ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損した調味料の製造に利用可能な麹菌及びその利用
【課題】調味料製造に必須の各種酵素の活性が高く、醸造に好適な麹菌を提供する。
【解決手段】調味料製造に通常用いられる麹菌アスペルギルス・オリーゼにおいてｃｒｅＣ遺伝子を欠損させることによって、プロテアーゼ活性のみならず、同様に醸造時に重要な機能を果たすアミラーゼ活性及びキシラナーゼ活性をも向上させることができ、醸造にきわめて適した麹菌株を作製できる。さらに、ｃｒｅＣ遺伝子の欠損はカーボンカタボライト・リプレッションの脱抑制に係ると考えられることから、カーボンカタボライト・リプレッションの影響を受けやすい、液体麹の製造や、バイオエタノール生産の糖化段階に用いる加水分解酵素生産等にも応用可能である。
【解決手段】調味料製造に通常用いられる麹菌アスペルギルス・オリーゼにおいてｃｒｅＣ遺伝子を欠損させることによって、プロテアーゼ活性のみならず、同様に醸造時に重要な機能を果たすアミラーゼ活性及びキシラナーゼ活性をも向上させることができ、醸造にきわめて適した麹菌株を作製できる。さらに、ｃｒｅＣ遺伝子の欠損はカーボンカタボライト・リプレッションの脱抑制に係ると考えられることから、カーボンカタボライト・リプレッションの影響を受けやすい、液体麹の製造や、バイオエタノール生産の糖化段階に用いる加水分解酵素生産等にも応用可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌のカーボンカタボライト・リプレッションを正に制御する制御するタンパク質ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能を欠損させた麹菌、及びその利用に係わるものである。
【背景技術】
【０００２】
焼酎、清酒、みりん、味噌、醤油等の調味料の製造では、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリーゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）といった麹菌が用いられている。麹菌は各種酵素の生産に適しており、その用途に応じ、その各種酵素系の発現に適した製麹方法が採られている。例えば醤油の製造においては、蒸煮した穀類等の固体原料に麹菌の胞子を散布し、その表面で麹菌を増殖させることによって製麹を行っている。麹の原料となる大豆、小麦、米の種類により、また、それらのα化度、水分量により、製麹中の温度、湿度、培養時間、手入れ条件、通風・換気条件等のさまざまな製麹条件を調整して、各種酵素を効率よく産生させるように管理するのが一般的である。
【０００３】
特に、プロテアーゼやアミラーゼ、キシラナーゼなどの各種酵素の活性は、原料利用率ときわめてよく相関している。したがって従来、調味料を歩留まりよく製造するために、紫外線照射や薬剤による変異誘発によって各種酵素活性の高い麹菌を得るための育種が繰り返されてきた。
【０００４】
一方、調味料の製造に利用可能な麹菌とは近縁のアスペルギルス・ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）において、カーボンカタボライト・リプレッションを正に制御するタンパク質ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損した変異株では、プロテアーゼ生産が向上することが知られている（非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株において、プロテアーゼ以外の遺伝子の発現に変化が生じているかどうかについては、βガラクトシダーゼ及びキナ酸脱水素酵素を除いて報告されていない。また、アスペルギルス・ニドランスは醸造等に使用される麹菌ではないため、調味料製造に使用可能な安全性の高い麹菌において同遺伝子が存在するか否かも全く知られていない。このため、調味料製造に使用される麹菌において、同様の遺伝子の機能欠損によってプロテアーゼ等の酵素活性の高い菌株が得られるかどうかは、その遺伝子の存在が不明である状況においては、当業者であっても予想できるものではなく、まったく未知の事項であった。
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｏｌ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１５０，１９３−２０４、１９７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって本発明の目的は、調味料製造に使用可能な麹菌においても同様の遺伝子が存在するか否かを最初に精査し、もし存在する場合には、同遺伝子の機能を欠損させることによって麹菌におけるプロテアーゼの各種酵素の活性が変化するかどうかを調査し、そのような変化が調味料の製造に有用かどうかを判定することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的を達成すべく、調味料製造に使用可能な麹菌において、同様の遺伝子をクローニングすることを試みた。まず、上記のアスペルギルス・ニドランスのｃｒｅＣ遺伝子配列を用いて、麹菌ゲノムデータベースＤＯＧＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ？ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）において相同性検索を実施したところ、アスペルギルス・オリーゼのゲノムにおいて、相同性が高い遺伝子としてＩＤ：ＡＯ０９０００３０００１４９とされる遺伝子が見出された。しかしながら、同遺伝子についての機能は未知であったことから、データベース上の配列を基にプライマーを設計し、ＰＣＲによって該遺伝子の全長をクローニングした。
【０００９】
該遺伝子をコードする正確な領域はゲノムデータベース上では不明であったため、５’−ＲＡＣＥ法により遺伝子領域決定したところ、該遺伝子は、２３７１ｂｐ（開始コドンＡＴＧ：終止コドンＴＡＡ）からなり、５９５アミノ酸残基、約６５．４ｋＤａのタンパク質をコードしていることが判明し、アスペルギルス・オリーゼにおいてもｃｒｅＣ遺伝子と同様の遺伝子（以下、「ｃｒｅＣ遺伝子」という）が存在することが明らかになった（別紙に「配列１」としてｃｒｅＣ遺伝子の塩基配列、「配列２」としてアミノ酸配列を示す）。そこで、調味料製造に用いられる麹菌であるアスペルギルス・オリーゼを用いて、相同組換え法によりｃｒｅＣ遺伝子欠損株を作成し、調味料製造に関わる各種酵素の活性を測定した。
【００１０】
その結果、驚くべきことに、本発明者は、アスペルギルス・オリーゼのｃｒｅＣ遺伝子の機能を欠損させることによって、プロテアーゼ活性のみならず、調味料製造時に重要な役割を担うアミラーゼ活性及びキシラナーゼ活性も向上させることができ、調味料製造にきわめて適した麹菌株を作製できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
したがって、本発明は以下の通りである。
（１）ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損している調味料の製造に利用可能な麹菌。
（２）ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能欠損により、プロテアーゼ、アミラーゼ及びキシラナーゼの酵素活性がｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損していない親株に比べて１．１倍以上向上している、上記（１）記載の麹菌。
（３）麹菌がアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である上記（１）記載の麹菌。
（４）上記（１）ないし（３）に記載の麹菌を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
（５）上記（１）ないし（３）に記載の麹菌を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の麹菌は、高プロテアーゼ活性、高アミラーゼ活性および高キシラナーゼ活性を有していること、また調味料製造に通常用いられる麹菌を親株としているために、調味料の効率的な製造に直接的に寄与することから、産業上の利用可能性が非常に高いものである。さらに、ｃｒｅＣ遺伝子の欠損はカーボンカタボライト・リプレッションの脱抑制に係ると考えられることから、カーボンカタボライト・リプレッションの影響を受けやすい、液体麹の製造や、バイオエタノール生産の糖化段階に用いる加水分解酵素生産等にも応用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、調味料製造に使用できる麹菌とは、焼酎、清酒、みりん、醤油、味噌等の調味料の製造に使用可能で、安全性の確立されているアスペルギルス属に属する麹菌であれば特に限定はされない。具体的には、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリーゼ、アスペルギルス・ソーヤ等が好ましい。中でも特に好ましいのはアスペルギルス・オリーゼ、アスペルギルス・ソーヤである。
【００１４】
本発明においてｃｒｅＣ遺伝子とは、ゲノムデータベースＤＯＧＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ？ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）においてＩＤがＡＯ０９０００３０００１４９である遺伝子を指す。
【００１５】
ｃｒｅＣ遺伝子の機能欠損株は、相同組換えによる遺伝子破壊や、変異導入による機能欠損の誘導により取得することができる。
【００１６】
相同組換えによる遺伝子の破壊方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、ｃｒｅＣ遺伝子の断片もしくはその上流・下流の領域とマーカー遺伝子とを組み合わせたＤＮＡ断片をベクターに組み込み、プロトプラスト−ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法などによってベクターを糸状菌に取り込ませ、相同組換えによって当該ＤＮＡ断片を糸状菌のゲノム中に導入する方法などを挙げられる。ＤＮＡ断片を麹菌細胞中に取り込ませる他の方法としては、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
【００１７】
相同組換え法によって所期の遺伝子が麹菌に導入されたことを確認する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、遺伝子を導入する際に、親株として栄養要求性の突然変異株を、マーカー遺伝子として当該栄養要求性を補償するような機能を持つ遺伝子を用い、形質転換後に栄養要求性培地上で正常に生育した株を選抜する方法などが挙げられる。ただし、このような栄養要求性だけでは、目的とする遺伝子座が導入したマーカー遺伝子と置換されたかどうか確認できない。従って、栄養要求性に合わせて適宜ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法等を用いて、目的とする遺伝子座がマーカーによって置換されていることを確認する必要がある。
【００１８】
また、変異導入法としては、公知の処理方法を用いることができ、紫外線、イオンビーム、放射線等を照射させる物理的方法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン色素等の変異剤を用いる化学的方法がある。特に好ましくは、イオンビーム、紫外線を照射させる方法を挙げることができる。
【００１９】
上記のような遺伝子破壊法、または変異導入法によってｃｒｅＣの機能が欠損し、プロテアーゼ活性が向上した株をスクリーニングする方法としては、ミルクカゼインを含有するプレートでハローアッセイを行うことで、親株に比べハローが大きくなった株を候補株とし、選抜した候補株からゲノムＤＮＡを抽出し、シークエンス解析で確認する方法などを挙げることができる。他の方法としては、コロニーハイブリダイゼーション法等を利用することができる。
【００２０】
また、本発明における各種酵素活性が上昇した株とは、醤油原料培地などにおいて親株に比べて酵素活性が１．１倍以上上昇した株を差す。
【００２１】
なお、各種酵素活性の測定方法としては、通常用いられている方法を利用することができ、たとえばプロテアーゼ活性の測定法としては「しょう油試験法」（財団法人日本醤油研究所・編集発行）に記載の方法を用いることができる。
【００２２】
本発明の麹菌を用いた麹の製法およびその麹を用いた調味料を製造する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、醤油の製造においては、通常の麹原料、たとえば撒水して蒸煮した大豆原料と炒熬割砕した小麦原料の混合物に、上記のｃｒｅＣ遺伝子の機能欠損した麹菌を接種混合して麹を調製し、得られた麹を通常の仕込みタンクに適当な濃度の食塩水で仕込み、適宜撹拌しつつ３〜６ヶ月間程度発酵熟成させて醤油諸味を得、常法により圧搾、精製、必要により火入れを行い、製品醤油（生醤油あるいは火入醤油）とする。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例において本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。なお、実施例中の％は、全てｗ／ｖ％を意味する。
【００２４】
実施例１ 相同組換え法によるｃｒｅＣ遺伝子欠損株の作成
（１）相同組換えによるｃｒｅＣ遺伝子欠損株の作成
ｃｒｅＣ遺伝子欠損株を作成するための親株として、硫酸（硫黄源）を資化することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・オリーゼΔｌｉｇＤ株を用いた。なお、ΔｌｉｇＤ株は、公知文献（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏｌ．４５（２００８）、８７８−８８９）に従い、アスペルギルス・オリーゼＲＩＢ４０株（寄託番号：ＡＴＣＣ４２１４９）を元に作成された株である。また、マーカー遺伝子としては、硫酸（硫黄源）を資化する機能をもつアスペルギルス・ニドランスｓＣ遺伝子（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９５ Ｍａｙ ２０；２４７（４）：４２３−４２９．）を用いた。
【００２５】
このため、所期のマーカー遺伝子が正常に導入された株は、ｓＣ遺伝子が導入されることによってΔｌｉｇＤ株の栄養要求性が回復するため、硫黄源として硫酸塩だけが含まれる培地においても生育することが可能になる。このことから、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株を容易に単離することができる。
【００２６】
すなわち、アスペルギルス・オリーゼΔｌｉｇＤ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｃｒｅＣ遺伝子コード領域の上流領域約１．５ｋｂｐ（ｃｒｅＣ ＯＲＦ上流領域）から下流領域約１．５ｋｂｐ（ｃｒｅＣ ＯＲＦ下流領域）までをプライマー１、２を用いてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法による増幅は定法により行い、得られた増幅産物をベクターｐＥＮＴＲ Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン）に導入し、完成したベクターを制限酵素ＡａｔＩＩサイト、ＸｂａＩサイトを付加したプライマー３、４を用いて再度ＰＣＲ法により増幅した。得られた増幅産物を制限酵素ＡａｔＩＩ、ＸｂａＩで処理し、ｃｒｅＣのＯＲＦ部分を欠損した直鎖状の配列（甲）を得た。
【００２７】
次に、アスペルギルス・ニドランスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡａｔＩＩサイト、ＸｂａＩサイトを付加したプライマー５、６を用いて、ＰＣＲ法によってｓＣ遺伝子領域を増幅した後、ｐＣＲＢｌｕｎｔベクター（インビトロジェン）に導入した。得られたベクターをＡａｔＩＩ、ＸｂａＩで処理し、ｓＣ領域の配列（乙）を得た。
【００２８】
このようにして得られた配列甲及び乙を、ＤＮＡリガーゼを用いて融合することで、ｃｒｅＣ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図１）。このベクターをＮｏｔＩで処理し、得られた直鎖状のベクターをプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて麹菌ΔｌｉｇＤ株に導入した。硫酸を含む選択培地（グルコース１％、亜硝酸ナトリウム０．２％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．０５％、硫酸鉄０．００１％、トレースエレメント０．１％、食塩４．６８％）で生育した株を同培地に３回植え継ぎ、ｃｒｅＣ遺伝子欠損候補株を得た。
【００２９】
これらの候補株から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてｃｒｅＣ遺伝子の増幅をＰＣＲ法で確認した。ｃｒｅＣ遺伝子が破壊されていた場合、遺伝子の増幅は認められないため、増幅を認めない株をしてｃｒｅＣ遺伝子欠損株とした。
【００３０】
使用したプライマーを表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
（２）生育の確認
直径８ｃｍのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株、および対照株として親株ΔｌｉｇＤとをそれぞれプレートの中央に播種した。３０℃で２４時間おきにコロニーの直径を測定した。その結果、親株であるΔｌｉｇＤ株、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株間で生育に差がないことが明らかとなった（図２）。
【００３３】
（３）ハローアッセイ
直径８ｃｍのプラスチックシャーレにハローアッセイ用の培地（ミルクプレート、デンプンプレート）を作成し、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株、および対照株として親株ΔｌｉｇＤをプレートの中央に播種し、形成されるハローの大きさを測定した。その結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株は親株に比べ大きなハローを形成したことから、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性が向上していることが示唆された（図３）。
【００３４】
なお、使用したミルクプレートの組成は以下の通りである。
グルコース２％、亜硝酸ナトリウム０．３％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．５％、塩化カリウム０．５％、硫酸鉄０．００１％、ミルクカゼイン０．１％、トレースエレメント０．１％、寒天１．５％
【００３５】
また、使用したデンプンプレートの組成は以下の通りである。
グルコース２％、亜硝酸ナトリウム０．３％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．５％、塩化カリウム０．５％、硫酸鉄０．００１％、デンプン０．１％、トレースエレメント０．１％、寒天１．５％
【００３６】
（３）プロテアーゼ活性の測定
脱脂大豆５ｇに８ｍｌの滅菌蒸留水を散水し、５ｇの割砕小麦を加えてよく攪拌し、４０分オートクレーブ処理を行った原料を醤油原料培地とした。該醤油原料培地１ｇ当たり、胞子数が１０6個となるように、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株、および対照株として親株ΔｌｉｇＤの胞子をそれぞれ散布し、よく攪拌して、２８℃で４８時間程度培養した。培養の結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株と親株との間に生育の差は認められなかった。
【００３７】
培養した麹に１４０ｍｌの冷水を添加しよく攪拌した後４時間放置し、これをろ紙でろ過することで酵素液を調整した。調整した酵素液を用いてプロテアーゼ活性を測定した。測定は以下の手順で行った。
【００３８】
１．５％ミルクカゼイン溶液１ｍｌと蒸留水１ｍｌを試験管にとり、３０℃の恒温槽で５分間予熱した。５分後１ｍｌの酵素液を加え、１０分間反応を行った後、０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液３ｍｌを加え反応を停止した。さらに３０℃で３０分放置して、沈殿をろ紙で除いた後、ろ液２ｍｌを取り、０．５５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌ、Ｆｏｌｉｎ試薬１ｍｌを加え３０℃で３０分反応させ、分光光度計で６６０ｎｍの吸光度を測定した。同様の方法で、チロシン標準液を用いて検量線を作成し、１分間にチロシン１μｇを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとして酵素活性を計算した。その結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株は親株ΔｌｉｇＤに比べてプロテアーゼ活性が有意に高かった（図４）。
【００３９】
（４）アミラーゼ活性の測定
アミラーゼ活性測定は以下の手順で行った。
酵素液１ｍｌに５０ｍＭ ＭａｃｌＬｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）を１ｍｌ加え、１％デンプン水溶液を２ｍｌ加え、３０℃で３０分反応を行った。その後、０．５規定酢酸１０ｍｌ、０．０００３規定ヨウ素溶液１０ｍｌを加え、分光光度計で７００ｎｍの吸光度を測定した。ヨウ素青色呈色を１０％低下せしめる酵素量を１ｕｎｉｔとして酵素活性を計算した。その結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株は親株ΔｌｉｇＤに比べてアミラーゼ活性が有意に高かった（図５）。
【００４０】
（５）キシラナーゼ活性の測定
キシラナーゼ活性測定は以下の手順で行った。
０．５％キシラン水溶液１６０μｌに４０μｌの酵素液を加え、４０℃で６０分程度反応を行った後、ＤＮＳ試薬４００μｌを加え、５分間沸騰させた後に、２．４ｍｌの純水を加え、よく混合した後、分光光度計で５００ｎｍの吸光度を測定した。同様の方法でキシロース標準液を用いて検量線を作成し、１分間に１μｇのキシロースを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとして酵素活性を計算した。その結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株は親株ΔｌｉｇＤに比べてプロテアーゼ活性が有意に高かった（図６）。
【００４１】
なお、ここで使用したＤＮＳ試薬は下記の手順で調製した。
４．５％水酸化ナトリウム水溶液３００ｍｌに、１％３，５−ジニトロサリチル酸水溶液８８０ｍｌと、ロッシェル塩２５５ｇを添加した。この溶液に、１０％水酸化ナトリウム水溶液２２ｍｌにフェノール１０ｇを混合し、１００ｍｌにフィルアップした溶液６９ｍｌに炭酸水素ナトリウム６．９ｇを溶解せしめたものを加え、２日以上室温に遮光保存したものを使用した。
【００４２】
上記（３）〜（５）における、親株ΔｌｉｇＤとｃｒｅＣ遺伝子欠損株の各種酵素活性の数値、および対照株すなわちΔｌｉｇＤに対するｃｒｅＣ遺伝子欠損株の酵素活性の比を比べた結果をまとめると、以下表２のようになった。なお、表中、ΔｃｒｅＣはｃｒｅＣ遺伝子欠損株のことを示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
以上の結果より、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、キシラナーゼ活性が親株に比べて高くなっている調味料製造に好適な麹菌を得ることができた。
【００４５】
実施例２ ｃｒｅＣ遺伝子欠損株を用いた醤油の製造
脱脂大豆５ｋｇに７Ｌの水を加え１時間混合後、高圧蒸煮缶にて蒸煮圧力４ｋｇ／ｃｍ2で１０分蒸煮を行った。この蒸煮脱脂大豆に、加熱変性後割砕した小麦５．２ｋｇを加え、種麹と共に混合し、製麹を行った。なお、種麹としては実施例１で得られたｃｒｅＣ遺伝子欠損株を用い、対照としてその親株を使用した。
【００４６】
得られた麹を冷塩水と共に仕込み、仕込み直後１０〜１５℃、１ヶ月後に２５℃〜３０℃まで温度を上げ、トータル５ヶ月間醸造し、標準的な濃口醤油を得た。なお、これ
らの試験は全てＰ１レベル閉鎖系で行った。得られた諸味等を分析した結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株を用いた場合には、親株と比較して窒素利用率が高く、かつ醤油粕が少ないことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、実施例で行った遺伝子破壊ベクターの作出工程を模式的に表したものである。矢印はプライマーの作成位置、および作成方向を、矢印に付記された数字は実施例中に示したプライマーの番号を、また、ＡｎｓＣはアスペルギルス・ニドランス由来のｓＣ遺伝子を示す。
【図２】図２は、対照株ΔｌｉｇＤ株とｃｒｅＣ遺伝子欠損株とでコロニーの直径を比較した結果を示している。◇は親株、□はｃｒｅＣ遺伝子欠損株（ΔｃｒｅＣ）における測定値を示す。
【図３】図３は、ハローアッセイの結果を示す。上段はミルクプレートの結果、下段はデンプンプレートの結果を示す。
【図４】図４は、醤油原料培地における親株ΔｌｉｇＤとｃｒｅＣ遺伝子欠損株（ΔｃｒｅＣ）のプロテアーゼ活性を比較した結果を示す。
【図５】図５は、醤油原料培地における親株ΔｌｉｇＤとｃｒｅＣ遺伝子欠損株（ΔｃｒｅＣ）のアミラーゼ活性を比較した結果を示す。
【図６】図６は、醤油原料培地における親株ΔｌｉｇＤとｃｒｅＣ遺伝子欠損株（ΔｃｒｅＣ）のキシラナーゼ活性を比較した結果を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、麹菌のカーボンカタボライト・リプレッションを正に制御する制御するタンパク質ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能を欠損させた麹菌、及びその利用に係わるものである。
【背景技術】
【０００２】
焼酎、清酒、みりん、味噌、醤油等の調味料の製造では、アスペルギルス・カワチ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリーゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）といった麹菌が用いられている。麹菌は各種酵素の生産に適しており、その用途に応じ、その各種酵素系の発現に適した製麹方法が採られている。例えば醤油の製造においては、蒸煮した穀類等の固体原料に麹菌の胞子を散布し、その表面で麹菌を増殖させることによって製麹を行っている。麹の原料となる大豆、小麦、米の種類により、また、それらのα化度、水分量により、製麹中の温度、湿度、培養時間、手入れ条件、通風・換気条件等のさまざまな製麹条件を調整して、各種酵素を効率よく産生させるように管理するのが一般的である。
【０００３】
特に、プロテアーゼやアミラーゼ、キシラナーゼなどの各種酵素の活性は、原料利用率ときわめてよく相関している。したがって従来、調味料を歩留まりよく製造するために、紫外線照射や薬剤による変異誘発によって各種酵素活性の高い麹菌を得るための育種が繰り返されてきた。
【０００４】
一方、調味料の製造に利用可能な麹菌とは近縁のアスペルギルス・ニドランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）において、カーボンカタボライト・リプレッションを正に制御するタンパク質ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損した変異株では、プロテアーゼ生産が向上することが知られている（非特許文献１）。
【０００５】
しかしながら、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株において、プロテアーゼ以外の遺伝子の発現に変化が生じているかどうかについては、βガラクトシダーゼ及びキナ酸脱水素酵素を除いて報告されていない。また、アスペルギルス・ニドランスは醸造等に使用される麹菌ではないため、調味料製造に使用可能な安全性の高い麹菌において同遺伝子が存在するか否かも全く知られていない。このため、調味料製造に使用される麹菌において、同様の遺伝子の機能欠損によってプロテアーゼ等の酵素活性の高い菌株が得られるかどうかは、その遺伝子の存在が不明である状況においては、当業者であっても予想できるものではなく、まったく未知の事項であった。
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｏｌ．ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１５０，１９３−２０４、１９７７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって本発明の目的は、調味料製造に使用可能な麹菌においても同様の遺伝子が存在するか否かを最初に精査し、もし存在する場合には、同遺伝子の機能を欠損させることによって麹菌におけるプロテアーゼの各種酵素の活性が変化するかどうかを調査し、そのような変化が調味料の製造に有用かどうかを判定することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記目的を達成すべく、調味料製造に使用可能な麹菌において、同様の遺伝子をクローニングすることを試みた。まず、上記のアスペルギルス・ニドランスのｃｒｅＣ遺伝子配列を用いて、麹菌ゲノムデータベースＤＯＧＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ？ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）において相同性検索を実施したところ、アスペルギルス・オリーゼのゲノムにおいて、相同性が高い遺伝子としてＩＤ：ＡＯ０９０００３０００１４９とされる遺伝子が見出された。しかしながら、同遺伝子についての機能は未知であったことから、データベース上の配列を基にプライマーを設計し、ＰＣＲによって該遺伝子の全長をクローニングした。
【０００９】
該遺伝子をコードする正確な領域はゲノムデータベース上では不明であったため、５’−ＲＡＣＥ法により遺伝子領域決定したところ、該遺伝子は、２３７１ｂｐ（開始コドンＡＴＧ：終止コドンＴＡＡ）からなり、５９５アミノ酸残基、約６５．４ｋＤａのタンパク質をコードしていることが判明し、アスペルギルス・オリーゼにおいてもｃｒｅＣ遺伝子と同様の遺伝子（以下、「ｃｒｅＣ遺伝子」という）が存在することが明らかになった（別紙に「配列１」としてｃｒｅＣ遺伝子の塩基配列、「配列２」としてアミノ酸配列を示す）。そこで、調味料製造に用いられる麹菌であるアスペルギルス・オリーゼを用いて、相同組換え法によりｃｒｅＣ遺伝子欠損株を作成し、調味料製造に関わる各種酵素の活性を測定した。
【００１０】
その結果、驚くべきことに、本発明者は、アスペルギルス・オリーゼのｃｒｅＣ遺伝子の機能を欠損させることによって、プロテアーゼ活性のみならず、調味料製造時に重要な役割を担うアミラーゼ活性及びキシラナーゼ活性も向上させることができ、調味料製造にきわめて適した麹菌株を作製できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１１】
したがって、本発明は以下の通りである。
（１）ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損している調味料の製造に利用可能な麹菌。
（２）ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能欠損により、プロテアーゼ、アミラーゼ及びキシラナーゼの酵素活性がｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損していない親株に比べて１．１倍以上向上している、上記（１）記載の麹菌。
（３）麹菌がアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である上記（１）記載の麹菌。
（４）上記（１）ないし（３）に記載の麹菌を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
（５）上記（１）ないし（３）に記載の麹菌を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の麹菌は、高プロテアーゼ活性、高アミラーゼ活性および高キシラナーゼ活性を有していること、また調味料製造に通常用いられる麹菌を親株としているために、調味料の効率的な製造に直接的に寄与することから、産業上の利用可能性が非常に高いものである。さらに、ｃｒｅＣ遺伝子の欠損はカーボンカタボライト・リプレッションの脱抑制に係ると考えられることから、カーボンカタボライト・リプレッションの影響を受けやすい、液体麹の製造や、バイオエタノール生産の糖化段階に用いる加水分解酵素生産等にも応用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明において、調味料製造に使用できる麹菌とは、焼酎、清酒、みりん、醤油、味噌等の調味料の製造に使用可能で、安全性の確立されているアスペルギルス属に属する麹菌であれば特に限定はされない。具体的には、アスペルギルス・カワチ、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・オリーゼ、アスペルギルス・ソーヤ等が好ましい。中でも特に好ましいのはアスペルギルス・オリーゼ、アスペルギルス・ソーヤである。
【００１４】
本発明においてｃｒｅＣ遺伝子とは、ゲノムデータベースＤＯＧＡＮ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／ｄｏｇａｎ／ＭｉｃｒｏＴｏｐ？ＧＥＮＯＭＥ＿ＩＤ＝ａｏ）においてＩＤがＡＯ０９０００３０００１４９である遺伝子を指す。
【００１５】
ｃｒｅＣ遺伝子の機能欠損株は、相同組換えによる遺伝子破壊や、変異導入による機能欠損の誘導により取得することができる。
【００１６】
相同組換えによる遺伝子の破壊方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、ｃｒｅＣ遺伝子の断片もしくはその上流・下流の領域とマーカー遺伝子とを組み合わせたＤＮＡ断片をベクターに組み込み、プロトプラスト−ＰＥＧ法やエレクトロポレーション法などによってベクターを糸状菌に取り込ませ、相同組換えによって当該ＤＮＡ断片を糸状菌のゲノム中に導入する方法などを挙げられる。ＤＮＡ断片を麹菌細胞中に取り込ませる他の方法としては、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。
【００１７】
相同組換え法によって所期の遺伝子が麹菌に導入されたことを確認する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、遺伝子を導入する際に、親株として栄養要求性の突然変異株を、マーカー遺伝子として当該栄養要求性を補償するような機能を持つ遺伝子を用い、形質転換後に栄養要求性培地上で正常に生育した株を選抜する方法などが挙げられる。ただし、このような栄養要求性だけでは、目的とする遺伝子座が導入したマーカー遺伝子と置換されたかどうか確認できない。従って、栄養要求性に合わせて適宜ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法等を用いて、目的とする遺伝子座がマーカーによって置換されていることを確認する必要がある。
【００１８】
また、変異導入法としては、公知の処理方法を用いることができ、紫外線、イオンビーム、放射線等を照射させる物理的方法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、アクリジン色素等の変異剤を用いる化学的方法がある。特に好ましくは、イオンビーム、紫外線を照射させる方法を挙げることができる。
【００１９】
上記のような遺伝子破壊法、または変異導入法によってｃｒｅＣの機能が欠損し、プロテアーゼ活性が向上した株をスクリーニングする方法としては、ミルクカゼインを含有するプレートでハローアッセイを行うことで、親株に比べハローが大きくなった株を候補株とし、選抜した候補株からゲノムＤＮＡを抽出し、シークエンス解析で確認する方法などを挙げることができる。他の方法としては、コロニーハイブリダイゼーション法等を利用することができる。
【００２０】
また、本発明における各種酵素活性が上昇した株とは、醤油原料培地などにおいて親株に比べて酵素活性が１．１倍以上上昇した株を差す。
【００２１】
なお、各種酵素活性の測定方法としては、通常用いられている方法を利用することができ、たとえばプロテアーゼ活性の測定法としては「しょう油試験法」（財団法人日本醤油研究所・編集発行）に記載の方法を用いることができる。
【００２２】
本発明の麹菌を用いた麹の製法およびその麹を用いた調味料を製造する方法としては、公知の方法を用いることができる。たとえば、醤油の製造においては、通常の麹原料、たとえば撒水して蒸煮した大豆原料と炒熬割砕した小麦原料の混合物に、上記のｃｒｅＣ遺伝子の機能欠損した麹菌を接種混合して麹を調製し、得られた麹を通常の仕込みタンクに適当な濃度の食塩水で仕込み、適宜撹拌しつつ３〜６ヶ月間程度発酵熟成させて醤油諸味を得、常法により圧搾、精製、必要により火入れを行い、製品醤油（生醤油あるいは火入醤油）とする。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例において本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。なお、実施例中の％は、全てｗ／ｖ％を意味する。
【００２４】
実施例１ 相同組換え法によるｃｒｅＣ遺伝子欠損株の作成
（１）相同組換えによるｃｒｅＣ遺伝子欠損株の作成
ｃｒｅＣ遺伝子欠損株を作成するための親株として、硫酸（硫黄源）を資化することのできない栄養要求性株である麹菌アスペルギルス・オリーゼΔｌｉｇＤ株を用いた。なお、ΔｌｉｇＤ株は、公知文献（Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔ Ｂｉｏｌ．４５（２００８）、８７８−８８９）に従い、アスペルギルス・オリーゼＲＩＢ４０株（寄託番号：ＡＴＣＣ４２１４９）を元に作成された株である。また、マーカー遺伝子としては、硫酸（硫黄源）を資化する機能をもつアスペルギルス・ニドランスｓＣ遺伝子（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．１９９５ Ｍａｙ ２０；２４７（４）：４２３−４２９．）を用いた。
【００２５】
このため、所期のマーカー遺伝子が正常に導入された株は、ｓＣ遺伝子が導入されることによってΔｌｉｇＤ株の栄養要求性が回復するため、硫黄源として硫酸塩だけが含まれる培地においても生育することが可能になる。このことから、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株を容易に単離することができる。
【００２６】
すなわち、アスペルギルス・オリーゼΔｌｉｇＤ株のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｃｒｅＣ遺伝子コード領域の上流領域約１．５ｋｂｐ（ｃｒｅＣ ＯＲＦ上流領域）から下流領域約１．５ｋｂｐ（ｃｒｅＣ ＯＲＦ下流領域）までをプライマー１、２を用いてＰＣＲ法により増幅した。ＰＣＲ法による増幅は定法により行い、得られた増幅産物をベクターｐＥＮＴＲ Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン）に導入し、完成したベクターを制限酵素ＡａｔＩＩサイト、ＸｂａＩサイトを付加したプライマー３、４を用いて再度ＰＣＲ法により増幅した。得られた増幅産物を制限酵素ＡａｔＩＩ、ＸｂａＩで処理し、ｃｒｅＣのＯＲＦ部分を欠損した直鎖状の配列（甲）を得た。
【００２７】
次に、アスペルギルス・ニドランスのゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡａｔＩＩサイト、ＸｂａＩサイトを付加したプライマー５、６を用いて、ＰＣＲ法によってｓＣ遺伝子領域を増幅した後、ｐＣＲＢｌｕｎｔベクター（インビトロジェン）に導入した。得られたベクターをＡａｔＩＩ、ＸｂａＩで処理し、ｓＣ領域の配列（乙）を得た。
【００２８】
このようにして得られた配列甲及び乙を、ＤＮＡリガーゼを用いて融合することで、ｃｒｅＣ遺伝子破壊用コンストラクトを作成した（図１）。このベクターをＮｏｔＩで処理し、得られた直鎖状のベクターをプロトプラスト−ＰＥＧ法を用いて麹菌ΔｌｉｇＤ株に導入した。硫酸を含む選択培地（グルコース１％、亜硝酸ナトリウム０．２％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．０５％、塩化カリウム０．０５％、硫酸鉄０．００１％、トレースエレメント０．１％、食塩４．６８％）で生育した株を同培地に３回植え継ぎ、ｃｒｅＣ遺伝子欠損候補株を得た。
【００２９】
これらの候補株から定法に従いゲノムＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてｃｒｅＣ遺伝子の増幅をＰＣＲ法で確認した。ｃｒｅＣ遺伝子が破壊されていた場合、遺伝子の増幅は認められないため、増幅を認めない株をしてｃｒｅＣ遺伝子欠損株とした。
【００３０】
使用したプライマーを表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
（２）生育の確認
直径８ｃｍのプラスチックシャーレに麹汁培地を作成し、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株、および対照株として親株ΔｌｉｇＤとをそれぞれプレートの中央に播種した。３０℃で２４時間おきにコロニーの直径を測定した。その結果、親株であるΔｌｉｇＤ株、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株間で生育に差がないことが明らかとなった（図２）。
【００３３】
（３）ハローアッセイ
直径８ｃｍのプラスチックシャーレにハローアッセイ用の培地（ミルクプレート、デンプンプレート）を作成し、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株、および対照株として親株ΔｌｉｇＤをプレートの中央に播種し、形成されるハローの大きさを測定した。その結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株は親株に比べ大きなハローを形成したことから、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性が向上していることが示唆された（図３）。
【００３４】
なお、使用したミルクプレートの組成は以下の通りである。
グルコース２％、亜硝酸ナトリウム０．３％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．５％、塩化カリウム０．５％、硫酸鉄０．００１％、ミルクカゼイン０．１％、トレースエレメント０．１％、寒天１．５％
【００３５】
また、使用したデンプンプレートの組成は以下の通りである。
グルコース２％、亜硝酸ナトリウム０．３％、リン酸２カリウム０．１％、硫酸マグネシウム０．５％、塩化カリウム０．５％、硫酸鉄０．００１％、デンプン０．１％、トレースエレメント０．１％、寒天１．５％
【００３６】
（３）プロテアーゼ活性の測定
脱脂大豆５ｇに８ｍｌの滅菌蒸留水を散水し、５ｇの割砕小麦を加えてよく攪拌し、４０分オートクレーブ処理を行った原料を醤油原料培地とした。該醤油原料培地１ｇ当たり、胞子数が１０6個となるように、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株、および対照株として親株ΔｌｉｇＤの胞子をそれぞれ散布し、よく攪拌して、２８℃で４８時間程度培養した。培養の結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株と親株との間に生育の差は認められなかった。
【００３７】
培養した麹に１４０ｍｌの冷水を添加しよく攪拌した後４時間放置し、これをろ紙でろ過することで酵素液を調整した。調整した酵素液を用いてプロテアーゼ活性を測定した。測定は以下の手順で行った。
【００３８】
１．５％ミルクカゼイン溶液１ｍｌと蒸留水１ｍｌを試験管にとり、３０℃の恒温槽で５分間予熱した。５分後１ｍｌの酵素液を加え、１０分間反応を行った後、０．４Ｍトリクロロ酢酸溶液３ｍｌを加え反応を停止した。さらに３０℃で３０分放置して、沈殿をろ紙で除いた後、ろ液２ｍｌを取り、０．５５Ｍ炭酸ナトリウム溶液５ｍｌ、Ｆｏｌｉｎ試薬１ｍｌを加え３０℃で３０分反応させ、分光光度計で６６０ｎｍの吸光度を測定した。同様の方法で、チロシン標準液を用いて検量線を作成し、１分間にチロシン１μｇを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとして酵素活性を計算した。その結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株は親株ΔｌｉｇＤに比べてプロテアーゼ活性が有意に高かった（図４）。
【００３９】
（４）アミラーゼ活性の測定
アミラーゼ活性測定は以下の手順で行った。
酵素液１ｍｌに５０ｍＭ ＭａｃｌＬｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ５．０）を１ｍｌ加え、１％デンプン水溶液を２ｍｌ加え、３０℃で３０分反応を行った。その後、０．５規定酢酸１０ｍｌ、０．０００３規定ヨウ素溶液１０ｍｌを加え、分光光度計で７００ｎｍの吸光度を測定した。ヨウ素青色呈色を１０％低下せしめる酵素量を１ｕｎｉｔとして酵素活性を計算した。その結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株は親株ΔｌｉｇＤに比べてアミラーゼ活性が有意に高かった（図５）。
【００４０】
（５）キシラナーゼ活性の測定
キシラナーゼ活性測定は以下の手順で行った。
０．５％キシラン水溶液１６０μｌに４０μｌの酵素液を加え、４０℃で６０分程度反応を行った後、ＤＮＳ試薬４００μｌを加え、５分間沸騰させた後に、２．４ｍｌの純水を加え、よく混合した後、分光光度計で５００ｎｍの吸光度を測定した。同様の方法でキシロース標準液を用いて検量線を作成し、１分間に１μｇのキシロースを遊離させる酵素量を１ｕｎｉｔとして酵素活性を計算した。その結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株は親株ΔｌｉｇＤに比べてプロテアーゼ活性が有意に高かった（図６）。
【００４１】
なお、ここで使用したＤＮＳ試薬は下記の手順で調製した。
４．５％水酸化ナトリウム水溶液３００ｍｌに、１％３，５−ジニトロサリチル酸水溶液８８０ｍｌと、ロッシェル塩２５５ｇを添加した。この溶液に、１０％水酸化ナトリウム水溶液２２ｍｌにフェノール１０ｇを混合し、１００ｍｌにフィルアップした溶液６９ｍｌに炭酸水素ナトリウム６．９ｇを溶解せしめたものを加え、２日以上室温に遮光保存したものを使用した。
【００４２】
上記（３）〜（５）における、親株ΔｌｉｇＤとｃｒｅＣ遺伝子欠損株の各種酵素活性の数値、および対照株すなわちΔｌｉｇＤに対するｃｒｅＣ遺伝子欠損株の酵素活性の比を比べた結果をまとめると、以下表２のようになった。なお、表中、ΔｃｒｅＣはｃｒｅＣ遺伝子欠損株のことを示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】
以上の結果より、プロテアーゼ活性、アミラーゼ活性、キシラナーゼ活性が親株に比べて高くなっている調味料製造に好適な麹菌を得ることができた。
【００４５】
実施例２ ｃｒｅＣ遺伝子欠損株を用いた醤油の製造
脱脂大豆５ｋｇに７Ｌの水を加え１時間混合後、高圧蒸煮缶にて蒸煮圧力４ｋｇ／ｃｍ2で１０分蒸煮を行った。この蒸煮脱脂大豆に、加熱変性後割砕した小麦５．２ｋｇを加え、種麹と共に混合し、製麹を行った。なお、種麹としては実施例１で得られたｃｒｅＣ遺伝子欠損株を用い、対照としてその親株を使用した。
【００４６】
得られた麹を冷塩水と共に仕込み、仕込み直後１０〜１５℃、１ヶ月後に２５℃〜３０℃まで温度を上げ、トータル５ヶ月間醸造し、標準的な濃口醤油を得た。なお、これ
らの試験は全てＰ１レベル閉鎖系で行った。得られた諸味等を分析した結果、ｃｒｅＣ遺伝子欠損株を用いた場合には、親株と比較して窒素利用率が高く、かつ醤油粕が少ないことが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、実施例で行った遺伝子破壊ベクターの作出工程を模式的に表したものである。矢印はプライマーの作成位置、および作成方向を、矢印に付記された数字は実施例中に示したプライマーの番号を、また、ＡｎｓＣはアスペルギルス・ニドランス由来のｓＣ遺伝子を示す。
【図２】図２は、対照株ΔｌｉｇＤ株とｃｒｅＣ遺伝子欠損株とでコロニーの直径を比較した結果を示している。◇は親株、□はｃｒｅＣ遺伝子欠損株（ΔｃｒｅＣ）における測定値を示す。
【図３】図３は、ハローアッセイの結果を示す。上段はミルクプレートの結果、下段はデンプンプレートの結果を示す。
【図４】図４は、醤油原料培地における親株ΔｌｉｇＤとｃｒｅＣ遺伝子欠損株（ΔｃｒｅＣ）のプロテアーゼ活性を比較した結果を示す。
【図５】図５は、醤油原料培地における親株ΔｌｉｇＤとｃｒｅＣ遺伝子欠損株（ΔｃｒｅＣ）のアミラーゼ活性を比較した結果を示す。
【図６】図６は、醤油原料培地における親株ΔｌｉｇＤとｃｒｅＣ遺伝子欠損株（ΔｃｒｅＣ）のキシラナーゼ活性を比較した結果を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損している調味料の製造に利用可能な麹菌。
【請求項２】
ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能欠損により、プロテアーゼ、アミラーゼ及びキシラナーゼの酵素活性がｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損していない親株に比べて１．１倍以上向上している、請求項１に記載の麹菌。
【請求項３】
麹菌がアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である請求項１記載の麹菌。
【請求項４】
請求項１ないし３に記載の麹菌を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
【請求項５】
請求項１ないし３に記載の麹菌を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
【請求項１】
ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損している調味料の製造に利用可能な麹菌。
【請求項２】
ｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能欠損により、プロテアーゼ、アミラーゼ及びキシラナーゼの酵素活性がｃｒｅＣをコードする遺伝子の機能が欠損していない親株に比べて１．１倍以上向上している、請求項１に記載の麹菌。
【請求項３】
麹菌がアスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）である請求項１記載の麹菌。
【請求項４】
請求項１ないし３に記載の麹菌を用いて製麹することを特徴とする麹の製造法。
【請求項５】
請求項１ないし３に記載の麹菌を用いて麹を調製し、その麹を用いて常法により仕込みし、発酵、熟成せしめることを特徴とする調味料の製造法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−７５１３１（Ｐ２０１０−７５１３１Ａ）
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２４９４０５（Ｐ２００８−２４９４０５）
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月８日（２０１０．４．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年９月２９日（２００８．９．２９）
【出願人】（０００００６７７０）ヤマサ醤油株式会社 (56)
【Ｆターム（参考）】
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