抗酸化ストレス酵素発現誘導剤
【課題】Ｌ−カルボシステインの新規な用途を提供すること。
【解決手段】Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗酸化ストレス酵素発現誘導剤。
【解決手段】Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗酸化ストレス酵素発現誘導剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化ストレス酵素発現誘導剤及びＮｒｆ２活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−カルボシステインは、上気道炎（咽頭炎、喉頭炎）、急性気管支炎、気管支喘息、慢性気管支炎、気管支拡張症、肺結核等の疾患における去痰作用、慢性副鼻腔炎等の疾患における排膿作用を有しており、安全性の高い去痰剤として広く臨床で用いられている。
【０００３】
さらに、Ｌ−カルボシステインを有効成分とするインフルエンザウイルス感染症の治療及び予防薬（特許文献１）、ライノウイルス感染症の治療及び予防薬（特許文献２）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２８１２２７号公報
【特許文献２】特開２００５−２８１２２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｌ−カルボシステインの新規な用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、Ｌ−カルボシステインが転写因子Ｎｒｆ２（ＮＦ−Ｅ２ ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）の核内移行を促進する作用を有し、この作用を介して抗酸化ストレス酵素を発現させる作用を有する、との全く新規な知見を得た。本発明はこの新規な知見に基づくものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗酸化ストレス酵素発現誘導剤を提供する。
【０００８】
通常は均衡している生体内の酸化還元状態が酸化方向に過剰に傾いた状態、又は親電子性物質が過剰な状態になると、様々な疾患が引き起こされる。上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤によれば、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分としているため、抗酸化ストレス酵素を発現させることができる。そして、この作用を通じて酸化方向に過剰に傾いた状態等を予防、又はこれらの状態から回復することができる。
【０００９】
なお、本明細書において、「抗酸化ストレス酵素」とは、転写因子Ｎｒｆ２により転写レベルでの発現調節を受ける遺伝子にコードされた酵素を意味する。
【００１０】
本発明はまた、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗酸化ストレス酵素発現促進剤を提供する。
【００１１】
本発明は更に、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤、及びＬ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＮｒｆ２核内移行促進剤を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩の作用として、喀痰の物性を改善し排出を速やかにする作用、線毛の修復を促進し輸送能を改善する作用、細菌感染のファーストステップである細菌の咽頭上皮細胞への付着を抑制する作用等が知られている。しかしながら、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩が、転写因子Ｎｒｆ２の核内移行を促進する作用、これを介した抗酸化ストレス酵素の発現に対する作用を有することについては、これまで全く知られていない。
【００１３】
本発明によれば、上記転写因子Ｎｒｆ２の核内移行を促進する作用、これを介した抗酸化ストレス酵素の発現に対する作用に基づく、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩の新規な用途（抗酸化ストレス酵素発現誘導剤、抗酸化ストレス酵素発現促進剤、Ｎｒｆ２活性化剤、Ｎｒｆ２核内移行促進剤）を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図２】実施例２の遺伝子発現量解析の結果を示すグラフである。
【図３】実施例３の遺伝子発現量解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態についてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、下記化学式（１）で表されるＬ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする。
【化１】
【００１７】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分としているため、抗酸化ストレス酵素の発現を誘導することができる。ここで、「発現誘導」とは、発現していない抗酸化ストレス酵素を発現させること、及び発現している抗酸化ストレス酵素の発現レベルを増加させることを含む。
【００１８】
Ｌ−カルボシステインは、Ｓ−（カルボキシメチル）−Ｌ−システイン（Ｓ−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）との化学名でも呼ばれる化合物である。なお、本明細書において、Ｌ−カルボシステインを「Ｓ−ＣＭＣ」ともいう。
【００１９】
Ｌ−カルボシステインの薬学的に許容される塩は、Ｌ−カルボシステインと薬学的に許容される塩基（例えば、無機又は有機塩基）又は酸（例えば、無機又は有機酸）との塩を意味する。
【００２０】
薬学的に許容される無機塩基との塩としては、例えば、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第一鉄、第二鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、亜マンガン酸、カリウム、ナトリウム等の無機塩基との塩が挙げられる。
【００２１】
薬学的に許容される有機塩基との塩としては、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等の有機塩基との塩が挙げられる。
【００２２】
薬学的に許容される無機酸との塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸等の無機酸との塩が挙げられる。
【００２３】
薬学的に許容される有機酸との塩としては、例えば、酢酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、ステアリン酸、パルミチン酸等の有機酸との塩が挙げられる。
【００２４】
実施例において詳細に説明するように、Ｌ−カルボシステインは転写因子Ｎｒｆ２の核内への移行を促進し、これを介して抗酸化ストレス酵素の発現を誘導する作用を有する。転写因子Ｎｒｆ２は、通常細胞質においてＫｅａｐ１と呼ばれる因子と結合しており、核内への移行が阻害されていることが知られている。細胞が酸化ストレス若しくは親電子性物質にさらされたとき、又は転写因子Ｎｒｆ２のリン酸化により、転写因子Ｎｒｆ２がＫｅａｐ１と解離し、核内へと移行することが知られている。また、核内へと移行した転写因子Ｎｒｆ２は、抗酸化剤応答配列ＡＲＥ（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）又は親電子性物質応答配列ＥｐＲＥ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合し、これらの配列により発現調節を受ける遺伝子の発現を誘導することが知られている（例えば、生化学 第８１巻 第６号，ｐｐ．４４７〜４５５，２００９年）。
【００２５】
したがって、本明細書において、「抗酸化ストレス酵素」とは、転写因子Ｎｒｆ２により転写レベルでの発現調節を受ける遺伝子にコードされた酵素を意味し、好ましくは抗酸化剤応答配列ＡＲＥ（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）又は親電子性物質応答配列ＥｐＲＥ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）を介した転写レベルでの発現調節を受ける遺伝子にコードされた酵素である。
【００２６】
抗酸化ストレス酵素としては、ストレスに対する恒常性維持のために機能する酵素が挙げられ、その具体例としては、例えば、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）、グルタチオン合成酵素、チオレドキシンレダクターゼ、チオレドキシン、ペルオキシレドキシン１、グルタチオンパーオキシダーゼ、グルタミン酸システインリガーゼ等の抗酸化酵素、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ１）、エポキシドヒドラーゼ、アルドケトレダクターゼ等の解毒酵素（異物代謝系第２相解毒酵素）、シスチントランスポーター、多剤耐性関連タンパク質１（Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、多剤耐性関連タンパク質２（Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）等の薬物トランスポーター、２０Ｓプロテアソーム サブユニットβ５（２０Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｓｕｂｕｉｎｉｔ β５）等のユビキチンプロテオソームが挙げられる。
【００２７】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、他の有効成分として抗酸化物質を更に含むことができる。抗酸化物質としては、薬学的に許容されるものであれば特に制限なく任意のものを用いることができる。抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸、α−トコフェロール、トコトリエノール、ポリフェノール（フラボノイド、レスベラトロール等）、カロテノイド、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインが挙げられる。
【００２８】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、薬学的に許容される添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤が挙げられる。これらの添加剤としては、医薬品製剤の製造に使用可能なものであれば特に限定はなく、例えば、医薬品添加物事典［日本医薬品添加剤協会、薬事日報社（２００７年）］に記載されているものを適宜使用できる。
【００２９】
賦形剤は、有機系賦形剤又は無機系賦形剤のいずれであってもよい。有機系賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトール等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランが挙げられる。無機系賦形剤としては、例えば、軽質無機ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等のケイ酸塩誘導体；リン酸水素カルシウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩；硫酸カルシウム等の硫酸塩が挙げられる。
【００３０】
滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーガム等のワックス類；アジピン酸；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬ−ロイシン；脂肪酸ナトリウム；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水ケイ酸、ケイ酸水和物等のケイ酸類が挙げられる。
【００３１】
結合剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールが挙げられる。
【００３２】
崩壊剤としては、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン・セルロース類が挙げられる。
【００３３】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール等のクレゾール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸が挙げられる。
【００３４】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料が挙げられる。
【００３５】
希釈剤としては、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖注射液が挙げられる。
【００３６】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を、単独で、又は必要に応じて上記抗酸化剤及び上記添加剤からなる群より選択される１種以上と混和することにより調製できる。
【００３７】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、従来薬学的によく知られた形態及び投与経路を適用してヒトに投与することができ、例えば、散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、シロップ剤等の製剤として経口的に、又は軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、貼付剤等の製剤として非経口的に投与することができる。
【００３８】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤の投与は、例えば、年齢、体重、症状等によっても異なるが、経口投与では、１回５００〜５０００ｍｇ、より好ましくは１回１０００〜３０００ｍｇを１日３回投与することが望ましい。
【００３９】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、酸化ストレスを原因として発症する疾病の予防又は治療に対して有効である。このような疾病の例としては、例えば、冠動脈心疾患、心筋梗塞、ハンチントン病、肝線維症、肺線維症、癌、白内障が挙げられる。
【００４０】
実施例において詳細に説明するように、Ｌ−カルボシステインは、細胞が酸化ストレス下にあるときの方が、非酸化ストレス下にあるときに比べて、抗酸化ストレス酵素の発現をより強く誘導する作用を有する。すなわち、酸化ストレスにより誘導される抗酸化ストレス酵素の発現を更に促進する作用を有する。したがって、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩は、抗酸化ストレス酵素発現促進剤として使用することもできる。
【００４１】
本発明の抗酸化ストレス酵素発現促進剤は、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする。また、上記抗酸化ストレス酵素発現促進剤に更に添加できる成分（抗酸化物質、添加剤等）、剤形、用法、用量、適用等は、上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤について説明したのと同じものとすることができる。
【００４２】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩は、転写因子Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１との結合の解離を促進し（活性化）、これにより転写因子Ｎｒｆ２の核内への移行を促進しているものと考えられる。したがって、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩は、Ｎｒｆ２活性化剤として使用することができる。更に、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩は、Ｎｒｆ２核内移行促進剤として使用することもできる。
【００４３】
本発明のＮｒｆ２活性化剤、及びＮｒｆ２核内移行促進剤は、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする。また、上記Ｎｒｆ２活性化剤、及びＮｒｆ２核内移行促進剤に更に添加できる成分（抗酸化物質、添加剤等）、剤形、用法、用量、適用等は、上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤について説明したのと同じものとすることができる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。
【００４５】
［実施例１：Ｎｒｆ２の核内移行促進作用］
Ｌ−カルボシステインの投与による核内Ｎｒｆ２タンパク質量の変化を解析した例を示す。なお、以下の実施例には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄）（「Ｎｒｆ２＋／＋」とも表記する。）から採取した肺胞マクロファージと、転写因子Ｎｒｆ２をノックアウトしたマウス（「Ｎｒｆ２−／−」とも表記する。）から採取した肺胞マクロファージを用いた。
【００４６】
〔肺胞マクロファージの採取〕
マウスを炭酸ガス処理により安楽死させ、マウスの気管にカニューレを挿入し、生理食塩液１ｍＬで気管支肺胞洗浄液を回収した。これを５回繰り返し、プールした気管支肺胞洗浄液を遠心分離（２００×ｇ、５分、４℃）し、回収した細胞を沈殿させた。上清を除き、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で再懸濁後、１０ｃｍディッシュに細胞を播種した。
【００４７】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液の調製〕
３５．８４ｍｇのＬ−カルボシステイン（日本理化学薬品、Ｌｏｔ．：４１ＡＬ２０６）に、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を２ｍＬ加えて完全に溶解した。ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）を加えた後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨ７．２〜７．４となるように調整して最終容量を２０ｍＬとした（１０ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液）。１０ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液からＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で段階希釈を行い、それぞれ０．３、１、３ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液を調製した。Ｌ−カルボシステイン水溶液は用事調製とした。
【００４８】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液による処置、及び核内タンパク質抽出〕
上記〔肺胞マクロファージの採取〕で得た細胞を、インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で一晩静置し、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。その後、Ｌ−カルボシステイン溶液（０．３、１、３、１０ｍＭ）を添加した。Ｌ−カルボシステイン処置から６又は２４時間後に冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））で細胞を洗浄し、ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、取扱説明書に従い細胞核内タンパク質を抽出した。タンパク質濃度はＤｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した。
【００４９】
〔ウエスタンブロット解析〕
１０〜２０ｇのタンパク質を、５〜２０％のグラジエントゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、その後、ポリビニリデンジフロライド（ＰＶＤＦ）メンブレンにタンパク質を転写（トランスファー）した。得られたメンブレンを３％スキムミルク懸濁液中で１時間振盪し、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含む）（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄した（５分間×３回）。１次抗体としてａｎｔｉ−Ｎｒｆ２ ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて上記メンブレンを４℃で一晩振盪した。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後（リンス×３回、２分間×２回、１５分間×１回、５分間×１回）、２次抗体液（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ））で１時間振盪した。再びＴＢＳ−Ｔにて洗浄し（リンス×３回、２分間×２回、１５分間×１回、５分間×１回）、化学発光（ＥＣＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）によりＸ線フィルムにバンドを検出した。また、内部標準としてＬａｍｉｎ Ｂを採用し、同一メンブレンでリプローブした。
【００５０】
ウエスタンブロット解析の結果を図１に示す。Ｌ−カルボシステイン（Ｓ−ＣＭＣ）の添加により、核内Ｎｒｆ２のタンパク質量が用量依存的に増加していた（図１「Ｎｒｆ２＋／＋」の結果参照）。なお、Ｎｒｆ２ノックアウトマウスでは、タンパク質は検出されていない（図１「Ｎｒｆ２−／−」の結果参照）。ウエスタンブロット解析の結果から、Ｌ−カルボシステインはＮｒｆ２を活性化し、Ｎｒｆ２の核内移行を促進する作用を有することが示された。
【００５１】
［実施例２：抗酸化ストレス酵素の発現誘導］
Ｌ−カルボシステインの投与による抗酸化ストレス酵素（ＧＣＬＣ、ＨＯ−１、ＧＣＬＭ、ＮＱＯ１）の発現量変化を解析した例を示す。なお、「ＧＣＬＣ」は「グルタミン酸システインリガーゼの触媒サブユニット」を、「ＧＣＬＭ」は「グルタミン酸システインリガーゼの修飾サブユニット」を指す。
【００５２】
〔肺胞マクロファージの採取〕
実施例１と同様の方法で、肺胞マクロファージを回収した。回収した細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で再懸濁後、２４穴プレートに細胞を播種した。
【００５３】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液の調製〕
実施例１と同様の方法で、Ｌ−カルボシステイン水溶液を調製した。
【００５４】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液による処置、及び全ＲＮＡ抽出〕
上記〔肺胞マクロファージの採取〕で得た細胞を、インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で一晩静置し、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で洗浄後、Ｌ−カルボシステイン溶液（０．３、１、３、１０ｍＭ）を添加した。Ｌ−カルボシステイン処置から２４時間後に冷ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて取扱説明書に従い全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡの濃度は吸光度測定により算出した。
【００５５】
〔逆転写反応、及びリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ量の解析〕
抽出した全ＲＮＡに対して、Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて逆転写反応を行った。その後、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡績、東京）及び各種プライマーを用いてｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＡＢＩ７７００，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりリアルタイムＰＣＲを行った。結果の解析は比較Ｃｔ法による相対定量により行った。ＰＣＲ反応条件及び使用プライマー配列を下記表１及び２に示す。また、内在性コントロール遺伝子としてグルタルアルデヒド脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を採用した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
【００５８】
発現量解析の結果を図２に示す。図２（Ａ）〜（Ｄ）の各グラフには、Ｌ−カルボシステイン（Ｓ−ＣＭＣ）非添加群のマウス（Ｎｒｆ２＋／＋）における発現レベルを１としたときの相対的な発現レベル（相対発現レベル）の値を示した。いずれの抗酸化ストレス酵素（ＧＣＬＣ、ＨＯ−１、ＧＣＬＭ、ＮＱＯ１）においても、Ｌ−カルボシステインの添加により、用量依存的に発現レベルが増加していた（図２（Ａ）〜（Ｄ）「Ｎｒｆ２＋／＋」）。一方、Ｎｒｆ２ノックアウトマウスでは、Ｌ−カルボシステインの添加の有無に関わらず、有意な発現レベルの変化は認められなかった（図２（Ａ）〜（Ｄ）「Ｎｒｆ２−／−」）。
【００５９】
また、図２（Ａ）〜（Ｄ）中、「ＮＡＣ」は、Ｌ−カルボシステイン水溶液に代えて１０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）水溶液を添加したときの結果を示す。ＮＡＣの添加では、いずれの抗酸化ストレス酵素においても発現レベルの増加は認められなかった（図２（Ａ）〜（Ｄ））。
【００６０】
図１及び図２（Ａ）〜（Ｄ）の結果から、Ｌ−カルボシステインは転写因子Ｎｒｆ２の核内移行の促進作用を介して、抗酸化ストレス酵素の発現を誘導することが示された。
【００６１】
また、ＮＡＣは抗酸化剤として知られており、Ｌ−カルボシステインとよく似た化学構造を有する。ＮＡＣには抗酸化ストレス酵素の発現誘導作用は認められなかったことから、転写因子Ｎｒｆ２の核内移行の促進作用や抗酸化ストレス酵素の発現誘導作用は、Ｌ−カルボシステインに特有の極めて意外な効果である。
【００６２】
［実施例３：酸化ストレス下における抗酸化ストレス酵素の発現誘導］
タバコ煙抽出液（ＣＳＥ）による酸化ストレス下において、Ｌ−カルボシステインの投与による抗酸化ストレス酵素（ＨＯ−１、ＧＣＬＭ）の発現量変化を解析した例を示す。
【００６３】
〔肺胞マクロファージの採取〕
実施例１と同様の方法で、肺胞マクロファージを回収した。回収した細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で再懸濁後、２４穴プレートに細胞を播種した。
【００６４】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液の調製〕
実施例１と同様の方法で、Ｌ−カルボシステイン水溶液を調製した。
【００６５】
〔タバコ煙抽出液（ＣＳＥ）の調製〕
タバコ煙（ｈｉ−ｌｉｔｅ、日本たばこ産業）を５０ｍＬシリンジで５０ｍＬ／１０秒の速度で吸引した後、１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ（−））中に５０ｍＬ／１５秒の速度で排気することでバブリング操作を行った。このバブリング操作をタバコ１本あたり１０回行った。得られたタバコ煙抽出液を水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．２−７．５に調整し、フィルター滅菌（ポアサイズ：０．２μｍ）した。これを１００％のｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ ｅｘｔｒａｃｔ（ＣＳＥ）とした。
【００６６】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液による処置、及び全ＲＮＡ抽出〕
実施例２と同様の方法で、Ｌ−カルボシステイン水溶液による処置、及び全ＲＮＡ抽出を行った。
【００６７】
〔逆転写反応、及びリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ量の解析〕
実施例２と同様の方法で、ｍＲＮＡ量の解析を行った。
【００６８】
発現量解析の結果を図３に示す。図３（Ａ）及び（Ｂ）は、処置なし（Ｃｏｎｔ）、Ｌ−カルボシステイン添加（Ｓ−ＣＭＣ）、タバコ煙抽出物添加（ＣＳＥ）、並びにタバコ煙抽出物及びＬ−カルボシステイン添加（ＣＳＥ＋Ｓ−ＣＭＣ）したときの、抗酸化ストレス酵素（ＨＯ−１、ＧＣＬＭ）のｍＲＮＡ発現量を解析した結果である。図３（Ｃ）及び（Ｄ）は、処置なし（Ｃｏｎｔ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン添加（ＮＡＣ）、タバコ煙抽出物添加（ＣＳＥ）、並びにタバコ煙抽出物及びＮ−アセチル−Ｌ−システイン添加（ＣＳＥ＋ＮＡＣ）したときの、抗酸化ストレス酵素（ＨＯ−１、ＧＣＬＭ）のｍＲＮＡ発現量を解析した結果である。
【００６９】
図３（Ａ）及び（Ｂ）に示すとおり、Ｌ−カルボシステインの添加により抗酸化ストレス酵素（ＨＯ−１、ＧＣＬＭ）の相対発現レベルが増加した（「Ｃｏｎｔ」対「Ｓ−ＣＭＣ」）。酸化ストレス下にあるときも同様にＬ−カルボシステインの添加により抗酸化ストレス酵素の相対発現レベルが増加した（「ＣＳＥ」対「ＣＳＥ＋Ｓ−ＣＭＣ」）。また、酸化ストレス下にあるときの増加量は、酸化ストレス下にないときの増加量と比べて、極めて高いものであった。すなわち、Ｌ−カルボシステインは、酸化ストレスにより誘導される抗酸化ストレス酵素の発現を更に促進する作用を有することが示された。
【００７０】
図３（Ｃ）及び（Ｄ）に示すとおり、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを添加しても抗酸化ストレス酵素の相対発現レベルは増加せず、むしろ減少傾向にあった（「Ｃｏｎｔ」対「ＮＡＣ」）。さらに、酸化ストレス下にあるときは、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの添加により抗酸化ストレス酵素の相対発現レベルが著しく減少した（「ＣＳＥ」対「ＣＳＥ＋ＮＡＣ」）。
【００７１】
このことからも、転写因子Ｎｒｆ２の核内移行の促進作用や抗酸化ストレス酵素の発現誘導作用及び発現促進作用は、Ｌ−カルボシステインに特有の極めて意外な効果であるといえる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化ストレス酵素発現誘導剤及びＮｒｆ２活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−カルボシステインは、上気道炎（咽頭炎、喉頭炎）、急性気管支炎、気管支喘息、慢性気管支炎、気管支拡張症、肺結核等の疾患における去痰作用、慢性副鼻腔炎等の疾患における排膿作用を有しており、安全性の高い去痰剤として広く臨床で用いられている。
【０００３】
さらに、Ｌ−カルボシステインを有効成分とするインフルエンザウイルス感染症の治療及び予防薬（特許文献１）、ライノウイルス感染症の治療及び予防薬（特許文献２）が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００５−２８１２２７号公報
【特許文献２】特開２００５−２８１２２９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、Ｌ−カルボシステインの新規な用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、Ｌ−カルボシステインが転写因子Ｎｒｆ２（ＮＦ−Ｅ２ ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒ ２）の核内移行を促進する作用を有し、この作用を介して抗酸化ストレス酵素を発現させる作用を有する、との全く新規な知見を得た。本発明はこの新規な知見に基づくものである。
【０００７】
すなわち、本発明は、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗酸化ストレス酵素発現誘導剤を提供する。
【０００８】
通常は均衡している生体内の酸化還元状態が酸化方向に過剰に傾いた状態、又は親電子性物質が過剰な状態になると、様々な疾患が引き起こされる。上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤によれば、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分としているため、抗酸化ストレス酵素を発現させることができる。そして、この作用を通じて酸化方向に過剰に傾いた状態等を予防、又はこれらの状態から回復することができる。
【０００９】
なお、本明細書において、「抗酸化ストレス酵素」とは、転写因子Ｎｒｆ２により転写レベルでの発現調節を受ける遺伝子にコードされた酵素を意味する。
【００１０】
本発明はまた、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗酸化ストレス酵素発現促進剤を提供する。
【００１１】
本発明は更に、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤、及びＬ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＮｒｆ２核内移行促進剤を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩の作用として、喀痰の物性を改善し排出を速やかにする作用、線毛の修復を促進し輸送能を改善する作用、細菌感染のファーストステップである細菌の咽頭上皮細胞への付着を抑制する作用等が知られている。しかしながら、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩が、転写因子Ｎｒｆ２の核内移行を促進する作用、これを介した抗酸化ストレス酵素の発現に対する作用を有することについては、これまで全く知られていない。
【００１３】
本発明によれば、上記転写因子Ｎｒｆ２の核内移行を促進する作用、これを介した抗酸化ストレス酵素の発現に対する作用に基づく、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩の新規な用途（抗酸化ストレス酵素発現誘導剤、抗酸化ストレス酵素発現促進剤、Ｎｒｆ２活性化剤、Ｎｒｆ２核内移行促進剤）を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】実施例１のウエスタンブロット解析の結果を示す図である。
【図２】実施例２の遺伝子発現量解析の結果を示すグラフである。
【図３】実施例３の遺伝子発現量解析の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を実施するための形態についてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１６】
本発明の抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、下記化学式（１）で表されるＬ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする。
【化１】
【００１７】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分としているため、抗酸化ストレス酵素の発現を誘導することができる。ここで、「発現誘導」とは、発現していない抗酸化ストレス酵素を発現させること、及び発現している抗酸化ストレス酵素の発現レベルを増加させることを含む。
【００１８】
Ｌ−カルボシステインは、Ｓ−（カルボキシメチル）−Ｌ−システイン（Ｓ−（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）との化学名でも呼ばれる化合物である。なお、本明細書において、Ｌ−カルボシステインを「Ｓ−ＣＭＣ」ともいう。
【００１９】
Ｌ−カルボシステインの薬学的に許容される塩は、Ｌ−カルボシステインと薬学的に許容される塩基（例えば、無機又は有機塩基）又は酸（例えば、無機又は有機酸）との塩を意味する。
【００２０】
薬学的に許容される無機塩基との塩としては、例えば、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第一鉄、第二鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、亜マンガン酸、カリウム、ナトリウム等の無機塩基との塩が挙げられる。
【００２１】
薬学的に許容される有機塩基との塩としては、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等の有機塩基との塩が挙げられる。
【００２２】
薬学的に許容される無機酸との塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸等の無機酸との塩が挙げられる。
【００２３】
薬学的に許容される有機酸との塩としては、例えば、酢酸、マレイン酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、ステアリン酸、パルミチン酸等の有機酸との塩が挙げられる。
【００２４】
実施例において詳細に説明するように、Ｌ−カルボシステインは転写因子Ｎｒｆ２の核内への移行を促進し、これを介して抗酸化ストレス酵素の発現を誘導する作用を有する。転写因子Ｎｒｆ２は、通常細胞質においてＫｅａｐ１と呼ばれる因子と結合しており、核内への移行が阻害されていることが知られている。細胞が酸化ストレス若しくは親電子性物質にさらされたとき、又は転写因子Ｎｒｆ２のリン酸化により、転写因子Ｎｒｆ２がＫｅａｐ１と解離し、核内へと移行することが知られている。また、核内へと移行した転写因子Ｎｒｆ２は、抗酸化剤応答配列ＡＲＥ（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）又は親電子性物質応答配列ＥｐＲＥ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）に結合し、これらの配列により発現調節を受ける遺伝子の発現を誘導することが知られている（例えば、生化学 第８１巻 第６号，ｐｐ．４４７〜４５５，２００９年）。
【００２５】
したがって、本明細書において、「抗酸化ストレス酵素」とは、転写因子Ｎｒｆ２により転写レベルでの発現調節を受ける遺伝子にコードされた酵素を意味し、好ましくは抗酸化剤応答配列ＡＲＥ（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）又は親電子性物質応答配列ＥｐＲＥ（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）を介した転写レベルでの発現調節を受ける遺伝子にコードされた酵素である。
【００２６】
抗酸化ストレス酵素としては、ストレスに対する恒常性維持のために機能する酵素が挙げられ、その具体例としては、例えば、ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）、グルタチオン合成酵素、チオレドキシンレダクターゼ、チオレドキシン、ペルオキシレドキシン１、グルタチオンパーオキシダーゼ、グルタミン酸システインリガーゼ等の抗酸化酵素、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）、キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ１）、エポキシドヒドラーゼ、アルドケトレダクターゼ等の解毒酵素（異物代謝系第２相解毒酵素）、シスチントランスポーター、多剤耐性関連タンパク質１（Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）、多剤耐性関連タンパク質２（Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）等の薬物トランスポーター、２０Ｓプロテアソーム サブユニットβ５（２０Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｓｕｂｕｉｎｉｔ β５）等のユビキチンプロテオソームが挙げられる。
【００２７】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、他の有効成分として抗酸化物質を更に含むことができる。抗酸化物質としては、薬学的に許容されるものであれば特に制限なく任意のものを用いることができる。抗酸化剤としては、例えば、アスコルビン酸、α−トコフェロール、トコトリエノール、ポリフェノール（フラボノイド、レスベラトロール等）、カロテノイド、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインが挙げられる。
【００２８】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、薬学的に許容される添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤が挙げられる。これらの添加剤としては、医薬品製剤の製造に使用可能なものであれば特に限定はなく、例えば、医薬品添加物事典［日本医薬品添加剤協会、薬事日報社（２００７年）］に記載されているものを適宜使用できる。
【００２９】
賦形剤は、有機系賦形剤又は無機系賦形剤のいずれであってもよい。有機系賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、葡萄糖、マンニトール、ソルビトール等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、α澱粉、デキストリン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルランが挙げられる。無機系賦形剤としては、例えば、軽質無機ケイ酸、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸カルシウム、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム等のケイ酸塩誘導体；リン酸水素カルシウム等のリン酸塩；炭酸カルシウム等の炭酸塩；硫酸カルシウム等の硫酸塩が挙げられる。
【００３０】
滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；タルク；コロイドシリカ；ビーガム等のワックス類；アジピン酸；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；グリコール；フマル酸；安息香酸ナトリウム；ＤＬ−ロイシン；脂肪酸ナトリウム；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水ケイ酸、ケイ酸水和物等のケイ酸類が挙げられる。
【００３１】
結合剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロゴールが挙げられる。
【００３２】
崩壊剤としては、例えば、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、内部架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム等のセルロース誘導体；カルボキシメチルスターチ、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン・セルロース類が挙げられる。
【００３３】
安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；フェノール、クレゾール等のクレゾール類；チメロサール；デヒドロ酢酸；ソルビン酸が挙げられる。
【００３４】
矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料が挙げられる。
【００３５】
希釈剤としては、例えば、注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖注射液が挙げられる。
【００３６】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を、単独で、又は必要に応じて上記抗酸化剤及び上記添加剤からなる群より選択される１種以上と混和することにより調製できる。
【００３７】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、従来薬学的によく知られた形態及び投与経路を適用してヒトに投与することができ、例えば、散剤、錠剤、カプセル剤、細粒剤、顆粒剤、シロップ剤等の製剤として経口的に、又は軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、貼付剤等の製剤として非経口的に投与することができる。
【００３８】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤の投与は、例えば、年齢、体重、症状等によっても異なるが、経口投与では、１回５００〜５０００ｍｇ、より好ましくは１回１０００〜３０００ｍｇを１日３回投与することが望ましい。
【００３９】
上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤は、酸化ストレスを原因として発症する疾病の予防又は治療に対して有効である。このような疾病の例としては、例えば、冠動脈心疾患、心筋梗塞、ハンチントン病、肝線維症、肺線維症、癌、白内障が挙げられる。
【００４０】
実施例において詳細に説明するように、Ｌ−カルボシステインは、細胞が酸化ストレス下にあるときの方が、非酸化ストレス下にあるときに比べて、抗酸化ストレス酵素の発現をより強く誘導する作用を有する。すなわち、酸化ストレスにより誘導される抗酸化ストレス酵素の発現を更に促進する作用を有する。したがって、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩は、抗酸化ストレス酵素発現促進剤として使用することもできる。
【００４１】
本発明の抗酸化ストレス酵素発現促進剤は、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする。また、上記抗酸化ストレス酵素発現促進剤に更に添加できる成分（抗酸化物質、添加剤等）、剤形、用法、用量、適用等は、上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤について説明したのと同じものとすることができる。
【００４２】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩は、転写因子Ｎｒｆ２とＫｅａｐ１との結合の解離を促進し（活性化）、これにより転写因子Ｎｒｆ２の核内への移行を促進しているものと考えられる。したがって、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩は、Ｎｒｆ２活性化剤として使用することができる。更に、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩は、Ｎｒｆ２核内移行促進剤として使用することもできる。
【００４３】
本発明のＮｒｆ２活性化剤、及びＮｒｆ２核内移行促進剤は、Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする。また、上記Ｎｒｆ２活性化剤、及びＮｒｆ２核内移行促進剤に更に添加できる成分（抗酸化物質、添加剤等）、剤形、用法、用量、適用等は、上記抗酸化ストレス酵素発現誘導剤について説明したのと同じものとすることができる。
【実施例】
【００４４】
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。
【００４５】
［実施例１：Ｎｒｆ２の核内移行促進作用］
Ｌ−カルボシステインの投与による核内Ｎｒｆ２タンパク質量の変化を解析した例を示す。なお、以下の実施例には、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄）（「Ｎｒｆ２＋／＋」とも表記する。）から採取した肺胞マクロファージと、転写因子Ｎｒｆ２をノックアウトしたマウス（「Ｎｒｆ２−／−」とも表記する。）から採取した肺胞マクロファージを用いた。
【００４６】
〔肺胞マクロファージの採取〕
マウスを炭酸ガス処理により安楽死させ、マウスの気管にカニューレを挿入し、生理食塩液１ｍＬで気管支肺胞洗浄液を回収した。これを５回繰り返し、プールした気管支肺胞洗浄液を遠心分離（２００×ｇ、５分、４℃）し、回収した細胞を沈殿させた。上清を除き、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で再懸濁後、１０ｃｍディッシュに細胞を播種した。
【００４７】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液の調製〕
３５．８４ｍｇのＬ−カルボシステイン（日本理化学薬品、Ｌｏｔ．：４１ＡＬ２０６）に、１ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム水溶液を２ｍＬ加えて完全に溶解した。ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）を加えた後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を加えてｐＨ７．２〜７．４となるように調整して最終容量を２０ｍＬとした（１０ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液）。１０ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液からＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で段階希釈を行い、それぞれ０．３、１、３ｍｍｏｌ／Ｌ水溶液を調製した。Ｌ−カルボシステイン水溶液は用事調製とした。
【００４８】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液による処置、及び核内タンパク質抽出〕
上記〔肺胞マクロファージの採取〕で得た細胞を、インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で一晩静置し、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で洗浄した。その後、Ｌ−カルボシステイン溶液（０．３、１、３、１０ｍＭ）を添加した。Ｌ−カルボシステイン処置から６又は２４時間後に冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ（−））で細胞を洗浄し、ｎｕｃｌｅａｒ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、取扱説明書に従い細胞核内タンパク質を抽出した。タンパク質濃度はＤｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて測定した。
【００４９】
〔ウエスタンブロット解析〕
１０〜２０ｇのタンパク質を、５〜２０％のグラジエントゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、その後、ポリビニリデンジフロライド（ＰＶＤＦ）メンブレンにタンパク質を転写（トランスファー）した。得られたメンブレンを３％スキムミルク懸濁液中で１時間振盪し、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）（０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０含む）（ＴＢＳ−Ｔ）で洗浄した（５分間×３回）。１次抗体としてａｎｔｉ−Ｎｒｆ２ ｒａｂｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて上記メンブレンを４℃で一晩振盪した。ＴＢＳ−Ｔで洗浄後（リンス×３回、２分間×２回、１５分間×１回、５分間×１回）、２次抗体液（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ））で１時間振盪した。再びＴＢＳ−Ｔにて洗浄し（リンス×３回、２分間×２回、１５分間×１回、５分間×１回）、化学発光（ＥＣＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）によりＸ線フィルムにバンドを検出した。また、内部標準としてＬａｍｉｎ Ｂを採用し、同一メンブレンでリプローブした。
【００５０】
ウエスタンブロット解析の結果を図１に示す。Ｌ−カルボシステイン（Ｓ−ＣＭＣ）の添加により、核内Ｎｒｆ２のタンパク質量が用量依存的に増加していた（図１「Ｎｒｆ２＋／＋」の結果参照）。なお、Ｎｒｆ２ノックアウトマウスでは、タンパク質は検出されていない（図１「Ｎｒｆ２−／−」の結果参照）。ウエスタンブロット解析の結果から、Ｌ−カルボシステインはＮｒｆ２を活性化し、Ｎｒｆ２の核内移行を促進する作用を有することが示された。
【００５１】
［実施例２：抗酸化ストレス酵素の発現誘導］
Ｌ−カルボシステインの投与による抗酸化ストレス酵素（ＧＣＬＣ、ＨＯ−１、ＧＣＬＭ、ＮＱＯ１）の発現量変化を解析した例を示す。なお、「ＧＣＬＣ」は「グルタミン酸システインリガーゼの触媒サブユニット」を、「ＧＣＬＭ」は「グルタミン酸システインリガーゼの修飾サブユニット」を指す。
【００５２】
〔肺胞マクロファージの採取〕
実施例１と同様の方法で、肺胞マクロファージを回収した。回収した細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で再懸濁後、２４穴プレートに細胞を播種した。
【００５３】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液の調製〕
実施例１と同様の方法で、Ｌ−カルボシステイン水溶液を調製した。
【００５４】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液による処置、及び全ＲＮＡ抽出〕
上記〔肺胞マクロファージの採取〕で得た細胞を、インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で一晩静置し、ＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で洗浄後、Ｌ−カルボシステイン溶液（０．３、１、３、１０ｍＭ）を添加した。Ｌ−カルボシステイン処置から２４時間後に冷ＰＢＳ（−）で細胞を洗浄し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて取扱説明書に従い全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡの濃度は吸光度測定により算出した。
【００５５】
〔逆転写反応、及びリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ量の解析〕
抽出した全ＲＮＡに対して、Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて逆転写反応を行った。その後、ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（東洋紡績、東京）及び各種プライマーを用いてｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（ＡＢＩ７７００，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によりリアルタイムＰＣＲを行った。結果の解析は比較Ｃｔ法による相対定量により行った。ＰＣＲ反応条件及び使用プライマー配列を下記表１及び２に示す。また、内在性コントロール遺伝子としてグルタルアルデヒド脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）を採用した。
【００５６】
【表１】
【００５７】
【表２】
【００５８】
発現量解析の結果を図２に示す。図２（Ａ）〜（Ｄ）の各グラフには、Ｌ−カルボシステイン（Ｓ−ＣＭＣ）非添加群のマウス（Ｎｒｆ２＋／＋）における発現レベルを１としたときの相対的な発現レベル（相対発現レベル）の値を示した。いずれの抗酸化ストレス酵素（ＧＣＬＣ、ＨＯ−１、ＧＣＬＭ、ＮＱＯ１）においても、Ｌ−カルボシステインの添加により、用量依存的に発現レベルが増加していた（図２（Ａ）〜（Ｄ）「Ｎｒｆ２＋／＋」）。一方、Ｎｒｆ２ノックアウトマウスでは、Ｌ−カルボシステインの添加の有無に関わらず、有意な発現レベルの変化は認められなかった（図２（Ａ）〜（Ｄ）「Ｎｒｆ２−／−」）。
【００５９】
また、図２（Ａ）〜（Ｄ）中、「ＮＡＣ」は、Ｌ−カルボシステイン水溶液に代えて１０ｍＭのＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）水溶液を添加したときの結果を示す。ＮＡＣの添加では、いずれの抗酸化ストレス酵素においても発現レベルの増加は認められなかった（図２（Ａ）〜（Ｄ））。
【００６０】
図１及び図２（Ａ）〜（Ｄ）の結果から、Ｌ−カルボシステインは転写因子Ｎｒｆ２の核内移行の促進作用を介して、抗酸化ストレス酵素の発現を誘導することが示された。
【００６１】
また、ＮＡＣは抗酸化剤として知られており、Ｌ−カルボシステインとよく似た化学構造を有する。ＮＡＣには抗酸化ストレス酵素の発現誘導作用は認められなかったことから、転写因子Ｎｒｆ２の核内移行の促進作用や抗酸化ストレス酵素の発現誘導作用は、Ｌ−カルボシステインに特有の極めて意外な効果である。
【００６２】
［実施例３：酸化ストレス下における抗酸化ストレス酵素の発現誘導］
タバコ煙抽出液（ＣＳＥ）による酸化ストレス下において、Ｌ−カルボシステインの投与による抗酸化ストレス酵素（ＨＯ−１、ＧＣＬＭ）の発現量変化を解析した例を示す。
【００６３】
〔肺胞マクロファージの採取〕
実施例１と同様の方法で、肺胞マクロファージを回収した。回収した細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）で再懸濁後、２４穴プレートに細胞を播種した。
【００６４】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液の調製〕
実施例１と同様の方法で、Ｌ−カルボシステイン水溶液を調製した。
【００６５】
〔タバコ煙抽出液（ＣＳＥ）の調製〕
タバコ煙（ｈｉ−ｌｉｔｅ、日本たばこ産業）を５０ｍＬシリンジで５０ｍＬ／１０秒の速度で吸引した後、１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（ＦＢＳ（−））中に５０ｍＬ／１５秒の速度で排気することでバブリング操作を行った。このバブリング操作をタバコ１本あたり１０回行った。得られたタバコ煙抽出液を水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ７．２−７．５に調整し、フィルター滅菌（ポアサイズ：０．２μｍ）した。これを１００％のｃｉｇａｒｅｔｔｅ ｓｍｏｋｅ ｅｘｔｒａｃｔ（ＣＳＥ）とした。
【００６６】
〔Ｌ−カルボシステイン水溶液による処置、及び全ＲＮＡ抽出〕
実施例２と同様の方法で、Ｌ−カルボシステイン水溶液による処置、及び全ＲＮＡ抽出を行った。
【００６７】
〔逆転写反応、及びリアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ量の解析〕
実施例２と同様の方法で、ｍＲＮＡ量の解析を行った。
【００６８】
発現量解析の結果を図３に示す。図３（Ａ）及び（Ｂ）は、処置なし（Ｃｏｎｔ）、Ｌ−カルボシステイン添加（Ｓ−ＣＭＣ）、タバコ煙抽出物添加（ＣＳＥ）、並びにタバコ煙抽出物及びＬ−カルボシステイン添加（ＣＳＥ＋Ｓ−ＣＭＣ）したときの、抗酸化ストレス酵素（ＨＯ−１、ＧＣＬＭ）のｍＲＮＡ発現量を解析した結果である。図３（Ｃ）及び（Ｄ）は、処置なし（Ｃｏｎｔ）、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン添加（ＮＡＣ）、タバコ煙抽出物添加（ＣＳＥ）、並びにタバコ煙抽出物及びＮ−アセチル−Ｌ−システイン添加（ＣＳＥ＋ＮＡＣ）したときの、抗酸化ストレス酵素（ＨＯ−１、ＧＣＬＭ）のｍＲＮＡ発現量を解析した結果である。
【００６９】
図３（Ａ）及び（Ｂ）に示すとおり、Ｌ−カルボシステインの添加により抗酸化ストレス酵素（ＨＯ−１、ＧＣＬＭ）の相対発現レベルが増加した（「Ｃｏｎｔ」対「Ｓ−ＣＭＣ」）。酸化ストレス下にあるときも同様にＬ−カルボシステインの添加により抗酸化ストレス酵素の相対発現レベルが増加した（「ＣＳＥ」対「ＣＳＥ＋Ｓ−ＣＭＣ」）。また、酸化ストレス下にあるときの増加量は、酸化ストレス下にないときの増加量と比べて、極めて高いものであった。すなわち、Ｌ−カルボシステインは、酸化ストレスにより誘導される抗酸化ストレス酵素の発現を更に促進する作用を有することが示された。
【００７０】
図３（Ｃ）及び（Ｄ）に示すとおり、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインを添加しても抗酸化ストレス酵素の相対発現レベルは増加せず、むしろ減少傾向にあった（「Ｃｏｎｔ」対「ＮＡＣ」）。さらに、酸化ストレス下にあるときは、Ｎ−アセチル−Ｌ−システインの添加により抗酸化ストレス酵素の相対発現レベルが著しく減少した（「ＣＳＥ」対「ＣＳＥ＋ＮＡＣ」）。
【００７１】
このことからも、転写因子Ｎｒｆ２の核内移行の促進作用や抗酸化ストレス酵素の発現誘導作用及び発現促進作用は、Ｌ−カルボシステインに特有の極めて意外な効果であるといえる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗酸化ストレス酵素発現誘導剤。
【請求項２】
抗酸化ストレス酵素が、抗酸化酵素、解毒酵素（第２相解毒酵素）、薬物トランスポーター及びユビキチンプロテオソームからなる群より選ばれる１種又は２種以上である、請求項１に記載の抗酸化ストレス酵素発現誘導剤。
【請求項３】
抗酸化物質を更に含む、請求項１又は２に記載の抗酸化ストレス酵素発現誘導剤。
【請求項４】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗酸化ストレス酵素発現促進剤。
【請求項５】
抗酸化ストレス酵素が、抗酸化酵素、解毒酵素（第２相解毒酵素）、薬物トランスポーター及びユビキチンプロテオソームからなる群より選ばれる１種又は２種以上である、請求項４に記載の抗酸化ストレス酵素発現促進剤。
【請求項６】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。
【請求項７】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＮｒｆ２核内移行促進剤。
【請求項１】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗酸化ストレス酵素発現誘導剤。
【請求項２】
抗酸化ストレス酵素が、抗酸化酵素、解毒酵素（第２相解毒酵素）、薬物トランスポーター及びユビキチンプロテオソームからなる群より選ばれる１種又は２種以上である、請求項１に記載の抗酸化ストレス酵素発現誘導剤。
【請求項３】
抗酸化物質を更に含む、請求項１又は２に記載の抗酸化ストレス酵素発現誘導剤。
【請求項４】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗酸化ストレス酵素発現促進剤。
【請求項５】
抗酸化ストレス酵素が、抗酸化酵素、解毒酵素（第２相解毒酵素）、薬物トランスポーター及びユビキチンプロテオソームからなる群より選ばれる１種又は２種以上である、請求項４に記載の抗酸化ストレス酵素発現促進剤。
【請求項６】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＮｒｆ２活性化剤。
【請求項７】
Ｌ−カルボシステイン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とするＮｒｆ２核内移行促進剤。
【図２】
【図３】
【図１】
【図３】
【図１】
【公開番号】特開２０１３−４３８５１（Ｐ２０１３−４３８５１Ａ）
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−１８１８５２（Ｐ２０１１−１８１８５２）
【出願日】平成２３年８月２３日（２０１１．８．２３）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（０００００１３９５）杏林製薬株式会社 (120)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２５年３月４日（２０１３．３．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年８月２３日（２０１１．８．２３）
【出願人】（５０４１７１１３４）国立大学法人 筑波大学 (510)
【出願人】（０００００１３９５）杏林製薬株式会社 (120)
【Ｆターム（参考）】
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