タンパク質捕捉剤
【課題】タンパク質、特に免疫グロブリンの捕捉に有用な捕捉剤を提供する。
【解決手段】一般式（１）
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、または炭素数１から４のハロアルキル基もしくはフェニル基を表し、Ｒ２は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７から１１のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、ハロアルコキシ基、または炭素数７から１１のアラルキルオキシ基を表す。）で表される２−（インドール−３−イル）エチルアミノ基を、カルボニル基を介して不溶性担体に固定化して得られる、タンパク質の捕捉に有用な捕捉剤。
【解決手段】一般式（１）
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、または炭素数１から４のハロアルキル基もしくはフェニル基を表し、Ｒ２は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７から１１のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、ハロアルコキシ基、または炭素数７から１１のアラルキルオキシ基を表す。）で表される２−（インドール−３−イル）エチルアミノ基を、カルボニル基を介して不溶性担体に固定化して得られる、タンパク質の捕捉に有用な捕捉剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプタミン誘導体を不溶性担体に固定化して得られる、各種タンパク質、特に免疫グロブリンの捕捉に利用可能な捕捉剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の吸着、濃縮、除去（これらをあわせ、以下「捕捉」という。）は、生化学的な試料を取り扱う実験、試験、検査、製造において広く用いられている操作であり、多くの方法が知られている。捕捉方法の例としては、ゲル透過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーや、膜濃縮法、硫酸アンモニウム（硫安）沈殿法、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法、アセトン沈殿法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法、免疫沈澱法などがあげられ、目的、使用環境、操作コストなどに応じ、単独または組み合わせて使用される。
【０００３】
タンパク質をはじめとして多くの生体成分は温度、ｐＨ、有機溶媒、高濃度の塩（特にカオトロピック塩）の影響を受けやすい。そのため、生理的な環境から大きく異なる環境に移されると、生体成分に非可逆的な構造変化が起き、生体成分本来の生物活性を失ったり、生体成分自体が分解することが知られている。したがって、前述の捕捉方法は生理的な環境下で行なうのが好ましい。
【０００４】
タンパク質に結合する性質を有した化合物には様々なものが知られているが、そのような化合物をタンパク質捕捉の目的で用いる場合、該化合物を不溶性担体に結合して得られる捕捉剤の形で用いるのが一般的である。ここで、不溶性担体に結合させる化合物のことを一般にリガンドと呼ぶ。高分子化合物のリガンドの一例としては、プロテインＡ（特許文献１）のようなタンパク質、ヘパリン（特許文献２）のような多糖、ε−ポリリジン（特許文献３）のようなポリペプチドがあげられる。低分子化合物のリガンドの一例としては、スルホン誘導体（特許文献４）、トリアジン誘導体（特許文献５）、メルカプト複素環式化合物（特許文献６）、４−（アルキルチオエチル）ピリジン誘導体（非特許文献１）、トリプトファン（特許文献７）があげられる。なお、特許文献７で開示のトリプトファンをリガンドとした捕捉剤は、ｐＨ５以下の酸性条件下で良好なタンパク質捕捉能を有しているが、当該環境は生理的な環境とは異なるため、必ずしも好ましいリガンドとはいえない。また、トリプタミン誘導体をリガンドとして利用した例はこれまでない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５２２０８５号公報
【特許文献２】特開２００１−０８６９８４号公報
【特許文献３】特開２００１−２１８８３９号公報
【特許文献４】米国特許４６９６９８０号公報
【特許文献５】米国特許６１１７９９６号公報
【特許文献６】特表平１０−５００６１５号公報
【特許文献７】特開２０１０−２１０４９７号公報
【特許文献８】ＷＯ９６／０９１１６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，９（４），２１１−２２１，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、タンパク質、特に免疫グロブリンの捕捉に有用な、トリプタミン誘導体を不溶性担体に固定化して得られる捕捉剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明の下記一般式（１）で示されるトリプタミン誘導体を不溶性担体に固定化して得られる捕捉剤が、タンパク質、特に免疫グロブリンを簡便に捕捉するのに有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、一般式（１）
一般式（１）
【００１０】
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、または炭素数１から４のハロアルキル基もしくは水酸基で置換されていてもよいフェニル基を表し、Ｒ２は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７から１１のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、または炭素数７から１１のアラルキルオキシ基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２およびＸは同時に水素原子にはなり得ない。）で表される２−（インドール−３−イル）エチルアミノ基を、カルボニル基を介して不溶性担体に固定化して得られるタンパク質捕捉剤に関するものである。
その具体例として、不溶性担体とカルボニル基導入剤とを反応させ、次いで一般式（１ａ）
【００１１】
【化２】
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、または炭素数１から４のハロアルキル基もしくは水酸基で置換されていてもよいフェニル基を表し、Ｒ２は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７から１１のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、または炭素数７から１１のアラルキルオキシ基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２およびＸは同時に水素原子にはなり得ない。）で表される２−（インドール−３−イル）エチルアミノ基と反応させて得られる、タンパク質捕捉剤がある。
【００１２】
また本発明は、本発明のタンパク質捕捉剤を用いた、タンパク質の分離精製法に関するものである。
【００１３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１４】
はじめに本発明のタンパク質捕捉剤（１）およびトリプタミン誘導体（１ａ）における、Ｒ１、Ｒ２、Ｘの定義を以下に示す。
【００１５】
Ｒ１およびＲ２で表される炭素数１から４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基が例示できる。
【００１６】
Ｒ１で表される炭素数１から４のハロアルキル基または水酸基で置換されていてもよいフェニル基としては、フェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、４−（パーフルオロエチル）フェニル基、２−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基が例示できる。
【００１７】
Ｒ２で表される炭素数７から１１のアラルキル基としては、ベンジル基、２−フェネチル基、１−ナフチルメチル基が例示できる。
【００１８】
Ｒ２で表されるアミノ基で置換されていてもよいフェニル基としては、２−アミノフェニル基、３−アミノフェニル基、４−アミノフェニル基が例示できる。
【００１９】
Ｒ２で表されるチエニル基としては、２−チエニル基、３−チエニル基が例示できる。
【００２０】
Ｘで表されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれかである。
【００２１】
Ｘで表される炭素数１から４のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロピルオキシ基、シクロプロピルオキシ基、ブトキシ基が例示できる。
【００２２】
Ｘで表される炭素数１から４のハロアルコキシ基としては、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、パーフルオロエトキシ基が例示できる。
【００２３】
Ｘで表される炭素数７から１１のアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、１−ナフチルメチルオキシ基が例示できる。
【００２４】
Ｒ１、Ｒ２およびＸの組合せは、免疫グロブリンの捕捉において良好な性能を示す点で、Ｒ１が水素原子、メチル基、４−ヒドロキシフェニル基のいずれかであり、Ｒ２が水素原子であり、Ｘが水素原子、５−クロロ、５−メトキシ、５−ベンジルオキシ、７−メトキシ、７−ベンジルオキシのいずれかであることが好ましく、以下の（Ａ）または（Ｂ）の組み合わせであるとさらに好ましい：
（Ａ）Ｒ１がメチル基または４−ヒドロキシフェニル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｘが水素原子
（Ｂ）Ｒ１およびＲ２が水素原子であり、Ｘが５−クロロ、５−メトキシ、５−ベンジルオキシ、７−メトキシまたは７−ベンジルオキシ
本発明のタンパク質捕捉剤の製造原料であるトリプタミン誘導体（１ａ）は、市販品として入手可能な化合物や、既知の方法で合成できる化合物を用いることができる。また、必要に応じて、これらの塩酸塩を用いてもよい。トリプタミン誘導体（１ａ）の不溶性担体（ｇｅｌ）に対する固定化量は、タンパク質の捕捉の性能がよい点で、１００μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）以上が好ましい。
【００２５】
本発明のタンパク質捕捉剤の製造原料である不溶性担体に特に限定はなく、アガロース、アルギネート、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖や、ポリビニルアルコール、水酸基を導入したポリメタクリレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子が例示できる。中でも、トヨパール（商品名、東ソー社製）等水酸基を導入したポリメタクリレート、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア社製）等のアガロース、セルファインＧＣＬ−２０００（商品名、チッソ社製）等のセルロースが不溶性担体として好ましい。不溶性担体の形状、表面構造、重合度については特に限定はないが、オープンカラムに充填して使用する態様では、微粒子状とすると捕捉性能がよい点で好ましい。また、粒子径を１から１００μｍの範囲とすると、圧力損失を抑えつつタンパク質の吸着量を上げることができるため好ましい。さらに、水酸基を４００μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）以上含有した不溶性担体（ｇｅｌ）は、トリプタミン誘導体（１ａ）の固定化量を多くすることができる点で好ましい。
【００２６】
本発明のタンパク質捕捉剤の製造方法に特に限定はなく、例えばＷＯ９６／０９１１６号（特許文献８）に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、不溶性担体上の水酸基をカルボニル導入剤で処理し、次いでトリプタミン誘導体（１ａ）と反応させることにより製造することができる。用いることのできるカルボニル基導入剤としては、１，１’−カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸エチル、クロロギ酸−ｐ−ニトロフェニルエステル、炭酸ビス（トリクロロメチル）、トリクロロメチルクロロホルメート、ホスゲンダイマーが例示できる。この中で、１，１’−カルボニルジイミダゾールが固定化量が多い点で好ましい。
【００２７】
次に、本発明のタンパク質捕捉剤を用いたタンパク質の捕捉について説明する。
【００２８】
本発明のタンパク質捕捉剤を用いて、捕捉することができるタンパク質としては、血漿タンパク質成分（例えば血漿中の免疫グロブリン）、血清アルブミン、血液凝固因子、ラクトアルブミンやラクトフェリンなどの乳タンパク質成分、天然には微量しか存在しないペプチドホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、成長抑制因子、ワクチンが例示できる。また、人工的に設計した遺伝子組換えタンパク質も含まれる。中でも免疫グロブリンが、本発明のタンパク質捕捉剤（１）の特徴を活かせる点で好ましい。なお、ここでいう免疫グロブリンは、その類縁体、フラグメントまたは融合体を含んでもよい。ここでいう類縁体とは、免疫グロブリンの構造や機能が少なくとも部分的に保持された、天然もしくは人工的に作られたタンパク質またはタンパク質コンジュゲートを指し、フラグメントとは、酵素的な処理または遺伝子工学的な設計によって作製された、免疫グロブリンの部分構造を有したタンパク質を指し、融合体とは各種サイトカインやサイトカイン受容体など生物活性を有したタンパク質の機能部分を、免疫グロブリンの全体または一部と遺伝子工学的に融合させて作製したものを指す。
【００２９】
本発明のタンパク質捕捉剤をオープンカラムに充填し、緩衝液、金属塩溶液、アミノ酸溶液、アルコール溶液等の溶離液を通液することで、タンパク質の捕捉を行なうことができる。本発明のタンパク質捕捉剤（１）を充填したカラムの溶離液として用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、Ｃｈｏｌａｍｉｎｅ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが例示できる。溶離液として用いる金属塩溶液に含まれる金属塩としては、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムが例示できる。溶離液として用いるアミノ酸溶液に含まれるアミノ酸としては、グリシン、アルギニン、ベータアラニン、ガンマアミノ酪酸が例示できる。溶離液として用いるアルコール溶液に含まれるアルコールとしては、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコールが例示できる。なお、前述した溶液を混合した溶液も溶離液として用いることもできる。溶離液のｐＨは５から９の範囲内であれば、目的とするタンパク質を捕捉できるが、ｐＨは６から８の範囲内とするとタンパク質の変性が少ない点で好ましい。本発明のタンパク質捕捉剤（１）を用いて、免疫グロブリン、またはその類縁体、フラグメントもしくは融合体を捕捉する場合、例えば、ｐＨを６から８に調整した塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液を通液するクロマトグラフィーを実施すればよい。
【００３０】
本発明のタンパク質捕捉剤（１）は、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液などのアルカリ性水溶液、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸の水溶液、塩酸グアニジン水溶液、尿素水溶液などのタンパク変性剤水溶液、アルギニンやヒスチジンなどのアミノ酸を含んだ水溶液、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ（商品名）などの界面活性剤水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコールなどのアルコール溶液、またはこれら溶液を混合した溶液を用いて洗浄することによって、初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のタンパク質捕捉剤（１）は、有用なタンパク質、特に免疫グロブリンを簡便に捕捉できる。そのため、医療用タンパク質、特に免疫グロブリンの工業的な分離精製において極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００３３】
実施例１ ポリメタクリレートゲルのイミダゾリルカルボニル化
（１）不溶性担体として、ポリメタクリレートゲルであるトヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−６５Ｆ、商品名、東ソー社製）を用いた。まず該ゲルを遠沈管に充填し１００×ｇで遠心分離することで、沈降ゲル（１０ｍＬ）を得た。
（２）吸引濾過により溶媒を除去し、ゲルを１，４−ジオキサン（５０ｍＬ×５）で洗浄した。
（３）ゲルに１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）と１，１’−カルボニルジイミダゾール（１．０ｇ，６．１７ｍｍｏｌ）を添加し、４０℃で１時間、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（４）１００×ｇでゲルを遠心分離し、反応液を吸引濾過した。
（５）ゲルを１，４−ジオキサン（２０ｍＬ×４）で洗浄することで、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲルを得た。
【００３４】
実施例２ ５−メトキシトリプタミンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、５−メトキシトリプタミンの１，４−ジオキサン溶液（１．２３ｍｏｌ／Ｌ，１．９ｍＬ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、ゲルを１，４−ジオキサン（４ｍＬ×５）で洗浄した。
（３）さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（４）反応液をろ過し、水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した。
（５）０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（６）反応液を濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することで、５−メトキシトリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル１１）を得た。
【００３５】
反応終了後のゲルを洗浄した、１，４−ジオキサンろ液中に含まれる未反応の５−メトキシトリプタミンの量を液体クロマトグラフィーで分析し、固定化ゲル１１に固定化された５−メトキシトリプタミンの量を算出した。その結果、固定化量は４６０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００３６】
実施例３ ５−メトキシトリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル１１）のタンパク質捕捉量測定
（１）実施例２に記載の方法で製造した固定化ゲル１１を、オープンカラム（バイオスピンエンプティーカラム、商品名、ＢｉｏＲａｄ社製）に充填し、１００×ｇで１分間遠心分離し、沈降ゲル（０．５ｍＬ）を得た。
（２）ヒト免疫グロブリン溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ，化血研製）３ｍＬを、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（緩衝液Ａ）１０．５ｍＬで希釈することでタンパク質溶液（１．５ｍＬ，免疫グロブリン５０ｍｇを含む）を調製し、これを固定化ゲル１１を充填したカラムに添加した。
（３）マイクロチューブローテーター（アズワン社製ＭＴＲ１０３）を用いて２５℃で一晩回転した後、４０×ｇで２分間遠心濾過した。
（４）カラムに緩衝液Ａ（１．５ｍＬ）を加え、４０×ｇで２分間遠心濾過する洗浄操作を、計４回繰り返した。
（５）カラムに１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１．５ｍＬを加え、４０×ｇで２分間遠心濾過するタンパク質回収操作を、計４回繰り返した。
【００３７】
タンパク質回収液の２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し、それぞれの回収液に含まれる免疫グロブリンの総量から、捕捉量を算出した。その結果、タンパク質の捕捉量は４４ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００３８】
実施例４ ５−クロロトリプタミンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、５−クロロトリプタミンの（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（１．２３ｍｏｌ／Ｌ，１．９ｍＬ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、得られたゲルを（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（４ｍＬ×５）で洗浄した。
（３）更に水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とう後、水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した。
（４）０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（５）濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することで５−クロロトリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル１０）を得た。
【００３９】
洗浄した（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（ろ液）中の未反応の５−クロロプタミンの量を液体クロマトグラフィーで分析し、固定化ゲル１０に固定化された５−クロロトリプタミンの量を算出した。その結果、固定化量は３２０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４０】
実施例５ ５−クロロトリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル１０）のタンパク質捕捉量測定
実施例３の記載と同様な方法で、固定化ゲル１０のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は４２ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４１】
実施例６ ２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、０．３ｍｏｌ／Ｌの２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミン塩酸塩の（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（１．９ｍＬ）と、トリエチルアミン（６２２ｍｇ，６．１５ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、水（４ｍＬ×５）で洗浄し、更に水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（３）水（１０ｍＬ×１０）で洗浄後、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（４）濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することで、２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル４）を得た。
【００４２】
反応終了後のゲルを洗浄した水溶液（ろ液）中の未反応の２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミンの量を液体クロマトグラフィーで分析し、固定化ゲル４に固定化された２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミンの量を算出した。その結果、固定化量は６０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４３】
実施例７ ２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル４）のタンパク質捕捉量測定
実施例３の記載と同様な方法で、固定化ゲル４のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は４０ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４４】
実施例８ アガロースゲルのイミダゾリルカルボニル化
実施例１の記載と同様な方法で、アガロースゲルであるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア社製）の水酸基をイミダゾリルカルボニル化した。
【００４５】
実施例９ ５−クロロトリプタミンのアガロースゲルへの固定化
実施例４の記載と同様な方法で、実施例８に記載の方法で調製した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したアガロースゲル（２ｍＬ）への５−クロロトリプタミンの固定化を行ない、５−クロロトリプタミン固定化アガロースゲル（固定化ゲル１７）を得た。実施例４の記載と同様な方法で分析した結果、固定化ゲル１７に固定化された５−クロロトリプタミンの固定化量は３４０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４６】
実施例１０ ５−クロロトリプタミン固定化アガロースゲル（固定化ゲル１７）のタンパク質捕捉量測定
実施例３の記載と同様な方法で、固定化ゲル１７のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は８０ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４７】
実施例１１ セルロースゲルのイミダゾリルカルボニル化
実施例１の記載と同様な方法で、セルロースゲルであるセルファインＧＣＬ−２０００（商品名、チッソ社製）の水酸基をイミダゾリルカルボニル化した。
【００４８】
実施例１２ ５−クロロトリプタミンのセルロースゲルへの固定化
実施例４の記載と同様な方法で、実施例１１に記載の方法で調製した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したセルロースゲル（２ｍＬ）への５−クロロトリプタミンの固定化を行ない、５−クロロトリプタミン固定化セルロースゲル（固定化ゲル１８）を得た。実施例４の記載と同様な方法で分析した結果、固定化ゲル１８に固定化された５−クロロトリプタミンの固定化量は５８０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４９】
実施例１３ ５−クロロトリプタミン固定化セルロースゲル（固定化ゲル１８）のタンパク質捕捉量測定
実施例３の記載と同様な方法で、固定化ゲル１８のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は５２ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００５０】
参考例１ ２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−［（２−フタルイミド）エチル］インドールの合成
【００５１】
【化３】
２−ブロモ−３−［（２−フタルイミド）エチル］インドール（１．５０ｇ，４．０６ｍｍｏｌ）のトルエン／エタノール（１０ｍＬ／１０ｍＬ）混合溶液に４−ヒドロキシフェニルホウ酸（８４０ｍｇ，６．０９ｍｍｏｌ）、塩化パラジウム（ＩＩ）（３６ｍｇ，０．２０３ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１０６ｍｇ，０．４０６ｍｍｏｌ）、塩化リチウム（１７２ｍｇ，４．０６ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（８６０ｍｇ，８．１２ｍｍｏｌ）を加え、封管容器、アルゴン雰囲気下で８０℃・８時間加熱撹拌した。反応終了後、反応混合物に水を加え、酢酸エチル（２０ｍＬ）で２回抽出後、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム（山善社製）で精製することで黄色固体の２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−［（２−フタルイミド）エチル］インドール（５２１ｍｇ，３４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ ３．１２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝７．６ ａｎｄ ７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｄｄ，Ｊ＝７．６ ａｎｄ ７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７８−７．８２（ｍ，４Ｈ），９．６１（ｓ，１Ｈ），１１．０（ｓ，１Ｈ）．
参考例２ ２−［２−（４−ヒドロキシフェニル）インドール−３−イル］エチルアミン塩酸塩の合成
【００５２】
【化４】
２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−［（２−フタルイミド）エチル］インドール（５２１ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）をエタノール（８０ｍＬ）懸濁し、次いでヒドラジン一水和物（１ｍＬ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応終了後、エタノールと過剰のヒドラジン一水和物を完全に留去し、固体を析出させた。得られた固体を１Ｍ塩酸（２０ｍＬ×２）で洗浄し、ろ過した。得られたろ液を完全に乾固させることによって、黄土色固体の２−［２−（４−ヒドロキシフェニル）インドール−３−イル］エチルアミン塩酸塩（３６０ｍｇ，９３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ ３．１４（ｔ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，４Ｈ），３．５０（ｂｒｓ，２Ｈ），６．７６（ｄｄ，Ｊ＝２．１ ａｎｄ ６．６Ｈｚ，２Ｈ），７．１４（ｄｄｄ，Ｊ＝１．１ ａｎｄ ７．５ ａｎｄ ７．５ Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄｄｄ，Ｊ＝１．１ ａｎｄ ７．５ ａｎｄ ７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｂｒｓ，１Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝１．１ ａｎｄ ７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄｄ，Ｊ＝２．１ ａｎｄ ６．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｄｄ，Ｊ＝１．１ ａｎｄ ７．５Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ）．
実施例および参考例に記載の方法に基づき製造可能な、トリプタミン誘導体、該誘導体を固定化した担体（固定化ゲル）、該固定化ゲルのトリプタミン誘導体固定化量、および該固定化ゲルによるタンパク質（ヒト免疫グロブリン）捕捉量をまとめた表を表１から６に示す。
【００５３】
【化５】
【００５４】
【表１】
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
【００５８】
【表５】
【００５９】
【表６】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリプタミン誘導体を不溶性担体に固定化して得られる、各種タンパク質、特に免疫グロブリンの捕捉に利用可能な捕捉剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の吸着、濃縮、除去（これらをあわせ、以下「捕捉」という。）は、生化学的な試料を取り扱う実験、試験、検査、製造において広く用いられている操作であり、多くの方法が知られている。捕捉方法の例としては、ゲル透過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーや、膜濃縮法、硫酸アンモニウム（硫安）沈殿法、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿法、アセトン沈殿法、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿法、免疫沈澱法などがあげられ、目的、使用環境、操作コストなどに応じ、単独または組み合わせて使用される。
【０００３】
タンパク質をはじめとして多くの生体成分は温度、ｐＨ、有機溶媒、高濃度の塩（特にカオトロピック塩）の影響を受けやすい。そのため、生理的な環境から大きく異なる環境に移されると、生体成分に非可逆的な構造変化が起き、生体成分本来の生物活性を失ったり、生体成分自体が分解することが知られている。したがって、前述の捕捉方法は生理的な環境下で行なうのが好ましい。
【０００４】
タンパク質に結合する性質を有した化合物には様々なものが知られているが、そのような化合物をタンパク質捕捉の目的で用いる場合、該化合物を不溶性担体に結合して得られる捕捉剤の形で用いるのが一般的である。ここで、不溶性担体に結合させる化合物のことを一般にリガンドと呼ぶ。高分子化合物のリガンドの一例としては、プロテインＡ（特許文献１）のようなタンパク質、ヘパリン（特許文献２）のような多糖、ε−ポリリジン（特許文献３）のようなポリペプチドがあげられる。低分子化合物のリガンドの一例としては、スルホン誘導体（特許文献４）、トリアジン誘導体（特許文献５）、メルカプト複素環式化合物（特許文献６）、４−（アルキルチオエチル）ピリジン誘導体（非特許文献１）、トリプトファン（特許文献７）があげられる。なお、特許文献７で開示のトリプトファンをリガンドとした捕捉剤は、ｐＨ５以下の酸性条件下で良好なタンパク質捕捉能を有しているが、当該環境は生理的な環境とは異なるため、必ずしも好ましいリガンドとはいえない。また、トリプタミン誘導体をリガンドとして利用した例はこれまでない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００２−５２２０８５号公報
【特許文献２】特開２００１−０８６９８４号公報
【特許文献３】特開２００１−２１８８３９号公報
【特許文献４】米国特許４６９６９８０号公報
【特許文献５】米国特許６１１７９９６号公報
【特許文献６】特表平１０−５００６１５号公報
【特許文献７】特開２０１０−２１０４９７号公報
【特許文献８】ＷＯ９６／０９１１６号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，９（４），２１１−２２１，２０００
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明が解決しようとする課題は、タンパク質、特に免疫グロブリンの捕捉に有用な、トリプタミン誘導体を不溶性担体に固定化して得られる捕捉剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、前記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、本発明の下記一般式（１）で示されるトリプタミン誘導体を不溶性担体に固定化して得られる捕捉剤が、タンパク質、特に免疫グロブリンを簡便に捕捉するのに有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、一般式（１）
一般式（１）
【００１０】
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、または炭素数１から４のハロアルキル基もしくは水酸基で置換されていてもよいフェニル基を表し、Ｒ２は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７から１１のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、または炭素数７から１１のアラルキルオキシ基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２およびＸは同時に水素原子にはなり得ない。）で表される２−（インドール−３−イル）エチルアミノ基を、カルボニル基を介して不溶性担体に固定化して得られるタンパク質捕捉剤に関するものである。
その具体例として、不溶性担体とカルボニル基導入剤とを反応させ、次いで一般式（１ａ）
【００１１】
【化２】
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、または炭素数１から４のハロアルキル基もしくは水酸基で置換されていてもよいフェニル基を表し、Ｒ２は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７から１１のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、または炭素数７から１１のアラルキルオキシ基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２およびＸは同時に水素原子にはなり得ない。）で表される２−（インドール−３−イル）エチルアミノ基と反応させて得られる、タンパク質捕捉剤がある。
【００１２】
また本発明は、本発明のタンパク質捕捉剤を用いた、タンパク質の分離精製法に関するものである。
【００１３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
【００１４】
はじめに本発明のタンパク質捕捉剤（１）およびトリプタミン誘導体（１ａ）における、Ｒ１、Ｒ２、Ｘの定義を以下に示す。
【００１５】
Ｒ１およびＲ２で表される炭素数１から４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、シクロプロピル基、ブチル基が例示できる。
【００１６】
Ｒ１で表される炭素数１から４のハロアルキル基または水酸基で置換されていてもよいフェニル基としては、フェニル基、２−トリフルオロメチルフェニル基、３−トリフルオロメチルフェニル基、４−トリフルオロメチルフェニル基、４−（パーフルオロエチル）フェニル基、２−ヒドロキシフェニル基、３−ヒドロキシフェニル基、４−ヒドロキシフェニル基が例示できる。
【００１７】
Ｒ２で表される炭素数７から１１のアラルキル基としては、ベンジル基、２−フェネチル基、１−ナフチルメチル基が例示できる。
【００１８】
Ｒ２で表されるアミノ基で置換されていてもよいフェニル基としては、２−アミノフェニル基、３−アミノフェニル基、４−アミノフェニル基が例示できる。
【００１９】
Ｒ２で表されるチエニル基としては、２−チエニル基、３−チエニル基が例示できる。
【００２０】
Ｘで表されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子のいずれかである。
【００２１】
Ｘで表される炭素数１から４のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロピルオキシ基、シクロプロピルオキシ基、ブトキシ基が例示できる。
【００２２】
Ｘで表される炭素数１から４のハロアルコキシ基としては、ジフルオロメトキシ基、トリフルオロメトキシ基、パーフルオロエトキシ基が例示できる。
【００２３】
Ｘで表される炭素数７から１１のアラルキルオキシ基としては、ベンジルオキシ基、１−ナフチルメチルオキシ基が例示できる。
【００２４】
Ｒ１、Ｒ２およびＸの組合せは、免疫グロブリンの捕捉において良好な性能を示す点で、Ｒ１が水素原子、メチル基、４−ヒドロキシフェニル基のいずれかであり、Ｒ２が水素原子であり、Ｘが水素原子、５−クロロ、５−メトキシ、５−ベンジルオキシ、７−メトキシ、７−ベンジルオキシのいずれかであることが好ましく、以下の（Ａ）または（Ｂ）の組み合わせであるとさらに好ましい：
（Ａ）Ｒ１がメチル基または４−ヒドロキシフェニル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｘが水素原子
（Ｂ）Ｒ１およびＲ２が水素原子であり、Ｘが５−クロロ、５−メトキシ、５−ベンジルオキシ、７−メトキシまたは７−ベンジルオキシ
本発明のタンパク質捕捉剤の製造原料であるトリプタミン誘導体（１ａ）は、市販品として入手可能な化合物や、既知の方法で合成できる化合物を用いることができる。また、必要に応じて、これらの塩酸塩を用いてもよい。トリプタミン誘導体（１ａ）の不溶性担体（ｇｅｌ）に対する固定化量は、タンパク質の捕捉の性能がよい点で、１００μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）以上が好ましい。
【００２５】
本発明のタンパク質捕捉剤の製造原料である不溶性担体に特に限定はなく、アガロース、アルギネート、カラゲナン、キチン、セルロース、デキストリン、デキストラン、デンプン等の多糖や、ポリビニルアルコール、水酸基を導入したポリメタクリレート、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリウレタン等の合成高分子が例示できる。中でも、トヨパール（商品名、東ソー社製）等水酸基を導入したポリメタクリレート、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア社製）等のアガロース、セルファインＧＣＬ−２０００（商品名、チッソ社製）等のセルロースが不溶性担体として好ましい。不溶性担体の形状、表面構造、重合度については特に限定はないが、オープンカラムに充填して使用する態様では、微粒子状とすると捕捉性能がよい点で好ましい。また、粒子径を１から１００μｍの範囲とすると、圧力損失を抑えつつタンパク質の吸着量を上げることができるため好ましい。さらに、水酸基を４００μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）以上含有した不溶性担体（ｇｅｌ）は、トリプタミン誘導体（１ａ）の固定化量を多くすることができる点で好ましい。
【００２６】
本発明のタンパク質捕捉剤の製造方法に特に限定はなく、例えばＷＯ９６／０９１１６号（特許文献８）に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、不溶性担体上の水酸基をカルボニル導入剤で処理し、次いでトリプタミン誘導体（１ａ）と反応させることにより製造することができる。用いることのできるカルボニル基導入剤としては、１，１’−カルボニルジイミダゾール、クロロギ酸エチル、クロロギ酸−ｐ−ニトロフェニルエステル、炭酸ビス（トリクロロメチル）、トリクロロメチルクロロホルメート、ホスゲンダイマーが例示できる。この中で、１，１’−カルボニルジイミダゾールが固定化量が多い点で好ましい。
【００２７】
次に、本発明のタンパク質捕捉剤を用いたタンパク質の捕捉について説明する。
【００２８】
本発明のタンパク質捕捉剤を用いて、捕捉することができるタンパク質としては、血漿タンパク質成分（例えば血漿中の免疫グロブリン）、血清アルブミン、血液凝固因子、ラクトアルブミンやラクトフェリンなどの乳タンパク質成分、天然には微量しか存在しないペプチドホルモン、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、成長抑制因子、ワクチンが例示できる。また、人工的に設計した遺伝子組換えタンパク質も含まれる。中でも免疫グロブリンが、本発明のタンパク質捕捉剤（１）の特徴を活かせる点で好ましい。なお、ここでいう免疫グロブリンは、その類縁体、フラグメントまたは融合体を含んでもよい。ここでいう類縁体とは、免疫グロブリンの構造や機能が少なくとも部分的に保持された、天然もしくは人工的に作られたタンパク質またはタンパク質コンジュゲートを指し、フラグメントとは、酵素的な処理または遺伝子工学的な設計によって作製された、免疫グロブリンの部分構造を有したタンパク質を指し、融合体とは各種サイトカインやサイトカイン受容体など生物活性を有したタンパク質の機能部分を、免疫グロブリンの全体または一部と遺伝子工学的に融合させて作製したものを指す。
【００２９】
本発明のタンパク質捕捉剤をオープンカラムに充填し、緩衝液、金属塩溶液、アミノ酸溶液、アルコール溶液等の溶離液を通液することで、タンパク質の捕捉を行なうことができる。本発明のタンパク質捕捉剤（１）を充填したカラムの溶離液として用いる緩衝液としては、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、Ｃｈｏｌａｍｉｎｅ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳが例示できる。溶離液として用いる金属塩溶液に含まれる金属塩としては、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムが例示できる。溶離液として用いるアミノ酸溶液に含まれるアミノ酸としては、グリシン、アルギニン、ベータアラニン、ガンマアミノ酪酸が例示できる。溶離液として用いるアルコール溶液に含まれるアルコールとしては、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコールが例示できる。なお、前述した溶液を混合した溶液も溶離液として用いることもできる。溶離液のｐＨは５から９の範囲内であれば、目的とするタンパク質を捕捉できるが、ｐＨは６から８の範囲内とするとタンパク質の変性が少ない点で好ましい。本発明のタンパク質捕捉剤（１）を用いて、免疫グロブリン、またはその類縁体、フラグメントもしくは融合体を捕捉する場合、例えば、ｐＨを６から８に調整した塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液を通液するクロマトグラフィーを実施すればよい。
【００３０】
本発明のタンパク質捕捉剤（１）は、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液などのアルカリ性水溶液、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸の水溶液、塩酸グアニジン水溶液、尿素水溶液などのタンパク変性剤水溶液、アルギニンやヒスチジンなどのアミノ酸を含んだ水溶液、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ（商品名）などの界面活性剤水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、エチレングリコールなどのアルコール溶液、またはこれら溶液を混合した溶液を用いて洗浄することによって、初期状態に復帰させることができ、繰り返し使用することができる。
【発明の効果】
【００３１】
本発明のタンパク質捕捉剤（１）は、有用なタンパク質、特に免疫グロブリンを簡便に捕捉できる。そのため、医療用タンパク質、特に免疫グロブリンの工業的な分離精製において極めて有用である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらに限定されるものではない。
【００３３】
実施例１ ポリメタクリレートゲルのイミダゾリルカルボニル化
（１）不溶性担体として、ポリメタクリレートゲルであるトヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ＨＷ−６５Ｆ、商品名、東ソー社製）を用いた。まず該ゲルを遠沈管に充填し１００×ｇで遠心分離することで、沈降ゲル（１０ｍＬ）を得た。
（２）吸引濾過により溶媒を除去し、ゲルを１，４−ジオキサン（５０ｍＬ×５）で洗浄した。
（３）ゲルに１，４−ジオキサン（１０ｍＬ）と１，１’−カルボニルジイミダゾール（１．０ｇ，６．１７ｍｍｏｌ）を添加し、４０℃で１時間、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（４）１００×ｇでゲルを遠心分離し、反応液を吸引濾過した。
（５）ゲルを１，４−ジオキサン（２０ｍＬ×４）で洗浄することで、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲルを得た。
【００３４】
実施例２ ５−メトキシトリプタミンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、５−メトキシトリプタミンの１，４−ジオキサン溶液（１．２３ｍｏｌ／Ｌ，１．９ｍＬ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、ゲルを１，４−ジオキサン（４ｍＬ×５）で洗浄した。
（３）さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（４）反応液をろ過し、水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した。
（５）０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（６）反応液を濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することで、５−メトキシトリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル１１）を得た。
【００３５】
反応終了後のゲルを洗浄した、１，４−ジオキサンろ液中に含まれる未反応の５−メトキシトリプタミンの量を液体クロマトグラフィーで分析し、固定化ゲル１１に固定化された５−メトキシトリプタミンの量を算出した。その結果、固定化量は４６０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００３６】
実施例３ ５−メトキシトリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル１１）のタンパク質捕捉量測定
（１）実施例２に記載の方法で製造した固定化ゲル１１を、オープンカラム（バイオスピンエンプティーカラム、商品名、ＢｉｏＲａｄ社製）に充填し、１００×ｇで１分間遠心分離し、沈降ゲル（０．５ｍＬ）を得た。
（２）ヒト免疫グロブリン溶液（１５０ｍｇ／ｍＬ，化血研製）３ｍＬを、１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）（緩衝液Ａ）１０．５ｍＬで希釈することでタンパク質溶液（１．５ｍＬ，免疫グロブリン５０ｍｇを含む）を調製し、これを固定化ゲル１１を充填したカラムに添加した。
（３）マイクロチューブローテーター（アズワン社製ＭＴＲ１０３）を用いて２５℃で一晩回転した後、４０×ｇで２分間遠心濾過した。
（４）カラムに緩衝液Ａ（１．５ｍＬ）を加え、４０×ｇで２分間遠心濾過する洗浄操作を、計４回繰り返した。
（５）カラムに１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）１．５ｍＬを加え、４０×ｇで２分間遠心濾過するタンパク質回収操作を、計４回繰り返した。
【００３７】
タンパク質回収液の２８０ｎｍにおける吸光度をＵ−２９００スペクトロフォトメーター（日立製作所製）で測定し、それぞれの回収液に含まれる免疫グロブリンの総量から、捕捉量を算出した。その結果、タンパク質の捕捉量は４４ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００３８】
実施例４ ５−クロロトリプタミンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、５−クロロトリプタミンの（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（１．２３ｍｏｌ／Ｌ，１．９ｍＬ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、得られたゲルを（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（４ｍＬ×５）で洗浄した。
（３）更に水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とう後、水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した。
（４）０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（５）濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することで５−クロロトリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル１０）を得た。
【００３９】
洗浄した（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（ろ液）中の未反応の５−クロロプタミンの量を液体クロマトグラフィーで分析し、固定化ゲル１０に固定化された５−クロロトリプタミンの量を算出した。その結果、固定化量は３２０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４０】
実施例５ ５−クロロトリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル１０）のタンパク質捕捉量測定
実施例３の記載と同様な方法で、固定化ゲル１０のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は４２ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４１】
実施例６ ２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミンのポリメタクリレートゲルへの固定化
（１）実施例１に記載の方法で製造した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したポリメタクリレートゲル（２ｍＬ）に、０．３ｍｏｌ／Ｌの２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミン塩酸塩の（１，４−ジオキサン：水＝１：１）溶液（１．９ｍＬ）と、トリエチルアミン（６２２ｍｇ，６．１５ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で一晩、１５０ｒｐｍでレシプロ振とうし、反応させた。
（２）反応終了後、水（４ｍＬ×５）で洗浄し、更に水（１０ｍＬ×１０）で洗浄した後、０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（３）水（１０ｍＬ×１０）で洗浄後、０．１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）を加え、２５℃で１５分間、１５０ｒｐｍでロータリー振とうした。
（４）濾過後、さらに水（１０ｍＬ×１０）で洗浄することで、２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル４）を得た。
【００４２】
反応終了後のゲルを洗浄した水溶液（ろ液）中の未反応の２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミンの量を液体クロマトグラフィーで分析し、固定化ゲル４に固定化された２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミンの量を算出した。その結果、固定化量は６０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４３】
実施例７ ２−（４−ヒドロキシフェニル）トリプタミン固定化ポリメタクリレートゲル（固定化ゲル４）のタンパク質捕捉量測定
実施例３の記載と同様な方法で、固定化ゲル４のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は４０ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４４】
実施例８ アガロースゲルのイミダゾリルカルボニル化
実施例１の記載と同様な方法で、アガロースゲルであるＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（商品名、ＧＥヘルスケア社製）の水酸基をイミダゾリルカルボニル化した。
【００４５】
実施例９ ５−クロロトリプタミンのアガロースゲルへの固定化
実施例４の記載と同様な方法で、実施例８に記載の方法で調製した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したアガロースゲル（２ｍＬ）への５−クロロトリプタミンの固定化を行ない、５−クロロトリプタミン固定化アガロースゲル（固定化ゲル１７）を得た。実施例４の記載と同様な方法で分析した結果、固定化ゲル１７に固定化された５−クロロトリプタミンの固定化量は３４０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４６】
実施例１０ ５−クロロトリプタミン固定化アガロースゲル（固定化ゲル１７）のタンパク質捕捉量測定
実施例３の記載と同様な方法で、固定化ゲル１７のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は８０ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４７】
実施例１１ セルロースゲルのイミダゾリルカルボニル化
実施例１の記載と同様な方法で、セルロースゲルであるセルファインＧＣＬ−２０００（商品名、チッソ社製）の水酸基をイミダゾリルカルボニル化した。
【００４８】
実施例１２ ５−クロロトリプタミンのセルロースゲルへの固定化
実施例４の記載と同様な方法で、実施例１１に記載の方法で調製した、水酸基をイミダゾリルカルボニル化したセルロースゲル（２ｍＬ）への５−クロロトリプタミンの固定化を行ない、５−クロロトリプタミン固定化セルロースゲル（固定化ゲル１８）を得た。実施例４の記載と同様な方法で分析した結果、固定化ゲル１８に固定化された５−クロロトリプタミンの固定化量は５８０μｍｏｌ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００４９】
実施例１３ ５−クロロトリプタミン固定化セルロースゲル（固定化ゲル１８）のタンパク質捕捉量測定
実施例３の記載と同様な方法で、固定化ゲル１８のタンパク質捕捉量を測定した。タンパク質の捕捉量は５２ｍｇ／ｍＬ（ｇｅｌ）であった。
【００５０】
参考例１ ２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−［（２−フタルイミド）エチル］インドールの合成
【００５１】
【化３】
２−ブロモ−３−［（２−フタルイミド）エチル］インドール（１．５０ｇ，４．０６ｍｍｏｌ）のトルエン／エタノール（１０ｍＬ／１０ｍＬ）混合溶液に４−ヒドロキシフェニルホウ酸（８４０ｍｇ，６．０９ｍｍｏｌ）、塩化パラジウム（ＩＩ）（３６ｍｇ，０．２０３ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（１０６ｍｇ，０．４０６ｍｍｏｌ）、塩化リチウム（１７２ｍｇ，４．０６ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（８６０ｍｇ，８．１２ｍｍｏｌ）を加え、封管容器、アルゴン雰囲気下で８０℃・８時間加熱撹拌した。反応終了後、反応混合物に水を加え、酢酸エチル（２０ｍＬ）で２回抽出後、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥した後、乾燥剤を濾別し溶媒を減圧留去した。得られた混合物を自動設定中圧カラムクロマトグラフィーシステム（山善社製）で精製することで黄色固体の２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−［（２−フタルイミド）エチル］インドール（５２１ｍｇ，３４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ ３．１２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．８０（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），６．８０（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．００（ｄｄ，Ｊ＝７．６ ａｎｄ ７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．０７（ｄｄ，Ｊ＝７．６ ａｎｄ ７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５７（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．７８−７．８２（ｍ，４Ｈ），９．６１（ｓ，１Ｈ），１１．０（ｓ，１Ｈ）．
参考例２ ２−［２−（４−ヒドロキシフェニル）インドール−３−イル］エチルアミン塩酸塩の合成
【００５２】
【化４】
２−（４−ヒドロキシフェニル）−３−［（２−フタルイミド）エチル］インドール（５２１ｍｇ，１．３４ｍｍｏｌ）をエタノール（８０ｍＬ）懸濁し、次いでヒドラジン一水和物（１ｍＬ）を加え、室温で１２時間撹拌した。反応終了後、エタノールと過剰のヒドラジン一水和物を完全に留去し、固体を析出させた。得られた固体を１Ｍ塩酸（２０ｍＬ×２）で洗浄し、ろ過した。得られたろ液を完全に乾固させることによって、黄土色固体の２−［２−（４−ヒドロキシフェニル）インドール−３−イル］エチルアミン塩酸塩（３６０ｍｇ，９３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，ＴＭＳ，ｐｐｍ）：δ ３．１４（ｔ，Ｊ＝２．９Ｈｚ，４Ｈ），３．５０（ｂｒｓ，２Ｈ），６．７６（ｄｄ，Ｊ＝２．１ ａｎｄ ６．６Ｈｚ，２Ｈ），７．１４（ｄｄｄ，Ｊ＝１．１ ａｎｄ ７．５ ａｎｄ ７．５ Ｈｚ，１Ｈ），７．２１（ｄｄｄ，Ｊ＝１．１ ａｎｄ ７．５ ａｎｄ ７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．２６（ｂｒｓ，１Ｈ），７．３５（ｄｄ，Ｊ＝１．１ ａｎｄ ７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄｄ，Ｊ＝２．１ ａｎｄ ６．６Ｈｚ，２Ｈ），７．６１（ｄｄ，Ｊ＝１．１ ａｎｄ ７．５Ｈｚ，１Ｈ），８．０２（ｓ，１Ｈ）．
実施例および参考例に記載の方法に基づき製造可能な、トリプタミン誘導体、該誘導体を固定化した担体（固定化ゲル）、該固定化ゲルのトリプタミン誘導体固定化量、および該固定化ゲルによるタンパク質（ヒト免疫グロブリン）捕捉量をまとめた表を表１から６に示す。
【００５３】
【化５】
【００５４】
【表１】
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】
【表４】
【００５８】
【表５】
【００５９】
【表６】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、または炭素数１から４のハロアルキル基もしくは水酸基で置換されていてもよいフェニル基を表し、Ｒ２は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７から１１のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、または炭素数７から１１のアラルキルオキシ基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２およびＸは同時に水素原子にはなり得ない。）で表される２−（インドール−３−イル）エチルアミノ基を、カルボニル基を介して不溶性担体に固定化して得られる、タンパク質捕捉剤。
【請求項２】
不溶性担体とカルボニル基導入剤とを反応させ、次いで一般式（１ａ）
【化２】
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、または炭素数１から４のハロアルキル基もしくは水酸基で置換されていてもよいフェニル基を表し、Ｒ２は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７から１１のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、または炭素数７から１１のアラルキルオキシ基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２およびＸは同時に水素原子にはなり得ない。）で表される２−（インドール−３−イル）エチルアミノ基と反応させて得られる、請求項１に記載のタンパク質捕捉剤。
【請求項３】
カルボニル基導入剤が、１，１’−カルボニルジイミダゾールである請求項２に記載のタンパク質捕捉剤。
【請求項４】
Ｒ１が水素原子、メチル基または４−ヒドロキシフェニル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｘが水素原子、５−クロロ、５−メトキシ、５−ベンジルオキシ、７−メトキシまたは７−ベンジルオキシである請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質捕捉剤。
【請求項５】
Ｒ１およびＸが下記（Ａ）または（Ｂ）である請求項４に記載のタンパク質捕捉剤。
（Ａ）Ｒ１がメチル基または４−ヒドロキシフェニル基であり、Ｘが水素原子
（Ｂ）Ｒ１が水素原子であり、Ｘが５−クロロ、５−メトキシ、５−ベンジルオキシ、７−メトキシまたは７−ベンジルオキシ
【請求項６】
不溶性担体が、水酸基を導入したポリメタクリレート、アガロース、セルロースのいずれかである、請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質捕捉剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のタンパク質捕捉剤を用いた、タンパク質の分離精製法。
【請求項８】
タンパク質が、免疫グロブリンまたはその類縁体、フラグメントもしくは融合体である、請求項７に記載の分離精製法。
【請求項１】
一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、または炭素数１から４のハロアルキル基もしくは水酸基で置換されていてもよいフェニル基を表し、Ｒ２は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７から１１のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、または炭素数７から１１のアラルキルオキシ基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２およびＸは同時に水素原子にはなり得ない。）で表される２−（インドール−３−イル）エチルアミノ基を、カルボニル基を介して不溶性担体に固定化して得られる、タンパク質捕捉剤。
【請求項２】
不溶性担体とカルボニル基導入剤とを反応させ、次いで一般式（１ａ）
【化２】
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、または炭素数１から４のハロアルキル基もしくは水酸基で置換されていてもよいフェニル基を表し、Ｒ２は水素原子、炭素数１から４のアルキル基、炭素数７から１１のアラルキル基、アミノ基で置換されていてもよいフェニル基、またはチエニル基を表し、Ｘは水素原子、ハロゲン原子、炭素数１から４のアルコキシ基、炭素数１から４のハロアルコキシ基、または炭素数７から１１のアラルキルオキシ基を表す。但し、Ｒ１、Ｒ２およびＸは同時に水素原子にはなり得ない。）で表される２−（インドール−３−イル）エチルアミノ基と反応させて得られる、請求項１に記載のタンパク質捕捉剤。
【請求項３】
カルボニル基導入剤が、１，１’−カルボニルジイミダゾールである請求項２に記載のタンパク質捕捉剤。
【請求項４】
Ｒ１が水素原子、メチル基または４−ヒドロキシフェニル基であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｘが水素原子、５−クロロ、５−メトキシ、５−ベンジルオキシ、７−メトキシまたは７−ベンジルオキシである請求項１から３のいずれかに記載のタンパク質捕捉剤。
【請求項５】
Ｒ１およびＸが下記（Ａ）または（Ｂ）である請求項４に記載のタンパク質捕捉剤。
（Ａ）Ｒ１がメチル基または４−ヒドロキシフェニル基であり、Ｘが水素原子
（Ｂ）Ｒ１が水素原子であり、Ｘが５−クロロ、５−メトキシ、５−ベンジルオキシ、７−メトキシまたは７−ベンジルオキシ
【請求項６】
不溶性担体が、水酸基を導入したポリメタクリレート、アガロース、セルロースのいずれかである、請求項１から５のいずれかに記載のタンパク質捕捉剤。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載のタンパク質捕捉剤を用いた、タンパク質の分離精製法。
【請求項８】
タンパク質が、免疫グロブリンまたはその類縁体、フラグメントもしくは融合体である、請求項７に記載の分離精製法。
【公開番号】特開２０１３−６３９２２（Ｐ２０１３−６３９２２Ａ）
【公開日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２０２８１１（Ｐ２０１１−２０２８１１）
【出願日】平成２３年９月１６日（２０１１．９．１６）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【出願人】（０００１７３７６２）公益財団法人相模中央化学研究所 (151)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年４月１１日（２０１３．４．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年９月１６日（２０１１．９．１６）
【出願人】（０００００３３００）東ソー株式会社 (1,901)
【出願人】（０００１７３７６２）公益財団法人相模中央化学研究所 (151)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]