塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体を含有する吸収促進組成物
【課題】効率よく生体に吸収されて十分な生理活性を発揮することができ、食品、化粧品、医薬品、飼料などの製造において煩雑な加工工程を経ることなく利用しうるという特徴を備えた塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する組成物、及びその製法を提供すること。
【解決手段】塩基性生理活性タンパク質濃度を０．００１％〜１０％、より好ましくは０．０１％〜０．５％、ソホロリピッド濃度を０．０１％〜１０％、より好ましくは０．１％〜１％、塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率を０．０００１〜１００、より好ましくは０．０１〜５、ｐＨを３〜８、より好ましくはｐＨ５〜７の範囲に制御することで、生体への吸収に適切な粒子サイズ、且つ塩基性生理活性タンパク質の３次構造を維持した複合体を形成させることができる。
【解決手段】塩基性生理活性タンパク質濃度を０．００１％〜１０％、より好ましくは０．０１％〜０．５％、ソホロリピッド濃度を０．０１％〜１０％、より好ましくは０．１％〜１％、塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率を０．０００１〜１００、より好ましくは０．０１〜５、ｐＨを３〜８、より好ましくはｐＨ５〜７の範囲に制御することで、生体への吸収に適切な粒子サイズ、且つ塩基性生理活性タンパク質の３次構造を維持した複合体を形成させることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッド含有製剤に関するものであり、塩基性生理活性タンパク質のキャリアとしてソホロリピッドを使用する。巨大なタンパク質分子は、生体内へ吸収されること、標的細胞内に取り込まれた後も活性を有すること、の二つを同時に実現するのは非常に困難であり、いずれか一方の性能を高めれば他方が損なわれるのが一般的である。本発明はこのように相反する２つの機能をともに損なわず、最適化された塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
「塩基性生理活性タンパク質」はアミノ酸の配列から計算される等電点（ｐＩ）が生体内のｐＨよりも高いものであり、より具体的にはｐＩとして７．５以上のものである。例えばラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ；Ｌｆ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、ラクトペルオキシダーゼ（Ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＬＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＦＧＦ）などが挙げられる。
【０００３】
塩基性生理活性タンパク質としては上記以外に様々なものが存在し、その生体への利用には様々な工夫がなされているが、その中から、乳由来の多機能性タンパク質としてラクトフェリンを具体的な例として挙げる。
【０００４】
ラクトフェリンは健康食品、化粧品に利用されている他、医薬品への応用にも期待がかけられている多機能性の有用物質である。ラクトフェリンの様々な生理活性として、抗菌、抗炎症、免疫賦活、抗癌、抗ウィルス、乳酸菌増殖促進、骨代謝正常化、創傷治癒、脂質代謝促進などが示されており（非特許文献１）、皮膚に関する作用としては、皮膚線維芽細胞のコラーゲン合成、ヒアルロン酸合成を促進することが示されている（非特許文献２）。このようなラクトフェリンの有用性は医薬品、健康食品や化粧品に利用することが期待されているが、実際に生体へ作用させるためには安定性やターゲット細胞へ輸送されたときの機能性を担保することが課題であり、ラクトフェリンの多彩な機能が十分には利用されていないのが現状である。
【０００５】
従来からの技術として特許文献１に、胃液中で溶出せず、ペプシンによる分解が低減されるような特殊加工を施したラクトフェリン複合体及びその製法技術が報告されており、ラクトフェリンの生理活性を維持したまま腸管に到達させることができる。しかしながら、この技術では、ラクトフェリンと高分子酸の粉末をあらかじめ脂質皮膜でコーティングし、水溶液中に分散させ、加熱下で複合体を形成させた後に回収するため、非常に煩雑な工程を経る必要がある。特許文献１に限らず、従来からのラクトフェリン複合体の製法においては、調製方法の煩雑さが実用性を低下せしめているのが現状である。
【０００６】
引用文献では、有効成分を生体内（の標的細胞）へ輸送する手法の一例として、リン脂質などの両親媒性物質の会合によって形成する二分子膜からなるリポソームと呼ばれるベシクルを利用したものがある。リポソームは薬物担体として脚光を集めたが、一般にベシクルは熱力学的に不安定であり、ベシクル粒子同士の凝集や融合、膜成分の結晶化による沈殿の生成、粒子径の増大などが起こり、効力の低下や外観変化による商品価値の損失が生じやすい。
【０００７】
Ｋ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０，２１１７−２１２２（２００４）ではアニオン系の界面活性剤（例えばオクチル硫酸ナトリウム）とカチオン系の界面活性剤（例えばセチルトリメチルアンモニウムブロマイド）の混合により熱力学的に安定なベシクルを形成することが報告されており、粒子同士の凝集、融合、膜成分の結晶化による沈殿、粒子径の増大がおこらず長期間安定である（非特許文献３）。しかしながら、カチオン系の界面活性剤は毒性を示すことから、生体への適用には適さない。また、調製に手間がかかることも実用性を低下させる問題点である。
【０００８】
カチオン系の界面活性剤を用いない方法としては、ポリエチレングリコールとリン脂質を混合してベシクルを形成させる技術も開示されているが（特許文献２）、多成分系であるため、ベシクル形成の煩雑さが課題として残されている。
【０００９】
ベシクル形成の煩雑さを改善する素材として、酵母や細菌が作る界面活性剤（バイオサーファクタント）を用いる方法が報告されており、マンノシルエリスリトールリピッドを利用した技術（特許文献３）やソホロリピッドを利用した技術（特許文献４）がある。マンノシルエリスリトールリピッドはマンノース骨格を有し、マンノース骨格の１位の水酸基に糖アルコールがグリコシド結合しているバイオサーファクタントであり、ソホロリピッドは、ソホロース（グルコースが２つ結合したもの）とヒドロキシ脂肪酸からなる両親媒性の糖脂質である。いずれの特許もこれらのバイオサーファクタントをキャリアとして用いることにより有効成分の経皮吸収性が上昇することを特徴としている。
【００１０】
しかしながら、生体内へ輸送される有効成分の分子サイズは１ｋＤａ程度の化合物のデータが示されているのみであり、数十〜数百ｋＤａにも及ぶタンパク質を有効成分とする場合について皮膚への浸透性が十分に得られるかの検証がなされていない。更にタンパク質は界面活性剤による変性を起こすことが予想され、浸透性は高まっても有効性が失われる可能性が懸念される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０１６５９５
【特許文献２】特開２００２−２１２１０６号公報
【特許文献３】特開２００９−１６７１５９号公報
【特許文献４】特開２００９−６２２８８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｕｚｕｋｉ ａｎｄ Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｆｏｏｄ Ｒｅｖ （２０１０）
【非特許文献２】Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ （２０１０）
【非特許文献３】Ｋ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０，２１１７−２１２２ （２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
効率よく生体に吸収されて十分な生理活性を発揮することができ、食品、化粧品、医薬品、飼料などの製造において煩雑な加工工程を経ることなく利用しうるという特徴を備えた塩基性生理活性タンパク質とキャリア複合体組成物、及びその製法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体を含有する組成物
【００１５】
塩基性生理活性タンパク質濃度０．００１％〜１０％、ソホロリピッド濃度０．０１％〜１０％、塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率０．０００１〜１００、ｐＨ３〜８、に制御することを特徴とする［００１４］に記載の組成物
【００１６】
塩基性生理活性タンパク質濃度０．０１％〜０．５％、ソホロリピッド濃度０．１％〜１％、塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率０．０１〜５、ｐＨ５〜７に制御することを特徴とする［００１４］に記載の組成物
【００１７】
塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体粒子のサイズを１ｎｍ〜３μｍであることを特徴とする［００１４］から［００１６］のいずれかに記載の組成物
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、立体構造変化をほとんど起こさせず細胞間隙を浸透させるに十分な粒子径の塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体を形成することにより、複合体の生体吸収性は塩基性生理活性タンパク質単独の場合と比べ飛躍的に高まり、同時に塩基性生理活性タンパク質の様々な生理活性は複合体においても維持あるいは増進される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】塩基性生理活性タンパク質の濃度とソホロリピッド濃度とｐＨの間の相関関係を示す図
【図２】ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ。ソホロリピッド、ラクトフェリン、及び混合物の粒度分布を示す図
【図３】ラクトフェリン、およびラクトフェリン−ソホロリピッド複合体による３次元培養皮膚モデルを使用した経皮吸収性試験の結果を示す図
【図４】ラクトフェリン、およびラクトフェリン−ソホロリピッド複合体による線維芽細胞の増殖促進効果（リン酸バッファー、ｐＨ７）を示す図
【図５】ラクトフェリン、及びラクトフェリン−ソホロリピッド複合体による線維芽細胞の増殖促進効果（クエン酸バッファー、ｐＨ５）を示す図
【図６】ラクトフェリン及びラクトフェリン−ソホロリピッド複合体のＣＤスペクトルを示す図
【図７】ラクトフェリン及びラクトフェリン−ソホロリピッド複合体の表面疎水性度を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において「塩基性生理活性タンパク質」とは天然の塩基性生理活性タンパク質分子そのもののほか、遺伝子組み換え型タンパク質、及び塩基性生理活性タンパク質の活性フラグメントなどの塩基性生理活性タンパク質の機能的等価物をも包含し、由来する生物種を問わない。また、本発明において「塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する組成物」は塩基性生理活性タンパク質を含有する組成物であって、食品、化粧品、医薬品、飼料などの他の製品の素材として使用されうるものであり、塩基性生理活性タンパク質の生理活性又は特徴をそれが使用された製品において発揮させることを少なくとも１つの目的として使用されるべき素材組成物を意味する。
【００２１】
本発明において「ソホロリピッド」とはスタルメレラ属に属する微生物、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、あるいはカンジダ属Ｃ．Ａｐｉｃｏｌａ、Ｃ．ｐｅｔｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓなどの酵母を培養することにより、その培地中に生産物として得ることができる。
【００２２】
ソホロリピッドはソホロース又はヒドロキシル基が一部アセチル化したソホロースと、ヒドロキシ脂肪酸とからなる糖脂質である。なお、ソホロースとはβ１→２結合した２分子のブドウ糖からなる糖であり、ヒドロキシ脂肪酸はヒドロキシル基を有する脂肪酸である。ソホロリピッドは分子内のソホロースが結合したラクトン型と、ヒドロキシル脂肪酸のカルボキシル基が遊離した酸型とに大別され、ラクトン型ソホロリピッド、酸型ソホロリピッド、酸型ソホロリピッド塩が存在する。
【００２３】
塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドをそれぞれ、又は粉体混合後に水に溶解、または分散させ、各単独に分散または溶解させた場合はそれぞれの水溶液を混合し攪拌により均一な溶液とすることにより、最終濃度に調整する。
【００２４】
塩基性生理活性タンパク質の濃度が０．００１％よりも少なくなると十分な生理作用を発揮することができなくなり、１０％よりも多くなるとソホロリピッドとの複合体形成及び粒子サイズを制御することが困難になる。また、価格的にも産業利用の上で非現実的な配合量となる。十分な生理活性が得られ、且つ複合体形成の制御を行いやすい塩基性生理活性タンパク質の最終溶液中濃度として０．０１％〜１％とすることが好ましい（図１）。
【００２５】
次にソホロリピッドの濃度が０．０１％より低くなると生理作用を期待できる濃度の塩基性生理活性タンパク質との複合体形成が十分になされず、機能の面で不完全となり、１０％より多くなるとソホロリピッドの有する界面活性能により塩基性生理活性タンパク質の立体構造を変化させるリスクが高くなり、その結果として塩基性生理活性タンパク質の生理活性が損なわれてしまう。塩基性生理活性タンパク質との複合体形成に十分であり、かつ生理活性を損なわないためのソホロリピッド濃度としては０．１％〜１％とするのがより好ましい（図１）。
【００２６】
塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッド濃度比率が０．０００１以下となると、塩基性生理活性タンパク質過多のため、細胞間隙の浸透性が低くなり、標的細胞へ届けられる塩基性生理活性タンパク質輸送効率が著しく低下し、１００以上となるとソホロリピッド過多となり、塩基性生理活性タンパク質の変性に伴う生理活性の低下がおこる。塩基性生理活性タンパク質の輸送効率を上げ、生理活性を維持させるために塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率は０．０１〜１０とするのがより好ましい（図１）。
【００２７】
このような配合量、及び配合比率で形成させる塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体溶液のｐＨは３〜８の範囲に制御することが必要であり、より好ましくはｐＨを５〜７の範囲に制御することが望ましい。ｐＨが３よりも低くなると複合体の粒子サイズが大きくなりすぎて、細胞間隙を浸透させることが難しくなり、ｐＨが８を越えると塩基性生理活性タンパク質の等電点に近づくために、塩基性生理活性タンパク質の安定性が損なわれる。複合体粒子サイズを適正に制御し、塩基性生理活性タンパク質を安定な状態に保つためにｐＨは５〜７とするのがより好ましい（図１）。
【００２８】
本発明の複合体は塩基性生理活性タンパク質を含有する粉末とソホロリピッドを含有する粉末とをそれぞれ別々に容器に収容しておき、必要なときにこれらを混合し、水性溶液と一緒にすることもできる。あるいは、塩基性生理活性タンパク質を含有する粉末とソホロリピッドを含有する粉末とを既に混合された状態で容器に収容しておき必要時には水性溶液と一緒にするだけの原料製品として提供してもよい。
【００２９】
本発明の複合体は複合体を形成させた後、そのままの形態、すなわちコロイド状の沈殿物、ゾル、又はゲルなどの形態で使用することができるが、形成された複合体をさらに処理して、粉末、乳化懸濁液などの別の形態にしてもよい。たとえば、複合体を形成させたあと、遠心分離などで処理し、この複合体をさらに凍結乾燥し、粉砕加工して粉末状にすることもできる。
【００３０】
本発明の複合体組成物は、上記のような形態の複合体そのままであってもよく、また、複合体に付加的な成分を加えて、又は加えずに、錠剤、顆粒、丸薬などの任意の形態にして利用することができる。このような形態への加工の方法は製剤技術の分野において公知である。
【００３１】
本発明の組成物には塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドに加えて、一般的に使用されているその他の付加的な成分を含むことができ、そのような成分の種類、添加量の選択は製造しようとする具体的な組成物の形態、用途など及び組成物を適用しようとする製品の性質などに応じて適宜行うことができる。
【００３２】
付加的な成分とは、例えば、可塑剤、賦形剤、乳化剤、安定剤、ビタミン類、ミネラル類、ＥＰＡ，ＤＨＡ，コエンザイムＱ１０など脂溶性又は水溶性の一般的栄養成分、モルヒネなどの薬効成分、乳酸菌類、抗酸化剤、抗菌剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進剤、保湿剤、ホルモン剤、色素、たんぱく質、脂質などが挙げられる。
【００３３】
具体的な成分名としては、例えば、オリーブ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ種子油、ヤシ油、パーム油、マカデミアナッツ油、ワックス類、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、パラフィン、セレシン、オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、アクリル酸、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール、グアガム、カラギーナン、アラビアガム、ペクチン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシビニルポリマー、コラーゲン、コラーゲン誘導体、エラスチン、エラスチン誘導体、ヒアルロン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、卵黄レシチン、水添卵黄レシチン、大豆レシチン、水添大豆レシチン、羅漢果配糖体、ステビオサイド、グリチルリチン、グリチルリチン酸２カリウム、イソフラボン配糖体、アスタキサンチンなどを挙げることができる。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下に実施例によって説明するが、これら実施例は例示のみを意図しており、本発明の範囲を限定しない。本発明の範囲内の他の局面、利点、および改変は、本発明の当業者には明らかである。
【００３５】
（性能確認試験１）塩基性生理活性タンパク質−ソホロリピッド複合体形成の確認塩基性生理活性タンパク質としてラクトフェリンを使用したソホロリピッドとラクトフェリンの複合体形成に関しては動的光散乱式粒度分布測定装置による粒度分布測定をおこなった。測定温度は２５℃、粒度分布は体積基準（ｄ４，３）で表した。
【００３６】
図２に示されるとおり、ソホロリピッド単独溶液における粒子の直径はｐＨ条件に応じて４０ｎｍ〜２μｍであり、ｐＨが低いほど粒子の直径が大きくなる傾向が認められた。ラクトフェリンはｐＨ条件によらず、直径約１０ｎｍの粒子サイズであったが、ソホロリピッド、ラクトフェリン混合溶液では、それぞれの粒子サイズがシフトした。
ｐＨ５ではラクトフェリン単独で見られた粒子サイズが消失し、ソホロリピッドの粒子サイズへシフトし、ｐＨ７ではソホロリピッド単独で見られた粒子サイズが消失し、ラクトフェリンの粒子サイズへシフトした。以上の結果より、ラクトフェリン−ソホロリピッドの複合体が形成されることが示された
【００３７】
（性能確認試験２）ラクトフェリンの経皮吸収性の測定
ラクトフェリン単独、及びラクトフェリンとソホロリピッド複合体を３次元培養皮膚（東洋紡績株式会社：ＴＥＳＴＳＫＩＭ）の表皮側に作用させ、３０，６０，１２０分後に真皮側の下層溶液を回収し、ラクトフェリンの量をＥＬＩＳＡキット（ＢＥＴＨＹＬ社製）にて定量した。
【００３８】
図３に示されるとおり、ソホロリピッドと複合体を形成させることにより、ラクトフェリンの経皮吸収性が飛躍的に上昇することが示された。
【００３９】
ラクトフェリンの標的細胞への生理作用を評価するために、ヒト皮膚真皮線維芽細胞にラクトフェリン、ソホロリピッド単独及び複合体溶液を作用させ、細胞増殖促進効果を評価した。培養３日目・４日目それぞれについて、バッファーのみを加えた群に対するその他の群における細胞増殖率を図４に示した。
【００４０】
培養３日後には、今回試験を行ったすべての濃度において細胞賦活活性が認められ、バッファー群と比較してラクトフェリン０．０１％により３６．８％、ラクトフェリン０．０３％により２７．３％、ラクトフェリン０．０５％により２２．９％、それぞれ有意に細胞増殖率が上昇していた（ｐ＜０．０１，図４）。これと同濃度のラクトフェリンに関して、ソホロリピッド０．０１％と混合することによって形成させたラクトフェリン−ソホロリピッド複合体で線維芽細胞を処理した場合、ソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０１％における細胞増殖率の上昇は３５．２％、ソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０３％では３２．５％、ソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０５％は２２．４％であり、バッファー群との比較においては有意な細胞増殖率の上昇を認めたが（ｐ＜０．０１，図４）、いずれの濃度においても、ラクトフェリン単独で作用させた場合と有意な差はなかった（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定による）。培養４日後においても、細胞増殖率の増加幅がやや異なるものの、培養３日目における結果とほぼ同じ傾向を示した。従って、ｐＨ＝７におけるソホロリピッドとラクトフェリンの複合体形成は、ラクトフェリンによる線維芽細胞の増殖促進効果に関して影響がないことが示された。
【００４１】
一方、クエン酸バッファー、（ｐＨ５）を用いた場合、図５に示したように、培養３日後にはラクトフェリン０．０１％により１４．９％、０．０３％により１７．２％と、リン酸バッファー、（ｐＨ７）よりは弱いものの有意な細胞増殖率の上昇が認められた（ｐ＜０．０１，図５）。しかし、ラクトフェリン０．０５％では、細胞増殖率に有意な変化がみられなかった。これと同濃度のラクトフェリンに関して、ソホロリピッド０．０１％と混合することによって形成させたラクトフェリン−ソホロリピッド複合体で線維芽細胞を処理した場合、ソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０３％のみで１２．５％の細胞増殖率の上昇（ｐ＜０．０５，図５）を認めたが、ソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０１％およびソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０５％では、細胞増殖率の上昇は有意な変化とはいえなかった（上昇率はそれぞれ１０．９％，０．６％）。培養４日後のラクトフェリンによる細胞増殖促進効果は、濃度０．０１％で２４．４％、０．０３％で１７．２％、０．０５％で１０．７％と、いずれの濃度においても有意な増殖促進効果が認められた（ｐ＜０．０１，図５）。
【００４２】
しかしながら、クエン酸バッファー系（ｐＨ＝５）においては、評価を行ったすべてのラクトフェリン濃度について、ラクトフェリン−ソホロリピッドによる細胞賦活性は、ラクトフェリン単独で作用させた場合の細胞賦活性よりも有意に低下していた（図５、ソホロリピッドを含まない同濃度のラクトフェリン群との比較で＃ｐ＜０．０５，＃＃ｐ＜０．０１）。
【００４３】
図４、及び図５で示されたとおり、皮膚真皮由来の線維芽細胞におけるラクトフェリンの細胞増殖促進効果はソホロリピッド共存下でも保持された。しかし、ｐＨ、ラクトフェリン濃度、ソホロリピッド濃度によって複合体の細胞増殖促進効果が異なることも示唆された。
【００４４】
化粧品ローションとしての実施例
実施例１ 比較例１
ラクトフェリン ０．２％ ０．２％
ソホロリピッド ０．２％ −
１，３−ブチレングリコール ４．０％ ４．０％
ジプロピレングリコール １．０％ １．０％
セタノール ２．０％ ２．０％
ＰＯＥ硬化ヒマシ油 ０．２％ ０．２％
スクワラン ０．５％ ０．５％
エタノール ５．０％ ５．０％
ｐＨ調整剤 適量（６．０）適量（６．０）
防腐剤 適量 適量
水 残量 適量
【００４５】
実施例２：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する顆粒形態の素材組成物
ラクトフェリン５ｇ、ソホロリピッド５ｇ、エリスリトール２０ｇ、デキストリン７０ｇ、ｐＨ調整剤適量（ｐＨ６．５となるように調整）を流動層造粒機にいれ、イオン交換水１００ｇを噴霧して造粒し、顆粒形態の素材組成物を得た。この素材組成物は顆粒状食品、医薬品、飼料に適用できる。
【００４６】
実施例３：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する液状形態の組成物
ラクトフェリン０．５ｇ、ソホロリピッド０．２５ｇ、エリスリトール５ｇ、スクラロース０．３ｇ、ｐＨ調整剤適量（ｐＨ３．５となるように調整）、防腐剤適量、残量をイオン交換水で総量１００ｇとし、７５℃まで昇温し、プロペラ攪拌機により１５分間分散溶解させ、液状形態の組成物を得た。本組成物は清涼飲料、飼料として適用できる。
【００４７】
実施例４：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する固形状の錠剤
ラクトフェリン２．５ｇ、ソホロリピッド１ｇ、マルチトール３３ｇ、ソルビトール３３ｇ、エリスリトール１５ｇ、クエン酸４ｇ、香料２ｇ、ステアリン酸カルシウム３ｇ、ミルクカルシウム６ｇ、スクラロース０．５ｇで総量１００ｇとし、打錠装置を用いて固形状形態の錠剤を得た。本錠剤は食品サプリメント、飼料に適用できる。
【００４８】
実施例５：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有するクリーム
油相成分としてホホバ油５ｇ、プロピルパラベン０．１ｇ、ソホロリピッド２．５ｇ、スクワラン１０ｇを８０℃で加温溶解した。水相成分として、イオン交換水７０ｇ、カルボキシビニルポリマー０．４ｇ、グリセリン５ｇ、ラクトフェリン０．５ｇ、メチルパラベン０．２ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０、０．２５ｇ、ｐＨ調整剤適量（最終ｐＨ６．５に調整）を８０℃で加温溶解した。油相分散液を攪拌しながら水相溶解液を加え１０分間攪拌し、トリエタノールアミン０．４ｇとイオン交換水残量を加え、総量１００ｇに調整し、攪拌しながら３５℃まで冷却し、クリームを得た。
【００４９】
実施例６：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有するゲル状組成物
カルボキシビニルポリマーの２重量％水溶液を１０ｇ、キサンタンガム１０ｇ、ヘキシレングリコール１０ｇ、ソホロリピッド１ｇ、グリセリン１ｇ、フェノキシエタノール０．５ｇ、ラクトフェリン０．５ｇ、エタノール５ｇ、アスコルビン酸０．１ｇ（ｐＨ６前後）、ビタミンＥ０．０００１ｇ、香料０．０１ｇ、イオン交換水残量を加え、総量１００ｇに調整し、ゲル状組成物を得た。ゲル状化粧品基材（美白剤など）として適用できる。
【００５０】
実施例７：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有するゾル状組成物
パラチノース８ｇ、キシリトール２ｇ、ラクトフェリン０．２ｇ、ソホロリピッド０．２ｇ、クエン酸ナトリウム０．１２ｇ、クエン酸０．２２ｇ、香料０．２ｇ、キサンタンガム０．５ｇ、イオン交換水残量で全量１００ｇに調整し、加温攪拌溶解し、ゾル状組成物を得た。食品、飼料として適用する。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のラクトフェリン−ホロリピッド複合体を含有する製剤は化粧品、医薬品、食品、飼料、及びそれらの添加剤として好適に使用することが可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッド含有製剤に関するものであり、塩基性生理活性タンパク質のキャリアとしてソホロリピッドを使用する。巨大なタンパク質分子は、生体内へ吸収されること、標的細胞内に取り込まれた後も活性を有すること、の二つを同時に実現するのは非常に困難であり、いずれか一方の性能を高めれば他方が損なわれるのが一般的である。本発明はこのように相反する２つの機能をともに損なわず、最適化された塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
「塩基性生理活性タンパク質」はアミノ酸の配列から計算される等電点（ｐＩ）が生体内のｐＨよりも高いものであり、より具体的にはｐＩとして７．５以上のものである。例えばラクトフェリン（Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ；Ｌｆ）、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、ラクトペルオキシダーゼ（Ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＬＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＦＧＦ）などが挙げられる。
【０００３】
塩基性生理活性タンパク質としては上記以外に様々なものが存在し、その生体への利用には様々な工夫がなされているが、その中から、乳由来の多機能性タンパク質としてラクトフェリンを具体的な例として挙げる。
【０００４】
ラクトフェリンは健康食品、化粧品に利用されている他、医薬品への応用にも期待がかけられている多機能性の有用物質である。ラクトフェリンの様々な生理活性として、抗菌、抗炎症、免疫賦活、抗癌、抗ウィルス、乳酸菌増殖促進、骨代謝正常化、創傷治癒、脂質代謝促進などが示されており（非特許文献１）、皮膚に関する作用としては、皮膚線維芽細胞のコラーゲン合成、ヒアルロン酸合成を促進することが示されている（非特許文献２）。このようなラクトフェリンの有用性は医薬品、健康食品や化粧品に利用することが期待されているが、実際に生体へ作用させるためには安定性やターゲット細胞へ輸送されたときの機能性を担保することが課題であり、ラクトフェリンの多彩な機能が十分には利用されていないのが現状である。
【０００５】
従来からの技術として特許文献１に、胃液中で溶出せず、ペプシンによる分解が低減されるような特殊加工を施したラクトフェリン複合体及びその製法技術が報告されており、ラクトフェリンの生理活性を維持したまま腸管に到達させることができる。しかしながら、この技術では、ラクトフェリンと高分子酸の粉末をあらかじめ脂質皮膜でコーティングし、水溶液中に分散させ、加熱下で複合体を形成させた後に回収するため、非常に煩雑な工程を経る必要がある。特許文献１に限らず、従来からのラクトフェリン複合体の製法においては、調製方法の煩雑さが実用性を低下せしめているのが現状である。
【０００６】
引用文献では、有効成分を生体内（の標的細胞）へ輸送する手法の一例として、リン脂質などの両親媒性物質の会合によって形成する二分子膜からなるリポソームと呼ばれるベシクルを利用したものがある。リポソームは薬物担体として脚光を集めたが、一般にベシクルは熱力学的に不安定であり、ベシクル粒子同士の凝集や融合、膜成分の結晶化による沈殿の生成、粒子径の増大などが起こり、効力の低下や外観変化による商品価値の損失が生じやすい。
【０００７】
Ｋ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０，２１１７−２１２２（２００４）ではアニオン系の界面活性剤（例えばオクチル硫酸ナトリウム）とカチオン系の界面活性剤（例えばセチルトリメチルアンモニウムブロマイド）の混合により熱力学的に安定なベシクルを形成することが報告されており、粒子同士の凝集、融合、膜成分の結晶化による沈殿、粒子径の増大がおこらず長期間安定である（非特許文献３）。しかしながら、カチオン系の界面活性剤は毒性を示すことから、生体への適用には適さない。また、調製に手間がかかることも実用性を低下させる問題点である。
【０００８】
カチオン系の界面活性剤を用いない方法としては、ポリエチレングリコールとリン脂質を混合してベシクルを形成させる技術も開示されているが（特許文献２）、多成分系であるため、ベシクル形成の煩雑さが課題として残されている。
【０００９】
ベシクル形成の煩雑さを改善する素材として、酵母や細菌が作る界面活性剤（バイオサーファクタント）を用いる方法が報告されており、マンノシルエリスリトールリピッドを利用した技術（特許文献３）やソホロリピッドを利用した技術（特許文献４）がある。マンノシルエリスリトールリピッドはマンノース骨格を有し、マンノース骨格の１位の水酸基に糖アルコールがグリコシド結合しているバイオサーファクタントであり、ソホロリピッドは、ソホロース（グルコースが２つ結合したもの）とヒドロキシ脂肪酸からなる両親媒性の糖脂質である。いずれの特許もこれらのバイオサーファクタントをキャリアとして用いることにより有効成分の経皮吸収性が上昇することを特徴としている。
【００１０】
しかしながら、生体内へ輸送される有効成分の分子サイズは１ｋＤａ程度の化合物のデータが示されているのみであり、数十〜数百ｋＤａにも及ぶタンパク質を有効成分とする場合について皮膚への浸透性が十分に得られるかの検証がなされていない。更にタンパク質は界面活性剤による変性を起こすことが予想され、浸透性は高まっても有効性が失われる可能性が懸念される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０１６５９５
【特許文献２】特開２００２−２１２１０６号公報
【特許文献３】特開２００９−１６７１５９号公報
【特許文献４】特開２００９−６２２８８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｕｚｕｋｉ ａｎｄ Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｆｏｏｄ Ｒｅｖ （２０１０）
【非特許文献２】Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ （２０１０）
【非特許文献３】Ｋ．Ｔｓｕｃｈｉｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２０，２１１７−２１２２ （２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
効率よく生体に吸収されて十分な生理活性を発揮することができ、食品、化粧品、医薬品、飼料などの製造において煩雑な加工工程を経ることなく利用しうるという特徴を備えた塩基性生理活性タンパク質とキャリア複合体組成物、及びその製法を提供すること。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体を含有する組成物
【００１５】
塩基性生理活性タンパク質濃度０．００１％〜１０％、ソホロリピッド濃度０．０１％〜１０％、塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率０．０００１〜１００、ｐＨ３〜８、に制御することを特徴とする［００１４］に記載の組成物
【００１６】
塩基性生理活性タンパク質濃度０．０１％〜０．５％、ソホロリピッド濃度０．１％〜１％、塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率０．０１〜５、ｐＨ５〜７に制御することを特徴とする［００１４］に記載の組成物
【００１７】
塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体粒子のサイズを１ｎｍ〜３μｍであることを特徴とする［００１４］から［００１６］のいずれかに記載の組成物
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、立体構造変化をほとんど起こさせず細胞間隙を浸透させるに十分な粒子径の塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体を形成することにより、複合体の生体吸収性は塩基性生理活性タンパク質単独の場合と比べ飛躍的に高まり、同時に塩基性生理活性タンパク質の様々な生理活性は複合体においても維持あるいは増進される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】塩基性生理活性タンパク質の濃度とソホロリピッド濃度とｐＨの間の相関関係を示す図
【図２】ａ，ｂ，ｃ，ｄ，ｅ，ｆ。ソホロリピッド、ラクトフェリン、及び混合物の粒度分布を示す図
【図３】ラクトフェリン、およびラクトフェリン−ソホロリピッド複合体による３次元培養皮膚モデルを使用した経皮吸収性試験の結果を示す図
【図４】ラクトフェリン、およびラクトフェリン−ソホロリピッド複合体による線維芽細胞の増殖促進効果（リン酸バッファー、ｐＨ７）を示す図
【図５】ラクトフェリン、及びラクトフェリン−ソホロリピッド複合体による線維芽細胞の増殖促進効果（クエン酸バッファー、ｐＨ５）を示す図
【図６】ラクトフェリン及びラクトフェリン−ソホロリピッド複合体のＣＤスペクトルを示す図
【図７】ラクトフェリン及びラクトフェリン−ソホロリピッド複合体の表面疎水性度を示す図
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明において「塩基性生理活性タンパク質」とは天然の塩基性生理活性タンパク質分子そのもののほか、遺伝子組み換え型タンパク質、及び塩基性生理活性タンパク質の活性フラグメントなどの塩基性生理活性タンパク質の機能的等価物をも包含し、由来する生物種を問わない。また、本発明において「塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する組成物」は塩基性生理活性タンパク質を含有する組成物であって、食品、化粧品、医薬品、飼料などの他の製品の素材として使用されうるものであり、塩基性生理活性タンパク質の生理活性又は特徴をそれが使用された製品において発揮させることを少なくとも１つの目的として使用されるべき素材組成物を意味する。
【００２１】
本発明において「ソホロリピッド」とはスタルメレラ属に属する微生物、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂｏｍｂｉｃｏｌａ、あるいはカンジダ属Ｃ．Ａｐｉｃｏｌａ、Ｃ．ｐｅｔｒｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃ．ｂｏｇｏｒｉｅｎｓｉｓなどの酵母を培養することにより、その培地中に生産物として得ることができる。
【００２２】
ソホロリピッドはソホロース又はヒドロキシル基が一部アセチル化したソホロースと、ヒドロキシ脂肪酸とからなる糖脂質である。なお、ソホロースとはβ１→２結合した２分子のブドウ糖からなる糖であり、ヒドロキシ脂肪酸はヒドロキシル基を有する脂肪酸である。ソホロリピッドは分子内のソホロースが結合したラクトン型と、ヒドロキシル脂肪酸のカルボキシル基が遊離した酸型とに大別され、ラクトン型ソホロリピッド、酸型ソホロリピッド、酸型ソホロリピッド塩が存在する。
【００２３】
塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドをそれぞれ、又は粉体混合後に水に溶解、または分散させ、各単独に分散または溶解させた場合はそれぞれの水溶液を混合し攪拌により均一な溶液とすることにより、最終濃度に調整する。
【００２４】
塩基性生理活性タンパク質の濃度が０．００１％よりも少なくなると十分な生理作用を発揮することができなくなり、１０％よりも多くなるとソホロリピッドとの複合体形成及び粒子サイズを制御することが困難になる。また、価格的にも産業利用の上で非現実的な配合量となる。十分な生理活性が得られ、且つ複合体形成の制御を行いやすい塩基性生理活性タンパク質の最終溶液中濃度として０．０１％〜１％とすることが好ましい（図１）。
【００２５】
次にソホロリピッドの濃度が０．０１％より低くなると生理作用を期待できる濃度の塩基性生理活性タンパク質との複合体形成が十分になされず、機能の面で不完全となり、１０％より多くなるとソホロリピッドの有する界面活性能により塩基性生理活性タンパク質の立体構造を変化させるリスクが高くなり、その結果として塩基性生理活性タンパク質の生理活性が損なわれてしまう。塩基性生理活性タンパク質との複合体形成に十分であり、かつ生理活性を損なわないためのソホロリピッド濃度としては０．１％〜１％とするのがより好ましい（図１）。
【００２６】
塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッド濃度比率が０．０００１以下となると、塩基性生理活性タンパク質過多のため、細胞間隙の浸透性が低くなり、標的細胞へ届けられる塩基性生理活性タンパク質輸送効率が著しく低下し、１００以上となるとソホロリピッド過多となり、塩基性生理活性タンパク質の変性に伴う生理活性の低下がおこる。塩基性生理活性タンパク質の輸送効率を上げ、生理活性を維持させるために塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率は０．０１〜１０とするのがより好ましい（図１）。
【００２７】
このような配合量、及び配合比率で形成させる塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体溶液のｐＨは３〜８の範囲に制御することが必要であり、より好ましくはｐＨを５〜７の範囲に制御することが望ましい。ｐＨが３よりも低くなると複合体の粒子サイズが大きくなりすぎて、細胞間隙を浸透させることが難しくなり、ｐＨが８を越えると塩基性生理活性タンパク質の等電点に近づくために、塩基性生理活性タンパク質の安定性が損なわれる。複合体粒子サイズを適正に制御し、塩基性生理活性タンパク質を安定な状態に保つためにｐＨは５〜７とするのがより好ましい（図１）。
【００２８】
本発明の複合体は塩基性生理活性タンパク質を含有する粉末とソホロリピッドを含有する粉末とをそれぞれ別々に容器に収容しておき、必要なときにこれらを混合し、水性溶液と一緒にすることもできる。あるいは、塩基性生理活性タンパク質を含有する粉末とソホロリピッドを含有する粉末とを既に混合された状態で容器に収容しておき必要時には水性溶液と一緒にするだけの原料製品として提供してもよい。
【００２９】
本発明の複合体は複合体を形成させた後、そのままの形態、すなわちコロイド状の沈殿物、ゾル、又はゲルなどの形態で使用することができるが、形成された複合体をさらに処理して、粉末、乳化懸濁液などの別の形態にしてもよい。たとえば、複合体を形成させたあと、遠心分離などで処理し、この複合体をさらに凍結乾燥し、粉砕加工して粉末状にすることもできる。
【００３０】
本発明の複合体組成物は、上記のような形態の複合体そのままであってもよく、また、複合体に付加的な成分を加えて、又は加えずに、錠剤、顆粒、丸薬などの任意の形態にして利用することができる。このような形態への加工の方法は製剤技術の分野において公知である。
【００３１】
本発明の組成物には塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドに加えて、一般的に使用されているその他の付加的な成分を含むことができ、そのような成分の種類、添加量の選択は製造しようとする具体的な組成物の形態、用途など及び組成物を適用しようとする製品の性質などに応じて適宜行うことができる。
【００３２】
付加的な成分とは、例えば、可塑剤、賦形剤、乳化剤、安定剤、ビタミン類、ミネラル類、ＥＰＡ，ＤＨＡ，コエンザイムＱ１０など脂溶性又は水溶性の一般的栄養成分、モルヒネなどの薬効成分、乳酸菌類、抗酸化剤、抗菌剤、抗炎症剤、血行促進剤、美白剤、肌荒れ防止剤、老化防止剤、発毛促進剤、保湿剤、ホルモン剤、色素、たんぱく質、脂質などが挙げられる。
【００３３】
具体的な成分名としては、例えば、オリーブ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ種子油、ヤシ油、パーム油、マカデミアナッツ油、ワックス類、流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、パラフィン、セレシン、オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、アクリル酸、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３−ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２−ペンタンジオール、２，４−ヘキシレングリコール、１，２−ヘキサンジオール、１，２−オクタンジオール、グアガム、カラギーナン、アラビアガム、ペクチン、キサンタンガム、カードラン、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、メチルヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシビニルポリマー、コラーゲン、コラーゲン誘導体、エラスチン、エラスチン誘導体、ヒアルロン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、卵黄レシチン、水添卵黄レシチン、大豆レシチン、水添大豆レシチン、羅漢果配糖体、ステビオサイド、グリチルリチン、グリチルリチン酸２カリウム、イソフラボン配糖体、アスタキサンチンなどを挙げることができる。
【実施例】
【００３４】
本発明を以下に実施例によって説明するが、これら実施例は例示のみを意図しており、本発明の範囲を限定しない。本発明の範囲内の他の局面、利点、および改変は、本発明の当業者には明らかである。
【００３５】
（性能確認試験１）塩基性生理活性タンパク質−ソホロリピッド複合体形成の確認塩基性生理活性タンパク質としてラクトフェリンを使用したソホロリピッドとラクトフェリンの複合体形成に関しては動的光散乱式粒度分布測定装置による粒度分布測定をおこなった。測定温度は２５℃、粒度分布は体積基準（ｄ４，３）で表した。
【００３６】
図２に示されるとおり、ソホロリピッド単独溶液における粒子の直径はｐＨ条件に応じて４０ｎｍ〜２μｍであり、ｐＨが低いほど粒子の直径が大きくなる傾向が認められた。ラクトフェリンはｐＨ条件によらず、直径約１０ｎｍの粒子サイズであったが、ソホロリピッド、ラクトフェリン混合溶液では、それぞれの粒子サイズがシフトした。
ｐＨ５ではラクトフェリン単独で見られた粒子サイズが消失し、ソホロリピッドの粒子サイズへシフトし、ｐＨ７ではソホロリピッド単独で見られた粒子サイズが消失し、ラクトフェリンの粒子サイズへシフトした。以上の結果より、ラクトフェリン−ソホロリピッドの複合体が形成されることが示された
【００３７】
（性能確認試験２）ラクトフェリンの経皮吸収性の測定
ラクトフェリン単独、及びラクトフェリンとソホロリピッド複合体を３次元培養皮膚（東洋紡績株式会社：ＴＥＳＴＳＫＩＭ）の表皮側に作用させ、３０，６０，１２０分後に真皮側の下層溶液を回収し、ラクトフェリンの量をＥＬＩＳＡキット（ＢＥＴＨＹＬ社製）にて定量した。
【００３８】
図３に示されるとおり、ソホロリピッドと複合体を形成させることにより、ラクトフェリンの経皮吸収性が飛躍的に上昇することが示された。
【００３９】
ラクトフェリンの標的細胞への生理作用を評価するために、ヒト皮膚真皮線維芽細胞にラクトフェリン、ソホロリピッド単独及び複合体溶液を作用させ、細胞増殖促進効果を評価した。培養３日目・４日目それぞれについて、バッファーのみを加えた群に対するその他の群における細胞増殖率を図４に示した。
【００４０】
培養３日後には、今回試験を行ったすべての濃度において細胞賦活活性が認められ、バッファー群と比較してラクトフェリン０．０１％により３６．８％、ラクトフェリン０．０３％により２７．３％、ラクトフェリン０．０５％により２２．９％、それぞれ有意に細胞増殖率が上昇していた（ｐ＜０．０１，図４）。これと同濃度のラクトフェリンに関して、ソホロリピッド０．０１％と混合することによって形成させたラクトフェリン−ソホロリピッド複合体で線維芽細胞を処理した場合、ソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０１％における細胞増殖率の上昇は３５．２％、ソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０３％では３２．５％、ソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０５％は２２．４％であり、バッファー群との比較においては有意な細胞増殖率の上昇を認めたが（ｐ＜０．０１，図４）、いずれの濃度においても、ラクトフェリン単独で作用させた場合と有意な差はなかった（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定による）。培養４日後においても、細胞増殖率の増加幅がやや異なるものの、培養３日目における結果とほぼ同じ傾向を示した。従って、ｐＨ＝７におけるソホロリピッドとラクトフェリンの複合体形成は、ラクトフェリンによる線維芽細胞の増殖促進効果に関して影響がないことが示された。
【００４１】
一方、クエン酸バッファー、（ｐＨ５）を用いた場合、図５に示したように、培養３日後にはラクトフェリン０．０１％により１４．９％、０．０３％により１７．２％と、リン酸バッファー、（ｐＨ７）よりは弱いものの有意な細胞増殖率の上昇が認められた（ｐ＜０．０１，図５）。しかし、ラクトフェリン０．０５％では、細胞増殖率に有意な変化がみられなかった。これと同濃度のラクトフェリンに関して、ソホロリピッド０．０１％と混合することによって形成させたラクトフェリン−ソホロリピッド複合体で線維芽細胞を処理した場合、ソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０３％のみで１２．５％の細胞増殖率の上昇（ｐ＜０．０５，図５）を認めたが、ソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０１％およびソホロリピッド０．０１％＋ラクトフェリン０．０５％では、細胞増殖率の上昇は有意な変化とはいえなかった（上昇率はそれぞれ１０．９％，０．６％）。培養４日後のラクトフェリンによる細胞増殖促進効果は、濃度０．０１％で２４．４％、０．０３％で１７．２％、０．０５％で１０．７％と、いずれの濃度においても有意な増殖促進効果が認められた（ｐ＜０．０１，図５）。
【００４２】
しかしながら、クエン酸バッファー系（ｐＨ＝５）においては、評価を行ったすべてのラクトフェリン濃度について、ラクトフェリン−ソホロリピッドによる細胞賦活性は、ラクトフェリン単独で作用させた場合の細胞賦活性よりも有意に低下していた（図５、ソホロリピッドを含まない同濃度のラクトフェリン群との比較で＃ｐ＜０．０５，＃＃ｐ＜０．０１）。
【００４３】
図４、及び図５で示されたとおり、皮膚真皮由来の線維芽細胞におけるラクトフェリンの細胞増殖促進効果はソホロリピッド共存下でも保持された。しかし、ｐＨ、ラクトフェリン濃度、ソホロリピッド濃度によって複合体の細胞増殖促進効果が異なることも示唆された。
【００４４】
化粧品ローションとしての実施例
実施例１ 比較例１
ラクトフェリン ０．２％ ０．２％
ソホロリピッド ０．２％ −
１，３−ブチレングリコール ４．０％ ４．０％
ジプロピレングリコール １．０％ １．０％
セタノール ２．０％ ２．０％
ＰＯＥ硬化ヒマシ油 ０．２％ ０．２％
スクワラン ０．５％ ０．５％
エタノール ５．０％ ５．０％
ｐＨ調整剤 適量（６．０）適量（６．０）
防腐剤 適量 適量
水 残量 適量
【００４５】
実施例２：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する顆粒形態の素材組成物
ラクトフェリン５ｇ、ソホロリピッド５ｇ、エリスリトール２０ｇ、デキストリン７０ｇ、ｐＨ調整剤適量（ｐＨ６．５となるように調整）を流動層造粒機にいれ、イオン交換水１００ｇを噴霧して造粒し、顆粒形態の素材組成物を得た。この素材組成物は顆粒状食品、医薬品、飼料に適用できる。
【００４６】
実施例３：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する液状形態の組成物
ラクトフェリン０．５ｇ、ソホロリピッド０．２５ｇ、エリスリトール５ｇ、スクラロース０．３ｇ、ｐＨ調整剤適量（ｐＨ３．５となるように調整）、防腐剤適量、残量をイオン交換水で総量１００ｇとし、７５℃まで昇温し、プロペラ攪拌機により１５分間分散溶解させ、液状形態の組成物を得た。本組成物は清涼飲料、飼料として適用できる。
【００４７】
実施例４：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有する固形状の錠剤
ラクトフェリン２．５ｇ、ソホロリピッド１ｇ、マルチトール３３ｇ、ソルビトール３３ｇ、エリスリトール１５ｇ、クエン酸４ｇ、香料２ｇ、ステアリン酸カルシウム３ｇ、ミルクカルシウム６ｇ、スクラロース０．５ｇで総量１００ｇとし、打錠装置を用いて固形状形態の錠剤を得た。本錠剤は食品サプリメント、飼料に適用できる。
【００４８】
実施例５：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有するクリーム
油相成分としてホホバ油５ｇ、プロピルパラベン０．１ｇ、ソホロリピッド２．５ｇ、スクワラン１０ｇを８０℃で加温溶解した。水相成分として、イオン交換水７０ｇ、カルボキシビニルポリマー０．４ｇ、グリセリン５ｇ、ラクトフェリン０．５ｇ、メチルパラベン０．２ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０、０．２５ｇ、ｐＨ調整剤適量（最終ｐＨ６．５に調整）を８０℃で加温溶解した。油相分散液を攪拌しながら水相溶解液を加え１０分間攪拌し、トリエタノールアミン０．４ｇとイオン交換水残量を加え、総量１００ｇに調整し、攪拌しながら３５℃まで冷却し、クリームを得た。
【００４９】
実施例６：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有するゲル状組成物
カルボキシビニルポリマーの２重量％水溶液を１０ｇ、キサンタンガム１０ｇ、ヘキシレングリコール１０ｇ、ソホロリピッド１ｇ、グリセリン１ｇ、フェノキシエタノール０．５ｇ、ラクトフェリン０．５ｇ、エタノール５ｇ、アスコルビン酸０．１ｇ（ｐＨ６前後）、ビタミンＥ０．０００１ｇ、香料０．０１ｇ、イオン交換水残量を加え、総量１００ｇに調整し、ゲル状組成物を得た。ゲル状化粧品基材（美白剤など）として適用できる。
【００５０】
実施例７：塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドを含有するゾル状組成物
パラチノース８ｇ、キシリトール２ｇ、ラクトフェリン０．２ｇ、ソホロリピッド０．２ｇ、クエン酸ナトリウム０．１２ｇ、クエン酸０．２２ｇ、香料０．２ｇ、キサンタンガム０．５ｇ、イオン交換水残量で全量１００ｇに調整し、加温攪拌溶解し、ゾル状組成物を得た。食品、飼料として適用する。
【産業上の利用可能性】
【００５１】
本発明のラクトフェリン−ホロリピッド複合体を含有する製剤は化粧品、医薬品、食品、飼料、及びそれらの添加剤として好適に使用することが可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体を含有する組成物
【請求項２】
塩基性生理活性タンパク質濃度０．００１％〜１０％、ソホロリピッド濃度０．０１％〜１０％、塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率０．０００１〜１００、ｐＨ３〜８、に制御することを特徴とする請求項１に記載の組成物
【請求項３】
塩基性生理活性タンパク質濃度０．０１％〜０．５％、ソホロリピッド濃度０．１％〜１％、塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率０．０１〜５、ｐＨ５〜７に制御することを特徴とする請求項１に記載の組成物
【請求項４】
塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体粒子のサイズを１ｎｍ〜３μｍであることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の組成物
【請求項１】
塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体を含有する組成物
【請求項２】
塩基性生理活性タンパク質濃度０．００１％〜１０％、ソホロリピッド濃度０．０１％〜１０％、塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率０．０００１〜１００、ｐＨ３〜８、に制御することを特徴とする請求項１に記載の組成物
【請求項３】
塩基性生理活性タンパク質濃度０．０１％〜０．５％、ソホロリピッド濃度０．１％〜１％、塩基性生理活性タンパク質対ソホロリピッドの濃度比率０．０１〜５、ｐＨ５〜７に制御することを特徴とする請求項１に記載の組成物
【請求項４】
塩基性生理活性タンパク質とソホロリピッドの複合体粒子のサイズを１ｎｍ〜３μｍであることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載の組成物
【図１】
【図２】
【図２】
【図２】
【図２】
【図２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図２】
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【図６】
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【公開番号】特開２０１２−２３２９６３（Ｐ２０１２−２３２９６３Ａ）
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１１５２０６（Ｐ２０１１−１１５２０６）
【出願日】平成２３年５月２日（２０１１．５．２）
【出願人】（０００１０６１０６）サラヤ株式会社 (44)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１１月２９日（２０１２．１１．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年５月２日（２０１１．５．２）
【出願人】（０００１０６１０６）サラヤ株式会社 (44)
【Ｆターム（参考）】
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