クロストリジウム・ブチリカムのバクテリオシンをコードする遺伝子およびそのタンパク質
【課題】クロストリジウム・ブチリカムのｃｒｙｐｔｉｃプラスミドを解析し、その機能、塩基配列および活性部位を特定すること。
【解決手段】クロストリジウム・ブチリカムのｃｒｙｐｔｉｃプラスミド中、バクテリオシンをコードする塩基配列を決定した。
【解決手段】クロストリジウム・ブチリカムのｃｒｙｐｔｉｃプラスミド中、バクテリオシンをコードする塩基配列を決定した。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)のバクテリオシンをコードするＤＮＡの３’末端側の特定のＤＮＡからなる遺伝子、バクテリオシンのＣ末端側の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、当該遺伝子を有する組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ブチリカムは、現在、整腸剤などの医薬品、食品及び飼料添加剤など様々な分野において有用菌として使用されており、広く一般に知られている。例えば、非特許文献１または２では、クロストリジウム・ディフィシル下痢症に対してクロストリジウム・ブチリカム投与による治療が提案されている。これは、クロストリジウム・ブチリカムとクロストリジウム・ディフィシルとの腸内での競争的排除（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を利用したものである。
【非特許文献１】日本細菌学会誌４３（４）、８２９（１９８８）
【非特許文献２】感染症学会誌６４（１１）、１４２５（１９９０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、クロストリジウム・ブチリカムのクロストリジウム・ディフィシル下痢症への有効性に対する詳細なメカニズムや活性物質については、未だ十分には検討されていない。
【０００４】
一方、クロストリジウム・ブチリカムは、ｃｒｙｐｔｉｃプラスミドを有することが知られている。本発明者らは、該プラスミドが何らかの重要な機能を果たすのではないかと推定し、該プラスミドの塩基配列や活性部位についての詳細な検討を行った。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、クロストリジウム・ブチリカムのｃｒｙｐｔｉｃプラスミドを解析し、その塩基配列、機能および活性部位を特定することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、クロストリジウム・ブチリカム、具体的にはクロストリジウム・ブチリカムは、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８(Clostridium butyricum MIYAIRI 588) ＦＥＲＭ ＢＰ−２７８９（微工研菌寄第２７８９号）が有するプラスミドの全塩基配列を決定し、該プラスミドの機能を決定した。
【０００７】
その結果、該プラスミドが発現するタンパク質の一つがバクテリオシンであることを見出した。さらに、該バクテリオシンを構成するアミノ酸配列のうち、Ｃ末端側の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質が活性部位であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；または（ｂ）上記（ａ）の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の（ｃ）〜（ｆ）の組換えタンパク質は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｃｉｌｅ）、クロストリジウム・ベイジェリンキー(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）などの特定の細菌に対して抗菌スペクトルを示す。このため、本発明の（ｃ）〜（ｆ）の組換えタンパク質は、下痢症のクロストリジウム・ディフィシルが原因菌であるクロストリジウム・ディフィシルに有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明の第１は、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを含有する遺伝子、配列番号２の推定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および配列番号２にメチオニン（Ｍ）を最初に付加した配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質を提供するものである。
【００１２】
本発明の遺伝子を構成するＤＮＡは、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡ（以下、「ＤＮＡ変異体」と称することもある）であってもよい。この際、ＤＮＡ変異体は、クロストリジウム・ブチリカムの産生するバクテリオシンをコードすることが必須であり、さらに上記配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと相同性が９０％以上、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の塩基配列からなることが好ましい。
【００１３】
本発明において、ＤＮＡ変異体は、当該分野において既知の方法によって、上記配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡから調製できる。このような操作としては、例えば、部位特異的突然変異誘発、点変異、欠失、重複、逆位、挿入、転座、遺伝コードの縮重によりアミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを変更する保存的変更などが挙げられる。
【００１４】
また、本発明の組換えタンパク質は、配列番号２または３のアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２４個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質（以下、「タンパク質誘導体」とも称する）であってもよい。この際、タンパク質誘導体としては、上記したようなＤＮＡ変異体によってコードされるタンパク質、さらには基本的な活性は変化させずにアミノ酸配列が保存的あるいは半保存的に変更（例えば、グリシン、バリン、ロイシンやイソロイシン等の脂肪族鎖を有するアミノ酸同士の置換やフェニルアラニン、チロシンやトリプトファン等の芳香族鎖を有するアミノ酸同士の置換）されたタンパク質などが挙げられる。
【００１５】
本発明の配列番号１に示される塩基配列は、配列番号４の５’末端側から７０３〜９５４番目の塩基配列からなるＤＮＡである。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号４から推定されるアミノ酸配列（配列番号５）のＮ末端側から２３５〜３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１６】
本発明者らは、実施例で示されるように、クロストリジウム・ブチリカムのｃｒｙｐｔｉｃプラスミドを解析した結果、バクテリオシンをコードするＤＮＡ配列を決定した（配列番号４）。また、本発明者らは、該バクテリオシンを構成するアミノ酸配列のうち、該アミノ酸配列のＣ末端側配列である配列番号２のタンパク質が抗菌活性部位であることを特定した。さらに、配列番号４のうち、配列番号２に対応する塩基配列を塩基配列１とした。
【００１７】
以下、本明細書において、以下の（ｃ）〜（ｆ）の組換えタンパク質をＣＴバクテリオシンと称する：（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質；（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質；または（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質。
【００１８】
配列番号４でコードされるバクテリオシンおよびＣＴバクテリオシンは、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ベイジェリンキーに抗菌活性を有する。抗生物質等の化学療法薬は、今日、種々の感染症の予防や治療に使用されており、広域な抗菌スペクトルと強力な抗菌活性を有するものが主流となっている。したがって、抗生物質等を投与すると標的病原菌のみならず種々の有用菌にまで作用して、一定の割合で棲み分けがされていた腸内菌叢のバランスが崩れ、通常は他の正常菌叢構成菌と拮抗し菌数の少ない抗生物質耐性菌が爆発的に増殖して新たな感染症を惹起することがある。例えば、各種広域合成ペニシリン、セファロスポリン、クリンダマイシン、リンコマイシン等の抗生物質の投与によって重篤な下痢、偽膜性大腸炎の発症がみられるが、これは腸内に異常増殖したクロストリジウム・ディフィシルが産生する腸管毒（トキシンＡ、Ｄ−ｌ毒素）および細胞毒（トキシンＢ、Ｄ−２毒素）によるものであることが知られている。バクテリオシンおよびＣＴバクテリオシンは、クロストリジウム・ディフィシルに対して抗菌活性を有し、また、抗菌スペクトルが狭い。したがって、クロストリジウム・ディフィシルに特異的に作用し、他の有用菌には作用しないため、非常に有用である。また、ＣＢＭ５８８はクロストリジウム・ディフィシルに対する拮抗作用があることが知られているが（日本細菌学会誌４３（４）、８２９（１９８８）、感染症学会誌６４（１１）、１４２５（１９９０））、バクテリオシンによる抗菌活性はそのメカニズムの１つであると考えられる。
【００１９】
また、バクテリオシンは、トリプシン処理により分解される（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９７６），９５，６７−７７）のに対し、ＣＴバクテリオシンは、トリプシンにより分解されないことを本発明者らは見出した。これは、ＣＴバクテリオシンを薬剤として摂取したときに、小腸で薬剤が分解されず、ターゲット器官である腸に適切に薬剤有効量を到達させることができるという点で、非常に有利である。
【００２０】
本発明の第２は、本発明の第１の遺伝子を含有する組換えベクターである。
【００２１】
該組換えベクターは、第１の遺伝子を含有する限り、特に限定されない。具体的には、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの最初に開始コドンＡＴＧを付加した遺伝子；配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子；配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子（配列番号４の塩基配列から、シグナル配列と推定される部位を除去した配列）；を適当な制限酵素で切断された発現用ベクター中に連結されることによって調製される。
【００２２】
また、組換えベクターの形態としては、プラスミド、コスミド、人工的な染色体、ウィルスまたはファージなどが挙げられる。さらに、上記概念による組換えベクターは、本発明の遺伝子がトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞を選択できるような一以上の選択マーカーを含むものであってもよい。このような選択マーカーの例としては、カナマイシン、アンピシリン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ゼオシン等の抗生物質、および細胞死関連遺伝子による制御などが挙げられる。
【００２３】
また、組換えベクターは、本発明の第１の遺伝子を発現させるプロモーターまたは他の制御配列（例えば、細菌発現用のリボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流制御領域、エンハンサー、オペレーターやシグナル配列等）が本発明の遺伝子に連結されるものであることが好ましい。このようなプロモーターまたは他の制御配列は、本発明の第１の遺伝子を発現できるものであれば特に制限されることなく、当該分野において既知のものが使用される。具体的には、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｓｐａプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、レトロウィルスＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、ＥＦプロモーター等、およびこれらのプロモーターの一部などが挙げられる。組換えベクターは、上記制御配列に加えて、タンパク質の発現を調節できる調節配列を含むものであってもよい。この際、調節配列としては、調節化合物の存在や種々の温度若しくは代謝条件等がある。
【００２４】
本発明の第３は、上記した本発明の組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００２５】
宿主細胞は、当該分野において既知の方法によって、本発明の組換えベクターを宿主細胞にトランスフェクションまたは形質転換することによって得られる。また、トランスフェクションまたは形質転換される宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、および酵母、カビ、ヒト腎胚細胞（２９３）、サル腎細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ショウジョウバエ(Drosophila)細胞またはネズミＬ細胞等の哺乳動物細胞、バキュロウィルスによる昆虫細胞、ガン細胞等の真核細胞、カイコ等の個体が挙げられ、これらのうち、操作が容易でかつ当該分野において良く知られている点、大量培養が容易で目的とする遺伝子やタンパク質を大量に産生できる点及び目的とする遺伝子やタンパク質の精製方法がよく確立されている点などを考慮すると、大腸菌、ＣＨＯ細胞が本発明において好ましく使用される。
【００２６】
本発明の第２のベクター、および宿主細胞を使用することにより、活性部位であるＣＴバクテリオシンを製造することが可能となり、さらに大量生産が可能であるため、工業生産的にも非常に有意である。
【００２７】
本発明の組換えＣＴバクテリオシンは、バクテリオシン活性を有するため、該ＣＴバクテリオシンを有効成分とする医薬組成物とすることができる。該医薬組成物は、クロストリジウム・ディフィシル下痢症および偽膜性大腸炎の予防および治療用として患者に投与することができる。
【００２８】
医薬組成物は、上記ＣＴバクテリオシン、および製薬上許容される担体と配合して、または製薬上許容される溶剤に溶解もしくは懸濁した組成物として、経口的または非経口的に患者に投与できる。たとえば、該タンパク質を添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルロースカルシウム、カルボシキメチルセルーロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の充填剤または希釈剤等と適宜混合して、錠剤、散剤（粉末）、丸剤、および顆粒剤等の固型製剤にすることができる。また、硬質または軟質のゼラチンカプセル等を用いてカプセル剤としてもよい。これらの固型製剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートフタレート、メタアクリレートコポリマー等の被覆用基剤を用いて腸溶性被覆を施してもよい。さらに、バクテリオシンを一般的に用いられる不活性希釈剤に溶解して、必要に応じて、この溶液に浸潤剤、乳化剤、分散助剤、界面活性剤、甘味料、フレーバー、芳香物質等を適宜添加することにより、シロップ剤、エリキシル剤等の液状製剤とすることもできる。
【００２９】
上述したうち、好ましい投与形態や投与経路などは、担当の医師によって選択される。
【００３０】
また、本発明の医薬組成物全体における有効成分の含有量は、投与時の形態、病気の種類や重篤度や目的とする投与量などによって様々であるが、一般的には、原料の全質量に対して、０．１〜１００質量％、好ましくは５〜２０質量％、特に好ましくは２〜１０質量％である。
【００３１】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重及び症状、目的とする投与形態や方法、治療効果、および処置期間等によって異なり、正確な量は医師により決定されるものであるが、通常、１日当たり、好ましくは１〜５０ｍｇ、より好ましくは１０〜３０ｍｇの範囲である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を用いて、より具体的に本発明を説明する。なお、本発明が下記実施例に
限定されることはない。
【００３３】
（操作１）プラスミドの抽出
Ｃｌｏｃｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８（以下、ＣＢＭ５８８と称する）の菌体２００ｍｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（２５％ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）１ｍｌに懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。該懸濁液に１０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−２０ｍＭ ＥＤＴＡ中２％ ＳＤＳ，ｐＨ１２．５）を加えて混合した後、３４℃で２０分間インキュベートした。その後、７ｍｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）と１．２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌとを添加し、４℃で４時間静置した。フェノール抽出、エタノール沈殿処理し、該処理物を１５０μｌのＲＮａｓｅ（２０μｇ／ｍｌ）を含むＴＥバッファーで溶解した。これを０．７％のアガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを抽出した。
【００３４】
得られたプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶとで３７℃、３時間消化し、それぞれの制限酵素断片を予め制限酵素処理したクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製）にライゲーションした。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で生育した株を選択した。
【００３５】
選択した株からベクターを抽出し、シーケンス解析した。シーケンス解析は、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＣ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔによって得られた反応産物をＧｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）で解析を行い、プラスミドの全塩基配列を決定した。該プラスミドをｐＣＢＭ５８８と称した。
【００３６】
ｐＣＢＭ５８８の構造を図１に示す。ｐＣＢＭ５８８の全塩基数は、８０６０ｂｐ、ＧＣ％は２４．３％であり、９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が推定された。なお、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ によって解析した。
【００３７】
図１のＯＲＦ３がコードする塩基配列は、配列番号４で示される配列であった。また、ＯＲＦ３がコードする３４ｋＤａのタンパクはＣ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍの産生するＣｌｏｓｔｉｃｉｎ５７４（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００３），Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．３，ｐ．１５８９−１５９７）と４８％のアミノ酸の相同性が認められた。Ｃｌｏｓｔｉｃｉｎ５７４は、バクテリオシンであり、配列番号４から推定されるアミノ酸配列の配列番号５で示されるタンパク質は、バクテリオシンであると断定した。また、該タンパク質は、分子量や抗菌スペクトルからｂｕｔｙｒｉｃｉｎ７４２３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９７６），９５，６７−７７）と同一であると推察された。なお、アミノ酸配列の相同性検索は、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ検索によって行った。
【００３８】
次に、得られたアミノ酸配列から、シグナルペプチドの検索を行った。シグナルペプチドの検索はｓｉｇｎａｌＰ３．０を用いた。その結果、シグナルペプチドの配列は、Ｎ末端側の２９アミノ酸（ＭＩＫＫＩＳＫＩＴＳＹＩＬＦＡＡＬＴＴＳＬＬＰＳＩＮＡＮＡ）であることがわかった。このため、以下の操作例２においては、該シグナルペプチドを除去した部分の遺伝子（配列番号６）を用いた。
【００３９】
（操作例２）組換えバクテリオシンの産生
シグナルペプチドを除いたバクテリオシン遺伝子を大腸菌発現ベクターに組み込むために、図２に示されるようにして以下の操作を行った。
【００４０】
制限酵素ＮｃｏＩの認識部位を持つプライマーＦｂａｃ−０１（配列番号７） ５’ ＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＡＴＧＡＡＴＣＡＴＣ ３’と制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を持つプライマーＲｂａｃ−０２（配列番号８） ５’ＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＡＴ ３’とを用いて、操作１で得られた配列番号６の遺伝子をＰＣＲによって増幅した（図２）。ＰＣＲ産物はＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとで３７℃、３時間制限酵素処理を行い、予めＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとで切断した発現ベクターｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションして、バクテリオシン発現ベクターｐＢＡＣ０１を構築した。
【００４１】
ｐＢＡＣ０１を発現宿主であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で生育した株を選択した。選択されたシングルコロニーを１００ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）に接種し、３７℃で振とう培養した（非誘導菌体）。
【００４２】
ＯＤ６００が０．６に達した時点でバクテリオシン遺伝子の発現を誘導するために、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの濃度になるように添加してさらに４時間培養した。培養終了後、遠心分離に
よって菌体を回収し、−２０度で凍結した（誘導菌体）。
【００４３】
組換えタンパクの精製はＮｉ−ＮＴＡ ｆａｓｔ ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて行った。菌体ペレットを融解した後、ｌｙｓｏｚｙｍｅ １０ｍｇとＢｅｎｓｏｎａｓｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）２５０Ｕを含む１０ｍｌのｎａｔｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）で懸濁して３０分間氷上でインキュベートした（可溶化画分）。これを１４，０００ｇで３０分間遠心分離し、その上清を０．５ｍｌのｎｉｃｋｅｌ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｎｉ−ＮＴＡ）カラムにアプライした（通過したものを「カラム通過画分」とする）。４ｍｌのｎａｔｉｖｅ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）で２回洗浄した後（図３中、１回目の洗浄を「洗浄１」と、２回目の洗浄を「洗浄２」とする）、１ｍｌのｎａｔｉｖｅ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）で２回溶出し、６×Ｈｉｓ ｔａｇタンパクを溶出した。
【００４４】
回収した全ての画分は等量の２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを添加し９５℃で５分間加熱した後、Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１４％）によって分離した。ゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０によって染色した。結果を図３に示す。図３に示すように、溶出１回目（図中、「溶出１」）および溶出２回目（図中、「溶出２」）のサンプルには、約２９ｋＤａおよび約１０ｋＤａにバンドが検出された。
【００４５】
次に、組換えタンパク質を免疫学的手法によって検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ポリアクリルアミドゲル中のタンパクをＰＶＤＦ膜にブロッティングした。１次抗体としてＰｅｎｔａ Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、２次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ１ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ（Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を使用した。検出は４−クロル−１−ナフロールと過酸化水素を使用した発色法を用いた。結果を図４Ａに示す。なお、図４Ａに示したものは、溶出１回目のサンプル（図３のレーン７）である。
【００４６】
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、アミノ酸配列分析装置はＰｒｏｃｉｓｅ ４９２ｃＬＣを使用して、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした組換えタンパク質のアミノ酸分析を行った。その結果、約１０ｋＤａのタンパク質のＮ末端アミノ酸配列はＰＳＡＷＱであることがわかった。すなわち約１０ｋＤａのタンパク質は、配列番号５のＮ末端側から２３５〜３１７番目のアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質であることがわかった。
【００４７】
（評価例１）
組換えバクテリオシンの活性を測定するために、ＳＤＳとβ−メルカプトエタノールを２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーから除いた非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプルは溶出電気泳動終了後、ゲルを固定液（２０％イソプロパノール、１０％酢酸、７０％水）で固定した後、水で洗浄し、最後にＰＢＳ中で３０分間振とうした。変法ＧＡＭ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬社製）にゲルを載せ、その上に０．７５％寒天と１％の指示菌（Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ ＪＣＭ１４０８）の培養液を含むＧＡＭブイヨン「ニッスイ」（日水製薬社製）を重層し、３７℃で１６時間嫌気培養を行った。図４Ｂに、溶出１回目のサンプル（図３のレーン７）の結果を示す。図４Ｂに示すように、図３の１０ｋＤａ付近のバンドのタンパク質（以下、このタンパク質をバクテリオシンＡと称する）が抗菌活性を示すことがわかった。バクテリオシンＡは、約３４ｋＤａの完全なバクテリオシン（バクテリオシンＢ）の一部である。バクテリオシンＡは図４Ａで示したように免疫染色によってＨｉｓタグが検出されたため、バクテリオシンＢのＣ末端領域であることが示された。
【００４８】
（評価例２）
９６穴のマルチプレートにＧＡＭブイヨンでバクテリオシンを含む試料（溶出画分とＣＢＭ５８８をＧＡＭブイヨン２４時間培養した上清）を連続２倍希釈して１００μずつ分注し、そこに１％の指示菌（Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ ＪＣＭ１４０８（ＡＴＣＣ６０１３））を含むＧＡＭブイヨンを１００μＬ添加した。３７℃で１６時間嫌気培養した後、６００ｎｍの吸光度を測定した。サンプル無添加の対照と比べ５０％以上の増殖抑制が認められた希釈段階をバクテリオシンの活性単位（ＡＵ）とした。結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
（評価例３）
ＧＡＭ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬社製）の上に０．７５％寒天と１％の指示菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＪＣＭ １２９６（ＡＴＣＣ９６８９））の培養液を含むＧＡＭブイヨンを重層した。その上に６ｍｍのペーパーディスクを載せ、２５μｌのサンプルを添加後、３７℃で１６時間嫌気培養を行った。ディスクの周囲に認められる透明の増殖阻止帯を観察した。サンプルは、上記溶出１を用い、５０ｍＭ ＰＢＳを用いて１０倍〜１００倍に希釈した。
【００５１】
結果を図５に示す。図５に示すように、バクテリオシンＡを含むサンプルは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｃｉｌｅに対して、抗菌活性を有することがわかる。Ｃ末端側であるバクテリオシンＡであっても活性が維持されることから、バクテリオシンの抗菌活性部位は、Ｃ末端側にあることが明らかとなった。
【００５２】
（評価例４）
試料は、溶出１を５０ｍＭ トリスバッファー（ｐＨ８．０）で１００倍希釈したものを用いた。
【００５３】
トリプシン処理：ウシ脾臓製トリプシン（和光純薬工業製）を１ｍｇ／ｌの濃度で５０ｍＭ トリスバッファー（ｐＨ８．０）を用いて３７℃、６時間反応を行った。
【００５４】
その結果、図６に示すようにバクテリオシンＡは、トリプシンで処理しても、抗菌活性が維持されることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】プラスミドｐＣＢＭ５８８の構造を示す概略図である。
【図２】操作例２のＰＣＲの概略を示す図である。
【図３】操作例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】操作例２におけるイムノブロッティングの結果を示す図および組換えバクテリオシンの活性の結果を示す図である。
【図５】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｃｉｌｅ ＪＣＭ １２９６に対するバクテリオシン活性の結果を示す図である。
【図６】バクテリオシンをトリプシン処理した結果を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロストリジウム・ブチリカム(Clostridium butyricum)のバクテリオシンをコードするＤＮＡの３’末端側の特定のＤＮＡからなる遺伝子、バクテリオシンのＣ末端側の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質、当該遺伝子を有する組換えベクター、およびこの組換えベクターを含む宿主細胞を提供するものである。
【背景技術】
【０００２】
クロストリジウム・ブチリカムは、現在、整腸剤などの医薬品、食品及び飼料添加剤など様々な分野において有用菌として使用されており、広く一般に知られている。例えば、非特許文献１または２では、クロストリジウム・ディフィシル下痢症に対してクロストリジウム・ブチリカム投与による治療が提案されている。これは、クロストリジウム・ブチリカムとクロストリジウム・ディフィシルとの腸内での競争的排除（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を利用したものである。
【非特許文献１】日本細菌学会誌４３（４）、８２９（１９８８）
【非特許文献２】感染症学会誌６４（１１）、１４２５（１９９０）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、クロストリジウム・ブチリカムのクロストリジウム・ディフィシル下痢症への有効性に対する詳細なメカニズムや活性物質については、未だ十分には検討されていない。
【０００４】
一方、クロストリジウム・ブチリカムは、ｃｒｙｐｔｉｃプラスミドを有することが知られている。本発明者らは、該プラスミドが何らかの重要な機能を果たすのではないかと推定し、該プラスミドの塩基配列や活性部位についての詳細な検討を行った。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、クロストリジウム・ブチリカムのｃｒｙｐｔｉｃプラスミドを解析し、その塩基配列、機能および活性部位を特定することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、クロストリジウム・ブチリカム、具体的にはクロストリジウム・ブチリカムは、クロストリジウム・ブチリカム・ミヤイリ ５８８(Clostridium butyricum MIYAIRI 588) ＦＥＲＭ ＢＰ−２７８９（微工研菌寄第２７８９号）が有するプラスミドの全塩基配列を決定し、該プラスミドの機能を決定した。
【０００７】
その結果、該プラスミドが発現するタンパク質の一つがバクテリオシンであることを見出した。さらに、該バクテリオシンを構成するアミノ酸配列のうち、Ｃ末端側の特定のアミノ酸配列からなるタンパク質が活性部位であることを見出し、本発明を完成させた。
【０００８】
すなわち、本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；または（ｂ）上記（ａ）の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の（ｃ）〜（ｆ）の組換えタンパク質は、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｃｉｌｅ）、クロストリジウム・ベイジェリンキー(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）などの特定の細菌に対して抗菌スペクトルを示す。このため、本発明の（ｃ）〜（ｆ）の組換えタンパク質は、下痢症のクロストリジウム・ディフィシルが原因菌であるクロストリジウム・ディフィシルに有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１１】
本発明の第１は、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡを含有する遺伝子、配列番号２の推定されるアミノ酸配列からなるタンパク質、および配列番号２にメチオニン（Ｍ）を最初に付加した配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質を提供するものである。
【００１２】
本発明の遺伝子を構成するＤＮＡは、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の相同性を有するＤＮＡ（以下、「ＤＮＡ変異体」と称することもある）であってもよい。この際、ＤＮＡ変異体は、クロストリジウム・ブチリカムの産生するバクテリオシンをコードすることが必須であり、さらに上記配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡと相同性が９０％以上、より好ましくは９２％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上、最も好ましくは９９％以上の塩基配列からなることが好ましい。
【００１３】
本発明において、ＤＮＡ変異体は、当該分野において既知の方法によって、上記配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡから調製できる。このような操作としては、例えば、部位特異的突然変異誘発、点変異、欠失、重複、逆位、挿入、転座、遺伝コードの縮重によりアミノ酸配列を変えずに塩基配列のみを変更する保存的変更などが挙げられる。
【００１４】
また、本発明の組換えタンパク質は、配列番号２または３のアミノ酸配列において１若しくは数個、好ましくは１〜２４個、より好ましくは１〜１５個、さらに好ましくは１〜８個、特に好ましくは１〜３個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質（以下、「タンパク質誘導体」とも称する）であってもよい。この際、タンパク質誘導体としては、上記したようなＤＮＡ変異体によってコードされるタンパク質、さらには基本的な活性は変化させずにアミノ酸配列が保存的あるいは半保存的に変更（例えば、グリシン、バリン、ロイシンやイソロイシン等の脂肪族鎖を有するアミノ酸同士の置換やフェニルアラニン、チロシンやトリプトファン等の芳香族鎖を有するアミノ酸同士の置換）されたタンパク質などが挙げられる。
【００１５】
本発明の配列番号１に示される塩基配列は、配列番号４の５’末端側から７０３〜９５４番目の塩基配列からなるＤＮＡである。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列は、配列番号４から推定されるアミノ酸配列（配列番号５）のＮ末端側から２３５〜３１７番目のアミノ酸配列からなるタンパク質である。
【００１６】
本発明者らは、実施例で示されるように、クロストリジウム・ブチリカムのｃｒｙｐｔｉｃプラスミドを解析した結果、バクテリオシンをコードするＤＮＡ配列を決定した（配列番号４）。また、本発明者らは、該バクテリオシンを構成するアミノ酸配列のうち、該アミノ酸配列のＣ末端側配列である配列番号２のタンパク質が抗菌活性部位であることを特定した。さらに、配列番号４のうち、配列番号２に対応する塩基配列を塩基配列１とした。
【００１７】
以下、本明細書において、以下の（ｃ）〜（ｆ）の組換えタンパク質をＣＴバクテリオシンと称する：（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質；（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質；または（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質。
【００１８】
配列番号４でコードされるバクテリオシンおよびＣＴバクテリオシンは、クロストリジウム・ディフィシル、クロストリジウム・ベイジェリンキーに抗菌活性を有する。抗生物質等の化学療法薬は、今日、種々の感染症の予防や治療に使用されており、広域な抗菌スペクトルと強力な抗菌活性を有するものが主流となっている。したがって、抗生物質等を投与すると標的病原菌のみならず種々の有用菌にまで作用して、一定の割合で棲み分けがされていた腸内菌叢のバランスが崩れ、通常は他の正常菌叢構成菌と拮抗し菌数の少ない抗生物質耐性菌が爆発的に増殖して新たな感染症を惹起することがある。例えば、各種広域合成ペニシリン、セファロスポリン、クリンダマイシン、リンコマイシン等の抗生物質の投与によって重篤な下痢、偽膜性大腸炎の発症がみられるが、これは腸内に異常増殖したクロストリジウム・ディフィシルが産生する腸管毒（トキシンＡ、Ｄ−ｌ毒素）および細胞毒（トキシンＢ、Ｄ−２毒素）によるものであることが知られている。バクテリオシンおよびＣＴバクテリオシンは、クロストリジウム・ディフィシルに対して抗菌活性を有し、また、抗菌スペクトルが狭い。したがって、クロストリジウム・ディフィシルに特異的に作用し、他の有用菌には作用しないため、非常に有用である。また、ＣＢＭ５８８はクロストリジウム・ディフィシルに対する拮抗作用があることが知られているが（日本細菌学会誌４３（４）、８２９（１９８８）、感染症学会誌６４（１１）、１４２５（１９９０））、バクテリオシンによる抗菌活性はそのメカニズムの１つであると考えられる。
【００１９】
また、バクテリオシンは、トリプシン処理により分解される（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９７６），９５，６７−７７）のに対し、ＣＴバクテリオシンは、トリプシンにより分解されないことを本発明者らは見出した。これは、ＣＴバクテリオシンを薬剤として摂取したときに、小腸で薬剤が分解されず、ターゲット器官である腸に適切に薬剤有効量を到達させることができるという点で、非常に有利である。
【００２０】
本発明の第２は、本発明の第１の遺伝子を含有する組換えベクターである。
【００２１】
該組換えベクターは、第１の遺伝子を含有する限り、特に限定されない。具体的には、配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡの最初に開始コドンＡＴＧを付加した遺伝子；配列番号４の塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子；配列番号６の塩基配列からなるＤＮＡからなる遺伝子（配列番号４の塩基配列から、シグナル配列と推定される部位を除去した配列）；を適当な制限酵素で切断された発現用ベクター中に連結されることによって調製される。
【００２２】
また、組換えベクターの形態としては、プラスミド、コスミド、人工的な染色体、ウィルスまたはファージなどが挙げられる。さらに、上記概念による組換えベクターは、本発明の遺伝子がトランスフェクションまたは形質転換された宿主細胞を選択できるような一以上の選択マーカーを含むものであってもよい。このような選択マーカーの例としては、カナマイシン、アンピシリン、ネオマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ゼオシン等の抗生物質、および細胞死関連遺伝子による制御などが挙げられる。
【００２３】
また、組換えベクターは、本発明の第１の遺伝子を発現させるプロモーターまたは他の制御配列（例えば、細菌発現用のリボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終止配列、上流制御領域、エンハンサー、オペレーターやシグナル配列等）が本発明の遺伝子に連結されるものであることが好ましい。このようなプロモーターまたは他の制御配列は、本発明の第１の遺伝子を発現できるものであれば特に制限されることなく、当該分野において既知のものが使用される。具体的には、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｓｐａプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター、レトロウィルスＬＴＲ（ｌｏｎｇ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｐｅａｔ）、ＥＦプロモーター等、およびこれらのプロモーターの一部などが挙げられる。組換えベクターは、上記制御配列に加えて、タンパク質の発現を調節できる調節配列を含むものであってもよい。この際、調節配列としては、調節化合物の存在や種々の温度若しくは代謝条件等がある。
【００２４】
本発明の第３は、上記した本発明の組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００２５】
宿主細胞は、当該分野において既知の方法によって、本発明の組換えベクターを宿主細胞にトランスフェクションまたは形質転換することによって得られる。また、トランスフェクションまたは形質転換される宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌等の原核細胞、および酵母、カビ、ヒト腎胚細胞（２９３）、サル腎細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ショウジョウバエ(Drosophila)細胞またはネズミＬ細胞等の哺乳動物細胞、バキュロウィルスによる昆虫細胞、ガン細胞等の真核細胞、カイコ等の個体が挙げられ、これらのうち、操作が容易でかつ当該分野において良く知られている点、大量培養が容易で目的とする遺伝子やタンパク質を大量に産生できる点及び目的とする遺伝子やタンパク質の精製方法がよく確立されている点などを考慮すると、大腸菌、ＣＨＯ細胞が本発明において好ましく使用される。
【００２６】
本発明の第２のベクター、および宿主細胞を使用することにより、活性部位であるＣＴバクテリオシンを製造することが可能となり、さらに大量生産が可能であるため、工業生産的にも非常に有意である。
【００２７】
本発明の組換えＣＴバクテリオシンは、バクテリオシン活性を有するため、該ＣＴバクテリオシンを有効成分とする医薬組成物とすることができる。該医薬組成物は、クロストリジウム・ディフィシル下痢症および偽膜性大腸炎の予防および治療用として患者に投与することができる。
【００２８】
医薬組成物は、上記ＣＴバクテリオシン、および製薬上許容される担体と配合して、または製薬上許容される溶剤に溶解もしくは懸濁した組成物として、経口的または非経口的に患者に投与できる。たとえば、該タンパク質を添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成もしくは天然ガム、結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、セルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルロースカルシウム、カルボシキメチルセルーロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム等の充填剤または希釈剤等と適宜混合して、錠剤、散剤（粉末）、丸剤、および顆粒剤等の固型製剤にすることができる。また、硬質または軟質のゼラチンカプセル等を用いてカプセル剤としてもよい。これらの固型製剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートフタレート、メタアクリレートコポリマー等の被覆用基剤を用いて腸溶性被覆を施してもよい。さらに、バクテリオシンを一般的に用いられる不活性希釈剤に溶解して、必要に応じて、この溶液に浸潤剤、乳化剤、分散助剤、界面活性剤、甘味料、フレーバー、芳香物質等を適宜添加することにより、シロップ剤、エリキシル剤等の液状製剤とすることもできる。
【００２９】
上述したうち、好ましい投与形態や投与経路などは、担当の医師によって選択される。
【００３０】
また、本発明の医薬組成物全体における有効成分の含有量は、投与時の形態、病気の種類や重篤度や目的とする投与量などによって様々であるが、一般的には、原料の全質量に対して、０．１〜１００質量％、好ましくは５〜２０質量％、特に好ましくは２〜１０質量％である。
【００３１】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年齢、体重及び症状、目的とする投与形態や方法、治療効果、および処置期間等によって異なり、正確な量は医師により決定されるものであるが、通常、１日当たり、好ましくは１〜５０ｍｇ、より好ましくは１０〜３０ｍｇの範囲である。
【実施例】
【００３２】
以下、実施例を用いて、より具体的に本発明を説明する。なお、本発明が下記実施例に
限定されることはない。
【００３３】
（操作１）プラスミドの抽出
Ｃｌｏｃｔｒｉｄｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍ ＭＩＹＡＩＲＩ ５８８（以下、ＣＢＭ５８８と称する）の菌体２００ｍｇを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（２５％ｓｕｃｒｏｓｅ，１ｍｇ／ｍｌ ｌｙｓｏｚｙｍｅ）１ｍｌに懸濁し、室温で１５分間インキュベートした。該懸濁液に１０ｍｌの溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−２０ｍＭ ＥＤＴＡ中２％ ＳＤＳ，ｐＨ１２．５）を加えて混合した後、３４℃で２０分間インキュベートした。その後、７ｍｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）と１．２ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌとを添加し、４℃で４時間静置した。フェノール抽出、エタノール沈殿処理し、該処理物を１５０μｌのＲＮａｓｅ（２０μｇ／ｍｌ）を含むＴＥバッファーで溶解した。これを０．７％のアガロースゲルで電気泳動後、エチジウムブロマイドで染色し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いてプラスミドを抽出した。
【００３４】
得られたプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶとで３７℃、３時間消化し、それぞれの制限酵素断片を予め制限酵素処理したクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製）にライゲーションした。その後、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ社製）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で生育した株を選択した。
【００３５】
選択した株からベクターを抽出し、シーケンス解析した。シーケンス解析は、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＣ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔによって得られた反応産物をＧｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ３１０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）で解析を行い、プラスミドの全塩基配列を決定した。該プラスミドをｐＣＢＭ５８８と称した。
【００３６】
ｐＣＢＭ５８８の構造を図１に示す。ｐＣＢＭ５８８の全塩基数は、８０６０ｂｐ、ＧＣ％は２４．３％であり、９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が推定された。なお、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＧｅｎＭａｒｋ．ｈｍｍ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ によって解析した。
【００３７】
図１のＯＲＦ３がコードする塩基配列は、配列番号４で示される配列であった。また、ＯＲＦ３がコードする３４ｋＤａのタンパクはＣ．ｔｙｒｏｂｕｔｙｒｉｃｕｍの産生するＣｌｏｓｔｉｃｉｎ５７４（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００３），Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．３，ｐ．１５８９−１５９７）と４８％のアミノ酸の相同性が認められた。Ｃｌｏｓｔｉｃｉｎ５７４は、バクテリオシンであり、配列番号４から推定されるアミノ酸配列の配列番号５で示されるタンパク質は、バクテリオシンであると断定した。また、該タンパク質は、分子量や抗菌スペクトルからｂｕｔｙｒｉｃｉｎ７４２３（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（１９７６），９５，６７−７７）と同一であると推察された。なお、アミノ酸配列の相同性検索は、ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ検索によって行った。
【００３８】
次に、得られたアミノ酸配列から、シグナルペプチドの検索を行った。シグナルペプチドの検索はｓｉｇｎａｌＰ３．０を用いた。その結果、シグナルペプチドの配列は、Ｎ末端側の２９アミノ酸（ＭＩＫＫＩＳＫＩＴＳＹＩＬＦＡＡＬＴＴＳＬＬＰＳＩＮＡＮＡ）であることがわかった。このため、以下の操作例２においては、該シグナルペプチドを除去した部分の遺伝子（配列番号６）を用いた。
【００３９】
（操作例２）組換えバクテリオシンの産生
シグナルペプチドを除いたバクテリオシン遺伝子を大腸菌発現ベクターに組み込むために、図２に示されるようにして以下の操作を行った。
【００４０】
制限酵素ＮｃｏＩの認識部位を持つプライマーＦｂａｃ−０１（配列番号７） ５’ ＡＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＡＴＧＡＡＴＣＡＴＣ ３’と制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ認識部位を持つプライマーＲｂａｃ−０２（配列番号８） ５’ＴＧＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＴＡＴ ３’とを用いて、操作１で得られた配列番号６の遺伝子をＰＣＲによって増幅した（図２）。ＰＣＲ産物はＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとで３７℃、３時間制限酵素処理を行い、予めＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩとで切断した発現ベクターｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションして、バクテリオシン発現ベクターｐＢＡＣ０１を構築した。
【００４１】
ｐＢＡＣ０１を発現宿主であるＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地で生育した株を選択した。選択されたシングルコロニーを１００ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）に接種し、３７℃で振とう培養した（非誘導菌体）。
【００４２】
ＯＤ６００が０．６に達した時点でバクテリオシン遺伝子の発現を誘導するために、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を１ｍＭの濃度になるように添加してさらに４時間培養した。培養終了後、遠心分離に
よって菌体を回収し、−２０度で凍結した（誘導菌体）。
【００４３】
組換えタンパクの精製はＮｉ−ＮＴＡ ｆａｓｔ ｓｔａｒｔ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を用いて行った。菌体ペレットを融解した後、ｌｙｓｏｚｙｍｅ １０ｍｇとＢｅｎｓｏｎａｓｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ社製）２５０Ｕを含む１０ｍｌのｎａｔｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）で懸濁して３０分間氷上でインキュベートした（可溶化画分）。これを１４，０００ｇで３０分間遠心分離し、その上清を０．５ｍｌのｎｉｃｋｅｌ−ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（Ｎｉ−ＮＴＡ）カラムにアプライした（通過したものを「カラム通過画分」とする）。４ｍｌのｎａｔｉｖｅ ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）で２回洗浄した後（図３中、１回目の洗浄を「洗浄１」と、２回目の洗浄を「洗浄２」とする）、１ｍｌのｎａｔｉｖｅ ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．０）で２回溶出し、６×Ｈｉｓ ｔａｇタンパクを溶出した。
【００４４】
回収した全ての画分は等量の２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーを添加し９５℃で５分間加熱した後、Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（１４％）によって分離した。ゲルはＣｏｏｍａｓｓｉｅ ｂｌｕｅ Ｒ−２５０によって染色した。結果を図３に示す。図３に示すように、溶出１回目（図中、「溶出１」）および溶出２回目（図中、「溶出２」）のサンプルには、約２９ｋＤａおよび約１０ｋＤａにバンドが検出された。
【００４５】
次に、組換えタンパク質を免疫学的手法によって検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、ポリアクリルアミドゲル中のタンパクをＰＶＤＦ膜にブロッティングした。１次抗体としてＰｅｎｔａ Ｈｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｑｉａｇｅｎ社製）、２次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ１ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ（Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）を使用した。検出は４−クロル−１−ナフロールと過酸化水素を使用した発色法を用いた。結果を図４Ａに示す。なお、図４Ａに示したものは、溶出１回目のサンプル（図３のレーン７）である。
【００４６】
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、アミノ酸配列分析装置はＰｒｏｃｉｓｅ ４９２ｃＬＣを使用して、ＰＶＤＦ膜にブロッティングした組換えタンパク質のアミノ酸分析を行った。その結果、約１０ｋＤａのタンパク質のＮ末端アミノ酸配列はＰＳＡＷＱであることがわかった。すなわち約１０ｋＤａのタンパク質は、配列番号５のＮ末端側から２３５〜３１７番目のアミノ酸配列（配列番号２）からなるタンパク質であることがわかった。
【００４７】
（評価例１）
組換えバクテリオシンの活性を測定するために、ＳＤＳとβ−メルカプトエタノールを２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファーから除いた非還元のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。サンプルは溶出電気泳動終了後、ゲルを固定液（２０％イソプロパノール、１０％酢酸、７０％水）で固定した後、水で洗浄し、最後にＰＢＳ中で３０分間振とうした。変法ＧＡＭ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬社製）にゲルを載せ、その上に０．７５％寒天と１％の指示菌（Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ ＪＣＭ１４０８）の培養液を含むＧＡＭブイヨン「ニッスイ」（日水製薬社製）を重層し、３７℃で１６時間嫌気培養を行った。図４Ｂに、溶出１回目のサンプル（図３のレーン７）の結果を示す。図４Ｂに示すように、図３の１０ｋＤａ付近のバンドのタンパク質（以下、このタンパク質をバクテリオシンＡと称する）が抗菌活性を示すことがわかった。バクテリオシンＡは、約３４ｋＤａの完全なバクテリオシン（バクテリオシンＢ）の一部である。バクテリオシンＡは図４Ａで示したように免疫染色によってＨｉｓタグが検出されたため、バクテリオシンＢのＣ末端領域であることが示された。
【００４８】
（評価例２）
９６穴のマルチプレートにＧＡＭブイヨンでバクテリオシンを含む試料（溶出画分とＣＢＭ５８８をＧＡＭブイヨン２４時間培養した上清）を連続２倍希釈して１００μずつ分注し、そこに１％の指示菌（Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ ＪＣＭ１４０８（ＡＴＣＣ６０１３））を含むＧＡＭブイヨンを１００μＬ添加した。３７℃で１６時間嫌気培養した後、６００ｎｍの吸光度を測定した。サンプル無添加の対照と比べ５０％以上の増殖抑制が認められた希釈段階をバクテリオシンの活性単位（ＡＵ）とした。結果を表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
（評価例３）
ＧＡＭ寒天培地「ニッスイ」（日水製薬社製）の上に０．７５％寒天と１％の指示菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ ＪＣＭ １２９６（ＡＴＣＣ９６８９））の培養液を含むＧＡＭブイヨンを重層した。その上に６ｍｍのペーパーディスクを載せ、２５μｌのサンプルを添加後、３７℃で１６時間嫌気培養を行った。ディスクの周囲に認められる透明の増殖阻止帯を観察した。サンプルは、上記溶出１を用い、５０ｍＭ ＰＢＳを用いて１０倍〜１００倍に希釈した。
【００５１】
結果を図５に示す。図５に示すように、バクテリオシンＡを含むサンプルは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｃｉｌｅに対して、抗菌活性を有することがわかる。Ｃ末端側であるバクテリオシンＡであっても活性が維持されることから、バクテリオシンの抗菌活性部位は、Ｃ末端側にあることが明らかとなった。
【００５２】
（評価例４）
試料は、溶出１を５０ｍＭ トリスバッファー（ｐＨ８．０）で１００倍希釈したものを用いた。
【００５３】
トリプシン処理：ウシ脾臓製トリプシン（和光純薬工業製）を１ｍｇ／ｌの濃度で５０ｍＭ トリスバッファー（ｐＨ８．０）を用いて３７℃、６時間反応を行った。
【００５４】
その結果、図６に示すようにバクテリオシンＡは、トリプシンで処理しても、抗菌活性が維持されることが明らかとなった。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】プラスミドｐＣＢＭ５８８の構造を示す概略図である。
【図２】操作例２のＰＣＲの概略を示す図である。
【図３】操作例２におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す図である。
【図４】操作例２におけるイムノブロッティングの結果を示す図および組換えバクテリオシンの活性の結果を示す図である。
【図５】Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｃｉｌｅ ＪＣＭ １２９６に対するバクテリオシン活性の結果を示す図である。
【図６】バクテリオシンをトリプシン処理した結果を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；または
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ｃ）または（ｄ）の組換えタンパク質：
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質。
【請求項３】
以下の（ｅ）または（ｆ）の組換えタンパク質：
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子および該遺伝子に連結されたプロモーターまたは他の調節配列を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項４または５に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項２または３に記載の組み換えタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからなる遺伝子：
（ａ）配列番号１の塩基配列からなるＤＮＡ；または
（ｂ）上記（ａ）の塩基配列と９０％以上の相同性を有し、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項２】
以下の（ｃ）または（ｄ）の組換えタンパク質：
（ｃ）配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
（ｄ）配列番号２のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質。
【請求項３】
以下の（ｅ）または（ｆ）の組換えタンパク質：
（ｅ）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質；または
（ｆ）配列番号３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつバクテリオシン活性を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１に記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項５】
請求項１に記載の遺伝子および該遺伝子に連結されたプロモーターまたは他の調節配列を含有する組換えベクター。
【請求項６】
請求項４または５に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
請求項２または３に記載の組み換えタンパク質を含む医薬組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−１９９９２９（Ｐ２００８−１９９９２９Ａ）
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−３７９４８（Ｐ２００７−３７９４８）
【出願日】平成１９年２月１９日（２００７．２．１９）
【出願人】（０００１１４２８２）ミヤリサン製薬株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１９日（２００７．２．１９）
【出願人】（０００１１４２８２）ミヤリサン製薬株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
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