アスタキサンチン産生細菌、細菌培養物、アスタキサンチン含有組成物およびアスタキサンチンの製造方法
【課題】酵母や藻類のような厚い細胞壁を有さず、アスタキサンチンを産生できる細菌、該細菌を用いて得られる細菌培養物およびアスタキサンチン含有組成物、並びに該細菌を用いるアスタキサンチンの製造方法を提供する。
【解決手段】産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量%以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上であるエリスロバクター属。エリスロバクター属１６ＳｒＤＮＡの特定塩基配列、又は該塩基配列と９６％以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種。かかる細菌を培養して得られる細菌培養物。かかる細菌から採取された、アスタキサンチンを含有する組成物。かかる細菌を培養する工程を有するアスタキサンチンの製造方法。
【解決手段】産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量%以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上であるエリスロバクター属。エリスロバクター属１６ＳｒＤＮＡの特定塩基配列、又は該塩基配列と９６％以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種。かかる細菌を培養して得られる細菌培養物。かかる細菌から採取された、アスタキサンチンを含有する組成物。かかる細菌を培養する工程を有するアスタキサンチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスタキサンチン産生能を有するエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌、該細菌を用いて得られる細菌培養物およびアスタキサンチン含有組成物、並びに該細菌を用いるアスタキサンチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロチノイド色素であるアスタキサンチンは、マダイ、サケなどの魚類、カニやエビなどの甲殻類に広く分布している。また、微生物が生産する例として、緑藻Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓが最も有名である。その他にも、赤色酵母Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓ （旧Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が挙げられる。Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓが生産するアスタキサンチン量は４３ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ程度であることが知られている（非特許文献１）。また、赤色酵母Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓ（旧Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）においては、０．４ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔの産生量が報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
原核細胞である細菌は、広い基質利用能力を有し、簡単な培養で高い生育速度を示し、上記酵母のような厚い細胞壁を有しないことから、有用物質生産において最も期待される微生物の1つである。細菌におけるアスタキサンチン生産では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの遺伝子組換え体により、１．４ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔが達成されている（非特許文献３）。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓを用いた方法では、０．０５ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔが達成されている（非特許文献４）。更に海洋細菌Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ１１４３において、０．１４ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔが報告されている（非特許文献５）。しかしながらこれらの遺伝子組替え体によるアスタキサンチンの生産は、現在のところ発現量の点などにおいて問題がある。
【０００４】
一方で、天然物からの分離によるアスタキサンチン製造では、オキアミや甲殻類から抽出するため、抽出効率が低い為に抽出量が低く、コストが高くなるという問題がある。また、天然資源の減少から資源の確保の点でも商業的に問題がある。
【０００５】
アスタキサンチンは、多くの生理活性を有しておりサプリメント食品などで販売されている。また、タイやサケなどの養殖魚では、その色調をより天然のものに近づけるために、アスタキサンチンを配合した飼料（色揚げ飼料）が用いられている。
【０００６】
近年の天然資源の減少により養殖による天然資源の生産が期待されている。魚介類の人口種苗生産において対象魚種に対して高い餌料効果や付加価値を添加する飼料が求められている。タイやニジマスなどの体色の鮮やかさが必要となる魚種には、アスタキサンチンなどの色素を配合した飼料が使用されている。
【０００７】
色揚げ用飼料添加物としてのアスタキサンチンは、カロリーピンク（合成アスタキサンチン）としてロッシュ社から販売されているが、トレーサビリティーの問題や天然物志向の中で、天然物アスタキサンチンが注目を受けている。これまで、色揚げ用天然物アスタキサンチンは、緑藻Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓや赤色酵母Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓが利用されているが、着色が十分でないなどの問題があった。緑藻Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓや赤色酵母Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓは、自身の細胞壁が厚く対象魚種の消化・吸収率が低い。このため、吸収率が高い新たな微生物が求められている。
【０００８】
細菌は、細胞壁が薄く増殖が速い特徴を持っている。そこで、アスタキサンチンを産生する細菌が検索され、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、アルテロモナス属、ピポモナス属、カリオファノン属、エリスロバクター属、パラコッカス属がすでに知られている。
【非特許文献１】リー及びソー（Ｌｅｅ，Ｙ．−Ｋ．ａｎｄ Ｓｏｈ，Ｃ．−Ｗ．）、「ジャーナル・オブ・ファイコロジー（Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．）」、米国、1991年、第２７巻、第３号、ｐ．５７５−５７７
【非特許文献２】フローレス-コテラら（Ｆｌｏｒｅｓ−Ｃｏｔｅｒａ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．）、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、米国、２００１年、第５５巻、第２号、ｐ．３４１−３４７
【非特許文献３】ワンら（Ｗａｎｇ，Ｃ．−Ｗ．ｅｔ ａｌ．）、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、米国、１９９９年、第６２巻、第３号、ｐ．２３５−２４１
【非特許文献４】ヨコヤマら（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．）、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、米国、１９９４年、第５８巻、第１０号、ｐ．１８４２−１８４４
【非特許文献５】ペインら（Ｐａｎｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジー・リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．）、米国、１９９６年、第２２巻、ｐ．３０３−３０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、酵母や藻類のような厚い細胞壁を有さず、アスタキサンチンを産生できる細菌、該細菌を用いて得られる細菌培養物およびアスタキサンチン含有組成物、並びに該細菌を用いるアスタキサンチンの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決する為に、
請求項１に記載の発明は、産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量%以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上であるエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属である。
請求項２に記載の発明は、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列か、又は配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種である。
請求項３に記載の発明は、産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量％以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上である請求項２に記載のエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種である。
請求項４に記載の発明は、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株である請求項２又は３に記載のエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種である。
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培養して得られる細菌培養物である。
請求項６に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌から採取された、アスタキサンチンを含有する組成物である。
請求項７に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培養する工程を有するアスタキサンチンの製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の新規の細菌及びその培養物を使用すれば、有用色素であるアスタキサンチンの産生を行うことが可能である。さらに本発明のアスタキサンチン含有組成物、アスタキサンチンの産生方法によれば、有用色素であるアスタキサンチンを効率的に産生することが可能になり、従来のアスタキサンチン含有飼料よりもアスタキサンチン含有量の多い色揚げ用餌料等の飼料を効率よく調製できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳しく説明する。以下、「エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株」のことを「エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株」又は「ＪＰＣＣ Ｏ １８８４株」と略記することがある。また、本発明において、アスタキサンチンとは、その構造異性体（シス体）も含むものとする。また、以下「構造異性体」とは、ずべて「シス体」のことを指す。
【００１３】
＜エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の獲得＞
海洋環境やマングローブ林より採取した海砂、泥、水などからアスタキサンチンを産生する微生物の獲得を試みた。酵母エキスを５．０ｇ／ｌ、ペプトンを１．０ｇ／ｌ、グルコースを５．０ｇ／ｌをとなるようにそれぞれ人工海水（千寿製薬）に添加して作製した寒天プレートに、１００μｌのサンプルを塗布した。
【００１４】
２５℃の条件下で７〜１０日間静置培養を行い、オレンジ、赤色のコロニーを形成する海洋微生物を獲得した。これらの微生物を単菌化するため、５ｍｌの上記成分を含む液体培地中に獲得した海洋微生物を植菌し、震とう培養（１５０ｒｐｍ）を行い生育させ、寒天プレートに塗布し、コロニーを形成させる操作を繰り返すことで単菌化した。
【００１５】
約８００株の海洋細菌からなる菌体粉末０．３ｍｇからクロロホルム：メタノール＝１:１（ｖ：ｖ）の溶液で色素を抽出し、アスタキサンチンのスクリーニングを行った。
【００１６】
アスタキサンチンの有無については、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）を用いて評価した。その結果、アスタキサンチンをはじめとする各種カロチノイド色素を産生する株を同定し、エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株を獲得した。
【００１７】
エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株は、２００７年４月９日付けで受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３４１として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託されている。
【００１８】
＜エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の同定＞
エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の同定は、株式会社テクノスルガに委託して実施した。前記方法で獲得した検体を用いて、「形態的性質」、「培養的性質」、「生理学的性質」、「糖類からの酸生成／ガス酸性」および「その他の生理学的性質」を確認し、「塩基配列」の同定および系統解析を行った。「形態的性質」を表１に、「培養的性質」を表２に、「生理学的性質」を表３に、「糖類からの酸生成／ガス酸性」を表４に、「その他の生理学的性質」を表５に、「１６SｒＤＮＡの塩基配列」を配列番号１にそれぞれ示す。
【００１９】
なお、表１〜５において、（１）ゼラチン液化、グラム染色性については、文献「ＢＡＲＲＯＷ，（Ｇ．Ｉ．） ａｎｄ ＦＥＬＴＨＡＭ，（Ｒ．Ｋ．Ａ）：Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ．３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．１９９３，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．」を参考にした。
また、（２）リトマス・ミルクでの培養条件、ＭＲテスト、デンプンの加水分解、クエン酸の利用、無機窒素源の利用、カタラーゼ、オキシダーゼ、Ｏ−Ｆテスト（酸化／発酵）、糖類からの酸生成／ガス酸性については、文献「坂崎利一、吉崎悦郎、三木寛二：新細菌培地学講座・下，第二版．１９９８，近大出版，東京」を参考にした。
また、（３）硝酸塩の還元、脱窒反応、ＶＰテスト、インドール産生、硫化水素の生成、ウレアーゼ活性、その他の生理学的性質については、「細菌同定キットＡＰＩ２０Ｅ，（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）」を使用した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】
【表５】
【００２５】
（塩基配列）
エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の１６SｒＤＮＡを、公知の方法により同定した結果、配列番号１に示す塩基配列であることが判った。
【００２６】
（系統解析）
解析ソフトウェアとしてＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（ＴＨＯＭＰＳＯＮ（Ｊ．Ｄ．），ＨＩＧＧＩＮＳ（Ｄ．Ｇ．） ａｎｄ ＧＩＢＳＯＮ（Ｔ．Ｊ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２：４６７３−４６８０．参照）、ＭＥＧＡ ｖｅｒ３．１（ＫＵＭＡＲ，（Ｓ．），ＴＡＭＵＲＡ，（Ｋ．） ａｎｄ ＮＥＩ，（Ｍ．），Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４，５，１５０−１６３．参照）を用い、得られた１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（株式会社テクノスルガ）、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）から取得した塩基配列情報と照合して、分子系統解析を行った。その結果得られた分子系統樹を図１に示す。
【００２７】
得られた検体は、α−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属する桿菌で、カタラーゼおよびオキシダーゼを有する偏性好気性細菌である。
そして、ＢＬＡＳＴ（ＡＬＴＳＣＨＵＬ，（Ｓ．Ｆ．），ＭＡＤＤＥＮ，（Ｔ．Ｆ．），ＳＣＨＡＦＦＥＲ，（Ａ．Ａ．），ＺＨＡＮＧ，（Ｊ．），ＺＨＡＮＧ，（Ｚ．），ＭＩＬＬＥＲ，（Ｗ．），ａｎｄ ＬＩＰＭＡＮ，（Ｄ．Ｊ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５：３３８９−３４０２．参照）を用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、検体の１６SｒＤＮＡの塩基配列は、エリスロバクター アクイマリス（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕｉｍａｒｉｓ）ＳＷ−１１０株の１６SｒＤＮＡの塩基配列に対し、９７．８％と最も高い相同性を示した。また、国際塩基配列データベースに対する相同性検索においても、エリスロバクター由来の１６SｒＤＮＡの塩基配列に対し高い相同性を示した。このことから、検体は、エリスロバクター属に含まれる可能性が高いと考えられた。
そして分子系統解析の結果、検体は、エリスロバクターの基準種であるエリスロバクター ロンガス（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｎｇｕｓ）と系統枝を形成し、エリスロバクター ロンガスの系統枝におけるブートストラップ値は８１％と比較的高く、その外側に位置するエリスロバクター アクイマリスの系統枝におけるブートストラップ値も８０％を示すことから、これら３株の位置は比較的安定していると考えられた。このことから、検体は、エリスロバクターに含まれ、既知種ではエリスロバクター ロンガスやエリスロバクター アクイマリスに近縁と考えられるが、検体の１６SｒＤＮＡの塩基配列は、これら２種の１６SｒＤＮＡの塩基配列と完全には一致しておらず、検体とこれら２種の系統枝と、他のエリスロバクターに属する種の系統枝を比較すると、検体がこれら２種のどちらかと同種となる可能性は低いと考えられた。
以上より、分子系統解析の結果、検体はエリスロバクター属の新種（エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株）であると判断された。
【００２８】
＜アスタキサンチン産生細菌、細菌培養物、アスタキサンチン含有組成物およびアスタキサンチンの製造方法＞
本発明の細菌は、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列か、又は配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種の細菌を包含する。このような細菌は、エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株と同種の株であると考えられるからである。１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種の細菌には、例えば、エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に対して、化学物質を作用させる手法や遺伝子組み換え等の公知の手法で変異を導入することで得られた細菌も包含される。
また、産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量％以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上であるエリスロバクター属に属する細菌も本発明の細菌である。後記するように、このような色素を高含有量で産生する細菌は、利用価値が高い。
【００２９】
本発明のアスタキサンチンの製造方法は、上記本発明の細菌（以下、「本細菌」と略記することがある）を培養する工程を有するものである。
本細菌を用いてアスタキサンチンを製造する方法を、以下に例示する。
本細菌を培養するための培地は、本細菌の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩、微量元素（ビタミン、微量金属）等を含むものであれば特に限定されない。
より具体的には、炭素源として、例えば、グルコース、シュークロース等の糖類、エタノールやグリセロールなどのアルコール類を挙げることができる。添加量は、添加する炭素源にもよるが、概ね０．５〜３．０質量％程度とすれば良い。
【００３０】
窒素源としては、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸カリウム、塩化アンモニウム、尿素などの硝酸体窒素、アンモニア窒素体のいずれかとすることができる。添加量は添加する窒素源にもよるが、概ね０．０１〜０．１質量％程度とすれば良い。
【００３１】
無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ素化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化鉄、塩化マンガン、硫酸マンガン、塩化マグネシウム、硫酸銅などを用いることができる。添加量は、添加する無機塩の種類にもよるが、０．００１〜０．０１質量％程度とすれば良い。
【００３２】
また、特殊な必要物質として、酵母エキス、ペプトン、トリプトンなどを用いることができる。これら特殊な必要物質の添加量は添加する物質にもよるが、０．０１〜０．５質量％程度とすれば良い。
その他、本発明の効果を損なわない範囲において、培地にはその他の成分を含有させても良い。
本細菌の培養に用いる培地として、市販品を用いても良く、好ましいものとして、例えば、マリンブロス培地（Ｄｉｆｃｏ社製）が挙げられる。
【００３３】
本細菌の培養を行う際は、培地は公知の方法に従って滅菌しておくことが好ましい。
培地のｐＨは、６．０〜８．０に調整することが好ましい。そして、培養温度は２０〜３５℃であることが好ましい。培養時間は特に限定されないが、通常、２〜４日であることが好ましい。培養法としては、震とう培養または通気培養が好ましい。そして、培養中に培地は撹拌することが好ましい。培地への植菌量は特に限定されないが、０．１〜５容量％であることが好ましい。
【００３４】
次いで、培養された本細菌からアスタキサンチンを得る。例えば、本細菌を培養して得られる細菌培養物から直接、または遠心分離により回収された沈殿物より、有機溶媒でアスタキサンチンを抽出することができる。細菌培養物は、凍結乾燥などの手法により乾燥菌体としてから溶媒抽出に供しても良い。ここで用いる溶媒は、アスタキサンチンが十分に溶解するものであれば良く、一種の溶媒を単独で用いても良いし、複数種の溶媒を混合した混合溶媒でも良い。
【００３５】
より具体的には、極性の高いアセトン、メタノール、酢酸エチルや、ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどの非極性溶媒を単独で、または混合して用いることができる。特に好ましい溶媒として、クロロホルムおよびメタノールの混合溶媒が挙げられる。これらの混合比は特に限定されるものではないが、クロロホルム：メタノール＝０．５：１．５〜１．５：０．５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。
さらに、シリカゲルなどの充填剤、抽出に用いたものと同様の溶媒を用いて、カラムクロマトグラフィーによりアスタキサンチンを精製しても良い。
【００３６】
得られた組成物中の成分は、例えば、その分析データを公知化合物の分析データと比較することで同定できる。分析法としては、構造に関するデータが取得できるものであればいずれでも良く、例えば、ＨＰＬＣ、ＩＲ、ＮＭＲ、ＬＣ／ＭＳなど通常汎用される分析法で良い。また、例えば、ＨＰＬＣにより分析時に検量線を作成しておけば、得られた組成物中の各成分の含有量も定量できる。
【００３７】
本細菌から採取される組成物には、本細菌が産生した成分として、アスタキサンチン以外にも、β−カロチンがアスタキサンチンに変換される過程で生じる種々の有用なカロチノイド色素が含有される。前記組成物中に含有される色素として、具体的には、アスタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、ハイドロエキネノン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、β−カロチンなどが挙げられる。
なかでも、アスタキサンチンは、産生される全色素中の含有量が５質量％以上と高濃度である。また、通常のアスタキサンチン産生能を有する細菌が産生するアスタキサンチンは、ほとんどがトランス体であるのに対し、本細菌が産生するアスタキサンチンには、シス体が１０質量％以上含まれている。
さらに、アドニキサンチンも、産生される全色素中の含有量が３５質量％以上と特に高濃度である。
したがって、本細菌から採取された組成物は、通常のアスタキサンチン産生能を有する細菌が産生する組成物よりも有用性が高い。
【００３８】
本細菌を培養して得られる培養物、または本細菌の乾燥菌体、凍結菌体、溶媒抽出物、もしくは粉砕・破砕処理物を、動物プランクトンの培養物へ添加して捕食させ、これを回収することにより、アスタキサンチンを製造することもできる。この製造方法によれば、アスタキサンチン等のカロチノイド色素が濃縮された飼料を提供することも可能になる。
【００３９】
前記動物プランクトンとしては、例えば、ワムシ、アルテミア、ミジンコなどを挙げることができる。これらの動物プランクトンに、本細菌を捕食させることにより生物学的濃縮が行われ、その結果得られる動物プランクトンの培養物は、従来の細菌の培養によって産生されるアスタキサンチン等のカロチノイド色素に比較して、格段に濃縮されたものであり、その利用価値は高い。
【００４０】
動物プランクトンによる濃縮を利用したアスタキサンチン等の製造方法により得られる飼料は、養殖魚において好適に用いることができる。稚魚の中にはカロチノイド色素を含有する甲殻類プランクトンを摂餌しているものがあり、この摂餌により魚の色が影響されることが知られている。従って、これらの稚魚類を養殖する際に、上記方法で製造された飼料を色揚げ用飼料として給餌すると、動物プランクトンにより濃縮されたカロチノイド色素等を給餌することが可能になることにより、従来よりも効率的に魚の色揚げを行うことができる。
【実施例】
【００４１】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
（エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の培養物からのアスタキサンチンを含むカロチノイド色素の分離）
エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の生育に必要な全ての栄養素を含むマリンブロス培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を調製し、１２１℃で１０分間滅菌処理した。次いで、１Ｌ三角フラスコにこの培地を２５０ｍｌ分取したのち、この株を５ｍｌ植菌して、１５０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で３日間培養を行った。この培養液を遠心分離し、凍結乾燥を行い、０．５ｇの乾燥菌体を得た。この菌体にクロロホルム：メタノール＝１：１（ｖ：ｖ）溶液を加えて色素を抽出後、シリカゲルをクロロホルム：メタノールの移動相に再懸濁させ、充填したオープンカラム（口径３０ｍｍ、全長６００ｍｍ）を用いて色素の分離を行った。
【００４２】
この株から抽出された色素は５つの画分に分けられた。そして各フラクション（フラクション１〜５）を分取し、ＨＰＬＣ（カラム：口径４．６ｍｍ、全長２５０ｍｍ）により分析した結果、フラクション２中に、公知のアスタキサンチンと同じベクトルを示す物質の存在が確認された。さらに、ＬＣ／ＭＳを用いた分析においても、公知のアスタキサンチンのデータと一致するデータが得られた。
【００４３】
フラクション２と同様に、その他のフラクション（フラクション１、３、４および５）を分取し、ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳを用いて分析した結果、アスタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アスタキサンチン構造異性体、アドニキサンチン構造異性体、カンタキサンチン、ハイドロエキネノン構造異性体、β−クリプトキサンチン、エキネノン、エキネノン構造異性体、β−カロチン、β−カロチン構造異性体の存在が確認された。
【００４４】
この株から抽出された主なカロチノイド色素の含有量は、乾燥菌体１ｇ当りでアスタキサンチン０．１１４ｍｇ／ｇ、アドニキサンチン０．６５６ｍｇ／ｇ、ゼアキサンチン０．０５９ｍｇ／ｇ、アドニルビン０．０１９ｍｇ／ｇ、アスタキサンチン構造異性体０．０１６ｍｇ／ｇ、アドニキサンチン構造異性体０．１４９ｍｇ／ｇ、カンタキサンチン０．００７ｍｇ／ｇ、ハイドロエキネノン構造異性体０．０６５ｍｇ／ｇ、β−クリプトキサンチン０．００６ｍｇ／ｇ、エキネノン０．１６５ｍｇ／ｇ、エキネノン構造異性体０．００１ｍｇ／ｇ、β−カロチン０．０６４ｍｇ／ｇ、β−カロチン構造異性体０．００１ｍｇ／ｇであり、カロチノイド色素の総量は１．３２２ｍｇ／ｇであった。
【００４５】
本発明は、サプリメント食品や飼料（色揚げ飼料）の製造に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の分子系統解析の結果を示す分子系統樹である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アスタキサンチン産生能を有するエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌、該細菌を用いて得られる細菌培養物およびアスタキサンチン含有組成物、並びに該細菌を用いるアスタキサンチンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カロチノイド色素であるアスタキサンチンは、マダイ、サケなどの魚類、カニやエビなどの甲殻類に広く分布している。また、微生物が生産する例として、緑藻Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓｐｌｕｖｉａｌｉｓが最も有名である。その他にも、赤色酵母Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓ （旧Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）が挙げられる。Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓが生産するアスタキサンチン量は４３ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔ程度であることが知られている（非特許文献１）。また、赤色酵母Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓ（旧Ｐｈａｆｆｉａ ｒｈｏｄｏｚｙｍａ）においては、０．４ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔの産生量が報告されている（非特許文献２）。
【０００３】
原核細胞である細菌は、広い基質利用能力を有し、簡単な培養で高い生育速度を示し、上記酵母のような厚い細胞壁を有しないことから、有用物質生産において最も期待される微生物の1つである。細菌におけるアスタキサンチン生産では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの遺伝子組換え体により、１．４ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔが達成されている（非特許文献３）。また、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｉｒｍｕｓを用いた方法では、０．０５ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔが達成されている（非特許文献４）。更に海洋細菌Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＭＢＩＣ１１４３において、０．１４ｍｇ／ｇ ｄｒｙ ｗｅｉｇｈｔが報告されている（非特許文献５）。しかしながらこれらの遺伝子組替え体によるアスタキサンチンの生産は、現在のところ発現量の点などにおいて問題がある。
【０００４】
一方で、天然物からの分離によるアスタキサンチン製造では、オキアミや甲殻類から抽出するため、抽出効率が低い為に抽出量が低く、コストが高くなるという問題がある。また、天然資源の減少から資源の確保の点でも商業的に問題がある。
【０００５】
アスタキサンチンは、多くの生理活性を有しておりサプリメント食品などで販売されている。また、タイやサケなどの養殖魚では、その色調をより天然のものに近づけるために、アスタキサンチンを配合した飼料（色揚げ飼料）が用いられている。
【０００６】
近年の天然資源の減少により養殖による天然資源の生産が期待されている。魚介類の人口種苗生産において対象魚種に対して高い餌料効果や付加価値を添加する飼料が求められている。タイやニジマスなどの体色の鮮やかさが必要となる魚種には、アスタキサンチンなどの色素を配合した飼料が使用されている。
【０００７】
色揚げ用飼料添加物としてのアスタキサンチンは、カロリーピンク（合成アスタキサンチン）としてロッシュ社から販売されているが、トレーサビリティーの問題や天然物志向の中で、天然物アスタキサンチンが注目を受けている。これまで、色揚げ用天然物アスタキサンチンは、緑藻Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓや赤色酵母Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓが利用されているが、着色が十分でないなどの問題があった。緑藻Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓや赤色酵母Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ ｄｅｎｄｒｏｈｏｕｓは、自身の細胞壁が厚く対象魚種の消化・吸収率が低い。このため、吸収率が高い新たな微生物が求められている。
【０００８】
細菌は、細胞壁が薄く増殖が速い特徴を持っている。そこで、アスタキサンチンを産生する細菌が検索され、フラボバクテリウム属、アルカリゲネス属、シュードモナス属、アルテロモナス属、ピポモナス属、カリオファノン属、エリスロバクター属、パラコッカス属がすでに知られている。
【非特許文献１】リー及びソー（Ｌｅｅ，Ｙ．−Ｋ．ａｎｄ Ｓｏｈ，Ｃ．−Ｗ．）、「ジャーナル・オブ・ファイコロジー（Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．）」、米国、1991年、第２７巻、第３号、ｐ．５７５−５７７
【非特許文献２】フローレス-コテラら（Ｆｌｏｒｅｓ−Ｃｏｔｅｒａ，Ｌ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．）、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）、米国、２００１年、第５５巻、第２号、ｐ．３４１−３４７
【非特許文献３】ワンら（Ｗａｎｇ，Ｃ．−Ｗ．ｅｔ ａｌ．）、バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．）、米国、１９９９年、第６２巻、第３号、ｐ．２３５−２４１
【非特許文献４】ヨコヤマら（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．）、バイオサイエンス・バイオテクノロジー・アンド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、米国、１９９４年、第５８巻、第１０号、ｐ．１８４２−１８４４
【非特許文献５】ペインら（Ｐａｎｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジー・リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．）、米国、１９９６年、第２２巻、ｐ．３０３−３０８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、酵母や藻類のような厚い細胞壁を有さず、アスタキサンチンを産生できる細菌、該細菌を用いて得られる細菌培養物およびアスタキサンチン含有組成物、並びに該細菌を用いるアスタキサンチンの製造方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決する為に、
請求項１に記載の発明は、産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量%以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上であるエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属である。
請求項２に記載の発明は、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列か、又は配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種である。
請求項３に記載の発明は、産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量％以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上である請求項２に記載のエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種である。
請求項４に記載の発明は、エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株である請求項２又は３に記載のエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種である。
請求項５に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培養して得られる細菌培養物である。
請求項６に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌から採取された、アスタキサンチンを含有する組成物である。
請求項７に記載の発明は、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培養する工程を有するアスタキサンチンの製造方法である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の新規の細菌及びその培養物を使用すれば、有用色素であるアスタキサンチンの産生を行うことが可能である。さらに本発明のアスタキサンチン含有組成物、アスタキサンチンの産生方法によれば、有用色素であるアスタキサンチンを効率的に産生することが可能になり、従来のアスタキサンチン含有飼料よりもアスタキサンチン含有量の多い色揚げ用餌料等の飼料を効率よく調製できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明について詳しく説明する。以下、「エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株」のことを「エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株」又は「ＪＰＣＣ Ｏ １８８４株」と略記することがある。また、本発明において、アスタキサンチンとは、その構造異性体（シス体）も含むものとする。また、以下「構造異性体」とは、ずべて「シス体」のことを指す。
【００１３】
＜エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の獲得＞
海洋環境やマングローブ林より採取した海砂、泥、水などからアスタキサンチンを産生する微生物の獲得を試みた。酵母エキスを５．０ｇ／ｌ、ペプトンを１．０ｇ／ｌ、グルコースを５．０ｇ／ｌをとなるようにそれぞれ人工海水（千寿製薬）に添加して作製した寒天プレートに、１００μｌのサンプルを塗布した。
【００１４】
２５℃の条件下で７〜１０日間静置培養を行い、オレンジ、赤色のコロニーを形成する海洋微生物を獲得した。これらの微生物を単菌化するため、５ｍｌの上記成分を含む液体培地中に獲得した海洋微生物を植菌し、震とう培養（１５０ｒｐｍ）を行い生育させ、寒天プレートに塗布し、コロニーを形成させる操作を繰り返すことで単菌化した。
【００１５】
約８００株の海洋細菌からなる菌体粉末０．３ｍｇからクロロホルム：メタノール＝１:１（ｖ：ｖ）の溶液で色素を抽出し、アスタキサンチンのスクリーニングを行った。
【００１６】
アスタキサンチンの有無については、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）を用いて評価した。その結果、アスタキサンチンをはじめとする各種カロチノイド色素を産生する株を同定し、エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株を獲得した。
【００１７】
エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株は、２００７年４月９日付けで受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−３４１として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターへ寄託されている。
【００１８】
＜エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の同定＞
エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の同定は、株式会社テクノスルガに委託して実施した。前記方法で獲得した検体を用いて、「形態的性質」、「培養的性質」、「生理学的性質」、「糖類からの酸生成／ガス酸性」および「その他の生理学的性質」を確認し、「塩基配列」の同定および系統解析を行った。「形態的性質」を表１に、「培養的性質」を表２に、「生理学的性質」を表３に、「糖類からの酸生成／ガス酸性」を表４に、「その他の生理学的性質」を表５に、「１６SｒＤＮＡの塩基配列」を配列番号１にそれぞれ示す。
【００１９】
なお、表１〜５において、（１）ゼラチン液化、グラム染色性については、文献「ＢＡＲＲＯＷ，（Ｇ．Ｉ．） ａｎｄ ＦＥＬＴＨＡＭ，（Ｒ．Ｋ．Ａ）：Ｃｏｗａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｅｌ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂａｃｔｅｒｉａ．３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．１９９３，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．」を参考にした。
また、（２）リトマス・ミルクでの培養条件、ＭＲテスト、デンプンの加水分解、クエン酸の利用、無機窒素源の利用、カタラーゼ、オキシダーゼ、Ｏ−Ｆテスト（酸化／発酵）、糖類からの酸生成／ガス酸性については、文献「坂崎利一、吉崎悦郎、三木寛二：新細菌培地学講座・下，第二版．１９９８，近大出版，東京」を参考にした。
また、（３）硝酸塩の還元、脱窒反応、ＶＰテスト、インドール産生、硫化水素の生成、ウレアーゼ活性、その他の生理学的性質については、「細菌同定キットＡＰＩ２０Ｅ，（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）」を使用した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】
【表５】
【００２５】
（塩基配列）
エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の１６SｒＤＮＡを、公知の方法により同定した結果、配列番号１に示す塩基配列であることが判った。
【００２６】
（系統解析）
解析ソフトウェアとしてＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（ＴＨＯＭＰＳＯＮ（Ｊ．Ｄ．），ＨＩＧＧＩＮＳ（Ｄ．Ｇ．） ａｎｄ ＧＩＢＳＯＮ（Ｔ．Ｊ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２：４６７３−４６８０．参照）、ＭＥＧＡ ｖｅｒ３．１（ＫＵＭＡＲ，（Ｓ．），ＴＡＭＵＲＡ，（Ｋ．） ａｎｄ ＮＥＩ，（Ｍ．），Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００４，５，１５０−１６３．参照）を用い、得られた１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列を、アポロンＤＢ細菌基準株データベース（株式会社テクノスルガ）、国際塩基配列データベース（ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ）から取得した塩基配列情報と照合して、分子系統解析を行った。その結果得られた分子系統樹を図１に示す。
【００２７】
得られた検体は、α−プロテオバクテリア（α−Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）に属する桿菌で、カタラーゼおよびオキシダーゼを有する偏性好気性細菌である。
そして、ＢＬＡＳＴ（ＡＬＴＳＣＨＵＬ，（Ｓ．Ｆ．），ＭＡＤＤＥＮ，（Ｔ．Ｆ．），ＳＣＨＡＦＦＥＲ，（Ａ．Ａ．），ＺＨＡＮＧ，（Ｊ．），ＺＨＡＮＧ，（Ｚ．），ＭＩＬＬＥＲ，（Ｗ．），ａｎｄ ＬＩＰＭＡＮ，（Ｄ．Ｊ．），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９７，２５：３３８９−３４０２．参照）を用いた細菌基準株データベースに対する相同性検索の結果、検体の１６SｒＤＮＡの塩基配列は、エリスロバクター アクイマリス（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕｉｍａｒｉｓ）ＳＷ−１１０株の１６SｒＤＮＡの塩基配列に対し、９７．８％と最も高い相同性を示した。また、国際塩基配列データベースに対する相同性検索においても、エリスロバクター由来の１６SｒＤＮＡの塩基配列に対し高い相同性を示した。このことから、検体は、エリスロバクター属に含まれる可能性が高いと考えられた。
そして分子系統解析の結果、検体は、エリスロバクターの基準種であるエリスロバクター ロンガス（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｎｇｕｓ）と系統枝を形成し、エリスロバクター ロンガスの系統枝におけるブートストラップ値は８１％と比較的高く、その外側に位置するエリスロバクター アクイマリスの系統枝におけるブートストラップ値も８０％を示すことから、これら３株の位置は比較的安定していると考えられた。このことから、検体は、エリスロバクターに含まれ、既知種ではエリスロバクター ロンガスやエリスロバクター アクイマリスに近縁と考えられるが、検体の１６SｒＤＮＡの塩基配列は、これら２種の１６SｒＤＮＡの塩基配列と完全には一致しておらず、検体とこれら２種の系統枝と、他のエリスロバクターに属する種の系統枝を比較すると、検体がこれら２種のどちらかと同種となる可能性は低いと考えられた。
以上より、分子系統解析の結果、検体はエリスロバクター属の新種（エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株）であると判断された。
【００２８】
＜アスタキサンチン産生細菌、細菌培養物、アスタキサンチン含有組成物およびアスタキサンチンの製造方法＞
本発明の細菌は、１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列か、又は配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種の細菌を包含する。このような細菌は、エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株と同種の株であると考えられるからである。１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種の細菌には、例えば、エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の１６ＳｒＤＮＡの塩基配列に対して、化学物質を作用させる手法や遺伝子組み換え等の公知の手法で変異を導入することで得られた細菌も包含される。
また、産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量％以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上であるエリスロバクター属に属する細菌も本発明の細菌である。後記するように、このような色素を高含有量で産生する細菌は、利用価値が高い。
【００２９】
本発明のアスタキサンチンの製造方法は、上記本発明の細菌（以下、「本細菌」と略記することがある）を培養する工程を有するものである。
本細菌を用いてアスタキサンチンを製造する方法を、以下に例示する。
本細菌を培養するための培地は、本細菌の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩、微量元素（ビタミン、微量金属）等を含むものであれば特に限定されない。
より具体的には、炭素源として、例えば、グルコース、シュークロース等の糖類、エタノールやグリセロールなどのアルコール類を挙げることができる。添加量は、添加する炭素源にもよるが、概ね０．５〜３．０質量％程度とすれば良い。
【００３０】
窒素源としては、例えば、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸カリウム、塩化アンモニウム、尿素などの硝酸体窒素、アンモニア窒素体のいずれかとすることができる。添加量は添加する窒素源にもよるが、概ね０．０１〜０．１質量％程度とすれば良い。
【００３１】
無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム、ホウ素化カリウム、塩化ストロンチウム、ホウ酸、ケイ酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化鉄、塩化マンガン、硫酸マンガン、塩化マグネシウム、硫酸銅などを用いることができる。添加量は、添加する無機塩の種類にもよるが、０．００１〜０．０１質量％程度とすれば良い。
【００３２】
また、特殊な必要物質として、酵母エキス、ペプトン、トリプトンなどを用いることができる。これら特殊な必要物質の添加量は添加する物質にもよるが、０．０１〜０．５質量％程度とすれば良い。
その他、本発明の効果を損なわない範囲において、培地にはその他の成分を含有させても良い。
本細菌の培養に用いる培地として、市販品を用いても良く、好ましいものとして、例えば、マリンブロス培地（Ｄｉｆｃｏ社製）が挙げられる。
【００３３】
本細菌の培養を行う際は、培地は公知の方法に従って滅菌しておくことが好ましい。
培地のｐＨは、６．０〜８．０に調整することが好ましい。そして、培養温度は２０〜３５℃であることが好ましい。培養時間は特に限定されないが、通常、２〜４日であることが好ましい。培養法としては、震とう培養または通気培養が好ましい。そして、培養中に培地は撹拌することが好ましい。培地への植菌量は特に限定されないが、０．１〜５容量％であることが好ましい。
【００３４】
次いで、培養された本細菌からアスタキサンチンを得る。例えば、本細菌を培養して得られる細菌培養物から直接、または遠心分離により回収された沈殿物より、有機溶媒でアスタキサンチンを抽出することができる。細菌培養物は、凍結乾燥などの手法により乾燥菌体としてから溶媒抽出に供しても良い。ここで用いる溶媒は、アスタキサンチンが十分に溶解するものであれば良く、一種の溶媒を単独で用いても良いし、複数種の溶媒を混合した混合溶媒でも良い。
【００３５】
より具体的には、極性の高いアセトン、メタノール、酢酸エチルや、ヘキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどの非極性溶媒を単独で、または混合して用いることができる。特に好ましい溶媒として、クロロホルムおよびメタノールの混合溶媒が挙げられる。これらの混合比は特に限定されるものではないが、クロロホルム：メタノール＝０．５：１．５〜１．５：０．５（ｖ／ｖ）であることが好ましい。
さらに、シリカゲルなどの充填剤、抽出に用いたものと同様の溶媒を用いて、カラムクロマトグラフィーによりアスタキサンチンを精製しても良い。
【００３６】
得られた組成物中の成分は、例えば、その分析データを公知化合物の分析データと比較することで同定できる。分析法としては、構造に関するデータが取得できるものであればいずれでも良く、例えば、ＨＰＬＣ、ＩＲ、ＮＭＲ、ＬＣ／ＭＳなど通常汎用される分析法で良い。また、例えば、ＨＰＬＣにより分析時に検量線を作成しておけば、得られた組成物中の各成分の含有量も定量できる。
【００３７】
本細菌から採取される組成物には、本細菌が産生した成分として、アスタキサンチン以外にも、β−カロチンがアスタキサンチンに変換される過程で生じる種々の有用なカロチノイド色素が含有される。前記組成物中に含有される色素として、具体的には、アスタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、カンタキサンチン、ハイドロエキネノン、β−クリプトキサンチン、エキネノン、β−カロチンなどが挙げられる。
なかでも、アスタキサンチンは、産生される全色素中の含有量が５質量％以上と高濃度である。また、通常のアスタキサンチン産生能を有する細菌が産生するアスタキサンチンは、ほとんどがトランス体であるのに対し、本細菌が産生するアスタキサンチンには、シス体が１０質量％以上含まれている。
さらに、アドニキサンチンも、産生される全色素中の含有量が３５質量％以上と特に高濃度である。
したがって、本細菌から採取された組成物は、通常のアスタキサンチン産生能を有する細菌が産生する組成物よりも有用性が高い。
【００３８】
本細菌を培養して得られる培養物、または本細菌の乾燥菌体、凍結菌体、溶媒抽出物、もしくは粉砕・破砕処理物を、動物プランクトンの培養物へ添加して捕食させ、これを回収することにより、アスタキサンチンを製造することもできる。この製造方法によれば、アスタキサンチン等のカロチノイド色素が濃縮された飼料を提供することも可能になる。
【００３９】
前記動物プランクトンとしては、例えば、ワムシ、アルテミア、ミジンコなどを挙げることができる。これらの動物プランクトンに、本細菌を捕食させることにより生物学的濃縮が行われ、その結果得られる動物プランクトンの培養物は、従来の細菌の培養によって産生されるアスタキサンチン等のカロチノイド色素に比較して、格段に濃縮されたものであり、その利用価値は高い。
【００４０】
動物プランクトンによる濃縮を利用したアスタキサンチン等の製造方法により得られる飼料は、養殖魚において好適に用いることができる。稚魚の中にはカロチノイド色素を含有する甲殻類プランクトンを摂餌しているものがあり、この摂餌により魚の色が影響されることが知られている。従って、これらの稚魚類を養殖する際に、上記方法で製造された飼料を色揚げ用飼料として給餌すると、動物プランクトンにより濃縮されたカロチノイド色素等を給餌することが可能になることにより、従来よりも効率的に魚の色揚げを行うことができる。
【実施例】
【００４１】
以下、具体的実施例により、本発明についてさらに詳しく説明する。ただし、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
（エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の培養物からのアスタキサンチンを含むカロチノイド色素の分離）
エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の生育に必要な全ての栄養素を含むマリンブロス培地（Ｄｉｆｃｏ社製）を調製し、１２１℃で１０分間滅菌処理した。次いで、１Ｌ三角フラスコにこの培地を２５０ｍｌ分取したのち、この株を５ｍｌ植菌して、１５０ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で３日間培養を行った。この培養液を遠心分離し、凍結乾燥を行い、０．５ｇの乾燥菌体を得た。この菌体にクロロホルム：メタノール＝１：１（ｖ：ｖ）溶液を加えて色素を抽出後、シリカゲルをクロロホルム：メタノールの移動相に再懸濁させ、充填したオープンカラム（口径３０ｍｍ、全長６００ｍｍ）を用いて色素の分離を行った。
【００４２】
この株から抽出された色素は５つの画分に分けられた。そして各フラクション（フラクション１〜５）を分取し、ＨＰＬＣ（カラム：口径４．６ｍｍ、全長２５０ｍｍ）により分析した結果、フラクション２中に、公知のアスタキサンチンと同じベクトルを示す物質の存在が確認された。さらに、ＬＣ／ＭＳを用いた分析においても、公知のアスタキサンチンのデータと一致するデータが得られた。
【００４３】
フラクション２と同様に、その他のフラクション（フラクション１、３、４および５）を分取し、ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳを用いて分析した結果、アスタキサンチン、アドニキサンチン、ゼアキサンチン、アドニルビン、アスタキサンチン構造異性体、アドニキサンチン構造異性体、カンタキサンチン、ハイドロエキネノン構造異性体、β−クリプトキサンチン、エキネノン、エキネノン構造異性体、β−カロチン、β−カロチン構造異性体の存在が確認された。
【００４４】
この株から抽出された主なカロチノイド色素の含有量は、乾燥菌体１ｇ当りでアスタキサンチン０．１１４ｍｇ／ｇ、アドニキサンチン０．６５６ｍｇ／ｇ、ゼアキサンチン０．０５９ｍｇ／ｇ、アドニルビン０．０１９ｍｇ／ｇ、アスタキサンチン構造異性体０．０１６ｍｇ／ｇ、アドニキサンチン構造異性体０．１４９ｍｇ／ｇ、カンタキサンチン０．００７ｍｇ／ｇ、ハイドロエキネノン構造異性体０．０６５ｍｇ／ｇ、β−クリプトキサンチン０．００６ｍｇ／ｇ、エキネノン０．１６５ｍｇ／ｇ、エキネノン構造異性体０．００１ｍｇ／ｇ、β−カロチン０．０６４ｍｇ／ｇ、β−カロチン構造異性体０．００１ｍｇ／ｇであり、カロチノイド色素の総量は１．３２２ｍｇ／ｇであった。
【００４５】
本発明は、サプリメント食品や飼料（色揚げ飼料）の製造に利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】エリスロバクターＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株の分子系統解析の結果を示す分子系統樹である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量%以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上であるエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属。
【請求項２】
１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列か、又は配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種。
【請求項３】
産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量％以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上である請求項２に記載のエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種。
【請求項４】
エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株である請求項２又は３に記載のエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培養して得られる細菌培養物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌から採取された、アスタキサンチンを含有する組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培養する工程を有するアスタキサンチンの製造方法。
【請求項１】
産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量%以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上であるエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属。
【請求項２】
１６ＳｒＤＮＡの塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列か、又は配列番号1に示す塩基配列と９６％以上の相同性を有する塩基配列であるエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種。
【請求項３】
産生する組成物中に占めるアドニキサンチン含有量が３５質量％以上、アスタキサンチン含有量が５質量％以上である請求項２に記載のエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種。
【請求項４】
エリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種１８８４株である請求項２又は３に記載のエリスロバクター（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）ＪＰＣＣ Ｏ種。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培養して得られる細菌培養物。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌から採取された、アスタキサンチンを含有する組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌を培養する工程を有するアスタキサンチンの製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００８−２５９４４９（Ｐ２００８−２５９４４９Ａ）
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１０４７１１（Ｐ２００７−１０４７１１）
【出願日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（０００２１７６８６）電源開発株式会社 (207)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【出願人】（０００２１７６８６）電源開発株式会社 (207)
【Ｆターム（参考）】
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