ＣＸＣＲ３はグリアジンレセプターである
グリアジンは、ＣＸＣＲ３に対する生理学的レセプターとして同定される。ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターを決定するためのアッセイが提供される。ＣＸＣＲ３シグナル伝達のインヒビターとして機能するグリアジンのフラグメントが、決定され得る。ＣＸＣＲ３を標的化することによって、グルテンに関する疾患および／または自己免疫に関する疾患を処置するための方法が提供される。このような疾患としては、セリアック病、グルテン感受性、グルテンアレルギー、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、免疫媒介性糖尿病または１型糖尿病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、および自己免疫性甲状腺疾患が挙げられる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国仮特許出願第６０／６５３，１１８号（２００５年２月１６日出願）および同第６０／７４１，９９８号（２００５年１２月２日出願）（これらの内容はともに、本明細書に具体的に参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、自己免疫疾患の分野に関する。特に、本発明は、自己免疫疾患の処置ならびに自己免疫疾患についての薬物スクリーニングおよび薬物発見に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
環境刺激（例えば、微生物およびグルテン）は、腸、脳、心臓、および他の器官においてゾヌリン放出を誘導する。ゾヌリン放出は、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）（エキソビボ）またはラクツロース／マンニトール試験（インビボ）における減少によって測定される場合に、上皮の透過性の増加を引き起こす。おそらく、環境刺激は、その細胞表面上のレセプターに結合することによって、細胞の表面と相互作用する。しかし、このようなレセプターは、同定されていない。
【０００４】
多くの炎症性疾患が自己免疫性であると考えられている。これらとしては、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、免疫媒介性糖尿病もしくは１型糖尿病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、および自己免疫性甲状腺疾患が挙げられる。長期の炎症は、しばしば、これらの疾患と関連するが、その炎症は、原発性の病理的傷害（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｓｕｌｔ）ではなく、続発症であると考えられている。
【０００５】
ＣＸＣＲ３は、Ｇタンパク質共役レセプターである。このレセプターは、３種類のケモカイン（ＩＰ１０（インターフェロン−γ誘導性１０ｋＤａタンパク質）、ＭＩＧ（インターフェロン−γによって誘導されるモノカイン）およびＩ−ＴＡＣ（インターフェロン誘導性Ｔ細胞α−化学誘引物質））に結合することが公知である。ＩＰ１０、ＭＩＧおよびＩ−ＴＡＣは、ＣＸＣ配列モチーフを含むので、ＣＸＣケモカインといわれている。ＣＸＣＲ３は、インテグリン活性化、細胞骨格変化、および走化性に関連づけられている。ＣＸＣＲ３は、顕著なことには、炎症を起こした組織において発現される。
【０００６】
自己免疫疾患をより有効に処置するための方法および自己免疫疾患を処置するに適した薬物を発見もしくは同定するための方法が、当該分野において継続して必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の一実施形態は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法を提供する。グリアジンもしくはグリアジンのフラグメント（例えば、少なくとも６個のアミノ酸残基を含むフラグメント）は、ＣＸＣＲ３と接触させられる。ＣＸＣＲ３に対するグリアジンもしくはグリアジンのフラグメントの結合が決定される。ＣＸＣＲ３に結合するグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして同定される。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法を提供する。グリアジンもしくは少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３を発現する第１の細胞およびＣＸＣＲ３を発現しない第２の細胞と接触させられる。第１の細胞もしくは第２の細胞に対するグリアジンもしくはフラグメントの結合が、決定される。上記第２の細胞と比較して上記第１の細胞に優先的に結合するグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして同定される。
【０００９】
本発明のなお別の実施形態は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法を提供する。グリアジンもしくは少なくとも６つのアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３もしくは別のＣＸＣＲ３リガンド（例えば、ＩＰ１０、ＭＩＧ、もしくはＩＴＡＣ）と接触させられる。上記グリアジンのフラグメントによって引き起こされるＣＸＣＲ３に対するリガンドの結合の阻害が決定される。ＣＸＣＲ３に対するリガンドの結合を阻害するグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして同定される。
【００１０】
本発明のなお別の局面は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法である。少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３もしくは別のＣＸＣＲ３リガンド（例えば、ＩＰ１０、ＭＩＧ、もしくはＩＴＡＣ）を発現する細胞と接触させられる。上記細胞に対するリガンドの結合が決定される。上記細胞に対するリガンドの結合を阻害するグリアジンのフラグメントは、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして同定される。
【００１１】
ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法もまた、本発明によって提供される。試験化合物が、ＣＸＣＲ３と接触させられる。ＣＸＣＲ３に対する上記試験化合物の結合が決定される。ＣＸＣＲ３に結合する試験化合物が、ゾヌリン放出のモジュレーターとして同定される。
【００１２】
本発明によって提供される別の実施形態は、ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法である。試験化合物が、ＣＸＣＲ３と接触させられる。試験化合物の存在下および非存在下でのＣＸＣＲ３に対する上記グリアジンの結合が、決定される。ＣＸＣＲ３に対するグリアジンの結合を阻害する試験化合物が、ゾヌリン放出のモジュレーターとして同定される。
【００１３】
本発明のなお別の実施形態は、ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法である。試験化合物は、ＣＸＣＲ３を発現する第１の細胞およびＣＸＣＲ３を発現しない第２の細胞と接触させられる。上記第１の細胞および第２の細胞に対する上記試験化合物の結合が決定される。上記第２の細胞と比較して上記第１の細胞に優先的に結合する試験化合物が、ゾヌリン放出のモジュレーターとして同定される。
【００１４】
なおさらなる実施形態は、ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングする方法である。試験化合物が、ＣＸＣＲ３を発現する細胞と接触させられる。上記細胞に対するグリアジンの結合が決定される。上記細胞に対するグリアジンの結合を阻害する試験化合物が、ゾヌリン放出のモジュレーターとして同定される。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、セリアック病、グルテンアレルギー、グルテン感受性、およびグルテン運動失調からなる群より選択される疾患を有する患者を処置するための方法である。ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体が、上記患者に投与される。ゾヌリン放出が、それによって阻害される。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、自己免疫疾患もしくは炎症関連疾患を有する患者を処置するための方法である。代表的には、これら疾患は、望ましくないＣＸＣＲ３シグナル伝達によって特徴付けられる。上記疾患は、１型糖尿病、セリアック病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、自閉症、疱疹状皮膚炎、ＩｇＡ腎症、原発性胆汁性肝硬変、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、グレーヴズ病、橋本病、および鬱からなる群より選択される。ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体は、上記患者に投与される。ＣＸＣＲ３シグナル伝達は、それによって阻害される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＸＣＲ３リガンドを同定するための方法を提供し、この方法は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞と、グリアジンもしくはそのフラグメントおよび試験されるべき化合物とを接触させる工程、ならびに上記細胞に結合したグリアジンもしくはそのフラグメントの量を決定する工程を包含する。例えば、１種以上のグリアジンもしくはそのフラグメントは、１種以上の蛍光部分で標識され得る。次いで、ＣＸＣＲ３発現細胞は、上記試験されるべき化合物の存在下で、上記蛍光標識されたグリアジンもしくはフラグメントと接触させられ得る。上記グリアジンもしくはそのフラグメントおよびＣＸＣＲ３の結合は、標準的技術を使用して決定され得る。適切な技術としては、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡、および蛍光分光光度法が挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、上記グリアジンもしくはそのフラグメントは、ＣＸＣＲ３発現細胞と、試験されるべき化合物の非存在下で接触させられ得る。そしてＣＸＣＲ３発現細胞に対するグリアジンもしくはそのフラグメントの量が決定され得る。試験されるべき化合物の存在下および試験されるべき化合物の非存在下での結合の量が、比較され得る。当業者に公知の他の技術が、上記グリアジンもしくはそのフラグメントの結合を提供するために使用され得る。例えば、ＣＸＣＲ３を発現する細胞は、固体表面（例えば、マイクロタイタープレートもしくはビーズ（例えば、磁性ビーズ）に固定され得、蛍光標識されたグリアジンもしくはそのフラグメントと接触させられ得る。結合した、蛍光標識されたグリアジンの量が、決定され得る。いくつかの実施形態において、グリアジンは、蛍光部分以外の検出可能な部分で（例えば、ビオチンもしくはジゴキシゲニンで）標識され得、適切な試薬（例えば、ストレプトアビジンもしくは抗ジゴキシゲニン抗体）で検出され得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＸＣＲ３リガンドを同定するための方法を提供し、この方法は、精製ＣＸＣＲ３もしくはそのフラグメントと、グリアジンもしくはそのフラグメントおよび試験されるべき化合物とを接触させる工程、ならびに上記ＣＸＣＲ３に結合したグリアジンもしくはそのフラグメントの量を決定する工程を包含する。例えば、１種以上のグリアジンもしくはそのフラグメントは、１種以上の蛍光部分で標識され得る。次いで、ＣＸＣＲ３は、蛍光標識されたグリアジンもしくはフラグメントと、上記試験されるべき化合物の存在下で接触させられ得る。上記グリアジンもしくはそのフラグメントおよびＣＸＣＲ３の結合は、標準的技術を使用して決定され得る。適切な技術としては、ＥＬＩＳＡおよび蛍光分光光度法が挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、上記グリアジンもしくはそのフラグメントは、試験されるべき化合物の非存在下でＣＸＣＲ３と接触させられ得る。そしてＣＸＣＲ３へのグリアジンもしくはそのフラグメントの結合の量が決定され得る。試験されるべき化合物の存在下での結合量および試験されるべき化合物の非存在下での結合量が、比較され得る。当業者に公知の他の技術が、上記グリアジンもしくはそのフラグメント結合を定量するために使用され得る。例えば、ＣＸＣＲ３は、固体表面（例えば、マイクロタイタープレートもしくはビーズ（例えば、磁性ビーズ））に固定され得、そして蛍光標識されたグリアジンもしくはそのフラグメントと接触させられ得る。結合した、蛍光標識されたグリアジンの量が、決定され得る。いくつかの実施形態において、グリアジンは、蛍光部分以外の検出可能な部分で（例えば、ビオチンもしくはジゴキシゲニンで）標識され得、適切な試薬（例えば、ストレプトアビジンもしくは抗ジゴキシゲニン抗体）で検出され得る。いくつかの実施形態において、グリアジンもしくはそのフラグメントは、固体支持体に結合され得、そして標識されたＣＸＣＲ３もしくはそのフラグメントが、試験されるべき化合物の存在下およびその非存在下で検出され得る。ＣＸＣＲ３は、当該分野で公知の任意の技術を用いて、例えば、グリアジンを標識および検出するための上記の技術を用いて、標識および検出され得る。
【００１９】
明細書を読めば当業者に明らかであるこれらおよび他の実施形態は、有用な治療剤についてスクリーニングする方法、ならびに自己免疫疾患および炎症関連疾患を処置するための方法を当該分野に提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ＣＸＣＲ３として公知のレセプターがグリアジンに対する生理学的レセプターであることを発見した。このレセプターは、グリアジンに結合するのみならず、ゾヌリンの放出および経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）における減少もまたシグナル伝達する。これらの下流効果は、グリアジンに対する結合が生理学的であることを示す。
【００２１】
ＣＸＣＲ３（ＣＸＲＣ３）シグナル伝達のモジュレーターについてのスクリーニングは、種々の技術によって達成され得る。試験化合物に対するＣＸＣＲ３の結合は、直接測定され得るか、または上記レセプターに対するグリアジンもしくは別のリガンドの結合の阻害が測定され得る。使用され得る他のリガンドとしては、ＩＰ１０、ＭＩＧ、およびＩＴＡＣが挙げられる。リガンドは、結合の測定を腰囲にするために標識され得る。アッセイは、無細胞系であってもよいし、細胞ベースの系であってもよい。いずれの結合アッセイ形式も使用され得る。その形式としては、上記レセプターが直接的または間接的かのいずれかで固体支持体に結合される形式が挙げられる。
【００２２】
試験され得る試験化合物は、任意の化合物である。上記化合物は、単一の化合物としてかまたは化合物の組み合わせにおいて試験され得る。上記化合物は、構造的に同定されていてもよいし、未知の構造のものであってもよい。上記化合物は、新規であってもよいし、以前から公知のものであってもよい。上記化合物は、天然産物であってもよいし、合成産物であってもよい。
【００２３】
本発明の一実施形態によれば、上記試験化合物は、グリアジンのフラグメントである。グリアジンは、コムギおよび他の穀類によって精製されるタンパク質のファミリーである。グリアジンの例は、グリアジンα、グリアジンγ、およびグリアジンωである。グリアジンは、種子中のアルコール水溶液可溶性貯蔵タンパク質（ａｑｕｅｏｕｓ ａｌｃｏｈｏｌ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。グリアジンの単一のクラス内ですら、大きな不均一性が存在する。少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１５個、２０個、３０個、３５個、５０個、または７５個のアミノ酸残基が、試験化合物としてのグリアジンのフラグメントにおいて使用され得る。フラグメントとしては、全長より短い任意の分子が挙げられる。フラグメントは、合成されてもよいし、例えば、タンパク質分解の結果であってもよい。以下の表は、代表的な多くのグリアジンの配列を提供する。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【００２９】
【表６】
【００３０】
【表７】
【００３１】
【表８】
【００３２】
【表９】
【００３３】
【表１０】
【００３４】
【表１１】
【００３５】
【表１２】
【００３６】
【表１３】
【００３７】
【表１４】
【００３８】
【表１５】
【００３９】
【表１６】
【００４０】
【表１７】
【００４１】
【表１８】
【００４２】
【表１９】
本発明の実施において使用され得るグリアジンのフラグメントとしては、表１のα−グリアジン配列のアミノ酸５７〜８９に対応する
【００４３】
【化１】
および野生型α−グリアジン配列の３２位のプロリンをロイシンに変異させた表１のα−グリアジン配列のアミノ酸３２〜４４位に対応する
【００４４】
【化２】
が挙げられるが、これらに限定されない。グリアジンの他の適切なフラグメントが、例えば、精製グリアジンをタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン、トリプシンまたはこれらの混合物）で消化し、ペプチドを単離することによって調製され得る。ペプチドは、当該分野で公知の任意の技術（例えば、逆送高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ））を使用して単離され得る。
【００４５】
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターは、インヒビター、エンハンサー、またはアゴニストであり得る。インヒビターは、炎症によって特徴付けられる疾患（自己免疫疾患が挙げられ、特に、セリアック病が挙げられる）を処置するために有用である。エンハンサーまたはアゴニストは、望ましい薬剤（例えば、最適に吸収されるよりも少ない治療剤）に対する組織の透過性を増大させるために使用され得る。
【００４６】
ＣＸＣＲ３に対する抗体は、その必要性のある患者への投与によって治療に役立ち得る。このような患者としては、グルテン関連疾患、ならびに炎症および自己免疫と関連する疾患を有する患者が挙げられる。投与は、抗体の投与のために当該分野で公知の任意の手段によってなされ得る。このような方法としては、静脈内投与、筋肉内投与、および皮下投与が挙げられるが、これらに限定されない。当該分野で公知の抗体の任意の形態が使用され得る。上記抗体は、ポリクローナルであってもよいし、モノクローナルであってもよい。これらは、例えば、ヒト化抗体であってもよいし、ヒト抗体であってもよいし、キメラ抗体であってもよいし、組換え抗体であってもよい。上記抗体は、いずれのアイソタイプであってもよい。上記抗体は、単鎖抗体であってもよいし、抗体のフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２であってもよい。
【００４７】
ＣＸＣＲ３によるシグナル伝達は、当該分野で公知の任意の手段によって測定され得る。決定され得るシグナル伝達事象としては、ＴＥＥＲにおける減少、ゾヌリン放出における増加、小グリア細胞の漸増、チロシンキナーゼリン酸化および走化性、ならびにＭＭＰ−２における増加および細胞馴化培地におけるＭＭＰ−９ゼラチン分解活性（ｇｅｌａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の増加が挙げられる。
【００４８】
本発明は、ＣＸＣＲ３−リガンド相互作用のレベルにおいて活性な、薬剤、化合物またはリード化合物について同定するための方法を提供する。一般に、本発明のスクリーニング方法は、ＣＸＣＲ３およびリガンド（例えば、グリアジンもしくはそのフラグメント）の相互作用を調節する化合物についてアッセイする工程を包含する。結合する薬剤についての広範に種々のアッセイが提供され、標識されたインビトロでのタンパク質−リガンド結合アッセイ、細胞ベースのアッセイ、イムノアッセイなどが挙げられる。広範に種々の形式（共免疫沈降、２−ハイブリッドトランス活性化、蛍光の偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、ＮＭＲ、蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）、転写活性化などが挙げられる）が使用され得る。例えば、広範に種々のＮＭＲベースの方法が、タンパク質標的に対する結合について低分子化合物のライブラリーをスクリーニングするために利用可能である（Ｈａｊｄｕｋ，Ｐ．Ｊ．ら． Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９９９．３２（３）：２１１−４０）。いくつかの実施形態において、本発明の方法は自動化されていてもよいし（例えば、ハイスループットスクリーニング）、リード化合物について化学ライブラリーをスクリーニングするために使用されてもよい。同定された化合物は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達に関する疾患（例えば、自己免疫疾患）を処置するために使用され得る。本発明の方法によって同定される化合物は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達を調節するためにさらに最適化され得る（例えば、誘導体化され得る）。スクリーニングおよび誘導体化を複数回反復することは、ＣＸＣＲ３シグナル伝達の調節を最適化するために採用され得る。
【００４９】
インビトロでのリガンド結合アッセイは、ＣＸＣＲ３またはそのフラグメントとリガンド（例えば、グリアジンもしくはそのフラグメント）とを含む成分の混合物を使用する。ＣＸＣＲ３および／またはグリアジンは、（例えば、６−Ｈｉｓのような精製タグとの）融合タンパク質として提供され得る。アッセイ混合物は、代表的には、ＣＸＣＲ３調節活性について試験されるべき化合物をさらに含む。試験されるべき化合物は、当業者に公知のあらゆる種の化合物であり得る（例えば、有機化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物およびこれらの混合物であり得る）。種々の他の試薬がまた、上記混合物中に含まれ得る。これらの試薬としては、塩、緩衝液、中性的なタンパク質（ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、アルブミン）、界面活性剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
一般に、アッセイ混合物は、試験されるべき化合物の存在を除いて、ＣＸＣＲ３が、基準結合親和性で（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）リガンド（例えば、グリアジンもしくはそのフラグメント）に特異的に結合する条件下でインキュベートされ得る。この混合物成分は、必須の結合を提供する任意の順番で添加され得る。そしてインキュベーションは、最適な結合を容易にする任意の温度で行われ得る。インキュベーション期間は、同様に、最適な結合のために選択される。いくつかの実施形態において、インキュベーション期間は、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最小限にされ得る。
【００５１】
インキュベーション後、ＣＸＣＲ３−リガンド結合に対して試験されるべき化合物の効果は、任意の都合のよい方法によって検出され得る。例えば、ＣＸＣＲ３またはリガンドが固定され得る。そして他のものは標識され得る；次いで、固相形式において、任意の種々の方法が、標識の性質および他のアッセイ成分に依存して、上記標識を（例えば、光学密度もしくは電子密度、放射線放出、非放射性エネルギー転移などを介して）検出するために使用され得るか、または抗体結合体などで間接的に検出され得る。
【００５２】
試験されるべき化合物の存在下での結合親和性を比較した場合の、試験されるべき化合物の非存在下でのＣＸＣＲ３およびリガンドの結合親和性における差異は、上記化合物が上記リガンドに対するＣＸＣＲ３の結合を調節することを示す。本明細書において使用される場合、差異は、統計的に有意であり、好ましくは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の差異を示す。
【００５３】
上記の開示は、一般に、本発明を記載している。本明細書において開示される全ての参考文献は、例示的に参考として援用される。より完全な理解は、例示目的のみであって、本発明の範囲を限定することを意図しない、本明細書において提供される以下の具体的な実施例を参照することによって得られ得る。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
グリアジンによって活性化される推定レセプターを同定するために、本発明者らは、グリアジンアフィニティーカラムを使用して、実験を行った。このカラムを通して、腸細胞溶解物を負荷した。本発明者らは、段階的塩勾配を用いてタンパク質を溶出した。これらの明らかなタンパク質バンドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で、分子量９７ｋＤａ、９０ｋＤａ、および８３ｋＤａを有することが認められた。認められたタンパク質は、０．２Ｍおよび０．３ＭのＮａＣｌで上記アフィニティーカラムから溶出された。上記カラムに結合したタンパク質の質量分析により、ＮＣＢＩ配列データベースにおいてＸＰ＿１２５４２９であると同定された（表２０を参照のこと）。この配列は、ＣＸＣＲ３レセプターの前駆体を含み、グリアジンによって結合されるタンパク質のうちの１つとしてＣＸＣＲ３レセプターを意味する（図４を参照のこと）。
【００５５】
【表２０】
ヒトＣＸＣＲ３は、３６８アミノ酸残基および予測分子量４０，４５９を有する。ヒトＣＸＣＲ３およびマウスＣＸＣＲ３の配列は、以下の表において提供される。
【００５６】
【表２１−１】
【００５７】
【表２１−２】
ＣＸＣＲ３は、炎症に関連するサイトカインであるＳＣＹＢ９、ＳＣＹＢ１０、およびＳＣＹＢ１１（ＭＩＧ、ＩＰ１０、およびＩＴＡＣとしても公知）のレセプターとして機能することが公知のＧタンパク質共役レセプターである。このレセプターはまた、ＣＤ１８３、ＧＰＲ９、ＣＫＲ−Ｌ２として同定されている。このレセプターのアミノ酸配列は、配列番号２３として示される。ヒトの改変体（例えば、Ｒ２９２ＱおよびＡ３６３Ｔ多型）は公知である（配列番号２２を参照のこと）。
【００５８】
（方法）
本発明者らは、α−グリアジン（Ｄｏｎａｌｄ Ｄ．Ｋａｓａｒｄａ博士から供与）をＣａｒｂｏｘｙＬｉｎｋＴＭ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）カップリングゲルに連結して、アフィニティーカラムを形成した。
【００５９】
本発明者らは、プロテアーゼインヒビターおよび標準的なプロトコルを使用してヒト腸粘膜を調製した。
【００６０】
使用され得る１つのプロトコルは、以下の工程を包含する：組織を緩衝液Ｄ（２０ｍｍｏｌ・Ｌ−１ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍｍｏｌ・Ｌ−１ ＥＤＴＡ、２５０ｍｍｏｌ・Ｌ−１ スクロース、ｐＨ７．５）で洗浄し、緩衝液Ｅ（５ｍｇ・Ｌ−１ ロイペプチン、２ｍｇ・Ｌ−１ アプロチニン、１ｍｇ・Ｌ−１ ペプスタチン、１０ｍｇ・Ｌ−１ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む緩衝液Ｄ）中でホモジナイズし、５０００×ｇで４℃において１０分間遠心分離する。上清を、１２０００×ｇで、４℃において４５分間遠心分離する。沈殿物を廃棄し、上清を３００００×ｇで、４℃においてさらに９０分間遠心分離する。沈殿物を、５ｇ・Ｌ−１ ３［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）を含む緩衝液Ｅ中で溶解し、５分ごとに穏やかに混合しながら、氷上に６０分間静置する。
【００６１】
（実施例２）
腸断片を、正常マウスから単離し、マイクロスナップセルに載せ、グリアジン反応に曝して、ゾヌリンを放出させる。図１Ａ。ゾヌリン放出後、その腸透過性は増大する。このことは、粘膜バリア機能の喪失を示唆する。図１Ｂ。このいわゆる「グルテン効果」は、このタンパク質が腸の表面（内腔側）に添加されたときのみ検出可能である。このことは、グリアジンが腸細胞刷子縁上に存在するレセプターと相互作用することを示唆する。
【００６２】
ＣＸＣＲ３が、ゾヌリンを放出するために活性化される必要があるグリアジン標的レセプターであるという仮定を確認するために、ＣＸＣＲ３ノックアウトマウスモデルを使用して実験を行った。腸組織を、これらの動物から単離し、マイクロスナップウェル系に載せ、グリアジンに曝したところ、ゾヌリンを放出しなかった。結果的に、腸透過性における変化は検出されなかった。図２および図３。これらの結果は、ＣＸＣＲ３がゾヌリン放出に関与するグリアジン標的レセプターであるという仮定を確証する。
【００６３】
「マイクロスナップウェル系」、すなわち、分極モデル（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｍｏｄｅｌ）は、ヒト腸生検材料を使用して腸のバリア機能を研究するために使用される。この系は、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することによって、内視鏡による空腸生検材料の腸透過性を評価する。
【００６４】
（実施例３）
ＣＸＣＲ３でトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を使用するインビトロ実験を、免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡によって、そのレセプターへのグリアジン結合を研究するために行った。このインビトロでのＩＦ実験は、ＣＸＣＲ３でトランスフェクトした細胞上でグリアジンが結合するが、ベクター単独でトランスフェクトした細胞上には結合しないことを示した。
【００６５】
図６において示されるように、ＣＸＣＲ３を発現するベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂで特異的に標識した。このヒトＣＸＣＲ３配列を、ＣＭＶｌ１プロモーターの制御下でｐｃ ＤＮＡ ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入した。赤い線は、抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂ（６Ｂにおいて矢印で印がつけられている）で得た結果を示し、青い線は、ＩｇＧ１アイソタイプコントロールで得られた結果を示す。図６Ａは、ベクター単独でのコントロールトランスフェクションを示す一方、図６Ｂは、ＣＸＣＲ３を発現するベクターで得られた結果を示す。ベクター単独では、ＣＸＣＲ３発現は４．４２％（平均１１．９（図６Ａ））であった。対照的に、ＣＸＣＲ３を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞では、ＣＸＣＲ３発現は６１．７８％（平均９５．５）であった。
【００６６】
ＣＸＣＲ３を発現するベクターでトランスフェクトした細胞を蛍光標識されたグリアジンと接触させた場合、このグリアジンは、その細胞に結合したが、ＣＸＣＲ３を発現しないコントロール細胞には結合しなかった。よって、ＰＴ−グリアジンは、ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞においてＣＸＣＲ３と共局在する。図７において、核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色し、ＣＸＣＲ３を、ＲＩＴＣ標識モノクローナル抗体（赤色）で染色し、ＰＴ−グリアジンを、ＦＩＴＣ（緑色）で染色した。パネルＡは、コントロールベクターでトランスフェクトした細胞での核染色のみを示す。パネルＢは、ＣＸＣＲ３を発現するベクターでトランスフェクトし、ＣＸＣＲ３に特異的なＲＩＴＣ標識モノクローナル抗体と接触させた細胞の外側での染色を示す。パネルＢにおける細胞をＦＩＴＣ標識グリアジンと接触させた場合、このグリアジンは、ＣＸＣＲ３と共局在した。
【００６７】
（実施例４）
最後に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上の同時刺激マーカーの発現を、正常被験体および自己免疫（セリアック病および１型糖尿病）に罹患した患者の両方において研究した。グリアジンに曝した自己免疫性患者由来のＰＢＭＣは、同時刺激マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびにＤＲの増大した発現を示した。ＤＲ発現の刺激（他のマーカーのではなく）は、特異的抗体を使用してＣＸＣＲ３レセプターをブロックすることによって阻止した。図８は、正常ボランティア由来の樹状細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現に対するＰＴ−グリアジンの効果がＣＸＣＲ３依存性であることを示す。
【００６８】
同時刺激マーカーを測定するために使用される抗体は、全て市販されており、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入：ＣＤ８０ Ｒ−フィコエリトリン（ｒ−ＰＥ）結合マウス抗ヒトモノクローナル抗体（ＣＤ８０ ｒ−ＰＥ，ｃａｔ．ｎｏ．５５７２２７）、ＣＤ４０およびＣＤ８６フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合マウス抗ヒトモノクローナル抗体（ＣＤ４０ ＦＩＴＣ，ｃａｔ．ｎｏ．５５５５８８；ＣＤ８６ ＦＩＴＣ，ｃａｔ．ｎｏ ５５５６５７）、ＨＬＡ−ＤＲ ＰＥ−ｃｙ５結合マウス抗ヒトモノクローナル抗体（ＨＬＡ−ＤＲ−ｃｙ５，ｃａｔ．ｎｏ．５５５８１３）。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入：アロフィコシアニン結合マウスモノクローナル抗ヒトＣＸＣＲ３（ＣＸＣＲ３ ＡＰＣ，ｃａｔ．ｎｏ ＦＡＢ １６０Ａ）。ブロッキング研究のために使用される抗体は、以下の通りであった：モノクローナル抗ヒトＣＸＣＲ３抗体（ｃａｔ．ｎｏ．ＭＡＢ １６０）およびマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（ｃａｔ．ｎｏ．ＭＡＢ００２）。
【００６９】
（実施例５）
グリアジン曝露に応じたゾヌリン放出および腸経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の変化を測定するためのエキソビボ実験を、マイクロスナップウェルチャンバに載せたマウス小腸を使用して行った。このエキソビボ実験を、マイクロスナップセルに載せたＣＸＣＲ３ノックアウト（ＫＯ）およびＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウス両方の腸組織において行った。ＰＴ−グリアジンに曝した場合、ＷＴマウス（ｎ＝１０）から得た腸セグメントは、ゾヌリンを放出し（０．３３±０．０６ 対 ０．６１±０．１３ ｎｇ／ｍｇ タンパク質（それぞれ、ベースライン 対 グリアジン曝露後；ｐ＜０．０４、図９Ｂを参照のこと）、そして有意なＴＥＥＲ減少（２４．１±４．５Ω／ｃｍ２ 対 １４．７±３．２（それぞれ、ベースライン 対 ｐｏｓｔ−グリアジン曝露後；ｐ＜０．０２、図９Ａを参照のこと））を示した。逆に言えば、ＰＴ−グリアジンに曝したＣＸＣＲ３ ＫＯマウス（ｎ＝１８）から得た腸セグメントは、ゾヌリンを放出せず（０．５６±０．１５ 対 ０．４５±０．１３ｎｇ／ｍｇ タンパク質（それぞれ、ベースライン 対 グリアジン曝露後；ｐ＝Ｎ．Ｓ．、図１０Ｂを参照のこと）、何らＴＥＥＲの変化を示さなかった（２０．０±４．８Ω／ｃｍ２ 対 １６．５±４．９（それぞれ、ベースライン 対 グリアジン曝露後；ｐ Ｎ．Ｓ．、図１０Ａを参照のこと）。
【００７０】
ここで本発明を理解しやすくするために、例示および実施例によってある程度詳細に十分に記載してきたが、本発明の範囲にも具体的な実施形態にも何ら影響を及ぼすことなく、条件、処方および他のパラメーターの広くかつ等価な範囲内で本発明を改変もしくは変更することによって、本発明が実施され得ること、ならびにこのような改変もしくは変更が添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図されることは、当業者にとって明らかである。本願明細書において言及された全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明の分野の当業者の技術水準を示し、各々個々の刊行物、特許または特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されることを示されたのと同程度にまで、本明細書に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、マイクロスナップウェル（ｍｉｃｒｏｓｎａｐｗｅｌｌ）に中の野生型マウス由来の空腸断片をグリアジンでチャレンジした場合の結果を示す。図１Ａは、チャレンジ後に放出されたゾヌリンの量を示す。グリアジンチャレンジは、放出されるゾヌリンの増加を生じる。図１Ｂは、チャレンジ後の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を示す。グリアジンチャレンジは、ＴＥＥＲにおける減少を生じる。
【図２】図２は、ＣＸＣＲ３欠損マウス由来の内視鏡による空腸生検材料のグリアジンチャレンジ後に放出されたゾヌリンを示す。グリアジンチャレンジは、ゾヌリン放出をもたらさなかった。図１Ａと比較のこと。
【図３】図３は、ＣＸＣＲ３欠損マウスからの内視鏡による空腸生検材料のグリアジンチャレンジ後のＴＥＥＲを示す。グリアジンチャレンジは、ＴＥＥＲを減少させなかった。図１Ｂと比較のこと。
【図４】図４は、タンパク質データベース検索に従って、グリアジンアフィニティーカラムに結合したタンパク質（ＣＸＣＲ３である）の結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、グリアジンでチャレンジしたＢ６野生型マウスのゾヌリンレベルとＴＥＥＲを示し、図５Ｂは、グリアジンでチャレンジしたＣＸＣＲ３ノックアウトマウス（ｎ＝２０）のゾヌリンレベルとＴＥＥＲを示す。上記ＣＸＣＲ３ノックアウトマウスは、グリアジンに応答せず、ゾヌリンを放出しない。よって、腸透過性における増加を示さない。対照的に、野生型コホートは、グリアジンに応答し、ゾヌリンを放出する。従って、腸透過性における増加を示す。
【図５Ｂ】図５Ａは、グリアジンでチャレンジしたＢ６野生型マウスのゾヌリンレベルとＴＥＥＲを示し、図５Ｂは、グリアジンでチャレンジしたＣＸＣＲ３ノックアウトマウス（ｎ＝２０）のゾヌリンレベルとＴＥＥＲを示す。上記ＣＸＣＲ３ノックアウトマウスは、グリアジンに応答せず、ゾヌリンを放出しない。よって、腸透過性における増加を示さない。対照的に、野生型コホートは、グリアジンに応答し、ゾヌリンを放出する。従って、腸透過性における増加を示す。
【図６】図６は、抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂ（赤色の線）およびＩｇＧ１アイソタイプコントロール（青色の線）でプローブしたＣＸＣＲ３トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。図６Ａは、ベクターでトランスフェクトした細胞を示す。図６Ｂは、ＣＸＣＲ３を発現するベクターでトランスフェクトした細胞を示す。
【図７】図７は、ＤＡＰＩ（青色）、ＲＩＴＣ標識抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体（赤色）、およびＦＩＴＣ標識ＰＴ−グリアジン（緑色）でプローブした、トランスフェクトされた細胞の蛍光顕微鏡検査の結果を示す。パネルＡは、コントロールベクターでトランスフェクトしかつＤＡＰＩおよび抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体でプローブした細胞を示し、パネルＢは、ＣＸＣＲ３発現ベクターでトランスフェクトしかつ抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体でプローブした細胞を示し、パネルＣは、ＣＸＣＲ３発現ベクターでトランスフェクトしかつ抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識ＰＴ−グリアジンでプローブした細胞を示す。
【図８】図８は、正常ボランティア由来の樹状細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現に対する、ペプシンおよびトリプシンで消化したグリアジン（ＰＴ−グリアジン）の効果の結果を示す。
【図９】図９は、Ｂｌａｃｋ ６野生型マウス小腸におけるＴＥＥＲとゾヌリン放出に対するＰＴ−グリアジンの効果を示す。図９Ａは、スナップウェル中で行われたＴＥＥＲ測定を示し、図９Ｂは、ゾヌリン濃度を示す。
【図１０】図１０は、ＣＸＣＲ３ノックアウトマウス由来の小腸上でのＴＥＥＲとゾヌリン放出に対するＰＴ−グリアジンの効果を示す。図１０Ａは、スナップウェル中で行われたＴＥＥＲ測定を示し、図１０Ｂは、ゾヌリン濃度を示す。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本願は、米国仮特許出願第６０／６５３，１１８号（２００５年２月１６日出願）および同第６０／７４１，９９８号（２００５年１２月２日出願）（これらの内容はともに、本明細書に具体的に参考として援用される）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の技術分野）
本発明は、自己免疫疾患の分野に関する。特に、本発明は、自己免疫疾患の処置ならびに自己免疫疾患についての薬物スクリーニングおよび薬物発見に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
環境刺激（例えば、微生物およびグルテン）は、腸、脳、心臓、および他の器官においてゾヌリン放出を誘導する。ゾヌリン放出は、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）（エキソビボ）またはラクツロース／マンニトール試験（インビボ）における減少によって測定される場合に、上皮の透過性の増加を引き起こす。おそらく、環境刺激は、その細胞表面上のレセプターに結合することによって、細胞の表面と相互作用する。しかし、このようなレセプターは、同定されていない。
【０００４】
多くの炎症性疾患が自己免疫性であると考えられている。これらとしては、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、免疫媒介性糖尿病もしくは１型糖尿病、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、乾癬、強皮症、および自己免疫性甲状腺疾患が挙げられる。長期の炎症は、しばしば、これらの疾患と関連するが、その炎症は、原発性の病理的傷害（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｓｕｌｔ）ではなく、続発症であると考えられている。
【０００５】
ＣＸＣＲ３は、Ｇタンパク質共役レセプターである。このレセプターは、３種類のケモカイン（ＩＰ１０（インターフェロン−γ誘導性１０ｋＤａタンパク質）、ＭＩＧ（インターフェロン−γによって誘導されるモノカイン）およびＩ−ＴＡＣ（インターフェロン誘導性Ｔ細胞α−化学誘引物質））に結合することが公知である。ＩＰ１０、ＭＩＧおよびＩ−ＴＡＣは、ＣＸＣ配列モチーフを含むので、ＣＸＣケモカインといわれている。ＣＸＣＲ３は、インテグリン活性化、細胞骨格変化、および走化性に関連づけられている。ＣＸＣＲ３は、顕著なことには、炎症を起こした組織において発現される。
【０００６】
自己免疫疾患をより有効に処置するための方法および自己免疫疾患を処置するに適した薬物を発見もしくは同定するための方法が、当該分野において継続して必要とされている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の一実施形態は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法を提供する。グリアジンもしくはグリアジンのフラグメント（例えば、少なくとも６個のアミノ酸残基を含むフラグメント）は、ＣＸＣＲ３と接触させられる。ＣＸＣＲ３に対するグリアジンもしくはグリアジンのフラグメントの結合が決定される。ＣＸＣＲ３に結合するグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして同定される。
【０００８】
本発明の別の実施形態は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法を提供する。グリアジンもしくは少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３を発現する第１の細胞およびＣＸＣＲ３を発現しない第２の細胞と接触させられる。第１の細胞もしくは第２の細胞に対するグリアジンもしくはフラグメントの結合が、決定される。上記第２の細胞と比較して上記第１の細胞に優先的に結合するグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして同定される。
【０００９】
本発明のなお別の実施形態は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法を提供する。グリアジンもしくは少なくとも６つのアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３もしくは別のＣＸＣＲ３リガンド（例えば、ＩＰ１０、ＭＩＧ、もしくはＩＴＡＣ）と接触させられる。上記グリアジンのフラグメントによって引き起こされるＣＸＣＲ３に対するリガンドの結合の阻害が決定される。ＣＸＣＲ３に対するリガンドの結合を阻害するグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして同定される。
【００１０】
本発明のなお別の局面は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法である。少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントが、ＣＸＣＲ３もしくは別のＣＸＣＲ３リガンド（例えば、ＩＰ１０、ＭＩＧ、もしくはＩＴＡＣ）を発現する細胞と接触させられる。上記細胞に対するリガンドの結合が決定される。上記細胞に対するリガンドの結合を阻害するグリアジンのフラグメントは、ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして同定される。
【００１１】
ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法もまた、本発明によって提供される。試験化合物が、ＣＸＣＲ３と接触させられる。ＣＸＣＲ３に対する上記試験化合物の結合が決定される。ＣＸＣＲ３に結合する試験化合物が、ゾヌリン放出のモジュレーターとして同定される。
【００１２】
本発明によって提供される別の実施形態は、ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法である。試験化合物が、ＣＸＣＲ３と接触させられる。試験化合物の存在下および非存在下でのＣＸＣＲ３に対する上記グリアジンの結合が、決定される。ＣＸＣＲ３に対するグリアジンの結合を阻害する試験化合物が、ゾヌリン放出のモジュレーターとして同定される。
【００１３】
本発明のなお別の実施形態は、ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法である。試験化合物は、ＣＸＣＲ３を発現する第１の細胞およびＣＸＣＲ３を発現しない第２の細胞と接触させられる。上記第１の細胞および第２の細胞に対する上記試験化合物の結合が決定される。上記第２の細胞と比較して上記第１の細胞に優先的に結合する試験化合物が、ゾヌリン放出のモジュレーターとして同定される。
【００１４】
なおさらなる実施形態は、ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングする方法である。試験化合物が、ＣＸＣＲ３を発現する細胞と接触させられる。上記細胞に対するグリアジンの結合が決定される。上記細胞に対するグリアジンの結合を阻害する試験化合物が、ゾヌリン放出のモジュレーターとして同定される。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、セリアック病、グルテンアレルギー、グルテン感受性、およびグルテン運動失調からなる群より選択される疾患を有する患者を処置するための方法である。ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体が、上記患者に投与される。ゾヌリン放出が、それによって阻害される。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態は、自己免疫疾患もしくは炎症関連疾患を有する患者を処置するための方法である。代表的には、これら疾患は、望ましくないＣＸＣＲ３シグナル伝達によって特徴付けられる。上記疾患は、１型糖尿病、セリアック病、自己免疫性肝炎、多発性硬化症、自閉症、疱疹状皮膚炎、ＩｇＡ腎症、原発性胆汁性肝硬変、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、グレーヴズ病、橋本病、および鬱からなる群より選択される。ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体は、上記患者に投与される。ＣＸＣＲ３シグナル伝達は、それによって阻害される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＸＣＲ３リガンドを同定するための方法を提供し、この方法は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞と、グリアジンもしくはそのフラグメントおよび試験されるべき化合物とを接触させる工程、ならびに上記細胞に結合したグリアジンもしくはそのフラグメントの量を決定する工程を包含する。例えば、１種以上のグリアジンもしくはそのフラグメントは、１種以上の蛍光部分で標識され得る。次いで、ＣＸＣＲ３発現細胞は、上記試験されるべき化合物の存在下で、上記蛍光標識されたグリアジンもしくはフラグメントと接触させられ得る。上記グリアジンもしくはそのフラグメントおよびＣＸＣＲ３の結合は、標準的技術を使用して決定され得る。適切な技術としては、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡、および蛍光分光光度法が挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、上記グリアジンもしくはそのフラグメントは、ＣＸＣＲ３発現細胞と、試験されるべき化合物の非存在下で接触させられ得る。そしてＣＸＣＲ３発現細胞に対するグリアジンもしくはそのフラグメントの量が決定され得る。試験されるべき化合物の存在下および試験されるべき化合物の非存在下での結合の量が、比較され得る。当業者に公知の他の技術が、上記グリアジンもしくはそのフラグメントの結合を提供するために使用され得る。例えば、ＣＸＣＲ３を発現する細胞は、固体表面（例えば、マイクロタイタープレートもしくはビーズ（例えば、磁性ビーズ）に固定され得、蛍光標識されたグリアジンもしくはそのフラグメントと接触させられ得る。結合した、蛍光標識されたグリアジンの量が、決定され得る。いくつかの実施形態において、グリアジンは、蛍光部分以外の検出可能な部分で（例えば、ビオチンもしくはジゴキシゲニンで）標識され得、適切な試薬（例えば、ストレプトアビジンもしくは抗ジゴキシゲニン抗体）で検出され得る。
【００１８】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＣＸＣＲ３リガンドを同定するための方法を提供し、この方法は、精製ＣＸＣＲ３もしくはそのフラグメントと、グリアジンもしくはそのフラグメントおよび試験されるべき化合物とを接触させる工程、ならびに上記ＣＸＣＲ３に結合したグリアジンもしくはそのフラグメントの量を決定する工程を包含する。例えば、１種以上のグリアジンもしくはそのフラグメントは、１種以上の蛍光部分で標識され得る。次いで、ＣＸＣＲ３は、蛍光標識されたグリアジンもしくはフラグメントと、上記試験されるべき化合物の存在下で接触させられ得る。上記グリアジンもしくはそのフラグメントおよびＣＸＣＲ３の結合は、標準的技術を使用して決定され得る。適切な技術としては、ＥＬＩＳＡおよび蛍光分光光度法が挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、上記グリアジンもしくはそのフラグメントは、試験されるべき化合物の非存在下でＣＸＣＲ３と接触させられ得る。そしてＣＸＣＲ３へのグリアジンもしくはそのフラグメントの結合の量が決定され得る。試験されるべき化合物の存在下での結合量および試験されるべき化合物の非存在下での結合量が、比較され得る。当業者に公知の他の技術が、上記グリアジンもしくはそのフラグメント結合を定量するために使用され得る。例えば、ＣＸＣＲ３は、固体表面（例えば、マイクロタイタープレートもしくはビーズ（例えば、磁性ビーズ））に固定され得、そして蛍光標識されたグリアジンもしくはそのフラグメントと接触させられ得る。結合した、蛍光標識されたグリアジンの量が、決定され得る。いくつかの実施形態において、グリアジンは、蛍光部分以外の検出可能な部分で（例えば、ビオチンもしくはジゴキシゲニンで）標識され得、適切な試薬（例えば、ストレプトアビジンもしくは抗ジゴキシゲニン抗体）で検出され得る。いくつかの実施形態において、グリアジンもしくはそのフラグメントは、固体支持体に結合され得、そして標識されたＣＸＣＲ３もしくはそのフラグメントが、試験されるべき化合物の存在下およびその非存在下で検出され得る。ＣＸＣＲ３は、当該分野で公知の任意の技術を用いて、例えば、グリアジンを標識および検出するための上記の技術を用いて、標識および検出され得る。
【００１９】
明細書を読めば当業者に明らかであるこれらおよび他の実施形態は、有用な治療剤についてスクリーニングする方法、ならびに自己免疫疾患および炎症関連疾患を処置するための方法を当該分野に提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ＣＸＣＲ３として公知のレセプターがグリアジンに対する生理学的レセプターであることを発見した。このレセプターは、グリアジンに結合するのみならず、ゾヌリンの放出および経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）における減少もまたシグナル伝達する。これらの下流効果は、グリアジンに対する結合が生理学的であることを示す。
【００２１】
ＣＸＣＲ３（ＣＸＲＣ３）シグナル伝達のモジュレーターについてのスクリーニングは、種々の技術によって達成され得る。試験化合物に対するＣＸＣＲ３の結合は、直接測定され得るか、または上記レセプターに対するグリアジンもしくは別のリガンドの結合の阻害が測定され得る。使用され得る他のリガンドとしては、ＩＰ１０、ＭＩＧ、およびＩＴＡＣが挙げられる。リガンドは、結合の測定を腰囲にするために標識され得る。アッセイは、無細胞系であってもよいし、細胞ベースの系であってもよい。いずれの結合アッセイ形式も使用され得る。その形式としては、上記レセプターが直接的または間接的かのいずれかで固体支持体に結合される形式が挙げられる。
【００２２】
試験され得る試験化合物は、任意の化合物である。上記化合物は、単一の化合物としてかまたは化合物の組み合わせにおいて試験され得る。上記化合物は、構造的に同定されていてもよいし、未知の構造のものであってもよい。上記化合物は、新規であってもよいし、以前から公知のものであってもよい。上記化合物は、天然産物であってもよいし、合成産物であってもよい。
【００２３】
本発明の一実施形態によれば、上記試験化合物は、グリアジンのフラグメントである。グリアジンは、コムギおよび他の穀類によって精製されるタンパク質のファミリーである。グリアジンの例は、グリアジンα、グリアジンγ、およびグリアジンωである。グリアジンは、種子中のアルコール水溶液可溶性貯蔵タンパク質（ａｑｕｅｏｕｓ ａｌｃｏｈｏｌ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｔｏｒａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。グリアジンの単一のクラス内ですら、大きな不均一性が存在する。少なくとも６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１５個、２０個、３０個、３５個、５０個、または７５個のアミノ酸残基が、試験化合物としてのグリアジンのフラグメントにおいて使用され得る。フラグメントとしては、全長より短い任意の分子が挙げられる。フラグメントは、合成されてもよいし、例えば、タンパク質分解の結果であってもよい。以下の表は、代表的な多くのグリアジンの配列を提供する。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【００２９】
【表６】
【００３０】
【表７】
【００３１】
【表８】
【００３２】
【表９】
【００３３】
【表１０】
【００３４】
【表１１】
【００３５】
【表１２】
【００３６】
【表１３】
【００３７】
【表１４】
【００３８】
【表１５】
【００３９】
【表１６】
【００４０】
【表１７】
【００４１】
【表１８】
【００４２】
【表１９】
本発明の実施において使用され得るグリアジンのフラグメントとしては、表１のα−グリアジン配列のアミノ酸５７〜８９に対応する
【００４３】
【化１】
および野生型α−グリアジン配列の３２位のプロリンをロイシンに変異させた表１のα−グリアジン配列のアミノ酸３２〜４４位に対応する
【００４４】
【化２】
が挙げられるが、これらに限定されない。グリアジンの他の適切なフラグメントが、例えば、精製グリアジンをタンパク質分解酵素（例えば、ペプシン、トリプシンまたはこれらの混合物）で消化し、ペプチドを単離することによって調製され得る。ペプチドは、当該分野で公知の任意の技術（例えば、逆送高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ））を使用して単離され得る。
【００４５】
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターは、インヒビター、エンハンサー、またはアゴニストであり得る。インヒビターは、炎症によって特徴付けられる疾患（自己免疫疾患が挙げられ、特に、セリアック病が挙げられる）を処置するために有用である。エンハンサーまたはアゴニストは、望ましい薬剤（例えば、最適に吸収されるよりも少ない治療剤）に対する組織の透過性を増大させるために使用され得る。
【００４６】
ＣＸＣＲ３に対する抗体は、その必要性のある患者への投与によって治療に役立ち得る。このような患者としては、グルテン関連疾患、ならびに炎症および自己免疫と関連する疾患を有する患者が挙げられる。投与は、抗体の投与のために当該分野で公知の任意の手段によってなされ得る。このような方法としては、静脈内投与、筋肉内投与、および皮下投与が挙げられるが、これらに限定されない。当該分野で公知の抗体の任意の形態が使用され得る。上記抗体は、ポリクローナルであってもよいし、モノクローナルであってもよい。これらは、例えば、ヒト化抗体であってもよいし、ヒト抗体であってもよいし、キメラ抗体であってもよいし、組換え抗体であってもよい。上記抗体は、いずれのアイソタイプであってもよい。上記抗体は、単鎖抗体であってもよいし、抗体のフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２であってもよい。
【００４７】
ＣＸＣＲ３によるシグナル伝達は、当該分野で公知の任意の手段によって測定され得る。決定され得るシグナル伝達事象としては、ＴＥＥＲにおける減少、ゾヌリン放出における増加、小グリア細胞の漸増、チロシンキナーゼリン酸化および走化性、ならびにＭＭＰ−２における増加および細胞馴化培地におけるＭＭＰ−９ゼラチン分解活性（ｇｅｌａｔｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）の増加が挙げられる。
【００４８】
本発明は、ＣＸＣＲ３−リガンド相互作用のレベルにおいて活性な、薬剤、化合物またはリード化合物について同定するための方法を提供する。一般に、本発明のスクリーニング方法は、ＣＸＣＲ３およびリガンド（例えば、グリアジンもしくはそのフラグメント）の相互作用を調節する化合物についてアッセイする工程を包含する。結合する薬剤についての広範に種々のアッセイが提供され、標識されたインビトロでのタンパク質−リガンド結合アッセイ、細胞ベースのアッセイ、イムノアッセイなどが挙げられる。広範に種々の形式（共免疫沈降、２−ハイブリッドトランス活性化、蛍光の偏光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、ＮＭＲ、蛍光共鳴エネルギー転移（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＦＲＥＴ）、転写活性化などが挙げられる）が使用され得る。例えば、広範に種々のＮＭＲベースの方法が、タンパク質標的に対する結合について低分子化合物のライブラリーをスクリーニングするために利用可能である（Ｈａｊｄｕｋ，Ｐ．Ｊ．ら． Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９９９．３２（３）：２１１−４０）。いくつかの実施形態において、本発明の方法は自動化されていてもよいし（例えば、ハイスループットスクリーニング）、リード化合物について化学ライブラリーをスクリーニングするために使用されてもよい。同定された化合物は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達に関する疾患（例えば、自己免疫疾患）を処置するために使用され得る。本発明の方法によって同定される化合物は、ＣＸＣＲ３シグナル伝達を調節するためにさらに最適化され得る（例えば、誘導体化され得る）。スクリーニングおよび誘導体化を複数回反復することは、ＣＸＣＲ３シグナル伝達の調節を最適化するために採用され得る。
【００４９】
インビトロでのリガンド結合アッセイは、ＣＸＣＲ３またはそのフラグメントとリガンド（例えば、グリアジンもしくはそのフラグメント）とを含む成分の混合物を使用する。ＣＸＣＲ３および／またはグリアジンは、（例えば、６−Ｈｉｓのような精製タグとの）融合タンパク質として提供され得る。アッセイ混合物は、代表的には、ＣＸＣＲ３調節活性について試験されるべき化合物をさらに含む。試験されるべき化合物は、当業者に公知のあらゆる種の化合物であり得る（例えば、有機化合物、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物およびこれらの混合物であり得る）。種々の他の試薬がまた、上記混合物中に含まれ得る。これらの試薬としては、塩、緩衝液、中性的なタンパク質（ｎｅｕｔｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）（例えば、アルブミン）、界面活性剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗菌剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
一般に、アッセイ混合物は、試験されるべき化合物の存在を除いて、ＣＸＣＲ３が、基準結合親和性で（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ）リガンド（例えば、グリアジンもしくはそのフラグメント）に特異的に結合する条件下でインキュベートされ得る。この混合物成分は、必須の結合を提供する任意の順番で添加され得る。そしてインキュベーションは、最適な結合を容易にする任意の温度で行われ得る。インキュベーション期間は、同様に、最適な結合のために選択される。いくつかの実施形態において、インキュベーション期間は、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最小限にされ得る。
【００５１】
インキュベーション後、ＣＸＣＲ３−リガンド結合に対して試験されるべき化合物の効果は、任意の都合のよい方法によって検出され得る。例えば、ＣＸＣＲ３またはリガンドが固定され得る。そして他のものは標識され得る；次いで、固相形式において、任意の種々の方法が、標識の性質および他のアッセイ成分に依存して、上記標識を（例えば、光学密度もしくは電子密度、放射線放出、非放射性エネルギー転移などを介して）検出するために使用され得るか、または抗体結合体などで間接的に検出され得る。
【００５２】
試験されるべき化合物の存在下での結合親和性を比較した場合の、試験されるべき化合物の非存在下でのＣＸＣＲ３およびリガンドの結合親和性における差異は、上記化合物が上記リガンドに対するＣＸＣＲ３の結合を調節することを示す。本明細書において使用される場合、差異は、統計的に有意であり、好ましくは、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％の差異を示す。
【００５３】
上記の開示は、一般に、本発明を記載している。本明細書において開示される全ての参考文献は、例示的に参考として援用される。より完全な理解は、例示目的のみであって、本発明の範囲を限定することを意図しない、本明細書において提供される以下の具体的な実施例を参照することによって得られ得る。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
グリアジンによって活性化される推定レセプターを同定するために、本発明者らは、グリアジンアフィニティーカラムを使用して、実験を行った。このカラムを通して、腸細胞溶解物を負荷した。本発明者らは、段階的塩勾配を用いてタンパク質を溶出した。これらの明らかなタンパク質バンドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で、分子量９７ｋＤａ、９０ｋＤａ、および８３ｋＤａを有することが認められた。認められたタンパク質は、０．２Ｍおよび０．３ＭのＮａＣｌで上記アフィニティーカラムから溶出された。上記カラムに結合したタンパク質の質量分析により、ＮＣＢＩ配列データベースにおいてＸＰ＿１２５４２９であると同定された（表２０を参照のこと）。この配列は、ＣＸＣＲ３レセプターの前駆体を含み、グリアジンによって結合されるタンパク質のうちの１つとしてＣＸＣＲ３レセプターを意味する（図４を参照のこと）。
【００５５】
【表２０】
ヒトＣＸＣＲ３は、３６８アミノ酸残基および予測分子量４０，４５９を有する。ヒトＣＸＣＲ３およびマウスＣＸＣＲ３の配列は、以下の表において提供される。
【００５６】
【表２１−１】
【００５７】
【表２１−２】
ＣＸＣＲ３は、炎症に関連するサイトカインであるＳＣＹＢ９、ＳＣＹＢ１０、およびＳＣＹＢ１１（ＭＩＧ、ＩＰ１０、およびＩＴＡＣとしても公知）のレセプターとして機能することが公知のＧタンパク質共役レセプターである。このレセプターはまた、ＣＤ１８３、ＧＰＲ９、ＣＫＲ−Ｌ２として同定されている。このレセプターのアミノ酸配列は、配列番号２３として示される。ヒトの改変体（例えば、Ｒ２９２ＱおよびＡ３６３Ｔ多型）は公知である（配列番号２２を参照のこと）。
【００５８】
（方法）
本発明者らは、α−グリアジン（Ｄｏｎａｌｄ Ｄ．Ｋａｓａｒｄａ博士から供与）をＣａｒｂｏｘｙＬｉｎｋＴＭ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）カップリングゲルに連結して、アフィニティーカラムを形成した。
【００５９】
本発明者らは、プロテアーゼインヒビターおよび標準的なプロトコルを使用してヒト腸粘膜を調製した。
【００６０】
使用され得る１つのプロトコルは、以下の工程を包含する：組織を緩衝液Ｄ（２０ｍｍｏｌ・Ｌ−１ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍｍｏｌ・Ｌ−１ ＥＤＴＡ、２５０ｍｍｏｌ・Ｌ−１ スクロース、ｐＨ７．５）で洗浄し、緩衝液Ｅ（５ｍｇ・Ｌ−１ ロイペプチン、２ｍｇ・Ｌ−１ アプロチニン、１ｍｇ・Ｌ−１ ペプスタチン、１０ｍｇ・Ｌ−１ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含む緩衝液Ｄ）中でホモジナイズし、５０００×ｇで４℃において１０分間遠心分離する。上清を、１２０００×ｇで、４℃において４５分間遠心分離する。沈殿物を廃棄し、上清を３００００×ｇで、４℃においてさらに９０分間遠心分離する。沈殿物を、５ｇ・Ｌ−１ ３［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）を含む緩衝液Ｅ中で溶解し、５分ごとに穏やかに混合しながら、氷上に６０分間静置する。
【００６１】
（実施例２）
腸断片を、正常マウスから単離し、マイクロスナップセルに載せ、グリアジン反応に曝して、ゾヌリンを放出させる。図１Ａ。ゾヌリン放出後、その腸透過性は増大する。このことは、粘膜バリア機能の喪失を示唆する。図１Ｂ。このいわゆる「グルテン効果」は、このタンパク質が腸の表面（内腔側）に添加されたときのみ検出可能である。このことは、グリアジンが腸細胞刷子縁上に存在するレセプターと相互作用することを示唆する。
【００６２】
ＣＸＣＲ３が、ゾヌリンを放出するために活性化される必要があるグリアジン標的レセプターであるという仮定を確認するために、ＣＸＣＲ３ノックアウトマウスモデルを使用して実験を行った。腸組織を、これらの動物から単離し、マイクロスナップウェル系に載せ、グリアジンに曝したところ、ゾヌリンを放出しなかった。結果的に、腸透過性における変化は検出されなかった。図２および図３。これらの結果は、ＣＸＣＲ３がゾヌリン放出に関与するグリアジン標的レセプターであるという仮定を確証する。
【００６３】
「マイクロスナップウェル系」、すなわち、分極モデル（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｍｏｄｅｌ）は、ヒト腸生検材料を使用して腸のバリア機能を研究するために使用される。この系は、経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を測定することによって、内視鏡による空腸生検材料の腸透過性を評価する。
【００６４】
（実施例３）
ＣＸＣＲ３でトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を使用するインビトロ実験を、免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡によって、そのレセプターへのグリアジン結合を研究するために行った。このインビトロでのＩＦ実験は、ＣＸＣＲ３でトランスフェクトした細胞上でグリアジンが結合するが、ベクター単独でトランスフェクトした細胞上には結合しないことを示した。
【００６５】
図６において示されるように、ＣＸＣＲ３を発現するベクターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を、抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂで特異的に標識した。このヒトＣＸＣＲ３配列を、ＣＭＶｌ１プロモーターの制御下でｐｃ ＤＮＡ ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に挿入した。赤い線は、抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂ（６Ｂにおいて矢印で印がつけられている）で得た結果を示し、青い線は、ＩｇＧ１アイソタイプコントロールで得られた結果を示す。図６Ａは、ベクター単独でのコントロールトランスフェクションを示す一方、図６Ｂは、ＣＸＣＲ３を発現するベクターで得られた結果を示す。ベクター単独では、ＣＸＣＲ３発現は４．４２％（平均１１．９（図６Ａ））であった。対照的に、ＣＸＣＲ３を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞では、ＣＸＣＲ３発現は６１．７８％（平均９５．５）であった。
【００６６】
ＣＸＣＲ３を発現するベクターでトランスフェクトした細胞を蛍光標識されたグリアジンと接触させた場合、このグリアジンは、その細胞に結合したが、ＣＸＣＲ３を発現しないコントロール細胞には結合しなかった。よって、ＰＴ−グリアジンは、ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞においてＣＸＣＲ３と共局在する。図７において、核を、ＤＡＰＩ（青色）で染色し、ＣＸＣＲ３を、ＲＩＴＣ標識モノクローナル抗体（赤色）で染色し、ＰＴ−グリアジンを、ＦＩＴＣ（緑色）で染色した。パネルＡは、コントロールベクターでトランスフェクトした細胞での核染色のみを示す。パネルＢは、ＣＸＣＲ３を発現するベクターでトランスフェクトし、ＣＸＣＲ３に特異的なＲＩＴＣ標識モノクローナル抗体と接触させた細胞の外側での染色を示す。パネルＢにおける細胞をＦＩＴＣ標識グリアジンと接触させた場合、このグリアジンは、ＣＸＣＲ３と共局在した。
【００６７】
（実施例４）
最後に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上の同時刺激マーカーの発現を、正常被験体および自己免疫（セリアック病および１型糖尿病）に罹患した患者の両方において研究した。グリアジンに曝した自己免疫性患者由来のＰＢＭＣは、同時刺激マーカーＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびにＤＲの増大した発現を示した。ＤＲ発現の刺激（他のマーカーのではなく）は、特異的抗体を使用してＣＸＣＲ３レセプターをブロックすることによって阻止した。図８は、正常ボランティア由来の樹状細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現に対するＰＴ−グリアジンの効果がＣＸＣＲ３依存性であることを示す。
【００６８】
同時刺激マーカーを測定するために使用される抗体は、全て市販されており、ＢＤ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入：ＣＤ８０ Ｒ−フィコエリトリン（ｒ−ＰＥ）結合マウス抗ヒトモノクローナル抗体（ＣＤ８０ ｒ−ＰＥ，ｃａｔ．ｎｏ．５５７２２７）、ＣＤ４０およびＣＤ８６フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合マウス抗ヒトモノクローナル抗体（ＣＤ４０ ＦＩＴＣ，ｃａｔ．ｎｏ．５５５５８８；ＣＤ８６ ＦＩＴＣ，ｃａｔ．ｎｏ ５５５６５７）、ＨＬＡ−ＤＲ ＰＥ−ｃｙ５結合マウス抗ヒトモノクローナル抗体（ＨＬＡ−ＤＲ−ｃｙ５，ｃａｔ．ｎｏ．５５５８１３）。Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入：アロフィコシアニン結合マウスモノクローナル抗ヒトＣＸＣＲ３（ＣＸＣＲ３ ＡＰＣ，ｃａｔ．ｎｏ ＦＡＢ １６０Ａ）。ブロッキング研究のために使用される抗体は、以下の通りであった：モノクローナル抗ヒトＣＸＣＲ３抗体（ｃａｔ．ｎｏ．ＭＡＢ １６０）およびマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール（ｃａｔ．ｎｏ．ＭＡＢ００２）。
【００６９】
（実施例５）
グリアジン曝露に応じたゾヌリン放出および腸経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）の変化を測定するためのエキソビボ実験を、マイクロスナップウェルチャンバに載せたマウス小腸を使用して行った。このエキソビボ実験を、マイクロスナップセルに載せたＣＸＣＲ３ノックアウト（ＫＯ）およびＣ５７ＢＬ／６野生型（ＷＴ）マウス両方の腸組織において行った。ＰＴ−グリアジンに曝した場合、ＷＴマウス（ｎ＝１０）から得た腸セグメントは、ゾヌリンを放出し（０．３３±０．０６ 対 ０．６１±０．１３ ｎｇ／ｍｇ タンパク質（それぞれ、ベースライン 対 グリアジン曝露後；ｐ＜０．０４、図９Ｂを参照のこと）、そして有意なＴＥＥＲ減少（２４．１±４．５Ω／ｃｍ２ 対 １４．７±３．２（それぞれ、ベースライン 対 ｐｏｓｔ−グリアジン曝露後；ｐ＜０．０２、図９Ａを参照のこと））を示した。逆に言えば、ＰＴ−グリアジンに曝したＣＸＣＲ３ ＫＯマウス（ｎ＝１８）から得た腸セグメントは、ゾヌリンを放出せず（０．５６±０．１５ 対 ０．４５±０．１３ｎｇ／ｍｇ タンパク質（それぞれ、ベースライン 対 グリアジン曝露後；ｐ＝Ｎ．Ｓ．、図１０Ｂを参照のこと）、何らＴＥＥＲの変化を示さなかった（２０．０±４．８Ω／ｃｍ２ 対 １６．５±４．９（それぞれ、ベースライン 対 グリアジン曝露後；ｐ Ｎ．Ｓ．、図１０Ａを参照のこと）。
【００７０】
ここで本発明を理解しやすくするために、例示および実施例によってある程度詳細に十分に記載してきたが、本発明の範囲にも具体的な実施形態にも何ら影響を及ぼすことなく、条件、処方および他のパラメーターの広くかつ等価な範囲内で本発明を改変もしくは変更することによって、本発明が実施され得ること、ならびにこのような改変もしくは変更が添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることが意図されることは、当業者にとって明らかである。本願明細書において言及された全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明の分野の当業者の技術水準を示し、各々個々の刊行物、特許または特許出願が具体的にかつ個々に参考として援用されることを示されたのと同程度にまで、本明細書に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、マイクロスナップウェル（ｍｉｃｒｏｓｎａｐｗｅｌｌ）に中の野生型マウス由来の空腸断片をグリアジンでチャレンジした場合の結果を示す。図１Ａは、チャレンジ後に放出されたゾヌリンの量を示す。グリアジンチャレンジは、放出されるゾヌリンの増加を生じる。図１Ｂは、チャレンジ後の経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）を示す。グリアジンチャレンジは、ＴＥＥＲにおける減少を生じる。
【図２】図２は、ＣＸＣＲ３欠損マウス由来の内視鏡による空腸生検材料のグリアジンチャレンジ後に放出されたゾヌリンを示す。グリアジンチャレンジは、ゾヌリン放出をもたらさなかった。図１Ａと比較のこと。
【図３】図３は、ＣＸＣＲ３欠損マウスからの内視鏡による空腸生検材料のグリアジンチャレンジ後のＴＥＥＲを示す。グリアジンチャレンジは、ＴＥＥＲを減少させなかった。図１Ｂと比較のこと。
【図４】図４は、タンパク質データベース検索に従って、グリアジンアフィニティーカラムに結合したタンパク質（ＣＸＣＲ３である）の結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、グリアジンでチャレンジしたＢ６野生型マウスのゾヌリンレベルとＴＥＥＲを示し、図５Ｂは、グリアジンでチャレンジしたＣＸＣＲ３ノックアウトマウス（ｎ＝２０）のゾヌリンレベルとＴＥＥＲを示す。上記ＣＸＣＲ３ノックアウトマウスは、グリアジンに応答せず、ゾヌリンを放出しない。よって、腸透過性における増加を示さない。対照的に、野生型コホートは、グリアジンに応答し、ゾヌリンを放出する。従って、腸透過性における増加を示す。
【図５Ｂ】図５Ａは、グリアジンでチャレンジしたＢ６野生型マウスのゾヌリンレベルとＴＥＥＲを示し、図５Ｂは、グリアジンでチャレンジしたＣＸＣＲ３ノックアウトマウス（ｎ＝２０）のゾヌリンレベルとＴＥＥＲを示す。上記ＣＸＣＲ３ノックアウトマウスは、グリアジンに応答せず、ゾヌリンを放出しない。よって、腸透過性における増加を示さない。対照的に、野生型コホートは、グリアジンに応答し、ゾヌリンを放出する。従って、腸透過性における増加を示す。
【図６】図６は、抗ＣＸＣＲ３ ｍＡｂ（赤色の線）およびＩｇＧ１アイソタイプコントロール（青色の線）でプローブしたＣＸＣＲ３トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の結果を示す。図６Ａは、ベクターでトランスフェクトした細胞を示す。図６Ｂは、ＣＸＣＲ３を発現するベクターでトランスフェクトした細胞を示す。
【図７】図７は、ＤＡＰＩ（青色）、ＲＩＴＣ標識抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体（赤色）、およびＦＩＴＣ標識ＰＴ−グリアジン（緑色）でプローブした、トランスフェクトされた細胞の蛍光顕微鏡検査の結果を示す。パネルＡは、コントロールベクターでトランスフェクトしかつＤＡＰＩおよび抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体でプローブした細胞を示し、パネルＢは、ＣＸＣＲ３発現ベクターでトランスフェクトしかつ抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体でプローブした細胞を示し、パネルＣは、ＣＸＣＲ３発現ベクターでトランスフェクトしかつ抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体およびＦＩＴＣ標識ＰＴ−グリアジンでプローブした細胞を示す。
【図８】図８は、正常ボランティア由来の樹状細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現に対する、ペプシンおよびトリプシンで消化したグリアジン（ＰＴ−グリアジン）の効果の結果を示す。
【図９】図９は、Ｂｌａｃｋ ６野生型マウス小腸におけるＴＥＥＲとゾヌリン放出に対するＰＴ−グリアジンの効果を示す。図９Ａは、スナップウェル中で行われたＴＥＥＲ測定を示し、図９Ｂは、ゾヌリン濃度を示す。
【図１０】図１０は、ＣＸＣＲ３ノックアウトマウス由来の小腸上でのＴＥＥＲとゾヌリン放出に対するＰＴ−グリアジンの効果を示す。図１０Ａは、スナップウェル中で行われたＴＥＥＲ測定を示し、図１０Ｂは、ゾヌリン濃度を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
グリアジンもしくは少なくとも６つのアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントと、ＣＸＣＲ３とを接触させる工程；
ＣＸＣＲ３に対する該グリアジンのフラグメントの結合を決定する工程；
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして、ＣＸＣＲ３に結合するグリアジンのフラグメントを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記フラグメントは、少なくとも７個のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フラグメントは、少なくとも８個のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フラグメントは、少なくとも９個のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記フラグメントは合成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フラグメントは、タンパク質分解生成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
グリアジンもしくは少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントと、ＣＸＣＲ３を発現する第１の細胞およびＣＸＣＲ３を発現しない第２の細胞とを接触させる工程；
該第１の細胞および該第２の細胞に対する該グリアジンのフラグメントの結合を決定する工程；
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして、該第２の細胞と比較して該第１の細胞に優先的に結合するグリアジンのフラグメントを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記フラグメントは、少なくとも７個のアミノ酸残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記フラグメントは、少なくとも８個のアミノ酸残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記フラグメントは、少なくとも９個のアミノ酸残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記フラグメントは合成されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記フラグメントは、タンパク質分解生成物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
グリアジンもしくは少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントと、グリアジン、ＩＰ１０、ＭＩＧまたはＩＴＡＣからなる群より選択されるリガンドの存在下で、ＣＸＣＲ３とを接触させる工程；
該グリアジンのフラグメントによって引き起こされるＣＸＣＲ３に対する該リガンドの結合の阻害を決定する工程；
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして、ＣＸＣＲ３に対する該リガンドの結合を阻害するグリアジンのフラグメントを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記フラグメントは、少なくとも７個のアミノ酸残基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記フラグメントは、少なくとも８個のアミノ酸残基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記フラグメントは、少なくとも９個のアミノ酸残基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸残基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記フラグメントは合成されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記フラグメントは、タンパク質分解生成物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
グリアジン、ＩＰ１０、ＭＩＧ、またはＩＴＡＣからなる群より選択されるリガンドの存在下で、グリアジンもしくは少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントと、ＣＸＣＲ３を発現する細胞とを接触させる工程；
該細胞に対する該リガンドの結合を決定する工程；
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして、該細胞に対する該リガンドの結合を阻害するグリアジンのフラグメントを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記フラグメントは、少なくとも７個のアミノ酸残基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記フラグメントは、少なくとも８個のアミノ酸残基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記フラグメントは、少なくとも９個のアミノ酸残基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸残基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記フラグメントは合成されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記フラグメントは、タンパク質分解生成物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
試験化合物と、ＣＸＣＲ３とを接触する工程；
ＣＸＣＲ３に対する該試験化合物の結合を決定する工程；
ゾヌリン放出のモジュレーターとして、ＣＸＣＲ３に結合する試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記試験化合物は、少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
試験化合物と、ＣＸＣＲ３とを接触させる工程；
該試験化合物の存在下および非存在下で、ＣＸＣＲ３に対するグリアジンもしくはグリアジンのフラグメントの結合を決定する工程；
ゾヌリン放出のモジュレーターとして、ＣＸＣＲ３に対する該グリアジンもしくはグリアジンのフラグメントの結合を阻害する試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記試験化合物は、少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
試験化合物と、ＣＸＣＲ３を発現する第１の細胞およびＣＸＣＲ３を発現しない第２の細胞とを接触させる工程；
該第１の細胞および第２の細胞に対する該試験化合物の結合を決定する工程；
ゾヌリン放出のモジュレーターとして、該第２の細胞と比較して該第１の細胞に優先的に結合する試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記試験化合物は、少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
試験化合物と、ＣＸＣＲ３を発現する細胞とを接触させる工程；
該細胞に対するグリアジンもしくは少なくとも６個のアミノ酸を含むグリアジンのフラグメントの結合を決定する工程；
ゾヌリン放出のモジュレーターとして、該細胞に対するグリアジンもしくはフラグメントの結合を阻害する試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記試験化合物は、少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
セリアック病を有する患者を処置するための方法であって、以下：
ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体を該患者に投与し、それによって、ゾヌリン放出が阻害される工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
望ましくないＣＸＣＲ３シグナル伝達によって特徴付けられる疾患を有する患者を処置するための方法であって、以下：
ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体を該患者に投与し、それによって、ＣＸＣＲ３シグナル伝達が阻害される工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記疾患は糖尿病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患は自己免疫性肝炎である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患は多発性硬化症である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患は自閉症である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患はグルテンアレルギーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患は疱疹状皮膚炎である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患は全身性エリテマトーデスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患はグレーヴズ病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患は橋本病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患は鬱である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患はグルテン運動失調である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患は胆汁性肝硬変である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患は慢性関節リウマチである、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患はＩｇＡ腎症である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５３】
グルテン感受性を有する患者を処置するための方法であって、以下：
ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体を該患者に投与し、それによって、ゾヌリン放出が阻害される工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項３７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体はポリクローナル抗体である、請求項３７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
グリアジンもしくは少なくとも６つのアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントと、ＣＸＣＲ３とを接触させる工程；
ＣＸＣＲ３に対する該グリアジンのフラグメントの結合を決定する工程；
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして、ＣＸＣＲ３に結合するグリアジンのフラグメントを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記フラグメントは、少なくとも７個のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フラグメントは、少なくとも８個のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記フラグメントは、少なくとも９個のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸残基である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記フラグメントは合成されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記フラグメントは、タンパク質分解生成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
グリアジンもしくは少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントと、ＣＸＣＲ３を発現する第１の細胞およびＣＸＣＲ３を発現しない第２の細胞とを接触させる工程；
該第１の細胞および該第２の細胞に対する該グリアジンのフラグメントの結合を決定する工程；
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして、該第２の細胞と比較して該第１の細胞に優先的に結合するグリアジンのフラグメントを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項９】
前記フラグメントは、少なくとも７個のアミノ酸残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記フラグメントは、少なくとも８個のアミノ酸残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記フラグメントは、少なくとも９個のアミノ酸残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記フラグメントは合成されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記フラグメントは、タンパク質分解生成物である、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
グリアジンもしくは少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントと、グリアジン、ＩＰ１０、ＭＩＧまたはＩＴＡＣからなる群より選択されるリガンドの存在下で、ＣＸＣＲ３とを接触させる工程；
該グリアジンのフラグメントによって引き起こされるＣＸＣＲ３に対する該リガンドの結合の阻害を決定する工程；
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして、ＣＸＣＲ３に対する該リガンドの結合を阻害するグリアジンのフラグメントを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１６】
前記フラグメントは、少なくとも７個のアミノ酸残基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記フラグメントは、少なくとも８個のアミノ酸残基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記フラグメントは、少なくとも９個のアミノ酸残基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸残基である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記フラグメントは合成されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記フラグメントは、タンパク質分解生成物である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
グリアジン、ＩＰ１０、ＭＩＧ、またはＩＴＡＣからなる群より選択されるリガンドの存在下で、グリアジンもしくは少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントと、ＣＸＣＲ３を発現する細胞とを接触させる工程；
該細胞に対する該リガンドの結合を決定する工程；
ＣＸＣＲ３シグナル伝達のモジュレーターとして、該細胞に対する該リガンドの結合を阻害するグリアジンのフラグメントを同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記フラグメントは、少なくとも７個のアミノ酸残基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記フラグメントは、少なくとも８個のアミノ酸残基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記フラグメントは、少なくとも９個のアミノ酸残基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記フラグメントは、少なくとも１０個のアミノ酸残基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記フラグメントは合成されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記フラグメントは、タンパク質分解生成物である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
試験化合物と、ＣＸＣＲ３とを接触する工程；
ＣＸＣＲ３に対する該試験化合物の結合を決定する工程；
ゾヌリン放出のモジュレーターとして、ＣＸＣＲ３に結合する試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３０】
前記試験化合物は、少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
試験化合物と、ＣＸＣＲ３とを接触させる工程；
該試験化合物の存在下および非存在下で、ＣＸＣＲ３に対するグリアジンもしくはグリアジンのフラグメントの結合を決定する工程；
ゾヌリン放出のモジュレーターとして、ＣＸＣＲ３に対する該グリアジンもしくはグリアジンのフラグメントの結合を阻害する試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記試験化合物は、少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
試験化合物と、ＣＸＣＲ３を発現する第１の細胞およびＣＸＣＲ３を発現しない第２の細胞とを接触させる工程；
該第１の細胞および第２の細胞に対する該試験化合物の結合を決定する工程；
ゾヌリン放出のモジュレーターとして、該第２の細胞と比較して該第１の細胞に優先的に結合する試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記試験化合物は、少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ゾヌリン放出のモジュレーターについてスクリーニングするための方法であって、以下：
試験化合物と、ＣＸＣＲ３を発現する細胞とを接触させる工程；
該細胞に対するグリアジンもしくは少なくとも６個のアミノ酸を含むグリアジンのフラグメントの結合を決定する工程；
ゾヌリン放出のモジュレーターとして、該細胞に対するグリアジンもしくはフラグメントの結合を阻害する試験化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３６】
前記試験化合物は、少なくとも６個のアミノ酸残基を含むグリアジンのフラグメントである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
セリアック病を有する患者を処置するための方法であって、以下：
ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体を該患者に投与し、それによって、ゾヌリン放出が阻害される工程、
を包含する、方法。
【請求項３８】
望ましくないＣＸＣＲ３シグナル伝達によって特徴付けられる疾患を有する患者を処置するための方法であって、以下：
ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体を該患者に投与し、それによって、ＣＸＣＲ３シグナル伝達が阻害される工程、
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記疾患は糖尿病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記疾患は自己免疫性肝炎である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾患は多発性硬化症である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記疾患は自閉症である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記疾患はグルテンアレルギーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記疾患は疱疹状皮膚炎である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記疾患は全身性エリテマトーデスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患はグレーヴズ病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患は橋本病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患は鬱である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患はグルテン運動失調である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５０】
前記疾患は胆汁性肝硬変である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患は慢性関節リウマチである、請求項３８に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患はＩｇＡ腎症である、請求項３８に記載の方法。
【請求項５３】
グルテン感受性を有する患者を処置するための方法であって、以下：
ＣＸＣＲ３に特異的に結合する抗体を該患者に投与し、それによって、ゾヌリン放出が阻害される工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
前記抗体はモノクローナル抗体である、請求項３７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体はポリクローナル抗体である、請求項３７〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公表番号】特表２００８−５３７０９６（Ｐ２００８−５３７０９６Ａ）
【公表日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５６２７７（Ｐ２００７−５５６２７７）
【出願日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４１４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１２９２５
【国際公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（３０１０３３２４８）ユニバーシティ オブ メリーランド， ボルチモア (7)
【出願人】（５０７２７４９９５）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年９月１１日（２００８．９．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月１６日（２００６．２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／００５４１４
【国際公開番号】ＷＯ２００６／１１２９２５
【国際公開日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【出願人】（３０１０３３２４８）ユニバーシティ オブ メリーランド， ボルチモア (7)
【出願人】（５０７２７４９９５）
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]