０１１０】
２．各種ＨｔｒＡ２の酵素活性の検討
培養細胞で発現した各種ＨｔｒＡ２に関して、カゼインナトリウムを基質としたプロテアーゼアッセイにより、その酵素活性を測定した（実施例２参照）。その結果、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）はいずれもプロテアーゼ活性を有する活性型であること、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）はいずれもプロテアーゼ活性を持たない不活性型であることが判明した。
【０１１１】
３．ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１の動物細胞用発現ベクターの作製
実施例２と同様の方法で作製したものを用いた。
【０１１２】
＜方法＞
各種ＨｔｒＡ２と各候補蛋白質（ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１）の発現プラスミドとは、トランスフェクション前日に細胞数５×１０５／６ｃｍ ＤｉｓｈとしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて導入した。各種ＨｔｒＡ２発現プラスミドは各候補蛋白質発現プラスミドのいずれかと組合せて、いずれも１μｇ／Ｄｉｓｈ添加した。４８時間後、各種ＨｔｒＡ２とＳＨＣ３（ｐ６４）またはＳＨＣ３（ｐ５２）とを共発現させた細胞は、４００μｌのリシスバッファーＢにより溶解し、遠心処理後、上清に２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を等量加え検討用試料として用いた。一方、各種ＨｔｒＡ２とＣＲＥＢＬ１またはＡＴＦ６とを共発現させた細胞は、２００μｌのリシスバッファーＢに２×ＳＤＳ サンプルバッファー（β−メルカプトエタノール０．１％含む）を等量加え、ソニケーション後、煮沸処理した後に検討用試料として用いた。
【０１１３】
上記各検討用試料１０μｌを用いてウエスタンブロッティングにより、ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１の発現、並びにこれら蛋白質の分解の有無を検出した。検出用の１次抗体として抗ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）抗体を、２次抗体としてホースラディッシュパーオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。検出は、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍを用いて実施した。
【０１１４】
＜結果＞
プロテアーゼ活性を有する活性型変異体（成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドが著しく減少した（図２−Ａの上図）。該活性型変異体とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドが著しく減少した（図２−Ｂの上図）。該活性型変異体とＳＨＣ３（ｐ６４）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドが著しく減少した（図２−Ｃの上図）。該活性型変異体とＳＨＣ３（ｐ５２）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドが著しく減少した（図２−Ｄの上図）。一方、不活性型ＨｔｒＡ２変異体（成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ΔＡＶＰＳ）または成熟型ＨｔｒＡ２ Ｓ３０６（ＧＶＰＳ））とＣＲＥＢＬ１とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ａの上図）。該不活性型ＨｔｒＡ２変異体とＡＴＦ６とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＡＴＦ６を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ｂの上図）。該不活性型ＨｔｒＡ２変異体とＳＨＣ３（ｐ６４）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ｃの上図）。該不活性型ＨｔｒＡ２変異体とＳＨＣ３（ｐ５２）とを共発現させた細胞を用いた解析では、ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドの減少は認められなかった（図２−Ｄの上図）。細胞内における各ＨｔｒＡ２変異体の発現は、各細胞間でほとんど差がなかった（図２−ＡおよびＢの下図）。
【０１１５】
このように、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）はいずれも、活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）または活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）により細胞内で分解されることが明らかになった。一方、ＣＲＥＢＬ１、ＡＴＦ６、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）はいずれも、不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）または不活性型の成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）では分解されなかった。
【実施例４】
【０１１６】
（ＨｔｒＡ２による分解パターンの検討）
ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）またはＳＨＣ３（ｐ５２）のＨｔｒＡ２による分解パターンを検討した。検討は、ビオチン化したＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）またはＳＨＣ３（ｐ５２）を用いて、ＨｔｒＡ２によるインビトロプロテアーゼアッセイにより行った。
【０１１７】
＜材料およびその調製＞
１．成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）
成熟型ＨｔｒＡ２および成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）は、実施例２と同様の方法で調製したものを用いた。
【０１１８】
２．ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の各動物細胞発現プラスミド
ＣＲＥＢＬ１動物細胞発現プラスミドは、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクターに実施例２と同様の方法でクローニングしたＣＲＥＢＬ１をＢａｍＨＩとＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓに組込むことにより取得した。
ＳＨＣ３（ｐ６４）動物細胞発現プラスミドは、ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターに実施例２と同様の方法でクローニングしたＳＨＣ３（ｐ６４）をＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓに組込むことにより取得した。
ＳＨＣ３（ｐ５２）動物細胞発現プラスミドは、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ５に実施例２と同様の方法で組込んだＳＨＣ３（ｐ５２）をＰｖｕＩＩとＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＶとＸｈｏＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓにライゲーションすることにより取得した。
【０１１９】
３．インビトロ翻訳反応系を用いたビオチン化ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の調製
ビオチンで標識されたＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の調製は、ウサギ網状赤血球ライセート（ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｌｙｓａｔｅ）を用いたインビトロ翻訳反応系（ＴＮＴ登録商標 Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で行った。
具体的にはまず、インビトロ翻訳反応溶液（ＴＮＴ登録商標 Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）４０μｌに各発現プラスミド（１μｇ／μｌ）１．５μｌ、１ｍＭ メチオニン１μｌ、ビオチン化リジンｔＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１μｌ、ヌクレアーゼを含まない水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）６．５μｌを加えて全量５０μｌとし、３０℃で１．５時間反応させた。その後、反応液５０μｌから１２．５μｌを採取し、２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウエスタンブロッティングにより、ビオチンでラベルされたＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の発現を検出した。検出は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ；Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて行った。その結果、いずれもビオチン化されていることが確認できた。
【０１２０】
＜方法＞
上記反応液をプロテアーゼアッセイの試料として用いた。反応液を１２．５μｌずつ３本のチューブ（Ｎｏ．２−４）に分注した。Ｎｏ．２のチューブにはコントロールとして、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を２５μｌ、Ｎｏ．３のチューブには２００μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２溶液を２５μｌ、Ｎｏ．４のチューブには２００μｇ／ｍｌの成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）溶液２５μｌをそれぞれ加え混合した。各チューブ（Ｎｏ．２−４）をさらに半量ずつ分注し、１つのチューブは３７℃で４時間反応し、もう一方のチューブは、３７℃で一晩反応させた。反応後、各チューブに２×ＳＤＳ サンプルバッファーを加え煮沸処理後、ウエスタンブロッティングにより、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）、ＳＨＣ３（ｐ５２）の分解パターンを検出した。
【０１２１】
分解の検出は、各蛋白質内部のビオチン化されたリジン残基を指標にして、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴｒａｎｓｃｅｎｄＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて行った。
【０１２２】
さらに分解箇所を調べる為、ウエスタンブロッティングに用いたメンブレンから、ストレプトアビジン−ＨＲＰを除去し、各蛋白質に付加されたＴａｇに対する抗体で、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の分解パターンを検出した。ＳＨＣ３の検出には、１次抗体として抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、２次抗体としてＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。ＣＲＥＢＬ１の検出には、１次抗体として抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を、２次抗体としてＨＲＰ標識化抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製）を用いた。分解の検出は、ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用いて行った。
【０１２３】
＜結果＞
蛋白質内部のビオチン化されたリジン残基を指標に、成熟型ＨｔｒＡ２によるＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）またはＳＨＣ３（ｐ５２）の分解パターンを検討した結果を、それぞれ図３−Ａ、図３−Ｂおよび図３−Ｃに示した。また、それぞれの蛋白質のＮ末またはＣ末に付加されたＴａｇを指標として、ＣＲＥＢＬ１、ＳＨＣ３（ｐ６４）およびＳＨＣ３（ｐ５２）の分解パターンを検討した結果を、それぞれ図４−Ａ、図４−Ｂおよび図４−Ｃに示した。
【０１２４】
ＣＲＥＢＬ１については、ビオチン化されたリジン残基を指標にした分解パターンの検討において、ビオチン化ＣＲＥＢＬ１を示すバンドの著しい減少が認められ、さらに５０ｋＤａ近辺にＣＲＥＢＬ１分解産物と考えられるバンドが検出された（図３−Ａ）。しかし、抗Ｔａｇ抗体による分解パターンの検討では、図３−Ａで認められた５０ｋＤａ近辺のＣＲＥＢＬ１分解産物と考えられるバンドだけでなく、別のサイズのＣＲＥＢＬ１分解産物を示すバンドも全く検出できなかった（図４−Ａ）。このことから、ＣＲＥＢＬ１はＨｔｒＡ２により数箇所で分解されたと考えられる。
【０１２５】
ＳＨＣ３（ｐ６４）については、ビオチン化されたリジン残基を指標にした分解パターンの検討において、ビオチン化ＳＨＣ３（ｐ６４）を示すバンドの著しい減少が認められ、さらに７０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ近辺にＳＨＣ３（ｐ６４）分解産物と考えられるバンドが検出された（図３−Ｂ）。抗Ｔａｇ抗体による分解パターンの検討においても、同様のバンドが検出された（図４−Ｂ）。このことから、ＳＨＣ３（ｐ６４）は、２箇所以上で成熟型ＨｔｒＡ２により分解された可能性がある。
【０１２６】
ＳＨＣ３（ｐ５２）については、ビオチン化されたリジン残基を指標にした分解パターンの検討において、ビオチン化ＳＨＣ３（ｐ５２）を示すバンドの著しい減少が認められたが、ＳＨＣ３（ｐ５２）分解産物と考えられるバンドは検出できなかった（図３−Ｃ）。しかし、抗Ｔａｇ抗体による分解パターンの検討において、４０ｋＤａ近辺にＳＨＣ３（ｐ５２）分解産物と考えられるバンドが検出された（図４−Ｃ）。このことから、ＳＨＣ３（ｐ５２）はＨｔｒＡ２により数箇所で分解されたと考えられる。
【０１２７】
このように、蛋白質内部を標識化して標識物質を検出することにより、ＨｔｒＡ２による上記蛋白質の分解が検出された。このことから、各蛋白質のＮ末またはＣ末に付加したＴａｇの検出により明らかになったＨｔｒＡ２による蛋白質の分解（実施例２および３）は、Ｔａｇが切断分離されたことによる見かけ上の分解ではなく、ＨｔｒＡ２が各蛋白質の内部に作用した結果生じた分解であることが判明した。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明は、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解に基づく細胞死の阻害、例えば神経細胞の細胞死の阻害、並びに神経細胞死を伴う疾患、例えば神経変性疾患の防止、治療または改善のために利用可能であり、医薬分野において非常に有用性が高い。さらにＨｔｒＡ２による細胞死、例えば小胞体ストレスによる細胞死、例えば神経細胞死の解明等の研究分野にも利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１２９】
配列番号１：ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質をコードするＤＮＡ。
配列番号２：ＨｔｒＡ２前駆体蛋白質。
配列番号３：成熟型ＨｔｒＡ２をコードするＤＮＡ。
配列番号４：成熟型ＨｔｒＡ。
配列番号５：配列番号３と同じ塩基配列であってその５２０位の塩基がｇである塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）をコードするＤＮＡ。
配列番号６：配列番号４と同じアミノ酸配列であって１７４番目のアミノ酸残基がＡｌａに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）。
配列番号７：配列番号３と同じ塩基配列であってその４−１５位の塩基を欠失させた塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号８：配列番号４と同じアミノ酸配列であって２−５番目のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）。
配列番号９：配列番号３に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその５位の塩基がｇであるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１０：配列番号４と同じアミノ酸配列であって２番目のアミノ酸残基がＧｌｙに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）。
配列番号１１：配列番号５と同じ塩基配列であってその４−１５位の塩基を欠失させた塩基配列からなるポリヌクレオチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１２：配列番号６と同じアミノ酸配列であって２−５番目のアミノ酸残基を欠失させたアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ΔＡＶＰＳ）。
配列番号１３：配列番号５に記載の塩基配列と同じ塩基配列であってその５位の塩基がｇであるポリヌクレオチド成熟型；ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）をコードするＤＮＡ。
配列番号１４：配列番号６と同じアミノ酸配列であって２番目のアミノ酸残基がＧｌｙに置換したアミノ酸配列からなるポリペプチド；成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ、ＧＶＰＳ）。
配列番号１５：ＳＨＣ３をコードするＤＮＡ。
配列番号１６：ＳＨＣ３。
配列番号１７：ＣＲＥＢＬ１をコードするＤＮＡ。
配列番号１８：ＣＲＥＢＬ１。
配列番号１９：ＡＴＦ６をコードするＤＮＡ。
配列番号２０：ＡＴＦ６。
配列番号２１：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２２：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて成熟型ＨｔｒＡ２ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２３：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２４：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（Ｓ３０６Ａ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２５：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＳＨＣ３ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２６：配列番号１５に記載の塩基配列に基づいて、ＳＨＣ３ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２７：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２８：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号２９：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３０：配列番号１７に記載の塩基配列に基づいて、ＣＲＥＢＬ１ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３１：配列番号１９に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３２：配列番号１９に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３３：配列番号１９に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３４：配列番号１９に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３５：配列番号１９に記載の塩基配列に基づいて、ＡＴＦ６ ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３６：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（ΔＡＶＰＳ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
配列番号３７：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて、成熟型ＨｔｒＡ２（ＧＶＰＳ）ＤＮＡを取得するために設計されたプライマー用ポリヌクレオチド。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＨＣ３（サーク ホモロジー ２ ドメイン コンテイニング トランスフォーミング プロテイン Ｃ３、ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ３）、ＡＴＦ６（アクティベーティング トランスクリプション ファクター ６、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ６）およびＣＲＥＢＬ１（サイクリックＡＭＰ レスポンシブ エレメント バインディング プロテイン ライク １、ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ １）のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２（ハイ テンパレイチャー リクワイアメント プロテイン Ａ２、ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２）による分解を阻害することを特徴とする神経細胞死阻害方法。
【請求項２】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする神経細胞死阻害方法。
【請求項３】
神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である請求項１または２に記載の神経細胞死阻害方法。
【請求項４】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする脳虚血障害または神経変性疾患の防止方法、治療方法または改善方法。
【請求項５】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病または筋萎縮性側索硬化症である請求項４に記載の防止方法、治療方法または改善方法。
【請求項６】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを化合物と接触させ、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１を検出することができるシグナルおよび／マーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／マーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、化合物が、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項７】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを化合物と接触させ、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、あるいは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、化合物が、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項８】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる神経細胞死阻害剤。
【請求項９】
神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である請求項８に記載の神経細胞死阻害剤。
【請求項１０】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる脳虚血障害または神経変性疾患の防止剤、治療剤または改善剤。
【請求項１１】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病または筋萎縮性側索硬化症である請求項１０に記載の神経変性疾患の防止剤、治療剤または改善剤。
【請求項１２】
ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢＬ１、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチド、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キット。
【請求項１】
ＳＨＣ３（サーク ホモロジー ２ ドメイン コンテイニング トランスフォーミング プロテイン Ｃ３、ｓｒｃ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ２ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ３）、ＡＴＦ６（アクティベーティング トランスクリプション ファクター ６、ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ６）およびＣＲＥＢＬ１（サイクリックＡＭＰ レスポンシブ エレメント バインディング プロテイン ライク １、ｃＡＭＰ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｋｅ １）のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２（ハイ テンパレイチャー リクワイアメント プロテイン Ａ２、ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ２）による分解を阻害することを特徴とする神経細胞死阻害方法。
【請求項２】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上用いることを特徴とする神経細胞死阻害方法。
【請求項３】
神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である請求項１または２に記載の神経細胞死阻害方法。
【請求項４】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害することを特徴とする脳虚血障害または神経変性疾患の防止方法、治療方法または改善方法。
【請求項５】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病または筋萎縮性側索硬化症である請求項４に記載の防止方法、治療方法または改善方法。
【請求項６】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを化合物と接触させ、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１を検出することができるシグナルおよび／マーカーを使用する系を用いて、このシグナルおよび／マーカーの存在若しくは不存在および／または変化を検出することにより、化合物が、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項７】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物の同定方法であって、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を可能にする条件下、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１とＨｔｒＡ２とを化合物と接触させ、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、あるいは、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解物の存在若しくは不存在の検出および／またはその量の変化の測定により、化合物が、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１の分解を阻害するか否かを決定することを特徴とする同定方法。
【請求項８】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる神経細胞死阻害剤。
【請求項９】
神経細胞死が脳虚血による神経細胞死である請求項８に記載の神経細胞死阻害剤。
【請求項１０】
ＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のうちの少なくとも１のＨｔｒＡ２による分解を阻害する化合物を１つ以上含んでなる脳虚血障害または神経変性疾患の防止剤、治療剤または改善剤。
【請求項１１】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病または筋萎縮性側索硬化症である請求項１０に記載の神経変性疾患の防止剤、治療剤または改善剤。
【請求項１２】
ＨｔｒＡ２、ＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドおよびＨｔｒＡ２をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１と、ＳＨＣ３、ＡＴＦ６、ＣＲＥＢＬ１、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチド、並びにＳＨＣ３、ＡＴＦ６およびＣＲＥＢＬ１のいずれか１をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターのうちの少なくともいずれか１とを含んでなる試薬キット。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ｃ】
【図２−Ｄ】
【図３−Ａ】
【図３−Ｂ】
【図３−Ｃ】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図４−Ｃ】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【図２−Ａ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ｃ】
【図２−Ｄ】
【図３−Ａ】
【図３−Ｂ】
【図３−Ｃ】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図４−Ｃ】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０３０２５６
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１４２８０（Ｐ２００５−５１４２８０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４３７８
【国際出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年４月７日（２００５．４．７）
【発行日】平成１９年１１月２９日（２００７．１１．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１４３７８
【国際出願日】平成１６年９月３０日（２００４．９．３０）
【出願人】（０００００２８３１）第一製薬株式会社 (129)
【Ｆターム（参考）】
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