【課題】肺のような臓器に観察されるコラーゲンのような結合組織に対する自己免疫応答を含む医学状態を診断及び治療するための方法を提供する。
【解決手段】特発性肺線維症のような肺疾患及び障害が、例えば、Ｖ型を含む多様な型のコラーゲンに対する自己免疫応答の証拠について、患者から得られた体液又は組織サンプルを抗Ｖ型コラーゲンに対する抗原を接触させることにより分析診断し、さらにＶ型コラーゲンを含む多様なコラーゲンのエピトープの療法的有効量を投与することによるＩＰＦのような肺疾患を治療する方法を提供する。

【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
特許請求の優先権
本出願は、その全体が本明細書に援用される、２００６年１月１３日に出願された米国仮特許出願番号６０／７５９，１９５の優先権を主張する。
【０００２】
政府資金提供の記載
米国政府は、米国保健研究所（ＮＩＨ）からの連邦補助金番号ＨＬ６０７９７に従って本発明に特定の権利を所有することができる。
【０００３】
技術分野
多様な態様は一般に、肺疾患のための試験及び治療に関し、いくつかの側面はＶ型コラーゲンのような、肺結合組織に対する自己免疫応答の証拠を同定することを含んでおり、さらに他の側面は、コラーゲン及びコラーゲン様分子の治療的に有効量を患者に投与することをにより患者の免疫応答を変調し、例えばＶ型コラーゲンに対して患者を耐性化することを含んでいる。
【０００４】
背景技術
自己免疫応答を含む病態学は周知である。所与のヒト又は動物自身の免疫システムにより組織に生じた傷害が関与する状態には、例えば、１型（若年性）糖尿病、関節リウマチ、多発性硬化症、及び例えば、乾癬を含むいくつかの炎症状態が含まれる。典型的には、動物自身の免疫システムの一部は、動物自身の組織の抗原への攻撃を開始する。前記の自己免疫疾患により例示されるごとく、その結果は、糖尿病のような管理可能ではあるが慢性の状態の生成から、多発性硬化症でしばしば起こるような完全な身体障害及び早死までの範囲の破局的なものでありうる。
【０００５】
自己免疫応答に具体的に関係する多様な疾患に加え、他の疾患も誤った免疫応答が関与しうる。従って、患者自身の免疫応答が疾患の進行に果たしうる役割（もしあれば）について決定するため、多様な疾患の病因を試験することに強い関心がある。
【０００６】
患者自身の免疫システムによる不可欠な組織に対する攻撃を含む別の病態は、臓器又は組織移植後の同種移植片拒絶である。心臓、腎臓、肝臓及び肺を含む種々の臓器の移植は、しばしば移植された組織を攻撃する移植レシピエントの免疫システムを生じる。同種移植片拒絶を最小化するために、臓器ドナー及びレシピエントを適合させることに大きな注意が払われる。それでも、一卵性双生児間を除けば、完全な適合を行うことは事実上不可能である。その後の同種免疫応答を管理するため、ほとんどの移植レシピエントは、そうしないと移植された臓器及び／又は組織を破壊するであろう自己免疫応答を制御するため、生存期間を通して免疫抑制化合物で処置される。
【０００７】
同種移植片拒絶は、お互いに決して完全適合ではない個体間の肺移植において特に問題である。肺移植の分野において、肺移植では他のほとんどの固形臓器の移植よりもより頻繁に拒絶が起こると広く信じられている。実際、肺同種移植片レシピエントにおける死亡の第一位の原因は、閉塞性細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ）（ＢＯ）として知られている慢性拒絶である（Trulock, 1997; Westra et al., 1990 ）。慢性拒絶の病因はあまりよく理解されていない；しかしながら、慢性拒絶を発生
するリスクは、反復した急性拒絶病状発生と相関していると信じられている。
【０００８】
閉塞性細気管支炎（ＢＯ）は、肺の長期間受容及び同種移植片レシピエントの生存に主要な障害である慢性拒絶の一形態であり、肺移植後５年生存者の少なくとも６０％が罹患している。ＢＯの組織病理学は、炎症性及び損傷性応答が、最終共通経路、小気道閉塞に付随する病変の発生に導くことを示唆している。どこにでも存在するドナーＨＬＡ抗原が急性拒絶応答の標的及び刺激であると信じられている。しかしながら、より新しい治療薬は急性拒絶の発生を減少させたにもかかわらず、ＢＯの発生は変化せず、組織特異的抗原への薬剤耐性宿主応答が慢性拒絶プロセスに関与しうるを示唆している。
【０００９】
臓器拒絶は、多くの場合において、宿主Ｔリンパ球による同種（ドナー）主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の認識により開始され、上方調節された細胞性及び体液性免疫を導くと考えられている。多様な治療には、移植された臓器への免疫応答の重症度を軽減するために免疫抑制剤を投与することが含まれる。残念ながら、多くの場合において、これらの療法は連続する拒絶病状発生を防止することに失敗し、それ故、免疫寛容として知られている同種移植片のあいまいな受容を誘導する最終目標は分かりにくいままである。
【００１０】
同種ＭＨＣ分子は、拒絶間の免疫応答の刺激及び標的である。それ故、ＭＨＣ抗原と相同的であることができるＭＨＣ由来ペプチド又は合成ペプチドは、同種移植片に対する免疫学的寛容性を誘導することを試みている研究の焦点となってきた（Krensky and Clayberger, 1997; Oluwole et al., 1993）。加えて、ごく最近の研究報告はＭＨＣ分子に由来する非多形合成ペプチドによる、インビトロでの複数の同種ＭＨＣ分子に対する寛容の誘導を報告している（Murphy et al., 1999）。しかしながら、これらのいずれもが、同種
移植片拒絶、特に、肺同種移植片拒絶の問題を解決したようには思われない。
【００１１】
ドナーＭＨＣ分子の多形領域の認識は通常、同種免疫応答についての刺激であり、ドナーＭＨＣに由来するペプチドにより誘導された免疫学的寛容は、ドナーＭＨＣ分子のアレルに特異的でありうる。従って、個体間で高度に保存されている、及び複数のＭＨＣアレルにわたって免疫学的寛容も誘導するタンパク質／ペプチドの同定は、同種移植片拒絶に苦しんでいる又は発生するリスクがある患者を治療するための効果的な療法を開発することにおいて非常に重要でありうる。しかしながら、肺同種移植片に対する免疫学的寛容の誘導についてのこうしたタンパク質／ペプチドの使用は十分に評価されていない。さらに、こうした寛容に有用であるタンパク質／ペプチドはごく少数しか同定されていない。
【００１２】
さらに、ドナー特異的輸血、ドナー由来ＡＰＣの胸腺注入、又は移植に先だったドナーＭＨＣ分子に由来するペプチドでの全身免疫化（Krensky and Clayberger, 1997）のような固形臓器同種移植片に対する寛容を誘導するための異なった技術の存在にもかかわらず、これらの技術のいずれもが有効であるには、十分な時間（即ち、数週間から数ヶ月）を寛容誘導が発生するのに当てるため、移植に先立った数週間前には特異的ドナーＭＨＣ分子が既知でなければならない。しかしながら、典型的なシナリオにおいては、可能性のあるドナーの同定と移植手術の間には数時間のみしかなく、ほとんどの場合、ほとんどの移植片レシピエントに寛容を誘導する十分な時間はない。
【００１３】
臓器移植の必要性にそれ自身必然的に伴う、自己免疫疾患をすでに患っている移植片レシピエントは、移植された臓器の破局的な拒絶に対して高められたリスクにさらされる可能性がある。従って、いずれの根底にある自己免疫に基づいた病態も、移植前ではないにしても確実に移植後には、同定する及び多分治療する必要がある。診断する及び治療するのが困難であり、そしてその根底にある原因が未知であり、さらにそれらを診断する及び治療する取り組みを複雑にしている、特発性肺線維症（ＩＰＦ）のような多様な肺疾患及び障害もある。
【００１４】
よって明らかに、ＩＰＦのような自己免疫疾患を同定する及びこうした疾患を治療する
又は少なくとも管理するために使用することが可能である方法に対する要求がある。本要求は、一つの主要な治療、肺移植がそれ自身存在している病原性自己免疫応答によりひどく危険にさらされている場合に特に深刻である。多様な側面及び態様は、多様な及び特異的な型のコラーゲンのような肺の成分に対する望まれない自己免疫応答により引き起こされる、又は悪化する疾患を診断すること及び治療することに関している。
【００１５】
概要
一つの態様は、ヒト又は動物患者においてＩＰＦのような肺疾患又は障害を評価する方法である。一つの態様は、患者から体液又は組織のサンプルを得ること、及び該サンプルを分析して、患者の免疫システムのいずれかの成分が、患者身体の臓器中に見出される結合組織のいずれかの要素に対する免疫応答を開始したかどうかを決定する工程を含んでなる。典型的な結合組織成分は、いずれかの型のコラーゲン及び／又はコラーゲンの抗原性成分を含むことができる。自己免疫応答を惹起することができる多様なコラーゲンには、例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン及びＶＩ型コラーゲンが含まれる。これらの患者の肺疾患又は状態を評価するための試験は、患者から体液又は組織のサンプルを得ること、サンプルの少なくとも一部とＶ型コラーゲンの少なくとも一つの抗原性成分（エピトープ）を接触させること、及びサンプル中の少なくとも一つの抗Ｖ型コラーゲン抗体の存在を示すいずれかのシグナルについての試験をモニターすること、の工程を含んでなることができる。こうした試験は、試験を行うために必須又は有益であることができるいずれかの型の、追加の成分の存在を含むことができる。こうした成分には、限定されるわけではないが、抗Ｖ型抗体に結合する二次抗体、レポーター分子又は原子、抗原性成分を結合するための表面、緩衝剤、安定剤、抗菌剤などが含まれる。
【００１６】
一つの側面は：肺からの体液若しくは組織又は肺と接触していた体液を得ること、サンプルの少なくとも一部とＶ型コラーゲンの少なくとも一つのエピトープ又は抗Ｖ型コラーゲン抗体と優先的に結合するいずれかの他の分子を接触させること、及び抗Ｖ型抗体とサンプル中のＶ型コラーゲンの少なくとも一つのエピトープの結合に付随する変化を検出すること、の工程を含んでなるアッセイである。このアッセイ及びそれらの変法は、ＩＰＦなどのような肺疾患、又はＶ型コラーゲンの少なくとも一部への自己免疫応答を含むいずれか他のタイプの肺疾患又は障害をアッセイするために使用し得る。
【００１７】
別の態様は、患者が肺の成分に対する自己免疫を有しているかどうかを決定する方法である。典型的な自己免疫応答は、体液性又は細胞性免疫のいずれか又は両方を含んでもよい。こうした応答には、例えば、遅延型過敏性応答が含まれる。自己免疫特性を有しうる肺疾患には、限定されるわけではないが、特発性肺線維症（Idiopathic Pulmonary Fibrosis）、急性呼吸促迫症候群(Acute Respiratory Distress)、成人呼吸促迫症候群（Adult
Respiratory Distress Syndrome）、二次膠原病性脈管疾患（secondary collagen vascular disease）、他の線維性肺疾患（fibrotic lung disease）などが含まれる。
【００１８】
一つの態様は、自己免疫特性を有する肺疾患又は状態を発生する増加したリスクを有する特異的患者又は患者の群を同定するため、患者をスクリーニングすることを含む。こうした疾患又は状態には、限定されるわけではないが、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、急性呼吸促迫症候群、成人呼吸窮迫症候群、二次膠原病性脈管疾患、他の線維性肺疾患など、あるいは少なくとも一部はＶ型コラーゲンのような肺結合組織への自己免疫反応による他の状態が含まれる。これらの患者をスクリーンするための試験は、患者から体液又は組織のサンプルを得ること、サンプルの少なくとも一部とＶ型コラーゲンの少なくとも一つのエピトープを接触させること、及びサンプル中の少なくとも一つの抗Ｖ型コラーゲン抗体の存在を示すいずれかのシグナルについてサンプル及び抗原の混合物をモニターすること、の工程を含んでもよい。
【００１９】
さらに別の態様は、患者の肺疾患の進行をモニターすること、又はこうした肺の疾患又は障害を患っている患者を治療するために使用した種々の治療計画をモニターすることを含む。これらの患者をモニターする試験は、患者から体液又は組織のサンプルを得ること、サンプルの少なくとも一部とＶ型コラーゲンの少なくとも一つのエピトープを接触させること、及びサンプル中の少なくとも一つの抗Ｖ型コラーゲン抗体の存在をの指標となるいずれかのシグナルについての試験をモニターすること、の工程を含んでもよい。
【００２０】
一つの態様は、ＩＰＦのような疾患のための診断試験を含み、いくつかの態様において、本試験は、患者から体液又は組織のサンプルを得ること、サンプルの少なくとも一部とＶ型コラーゲンの少なくとも一つのエピトープを接触させること、及びサンプル中の少なくとも一つの抗Ｖ型コラーゲン抗体の存在を示すいずれかのシグナルについて混合物をモニターすること、の工程を含んでもよい。
【００２１】
さらに別の態様は、ＢＯＳを発生する増加したリスクを有する候補者、例えば、Ｖ型コラーゲンのような、肺中に観察されるコラーゲンへの自己免疫応答について試験陽性の患者を同定するために、肺移植候補者を評価することを含む。これらの候補者を評価する方法は、候補者から体液又は組織のサンプルを得ること、サンプルの少なくとも一部とＶ型コラーゲンの少なくとも一つのエピトープを接触させること、及びサンプル中の抗Ｖ型抗体が抗原に結合した証拠について抗原及びサンプル混合物をモニターすること、の工程を含んでもよい。これらの候補者を評価するための試験は、抗原を固体表面に結合させること、サンプルと抗原を接触させること、抗原がサンプル中に存在する抗原に対する抗体に結合するための時間を見越すこと、及び過剰の抗体及び／又はサンプルを除去するために結合した抗原−抗体複合体を洗浄すること、の工程を含んでもよい。追加の工程は、抗原抗体複合体にレポーター部分を結合させること、及び抗原に結合した抗体の存在の指標となるシグナルの何らかの変化をについてシステムをモニターすることを含んでもよい。いくつかの態様において、試験における抗原は、Ｖ型コラーゲンの少なくとも一つのエピトープである。
【００２２】
別の態様は、Ｖ型コラーゲンのような肺中の結合組織に対する自己免疫応答が関与する肺疾患を同定するための方法を試験することを含む。いくつかの試験する方法は、所与の患者から体液又は組織のサンプルを得ること、及びＶ型コラーゲンに対する自己免疫応答の証拠についてサンプルの少なくとも一部をアッセイすること、の工程を含んでもよい。一つの態様において、Ｖ型コラーゲン又はそれらのエピトープ抗原性類似体に対する遅延型過敏性応答の証拠についてサンプルが分析される。さらに別の態様において、Ｖ型コラーゲンに対する抗体又はそれらのエピトープ又は抗原性類似体の存在についてサンプルが分析される。
【００２３】
さらに別の態様は、閉塞性細気管支炎（ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＢＯＳ）を発生する高められたリスクを有する患者を同定する、及び／又は該症候群の進行又は該症候群を治療するために使用された治療の有効性をモニターする方法である。これらの方法は一般に、患者から血清、血液、間質肺液、痰、粘液又は組織のサンプルを得ること、肺の結合組織の成分に対する自己免疫反応の証拠についてサンプルをアッセイすること、の工程を含む。一つの態様において、患者は肺移植の候補者又はレシピエントであり、該サンプルはＶ型コラーゲンに対する宿主免疫応答の証拠についてアッセイされる。一つの態様において、該サンプルはＶ型コラーゲンに対する細胞性免疫についてアッセイされる。さらに別の態様において、該サンプルはＶ型コラーゲンに対する体液性免疫についてアッセイされる。
【００２４】
別の態様は、体液又は組織のサンプルを、Ｖ型コラーゲンのエピトープ又はそれらの類
似体、一部又は成分に対する免疫の証拠をアッセイすることを含んでなる。
【００２５】
さらに別の態様は、Ｖ型コラーゲン又はそれらの抗原性部分又は断片に対する自己免疫応答のため、移植された組織を拒絶することについて高められたリスクにある予定肺移植レシピエントを同定する方法である。
【００２６】
さらに別の態様は、Ｖ型コラーゲン又はそれらのエピトープ又は抗原性断片に対する自己免疫応答による移植された組織を拒絶する継続するリスクを評価するため、肺組織移植受け取りをモニターする方法である。
【００２７】
さらに別の態様は、患者の臓器中に見出されるＶ型コラーゲンのような結合組織に対する自己免疫応答が関与する疾患又は障害を有する患者、あるいは疾患又は障害を発生するリスクのある患者を治療するための方法である。一つの態様において、該方法は、免疫抑制化合物、あるいはＶ型コラーゲンのような抗原の存在に対して患者を寛容化する化合物を提供すること、及び所与の患者に該化合物の治療的有効量を投与すること、の工程を含んでなる。こうした化合物には、限定されるわけではないが、多様なコラーゲン又はコラーゲンの一部、例えば、Ｖ型コラーゲン又はそれらのエピトープ又は抗原性類似体（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ａｎａｌｏｇｕｅｓ）が含まれる。自己免疫応答を誘導することができる典型的結合組織成分には、限定されるわけではないが、いずれかの型のコラーゲン及び／又はコラーゲンの抗原性成分（エピトープ）が含まれる。自己免疫応答を惹起することができる多様なコラーゲンには、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン及びそれらの多様な抗原性成分が含まれる。
【００２８】
さらに別の態様は、患者の肺組織中の又は移植された肺の組織中の、コラーゲン又はコラーゲンの抗原性成分に対する患者の自己免疫応答を抑制するためにコラーゲン又はコラーゲンの抗原性成分を提供することによる、特発性肺線維症、成人呼吸窮迫症候群及び他の線維性肺障害、急性呼吸促迫症候群、閉塞性細気管支炎（ＢＯＳ）などのような肺疾患又は障害の進行を治療する又は防止する方法である。こうした療法は、患者の免疫システムをより良好にコラーゲンを寛容するように条件付け、及びコラーゲンに対する患者の自己免疫応答を少なくとも部分的に抑制すると決定された期間にわたって、患者にコラーゲン又はコラーゲンの成分又はそれらの類似体の安全で及び有効な用量を投与することを含んでもよい。一つの態様において、該コラーゲンはＶ型コラーゲン又はそれらの抗原性断片又は類似体である。
【００２９】
さらに別の態様は、コラーゲン又はコラーゲンの抗原性部分に対するＴ細胞活性及び遅延型過敏性応答を含んでもよい、自己免疫応答により引き起こされる又は悪化される肺疾患の形態を治療することを含んでなる。一つの態様において、患者に投与されるコラーゲンは、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲン及びそれらの多様な抗原性成分から成る群より選択される。これらの化合物は、限定されるわけではないが、肺内滴下注入、経口、吸入、皮下注射、点滴、直接注入などを含む多様な手段により投与することができる。
【００３０】
さらに別の態様は、移植された臓器及び組織を拒絶する増加したリスクを有する患者を同定する方法である。典型的には、この方法は、患者から血液、血清、体液、痰又は組織のサンプルを採取すること、及び、患者の免疫システムのいずれかの成分が、患者身体の臓器中にある結合組織のいずれかの要素に対する免疫応答を開始したかどうかを決定するためにサンプルを分析すること、の工程を含んでなる。典型的な臓器には、限定されるわけではないが、肺、心臓、肝臓、腎臓、膵臓及び眼の構成要素が含まれる。典型的な結合組織成分には、いずれかの型のコラーゲン及び／又はコラーゲンの抗原性成分が含まれる
。自己免疫応答を惹起することができる多様なコラーゲンには、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、ＶＩ型コラーゲンが含まれる。
【００３１】
さらに別の態様は、所与の患者に自己免疫に基づいた肺病態を発生するリスクがあるかどうかを決定するための試験を実施するための、又はこうした状態とすでに診断された患者の健康をモニターするためのキットである。一つの態様において、該キットは、コラーゲンに対する細胞性及び／又は体液性自己免疫の証拠を検出するために適した、少なくとも一つのコラーゲンの抗原性成分、例えば、Ｖ型コラーゲン又はエピトープ、断片又はそれらの類似体を含む。一つの態様において、該キットはさらに、Ｖ型コラーゲンに対する自己免疫応答の指標である少なくとも一つの分子の存在下、シグナルの変化を示す少なくとも一つの原子か又は分子のレポーター部分を含む。さらに別の態様において、該キットはさらに、試験の半減期、感度及び／又は信頼性を増加させるように働く、少なくとも一つの緩衝液、安定剤、保存剤、抗菌化合物、補助剤などを含む。一つの態様において、キットはさらにフロイントアジュバント又は成分又はそれらの類似体を含む。
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明の原理の理解を進める目的で、ここでそれらの好ましい態様が参照され、及びそれを記述するために特別の専門用語が使用されるであろう。とは言っても、本発明に関連する当業者には普通に生じるであろうような、企図されている本発明の原理のこうした改変、修飾及びさらなる応用には、本発明の範囲の限定は意図されないことが理解されるであろう。
【００３３】
多数の説明及び実験が説明として提供されるが、限定ではない。記述、比較、説明又は実施例により提供されていようとなかろうと、本発明がどのように働くかの理論は限定と考えるべきではない。
【００３４】
本明細書で開示された及び暗示された組成物及び方法論は、ヒト及び他のより下等動物（例えば、愛玩動物、動物園又は家畜動物）両方への応用に有用である。従って、以下の実施例及び議論はガイダンス及び説明のつもりで示されており、限定ではない。
【００３５】
本明細書で使用される用語「評価すること」は、例えば、句「〜について患者を評価すること」で使用される場合、限定されるわけではないが、所与の疾患、障害又は状態などに相関することが示されているいずれかの識別できるパラメータについて診断する、スクリーニングする、評価する、モニターすることなどを含む。本明細書で使用される用語「評価すること」は、限定されるわけではないが、以下の活動の少なくとも一つを含む：特異的又は一般的医学状態を有しているかどうか決定するために患者を診断すること；疾患の進行又は治療計画の有効性を追跡するため、既知の又は疑われる医学状態を有する患者をモニターすること；所与の医学状態を発生するであろう可能性を見積もるために患者をスクリーニングすること；所与の患者が所与の疾患又は医学状態を有する又は発生するリスクがある確率を評価すること；疾患、症候群又は状態を発生する傾向又は感受性の存在を検出すること；及び所与の医学状態、疾患、障害などを発生すること及び／又は回復することについての長期又短期予後を予測すること。
【００３６】
本明細書で使用される用語「医学状態」とは、症候群、疾患、状態などを含む。
【００３７】
ラット肺移植モデルでの研究は、特異的抗抗Ｖ型コラーゲン自己免疫応答が原因で肺が拒絶されることを示した。追加の議論については：その全体が本明細書において援用されるDavid S. Wilkes により２００３年９月１３日に出願された米国特許出願番号10/243,797 に基く米国特許出願公開番号2003/0078208A 、及びDavic C. Mares et. al., による"
Type V Collagen Modulates Alloantigen-Induced Pathology and Immunology in the Lung," Am. J. Respir, Cell Mol. Biol, Vol. 23, pp. 62-70, 2000 、を参照されたい。
Ｖ型コラーゲン［ｃｏｌ（Ｖ）］は肺に存在するマイナーなコラーゲンであり（Madri and Furthmayr, 1980）、細気管支周囲結合組織（Madri and Furthmayr, 1979）、肺胞間質（Konomi et al, 1984）及び毛細血管基底膜（Madri and Furthmayr, 1979）に位置する
。αｌ（Ｖ）のα−１鎖はＸＩ型コラーゲンα２鎖［α２（ＸＩ）］とほとんど７６％相同的であり（Cremer et al., 1994）、及びα２（ＸＩ）の遺伝子はマウス及びヒトのＭ
ＨＣクラスＩＩ座位に位置しており（Hanson et al., 1989）、及びＭＨＣクラスＩＩと
アミノ酸配列を共有している（Wilson et al., 1995）。ＭＨＣ由来ペプチドは、肺以外
の同種移植片において寛容を誘導するために利用されてきた。本発明者は、ｃｏｌ（Ｖ）におけるＭＨＣ「様」配列の存在可能性のため、肺同種移植片における免疫応答を変調するためにｃｏｌ（Ｖ）を選択した。
【００３８】
ここで（以下に示されている）実施例１の結果を参照すると、コラーゲンに対して増加した自己免疫応答を有する肺移植患者は、移植拒絶についてより高いリスクであるようである。これら及びその他の観察に従い、一つの態様は、肺移植を待っている又は受けた患者のコラーゲンに対する細胞性か又は体液性自己免疫応答を測定することによる、肺移植拒絶の進行を予測する及び／又は追跡する方法である。一つの態様において、追跡された肺移植拒絶のバイオマーカーは、Ｖ型コラーゲン及び／又はＶ型コラーゲンのエピトープである。
【００３９】
ミオシン及び熱ショックタンパク質のような自己抗原は、心臓及び皮膚同種移植片拒絶の間、免疫応答の標的になり得ることが、医学文献に報告されている（Fedoseyeva, et al., 1999; Duquesnoy, et al., 1999; Birk, 1999）。げっ歯類における肺同種移植片拒
絶が、組織弾力性及び伸展性に必須であり、肺及び皮膚に観察されるマイナーコラーゲン（Schwarze, et al., 2000）であるＶ型コラーゲンに対するＴ細胞応答に関連していることも報告されている（Mares, et al., 2000）。ｃｏｌ（Ｖ）の断片が肺移植後に気管支
肺胞洗浄（ＢＡＬ）液内に放出され、ｃｏｌ（Ｖ）特異的Ｔ細胞の養子移入が移植された肺同系移植片中で「拒絶様」病態を誘導する（Haque, et al., 2002）。肺移植に先だっ
てラットにｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることにより誘導された経口寛容は、急性拒絶及びＢＯの発生を抑止した（ａｂｒｏｇａｔｅｄ）（Yasufuku et al., 2001; Yasufuku et al., 2002）。
【００４０】
一つの形式的可能性は、肺移植片を受けた患者はｃｏｌ（Ｖ）に対する細胞性及び／又は体液性免疫を発生する可能性があり、及びこの自己免疫応答がＢＯを発生するリスクを増加させるというものである。（以下に示されている）実施例２の結果のいくつかは、肺移植後のｃｏｌ（Ｖ）免疫反応性の発生と一致しており、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）の主要なリスクファクターを代表している。
【００４１】
ＢＯの組織病理学は、炎症及び傷害への応答が最終共通経路、移植片不全を導く病変の発生を結果として生じることを示唆している。肺移植環境の外部でこの症候群がまれなことは、自己免疫機構がこのプロセスに中心的役割を果たしていることを示している。しかしながら、急性拒絶及びＭＨＣ不適合が必ずしもＢＯＳにつながるわけではないという事実は、他の免疫因子が重要である可能性も示唆している。（以下に示されている）実施例２の結果は、肺移植が自己抗原、Ｖ型コラーゲンに対する新自己免疫の発生を誘導しうることを示唆している（Estenne, et al., 2002）。実際、この研究で観察された肺移植後
のｃｏｌ（Ｖ）自己免疫により与えられた相対的リスクは、以前にＢＯＳの移植後リスクとして同定された、急性拒絶病状発生のような因子よりもおよそ８〜１０倍大きかった（Sharpies, et al., 2002）。
【００４２】
肺移植片レシピエントの末梢血中のｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ反応性の原因であるＴ細胞の予備的分析は、ｃｏｌ（Ｖ）特異的ＣＤ８＋Ｔエフェクター細胞の役割は排除できないけれども、大部分はＣＤ４^＋であることを示している（Burlingham, W., Rodriguez, D. and Jankowska-Gan, E., 未発表）。ラットモデルにおいて、拒絶肺移植片からのインビトロ
培養により誘導されたｃｏｌ（Ｖ）特異的ＭＨＣクラスＩＩ制限ＣＤ４^＋Ｔ細胞クローンは、左肺同系移植片において肺拒絶病態を仲介することが可能であり、いくらかの病態は未処理の右肺にも広がっていた（Haque, et al., 2002）。同一のクローンを正常ラット
内へ注入した場合、未処理肺への損傷は観察されず、これらの結果は、同系移植片法に伴っている虚血及び再灌流障害が免疫病態を開始するために必要とされたことを示唆している。拒絶同種移植片から単離されたＴ細胞のすべてのクローンが病原性であるわけではなく、いくつかは保護的であるようであり（D. Wilkes, 未発表）、ｃｏｌ（Ｖ）又は他の
組織抗原に特異的なＣＤ４^＋Ｔ調節細胞は自己免疫病態を制限することにおいて役割を果たすことができることを示唆している。実際、患者Ｌ３におけるＢＯＳ発生後の移植片損失への急速な進行、及び抗ｃｏｌ（Ｖ）自己免疫を有する幾人かの患者における機能の安定化（図ＩＢ、左パネル及び１Ｃ、中央パネル）は、ヒト（VanBuskirk, et al, 1998: Burlingham, et al., 2000, Cai, et al., 2004）及び非ヒト霊長類（Torrealba, et al.,
2004）での腎臓移植で以前に記載されている現象である、ドナー抗原への調節されたＤ
ＴＨ応答の喪失又は獲得と相関していた（W. Burlingham and E. Jankowska-Gan, 未発表）。
【００４３】
ＨＬＡ ＤＲ不適合は臓器移植の早期急性拒絶の周知のリスクファクターである（Ayoub, et al., 1982）。このことは、なぜＤＲ不適合がＢＯＳに関連しているのかを部分的
に説明できる（van den Berg, et al., 2001）。ドナー及び自己抗原に向けられる免疫調節の状態を確立することにより、ＨＬＡ ＤＲ適合が肺移植に有益な役割を果たしている可能性が高い（Rodriguez, et al., 2004）。
【００４４】
ＩＶ型コラーゲンに対するＢ細胞自己免疫とグッドパスチャー症候群間のよく確立されたつながりがあり（Hudson et al., 2003）、それはトランスビボＤＴＨアッセイを使用
したＴ細胞レベルで本研究において確認された（図３Ｂ）。Ｔ細胞仲介傷害による腎臓からのコラーゲンＩＶの放出は、システムを局所Ｂ細胞免疫に、及びこの疾患のラットモデルにおける抗糸球体基底膜ＩｇＧ沈着に傾かせる。同様に、アロ反応性との関係において、虚血損傷肺移植片からのｃｏｌ（Ｖ）の放出は、ｃｏｌ（Ｖ）特異的エフェクターＴ細胞を活性化し、局所ｃｏｌ（Ｖ）特異的Ｂ細胞応答及び上皮下マトリックスにおけるＣ’−固定ＩｇＧの沈着を促進する。
【００４５】
本明細書に報告されている実施例２の一つの結果は、ＩＰＦを有する患者中に、先在するｃｏｌ（Ｖ）特異的自己免疫が存在するという発見である。肺移植後（ＲＥＦ）のこれらの患者の予後不良の理由と同様に、ＩＰＦの病因は謎のままである。抗ｃｏｌ（Ｖ）特異的Ｔ細胞が、この肺疾患の根底にある線維性プロセス、又はＩＰＦのための肺移植における早期不良転帰に寄与かどうかまだ決定されていないが、これらのデータは明瞭にこれらの現象間の関連と一致している。
【００４６】
実施例２の予期されなかった結果は、移植に先立ってｃｏｌ（Ｖ）に対する自己寛容を回復する又は強化することにより、ＩＰＦを有する又は発生するリスクがあると診断された患者を治療することを示唆している。一つの態様は、間質的な肺内への経口療法により（Yasufuku et al, 2001 ; Yasufuku, et al, 2002）、あるいは、限定されるわけではないが、Ｖ型コラーゲン及び抗原性成分及びそれらの変異体を含むコラーゲンに対する患者の寛容を増加させるように設計された、服用量計画での他の減感作戦略により、ｃｏｌ（ｖ）を投与することによって、ＩＰＦを治療する方法である。
【００４７】
さらに別の態様は、自己免疫応答を含む疾患を診断する又はモニターするための抗体に基づいたアッセイである。
【００４８】
コラーゲンに対する抗体の存在を検出することは、いくつかの態様に従って、ＥＬＩＳＡ法によるような多数のイムノアッセイ法のいずれかを使用して達成することができる。標準イムノアッセイ教科書を参照することにより見ることができるように、広範囲のイムノアッセイ技術が利用可能であり、これらには、限定されるわけではないが、シングルサイト及び２−サイト、又は非競合型の「サンドイッチ」アッセイ、ならびに慣用的競合結合アッセイが含まれる。
【００４９】
サンドイッチアッセイは中でも最も有用で及び通常使用される、抗体に基づいたアッセイ法であり、多様な態様を実施するために使用することができる。サンドイッチアッセイ技術の多数の変法が存在し、すべてが多様な態様に包含されることが意図される。簡単には、サンプル中の抗体を検出するための典型的なアッセイにおいては、非標識抗原を固体表面に固定化し、そして試験されるべきサンプルを結合された抗原分子と接触させる。適したインキュベーション期間後（即ち、抗体−抗原複合体の形成を可能にする十分な時間）、検出可能なシグナルを生成することができるレポーター分子で標識した抗ヒトＩｇＧのような第二抗体を次ぎに加え、抗体−抗原−標識抗体の形成に十分な時間放置する。未反応材料を洗い流し、そしてサンプル中の検出すべき抗体の存在を、レポーター分子により生成されたシグナルの観察により決定する。結果は、例えば、可視シグナルの単純な観察により、定性的であってもよく、あるいは、問題とするサンプルにより発生されたシグナルを検出されるべき抗体を既知の量含有する対照サンプルと比較することにより、定量的であってもよい。このアッセイの変法には、サンプル及び標識抗体の両方が同時に結合された抗原に加えられる、同時アッセイが含まれる。これらの技術は公知であり、当業者には容易に明らかになるであろういずれかのマイナー変法が含まれる。
【００５０】
典型的なサンドイッチアッセイにおいて、抗原は固定化されており、例えば、固体表面に共有結合でか又は受動的に結合されている。いくつかの態様において、固体表面は、典型的には、ガラス又はポリマーであり、最も通常に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニル又はポリプロピレンである。固体支持体はチューブ、ビーズ、ディスク又はマイクロプレートの形態、又はイムノアッセイの実施に適したいずれかの他の表面であってもよい。多様な結合プロセスが当該技術分野において周知であり、一般に所与の表面への抗原の架橋、共有結合又は物理吸着から成っている。固定化抗原は次ぎに、試験サンプルの添加に備えて洗浄される。試験されるべきサンプルのアリコートを次ぎに固定化抗原と接触させ、十分な期間（例えば、２〜４０分）、及びサンプル中に存在する、コラーゲンに対するいずれの抗体の結合も可能にするために適した条件下（例えば、２５℃）でインキュベートする。接触時間の実際の長さ、緩衝液条件、温度などは容易に調節可能なパラメータであり、所与の試験について典型的には容易に決定される。インキュベーション期間に続いて、いずれかの結合された抗体を含んでいる固定化抗原を洗浄及び乾燥し、結合された抗体に特異的な第二抗体（例えば、抗ヒトＩｇＧ）とインキュベートする。第二抗体はレポーター分子に連結されており、それを抗体−固定化抗原複合体への第二抗体の結合を示すために使用する。
【００５１】
用語「部分（moiety）」とは、本明細書で使用される場合、分子、原子、化学官能基などを含む。
【００５２】
本明細書で使用される用語「レポーター分子」には、それらの化学的性質により、抗原結合抗体の検出を可能にする分析的に同定可能なシグナルを提供する分子が含まれる。検出は定性的あっても、あるいは定量的であってもよい。この型のアッセイにおいて最も普通に使用される分子には、酵素、フルオロフォア又は放射性核種含有分子（即ち、放射性
同位元素）、化学発光分子などが含まれる。酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）の場合において、酵素は第二抗体に、一般にはグルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸によりコンジュゲートされている。しかしながら、容易に認識されるであろうように、広範囲の異なったコンジュゲーション技術が存在し、それらは容易に当該技術分野で利用可能であり、及び特定のアッセイ及び試験に至適の又はほぼ至適の条件は、最少の実験法のみで到達し得る。これらの型のアッセイにおいて普通に使用されるレポーター酵素には、限定されるわけではないが、中でも西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼが含まれる。特定の酵素で使用されるべき基質は、レポーター分子又は原子の存在に関連する所与のシグナルの検出可能な変化の産生（対応する酵素による加水分解で）に対して一般に選択される。上記の発色基質というよりむしろ蛍光生成物を生成する蛍光発生基質を用いることも可能である。ほとんどの場合、酵素−標識抗体は第一の抗体−抗原複合体に加えられ、結合させ、次ぎに過剰の試薬を洗い流す。適切な基質を含有する溶液を抗体−抗原−標識抗体の複合体へ加える。基質は第二抗体に連結された酵素と反応し、検出可能な視覚シグナルを産生し、それは通常分光光度計を使用してさらに定量することができ、サンプル中に存在した抗体の量の指標を与える。用語「レポーター分子」はガラス又はラテックスビーズのような細胞凝集又は凝集の阻害を使用することにも拡張される。加えて、レポーターは、その存在が、例えば、シンチレーション計数によって検出される放射性基又は原子でもあり得る。
【００５３】
もしくは、フルオレセイン及びローダミンのような蛍光化合物を抗体へ、それらの結合能を有意に変化させることなく化学的に結合させてもよい。特定の波長の光による照明で活性化した場合、蛍光色素標識抗体は光エネルギーを吸収し、分子の励起性の状態を誘導し、続いて特徴的な色の光を放出し、いくつかの態様において、放射されたシグナルは光学顕微鏡で視覚的に検出可能であり、他の態様において、シグナルは可視スペクトルの外側であることもできる。ＥＩＡでのように、蛍光標識抗体は一次抗体−抗原複合体に結合させることが可能である。非結合試薬を洗い出した後、残っている三次複合体を次ぎに適切な波長の光に暴露し、観察される蛍光は目的の抗体の存在を示す。免疫蛍光法及びＥＩＡ技術は両方とも当該技術分野でよく確立されており、本明細書に開示した多様な態様での使用に容易に適応可能である。加えて、放射性同位元素、化学発光、蛍光色素、又は生物発光分子などのような他のレポーター分子も用いることができる。
【００５４】
いくつかの態様を実施するため、純粋な又は部分的に純粋なコラーゲン又はそれらのエピトープ又は抗原性部分を得る必要があろう。これらの材料、例えば、Ｖ型コラーゲン又はそれらの抗原部分は、限定されるわけではないが、２〜３例を挙げると動物源、ヒト死体又は組換え手段を含む、多様な手段により容易に得ることができる。追加の方法にはＶ型コラーゲンのようなコラーゲンの部分的消化が含まれる。
【００５５】
一つの側面は、Ｖ型コラーゲンのような肺結合組織に対する自己免疫応答の証拠を同定することにより、特発性肺線維症のような疾患を診断することを含んでなる。結合組織の証拠は、Ｖ型コラーゲン及びそのエピトープを含むことができる。実施例３で明瞭に示したように、ＩＰＦを有する、又はＩＰＦ又はＢＯ又はＢＯＳを発生することが高められている患者を同定する及び／又は追跡するために使用し得る一つのアプローチは、患者の体液中の抗Ｖ型コラーゲン抗体のレベルを測定することである。
【００５６】
別の側面は、Ｖ型コラーゲン及びＶ型コラーゲンの多様な抗原性成分及び／又はそれらの類似体のような化合物の安全で及び療法的に有効量を投与することにより、肺組織中に観察されるコラーゲンの自己免疫拒絶に関連する、医学状態を有すると診断された、又は医学状態を有すると考えられる、又は医学状態を発生する高められたリスクにあると考えられる、患者を治療することを含む。これらの化合物は、経口摂取、肺内滴下注入、吸入、注射などを含む、当該技術分野では公知のいずれかの手段により投与し得る。療法化合
物の有効量及び治療の持続は、各患者に依存するであろうが、療法効果、例えば、Ｖ型コラーゲン又はそれらのいくつかの断片のようなコラーゲンに対する患者の自己免疫応答の少なくとも部分的な抑制を誘導するために容易に較正し得る。
【００５７】
免疫システムに関連する疾患又は医学状態を治療するためにＭＣＨエピトープを使用する療法的意義の追加の議論は、例えば、２００５年６月２８日にSachs により公布された米国特許第6,911,220 号、及び２００３年４月２４日に公開された米国特許公開番号2003/0078208 A1（Wilkes）（両方ともその全体が本明細書において援用される）に見ること
ができる。
【００５８】
一つの態様において、自己免疫応答を含む又は自己免疫応答により引き起こされる肺疾患又は障害を有する、又は患っていると考えられた患者は、例えば、シクロスポリンを含む免疫抑制剤で治療することが可能であった。免疫システムに対するいくつかのその効果を含む、シクロスポリンのさらなる一般的議論については、２００５年６月２５日にDavalian, et al．により公布された米国特許第6,410,696 号及び１９９９年１１月２３日にWang により公布された5,990,274 号（両方ともその全体が本明細書において援用される）を読者は参照されたい。
【実施例】
【００５９】
実施例１
移植後肺患者はＶ型コラーゲンが特異的な自己免疫を発生していたかどうかを決定するため、８人の肺移植片レシピエント及び５人の腎臓移植片レシピエント（グッドパスチャー症候群を有する、ＩＶ型コラーゲン（ｃｏｌ）自己免疫）からの白血球、及び３つの異なったコラーゲンを使用する遅延型過敏性（ＤＴＨ）アッセイを行った。図３、パネルＡに示したように、肺移植片レシピエントからのＴ細胞はｃｏｌ（Ｖ）に応答したが、ｃｏｌ（ＩＶ）又はｃｏｌ（ＩＩ）には応答せず、一方、グッドパスチャー症候群を有する患者からのＴ細胞はｃｏｌ（Ｖ）又はｃｏｌ（ＩＩ）には応答せずに、ｃｏｌ（ＩＶ）に対して有意により高いＤＴＨ応答を有していた。この鍵となる発見は、肺移植片レシピエントが抗Ｖ型コラーゲン自己免疫を有していることを示している。
【００６０】
我々は次ぎに、抗Ｖ型コラーゲン自己免疫応答が、肺移植を待っているいずれの患者にも観察することができ、それ故特定の患者が低下した肺機能及び拒絶を生じ易くできる先在条件を反映しているかどうかを決定した。肺移植を待っている多様な末期肺疾患を有する２３人の患者における抗ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ応答の解析は、一つの特定の群が抗Ｖ型コラーゲン自己免疫応答を有していることを示した。図５に示したように、特発性肺線維症（ＩＰＦ）の患者が抗ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ応答を示し、それはいずれか他の疾患を有する患者で観察されたよりも２倍高かった。この鍵となる発見は、ＩＰＦがＶ型コラーゲンに対する自己免疫応答により起こされ得ることを示している。
【００６１】
この発見をさらに支持するため、いくつかの異なった原因により肺移植を待っている患者を、ｃｏｌ（Ｖ）か又はｃｏｌ（ＩＩ）に対するかれらの自己免疫応答について試験した。図３、パネルＢに示したように、ＩＰＦ患者からのＴ細胞のみがＶ型コラーゲンに特異的である自己免疫応答を示した。University of Wisconsin で移植したＩＰＦを有する患者は有意に低い１年移植片生着（ｐ＝０．０５）（図３パネルＣ）を有したことを示したのは興味深く、それは先在するＶ型コラーゲンへの自己免疫応答がより速い肺機能の喪失及び死を生じ得ることを示唆する。図３及び５に示された結果は、ＩＰＦはＶ型コラーゲンへの自己免疫応答により起こされ得ること、これらの患者はこの自己免疫応答のためより速い速度で肺を拒絶するであろうこと、及びこれことがＶ型コラーゲンによる経口免疫寛容療法に応答するであろう追加の患者の群を表していることを示している。
【００６２】
ＩＰＦ患者で観察されたような、Ｖ型コラーゲンに対する先在する自己免疫応答が肺破壊を生じるであろうという考えを裏付けるため、我々は、我々のラット移植モデルを使用した。ＷＫＹラットを何もなしで（図６ａ）、ニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ）（図６ｂ）か又はＶ型コラーゲン（図６ｃ）で免疫し、同系移植肺を移植した。観察されるように、何もなしで又はＨＥＬで免役したラットは正常肺病理を示した。対照的に、Ｖ型コラーゲンに対して活性免疫応答を有するラットは３０日以内にそれらの同系移植片肺を破壊した。これらのデータはさらにＶ型コラーゲンへの自己免疫応答と一致しており、Ｖ型コラーゲンに対する自己免疫応答を示さない肺移植片レシピエントで予期されるよりも、移植された肺及び肺組織の拒絶のより高いリスクを示している。
【００６３】
実施例２
閉塞性細気管支炎（ＢＯＳ）は、肺移植後の移植片機能損失の主要原因である。肺細胞外マトリックス中のマイナーコラーゲン、Ｖ型コラーゲン（ｃｏｌ（Ｖ））はラット肺同種移植片拒絶の病変形成に結びつけられてきた。ヒト肺移植後のｃｏｌ（Ｖ）に対する自己免疫がＢＯＳの素因となるという仮説を試験するため、我々は末梢血中の遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答及び気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）中の抗体応答を試験した。
【００６４】
１９８８年から２００３年６月まで、University of Wisconsin で実施されたすべての肺移植（ｎ＝２２９）を、ＢＯＳの素因となるリスクファクターについて遡及的に分析した。５６人のこれらのレシピエント、１０人の正常対照及び２５人の移植を待っている患者における、ｃｏｌ（Ｖ）又はｃｏｌ（ＩＩ）に対するＤＴＨ又は抗体を測定した。
【００６５】
すべての対象は、University of Wisconsin 及びIndiana University School of Medicine で、ＩＲＢ認可インフォームド・コンセント手順を使用することにより同意した。１９８８年から２００３年３月まで、University of Wisconsin Hospital and Clinics で
一次肺移植を受けた２２９人の内、３人は技術的失敗のため分析から除外した。
【００６６】
すべての患者は、移植後０．５、１、３、６、９及び１２ヶ月、及び臨床的に指示された場合はその後でもプロトコール気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）及び経気管支生検（ＴＢＢ）を受けた。ＴＢＢ組織はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）封入及び細胞浸潤についてスクリーニングした。ｃｏｌ（Ｖ）研究患者（ｎ＝５６）には、２０００年に開始された移植後ＤＴＨ研究プロトコールに登録された２９人が含まれており、ＢＡＬが保存されていた２３人の患者が遡及的にｃｏｌ（Ｖ）に対する抗体を試験し、４人の患者は移植後３〜６年から始まったＤＴＨについてのみ試験した。さもなければ、およそ６、１２及び１８ヶ月目及びその後は毎年、ＤＴＨアッセイのために血液サンプルを採取した。非喫煙成人血液ドナー及び気管支鏡検査を受けているボランティア及びＢＡＬ液の収集物が、陰性対照として働いた。グッドパスチャー症候群のための腎臓移植後の５人の患者もＤＴＨ試験における対照血液ドナーとして採用された。
【００６７】
ＢＯＳレベルＩ（一次研究エンドポイント）は、少なくとも移植９０日後、最大移植後値の＜８０％へのＦＥＶ１の持続的低下により診断された（９）。
【００６８】
ＩｇＧは、商業的に調製されたProtein Ｇセファロースカラム(Pharmacia, Piscataway, NJ)を製造元のプロトコールに従って通過させることにより、患者及び対照のＢＡＬ液
から親和性精製された。すべての溶出フラクションは使用するまで−８０℃で凍結した。
【００６９】
ｃｏｌ（Ｖ）に対する抗体は、検出にヒツジ抗ヒトＩｇＧアイソタイプ特異的抗体を
使用したことを除いて、以前に記載されているウェスタンブロット技術を使用して分析した。ウシｃｏｌ（ＩＩ）及びｃｏｌ（Ｖ）(Collaborative Biomedical Products- BectonDickinson, Bedford MA)又はヒト胎盤から抽出した（１０）ｃｏｌ（Ｖ）を標的抗原と
して使用した。
【００７０】
ＣＢ−１７ ＳＣｌＤマウスはHarlan Sprague Dawley,Inc (Indianapolis, IN)から購入するか、又は近くで繁殖させた。全ての動物はＮＩＨガイドラインに沿って飼育し及び処置した。
【００７１】
トランスビボＤＴＨアッセイは、以前に記載されているように（ｉｉ）、ＳＯｌＤマウスの足蹠内にヒトＰＢＭＣ及び抗原を同時導入することにより実施した。ヒトｃｏｌ（Ｖ）、ｃｏｌ（ｌＶ）(Fluka, Inc., Buchs, Switzerland)又はウシｃｏｌ（ＩＩ）（５μ
ｇ／注入；Southern Biotech, Birmingham, AL）が試験抗原であった。足蹠厚はダイアル厚さ計を使用し、注射前及び２４時間後に測定した。緩衝液を伴ったＰＢＭＣ単独によるバックグラウンド膨潤を差し引いて、抗原特異的応答を決定した。バックグラウンドを＞２５ｘ１０^−４インチ超える膨潤応答を陽性と考えた（１２）。
【００７２】
ＢＯＳフリー生存率はKaplan 及びMeier の方法を使用して見積り、そしてlog-rank test を使用して群間を比較した。陰性ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ又はＡｂ応答の基準は厳格であ
った−たとえ全ての他の時点で陰性であっても、ウェスタンブロットでのわずかに陽性の抗ｃｏｌ（Ｖ）バンド又は最小陽性ＤＴＨ応答（２５ｘ１０^４インチ）を有する患者は陽性と考えた。Ｃｏｘの比例ハザードモデルを、疑わしいリスクファクター間の関連を評価するために使用し、そのいくつかは時間−変動，及びＢＯＳフリー生存であった。Ｐ値＜０．０５は有意であると考えた。全ての分析はＳＡＳ統計ソフトウェアリリース６．１２、SAS Institute Inc. (Cary, NC) を使用して実行した。移植前ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ応答はクラスカル・ワリス検定を使用し、ＩＰＦ患者サブグループ及び他のグループ間で比較した。
【００７３】
ここで表１（図７）を参照すると、ここに要約されているのは、University of WI, Madison での２２６人の肺移植片レシピエントにおける個体統計及びＢＯＳのの発生率である。ＢＯＳは８６人の患者（３８％）で発生した。両側肺移植（ｎ＝９３）と比較して片側（ｎ＝１３３）でより多かった。平均経過観察期間は３．７年であった。全体の比率の構成及びｃｏｌ（Ｖ）研究サブセットの構成はＢＯＳの発生率、平均経過観察期間、及び各疾患カテゴリーにおける患者の比率に関して類似していた。
【００７４】
我々は以前にＩｇＧ２産生が、肺同種移植片拒絶の病状発生の間にＢＡＬ液で選択的に増加したことを報告した（１０）。図１Ａに図解したように、肺移植片患者Ｌ３（ＢＯＳレベルＩＩＩ-移植片機能損失）及びＬ４１（ＢＯＳなし）のＢＡＬから単離されたＩｇ
Ｇ抗体は、ウェスタンブロットにおいてｃｏｌ（Ｖ）に強く結合したが、ｃｏｌ（ＩＩ）には結合しなかった。ウシ及びヒトｃｏｌ（Ｖ）の両方ともＢＡＬ ＩｇＧにより等しく認識されるたことは（データは示されていない）、標的エピトープが種を超えて保存されていることを示している。患者Ｌ３及びＬ４１とは対照的に、ＢＯＳを発生していないＬ３１のＢＡＬサンプル中では、ｃｏｌ（Ｖ）への結合は弱いか又は観察されなかった（図１Ａ）；陰性結果は正常ボランティアのＢＡＬから単離されたＩｇＧでも観察された（ｎ＝１０；データは示されていない）。
【００７５】
次ぎに、我々は、末梢における（トランスビボＤＴＨ試験を使用して）及び局所的に（ＢＡＬ抗体分析により）、ＢＯＳの発生と抗ｃｏｌ（Ｖ）自己免疫との関係を試験した。同一の３人の患者の臨床経過を図１Ｂに示した。患者Ｌ３は、試験された移植後の最も早い時期に（１８０日）、強い及び特異的な抗ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ反応性を有しており、ＦＥＶ−１は未だ最高レベルであった。強いｃｏｌ（Ｖ）抗体応答はＢＯＳの発生直前にも検出され（黒色矩形）、その時ＦＥＶ−１の値は最大の８０％付近で停滞していた。ＤＴＨ及びｃｏｌ（Ｖ）に対する抗体応答の両方がＢＯＳの発生の間に検出されたが、４５０
日目のＢＯＳ末期（グレードＩＩＩ）ではＤＴＨ反応性は失われた。
【００７６】
患者Ｌ４１は、ｃｏｌ（Ｖ）に対する強い早期応答を有するが、同種移植片機能の持続的低下がない患者の例である。抗ｃｏｌ（Ｖ）抗体（２＋）が４８〜２１３日目で検出され、及び１８８〜４６０日目に得られた全てのＰＢＭＣサンプルはｃｏｌ（Ｖ）に対してＤＴＨ陽性であった。５００日目から抗ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ応答は変動し、そして一般に減少した。９８０日目の急性拒絶病状発生後、ＢＯＳ−１についてのカットオフの直ぐ上の、最大ＦＥＶ１のおよそ８２％で安定化した。
【００７７】
患者Ｌ３１は４９日目にｃｏｌ（Ｖ）に対する弱い抗体応答及び４００日目に最小陽性抗ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ応答を有したが、強い自己免疫反応性を発生することはなかった。該患者は優れた移植片機能を＞５年維持し、そしてつい最近のＰＢＭＣサンプル（１６００日目）は抗ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ応答について陰性のままである。
【００７８】
ｃｏｌ（Ｖ）応答及び同種移植片機能のこれら三つのパターンは、５６人の患者の研究サブグループで見られたものを代表している。図１Ｃは、各カテゴリーにおける４人の追加患者の移植後時間経過を示している。各々の線は単一の患者についての％最大ＦＥＶｌを表しており、及び各々の赤色記号はｃｏｌ（Ｖ）について陽性試験を表している（ＢＡＬ中の抗体か又はＤＴＨアッセイにおいて＞２５の正味足蹠膨潤）。緑色記号は陰性抗ｃｏｌ（Ｖ）結果を示している。
【００７９】
第一のカテゴリー中の４人全ての患者（抗ｃｏｌ（Ｖ）＋、ＢＯＳ＋）は、Ｌ３患者と同様に、移植片機能の喪失に先立って陽性ＤＴＨ又は抗体試験を示した。第三のカテゴリーの患者（抗ｃｏｌ（Ｖ）−、ＢＯＳ−）は、ｃｏｌ（Ｖ）に対する応答をほとんど示さず、そしてすべて３〜６年の経過観察でＢＯＳフリーを続けた。中間のカテゴリーの患者は、抗ｃｏｌ（Ｖ）応答についての繰り返した陽性試験にもかかわらず、移植後１〜３年優れた移植片機能を何とか維持していたので、最も興味深い。
【００８０】
ＢＯＳか又は移植片機能損失又はエンドポイントとしてのＢＯＳ単独に関連するリスクファクターの遡及的分析の結果は表２（図８）に示されている。全患者集団中で、ＢＯＳの有意により高い（ｐ＜０．０５）リスクの素因となる移植前因子には、ドナーとの２ＤＲ不適合を有している（ＲＲ＝１．６４ｖｓ．０又は１ＤＲ不適合）、及び慢性閉塞性肺疾患、ＣＯＰＤ（ＲＲ＝１．７）又は「他の」（ＲＲ＝１．９）の疾患カテゴリーを有しているものが含まれる。ＢＯＳ又は移植片機能損失のより低い発生率の素因となる移植前因子には、嚢胞性線維症（ＣＦ）の本来の疾患又は両側肺移植を受けている（この疾患カテゴリーの主な治療）が含まれる（両方ともＲＲ＝０．３５）。ＢＯＳについての移植後リスクファクターも評価した。予期されたように、急性拒絶病状発生の発生率は、ＢＯＳの１．４〜１．５倍より高いリスクと関連し、それは極めて有意であった。しかしながら、ＣＭＶ＋ドナー肺のＣＭＶ−レシピエントへの移植、又は移植後期間におけるバイオプシ証明ＣＭＶはＢＯＳと有意に関連しなかった。
【００８１】
図８を再び参照すると、表２は、Ｃｏｘ比例ハザード肺移植モデルを使用し、ｃｏｌ（Ｖ）への応答について分析された５６の肺移植片レシピエントにおける乏しい機能（ＢＯＳ Ｉ又は移植片機能損失）又はＢＯＳ Ｉ発生の分析を要約している。この患者の下位集団において、急性拒絶は再び乏しい機能についてのリスクであった。乏しい移植片機能についての最も高いＲＲ（１２．３）は、ＢＯＳ発生に近い時点でｃｏｌ（Ｖ）に対して陽性ＤＴＨを有する患者で観察された。対照ｃｏｌ（ＩＩ）に対するＤＴＨ応答はＢＯＳの発生に相関を示さず（ＲＲ＝１．０）、ｃｏｌ（Ｖ）に対するＤＴＨ応答はＢＯＳリスクの特異的マーカーであることを示している。２は、ｃｏｌ（Ｖ）に対するＤＴＨ応答とＢＯＳの発生の関係を、如実に示している。移植後３７０日目（上のパネル）及び７６０
日目（下のパネル）に良好な肺機能（＞８０％最大ＦＥＶ１）を有する患者を、抗体及び／又はＤＴＨ分析に基づいてｃｏｌ（Ｖ）＋対ｃｏｌ（Ｖ）−応答者に分割し、カプランマイヤー分析を、エンドポイントとしてＢＯＳ Ｉまでの時間で実施した。各時点に先立って抗ｃｏｌ（Ｖ）反応性を有する患者の半分以上が次の２年以内にＢＯＳを発生し、一方、ｃｏｌ（Ｖ）に対して陰性応答を有する患者は主にＢＯＳフリーであった。
【００８２】
ＢＡＬ中の抗ｃｏｌ（Ｖ）抗体のレベルは、何らかの原因によりＢＯＳの発生又は移植片機能損失（ＲＲ＝２．３）、及びＢＯＳ単独のリスク（ＲＲ＝２．０８）と有意に関連した。二つの指標、ＤＴＨ又はｃｏｌ（Ｖ）に対する抗体が合わさった場合、ＢＯＳ又は移植片機能損失に対するＲＲは１２．７であり、ＢＯＳを発生した全ての患者がいくつかの前の時点で陽性ＤＴＨか又はｃｏｌ（Ｖ）に対する抗体応答を有していたので、ＢＯＳについては計算することができなかった、表２（図８）。
【００８３】
肺移植後患者で見られた抗ｃｏｌ（Ｖ）応答が、特定の患者に乏しい機能を生じやすくすることができる、前々から存在している状態の単なる反映しているかどうかを決定するため（ＣＯＰＤを有する患者はより高い移植前抗ｃｏｌ（Ｖ）応答を有し、一方、ＣＦを有する患者はより低い応答を有する）、肺移植を待っている、多様な末期肺疾患を有する２３人の患者における抗ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ応答を分析した。図３、パネルＡに示したように、ほとんど末期の肺疾患を有する患者は抗ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ応答を有しておらず、既知の肺疾患を有していない正常対象で見られたことと著しく異なっている。例外はＩＰＦを有する患者である。これらの患者における抗ｃｏｌ（Ｖ）ＤＴＨ応答はいずれか他の疾患を有する患者で見られるもののおよそ２倍であった。興味深いことに、University of Wisconsinで移植したＩＰＦの患者は、有意に低い１年移植片生存率（ｐ＝０．０５、
データは示されていない）、しかし同様の５年生存率及びＢＯＳ発生の比率を有していた（表１）。
【００８４】
肺移植後患者におけるコラーゲンに対する自己免疫の発生がＶ型コラーゲンに特異的であったかどうかを決定するため、８人の肺移植レシピエント及びグッドパスチャー症候群（ＩＶ型コラーゲン自己免疫）を有する５人の腎臓移植レシピエントに対し、ｃｏｌ（ＩＩ）、ｃｏｌ（ＩＶ）及びｃｏｌ（Ｖ）を使用してＤＴＨアッセイを実施した。図３、パネルＢに示したように、肺移植レシピエントはｃｏｌ（Ｖ）に応答したがｃｏｌ（ＩＶ）又はｃｏｌ（ＩＩ）には応答せず、一方、グッドパスチャー症候群を有する患者はｃｏｌ（Ｖ）又はｃｏｌ（ＩＩ）への応答なしに、ｃｏｌ（ＩＶ）に対し有意に高いＤＴＨ応答を有していた。
【００８５】
実施例３
Ｖ型コラーゲンに対する体液性又は抗体仲介免疫応答の検出のためのビーズアッセイ。このアッセイは、Ｖ型コラーゲン自己免疫応答を有する患者からの血清及び／又は肺洗浄液中に存在することができるＶ型コラーゲンに対する抗体を検出するであろう。Ｖ型コラーゲン−被覆ビーズならびに他の必要な試薬がこのアッセイのために提供される。末端利用者は、血清及び／又は肺洗浄液、及びアッセイを実行するためのＰＢＳのような通常の試薬（又はこれらの試薬はキット中に組み入れることが可能である）を提供することができる。簡単には、典型的なアッセイは以下のようである：
１）ストレプトアビジン被覆ビーズ（５μｍ、結合能１０〜２０μｇ／ｌｘ１０／７ビーズ（Polyscience, Warrington, PA ））を滅菌ＰＢＳで２回洗浄した。ビーズ（１ｘ１０／７）を４０μｇのヒトＶ型コラーゲンを含んだ１００μｌのＰＢＳに懸濁し、４℃で６０分インキュベートした。
【００８６】
２）ヒトコラーゲンＶ抗体に対する２０μｍのウサギ抗体（ビオテン）（Abeam, Cambridge,MA）を使用し、上記１と同一手順で陽性対照を発生させた。
【００８７】
３）各アッセイについて、１ｘ１０^６コンジュゲートビーズをＰＢＳ中で２回洗浄し、５０μｌの血清又は肺洗浄液を加えた１００μｌのＰＢＳ中でインキュベートした。室温で３０分インキュベート後、ビーズを１０％ＦＣＳ含有ＰＢＳで３回洗浄した。
【００８８】
４）ビーズを１００μｌの滅菌ＰＢＳ＋１０％ＦＢＳに懸濁し、室温で約３０分、二次抗体とインキュベートした。典型的には、Ｒ−ＰＥにコンジュゲートされた５μｌの抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した（Sigma, Saint Louis）。ビーズを１０％ＦＣＳ含有ＰＢＳ中で３回洗浄し、３００μｌのＰＢＳ／ＦＣＳ溶液に懸濁し、フローサイトメーターを使用して分析した。このアッセイの例の結果は図９に要約されている。
【００８９】
陽性対照については、既知の量の抗コラーゲン−Ｖ抗血清をビーズアッセイに加えた。図９の右側のパネルが図示しているように、抗コラーゲンＶ抗体の量の増加は、平均蛍光チャンネルの右への著しいシフトを生じる。それ故、この方法は患者の血清中に存在する異なった量の抗体を検出し得る。さらに図９を参照すると、左のパネルは健康なヒト対象から得られた血清サンプルと比較された４人の患者の血清からの抗コラーゲンＶ抗体の検出を図示している。トレースにより図示されているように、患者＃４５７からのサンプルは右への最も大きなシフトを示し、この患者が抗コラーゲンＶ抗体の最も高いレベルを有していることを示唆している。患者＃４５８及び４２０は小さなシフトを示し、患者＃４５７よりも低いレベルの抗体を示し、一方、患者５１９は、このアッセイで反応する何らの抗体も有していないようである。
【００９０】
図９に要約した結果により示されているように、患者４５７は右への最も大きなシフトを示し、この特定の患者が抗ｃｏｌ（Ｖ）抗体の最も高いレベルを有することを示唆している。対照的に、患者＃４５８及び＃４２０から集められたサンプルは蛍光ピークに小さなシフトを示し；一方、患者＃５９５はこの特定のサンプル中にいずれの抗体も少しも有していないようである。これらのデータは特発性肺疾患（ＩＰＤ）又は他の自己免疫に基づいた肺障害又は疾患を検出する、及び／又は肺移植を受けている所与の患者が移植された臓器を拒絶するであろう可能性を評価する方法を説明している。肺疾患を診断する、又はＢＯＳを発生する所与の患者の可能性を評価するこの方法は、一般には、患者から体液（例えば、血清又は間質液）又は組織を集めること、およびＶ型コラーゲンに対する抗体の存在についてサンプルを分析することを含む。
【００９１】
実施例４
試験動物における経口免疫寛容の誘導、コラーゲン又はコラーゲンの抗原性成分に対するヒト又は動物患者の自己免疫応答を変調するためのモデル。利用された病原体フリー、ＭＨＣ（ＲＴｌ）不適合雄ラットは：Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind.)又は
Taconic (Germantown, N.Y.) から購入され、施設のガイドラインに従ってIndiana University School of Medicine (Indianapolis, Ind.)のLaboratory Animal Resource Center に収容した、移植の時点で２５０〜３００ｇのFischer 344（Ｆ３４４、ＲＴｌ^ｌｖｌ
）、Brown Norway （ＢＮ、ＲＴｌ^ｎ）及び Wistar Kyoto（ＷＫＹ、ＲＴｌ^１）ラットであった。
【００９２】
簡単には、Ｖ型コラーゲンは以下のように調製した。精製したヒトＶ型コラーゲン［ｃｏｌ（Ｖ）］を０．００５Ｍ酢酸（０．５ｍｇ／ｍｌ）に希釈し、アッセイに使用されるまで４℃で貯蔵した。ｃｏｌ（Ｖ）の量は、サンプル中のヒドロキシプロリン含量の決定により評価した（Woessner, 1961）。
【００９３】
この特定の試験において、Ｖ型コラーゲンをＷＫＹ雄ラットに経口で投与した。動物（１８０〜２００ｇ）には、以前に記載されているように（Stark and Ostrow, 1990）、０
．５ｍｌの生理食塩水に溶解した１０μｇか又は５０μｇのｃｏｌ（Ｖ）、ｃｏｌ（ＩＩ）又はｃｏｌ（ＸＩ）溶液を、１６ゲージボールポイントステンレススチール動物摂取針（Braintree Scientific, Braintree, Mass.）を利用する胃経管栄養により摂取させた。対照として、同様の動物に希釈剤のみを摂取させた。８回又は４回摂取に対し、動物は一日おきに摂取させた。最後の摂取７日後、これらのラットは同所性移植によりＦ３４４肺同種移植片を受けた。ＷＫＹレシピエント内へ移植されたＷＫＹ肺移植片（同種移植片）を対照として使用した。
【００９４】
遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答は、Sayegh et al, 1992; Yoshino et al, 1995; 及び Yamagami et al, 1999 、に記載されている方法を改変して決定した。手短に言えば、肺移
植２週間後、対照又はｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットは、２６ゲージ注射針を使用する皮下（ｓ．ｃ．）注射により、右耳介内に、１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４又は第三者（ＢＮ）脾細胞の３０μｌ ＰＢＳ溶液を受けた。左耳介は等容積の希釈剤を受け、対照部位として働いた。無処置又は同種移植片レシピエントＷＫＹラットの別々の群が、１５μｇのｃｏｌ（Ｖ）を３０μｌ容量で右耳介内に、希釈剤を左耳介内に注射されて試験された。無処置ＷＫＹラットは陰性対照として使用した。耳の厚さは、注射直前及び２４時間後に盲検様式で、マイクロメーターカリパー（Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, 111.）で測定した。抗原特異的ＤＴＨ応答は以下の式に従って計算した：特異的耳介膨潤＝（右耳厚さ＠２４時間−右耳厚さ＠０時間）−（左耳厚さ＠２４時間−左耳厚さ＠０時間）ｘ１０^−３ｍｍ（Yamagami et al., 1999）。全てのデータは三回の
測定の平均として報告されている。
【００９５】
左肺同種移植片（ＷＫＹ→ＷＫＹ）又は 同種移植（Ｆ３４４→ＷＫＹ）の同所性移植は（Marck et al., 1983 and Prop et al., 1985）により最初に記載されている手順を利用し、既に報告されているように（Sekine et al., 1997）実施した。発明者の以前の報
告（Sekine et al., 1997）と同様に、全ての移植群において生存率は９０％を上回った
。実験期間の間、いずれの時点でも非免疫抑制療法は与えなかった。
【００９６】
移植肺は、移植後１日、６日及び１３日目に連続胸部Ｘ線検査によりモニターした。画像的変化は以下のように段階付けした：グレード１、正常；グレード２、軽度浸潤；グレード３、中程度浸潤；及びグレード４、重篤な浸潤又は完全不透明化。
【００９７】
５移植群を研究した：ＷＫＹラットからの肺をＷＫＹレシピエントに（ＷＫＹ→ＷＫＹ、対照同系移植片）；Ｆ３４４肺を希釈剤摂取ＷＫＹレシピエントに移植（Ｆ３４４→ＷＫＹ、対照同種移植片）；Ｆ３４４肺をｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹレシピエントに移植（Ｆ３４４→ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹ、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片）；Ｆ３４４肺をｃｏｌ（ＩＩ）摂取ＷＫＹレシピエントに移植（Ｆ３４４→ｃｏｌ（ＩＩ）摂取ＷＫＹ、ｃｏｌ（ＩＩ）摂取同種移植片）；並びにＦ３４４肺をｃｏｌ（ＸＩ）摂取ＷＫＹレシピエントに移植（Ｆ３４４→ｃｏｌ（ＸＩ）摂取ＷＫＹ、ｃｏｌ（ＸＩ）摂取同種移植片）。予備的実験は、無摂取ＷＫＹラット内に移植された同種移植片と比較して、同種移植病態の発生、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）示差的（differential）細胞計数又はＤＴＨ応答に何の影響も与えなかった。
【００９８】
ＢＡＬ液は、移植１週及び２週後のケタミン麻酔肺移植片レシピエントから集めた。簡単に言えば、自然の及び移植した肺のＢＡＬは、縫合により安全にされた１６ゲージカテーテルで、右及び左主気管支の選択的カニューレ挿入により実施した。体側気管支がクランプされている期間中、３ｍｌの滅菌ＰＢＳ（３７℃）を各主気管支内に点滴注入し、吸引した。遠心分離検体から得られた無細胞ＢＡＬ上清は、使用されるまで−７０℃で貯蔵した。ＢＡＬ液示差的細胞計数は、光学顕微鏡を利用してサイトスピン上の高倍率視野当たり３００細胞を計数し、サンプル中のマクロファージ、リンパ球及び多形核（ＰＭＮ）
細胞の量を決定することにより行った。
【００９９】
肺における病態の存在を検出するため、各群から移植肺を採取し、４％グルタルアルデヒドの気管内点滴注入により固定し、切片とし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、光学顕微鏡下で検査し、及び、移植群の予備知識無しに盲検的様式で、Lung Rejection Study Group（Yousem et al, 1996）により確立された組織学的基準に従って段階付けした。
【０１００】
ＢＡＬ液中のＰＭＮ及びリンパ球数の統計的分析は、最初にＡＮＯＶＡにより実行し、群間で差違が存在するかどうかを決定した。もし差違が観察されたら、Student-Newman-Keuls 検定を利用する事後解析を実行して、どの群が異なっているのかを決定した。Ｐ値
＜０．０５が有意であると決定された。対照同種移植におけるＤＴＨ及び異なった抗原が暴露された無処置ＷＫＹラットは正常に分布していないことが観察されたので、相互作用を有するrank-sum二方向ＡＮＯＶＡを利用し、群間の差違を決定した。Ｐ値＜０．０５が有意であると決定された。対照同種移植片及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片間の、ドナー同種抗原に対するＤＴＨ応答の相違はマンホイットニーＵ検定を利用して決定した。Ｐ値＜０．０５が有意であると決定された。気道及び脈管病理学的スコア間の相違は、最初にクラスカル・ワリス検定を利用して、続いてマンホイットニーＵ検定を利用する事後解析により決定した。Ｐ値＜０．０３が有意であると決定された。
【０１０１】
本発明者らは、ｃｏｌ（Ｖ）が、マウスにおける肺同種抗原に対する局所免疫応答の標的であることを以前に示した。次ぎに、彼らは肺同種移植片拒絶の間、ｃｏｌ（Ｖ）が抗原として認識されることを示した。ＤＴＨ応答は、肺以外の臓器移植の多様なげっ歯類モデルにおいて、拒絶の程度と相関すると報告されてきた（VanBuskirk et al, 1998; Lowry et al, 1985; Joo et al, 1995）。細胞性免疫応答のインビボ試験として、同種抗原への全身ＤＴＨ応答を実行した。Ｆ３４４肺同種移植片を受けて２週間後のＷＫＹラットにおける、及び無処置非移植ＷＫＹラットにおけるＦ３４４脾細胞、ｃｏｌ（Ｖ）及びＢＮ脾細胞（第三者）に対するＤＴＨ応答を試験した。図１０は、Ｆ３４４同種移植片を受けたＷＫＹラットは、Ｆ３４４脾細胞に対する有意なＤＴＨ応答［Ｆ３４４脾細胞か又はｃｏｌ（Ｖ）で試験された無処置ＷＫＹラットと比較してｐ＜０．０００１］を有していたことを図示している。Ｆ３４４同種移植片を受けたＷＫＹラットは、ｃｏｌ（Ｖ）に対する有意なＤＴＨ応答［Ｆ３４４脾細胞か又はｃｏｌ（Ｖ）で試験された無処置ＷＫＹラットと比較してｐ＜０．０００１］を有していたことを図示している；図１１。統計学的に、Ｆ３４４脾細胞及びｃｏｌ（Ｖ）に対する対照同種移植片のＤＴＨ応答間には差違はなかった（ｐ＞０．０５）。データは、Ｆ３４４同種移植片を受けたＷＫＹラットは第三者同種抗原（ＢＮ脾細胞、ＲＴ１^ｎ）へのＤＴＨ応答は有しておらず、Ｆ３４４同種移植片に対する免疫応答は同種特異的であることを示している。加えて、これらのデータは、肺同種移植片拒絶の間に抗原として認識されているｃｏｌ（Ｖ）と一致している。
【０１０２】
以前の報告は、肺以外の同種移植片の拒絶の間に免疫応答の標的である抗原の経口投与はドナー臓器に対する寛容を誘導することを示している（Ishido et al., 1999）。移植
に先だって肺移植片レシピエントへのｃｏｌ（Ｖ）の経口投与がドナー肺に対する免疫学的寛容性を誘導するかどうかを決定するため、ＷＫＹレシピエントに、上記のごとく移植に先だってｃｏｌ（Ｖ）を摂取させた。予備的実験では、１日おきに１０μｇのｃｏｌ（Ｖ）を８回摂取させ（８０μｇの総用量）、続いて最後の摂取から７日後の左同所性肺移植は、このモデルにおけるＢＡＬ細胞計数及び拒絶病態に最も大きな効果を有していた。それ故、この摂取計画を、すべての以下の研究で利用した。Ｃｏｌ（Ｖ）摂取レシピエントの左肺移植を行い、上記のように実験期間の完了時に採取した。
【０１０３】
図１２は、移植２週間後の対照ＷＫＹ同系移植片（ｉｓｏｇｒａｆｔ）レシピエント、
対照ＷＫＹ同種移植片（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）レシピエント及びｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹ同種移植片レシピエント及び正常ＷＫＹラットからのＢＡＬ液中の示差的細胞計数を図示している。同系移植片肺と比較して正常肺におけるＢＡＬ示差的細胞計数で差違はなかった。（Yagyu et al, 1990）と同様に、正常又は同系移植片肺と比較して、対照同種移植
片ＢＡＬにおいてはＰＭＮ及びリンパ球が有意に増加した（ＰＭＮについてｐ＜０．０３９、及びリンパ球についてｐ＜０．００００１）。対照的に、移植に先立ってｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることは、対照同種移植片と比較してＢＡＬ中のＰＭＮ及びリンパ球に有意な減少を生じた（ＰＭＮについてｐ＜０．０２３、及びリンパ球についてｐ＜０．００００１）。急性同種移植片拒絶は通常、同種移植片ＢＡＬ液中の総細胞数の増加に関係する（Hirt et al., 1999）。しかしながら、移植２週間後では、対照ＷＫＹ同種移植片肺は
重度の拒絶を通常受けており、移植片の破壊により、ＢＡＬ総細胞数を決定するための十分なＢＡＬは確実には実施することが不可能である。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントはより軽度の拒絶を示し、それはより容易なＢＡＬを可能にし、より高い細胞計数を生じる。これらの理由のため、群間の総細胞数の比較は行われなかった。まとめると、ｃｏｌ（Ｖ）による経口免疫は、急性拒絶間の同種移植片ＢＡＬ液におけるより少ないＰＭＮ及びリンパ球と関連することをこれらのデータは示している。
【０１０４】
ｃｏｌ（Ｖ）摂取が同種抗原に対するＤＴＨ応答を減少させるかどうかを決定するため、対照ＷＫＹ同種移植片レシピエント及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種ＷＫＹ移植片レシピエントは、右耳介に全同種抗原性（Ｆ３４４）脾細胞を及び左耳介にＰＢＳを暴露した。ＤＴＨ応答は２４時間後測定し、特異的耳介膨潤を決定した。図１０に示したように、無処置の対照同種ＷＫＹ移植片レシピエントは重度の急性拒絶を受け、ドナー抗原暴露後に強いＤＴＨ応答を有した。対照的に、より軽度の同種移植片拒絶を有していたｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹ移植片レシピエントは、ドナー抗原に対するＤＴＨ応答の有意な減少も有した。
【０１０５】
ｃｏｌ（Ｖ）により誘導された同種抗原に対する損なわれた免疫応答は、広範囲の免疫低応答性であり（Faria and Weiner 1999）、寛容ではない。それ故、ｃｏｌ（Ｖ）摂取
ＷＫＹラットが他の抗原に応答できるかどうかを決定するため、これらのラットは気管内（２００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ）か又は静脈内に（１〜５ｍｇ／ｋｇ）リポ多糖（ＬＰＳ）（Sigma, St. Louis, MO.）を受け、それらの用量は注射又は注入２４〜４８時間
後、肺及び全身的に重度の炎症反応を誘発することが知られている用量であった（Delclaux et al. 1999）。ラットはｃｏｌ（Ｖ）の最後の摂取から１週間後に暴露された。誘発された疾患は肺炎及びグラム陰性菌により起こされる敗血症に類似していた。正常ＷＫＹラットと同様に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラット内の肺内へのＬＰＳの点滴注入又はＩ．Ｖ．は重度の病気（波打つ毛皮及び虚脱）及びレシピエント肺の炎症を誘発した。これらのデータは、移植に先立ったｃｏｌ（Ｖ）の摂取は、ドナー抗原への広範囲の免疫低応答性ではなく、寛容性を誘導することにより同種移植片拒絶を防止したことを示している。
【０１０６】
まとめると、これらのデータは、ｃｏｌ（Ｖ）は広範囲の免疫低応答性ではなく、経口寛容性の誘導により肺同種移植片拒絶を下方調節するが、ｃｏｌ（ＩＩ）又はｃｏｌ（ＸＩ）はしない、ことを示している。さらに、ｃｏｌ（Ｖ）により誘導された経口免疫寛容性は、ドナー同種抗原に対するＤＴＨ応答を下方調節する。
【０１０７】
同種移植片ＢＡＬ液中の減少したＰＭＮ及びリンパ球数は、急性肺同種移植片拒絶間のそれほどひどくないＸ線検査及び組織学的病変と関連する。肺浸潤の進行する速度を決定するため、移植レシピエントを移植後１、６及び１３日目に連続胸部Ｘ線検査によりモニターし、上記のように段階付けした。対照同系移植片（ｉｓｏｇｒａｆｔ）は、全てのモニターした時点でいかなる肺浸潤も有していなかった（図１２Ａ）。対照同種移植片において、連続Ｘ線は移植６日目に左肺に浸潤の漸進的な発生を明らかにし、それは２週目の終わりまでに重篤な浸潤及び完全な不透明化を生じた（図１２Ｂ）。しかしながら、ｃｏ
ｌ（Ｖ）摂取同種移植片においては、浸潤の発生は対照と比較してより遅かった。Ｘ線は６日目では正常であり、移植２週間後に軽い浸潤のみが存在した（図１２Ｃ）。
【０１０８】
ここで図１３を参照すると、上段のパネルは、移植２週間後に採取した、自然の及び同系移植片ＷＫＹ肺、並びに対照同種移植及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植ラットからの自然の及び同種移植肺の肉眼的解剖学を示している。図１３ＡはＷＫＹラットレシピエントの同系移植片（左−Ｌ）及び自然肺（右−Ｒ）は外観が正常であることを示している。対照的に、対照同種移植片群の左同種移植肺は自然肺と比較して暗褐色の色、萎縮及び堅いコンシステンシーであった（図１３Ｂ）。炎症及び拒絶の結果、対照同種移植片においては体腔壁及び臓側胸膜の融合が通常観察された。ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントの移植された左肺（図１３Ｃ）は自然の（正常）又は同系移植片肺（図１３Ａ）の外観を有しており、胸膜癒着はなかった。
【０１０９】
同種移植片ＢＡＬ液におけるより少ないＰＭＮ及びリンパ球、胸部Ｘ線での同種移植片におけるあまりひどくない浸潤、及び保存された肉眼的解剖学は、移植に先立ってｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることは、拒絶病態の発生を下方調節することを示唆している。図１４の下段のパネルは、移植２週間後の対照同系移植片、対照同種移植片及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片の代表的な組織学を示している。以前の報告（Prop et al, 1985）と同様に、対照同系移植片肺は、拒絶の徴候がない正常組織学を有していた（図１４Ｄ）。対照同種移植片は、重度の急性拒絶と一致する広範な血管周囲、気管支周囲及び肺胞単核細胞浸潤を明らかにした（図１４Ｅ）。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片肺においては、軽度から中程度の血管周囲及び気管支周囲のみしか検出されなかった（図１４Ｆ）。
【０１１０】
図１５中の表３は標準判定基準を使用する移植２週間後での拒絶病態の段階付けを示している。急性血管拒絶は血管周囲単核細胞浸潤の存在及び程度に従って、Ａ０−Ａ４に段階付けされ、及び急性気道拒絶は気道炎症の程度及び強度に従ってＢ０−Ｂ４に段階付けた（Yousem et al. 1996）。全ての同系移植片対照肺は肺の正常構造が明らかにされた（Ａ０±０、Ｂ０±０）。対照ＷＫＹ同種移植片は重度の血管及び気道拒絶を有していた（それぞれＡ３．８±０．２、Ｂ４±０）。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹ同種移植は軽度から中程度の血管及び気道拒絶（それぞれＡ２．８±０．２、Ｂ２．６±０．２）を示した。ＣｏＩ（ＩＩ）及びｃｏｌ（ＸＩ）摂取同種移植片は、無処置の同種移植片と同様の拒絶病態を有していた（図１５）。これらのデータは、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹ同種移植片は、他の同種移植片よりも軽度の拒絶病態を有していた（Ａスコアについてはｐ＜０．０２８及びＢスコアについてはｐ＜０．００９）。
【０１１１】
これらのデータは、ｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることが、肺同種移植片拒絶を下方調節することを示しており、経口的に寛容化された肺移植片レシピエントは、ドナー同種抗原で再暴露後に減少したＤＴＨ応答を有すべきであることを示している。ｃｏｌ（Ｖ）摂取が同種抗原に対する免疫応答を減少させるかどうかを決定するため、対照同種移植片レシピエント及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントは、右耳介に全同種Ｆ３４４脾細胞及び左耳介にＰＢＳを暴露した。ＤＴＨ応答は２４時間後測定し、特異的耳介膨潤を決定した。図１４に示したように、無処置の対照同種移植片レシピエントは重度の急性拒絶を受け、ドナー抗原暴露後に強いＤＴＨ応答を有した（図１０に示された対照同種移植片と同一のデータ）。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントはドナー抗原に対する有意に軽減されたＤＴＨ応答を有していた（対照同種移植片と比較してｐ＜０．０２）。これらのデータは、移植に先立ってｃｏｌ（Ｖ）を摂取することは、ドナー抗原に対する寛容性を誘導することにより同種移植片拒絶を防止したことを示している。
【０１１２】
重度の拒絶反応（グレード４）の発病の時間である移植２週間後、同種移植片肺は示差的細胞計数の決定及び血清を採取するためＢＡＬを受けた。自然の及び移植肺を一括して
採取し、固定し、切片とし、染色し、及び標準判定基準（Yousem et al. 1996）を使用して拒絶病態について段階付けした。拒絶病態の全ての説明及び段階付けは肺病理学者であるOscar W. Cummings, M.D.により実施され、以前に報告されているように（Wilkes et al. 1998）、彼は処置群については知らされていない。図１４は、移植２週間後に採取さ
れた同系移植片ＷＫＹ肺、及び対照ＷＫＹ同種移植片及び ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹ同種移植片レシピエントからの自然の及び同種移植片肺の肉眼的解剖学を示している。対照ＷＫＹ同種移植片動物において、図１４Ｂは移植された（左）肺は自然の肺と比較して色が暗褐色で萎縮していた。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹ同種移植片レシピエントの移植された左肺（図１４Ｃ）は、自然の（正常）又は同系移植片肺（図１４Ａ）の外観を有していた。ｃｏｌ（ＩＩ）又はｃｏｌ（ＸＩ）を摂取させたＷＫＹラット中の同種移植片肺の全体の外観は無処置同種移植片肺と類似していた。予期されるように、同系移植片肺は正常のようにみえた（図１４Ａ）。
【０１１３】
図１４は、移植２週間後の対照ＷＫＹ同系移植片、対照ＷＫＹ同種移植片、及びｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹ同種移植片の組織学も図示している。ＷＫＹ同系移植片肺は正常な組織学を有していた（図１４Ｄ）。対照ＷＫＹ同種移植片は、重度の急性拒絶と一致する広範な血管周囲、気管支周囲及び肺胞単核細胞浸潤を明らかにした（図１１Ｅ）。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹ同種移植片肺においては、軽度から中程度の血管周囲及び気管支周囲のみしか検出されなかった（図１４Ｆ）。ＣｏＩ（ＩＩ）及びｃｏｌ（ＸＩ）を摂取させたＷＫＹラットの同種移植片肺は、無処置の同種移植片と同様の病態を有していた（図１５を参照されたい）。
【０１１４】
経口寛容が、肺以外の臓器におけるアロ反応性の下方調節に有益である（Ishido et al., 1999）と示されていたけれども、肺移植における経口寛容は、２００２年９月１３日
に出願されたWilkes による米国特許出願番号10/243,797 で最初に報告された。肺移植のラットモデルを利用し、本発明のデータは、肺移植に先立った肺同種移植片レシピエントへのｃｏｌ（Ｖ）の経口投与が拒絶反応を下方調節することを示している。対照同種移植片レシピエントと比較されたｃｏｌ（Ｖ）摂取の免疫学的、放射線学的及び組織学的分析は、ｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることが、同種移植片ＢＡＬ液中の減少したＰＭＮ及びリンパ球数、胸部Ｘ線での同種移植片におけるあまりひどくない浸潤、及び同種移植片の肉眼的解剖学での保存、及び拒絶病態の減少と相関していることを示した。最後に、経口的に寛容化された同種移植片レシピエントは、ドナー同種抗原に対するＤＴＨ応答を減少させた。
【０１１５】
以前に、マウスにおいてはｃｏｌ（Ｖ）が同種抗原に対する局所免疫応答の標的であることが示されている。Ｖ型コラーゲンは肺に存在するマイナーな型のコラーゲンであり、細気管支周囲結合組織、肺胞間質及び毛細血管基底膜に位置する。これらの組織は本発明者のマウスモデルにおいて同種抗原に応答する病理学的病変の部位であることが示されており（Wilkes et al., 1999）、ヒト肺同種移植片レシピエントにおける拒絶活性の部位
である（Trulock, 1997）。
【０１１６】
抗原の経口投与は末梢性Ｔ細胞寛容を誘導する有効な方法である。この現象はしばしば経口寛容と称され：脳脊髄炎、ぶどう膜炎、糖尿病、重症筋無力症及び関節炎を含む動物における自己免疫疾患の多様なモデルでよく研究されている。しかしながら、寛容を誘導する機構は完全には理解されていない。クローンアネルギー、クローン除去を含む寛容誘導についての全ての既知の機構、ＩＬ−４、ＩＬ−１０又はＴＧＦ−β仲介能動抑制による調節が経口寛容に役割を有することができる（Faria and Weiner, 1999）。一般に、抗原のより高い用量がアネルギー又はクローン除去を誘導すると報告されており（Chen et al., 1995; Whitacre et al., 1991）、一方、低用量はサイトカイン調節及び能動抑制を誘導する（Faria and Weiner, 1999; Chen et al., 1994）。心臓移植の動物モデルにお
いて、同種間脾細胞の経口投与は、ＴＨ１活性化をバイパスすること、及びＩＬ−４のようなＴｈ−２由来阻害性サイトカインの選択的刺激誘導により寛容誘導に有効であることが示されている（Ishido et al., 1999）。
【０１１７】
近交系、病原体フリー、ＭＨＣ（ＲＴｌ）不適合雄Ｆ３４４（ＲＴｌ^ｌｖｌ）及びＷＫＹ （ＲＴｌ^１）ラット（２５０〜３００ｇ）を移植手術に利用した。すべてのラットはHarlan Sprague Dawley(Indianapolis, Ind.) から購入した。左肺同種移植片の同所性移植は既に報告されたように実行し（Sekine et al. 1997）、Marck及び共同研究者（1983
）により記述された手順を利用した。ラットはいずれの免疫抑制も受けなかった。拒絶病態は移植後の種々の時点で段階付けした。Ｆ３４４→ＷＫＹ移植モデルは、移植後第一週の終わりまでに軽度急性拒絶（グレード１）、第二週の終わりまでに中程度から重度の拒絶（グレード２−３）及び第三週の終わりまでに重度−グレード４拒絶の発生が付随した（Matsumura et al. 1995）。加えて、Ｆ３４４→ＷＫＹモデルは、再現性よく閉塞性細
気管支炎（ＢＯ）を発生する、ただ一つの肺移植の動物モデルである（Hirt et al. 1999）。それ故、このモデルは、急性及び慢性拒絶の病因を研究する独特の機会を提供する。
【０１１８】
経口寛容の誘導における相違を観察するため、異なった摂取計画を試験した。データはより高いｃｏｌ（Ｖ）の用量（５０μｇ）と比較して、より低い用量（１０μｇ）の多数回の摂取は、拒絶病状発生がより抑制的であった。それ故、本明細書で使用した経口寛容のモデルにおいて、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０）による調節、又はＴＧＦ−βにより仲介される活性化された抑制も、寛容誘導において重要な役割を果たしているように思われる。
【０１１９】
移植寛容の誘導は移植研究の主たるゴールになってきており、長年にわたって異なった技術が移植寛容を誘導するために利用されてきた。ドナー特異的輸血（Zheng et al., 1999）、骨髄移植（Huang et al., 2000）、同種細胞の胸腺注入（Garrovillo et al., 1999）又はドナーＭＨＣ由来ペプチドによる全身免疫（Sayegh and Krensky, 1996）は多様
な動物モデルにおいて移植寛容を誘導することが示されている。しかしながら、これらの技術は、寛容誘導に利用されるドナー細胞が移植に先立って寛容を誘導する十分な時間内には利用できないであろうという事実のため、潜在肺移植片レシピエントでは限定的な実用性しか有していないであろう。低用量経口寛容の実験自己免疫モデルにおいて、経口寛容化後の調節細胞は、抗原特異的様式で引き金が引かれるが、抗原非特異的様式で抑制する。それ故、標的自己抗原それ自身を同定する必要はないであろうが、抑制性サイトカインを分泌する調節細胞を誘導することが可能なタンパク質が十分に経口的に投与されるであろう（Faria and Weiner, 1999）。本明細書で使用した肺移植における経口寛容のモデルは、経口的に投与された、ドナー特異的ではないｃｏｌ（Ｖ）はアロ反応性を抑制し、及び移植寛容を誘導することができる。発明者は、移植に先立ったｃｏｌ（Ｖ）による移植片レシピエントの経口治療が、肺移植における拒絶を防止するための、及びＶ型コラーゲン及び／又はそれらの抗原性成分に対する自己免疫反応により引き起こされることが知られている又は考えられている疾患を治療するための療法を提供するであろうことを想定する。図及びそこに引用されている参照文献を含む、実施例４から１０に報告された結果の追加の議論については、その全体が本明細書において援用される、Wilkes により２０
０２年９月１３日に出願された米国特許出願10/243,792 （現在米国特許公開番号2003/0078208 Al ）を参照されたい。
【０１２０】
実施例５
同種移植片拒絶の防止、及びコラーゲン及びコラーゲン様分子に対して動物を寛容化するために有用な追加のＭＨＣ「様」ペプチド及びコラーゲンの評価
病原体フリー、ＭＨＣ（ＲＴｌ）不適合雄ラットを本研究で利用した：Wistar Kyoto （ＷＫＹ、ＲＴ１^ｌ）、Fischer ３４４（Ｆ３４４、ＲＴ１^ｌｖｌ）及びBrown Norway
（ＢＮ、ＲＴ１^ｎ）ラット（移植の時点で２５０〜３００ｇ）。全てのラットはHarlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind.）から購入し、施設のガイドラインに従ってUniversity School of MedicineのLaboratory Animal Resource Center Indiana (Indianapolis,
Ind.）に収容した。
【０１２１】
実験で使用するためのＩＩ型コラーゲン［ｃｏｌ（ＩＩ）］は、以前に報告されているように（Maves et al. 2000）イヌ軟骨から単離されたか、又は Collaborative Biomedical Products, Bedford, Massから購入した。両調製物は０．００５Ｍ酢酸で可溶化し、
透析すると０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度を得た。
【０１２２】
ウシ胎児軟骨からのウシＸＩ型コラーゲン［ｃｏｌ（ＸＩ）］(Morris and Bachinger 1987) はBiogenesis, Sandown, N.H．から購入し、０．００５Ｍ酢酸（０．５ｍｇ／ｍｌ）で希釈し、使用されるまで４℃で貯蔵した。
【０１２３】
ヒト胎盤から抽出し、示差ＮａＣｌ沈殿（Mares et al. 2000）により精製されたヒト
Ｖ型コラーゲン［ｃｏｌ（Ｖ）］は、Dr. Jerome Seyer (VA Hospital, Hampton, Va.）
から贈与された。手短に言えば、胎盤組織を細かく切り、洗浄し、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する０．５Ｍ酢酸に懸濁し、そして４℃でペプシンにより消化した。上清を遠心した検体から吸引し、ペレットを集め、そして抽出過程を反復した。２つの消化物からの上清を合わせ、そして０．５Ｍ酢酸からの示差ＮａＣｌ沈殿（Maves et al. 2000）により、
上清からｃｏｌ（Ｖ）を精製した。使用するまで、無傷のｃｏｌ（Ｖ）は０．００５Ｍ酢酸（０．５ｍｇ／ｍｌ）に希釈した。コラーゲンの量は、既に報告されているように（Mares et al. 2000）、サンプル中のヒドロキシプロリン含量の決定により評価した。
【０１２４】
上記のように調製したコラーゲンはＷＫＹラットに経口で投与した。ラットには、０．５ｍｌの生理食塩水に溶解した１０μｇのｃｏｌ（ＩＩ）、ｃｏｌ（Ｖ）又はｃｏｌ（ＸＩ）溶液を、１６ゲージボールポイントステンレススチール動物摂取針（Braintree Scientific, Braintree, Mass.）を利用する胃経管栄養により摂取させた。対照動物には希釈剤のみを摂取させた。８回摂取に対し、動物は一日おきに摂取させた。最後の摂取７日後、これらのラットは肺同種移植片のレシピエントとして利用した（以下に記載）。
【０１２５】
左肺同系移植片（ＷＫＹ→ＷＫＹ）又は同種移植片（Ｆ３４４→ＷＫＹ）の同所性移植は、以前に記載されている手順（Prop et al. 1985）を利用し、以前に報告されているように実施した（Sekine et al. 1997）。手短に言えば、ドナーラット（Ｆ３４４又はＷＫＹ）をケタミン（４０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｍ．注射で麻酔した後、胸部を剃髪し、胸骨切開術を行い、心臓及び肺を一括して除去した。左肺を次ぎに切除し、ヘパリン処置したラクトリンゲル液を肺動脈中に注入した。ドナー肺を生理食塩水で飽和した滅菌ガーゼでラップし、移植するまで無菌ビーカー中の氷上（４℃）に置いた。
【０１２６】
レシピエントラットをアトロピン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）のｓ．ｃ．注射、続いての２％ハロタンの吸入で麻酔した。気道に１４−ゲージテフロンカテーテルでカニューレ挿入し、ラットは１００％酸素を利用するげっ歯類ベンチレーター（Analytical Specialties
Co., St. Louis, Mo.）を使用して機械的に換気し、麻酔維持のため１．５〜２％イソフルレンを吸入させた。左４肋間腔の開胸術を行ったら、左肺血管及び気管支に止血剤を置き、左肺を切除した。プラスチックカフ及び７−０絹縫合糸（Kono, Chiba, Japan）により、ドナー肺の肺血管をレシピエントに吻合した。ドナー及びレシピエント気管支を、８−０ Prolene 縫合糸（Ethicon, Sommerville, N. J.）を利用してお互いに縫合した。
気管支の吻合終了後直ちに止血剤を除去し、換気を回復させた。３−０絹縫合糸（Ethicon）を利用して１６ゲージ胸腔チューブ上で左開胸切開を閉じた後、麻酔維持を中断し、
動物を回復させた。自発呼吸が再開したら、カニューレを気道から除去し、胸腔チューブをはずした。ドナー肺の虚血時間はおよそ１時間であり、及びドナー肺を摘出する及び移植するための総手術時間はおよそ２時間であった。すべての移植手順は無菌状態の中、手術用顕微鏡（Micro Tech, colorado Springs, CO.）下でＫ．Ｙ．により実施された。Ｆ
３４４→ＷＫＹ移植モデルには、第１週目の終わりまでの軽度の急性拒絶、及び第二週目の終わりまでの中程度から重度の急性拒絶の発生が付随している（Matsumura et al. 1995）。 全ての移植群において生存率は９０％を上回った。実験期間の間、いずれの時点
でも非免疫抑制療法は与えなかった。
【０１２７】
移植肺は、移植後１日、６日及び１３日目に連続胸部Ｘ線検査によりモニターした。画像的変化は以下のように段階付けした：グレード１、正常；グレード２、軽度浸潤；グレード３、中程度浸潤；及びグレード４、重篤な浸潤又は完全不透明化。
【０１２８】
５移植群を研究した：ＷＫＹレシピエント内に移植されたＷＫＹラットラットからの肺［対照同系移植片］；希釈剤摂取ＷＫＹレシピエント内に移植されたＦ３４４肺［対照同種移植片］；ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹレシピエント内に移植されたＦ３４４肺［ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片］；ｃｏｌ（ＩＩ）摂取ＷＫＹレシピエント内に移植されたＦ３４４肺［ｃｏｌ（ＩＩ）摂取同種移植片］；及びｃｏｌ（ＸＩ）摂取ＷＫＹレシピエント内に移植されたＦ３４４肺［ｃｏｌ（ＸＩ）摂取同種移植片］。
【０１２９】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液は、以前に報告されているように（Sekine et al. 1997）、移植２週間後のケタミン麻酔下の肺移植レシピエントから集めた。手短に言えば、自然の及び移植した肺のＢＡＬは、縫合により安全にされた１６ゲージカテーテルで、右及び左主気管支の選択的カニューレ挿入により実施した。体側気管支がクランプされている間にサンプルを集め、３ｍｌの滅菌ＰＢＳ（３７℃）を各主気管支内に点滴注入し、吸引した。遠心分離検体から得られた無細胞ＢＡＬ上清は、使用されるまで−７０℃で貯蔵した。ＢＡＬ液示差的細胞計数は、光学顕微鏡を利用してサイトスピン上の高倍率視野当たり３００細胞を計数し、サンプル中のマクロファージ、リンパ球及び多形核（ＰＭＮ）細胞の量を決定することにより行った。
【０１３０】
遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答は、（Yamagami et al, 1999 ）に記載されている方法を
改変して決定した。手短に言えば、肺移植２週間後、対照又はｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットは、２６ゲージ注射針を使用するｓ．ｃ．注射により、右耳介内に、１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４又は第三者（ＢＮ）脾細胞の３０μｌ ＰＢＳ溶液を受けた。左耳介は等容積の希釈剤を受け、対照部位として働いた。無処置又は同種移植片レシピエントＷＫＹラットの別々の群が、１５μｇのｃｏｌ（ＩＩ）、ｃｏｌ（Ｖ）又はｃｏｌ（ＸＩ）を３０μｌ容量で右耳介内に、希釈剤を左耳介内に注射されて試験された。耳の厚さは、注射直前及び２４時間後に盲検様式で、マイクロメーターカリパー（Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, 111.）で測定した。抗原特異的ＤＴＨ応答は以下の式に従って計算した：特異的耳介膨潤＝（右耳厚さ＠２４時間−右耳厚さ＠０時間）−（左耳厚さ＠２４時間−左耳厚さ＠０時間）ｘ１０^−３ｍｍ（Yamagami et al., 1999）。全
てのデータは三回の測定の平均として報告されている。
【０１３１】
別の実験において、無処置及びｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットを、１００μｌのアジュバントの懸濁液（Titermax, CytRx Corp., Norcross, Ga.）に溶解した１００μｇの低エンドトキシン ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Sigma, St. Louis）で刺激した。各ラットは尾の基部への懸濁液のｓ．ｃ．で刺激した。７日後、右耳介内へ２％熱凝集ＢＳＡ溶液及び左耳介内へ希釈剤を接種した（Henningsen et al. 1984）。非刺激ラットがこれらの研究の対照であった。耳厚を注射直前及び２４時間後に測定し、特異的耳膨潤を上記のように計算した。
【０１３２】
ＤＴＨ部位でのＴＧＦ−βの中和は、（Bickerstaff et al. 2000）により記載されて
いる手順を改変して実施した。手短に言えば、肺移植２週間後、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットは、５μｇのポリクローナルニワトリ抗ラットＴＧＦ−β Ａｂ又は５μｇのポリクローナルヤギ抗ラットＩＬ−４又はＩＬ−１０Ａｂ（すべてR&D Systems, Minneapolis, Minn.）と混合された１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４脾細胞の３０μ
ｌ ＰＢＳ溶液を、２６ゲージ注射針を使用したｓ．ｃ．注射で右耳介内に受けた。左耳介は等容積の希釈剤を受け、対照部位として働いた。陰性対照のため、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片の別の群が、５μｇの対照ニワトリトリ免疫グロブリン又は対照ヤギ免疫グロブリン（R&D Systems, Minneapolis, Minn.）と混合された１０^７照射（３０００ラド）
ドナー由来Ｆ３４４脾細胞を右耳介内に、及び希釈剤を左耳介内に受けた。特異的耳膨潤は上記のように計算した。対照免疫グロブリンはＤＴＨ応答に何の影響も与えなかった。
【０１３３】
急性肺損傷のモデルとして、リポ多糖（ＬＰＳ）（Sigma, St. Louis, MO）の肺胞又は静脈内点滴注入を、（O'Learye wheat t al. 1997）により記載されている手順を改変し
て実施した。手短に言えば、最後の給餌一週間後、正常ＷＫＹラット又はｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットをアトロピン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）のｓ．ｃ．注射、続いての２％ハロタンの吸入で麻酔した。気道に１４−ゲージテフロンカテーテルでカニューレ挿入し、ラットは１００％酸素を利用するげっ歯類ベンチレーター（Analytical Specialties Co., St. Louis, Mo.）を使用して機械的に換気し、麻酔維持のため１．５〜２％イソフルレンを吸入させた。自発呼吸の消失後、ＬＰＳ（１ｍｇ／ｍｌで１ｍｇ／ｋｇ）を気道内に点滴注入し、１０分間機械的に換気した。麻酔維持を中断し、動物を蘇生させた。自発呼吸が再開したら、カニューレを気道から除去した。別の実験において、ラットはＬＰＳ（１ｍｇ／ｍｌで４ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈内に静脈内注射された。暴露２４時間後、ＢＡＬを実施し、肺を病理学の評価のために摘出した。
【０１３４】
実験群の血清中ＴＧＦ−βレベルは、製造元のプロトコールに従ったＴＧＦ−β_１免疫アッセイシステム（Promega, Madison, Wis.）を利用するＥＬＩＳＡにより定量した。血清中ＩＬ−４及びＩＬ−１０レベルは、製造元のプロトコールに従ったCytoscreen 免疫
アッセイキット（BioSource International, Camarillo, Calif.）を利用するＥＬＩＳＡにより定量した。ＴＧＦ−β、ＩＬ−４及びＩＬ−１０アッセイの感度はそれぞれ３２、２及び５ｐｇ／ｍｌであった。
【０１３５】
病理学は、各群からの自然及び移植肺を試験することにより評価した。肺サンプルを摘出し、固定し、切片化し、染色し、及び標準的判断基準（Yousem et al. 1996）を使用し、以前に報告されているように（Sekine et al. 1997）移植群の予備知識なしの盲検的様式で、病理学者（O. W. C.）により段階付けされた。
【０１３６】
ＢＡＬ液中のＰＭＮ及びリンパ球数の統計的分析は、最初にＡＮＯＶＡにより実行し、群間で差違が存在するかどうかを決定した。もし差違が観察されたら、Student-Newman-Keuls 検定を利用する事後解析を実行して、どの群が異なっているのかを決定した。Ｐ値
＜０．０５が有意であると決定された。対照同種移植におけるＤＴＨ及び異なった抗原が暴露された無処置ＷＫＹラットは正常に分布していないことが観察されたので、相互作用を有するrank-sum二方向ＡＮＯＶＡを利用し、群間の差違を決定した。Ｐ値＜０．０５が有意であると決定された。対照同種移植片及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片間の、ドナー同種抗原に対するＤＴＨ応答の相違はマンホイットニーＵ検定を利用して決定した。Ｐ値＜０．０５が有意であると決定された。気道及び脈管病理学的スコア間の相違は、最初にクラスカル・ワリス検定を利用して、続いてマンホイットニーＵ検定を利用する事後解析により決定した。Ｐ値＜０．０３が有意であると決定された。サイトカインの解析のためには、複数の比較のためのスチューデントｔ検定を利用した。Ｐ値＜０．０５が有意であ
ると決定された。
【０１３７】
細胞性免疫応答のインビボ試験である、ドナー抗原に対するＤＴＨ応答は、肺以外の臓器移植の多様なげっ歯類モデルにおいて、拒絶の程度と相関すると報告されてきた（VanBuskirk et al, 1998; Lowry et al, 1985）。本発明者らは、ｃｏｌ（Ｖ）が、マウスに
おける肺同種抗原に対する局所免疫応答の標的であることを以前に示した（Mares et al.
2000）。それ故、ｃｏｌ（Ｖ）が肺同種移植片拒絶の間に抗原として認識されるかどう
かを決定するため、無処置ラット及び肺同種移植片レシピエントにおいて、全身性ＤＴＨが同種抗原に応答することが決定された。肺同種移植片レシピエントがｃｏｌ（Ｖ）に対するＤＴＨ応答を発生するかどうかも決定された。Ｆ３４４（ドナー）脾細胞及びｃｏｌ（Ｖ）に対するＤＴＨ応答は、Ｆ３４４肺同種移植片を受けて２週間後（重度の急性拒絶が発生し始める時点（Matsumura et al. 1995））のＷＫＹラット及び無処置、非移植Ｗ
ＫＹラットにおいて試験した。同種抗原及びｃｏｌ（Ｖ）に対するＤＴＨ応答の特異性を決定するため、ｃｏｌ（ＩＩ）、ｃｏｌ（ＸＩ）及び第三者抗原、ＢＮ脾細胞に対するＤＴＨ応答を決定した。関節軟骨の主要成分であるＣｏＩ（ＩＩ）は肺には存在せず、及びｃｏｌ（Ｖ）とは相同的ではない（Smith et al. 1985）。対照的に、ｃｏｌ（ＸＩ）は
ｃｏｌ（Ｖ）と相同性を有するが（Morris and Bachinger 1987）、ｃｏｌ（ＩＩ）と同
様に、関節軟骨に観察され、及び肺には存在しない。これらの理由のため、ｃｏｌ（ＩＩ）及びｃｏｌ（ＸＩ）はｃｏｌ（Ｖ）の対照として働く。
【０１３８】
ＤＴＨ応答の尺度として特異的耳膨潤を利用し、図１０は、対照同種移植片レシピエントが移植２週間後にＦ３４４脾細胞及びｃｏｌ（Ｖ）に対する有意なＤＴＨ応答を発生したことを示している［Ｆ３４４脾細胞又はｃｏｌ（Ｖ）を暴露した無処置ＷＫＹラットと比較して^†Ｐ＜０．０００１、及びｃｏｌ（Ｖ）又はＦ３４４脾細胞を暴露した無処置ＷＫＹラットと比較して^†Ｐ＜０．０００１］（図１０）。対照的に、対照同種移植片は第三者（ＢＮ）抗原、ｃｏｌ（ＩＩ）又はｃｏｌ（ＸＩ）に対するＤＴＨ応答を有していなかった（図８）。無処置ＷＫＹラットはｃｏｌ（ＩＩ）又はｃｏｌ（ＸＩ）に対するＤＴＨ応答を有していなかった。これらのデータは、ＤＴＨ応答が同種移植片拒絶間の免疫活性化を示し、それはドナーに特異的ではあるが第三者同種抗原には特異的ではないことを示している他の研究（VanBuskirk et al. 1998）を裏付けている。加えて、ｃｏｌ（Ｖ）が肺同種抗原に対する免疫応答の標的である（しかしｃｏｌ（ＩＩ）又はｃｏｌ（ＸＩ）は標的ではない）という本発明者のマウスでの結果（Mares et al. 2000）を裏付けてい
る。
【０１３９】
以前の報告は、肺以外の同種移植片の拒絶の間に免疫応答の標的である抗原の経口投与は、ドナー臓器に対する寛容性を誘導することを示した（Ishido et al. 1999）。移植に先立っての、肺同種移植片レシピエントへのコラーゲンの経口投与がドナー肺に対する免疫学的寛容性を誘導するかどうかを決定するため、上記のように移植に先立ってＷＫＹレシピエントにｃｏｌ（ＩＩ）、ｃｏｌ（Ｖ）又はｃｏｌ（ＸＩ）を摂取させ、続いて連続胸部Ｘ線、同種移植片ＢＡＬ示差的細胞計数、病理学的段階付け及びドナー抗原に対するＤＴＨ応答を評価した。
【０１４０】
図１２は、重度の急性拒絶が発生し始める時点（Matsumura et al. 1995）である移植
２週間後の実験群、及び正常ＷＫＹラットにおける、ＢＡＬ液中の示差的細胞計数を示している。同系移植片肺と比較した正常においては、ＢＡＬ示差的細胞計数に差違はなかった。以前の報告（Prop et al. 1985; Yagyu et al. 1990）と同様に、正常又は同系移植
片肺と比較して、対照同種移植片ＢＡＬにおいてはＰＭＮ及びリンパ球が有意に増加した（正常又は同系移植片肺と比較してリンパ球について^＊ｐ＜０．００００１、及びＰＭＮについて^†ｐ＜０．０３８）（図１２）。対照的に、移植に先立ってｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることは、対照同種移植片と比較してＢＡＬ中のＰＭＮ及びリンパ球に有意な減少を
生じた（対照同種移植片と比較してリンパ球について^‡ｐ＜０．０００１、及びＰＭＮについて^§ｐ＜０．０２３）（図１２）。
【０１４１】
急性同種移植片拒絶は通常、同種移植片ＢＡＬ液中の総細胞数の増加に関係する（Matsumura et al. 1995）。しかしながら、移植２週間後では、対照ＷＫＹ同種移植片肺は重
度の拒絶を通常受けており、移植片の破壊により、ＢＡＬ総細胞数を決定するための十分なＢＡＬは確実には実施することが不可能である。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントはより軽度の拒絶を示し、それはより容易なＢＡＬを可能にし、より高い細胞計数を生じる。これらの理由のため、群間の総細胞数の比較は行われなかった。まとめると、ｃｏｌ（Ｖ）による経口免疫は、急性拒絶間の同種移植片ＢＡＬ液におけるより少ないＰＭＮ及びリンパ球と関連することをこれらのデータは示している。
【０１４２】
急性肺同種移植片拒絶において、同種移植片ＢＡＬ液中の減少したＰＭＮ及びリンパ球数は、それほどひどくないＸ線検査及び組織学的病変と通常関連する。肺浸潤の進行する速度を決定するため、移植レシピエントを移植後１、６及び１３日目に連続胸部Ｘ線検査によりモニターし、上記のように段階付けした。図１３に示したように、対照同系移植片は、全てのモニターした時点でいかなる肺浸潤も有していなかった（グレード１）（図１３Ａ）。対照同種移植片において、連続Ｘ線は移植６日目に左肺に軽度の浸潤（グレード２）の漸進的な発生を明らかにし（データは示されていない）、それは２週目の終わりまでに重篤な浸潤及び完全な不透明化（グレード４）を生じた（図１３Ｂ）。しかしながら、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片においては、浸潤の発生は対照と比較してより遅かった。Ｘ線は６日目では正常（グレード１）であり、移植２週間後に軽い浸潤（グレード２）のみが存在した（図１３Ｃ）。
【０１４３】
図１４の上段のパネルは、移植２週間後に摘出した、自然の及び同種移植片ＷＫＹ肺、及び対照同種移植及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植ラットからの自然の及び同種移植肺の肉眼的解剖学を示している。同系移植片（左−Ｌ）及び自然肺（右−Ｒ）は外観が正常であった（図１４Ａ）。対照同種移植片レシピエント中の移植肺は、自然肺と比較して暗褐色の色、萎縮していた（図１４Ｂ）。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントの移植された左肺（図１４Ｃ）は自然の（正常）又は同系移植片肺（図１４Ａ）の外観を有していた。
【０１４４】
同種移植片ＢＡＬ液におけるより少ないＰＭＮ及びリンパ球、胸部Ｘ線での同種移植片におけるあまりひどくない浸潤、及び保存された肉眼的解剖学は、移植に先立ってｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることは、拒絶病態の発生を下方調節することを示唆している。図１４の下段のパネルは、移植２週間後の対照同系移植片、対照同種移植片及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片の代表的な組織学を示している。全ての対照同系移植片肺は、拒絶の徴候がない正常組織学を有していた（図１４Ｄ）。対照同種移植片は、重度の急性拒絶と一致する広範な血管周囲、気管支周囲及び肺胞単核細胞浸潤を明らかにした（図１４Ｅ）。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片肺においては、軽度から中程度の血管周囲及び気管支周囲のみしか検出されなかった（図１４Ｆ）。
【０１４５】
図１５のデータは移植２週間後での拒絶病態の段階付けを示している。急性拒絶は血管周囲単核細胞浸潤の存在及び程度に従って、Ａ０−Ａ４に段階付けされ、及び気道炎症の程度及び強度に従ってＢ０−Ｂ４に段階付けた（Yousem et al. 1996）。全ての同系移植片対照肺は肺の正常構造が明らかにされた（Ａ０±０、Ｂ０±０）。対照同種移植片は重度の血管及び気道拒絶を有していた（それぞれＡ３．８±０．２、Ｂ４±０）。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片は軽度から中程度の血管及び気道拒絶（それぞれＡ２．８±０．２、Ｂ２．６±０．２）（対照同種移植片と比較してＡスコアについては^＊ｐ＜０．０２８及びＢスコアについては^†ｐ＜０．００９）（図１５、表３）を示した。実験は
、ｃｏＩ（ＩＩ）及びｃｏｌ（ＸＩ）の摂取が対照同種移植片と比較して同種移植片病態の発生に効果がないことを示している（図１５、表３）。これらのデータは、ｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることは急性拒絶病態を下方調節することを示している。
【０１４６】
ｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることが、肺同種移植片拒絶を下方調節することを示しているデータは、経口的に寛容化された肺移植片レシピエントが、ドナー同種抗原に対する減少したＤＴＨ応答を有すべきであることを示している。ｃｏｌ（Ｖ）摂取が同種抗原に対する免疫応答を減少させるかどうかを決定するため、対照同種移植片レシピエント及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントは、右耳介に全同種Ｆ３４４脾細胞及び左耳介にＰＢＳを暴露し、ＤＴＨ応答を決定した。図１６に示したように、及び図１０で前に示したように、無処置の対照同種移植片レシピエントは、ドナー抗原暴露後に強いＤＴＨ応答を有した。対照的に、対照同種移植片レシピエントと比較してｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントにおいては、ドナー抗原に対するＤＴＨ応答は有意に軽減されていた（対照同種移植片と比較して^＊ｐ＜０．０２）（図１６）。
【０１４７】
ｃｏｌ（Ｖ）により誘導された同種抗原に対する損なわれた免疫応答は、広範囲の免疫低応答性であり（Faria and Weiner 1999）、免疫寛容ではない。それ故、ｃｏｌ（Ｖ）
摂取ＷＫＹラットが他の抗原に応答できるかどうかを決定するため、これらのラットは気管内（１ｍｇ／ｋｇ）か又は静脈内に（４ｍｇ／ｋｇ）ＬＰＳを受け、それらの用量は暴露２４時間後に、肺及び全身的に重度の炎症反応を誘発することが知られている用量であった（O’Leary et al. 1997）。誘発された疾患は肺炎及びグラム陰性菌により起こされる敗血症に類似していた。正常ＷＫＹラットと同様に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラット内の肺内へのＬＰＳの点滴注入又はｉ．ｖ．注射はＢＡＬ示差的細胞計数及び病態に観察されるような重度の病気（波打つ毛皮及び虚脱）及びＰＭＮ及びリンパ球の大量の流入を誘発した（データは示されていない）。
【０１４８】
ｃｏｌ（Ｖ）摂取により誘導された損なわれた免疫応答が抗原特異的であったかどうかをさらに調べるため、ｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることが非相関微量抗原、ＢＳＡ、ラットにおけるＴリンパ球依存性抗原（Henningsen et al. 1984）に対するＤＴＨ応答に影響するかどうかを決定した。無処置及びｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットを、１００μｌのアジュバントに溶解した１００μｇのＢＳＡで刺激し、７日後、右耳介内へ２％熱凝集ＢＳＡ溶液及び左耳介内へ希釈剤を接種した。非刺激ラットがこれらの研究の対照であった。図２４に示したように、非刺激ラットの耳介内へのＢＳＡの注射は有意な耳膨潤を誘発しなかった。対照的に、無摂取刺激ＷＫＹラット内にＢＳＡを注射すると、有意な耳膨潤を誘発した（無刺激無処置ＷＫＹラットと比較して^＊ｐ＜０．０１８）（図１９）。しかしながら、ｃｏｌ（Ｖ）摂取はＢＳＡに対するＤＴＨ応答に影響しなかった（刺激ＷＫＹラットと比較して^†ｐ＞０．０５）（図２４）。まとめると、これらのデータは、肺同種移植片拒絶のｃｏｌ（Ｖ）誘導抑制は、広範な免疫低応答性ではなく免疫寛容により仲介されることを示している。
【０１４９】
経口寛容において、免疫応答を抑制する原因となるサイトカインとして、ＴＧＦ−β、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の全身的産生がしばしば引用される（Faria and Weiner 1999）
。それ故、次ぎに、ｃｏｌ（Ｖ）により誘導された経口寛容が肺同種移植片拒絶間のＴＧＦ−β、ＩＬ−４及びＩＬ−１０の上方調節された産生と関係しているかどうかを決定した。市販のＥＬＩＳＡを利用し、実験群の血清中のＴＧＦ−β、ＩＬ−４及びＩＬ−１０を定量した。図１７は、移植２週間後の正常ＷＫＹラット、対照同種移植片及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片における血清ＴＧＦ−βレベルを示す。予期されるように、低レベルのＴＧＦ−βが正常ＷＫＹラットの血清中に存在した（Ying and Sanders 1998）。対照
同種移植片においてはＴＧＦ−βのわずかな増加があった。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片の血清中では、ＴＧＦ−βレベルは著しく上方調節されていた（対照同種移植
片レシピエントと比較して^＊ｐ＜０．０５）（図１７）。ＩＬ−４又はＩＬ−１０は、同一ラットの血清中では検出不能であった（データは示されていない）。
【０１５０】
ＩＬ−４又はＩＬ−１０は血清中に検出されなかったけれども、このことは、ドナー同種抗原に対して下方制御された細胞性免疫応答における、それらの全身的活性を除外するものではない。ＴＧＦ−β、ＩＬ−４及びＩＬ−１０が同種抗原に対する免疫応答の抑制に役割を有しているかどうかを決定するため、ドナー抗原に対するＤＴＨアッセイにおいて、これらのサイトカインの中和抗体を利用した。（Bickerstaff et al. 2000）により
報告されている手順の改変を利用し、肺移植２週間後、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットは、５μｇのポリクローナル抗ＴＧＦ−β Ａｂ又は５μｇのポリクローナル抗ＩＬ−４又はＩＬ−１０Ａｂと混合された１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４脾細胞のＰＢＳ溶液を、右耳介内に受けた。左耳介は等容積の希釈剤プラス脾細胞を受け、対照部位として働いた。陰性対照のため、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片の別の群が、脾細胞とともに対照免疫グロブリンを右耳介内に、及び希釈剤プラス脾細胞を左耳介内に受けた。図１８に示したように、及び図１０で前に示したように、未処置対照同種移植片レシピエントはドナー抗原の暴露後に強いＤＴＨ応答を有したが、それはｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントでは有意に減少していた。しかしながら、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片は、抗ＴＧＦ−β抗体がドナー脾細胞と混合され、耳の耳介内に注射された場合、有意にＤＴＨ応答を回復した［対照免疫グロブリンと混合した抗原を暴露されたｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片と比較して^＊ｐ＜０．０３］（図１８）。対照的に、ドナー脾細胞とＩＬ−４又はＩＬ−１０の中和抗体を混合することはＤＴＨ応答を回復することにあまり有効ではなかった［対照免疫グロブリンと混合した抗原を暴露されたｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片と比較して^†‡ｐ＞０．０５］（図１８）。対照同種移植片と比較した、抗ＴＧＦ−β、抗ＩＬ−４及び抗ＩＬ−１０抗体によるｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片のＤＴＨ応答の回復は、それぞれ７５．７％、２４．３％及び３９．９％であった（図１８）。
【０１５１】
実施例６
急性肺同種移植片拒絶の発生への経口寛容についてのｃｏｌ（Ｖ）の効果は用量依存的である。Ｆ３４４（ＲＴｌ^ｌｖｌ）及びＷＫＹ（ＲＴｌ^１）雄ラット（２００〜２５０ｇ）はHarlan Sprague Dawley（Indianapolis, Ind.）から購入した。すべての左肺同種移
植片（Ｆ３４４）又は同系移植片（ＷＫＹ）は、以前に記載されているように（Sekine et al. 1997）、ＷＫＹレシピエント内に、正所的に移植した。
【０１５２】
ここで図２５、表４を参照すると、この実施例で集められたデータの要約が含まれている。Ｖ型コラーゲンは、正常出産のヒト胎盤か又は肺癌切除時に得られた正常肺組織検体から単離された。コラーゲン生化学に広範な専門知識を有するGerald N. Smith Jr., Ph.D. がこれらの研究のために精製Ｖ型コラーゲンを提供した。
【０１５３】
ＷＫＹラットは、予備的データ及び投稿原稿に報告されているように、胃経管栄養法を使用し、移植手術に先立ってコラーゲンで免疫した。全てのラットは、表に記載されているように、４又は８日間、１日おきに摂取させた。予備的データと同様に、１週間の摂取後回復期間の後、Ｆ３４４ラット（同種移植）又はＷＫＹラット（同系移植片）の左肺をＷＫＹレシピエント内に正所的に移植した。この実験のラットは免疫抑制剤を受けていない。各コラーゲン型に対する各摂取群には２０匹のラットが含まれている。ここで図２５、表４を参照すると、本明細書で報告された実施例で使用された実験群の説明が含まれている。
【０１５４】
重度の拒絶反応が発生する時点である（Matsumura et al. 1995）、移植２週間の終わ
りに先立った２４時間前、１０レシピエントラットのドナー抗原に対するＤＴＨ応答について試験し、続いて胸部臓器を摘出した。ＢＡＬを自然の及び移植片肺に対し、それぞれ
右及び左主気管支にカニューレを選択的に挿入することにより実施し、３７℃で５ｍｌのＰＢＳを点滴注入した（Sekine et al. 1997）。無細胞ＢＡＬは遠心分離した検体から得られ、上清を−８０℃で貯蔵した。血液は大静脈及び心穿刺により集め、検体を遠心分離して血清を分離し、−８０℃で貯蔵した。
【０１５５】
遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答研究は、予備データ及び原稿（Yasufuku et al. 投稿中）に報告されているように、２週間の術後期間の完了に先立つ２４時間前、ＷＫＹラットの右耳内への照射ドナー（Ｆ３４４）脾細胞の注射により実施した。データは「特異的耳膨潤」として報告された。予備的研究は、最大ＤＴＨ応答が耳注射２４時間後に起こることを示している他の報告（Yamagami et al. 1999）を確認し、それ故、すべてのＤＴＨ測定は耳注射２４時間後に実施されるであろう。予備的研究は、ＤＴＨ試験は全身的細胞性又は体液性応答に影響を及ぼさないことを確認した。コラーゲン摂取ＷＫＹラットと比較した同系移植片及び同種移植片対照レシピエントにおけるドナー抗原に対するＤＴＨ応答を比較することにより、異なった用量のｃｏｌ（Ｖ）がドナー抗原に対するＤＴＨ応答に示差的効果を有するかどうかを決定し得る。
【０１５６】
安楽死後、胸郭臓器を一括して除去し、組織学的に研究した。手短に言うと、胸郭臓器からのサンプルを４％グルタルアルデヒドの気管内点滴注入により固定し、パラフィンに包埋し、５〜７μｍの切片とし、および光学顕微鏡による組織学的研究のためヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。組織学的病変はヒト肺同種移植片拒絶についての標準組織学的基準（Yousem et al. 1996）により、盲検的様式（Wilkes et al. 1995）で段階付けした。急性拒絶は、血管周囲及び細気管支周囲単核細胞浸潤の変化する強度により特徴付けた（Yousem et al. 1996）。群間の細胞浸潤の相違が、急性拒絶の認められた基準内で説明されるよりも適していることができるので、Sigma Scan ソフトウェアー
（Jandel Scientific, Chicago, III）を利用し、デジタル化Ｈ＆Ｅ染色組織切片（細胞
／μｍ^２）上に存在する、血管周囲及び細気管支周囲単核細胞を計数することにより浸潤が定量化されるであろう。デジタル化法は現在我々の実験室で使用されている。
【０１５７】
細胞傷害性Ｔリンパ球は肺同種移植片拒絶の病態発生に鍵となる役割を有しており（Trulock 1997）、損なわれた細胞傷害活性は、経口寛容が疾患活性を防止する鍵となる機構であることが示されている（Faria and Weiner 1999; Mayer 2000; Garside and Mowat 1997）。ｃｏｌ（Ｖ）寛容化肺移植片レシピエントにおける減少した拒絶活性が損なわれ
た抗ドナー細胞傷害活性と関連するかどうかを決定するため、末梢リンパ節細胞を正常Ｆ３４４（ドナー）ラットから単離し、^５１Ｃｒ（New England Nuclear, Boston, Mass.）を負荷し、完全培地中、９６ウエル平底プレート（標的細胞、５ｘ１０^３／ウェル）においた。エフェクター細胞（各群中のレシピエントＷＫＹラットからの脾臓Ｔリンパ球）を種々の比で標的と３７℃で４時間インキュベートした（１：１、５：１、１０：１及び１００：１のＥ／Ｔ比）。純粋な脾臓Ｔ細胞（＞９５％純度）は、抗ＣＤ３磁気ビーズ（Dynal Corp, Lake Success, N.Y.）を利用して単離し、及びフローサイトメトリーにより確認した。細胞傷害性は、負荷標的細胞のみからの放出と比較された、各Ｅ／Ｔ比のエフェクター細胞により誘発された特異的^５１Ｃｒ放出により決定された。
【０１５８】
他の研究者は、ラット及びヒトにおける肺同種移植片拒絶が肺胞、血管及び細気管支組織に存在する細胞のアポトーシスと関連していること、及びそのアポトーシスが同種移植片受容の間にまれに検出されることを確認している（Blankenberg, et al. 2000）。同種抗原に対する局所的免疫応答が、マウスの血管内皮及び細気管支上皮内でのアポトーシスの誘導を含んでいることも以前に示されている。加えて、ドナー抗原に対するアネルギーを誘導するｃｏｌ（Ｖ）での免疫化は、このモデルにおいて同種抗原誘導アポトーシスを防止する。肺同種移植片におけるアポトーシスを防止する、ｃｏｌ（Ｖ）誘導経口寛容の能力を決定するため、ＴｄＴ仲介dUTP Nick End Labeling (TUNEL）アッセイキット（In
Situ Cell Death Detection Kit, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.）を利用して、移植２週間後の肺同種移植片組織切片におけるアポトーシスを検出した。血管周囲及び細気管支周囲組織中のアポトーシスを起こした細胞の量は、Sigma Scan ソフトウェア
ー（Jandel Scientific, Chicago, III）を利用し、デジタル化エオシン対比染色組織切
片（細胞／μｍ^２）上で定量した。
【０１５９】
ｃｏｌ（Ｖ）により誘導された免疫抑制のすべての可能性のあるメディエーター、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＣＴＧＦ及び一酸化窒素の産生、ならびに移植後合成の時間経過を決定するため、拒絶病態を防止することに最も有効であるｃｏｌ（Ｖ）の用量を、ラットの別の群を摂取するために使用した。簡単に言えば、同種移植片対照ラット及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントを移植後２日、４日、６日、８日、１０日、１２日及び１４日目に屠殺し、製造元のプロトコルによるＥＬＩＳＡにより（R&D Systems, Minneapolis, Minn.）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−βの血清レベルを定量した
（ｎ＝５ 各時点で５ラット）。ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ（Pharmingen, San Diego, Calif.）を利用して、末梢リンパ節及び脾細胞におけるこれらサイトカインのｍ
ＲＮＡを検出した。対照は、正常ＷＫＹラットからの血清、リンパ節及び脾細胞である。
【０１６０】
対照同種移植片、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片及び正常ラットの血清中のＣＴＧＦレベルは、ＣＴＦＧの構造及び機能における第一人者であるDr. George Martin, Ph.D., Scientific Director of Fibrogen, San Francisco, Calif. により、ＥＬＩＳＡを用いて決
定された。Dr. Martinにより提供されたプローブを利用し、末梢リンパ節及び脾臓中のＣＴＧＦについてのｍＲＮＡを検出するため、ノーザンブロッティングを使用した。タンパク質及びｍＲＮＡ発現は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−βについて記述された同一の時点でアッセイした。
【０１６１】
血清中の一酸化窒素レベルは、対照同種移植片及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片において上記の種々の時点で、及び上記の移植後の種々の時点で、ならびに正常ＷＫＹラットで検出した。安定な代謝亜硝酸塩及び硝酸塩の産生は、血清の分光光度分析を利用するGreiss 反応により決定した（Kallio et al. 1997）。
【０１６２】
実施例７
慢性肺同種移植片拒絶（閉塞性細気管支炎）の発生における経口寛容についてのＣｏＩ（Ｖ）用量の効果。病原体フリー、ＭＨＣ（ＲＴｌ）不適合雄ラットを本研究に利用した：Fischer 344（Ｆ３４４、ＲＴ１^ｌｖｌ）、Brown Norway（ＢＮ、ＲＴ１^ｎ）及びWistar Kyoto（ＷＫＹ、ＲＴｌ^１）ラット（移植の時点で２５０−３００ｇ）。全てのラット
はHarlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind.）から購入し、施設のガイドラインに従
ってUniversity School of MedicineのLaboratory Animal Resource Center Indiana (Indianapolis, Ind.）に収容した。
【０１６３】
ＩＩ型コラーゲン［ｃｏｌ（ＩＩ）］は、以前に報告されているようにイヌ軟骨から単離した。精製ヒトＶ型コラーゲン［ｃｏｌ（Ｖ）］及びＸＩ型コラーゲン［ｃｏｌ（ＸＩ）］はDr. Jerome Seyer (VA Hospital, Hampton, Va.）から贈与された。コラーゲンは
０．００５Ｍ酢酸（０．５ｍｇ／ｍｌ）で希釈し、使用されるまで４℃で貯蔵した。
【０１６４】
ＷＫＹラットは、０．５ｍｌの生理食塩水に溶解した１０μｇのｃｏｌ（Ｖ）溶液を、１６ゲージボールポイントステンレススチール動物摂取針（Braintree Scientific, Braintree, Mass.）を利用する胃経管栄養により摂取させた。対照動物には希釈剤のみを摂取させた。８回摂取に対し、動物は一日おきに摂取させた。最後の摂取７日後、これらのラットは肺同種移植片のレシピエントとして利用した。
【０１６５】
左肺同系移植片（ＷＫＹ→ＷＫＹ）又は同種移植片（Ｆ３４４→ＷＫＹ）の同所性移植は最初に（Marck et al. 1983, 及び Prop et al. 1985）により記述手順を利用し、既に報告されているように実施した。Ｆ３４４→ＷＫＹ移植モデルは、第二週の終わりまでに重度の拒絶発生が付随した。加えて、このモデルは、再現性よく閉塞性細気管支炎（ＢＯ）を発生する、ただ一つの肺移植の動物モデルである。全ての移植群において生存率は９０％を上回った。実験期間の間、いずれの時点でも非免疫抑制療法は与えなかった。
【０１６６】
３つの移植群を研究した：ＷＫＹラットからの肺をＷＫＹレシピエントに移植［対照同系移植片］；Ｆ３４４肺を希釈剤摂取ＷＫＹレシピエントに移植［対照同種移植片］；及びＦ３４４肺をｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹレシピエントに移植［ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片］。レシピエント移植２週及び１０週後に屠殺した。
【０１６７】
遅延型過敏性（ＤＴＨ）応答は、（Sayegh et al. 1994及び Yamagami et al. 1999）
に記載されている方法を改変して決定した。手短に言えば、肺移植１０週間後、対照又はｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットは、２６ゲージ注射針を使用するｓ．ｃ．注射により、右耳介内に、１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４又は第三者（ＢＮ）脾細胞の３０μｌのＰＢＳ溶液を受けた。左耳介は等容積の希釈剤を受け、対照部位として働いた。無処置ＷＫＹラットは陰性対照であった。無処置又は同種移植片レシピエントＷＫＹラットの別々の群が、１５μｇのｃｏｌ（ＩＩ）、ｃｏｌ（Ｖ）又はｃｏｌ（ＸＩ）を３０μｌ容量で右耳介内に、希釈剤を左耳介内に注射されて試験された。耳の厚さは、注射直前及び２４時間後に盲検様式で、マイクロメーターカリパー（Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, 111.）で測定した。特異的耳膨潤は以下の式に従って計算した：特異的耳膨潤＝（右耳厚さ＠２４時間−右耳厚さ＠０時間）−（左耳厚さ＠２４時間−左耳厚さ＠０時間）ｘ１０^−３ｍｍ。全てのデータは三回の測定の平均として報告されている。
【０１６８】
ＤＴＨ部位でのＴＧＦ−βの中和は、（Bickerstaff et al. 2000）により記載されて
いる手順を改変して実施した。手短に言えば、肺移植１０週間後、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットは、５μｇのポリクローナルニワトリ抗ラットＴＧＦ−β Ａｂ（R&D Systems,
Minneapolis, Minn.）と混合された１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４脾
細胞の３０μｌのＰＢＳ溶液を、右耳介内に受けた。左耳介は等容積の希釈剤を受け、対照部位として働いた。陰性対照のため、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片の別の群が、５μｇの対照ニワトリトリ免疫グロブリン又は対照ヤギ免疫グロブリン（R&D Systems, Minneapolis, Minn.）と混合された１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４脾細胞を右
耳介内に、及び希釈剤を左耳介内に受けた。特異的耳膨潤は上記のように計算した。対照免疫グロブリンはＤＴＨ応答に何の影響も与えなかった。
【０１６９】
混合白血球反応は以前に記述されている手順を改変することにより実施した。手短に言えば、抗原提示細胞源（ＡＰＣ）として使用されたＦ３４４脾細胞（刺激物質）をマイトマイシンＣ（Sigma, St. Louis, Mo.）で処理し、種々の比で、ＷＫＹラットからのリン
パ節Ｔ１リンパ球（応答物質）（３ｘ１０^５／ウェル）と、９６−ウェル平底マイクロタイタープレート（Costar, Cambridge, Mass.）の２００μｌの培地（ＲＰＭＩ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、５ｘ１０^−５Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｌ／ｍｌストレプトマイシン、１０％熱不活性化ウシ胎児血清）中で同時培養した。３７℃（５％ＣＯ_２）での５日間のインキュベーションが完了する１８時間前、各ウェルに１μＣｉ／ｍｌの^３Ｈ（Amersham Corp., Arlington Heights, 111.）を加え
た。培養物を自動化セルハーベスター（Brandel, Gaithersburg, Md.）で収穫し、液体シンチレーションカウンター（Beckman, Arlington Heights, 111.）で分析した。細胞増殖は、３回の培養での［^３Ｈ］チミジン取り込みの分当たりのカウントの平均として決定され、刺激指数として報告された。別の実験において、刺激物質として実験群のＷＫＹラットからの脾細胞及び応答物質としてＦ３４４ラットからのリンパ節Ｔリンパ球を使用して
同じアッセイを実施した。
【０１７０】
実験群の血清中のＴＧＦ−βレベルは、製造元のプロトコルにより、ＴＧＦ−β_１免疫アッセイシステム（Promega, Madison, Wis.）を利用するＥＬＩＳＡにより定量した。血清中のＩＬ−４及びＩＬ−１０レベルは、製造元のプロトコルにより、Cytoscreenイムノアッセイキット（BioSource International, Camarillo, Calif.）を利用するＥＬＩＳＡにより定量した。ＴＧＦ−β、ＩＬ−４及びＩＬ−１０アッセイの感度は、それぞれ３２、２及び５ｐｇ／ｍｌであった。
【０１７１】
病理学を評価するため、各群からの自然の及び移植された肺を摘出し、固定し、切片化し、染色し、及び既に報告されたように、移植群の予備知識がない盲検的様式で、病理学者（O. W. C.）による標準的判断基準を使用して拒絶病態について段階付けした。
【０１７２】
対照同種移植におけるＤＴＨ及び異なった抗原が暴露された無処置ＷＫＹラットについてのデータは正常に分布していないことが観察されたので、相互作用を有するrank-sum二方向ＡＮＯＶＡを利用し、群間の差違を決定した。対照同種移植片及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片間の、ドナー同種抗原に対するＤＴＨ応答の相違はマンホイットニーＵ検定を利用して決定した。ＭＬＲ及びサントカインの分析については、複数の比較のためのスチューデントｔ検定を利用した。Ｐ値＜０．０５が有意であると決定された。
【０１７３】
急性肺同種移植片拒絶は、ドナー抗原ならびにｃｏｌ（Ｖ）に対する免疫応答と関連することが示されている。しかしながら、最近の研究は、ドナー抗原に対する免疫応答が時間とともに減少できることを示唆した。ドナー抗原及びｃｏｌ（Ｖ）に対する免疫応答が肺移植後長期に存在するかどうかを決定するため、Ｆ３４４（ドナー）脾細胞及びｃｏｌ（Ｖ）に対するＤＴＨ応答を、Ｆ３４４肺移植片の移植１０週後に、ＷＫＹラットにおいて試験した。図１９は、対照同種移植片レシピエントが無処置ＷＫＹラットと比較して、ドナー抗原（Ｆ３４４脾細胞）及びｃｏｌ（Ｖ）に対する有意なＤＴＨ応答を有していることを示している（^＊ｐ＜０．０５）。有意に、１０週目でのドナー抗原及びｃｏｌ（Ｖ）に対するＤＴＨ応答は、急性拒絶の間に（移植２週間後）観察されたものと同じであった。ＣｏＩ（ＩＩ）又はｃｏｌ（ＸＩ）（対照）は、いずれの時点でも、肺同種移植片レシピエントにおいてＤＴＨ応答を誘導しなかった。
【０１７４】
ドナー由来抗原を使用する経口寛容誘導は、移植２週間後まではドナー抗原に対する細胞性免疫応答を抑制するのに有効であった。加えて、欠損抗原提示が、寛容が免疫応答を変調する別の機構であると報告されている。ｃｏｌ（Ｖ）摂取がドナー抗原に対する細胞性免疫応答を長期に下方調節するかどうかを次ぎに決定し、ｃｏｌ（Ｖ）誘導経口寛容が抗原提示に影響する効果を試験した。上記のように、非摂取及びｃｏｌ（Ｖ）が摂取されたＷＫＹラットは、Ｆ３４４肺同種移植片を受けた。移植２週間（急性拒絶の時間）及び１０週間（ＢＯ発症の時間）後、ラットを屠殺し、リンパ節リンパ球を単離し、ドナー抗原（Ｆ３４４脾細胞）で刺激した。図１９は、正常ＷＫＹラットからのリンパ節リンパ球又はＦ３４４肺同種移植片の移植後２週又は１０週目のＷＫＹラットから単離されたリンパ球が、ドナー抗原に対して匹敵する増殖応答を有していたことを示している。対照的に、正常又は対照同種移植片と比較し、ｃｏｌ（Ｖ）誘導経口寛容は、両方の時点でドナー抗原に対する増殖応答の有意な減少を起こした（^＊ｐ＜０．０５）。加えて、ｃｏｌ（Ｖ）摂取肺同種移植片レシピエントからのリンパ球に対する増殖応答は、２週と比較して１０週ではより低かった（^＊ｐ＜０．０５、図２０）。
【０１７５】
我々は次ぎに、ｃｏｌ（Ｖ）誘導経口寛容が抗原提示に影響するかどうかを決定した。手短に言えば、脾細胞（抗原提示細胞源）は正常ＷＫＹラット又はＦ３４４肺同種移植片の移植後２週又は１０週目のＷＫＹラットから単離され、ＭＬＲにおいてＦ３４４リンパ
節リンパ球が増殖するのを誘導するそれらの能力を試験した。図１９は、２週及び１０週目にｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントから単離された脾細胞が、正常ＷＫＹラットから単離された脾細胞に匹敵する増殖を誘導したことを示している。
【０１７６】
ドナー抗原に対するＤＴＨ応答は、臓器移植の多様なげっ歯類モデルにおける拒絶活性と相関すると報告されている。それ故、１０週目のｃｏｌ（Ｖ）摂取肺同種移植片レシピエントにおけるドナー抗原に対する減少したＤＴＨ応答を示しているデータは、同種移植片における減少した拒絶病態を示唆している。図２１は、移植１０週後の、Ｆ３４４肺同種移植片を受けたＷＫＹラット（対照同種移植片）、及びＦ３４４肺同種移植片を受けたｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットから摘出された肺同種移植片の肉眼的解剖学及び組織学を示している。対照同種移植片は暗褐色であり、萎縮し及び硬かった（図２１Ａ）。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットからの同種移植片は、わずかに変色しているのみでほとんど正常外観を有していた（図２１Ｂ）。移植１０週後、全ての全対照同種移植片は広範囲の間質単核細胞浸潤、線維症及びＢＯの病理学的病変である肉芽組織による小気道の閉塞を発生した（ｎ＝５、図２１Ｃ）。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ラットから摘出された同種移植片は軽度急性拒絶の病態を記述する間質性炎症がなく、軽度の肺胞性浸潤を有するのみであった（グレードＡ２、ｎ＝５、図２１Ｄ）。
【０１７７】
ＩＬ−４、ＩＬ−１０又はＴＧＦ−βの全身的産生は、経口寛容誘導免疫抑制の機構としてよく報告されている。移植１０週後の３つの実験群におけるＴＧＦ−βの血清レベルは、図２２に示されている。正常ＷＫＹラットは血清中に低レベルのＴＧＦ−β、Ｆ３４４肺同種移植片を受けたＷＫＹラットでは、わずかに、しかし有意ではなく増加したＴＧＦ−βレベルを有していた（対照同種移植-図２２）。しかしながら、肺移植に先だって
ｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることは、有意に増加したＴＧＦ−βの血清レベルを生じた（図２５、^＊ｐ＜０．０５）。肺移植なしでｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることのみでは、血清ＴＧＦ−βレベルは増加しなかった（データは示されていない）。ＩＬ−４又はＩＬ−１０のいずれも、いかなる群の血清にも検出されなかった。
【０１７８】
同種抗原に対するリンパ球応答の下方調節、及びインビトロでの同種抗原の無傷の提示を示しているデータは、ｃｏｌ（Ｖ）誘導経口寛容が、インビボでのドナー抗原に対する抑制されたＤＴＨ応答にも関連しているに違いないことを示唆している。予期されるように、図２３は、対照同種移植片レシピエントがドナー抗原に対する強いＤＴＨ応答を有していることを示している。しかしながら、移植に先だってｃｏｌ（Ｖ）を摂取させることは、ドナー抗原に対するＤＴＨ応答を有意に減少させた（図２６、^＊ｐ＜０．０５）。ＴＧＦ−βの増加した血清レベルがｃｏｌ（Ｖ）誘導経口寛容に寄与しているかどうかを決定するため、以前に報告されているように、ＴＧＦ−βへの中和抗体を使用してドナー抗原に対するＤＴＨ応答を繰り返した。図２３は、ＴＧＦ−βを中和することは、ドナー抗原に対するＤＴＨ応答の有意な回復を生じた（^＊ｐ＜０．０５、及びＤＴＨ応答の７５％が対照同種移植片において観察された）。
【０１７９】
実施例８
図２６を参照すると、表５は実施例８で使用された実験群、ＣｏＩ（Ｖ）のα鎖の臭化シアン消化物中に存在するペプチドが急性拒絶の発生を防止するかどうかの決定をリストしている。手短に言えば、これらの実験群は以下のようである：同種移植片対照無傷ｃｏｌ（Ｖ）摂取２（Ｖ）。Ｖ型コラーゲンは、剖検で得られたヒト肺から単離された。肺組織を切り刻み、洗浄し及び０．２Ｍ ＮａＣｌを含有する０．５Ｍ酢酸に懸濁させ、そしてペプシンにより消化し、遠心分離した検体から上清を吸引し、ペレットを集め、抽出手順を繰り返した。２つの消化物からの上清を合わせ、−７０℃で貯蔵した。Ｖ型コラーゲンは０．５Ｍ酢酸からの示差ＮａＣｌ沈殿により上清から精製した（Piez et al. 1963）。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により決定されるおよそ２のα鎖比αｌ（Ｖ
）／α２（Ｖ）を有するＶ型調製物が得られるまで、酢酸での可溶化及びＮａＣｌ沈殿のサイクルを繰り返す（Woodburye wheat t al. 1989）。α２（Ｖ）からのαｌ（Ｖ）の分離は、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィーにより達成される（Chiang et al 1980）。αｌ（Ｖ）及びα２（Ｖ）鎖をカラムから溶出し、溶出物液中のヒドロキシプロ
リン含量の決定により定量する。
【０１８０】
Ｖ型コラーゲンのα鎖はさらに、コラーゲンのメチオニン残基を切断する臭化シアンによる消化により分画化する（Miller et al. 1971）。消化が完了した後、サンプルを５０倍に希釈し、凍結乾燥して臭化シアンを除去した。消化の程度はポリアクリルアミドゲルでスクリーニングした。個々のペプチドはイオン交換及び分子ふるいクロマトグラフィーの併用により単離した。
【０１８１】
２０匹のＷＫＹラットは胃経管栄養法により、無傷のｃｏｌ（Ｖ）又はαｌ（Ｖ）又はα２（Ｖ）からプールされたペプチドを受けた。本実施例における無傷のｃｏｌ（Ｖ）又はペプチドの用量及び摂取計画は、実施例５で無傷のｃｏｌ（Ｖ）について決定されたものと同じである。移植２週間後、各群のラットを屠殺し、及び肺を回収した。
【０１８２】
実施例９
ここに示されたデータは、本発明の方法は、ヒト移植片レシピエントにおける急性又は慢性拒絶病状発生を防止する又は軽減するのに有効であろうこと、同一ではないにしても同様の療法は特発性肺疾患、又は肺に観察されるコラーゲンに対する自己免疫応答を含む、いずれか他のタイプの肺疾患又は肺障害のための有効な治療でもあるべきであることを示唆する。ヒト対象が移植を受けるためにリストに載せられた場合、該対象は本明細書に記載されたコラーゲン化合物のような同種免疫応答を抑制する分子の有効用量を受け始めるであろうことも意図される。治療を受けている患者は、経口投与により、好ましくは経口摂取か又はレシピエント内への肺内滴下注入により該化合物を受けるであろう。
【０１８３】
用量は、当業者には公知である多数の因子により決定されるであろう。該対象が移植リストに載せられた時点から移植の時まで、月当たり少なくとも３用量を受けるであろう。ある場合には、月当たり少なくとも３用量を受けるために、用量が４日の間、隔日で投与されるであろう。他の場合、移植に先立って月当たり５回の総容量について、８日の間、隔日で投与されるであろう。他の場合には、該対象は、移植リストに載せられた時点から移植の時まで、週に１回該化合物を受けるであろう。対象に依存して、該対象が移植リストに載せられた時点から移植の時まで、週当たり少なくとも２回、該化合物を投与することができる。
【０１８４】
実施例１０
自己免疫応答を抑制する分子、好ましくはコラーゲン化合物による、移植を受けた、又はコラーゲン、例えば、Ｖ型コラーゲンに対する自己免疫を含む肺疾患又は障害を患っているヒト対象の治療は、該対象における急性又は慢性病態を防止する又は軽減するであろうことがさらに企図される。上記のように、該化合物の投与は、経口摂取による、又はレシピエント（患者）内への肺内又は静脈内点滴注入によることを含む多様な手段で投与し得る。
【０１８５】
再び、投与量は当業者には公知の多数の因子に基づいて当業者により決定されるであろう。ほとんどの場合、所与の患者は少なくとも２ヶ月の間、又は疾患又は障害の病状が改善されるまで、月当たり少なくとも３用量の化合物を受けるようである。これらの用量は、月当たり３用量について、上記のように、４日の間、隔日で１用量の形態を取ることができる。このやり方を当業者により決定される必要なだけ繰り返すことが可能である。もしくは、該対象は、移植後必要とされる月の間、月当たり総計で５用量について８日の間
、隔日で１用量を受けることができる。他の側面において、該対象は、当業者により決定されるように、週毎の増加又は週で２倍の用量などを受けることができる。
【０１８６】
本発明が図及び前記の説明において詳細に図示され及び記述されてきたが、このことは特質において例示的であり制限的ではないと考えるべきであり、好ましい態様のみが示され記述されてきたこと、及び本発明の精神内にくるすべての変更及び修飾は保護されるべきと望まれることを理解されている。その上、本発明が特定の実施例、理論的根拠、説明、及び例示を使用して例示されてきたが、これらの例示及び付随する議論は本発明を制限しているとして説明されているわけではない。この出願で参照されている、全ての特許、特許出願、及び教科書、科学書、出版物などへの参照は、その全体が本明細書において援用される。
【０１８７】
参照文献
下記の参照文献は、それらが本明細書に示されているものへの例となる手順又は他の詳細な補完を提供する範囲において、特別に本明細書において援用される。

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【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】肺移植片レシピエントの臨床経過に関連した抗ｃｏｌ（Ｖ）Ｂ及びＴ細胞自己反応性。パネルＡ． ｃｏｌ（ＩＩ）又はｃｏｌ（Ｖ）に対して試験された患者Ｌ３、Ｌ４１、Ｌ３１からのＢＡＬサンプルから精製されたＩｇＧのウェスタンブロット分析。パネルＢ． 同じ３人の患者における抗ｃｏｌ（Ｖ）自己免疫及び移植片機能の時間経過。ＦＥＶ１（実線、左軸）は各患者について最大（Ｌ３について２．３、Ｌ４１について２．４及びＬ３１について２．８）の１００％に調整された。ＢＯＳレベル１は灰色の点線で表されている（最大ＦＥＶ１の８０％）。ｃｏｌ（Ｖ）（黒いバー、右軸）及びｃｏｌ（ＩＩ）（白いバー）に対するＤＴＨは陰を付けた領域で表されている負のＤＴＨ応答（＜２５ｘ１０^−４インチ）で示されている。ウェスタンブロットの結果（パネルＡから）はグラフの頂点近くの矩形により表されている。急性拒絶病状発生は^＊により表されている。パネルＣ． パネルＢで見られたものと同様の反応性のパターンを有する、４人の追加の対象における臨床経過及び抗ｃｏｌ（Ｖ）反応性の合成。％最大ＦＥＶｌ（各線は個々の移植片レシピエントを表している）、ｃｏｌ（Ｖ）に対する陽性Ａｂ及び／又はＤＴＨ（所与の対象ＦＥＶｌ線上の黒丸）又はｃｏｌ（Ｖ）に対する陰性Ａｂ及び／又はＤＴＨ（ＦＥＶｌ線上の白三角）、ならびに対象の死（＋）が示されている。ＢＯＳ１閾値（８０％最大ＦＥＶｌ）は灰色の点線で表されている。
【図２】ＢＯＳ Ｉが存在しないことに関して抗ｃｏｌ（Ｖ）反応性を発生させることの効果を試験しているカプランマイヤー分析。移植後３２６日（パネルＡ）又は移植後７６０日（パネルＢ）を通して良好な移植片機能を有する患者を、その時間に先立ち、ｃｏｌ（Ｖ）へのそれらの応答に基づいて分割した。パネルＡ、陽性抗ｃｏｌ（Ｖ）応答を有するもの（点線）には抗体／ＢＡＬ又はＤＴＨ／末梢血陽性が含まれ；パネルＢ、ＤＴＨ応答は前陽性抗ｃｏｌ（Ｖ）応答を有する患者を同定するために使用される唯一の判断基準である。両方のパネルにおいて、陰性の前抗ｃｏｌ（Ｖ）応答を有する患者は実線で示されている。ｃｏｌ（Ｖ）非反応性群及びｃｏｌ（Ｖ）反応性群間の相違は有意であった（ｐ＝０．０１、パネルＡ；ｐ＝０．０３、パネルＢ）
【図３】移植後肺患者におけるｃｏｌ（Ｖ）に対するＤＴＨ応答は特異的であり、前移植には存在しない。パネルＡ． 移植後肺患者（ｎ＝８、いずれの疾患でも）又はグッドパスチャー（Goodpasture's）症候群を有する腎臓患者（ＧＰＳ、ｎ＝５）をｃｏｌ（ＩＩ）（白いバー）、ｃｏｌ（ＩＶ）（斜線を付けたバー）又はｃｏｌ（Ｖ）（黒いバー）に対するＤＴＨ応答について試験し、平均膨潤±Ｓ．Ｄ．で表されている。種々のコラーゲンに対する肺移植片レシピエントの応答間の差違は有意であり（^＊ｐ＝０．００１）、ＧＰＳと腎臓移植片レシピエントの間の相違もそうであった。パネルＢ． 多様な肺疾患を有する非移植片レシピエントをｃｏｌ（ＩＩ）（白いバー）、又はｃｏｌ（Ｖ）（黒いバー）に対するＤＴＨ応答について試験し、平均膨潤±Ｓ．Ｄ．で表されている。ＩＰＦ及びいずれか他の疾患を有する患者においては、ｃｏｌ（Ｖ）に対する応答の相違は有意であった（^＊ｐ＝０．０２）。パネルＣ． ＩＰＦ及びいずれか他の疾患の移植前診断を有する患者についての時間と移植片機能損失のカプランマイヤー分析。１年移植片生存率相違は有意であった（ｐ＝０．０５）。log rank解析による総移植片生存率は、群間で有意に異なっていなかった。
【図４】急性拒絶を受けた肺中の沈着を示しているＩｇＧの免疫化学の写真。経気管支生検（ＴＢＢ）の凍結切片又は正常肺組織はアセトン中で固定し、以前に記載されているように（Wilkes et al - Journal of Immunology 1995）ＩｇＧサブタイプ沈着のために染色した。パネルＡ、Ｂ、Ｃ及びＤは、移植後１００日目に急性拒絶グレード２を受けた肺同種移植片から得られたＴＢＢのＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ｇＧ３及びＩｇＧ４サブクラス免疫染色を示している。細気管支周囲結合組織中のＩｇＧ２沈着が気管支上皮（矢印）に下にあることに注意されたい。対照的に、同一サンプル中には、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４沈着は検出されなかった。上皮下基質中のＩｇＧ２沈着は、正常肺中及び静止状態移植片状態を有する同種移植片中には存在しない（データは示されていない）。
【図５】肺移植を待っている患者におけるＶ型コラーゲンに対する遅延型過敏性応答。ＤＴＨ応答はＴ細胞活性化のマーカーであり、我々がラット肺移植モデルで報告したことを反している。ＩＰＦを有するが、他の形態の肺疾患ではない患者は、Ｖ型コラーゲンに対する有意により大きなＤＴＨ応答を有する。このことは、これらの患者がこの自己抗原に対して活性化されたＴ細胞をすでに有していることを示している。
【図６】未処置のＷＫＹラット（Ａ）、既にニワトリ卵リゾチームで免疫されたＷＫＹラット（Ｂ）、又は既にＶ型コラーゲンで免疫されたＷＫＹラット（Ｃ）内に移植された肺同系移植片の病態の効果を示している肺組織株の顕微鏡写真。データはｃｏｌ（Ｖ）（ＨＥＬではない）からの前感作は、移植後３０日目の肺の破壊を生じることを示している。いずれのラットも免疫抑制剤又は他の治療を受けていない。データはＨＥＬ及びｃｏｌ（Ｖ）群の各々について６匹のラット、未処置群ではＳＯラット以上を代表している。
【図７】表１、患者層の要約。これらの条件は多様な手術後病態と相関した肺移植法を受けた患者で診断された。
【図８】表２，ＢＯＳと関連する多様な因子を追跡しているデータの要約。因子はＢＯＳと関連する。
【図９Ａ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図９Ｂ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図９Ｃ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図９Ｄ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図９Ｅ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図９Ｆ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図９Ｇ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図９Ｈ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図９Ｉ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図９Ｊ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図９Ｋ】血清サンプル中の抗コラーゲンＶ抗体の異なったレベルを検出するために設計された、抗体ビーズに基づいたアッセイを使用して集められたデータのグラフ例示。右へのピークのシフトは抗コラーゲンＶ抗体の高いレベルを示す。左のパネルは患者から集められたデータを表し、右のパネルは多様なレベルの抗コラーゲンＶ抗体が血清に加えられた対照を表す。
【図１０】移植２週間後の対照同種移植片レシピエントにおける、ドナー同種抗原、ｃｏｌ（Ｖ）、及び第三者同種抗原に対するＤＴＨ応答の減少。無処置ＷＫＹラットが対照であった。動物は１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４脾細胞、第三者（ＢＮ）脾細胞又は１５μｇのｃｏｌ（Ｖ）を右耳介内に、及び左耳介に等容積の希釈剤を受けた。耳の厚さは、注射直前及び２４時間後に盲検様式で、マイクロメーターカリパー（Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, 111.）で測定した。特異的耳膨潤は方法に記載されているように計算した。データは、各群中４匹のラットのｍｍｘ１０^−３での特異的耳介膨潤の平均±ＳＥＭで表されている［Ｆ３４４脾細胞又はｃｏｌ（Ｖ）を暴露された無処置ＷＫＹラットと比較して^＊ｐ＜０．０００１又はｃｏｌ（Ｖ）又はＦ３４４脾細胞を暴露された無処置ＷＫＹラットと比較して^†ｐ＜０．０００１］。
【図１１】図１１Ａ、図１１Ｂ及び図１１Ｃ。１．５ｘｌ０^５同種（Ｃ５７ＢＬ／６）ＢＡＬ細胞単独、ｃｏｌ（ＩＩ）、又はｃｏｌ（ＸＩ）（各５０μｇ）の週４回の点滴注入後、４週の間の週１回、続いて週４回のＣ５７ＢＬ／６ ＢＡＬ細胞の点滴注入したＢＡＬＢ／ｃマウスの肺組織学。図１１Ａは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＢＡＬ細胞の点滴注入を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスの肺における細気管支周囲及び血管周囲単核細胞浸潤を示している。同様の病態病変がｃｏｌ（ＩＩ）（図１１Ｂ）又はＣｏＩ（ＸＩ）の週１回の点滴注入を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスの肺において観察された。
【図１２】正常ＷＫＹ肺、対照同系移植片肺、対照同種移植片肺及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片肺におけるＢＡＬ液示差的細胞計数。移植２週間後、移植された肺にＢＡＬを行った。示差的細胞計数は光学顕微鏡を利用し、サイトスピン調製液での３００細胞／視野を計数することにより決定した。Ｍａｃ、マクロファージ；Ｌｙｍ、リンパ球；ＰＭＮ、多形核細胞。データは４正常ＷＫＹ肺、４対照同系移植片、５対照同種移植片及び５ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片の平均±ＳＥＭで表されている（正常又は同系移植片と比較して、ＰＭＮについて^＊ｐ＜０．０３８及びリンパ球について^†ｐ＜０．０００００１、対照同種移植片と比較ＰＭＮして^＃ｐ＜０．０２３及びリンパ球と比較して^‡ｐ＜０．０００１）。
【図１３】図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃ。移植２週間後の移植片レシピエントの連続胸部Ｘ線。左肺視野の短い白線（矢頭）は血管吻合使用されたカフを表している。対照同系移植片レシピエントは図１３Ａに正常胸部Ｘ線を示している。対照同種移植片レシピエントのＸ線は、重篤な浸潤及び完全な不透明化の同種移植片を明らかにし、重度の拒絶を図１３Ｂに示している。Ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントは、図１３Ｃに移植２週間後の軽度の浸潤のみを示している。胸部Ｘ線は各群５ラットの代表である。
【図１４】図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ、図１４Ｅ及び図１４Ｆ。上段パネル：移植２週間後の（後面像）対照同系移植片肺、図１４Ａ、対照同種移植片肺、図１４Ｂ及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片肺、図１４Ｃの肉眼的解剖学。各パネルにおいて、左（Ｌ）肺は移植片肺であり、及び右（Ｒ）肺は自然肺である。対照同種移植片肺（パネルｂの「Ｌ」）は、自然肺と比較し、暗褐色の色であり、萎縮し、及び堅いコンシステンシーであった。しかしながら、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片肺（パネルｃ中の「Ｌ」）は同系移植片肺（パネルａ中「Ｌ」）の外観を有していた。対照同系移植片肺（図１４Ａ）は病態病変を示さず、正常ＷＫＹ肺と同一であった。写真は各群中の５ラットを代表している。下段パネル：移植２週間後の対照同系移植、図１４Ｄ、対照同種移植片、図１４Ｅ、及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片、図１４Ｆ、の組織学である。対照同系移植片は正常な気道及び血管構造を示す（図１４Ｄ）。対照同種移植片は、重度の拒絶反応と一致する広範な血管周囲、気管支周囲及び肺胞単核細胞浸潤を示す（図１４Ｅ）。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片は軽度から中程度のみの血管周囲、気管支周囲及び肺胞単核細胞浸潤を示す（図１４Ｆ）。顕微鏡写真は各群中の５匹のラットを代表している（１００ｘ倍率）。
【図１５】表３。拒絶病態を段階付けしており、表は移植拒絶について対照から動物モデルまでのデータを含む表である。
【図１６】ｃｏｌ（Ｖ）の経口投与によるドナー同種抗原に対するＤＴＨ応答の減少。移植２週間後の対照同種移植片レシピエント及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントの右耳介内に１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４脾細胞を、及び左耳介に等容積の希釈剤を暴露した。耳の厚さは、注射直前及び２４時間後に盲検様式で、マイクロメーターカリパー（Mitutoyo, Field Tool Supply, Chicago, 111.）で測定し、特異的耳膨潤を計算した。データは、各群中４匹のラットのｍｍｘ１０^−３での特異的耳介膨潤の平均±ＳＥＭで表されている（対照同種移植片と比較して^＊ｐ＜０．０２）。
【図１７】正常ＷＫＹラット、対照同種移植片レシピエント及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントの血清中のＴＧＦ−βレベル。血清中のＴＦＧ−βのレベルはＥＬＩＳＡにより決定された。データは、各群中４匹のラットの平均±ＳＥＭで表されている（対照同種移植片と比較して^＊ｐ＜０．０５）。
【図１８】ＴＧＦ−βの中和は、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントにおいてドナー同種抗原に対するＤＴＨ応答を回復する。肺移植２週間後、ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットは、５μｇのポリクローナル抗ＴＧＦ−β Ａｂ又は５μｇのポリクローナル抗ＩＬ−４又はＩＬ−１０Ａｂと混合された１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４脾細胞のＰＢＳ溶液を、右耳介内に受けた。左耳介は等容積の希釈剤プラス脾細胞を受け、対照部位として働いた。陰性対照のため、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片の別の群が、脾細胞とともに対照免疫グロブリンを右耳介内に、及び希釈剤プラス脾細胞を左耳介内に受けた。耳の厚さは、注射直前及び２４時間後に盲検様式で、マイクロメーターカリパーで測定し、以下に記載されるように特異的耳膨潤を計算した。ＳｐＩ、脾細胞。データは、各群中４匹のラットのｍｍｘ１０^−３での特異的耳介膨潤の平均±ＳＥＭで表されている［対照免疫グロブリンと混合した抗原を暴露したｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片と比較して^＊ｐ＜０．０３及びＴ；^†。‡ｐ＞０．０５］。対照同種移植片と比較した、抗ＴＦＧ−β、抗ＩＬ−４及び抗ＩＬ−１０によるｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片におけるｄＴＨ応答の回復は、それぞれ７５．７％、２４．３％及び３９．９％であった。
【図１９】移植１０週間後の、対照同種移植片レシピエントにおける、ドナー同種抗原、ｃｏｌ（ＩＩ）、ｃｏｌ（Ｖ）、ｃｏｌ（ＸＩ）及び第三者同種抗原に対するＤＴＨ応答。動物は、１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４脾細胞、第三者（ＢＮ）脾細胞又は１５μｇのｃｏｌ（ＩＩ）、ｃｏｌ（Ｖ）又はｃｏｌ（ＸＩ）を右耳介内に、希釈剤を左耳介に受けた。耳の厚さは、注射直前及び２４時間後に盲検様式で、マイクロメーターカリパーで測定し、以下に記載されるように特異的耳膨潤を計算した。ＳｐＩ、脾細胞。データは、各群中３匹のラットのｍｍｘ１０^−３での特異的耳介膨潤の平均±ＳＥＭで表されている［Ｆ３４４脾細胞又はｃｏｌ（Ｖ）を暴露した無処置ＷＫＹラットと比較して^＊ｐ＜０．０５］。
【図２０】混合白血球反応。種々の比のマイトマイシン−Ｃ−処理Ｆ３４４脾細胞（刺激物質）と、ｃｏｌ（Ｖ）を摂取させたＷＫＹラット（正常）又はＷＫＹラットからの３ｘ１０^５リンパ節Ｔリンパ球（応答物質）をインキュベートした。５日間のインキュベーションが完了する１８時間前、細胞を^３Ｈでパルスラベルし、増殖をチミジン取り込みの計数／分（ｃｐｍ）により決定した。刺激指数は、リンパ節リンパ球単独での増殖と比較した、種々の量の刺激物質により誘発されるリンパ節リンパ球の増殖の倍数に等しい。データは３回の実験を代表している。
【図２１】図２１Ａ、図２１Ｂ、図２１Ｃ及び図２１Ｄ。上段パネル：移植１０週後の、対照同種移植片肺、図２１Ａ、及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片肺、図２１Ｂ、の肉眼的解剖学。各パネル中、左（Ｌ）肺は移植片肺であり、及び右（Ｒ）は自然肺である。対照同種移植片肺は、自然肺と比較し、暗褐色の色であり、萎縮し、及び堅いコンシステンシーであった。しかしながら、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片肺はわずかに変色しているがほとんど正常外観を有していた。下段パネル：移植１０週後の対照同種移植、図２１Ｃ及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植、図２１Ｄ、の組織学。対照同種移植片は広範囲の間質単核細胞浸潤、線維症及びＢＯの病理学的病変である肉芽組織による小気道の閉塞を発生した。対照的に、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片は軽度急性拒絶の病態を記述する（グレードＡ２）間質性炎症がなく、軽度の肺胞性浸潤を有するのみであった。顕微鏡写真は各群中の５匹のラットを代表している。
【図２２】移植１０週後の、正常ＷＫＹラット、対照同種移植片レシピエント及びｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片レシピエントの血清中のＴＦＧ−βレベル。血清中のＴＦＧ−βのレベルはＥＬＩＳＡにより決定された。データは各群中の３匹のラットの平均±ＳＥＭを表している（対照同種移植片と比較して^＊ｐ＜０．０５）。
【図２３】ＤＴＨ応答におけるＴＧＦ−βの中和。ｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットは、５μｇのポリクローナルニワトリ抗ＴＧＦ−β Ａｂと混合された１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４脾細胞を右耳介内に、希釈剤を左耳介に受けた。陰性対照として、ｃｏｌ（Ｖ）摂取同種移植片の別の群が、５μｇの対照ニワトリトリ免疫グロブリン又は対照ヤギ免疫グロブリンと混合された１０^７照射（３０００ラド）ドナー由来Ｆ３４４脾細胞を右耳介内に、及び希釈剤を左耳介内に受けた。特異的耳膨潤は上記のように決定した。
【図２４】無処置及びｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットにおけるＢＳＡに対するＤＴＨ応答。無処置及びｃｏｌ（Ｖ）摂取ＷＫＹラットを、アジュバントに溶解した１００μｇのＢＳＡのｓ．ｃ．注射で刺激し、７日後、右耳介内へ２％熱凝集ＢＳＡ溶液及び左耳介内へ希釈剤を暴露した。耳の厚さは、注射直前及び２４時間後に盲検様式で、マイクロメーターカリパーで測定し、上記のように特異的耳膨潤を計算した。非刺激ＷＫＹラットが対照として働いた。データは、各群中４匹のラットのｍｍｘ１０^−３での特異的耳介膨潤の平均±ＳＥＭで表されている（非刺激無処置ＷＫＹラットと比較して^＊ｐ＜０．０１８、及び刺激ＷＫＹラットと比較して^†ｐ？０．０５）。
【図２５】表４は実施例６で使用された実験群の一覧表である。
【図２６】表５は実施例８に報告されている実験の結果の要旨である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺疾患を評価するための方法であって、
患者からサンプルを得ること；及び
前記患者の少なくとも一つの肺中に存在する少なくとも一つの型のコラーゲンに対する自己免疫の証拠について前記サンプルをアッセイすること：
の工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２】
前記コラーゲンが、Ｖ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンの少なくとも一つのエピトープ及びＶ型コラーゲンの少なくとも一つの抗原性断片から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記肺疾患が、特発性肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、急性呼吸不全症候群、二次膠原病性脈管疾患及び線維性肺疾患のいずれかの形態から成る群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が閉塞性細気管支炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アッセイする工程が、
Ｖ型コラーゲンの少なくとも一つの抗原性成分を提供すること；及び
前記サンプルの少なくとも一部と前記Ｖ型コラーゲンの少なくとも一つの抗原性成分toを接触させること：
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アッセイする工程がさらに、前記抗原性成分が前記Ｖ型コラーゲンの少なくとも一つの抗原性成分に対する少なくとも一つの抗体と相互作用した場合に生成されるシグナルをモニターすることを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
肺疾患を治療する方法であって、
肺中に存在する少なくとも一つの型のコラーゲンに対する自己免疫を有する患者を同定すること；
該自己免疫応答を抑制する少なくとも一つの化合物を提供すること；及び
前記患者に前記化合物の療法的有効量を投与すること：
の工程を含んでなる、前記方法。
【請求項８】
前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン及びＶＩ型コラーゲンから成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記コラーゲンがＶ型コラーゲンである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患が特発性肺線維症、成人呼吸窮迫症候群、急性呼吸促迫症候群、二次膠原病性脈管疾患、線維性肺疾患のいずれかの形態から成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物がシクロスポリン、免疫システム調節分子及び免疫システムの成分に対する抗体から成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記化合物が、Ｖ型コラーゲンの少なくとも一つの抗原性成分である、請求項７に記載の方法
【請求項１３】
前記化合物が、肺内点滴注入により患者に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物が経口摂取により患者に投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項１５】
移植された臓器組織を拒絶することについて、増加したリスクがある患者を同定する方法であって、
患者からサンプルを得ること；及び
肺中に存在する少なくとも一つの型のコラーゲンに対する自己免疫の証拠について前記サンプルをアッセイすること：
の工程を含んでなる、前記方法。
【請求項１６】
前記サンプルが、血液、血清、間質性肺液、痰、粘液、組織などから成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン及びＶＩ型コラーゲンから成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記コラーゲンがＶ型コラーゲンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
閉塞性細気管支炎（ＢＯＳ）を発生する、増加したリスクがある患者を同定する方法であって、
患者から血液のサンプルを得ること；及び
肺に観察されるコラーゲンの少なくとも一つの型に対する自己免疫反応の証拠について前記血液のサンプルをアッセイすること：
の工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２０】
前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン及びＶＩ型コラーゲンから成る群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記コラーゲンがＶ型コラーゲンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記試験が抗体に基づいたアッセイであり、前記アッセイが、
前記サンプルの少なくとも一部と、コラーゲンの少なくとも一つの抗原性成分に対する抗体に対する抗原とを接触させ；
前記抗原を、前記抗原に対する少なくとも一つの抗体に結合させること、ここで前記抗体は前記サンプル中に存在している；
前記サンプル中の前記抗体の、前記抗原への結合を示す少なくとも一つのシグナルをモニターすること：
の工程を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗原が、Ｖ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲンの抗原性成分及びＶ型コラーゲンの少なくとも一つの抗原性成分の抗原性類似体：から成る群より選択される、請求項１９に記載の方法
【請求項２４】
肺疾患を評価するためのキットであって、
Ｖ型コラーゲンの少なくとも一つの抗原性成分；及び
前記少なくとも一つの抗原性成分が少なくとも一つの抗Ｖ型抗体に結合した場合にシグナルを発生する少なくとも一つの部分：
を含んでなるキット。
【請求項２５】
前記キットがさらに表面を含み、前記表面は前記少なくとも一つの抗原性成分を結合するために適している、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記表面が、フィルター、ビーズ、プレート、膜、チップ、スライドなどから成る群より選択される物体の一部である、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記キットがさらに、レポーター分子、レポーター原子、キット中の抗原に結合された抗体に対する抗体、緩衝液、安定化剤、抗菌剤及びアジュバントから成るリストから選択される化合物の少なくとも一つを含む、請求項２４に記載のキット。

【図２】

【図３】

【図５】

【図７】

【図８】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図９Ｄ】

【図９Ｅ】

【図９Ｆ】

【図９Ｇ】

【図９Ｈ】

【図９Ｉ】

【図９Ｊ】

【図９Ｋ】

【図１０】

【図１２】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図１】

【図４】

【図６】

【図１１】

【図１３】

【図１４】

【図２１】

【公開番号】特開２０１２−１０８１３７（Ｐ２０１２−１０８１３７Ａ）
【公開日】平成２４年６月７日（２０１２．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−２８５６１７（Ｐ２０１１−２８５６１７）
【出願日】平成２３年１２月２７日（２０１１．１２．２７）
【分割の表示】特願２００８−５５０５４９（Ｐ２００８−５５０５４９）の分割
【原出願日】平成１９年１月１３日（２００７．１．１３）
【出願人】（３０１０４６７８７）インディアナ・ユニバーシティ・リサーチ・アンド・テクノロジー・コーポレーション (24)
【Ｆターム（参考）】