【課題】医薬品調製において又は診断的ツールとして使用されうる組み換え抗体の生産に適している、宿主細胞内で２又はそれ以上のタンパク質の発現を改善するための方法の提供。
【解決手段】２又はそれ以上のタンパク質をコードする２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットを前記細胞に与えることを含む方法において、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも２つが、少なくとも１つのSTAR配列を含む、２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を得るための方法であって、前記２又はそれ以上のタンパク質をコードする２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットを前記細胞に与えることを含む方法において、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも２つが、少なくとも１つの安定化抗リプレッサー（STabilizing Anti-Repressor:STAR）配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
２又はそれ以上のタンパク質の発現が所定の割合であるところの細胞を識別する方法であって、
−前記２又はそれ以上のタンパク質をコードする２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットを有する細胞のコレクションを用意すること、
−前記２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を選択すること、
−前記所定の割合で前記２又はそれ以上のタンパク質を発現する細胞を、得られた前記選択物から識別すること
を含む方法において、前記タンパク質発現ユニットの少なくとも２つが、少なくとも１つのSTAR配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項３】
２つのタンパク質が発現される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記所定の割合が、１：１である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記２又はそれ以上のタンパク質発現ユニットが、少なくとも２つの異なる選択マーカーをさらにコードし、及び前記方法が、前記細胞での２段階選択マーカースクリーニングをさらに含み、前記細胞が第１の選択マーカーの存在下で第１段階において選択され、そして第２の選択マーカーの存在下で第２段階において選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質発現ユニットの少なくとも１つが、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むモノシストロニックな遺伝子を含み、及び前記モノシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質発現ユニットの少なくとも１つが、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位と、選択マーカーとを含むビシストロニックな遺伝子を含み、及び前記ビシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質発現ユニットが、第２の選択マーカーをコードするオープンリーディングフレームを含むモノシストロニックな遺伝子をさらに含み、及び前記モノシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質発現ユニットの少なくとも１つが、少なくとも２つのSTAR配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも２つのSTAR配列を含む前記タンパク質発現ユニットは、前記タンパク質発現ユニットが少なくとも１つのSTAR配列によっていずれかの側で隣接されるように配置される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２つのSTAR配列が本質的に同一である、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記STAR配列が、表３及び／又は図６に表現され、及び／又はそれらの機能的等価体及び／又は機能的フラグメントである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記STAR配列がSTAR18である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
減少された翻訳効率を有する前記タンパク質翻訳開始部位が、内部リボソーム侵入部位（IRES：Internal Ribosome Entry Site）を含む、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質発現ユニットの夫々が、別々のDNAキャリアー上に存在する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記DNAキャリアーがベクターである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウィルスベクターが、アデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクターである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
目的の前記タンパク質のための前記タンパク質発現ユニットの１つが、イムノグロブリン重鎖をコードする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
目的の前記タンパク質のための前記タンパク質発現ユニットのもう１つが、イムノグロブリン軽鎖をコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数のタンパク質発現ユニットが、前記細胞内に同時に導入される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記機能プロモーターが、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、シミアンウイルス（SV40）プロモーター、ヒトユビキチンCプロモーター又はヒト伸長因子１−アルファ（EF1-α）プロモーターである、請求項６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
−目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームと、減少された翻訳効率を有するタンパク質翻訳開始部位と、選択マーカーとを含むビシストロニックな遺伝子と、ここで前記ビシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、
−少なくとも１つのSTAR配列と
を含むタンパク質発現ユニット。
【請求項２４】
第２の選択マーカーをコードするオープンリーディングフレームを含むモノシストロニックな遺伝子をさらに含み、前記モノシストロニックな遺伝子が、機能プロモーターの制御下にある、請求項２３に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項２５】
少なくとも２つのSTAR配列を含む、請求項２３又は請求項２４に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項２６】
少なくとも２つのSTAR配列を含む前記タンパク質発現ユニットは、前記タンパク質発現ユニットが少なくとも１つのSTAR配列によっていずれかの側で隣接されているように配置されている、請求項２５に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項２７】
前記STAR配列が本質的に同一である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項２８】
前記STAR配列が、表３及び／又は図６に表現され、及び／又はそれらの機能的等価体及び／又は機能的フラグメントである、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項２９】
前記STAR配列がSTAR18である、請求項２８に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３０】
減少された翻訳効率を有する前記タンパク質翻訳開始部位が、内部リボソーム侵入部位（IRES：Internal Ribosome Entry Site）を含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３１】
前記タンパク質発現ユニットがベクターである、請求項２３〜３０のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３２】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項３１に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３３】
前記ウィルスベクターが、アデノウィルスベクター又はレトロウィルスベクターである、請求項３２に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３４】
目的の前記タンパク質が、イムノグロブリン重鎖である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３５】
目的の前記タンパク質が、イムノグロブリン軽鎖である、請求項２３〜３３のいずれか一項に記載のタンパク質発現ユニット。
【請求項３６】
STARを含むタンパク質発現ユニットを備えられた細胞。
【請求項３７】
請求項２３〜３５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのタンパク質発現ユニットを含む細胞。
【請求項３８】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法に従い得られうる細胞。
【請求項３９】
請求項３８に記載の細胞から得られうるタンパク質。
【請求項４０】
多量体タンパク質である請求項３９に記載のタンパク質。
【請求項４１】
抗体である請求項４０に記載の多量体タンパク質。

【図１】

【図２】

【図３−Ａ】

【図３−Ｂ】

【図４】

【図５】

【図６−１】

【図６−２】

【図６−３】

【図６−４】

【図６−５】

【図６−６】

【図６−７】

【図６−８】

【図６−９】

【図６−１０】

【図６−１１】

【図６−１２】

【図６−１３】

【図６−１４】

【図６−１５】

【図６−１６】

【図６−１７】

【図６−１８】

【図６−１９】

【図６−２０】

【図６−２１】

【図６−２２】

【図６−２３】

【図６−２４】

【図６−２５】

【図６−２６】

【図６−２７】

【図６−２８】

【図６−２９】

【図６−３０】

【図６−３１】

【図６−３２】

【図６−３３】

【図６−３４】

【図６−３５】

【図６−３６】

【図６−３７】

【図６−３８】

【図６−３９】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【公開番号】特開２０１０−４８８６（Ｐ２０１０−４８８６Ａ）
【公開日】平成２２年１月１４日（２０１０．１．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８４７２７（Ｐ２００９−１８４７２７）
【出願日】平成２１年８月７日（２００９．８．７）
【分割の表示】特願２００４−５１３４９７（Ｐ２００４−５１３４９７）の分割
【原出願日】平成１５年６月１３日（２００３．６．１３）
【出願人】（５０４４６０４３０）クロマジェニックス　ビー．ブイ． (2)
【Ｆターム（参考）】