抗ポリヒスチジンタグ抗体及びそれを用いた非特異反応の回避方法
【課題】免疫測定法において、測定に伴う非特異反応を簡便かつ効果的に抑制し、より効果的な非特異反応抑制効果が得られる非特異反応回避剤を提供し、非特異反応の抑制された測定方法を提供する。
【解決手段】免疫測定法を用いてアナライトを定量する方法において、例えばヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）のような異好性抗体による非特異的な干渉による影響を除去する非特異反応回避剤であって、非特異因子活性阻害能を有しアナライトには反応しない抗体、特にポリヒスチジンタグに対する抗体を反応系中に共存させることを特徴とする非特異反応回避方法である。
【解決手段】免疫測定法を用いてアナライトを定量する方法において、例えばヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）のような異好性抗体による非特異的な干渉による影響を除去する非特異反応回避剤であって、非特異因子活性阻害能を有しアナライトには反応しない抗体、特にポリヒスチジンタグに対する抗体を反応系中に共存させることを特徴とする非特異反応回避方法である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定法においてアナライトを正確に検出、定量するための障害となるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）のような異好性抗体による非特異反応を抑制するための非特異反応回避方法及び非特異反応回避剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、血液や尿中等の検体に含まれるアナライト（測定対象）の測定にマウスモノクローナル抗体を用いた免疫測定方法が用いられている。しかし、抗原抗体反応の特異的な結合に基づいた免疫測定法においては、本来の目的とする特異的な抗原抗体反応以外の非特異反応により、測定値の信頼性が損なわれてしまうことがしばしば認められている。
【０００３】
この現象は、検体中に含まれる抗原以外の成分が標識抗体と反応することによって引き起こされる。試験される検体中に含まれるヒト抗マウス抗体（以下、ＨＡＭＡという）のような異好性抗体により、アナライトが存在しないにもかかわらず、例えば、通常のサンドイッチＥＬＩＳＡ測定において、固相に結合した抗体と標識された検出される抗体との非特異的架橋が起こり、結果として偽陽性シグナルが生じる。検査の自動化が進み迅速な測定が可能になった反面、ＨＡＭＡのような偽反応が増え、この非特異的反応が見逃されることが多くなっている。このようにイムノアッセイ系において非特異反応が認められ、目的アナライトを含まない検体に対しても反応することにより、本来陰性である検体が陽性と判定されることがあった（非特許文献１、非特許文献２参照。）。
【０００４】
ヒト由来の検体中にＨＡＭＡが存在する理由の１つには、治療としてマウスモノクローナル抗体を患者に大量に投与されるために生じることが挙げられる。マウス抗体の生体内への投与はＨＡＭＡを産生し、異種抗原に対する免疫応答の惹起が問題となっている。近年の抗体医薬品ではマウス由来の抗原結合部位とヒト由来の定常領域を融合させたキメラ抗体や、ヒト化抗体作製技術の進歩により生体内でのＨＡＭＡの出現は減少しているもののＨＡＭＡを持つ患者は増え続けており、その問題を完全に無視することはできない。
【０００５】
測定に使用するモノクローナル抗体とＨＡＭＡの結合を防がなければ、不正確な測定結果により、診断ミス等の重大な問題を生じる可能性がある。優れた特異性を持つモノクローナル抗体を実際の測定系に使用しても、その性能を十分生かすことができないことが大きな問題となっている（特許文献１参照）。
【０００６】
上述した非特異反応を回避した正しい測定値を得るために、従来色々な試みが行われてきた。
例えば、測定すべき検体を加熱や適当な試薬により前処理をしたり、各種動物血清、免疫グロブリン画分、アルブミン、スキムミルク、界面活性剤等を測定系に添加したりすることが一般的に行われてきた。また、ＦａｂやＦ（ａｂ’）2 等の抗体断片を特異反応に使用することで、抗体のＦｃ部位に起因する非特異反応を回避することも行われている（特許文献２、特許文献３参照）。
また、測定系に使用するモノクローナル抗体とは反応特異性が異なりかつ測定系に係わる反応を阻害しないモノクローナル抗体を測定系に添加することも行われている。例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体から誘導された凝集体の使用が提案されている。この凝集体は該抗体のホモポリマーであっても、抗体断片あるいはアルブミンのような蛋白質やデキストランのような多糖類の巨大分子とのヘテロポリマーであってもよい。
【０００７】
また、非特異反応の抑制のために、特異反応に使用するモノクローナル抗体を加熱処理などすることにより調製した、本来の抗体の特異活性は失っているが、非特異反応抑制活性は保持しているモノクローナル抗体由来物質が開示されている（特許文献４参照）。
しかし、これらの方法は非特異反応の抑制にある程度の効果はあるものの、一部の検体ではその効果はまだ不十分であるとともに、目的とする抗原抗体反応を一部阻害することもあり、実用上必ずしも満足できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第２１０９０８６号公報
【特許文献２】特開昭５４−１１９２９２号公報
【特許文献３】特開平０４−２２１７６２号公報
【特許文献４】特許第２５６１１３４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ３４／１，２６１−２６４（１９８８）
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ３５／１，１４６−１５１（１９８９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、免疫測定法において、検体中の微量成分の正確な検出ならびに定量を実現するために測定に伴う非特異反応を簡便かつ効果的に抑制することに優れた非特異反応回避方法とその非特異反応回避剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をおこなったところ、６から１８個の連続したポリヒスチジンタグに対する抗体もしくはその断片タンパク質にＨＡＭＡによる非特異反応抑制効果があることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
６から１８個の連続したヒスチジン残基からなるヒスチジンタグは、最もよく利用されるキャリアータンパク質の１つであり、目的ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に融合させて発現させる。ヒスチジンがニッケルイオン等の遷移金属に特異的に配位して結合する性質を使用して、ヒスチジンタグ融合ポリペプチドを大腸菌、酵母、動物細胞等で発現させた培養上清または破砕液から、ニッケル−キレートクロマトグラフィーカラムを用いて精製が可能であることは公知である。
また、上記ヒスチジン融合ポリペプチドの発現を迅速かつ特異的に検出、定量すべく、ヒスチジンタグ部分に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用してウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等で測定されている。抗ポリヒスチジンタグ抗体遺伝子の塩基配列は明らかになっていない。
【００１３】
本発明者らは、抗ポリヒスチジンタグ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を調製し、本細胞から抗体遺伝子を取得することができた。さらに驚くべきことに、本抗体についてＨＡＭＡによる非特異反応抑制効果の評価を行ったところ、抗原の免疫測定法を用いて定量する方法において、非特異的な干渉による影響を抗ポリヒスチジンタグ抗体が著しく除去するという、当業者が予想し得る以上の有利な非特異反応回避効果が得られた。
【００１４】
本発明は、上記課題を解決するために以下の発明を包含する。
すなわち本発明は、ポリヒスチジンタグに対する結合性を有するタンパク質であって、具体的には抗体もしくは抗体の断片を構成するタンパク質である。その一例として、重鎖の可変領域をコードするＤＮＡである配列番号１と、軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡである配列番号２に記載の塩基配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質断片、これらのタンパク質断片を含んでなる抗体分子、あるいはこれらのタンパク質断片を含んでなる抗体断片であることを特徴とする。抗体分子の場合、そのサブクラスは特に限定されないが、ＩｇＧ１に分類される抗体であることが好ましい。抗体断片の場合は、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2 、ｓｃＦｖなどが挙げられる。また、上記ポリヒスチジンタグは６から１８個の連続したヒスチジン残基が挙げられる。
【００１５】
また、本発明の別な態様としては、免疫測定法を用いてアナライトを定量する方法において、上述したタンパク質を非特異的な干渉による影響を除去することができる非特異反応回避剤として用いる方法であって、非特異因子活性阻害能を有しアナライトには反応しない、例えば上述したようなポリヒスチジンタグに対する抗体を反応系中に共存させることを特徴とする非特異反応回避方法である。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
［項１］配列番号１及び／又は配列番号２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチド。
［項２］項１に記載のポリペプチドを含む抗体。
［項３］項１に記載のポリペプチドを含む抗体断片。
［項４］抗体断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖである項３に記載の抗体断片。
［項５］免疫測定法を用いてアナライトを定量する方法において、非特異的な干渉による影響を除去する非特異反応回避方法であって、項１〜４のいずれかに記載の物質を反応系中に共存させる工程を含む非特異反応回避方法。
［項６］免疫測定法がサンドイッチ法による測定である項５に記載の非特異反応回避方法。
［項７］項１〜４のいずれかに記載の物質を含む非特異反応回避剤。
［項８］項７に記載の非特異反応回避剤を含む免疫測定キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、免疫測定法において異好性抗体による非特異反応を排除できるため、特異性の向上および偽陽性の低減が達成され、臨床検査などの分野において信頼性の高い免疫測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＣＨＯ−Ｋ１細胞に組換えて取得した抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体の抗原との反応性について確認した結果を示す図である。
【図２】抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体のＨＡＭＡ回避能について測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
【００２０】
本発明の実施形態の一つは、配列番号１および２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチド（これらのポリペプチドはそれぞれ配列番号３、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。）、もしくは、それらを含む抗体分子または抗体断片などの物質である。
これらの物質は、ポリヒスチジンタグに対する結合性を有し、具体的には抗体もしくは抗体の断片を構成する。抗原のポリヒスチジンタグは、６から１８個の連続したヒスチジン残基からなるタグが例示される。好ましくは６個の連続したヒスチジン残基からなるものであり、他のタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に融合されていてもよい。
【００２１】
配列番号１の塩基配列は、ポリヒスチジンに対する抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡである。また、配列番号２の塩基配列は、ポリヒスチジンに対する抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡである。
【００２２】
配列番号１および２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチドを含む抗体分子は、そのサブクラスは特に限定されないが、ＩｇＧ１に分類される抗体であることが好ましい。
配列番号１および２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチドを含む抗体断片は、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ 、ｓｃＦｖなどが挙げられる。
【００２３】
本発明のポリペプチド、抗体もしくは抗体の断片等は、当業者に公知の方法により生産され、また例えば遺伝子操作によって組換え生産された抗体もしくは抗体の断片であってもよく、ポリヒスチジンタグに対する抗体遺伝子を発現ベクターに連結し、哺乳動物細胞にトランスフェクションして抗体を取得する場合も含まれる。また、抗体遺伝子は抗体フラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）や各単鎖抗体、あるいは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってもよい。重鎖および軽鎖を別々に含む２つのベクターを用いてもよいし、また抗体の重鎖と軽鎖がタンデムにつながった１つのベクターを用いてもよい。
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２は、抗体全長を発現させた後、ペプシン，トリプシン又はパパイン等のタンパク質分解酵素で分解することによって得てもよい。
【００２４】
トランスフェクションする哺乳動物細胞（宿主細胞）は特に限定されるものではなく、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０２８５、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０４０３等）、ヒト胎児腎臓細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞、入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ１６３７、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ２２０２等）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えばＣＯＳ−７細胞、入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０５３９等）、ヒト子宮頸部癌細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．２、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０００７、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０１９１）、マウスミエローマ細胞（例えばＮＳ０細胞、入手先：例えば、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０２１３）などの各種哺乳動物細胞が挙げられる。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、免疫測定法を用いてアナライトを定量する方法において、非特異的な干渉による影響を除去する非特異反応回避方法であって、配列番号１および２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチド、もしくは、それらを含む抗体分子または抗体断片などの物質を反応系中に共存させる工程を含む非特異反応回避方法である。
【００２６】
免疫測定法とは、抗原抗体間の結合の高い特異性を利用して、目的とするアナライトを測定する方法である。この免疫測定法の測定感度を飛躍的に高めるために放射性化合物、蛍光物質、酵素、金属等の標識法を組み合わせ、微量の物質の測定が可能となっている。標識法に従いそれぞれ放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等と呼ばれている。
【００２７】
上述した物質の非特異反応回避剤としての使用方法は、特に限定されるものではないが、免疫測定法において行う特異的な免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液中で非特異反応回避剤と検体を同一の免疫反応中で接触させ、適当な時間（例えば、１分〜２時間程度）インキュベートする方法がある。
この間に、検体中の非特異反応を起こす物質（非特異反応物質）は非特異反応回避剤と反応し、特異的免疫反応工程での非特異反応活性は失われる。特異的免疫反応工程にはインキュベートを完了した検体と非特異反応回避剤の混合液をそのまま用いればよい。
【００２８】
さらに簡便な本発明の非特異反応回避剤としての使用方法は、非特異反応回避剤共存下に特異的免疫反応を行う方法である。
例えば、最も一般的に用いられる正サンドイッチ法の場合、固相化抗体と検体中の抗原とを反応させる第一免疫反応工程の緩衝液に非特異反応回避剤を添加するだけで、それ以外は何ら特別な工程を必要とせずに所望の効果を得ることができる。
さらに、抗体の特異反応部位を介して固定化された抗原と標識抗体とを反応させる第二免疫反応工程の緩衝液にも添加すれば、第一免疫反応工程で完全に吸収されなかった非特異反応物質も吸収されるため、測定の信頼性をより一層高めることができる。
なお、通常は第一免疫反応工程の緩衝液に添加されていれば十分な効果が得られる。
【００２９】
また、１段階サンドイッチ法においても免疫反応工程の緩衝液に非特異反応回避剤を添加して反応させることにより、非特異反応は回避される。
本発明の非特異反応回避剤はサブクラスの異なる抗体を少なくとも２種以上共存させることによって非特異反応を起こす物質との結合力を高めることもできる。
また、過剰量を添加しておけば非特異反応を起こす物質は優先的に非特異反応回避剤と反応するので非特異反応は回避される。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、配列番号１および２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチド、もしくは、それらを含む抗体分子または抗体断片などの物質を含む非特異反応回避剤である。
また、該非特異反応回避剤を含む免疫測定キットである。
【００３１】
本発明の非特異反応回避剤は、免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液に添加して使用されるか、あるいは免疫反応工程の緩衝液に添加して使用される。
該非特異反応回避剤の非特異反応物質と反応させる系における濃度は０．１〜５００μｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｍｌである。使用される緩衝液は公知の通常免疫反応に使われる適当な緩衝液であってよい。また、緩衝液中に通常添加される助剤、たとえば反応促進剤、洗浄剤または安定化剤と共に使用することができる。さらに別の非特異反応回避剤と共に混合して使用することもできる。
【００３２】
本発明の非特異反応回避剤は単独でキットの構成試薬にしてもよいし、他の構成試薬の成分としてもよい。しかし、測定操作を増やすことなしに非特異反応抑制効果が得られることを考慮すれば、構成試薬の一成分として添加するのが好ましい。
本発明の非特異反応回避剤は、好ましくは検体と固相化抗体を反応する緩衝液や標識抗体液に添加してキットの構成試薬とする。非特異反応回避剤の懸濁用媒体としては、被測定物質の種類、使用される測定原理、測定方法に応じた各種緩衝液が用いられる。緩衝液としては、測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよく、例えば、リン酸塩緩衝液（１０〜１００ｍＭ；ｐＨ６〜８）またはトリス−塩酸（５０ｍＭ／ＮａＣｌ １００ｍＭ；ｐＨ７〜８）などが使用できる。
【００３３】
反応促進剤としては、例えばデキストランサルフェートまたはポリエチレングリコールなど、洗浄剤としては、例えばトリトンＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０などを、また安定化剤としてアルブミン、スキムミルク、ゼラチンなどの蛋白質やアジ化ナトリウム、チメロサール、ケーソンＣＧなどの防腐剤を挙げることができる。
標識抗体は、代表的には、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素、放射性物質、蛍光物質等の何らかの手段により定量可能なシグナルを出す物質を結合した抗体を用いることができる。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合には復元液に添加することもできる。
【００３４】
本発明の非特異反応回避剤を用いる免疫測定法において使用される検体としては、例えば、血清、血漿、髄液、唾液等の体液や尿、糞便抽出液等が挙げられる。
又、測定対象となりうるアナライトとしては特に制約されないが、臨床検査に利用される物質、例えば体液中に含まれる生体内物質や疾患マーカーである、ヒトイムノグロブリン、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン、β２−ミクログロブリン、フェリチン、Ｃ反応性蛋白質、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、塩基性フェトプロティン、組織ポリペプチド抗原、免疫抑制酸性蛋白質、ＣＡ−５０、膵癌胎児性抗原、シアリルＬｅｘ −ｉ抗原、ＳＣＣ抗原、ＣＡ１５−３、ＣＡ７２−４、シアリルＴｎ抗原、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、γ−セミノプロティン、前立腺特異抗原、甲状腺刺激ホルモン、ニューロン特異エノラーゼ、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリンなどが挙げられる。
免疫測定法には放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等が挙げられ、さらには、化学発光法の応用や、ラテックス凝集法の応用等も含まれる。好ましくはＲＩＡ，ＥＩＡ等による測定キットの大部分で採用されているサンドイッチ法であり、正サンドイッチ法、1段階サンドイッチ法、固相サンドイッチ法などが挙げられる。より好ましくは、固相サンドイッチ法が挙げられる。サンドイッチ法とは、固相に結合させた抗原特異的な非標識抗体（一次抗体）を抗原と反応させ、次いで標識した二次抗体を抗原と一次抗体の複合体に結合させて抗原を検出する方法であり、一般に高い抗原特異性が利点である。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例に基づいて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
６×ヒスチジンタグ（連続した６個のヒスチジン残基からなるヒスチジンタグ）融合サルコシン分解酵素を抗原として、Ｂａｌｂ／ｃＡマウスに免疫し、マウスＢ細胞を取り出してマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０と細胞融合させた後、６×ヒスチジンタグに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。なお、初回免疫にはフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製、品番：０６３８−６０−７）を、２回目以降の追加免疫にはフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製、品番：０６３９−６０−６）を使用した。得られたハイブリドーマ細胞をＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ製、品番：１１２７９−０２３）で培養し、１×１０６ｃｅｌｌｓからＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製、品番：７４１３４）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｉｓｔ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ａｍｂｉｏｎ製、品番：ＡＭ１９１６）でメッセンジャーＲＮＡを抽出した。さらに、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α−（登録商標；東洋紡績製、品番：ＦＳＫ−１０１）を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ製、品番：６９８３１−３）を使用して重鎖と軽鎖をＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製、品番：ＫＯＤ−２０１）でＰＣＲ増幅した後、ＣＭＶプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに変更したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ製、品番：Ｅ１８４１）の制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトにそれぞれクローニングしてシーケンスを確認した。重鎖の可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２に、それぞれ示す。これらのポリペプチドはそれぞれ配列番号３、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列への変換は配列解析ソフトであるＧｅｎｅｔｙｘ（Ｇｅｎｅｔｙｘ社）を用いて行った。これにより本抗体の遺伝子配列が同定できた。
【実施例２】
【００３７】
実施例１で作製された発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０２８５）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、品番：１５３３８−１００）を使用してトランスフェクションした。２４時間培養後、培養上清を回収し、６×ヒスチジンタグ抗原との反応性をＥＬＩＳＡ測定で確認した。
詳細には、１０μｇ／ｍｌ濃度の抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌに希釈した培養上清（上清中の抗体濃度はマウス抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。）５０μlを添加し３５℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、４０００倍希釈した抗マウス抗体−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ製）を５０μｌ添加して３５℃で１時間インキュベートした後、さらにＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ＋（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＫＯ製）で５分間反応させた。５０μlの１Ｎ 硫酸を加えて反応停止後、プレートリーダー（製品名；ＳＰＥＣＴＲＡ、ＴＥＣＡＮ Ａｕｓｔｒｉａ社製）（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。なお、標準品としてポリヒスチジンタグに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から得られた抗体を用いた。
結果を図１、表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
その結果、ハイブリドーマ細胞由来の抗体と同様に６×ヒスチジンタグ抗原との反応性があることが確認でき、取得した抗体遺伝子が目的とする抗体遺伝子であることが証明された。
【実施例３】
【００４０】
抗ポリヒスチジンタグ抗体発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０２８５）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、品番：１５３３８−１００）を使用してトランスフェクションして１日培養後、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８二硫酸塩溶液（ナカライテスク製、品番：１６５１３−８４）入りハムＦ−１２培地（ナカライテスク製、品番：１７４５８−６５）で２週間の薬剤選択培養を実施して得られた細胞集団を限界希釈法でクローニングすることにより、ポリヒスチジンタグに特異的な抗体を産生する単一な組換えＣＨＯ−Ｋ１細胞を構築した。本細胞を培養しプロテインＡカラムであるＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製、品番：１１−００３４−９３）で精製された抗体を使用して、ＨＡＭＡによる影響を抑制できるかどうか正サンドイッチＥＬＩＳＡ法で確認した。
ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１（Ｒｏｃｈｅ製、品番：１２００９４１）、マウスＩｇＧ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製、品番：ＰＰ５４）、Ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ１（以下、ＨＢＲという）(ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＩＮＣ．製、品番：３ＫＣ５３４−０７５)、ポリヒスチジンタグに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から得られた抗体および組換えＣＨＯ−Ｋ１細胞から得られた抗体の５種類を用いて、ＨＡＭＡ干渉除去効果測定を行った。なお、ＨＡＭＡ血清にはＨＡＭＡ血清タイプ１（Ｒｏｃｈｅ製、品番：１７６７２７５）を使用した。
より詳細には、５０ｍＭ 炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で２０００倍希釈したＡｎｔｉ−ｈＣＥＡ抗体（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ製）を、５０μｌ／ｗｅｌｌを９６穴ＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト製、品番：ＭＳ−８８９６Ｆ）に添加し固相化した。また、抗ポリヒスチジンタグ抗体濃度が０．５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌになるよう、０．１％ ＢＳＡ＋ＰＢＳ溶液で希釈したＨＡＭＡ抑制のための抗体溶液を作製した。次いで、その抗体溶液５０μｌにＨＡＭＡ血清５０μｌを混合し、それぞれ５０μl／ｗｅｌｌずつ前記９６穴ＥＬＩＳＡプレートに分注し、室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し水分を十分に切った後、ペルオキシダーゼで標識したＡｎｔｉ−ｈＣＥＡ抗体を０．１％ ＢＳＡ＋ＰＢＳ溶液で４０００倍に希釈して５０μl／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、水分を切った後、ＴＭＢ＋発色液（ＤＡＫＯ製）を５０μｌ／ｗｅｌｌ分注し、室温で５分間反応させ、１Ｎ 硫酸で反応を止めた。プレートリーダー（製品名：ＳＰＥＣＴＲＡ、ＴＥＣＡＮ Ａｕｓｔｒｉａ社製）（主波長；４５０ｎｍ、副波長；６２０ｎｍ）にて測定しＨＡＭＡ回避率を算出した。
結果を図２及び表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
ハイブリドーマ由来と組換えＣＨＯ―Ｋ１細胞由来の抗ポリヒスチジンタグ抗体ではほぼ同程度のＨＡＭＡ回避効果が確認できた。通常の抗マウス抗体であるマウスＩｇＧ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製、品番：ＰＰ５４）では１μｇ／ｍｌでのＨＡＭＡ回避効果が６１％であるのに対し、組換えＣＨＯ―Ｋ１細胞由来の抗ポリヒスチジンタグ抗体のＨＡＭＡ回避率は７２％と高く、市販のＨＡＭＡ回避剤ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１（Ｒｏｃｈｅ製、品番：１２００９４１）の６９％やＨＢＲ(ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＩＮＣ．製、品番：３ＫＣ５３４−０７５)の６８％と比較しても同等以上の回避効果があるという優れた結果が得られた。抗ポリヒスチジンタグ抗体のＨＡＭＡ回避効果は極めて有効であることが確認できた。評価に用いた抗体は同じマウス抗体であり定常領域は同じであると考えられることから、抗原との反応性に寄与しているＣＤＲ領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含めた可変領域の違いがＨＡＭＡ回避効果に影響していることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明により、免疫測定法において非特異反応を排除できるため、非特異因子を含む生体由来の試料についても該非特異因子により生じる非特異反応を抑制して、抗原を正確に測定することができ、偽陽性の削減および特異性の向上が達成され、より信頼性の高い臨床検査が可能となることから産業界に大きく寄与することが期待される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫測定法においてアナライトを正確に検出、定量するための障害となるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）のような異好性抗体による非特異反応を抑制するための非特異反応回避方法及び非特異反応回避剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、血液や尿中等の検体に含まれるアナライト（測定対象）の測定にマウスモノクローナル抗体を用いた免疫測定方法が用いられている。しかし、抗原抗体反応の特異的な結合に基づいた免疫測定法においては、本来の目的とする特異的な抗原抗体反応以外の非特異反応により、測定値の信頼性が損なわれてしまうことがしばしば認められている。
【０００３】
この現象は、検体中に含まれる抗原以外の成分が標識抗体と反応することによって引き起こされる。試験される検体中に含まれるヒト抗マウス抗体（以下、ＨＡＭＡという）のような異好性抗体により、アナライトが存在しないにもかかわらず、例えば、通常のサンドイッチＥＬＩＳＡ測定において、固相に結合した抗体と標識された検出される抗体との非特異的架橋が起こり、結果として偽陽性シグナルが生じる。検査の自動化が進み迅速な測定が可能になった反面、ＨＡＭＡのような偽反応が増え、この非特異的反応が見逃されることが多くなっている。このようにイムノアッセイ系において非特異反応が認められ、目的アナライトを含まない検体に対しても反応することにより、本来陰性である検体が陽性と判定されることがあった（非特許文献１、非特許文献２参照。）。
【０００４】
ヒト由来の検体中にＨＡＭＡが存在する理由の１つには、治療としてマウスモノクローナル抗体を患者に大量に投与されるために生じることが挙げられる。マウス抗体の生体内への投与はＨＡＭＡを産生し、異種抗原に対する免疫応答の惹起が問題となっている。近年の抗体医薬品ではマウス由来の抗原結合部位とヒト由来の定常領域を融合させたキメラ抗体や、ヒト化抗体作製技術の進歩により生体内でのＨＡＭＡの出現は減少しているもののＨＡＭＡを持つ患者は増え続けており、その問題を完全に無視することはできない。
【０００５】
測定に使用するモノクローナル抗体とＨＡＭＡの結合を防がなければ、不正確な測定結果により、診断ミス等の重大な問題を生じる可能性がある。優れた特異性を持つモノクローナル抗体を実際の測定系に使用しても、その性能を十分生かすことができないことが大きな問題となっている（特許文献１参照）。
【０００６】
上述した非特異反応を回避した正しい測定値を得るために、従来色々な試みが行われてきた。
例えば、測定すべき検体を加熱や適当な試薬により前処理をしたり、各種動物血清、免疫グロブリン画分、アルブミン、スキムミルク、界面活性剤等を測定系に添加したりすることが一般的に行われてきた。また、ＦａｂやＦ（ａｂ’）2 等の抗体断片を特異反応に使用することで、抗体のＦｃ部位に起因する非特異反応を回避することも行われている（特許文献２、特許文献３参照）。
また、測定系に使用するモノクローナル抗体とは反応特異性が異なりかつ測定系に係わる反応を阻害しないモノクローナル抗体を測定系に添加することも行われている。例えば、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体から誘導された凝集体の使用が提案されている。この凝集体は該抗体のホモポリマーであっても、抗体断片あるいはアルブミンのような蛋白質やデキストランのような多糖類の巨大分子とのヘテロポリマーであってもよい。
【０００７】
また、非特異反応の抑制のために、特異反応に使用するモノクローナル抗体を加熱処理などすることにより調製した、本来の抗体の特異活性は失っているが、非特異反応抑制活性は保持しているモノクローナル抗体由来物質が開示されている（特許文献４参照）。
しかし、これらの方法は非特異反応の抑制にある程度の効果はあるものの、一部の検体ではその効果はまだ不十分であるとともに、目的とする抗原抗体反応を一部阻害することもあり、実用上必ずしも満足できるものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第２１０９０８６号公報
【特許文献２】特開昭５４−１１９２９２号公報
【特許文献３】特開平０４−２２１７６２号公報
【特許文献４】特許第２５６１１３４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ３４／１，２６１−２６４（１９８８）
【非特許文献２】Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ３５／１，１４６−１５１（１９８９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、免疫測定法において、検体中の微量成分の正確な検出ならびに定量を実現するために測定に伴う非特異反応を簡便かつ効果的に抑制することに優れた非特異反応回避方法とその非特異反応回避剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討をおこなったところ、６から１８個の連続したポリヒスチジンタグに対する抗体もしくはその断片タンパク質にＨＡＭＡによる非特異反応抑制効果があることを見出し、本発明を完成させた。
【００１２】
６から１８個の連続したヒスチジン残基からなるヒスチジンタグは、最もよく利用されるキャリアータンパク質の１つであり、目的ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端に融合させて発現させる。ヒスチジンがニッケルイオン等の遷移金属に特異的に配位して結合する性質を使用して、ヒスチジンタグ融合ポリペプチドを大腸菌、酵母、動物細胞等で発現させた培養上清または破砕液から、ニッケル−キレートクロマトグラフィーカラムを用いて精製が可能であることは公知である。
また、上記ヒスチジン融合ポリペプチドの発現を迅速かつ特異的に検出、定量すべく、ヒスチジンタグ部分に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用してウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ等で測定されている。抗ポリヒスチジンタグ抗体遺伝子の塩基配列は明らかになっていない。
【００１３】
本発明者らは、抗ポリヒスチジンタグ抗体を産生するハイブリドーマ細胞を調製し、本細胞から抗体遺伝子を取得することができた。さらに驚くべきことに、本抗体についてＨＡＭＡによる非特異反応抑制効果の評価を行ったところ、抗原の免疫測定法を用いて定量する方法において、非特異的な干渉による影響を抗ポリヒスチジンタグ抗体が著しく除去するという、当業者が予想し得る以上の有利な非特異反応回避効果が得られた。
【００１４】
本発明は、上記課題を解決するために以下の発明を包含する。
すなわち本発明は、ポリヒスチジンタグに対する結合性を有するタンパク質であって、具体的には抗体もしくは抗体の断片を構成するタンパク質である。その一例として、重鎖の可変領域をコードするＤＮＡである配列番号１と、軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡである配列番号２に記載の塩基配列を含む遺伝子によりコードされるタンパク質断片、これらのタンパク質断片を含んでなる抗体分子、あるいはこれらのタンパク質断片を含んでなる抗体断片であることを特徴とする。抗体分子の場合、そのサブクラスは特に限定されないが、ＩｇＧ１に分類される抗体であることが好ましい。抗体断片の場合は、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2 、ｓｃＦｖなどが挙げられる。また、上記ポリヒスチジンタグは６から１８個の連続したヒスチジン残基が挙げられる。
【００１５】
また、本発明の別な態様としては、免疫測定法を用いてアナライトを定量する方法において、上述したタンパク質を非特異的な干渉による影響を除去することができる非特異反応回避剤として用いる方法であって、非特異因子活性阻害能を有しアナライトには反応しない、例えば上述したようなポリヒスチジンタグに対する抗体を反応系中に共存させることを特徴とする非特異反応回避方法である。
【００１６】
すなわち、本発明は、以下のような構成からなる。
［項１］配列番号１及び／又は配列番号２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチド。
［項２］項１に記載のポリペプチドを含む抗体。
［項３］項１に記載のポリペプチドを含む抗体断片。
［項４］抗体断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖである項３に記載の抗体断片。
［項５］免疫測定法を用いてアナライトを定量する方法において、非特異的な干渉による影響を除去する非特異反応回避方法であって、項１〜４のいずれかに記載の物質を反応系中に共存させる工程を含む非特異反応回避方法。
［項６］免疫測定法がサンドイッチ法による測定である項５に記載の非特異反応回避方法。
［項７］項１〜４のいずれかに記載の物質を含む非特異反応回避剤。
［項８］項７に記載の非特異反応回避剤を含む免疫測定キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、免疫測定法において異好性抗体による非特異反応を排除できるため、特異性の向上および偽陽性の低減が達成され、臨床検査などの分野において信頼性の高い免疫測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＣＨＯ−Ｋ１細胞に組換えて取得した抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体の抗原との反応性について確認した結果を示す図である。
【図２】抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ抗体のＨＡＭＡ回避能について測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。
【００２０】
本発明の実施形態の一つは、配列番号１および２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチド（これらのポリペプチドはそれぞれ配列番号３、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。）、もしくは、それらを含む抗体分子または抗体断片などの物質である。
これらの物質は、ポリヒスチジンタグに対する結合性を有し、具体的には抗体もしくは抗体の断片を構成する。抗原のポリヒスチジンタグは、６から１８個の連続したヒスチジン残基からなるタグが例示される。好ましくは６個の連続したヒスチジン残基からなるものであり、他のタンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端に融合されていてもよい。
【００２１】
配列番号１の塩基配列は、ポリヒスチジンに対する抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡである。また、配列番号２の塩基配列は、ポリヒスチジンに対する抗体の軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡである。
【００２２】
配列番号１および２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチドを含む抗体分子は、そのサブクラスは特に限定されないが、ＩｇＧ１に分類される抗体であることが好ましい。
配列番号１および２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチドを含む抗体断片は、具体的にはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２ 、ｓｃＦｖなどが挙げられる。
【００２３】
本発明のポリペプチド、抗体もしくは抗体の断片等は、当業者に公知の方法により生産され、また例えば遺伝子操作によって組換え生産された抗体もしくは抗体の断片であってもよく、ポリヒスチジンタグに対する抗体遺伝子を発現ベクターに連結し、哺乳動物細胞にトランスフェクションして抗体を取得する場合も含まれる。また、抗体遺伝子は抗体フラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｃフラグメント）や各単鎖抗体、あるいは一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）であってもよい。重鎖および軽鎖を別々に含む２つのベクターを用いてもよいし、また抗体の重鎖と軽鎖がタンデムにつながった１つのベクターを用いてもよい。
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２は、抗体全長を発現させた後、ペプシン，トリプシン又はパパイン等のタンパク質分解酵素で分解することによって得てもよい。
【００２４】
トランスフェクションする哺乳動物細胞（宿主細胞）は特に限定されるものではなく、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０２８５、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０４０３等）、ヒト胎児腎臓細胞（例えばＨＥＫ２９３細胞、入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５７３、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ１６３７、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ２２０２等）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えばＣＯＳ−７細胞、入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５１、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０５３９等）、ヒト子宮頸部癌細胞（例えば、ＨｅＬａ細胞、入手先：例えば、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２．２、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０００７、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０１９１）、マウスミエローマ細胞（例えばＮＳ０細胞、入手先：例えば、理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０２１３）などの各種哺乳動物細胞が挙げられる。
【００２５】
本発明の別の実施形態は、免疫測定法を用いてアナライトを定量する方法において、非特異的な干渉による影響を除去する非特異反応回避方法であって、配列番号１および２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチド、もしくは、それらを含む抗体分子または抗体断片などの物質を反応系中に共存させる工程を含む非特異反応回避方法である。
【００２６】
免疫測定法とは、抗原抗体間の結合の高い特異性を利用して、目的とするアナライトを測定する方法である。この免疫測定法の測定感度を飛躍的に高めるために放射性化合物、蛍光物質、酵素、金属等の標識法を組み合わせ、微量の物質の測定が可能となっている。標識法に従いそれぞれ放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等と呼ばれている。
【００２７】
上述した物質の非特異反応回避剤としての使用方法は、特に限定されるものではないが、免疫測定法において行う特異的な免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液中で非特異反応回避剤と検体を同一の免疫反応中で接触させ、適当な時間（例えば、１分〜２時間程度）インキュベートする方法がある。
この間に、検体中の非特異反応を起こす物質（非特異反応物質）は非特異反応回避剤と反応し、特異的免疫反応工程での非特異反応活性は失われる。特異的免疫反応工程にはインキュベートを完了した検体と非特異反応回避剤の混合液をそのまま用いればよい。
【００２８】
さらに簡便な本発明の非特異反応回避剤としての使用方法は、非特異反応回避剤共存下に特異的免疫反応を行う方法である。
例えば、最も一般的に用いられる正サンドイッチ法の場合、固相化抗体と検体中の抗原とを反応させる第一免疫反応工程の緩衝液に非特異反応回避剤を添加するだけで、それ以外は何ら特別な工程を必要とせずに所望の効果を得ることができる。
さらに、抗体の特異反応部位を介して固定化された抗原と標識抗体とを反応させる第二免疫反応工程の緩衝液にも添加すれば、第一免疫反応工程で完全に吸収されなかった非特異反応物質も吸収されるため、測定の信頼性をより一層高めることができる。
なお、通常は第一免疫反応工程の緩衝液に添加されていれば十分な効果が得られる。
【００２９】
また、１段階サンドイッチ法においても免疫反応工程の緩衝液に非特異反応回避剤を添加して反応させることにより、非特異反応は回避される。
本発明の非特異反応回避剤はサブクラスの異なる抗体を少なくとも２種以上共存させることによって非特異反応を起こす物質との結合力を高めることもできる。
また、過剰量を添加しておけば非特異反応を起こす物質は優先的に非特異反応回避剤と反応するので非特異反応は回避される。
【００３０】
本発明の別の実施形態は、配列番号１および２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチド、もしくは、それらを含む抗体分子または抗体断片などの物質を含む非特異反応回避剤である。
また、該非特異反応回避剤を含む免疫測定キットである。
【００３１】
本発明の非特異反応回避剤は、免疫反応工程の前に予め適当な緩衝液に添加して使用されるか、あるいは免疫反応工程の緩衝液に添加して使用される。
該非特異反応回避剤の非特異反応物質と反応させる系における濃度は０．１〜５００μｇ／ｍｌであることが好ましく、さらに好ましくは１〜５０μｇ／ｍｌである。使用される緩衝液は公知の通常免疫反応に使われる適当な緩衝液であってよい。また、緩衝液中に通常添加される助剤、たとえば反応促進剤、洗浄剤または安定化剤と共に使用することができる。さらに別の非特異反応回避剤と共に混合して使用することもできる。
【００３２】
本発明の非特異反応回避剤は単独でキットの構成試薬にしてもよいし、他の構成試薬の成分としてもよい。しかし、測定操作を増やすことなしに非特異反応抑制効果が得られることを考慮すれば、構成試薬の一成分として添加するのが好ましい。
本発明の非特異反応回避剤は、好ましくは検体と固相化抗体を反応する緩衝液や標識抗体液に添加してキットの構成試薬とする。非特異反応回避剤の懸濁用媒体としては、被測定物質の種類、使用される測定原理、測定方法に応じた各種緩衝液が用いられる。緩衝液としては、測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよく、例えば、リン酸塩緩衝液（１０〜１００ｍＭ；ｐＨ６〜８）またはトリス−塩酸（５０ｍＭ／ＮａＣｌ １００ｍＭ；ｐＨ７〜８）などが使用できる。
【００３３】
反応促進剤としては、例えばデキストランサルフェートまたはポリエチレングリコールなど、洗浄剤としては、例えばトリトンＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０などを、また安定化剤としてアルブミン、スキムミルク、ゼラチンなどの蛋白質やアジ化ナトリウム、チメロサール、ケーソンＣＧなどの防腐剤を挙げることができる。
標識抗体は、代表的には、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素、放射性物質、蛍光物質等の何らかの手段により定量可能なシグナルを出す物質を結合した抗体を用いることができる。これらの構成試薬が凍結乾燥品の場合には復元液に添加することもできる。
【００３４】
本発明の非特異反応回避剤を用いる免疫測定法において使用される検体としては、例えば、血清、血漿、髄液、唾液等の体液や尿、糞便抽出液等が挙げられる。
又、測定対象となりうるアナライトとしては特に制約されないが、臨床検査に利用される物質、例えば体液中に含まれる生体内物質や疾患マーカーである、ヒトイムノグロブリン、ヒトアルブミン、ヒトフィブリノーゲン、β２−ミクログロブリン、フェリチン、Ｃ反応性蛋白質、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、ＣＡ１９−９、塩基性フェトプロティン、組織ポリペプチド抗原、免疫抑制酸性蛋白質、ＣＡ−５０、膵癌胎児性抗原、シアリルＬｅｘ −ｉ抗原、ＳＣＣ抗原、ＣＡ１５−３、ＣＡ７２−４、シアリルＴｎ抗原、ＣＡ１２５、ＮＣＣ−ＳＴ−４３９、γ−セミノプロティン、前立腺特異抗原、甲状腺刺激ホルモン、ニューロン特異エノラーゼ、肝炎ウイルス抗原、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、インスリンなどが挙げられる。
免疫測定法には放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）等が挙げられ、さらには、化学発光法の応用や、ラテックス凝集法の応用等も含まれる。好ましくはＲＩＡ，ＥＩＡ等による測定キットの大部分で採用されているサンドイッチ法であり、正サンドイッチ法、1段階サンドイッチ法、固相サンドイッチ法などが挙げられる。より好ましくは、固相サンドイッチ法が挙げられる。サンドイッチ法とは、固相に結合させた抗原特異的な非標識抗体（一次抗体）を抗原と反応させ、次いで標識した二次抗体を抗原と一次抗体の複合体に結合させて抗原を検出する方法であり、一般に高い抗原特異性が利点である。
【実施例】
【００３５】
以下に、実施例に基づいて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３６】
６×ヒスチジンタグ（連続した６個のヒスチジン残基からなるヒスチジンタグ）融合サルコシン分解酵素を抗原として、Ｂａｌｂ／ｃＡマウスに免疫し、マウスＢ細胞を取り出してマウスミエローマ細胞ＳＰ２／０と細胞融合させた後、６×ヒスチジンタグに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡ法でスクリーニングした。なお、初回免疫にはフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製、品番：０６３８−６０−７）を、２回目以降の追加免疫にはフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製、品番：０６３９−６０−６）を使用した。得られたハイブリドーマ細胞をＣＤ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ製、品番：１１２７９−０２３）で培養し、１×１０６ｃｅｌｌｓからＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製、品番：７４１３４）を用いてトータルＲＮＡを抽出し、Ｐｏｌｙ（Ａ）Ｐｕｒｉｓｔ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ（Ａｍｂｉｏｎ製、品番：ＡＭ１９１６）でメッセンジャーＲＮＡを抽出した。さらに、ＲｅｖｅｒＴｒａ Ａｃｅ−α−（登録商標；東洋紡績製、品番：ＦＳＫ−１０１）を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成した。
Ｍｏｕｓｅ Ｉｇ−Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ製、品番：６９８３１−３）を使用して重鎖と軽鎖をＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−（東洋紡績製、品番：ＫＯＤ−２０１）でＰＣＲ増幅した後、ＣＭＶプロモーターをＥＦ−１αプロモーターに変更したｐＣＩ−ｎｅｏプラスミド（プロメガ製、品番：Ｅ１８４１）の制限酵素ＸｂａＩ−ＮｏｔＩサイトにそれぞれクローニングしてシーケンスを確認した。重鎖の可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列を配列番号２に、それぞれ示す。これらのポリペプチドはそれぞれ配列番号３、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する。アミノ酸配列への変換は配列解析ソフトであるＧｅｎｅｔｙｘ（Ｇｅｎｅｔｙｘ社）を用いて行った。これにより本抗体の遺伝子配列が同定できた。
【実施例２】
【００３７】
実施例１で作製された発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０２８５）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、品番：１５３３８−１００）を使用してトランスフェクションした。２４時間培養後、培養上清を回収し、６×ヒスチジンタグ抗原との反応性をＥＬＩＳＡ測定で確認した。
詳細には、１０μｇ／ｍｌ濃度の抗原を固相化したＥＬＩＳＡプレートに、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌに希釈した培養上清（上清中の抗体濃度はマウス抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定した。）５０μlを添加し３５℃で２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、４０００倍希釈した抗マウス抗体−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ製）を５０μｌ添加して３５℃で１時間インキュベートした後、さらにＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＴＭＢ＋（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＫＯ製）で５分間反応させた。５０μlの１Ｎ 硫酸を加えて反応停止後、プレートリーダー（製品名；ＳＰＥＣＴＲＡ、ＴＥＣＡＮ Ａｕｓｔｒｉａ社製）（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。なお、標準品としてポリヒスチジンタグに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から得られた抗体を用いた。
結果を図１、表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
その結果、ハイブリドーマ細胞由来の抗体と同様に６×ヒスチジンタグ抗原との反応性があることが確認でき、取得した抗体遺伝子が目的とする抗体遺伝子であることが証明された。
【実施例３】
【００４０】
抗ポリヒスチジンタグ抗体発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞（理化学研究所バイオリソースセンター ＲＣＢ０２８５）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製、品番：１５３３８−１００）を使用してトランスフェクションして１日培養後、４００μｇ／ｍｌのＧ４１８二硫酸塩溶液（ナカライテスク製、品番：１６５１３−８４）入りハムＦ−１２培地（ナカライテスク製、品番：１７４５８−６５）で２週間の薬剤選択培養を実施して得られた細胞集団を限界希釈法でクローニングすることにより、ポリヒスチジンタグに特異的な抗体を産生する単一な組換えＣＨＯ−Ｋ１細胞を構築した。本細胞を培養しプロテインＡカラムであるＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製、品番：１１−００３４−９３）で精製された抗体を使用して、ＨＡＭＡによる影響を抑制できるかどうか正サンドイッチＥＬＩＳＡ法で確認した。
ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１（Ｒｏｃｈｅ製、品番：１２００９４１）、マウスＩｇＧ（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製、品番：ＰＰ５４）、Ｈｅｔｅｒｏｐｈｉｌｉｃ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔ１（以下、ＨＢＲという）(ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＩＮＣ．製、品番：３ＫＣ５３４−０７５)、ポリヒスチジンタグに特異的な抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞から得られた抗体および組換えＣＨＯ−Ｋ１細胞から得られた抗体の５種類を用いて、ＨＡＭＡ干渉除去効果測定を行った。なお、ＨＡＭＡ血清にはＨＡＭＡ血清タイプ１（Ｒｏｃｈｅ製、品番：１７６７２７５）を使用した。
より詳細には、５０ｍＭ 炭酸バッファー（ｐＨ９．６）で２０００倍希釈したＡｎｔｉ−ｈＣＥＡ抗体（Ｍｅｄｉｘ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ製）を、５０μｌ／ｗｅｌｌを９６穴ＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト製、品番：ＭＳ−８８９６Ｆ）に添加し固相化した。また、抗ポリヒスチジンタグ抗体濃度が０．５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌになるよう、０．１％ ＢＳＡ＋ＰＢＳ溶液で希釈したＨＡＭＡ抑制のための抗体溶液を作製した。次いで、その抗体溶液５０μｌにＨＡＭＡ血清５０μｌを混合し、それぞれ５０μl／ｗｅｌｌずつ前記９６穴ＥＬＩＳＡプレートに分注し、室温で１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し水分を十分に切った後、ペルオキシダーゼで標識したＡｎｔｉ−ｈＣＥＡ抗体を０．１％ ＢＳＡ＋ＰＢＳ溶液で４０００倍に希釈して５０μl／ｗｅｌｌ加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄し、水分を切った後、ＴＭＢ＋発色液（ＤＡＫＯ製）を５０μｌ／ｗｅｌｌ分注し、室温で５分間反応させ、１Ｎ 硫酸で反応を止めた。プレートリーダー（製品名：ＳＰＥＣＴＲＡ、ＴＥＣＡＮ Ａｕｓｔｒｉａ社製）（主波長；４５０ｎｍ、副波長；６２０ｎｍ）にて測定しＨＡＭＡ回避率を算出した。
結果を図２及び表２に示す。
【００４１】
【表２】
【００４２】
ハイブリドーマ由来と組換えＣＨＯ―Ｋ１細胞由来の抗ポリヒスチジンタグ抗体ではほぼ同程度のＨＡＭＡ回避効果が確認できた。通常の抗マウス抗体であるマウスＩｇＧ抗体（ＣＨＥＭＩＣＯＮ製、品番：ＰＰ５４）では１μｇ／ｍｌでのＨＡＭＡ回避効果が６１％であるのに対し、組換えＣＨＯ―Ｋ１細胞由来の抗ポリヒスチジンタグ抗体のＨＡＭＡ回避率は７２％と高く、市販のＨＡＭＡ回避剤ＭＡＫ３３−ＩｇＧ１（Ｒｏｃｈｅ製、品番：１２００９４１）の６９％やＨＢＲ(ＳＣＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ，ＩＮＣ．製、品番：３ＫＣ５３４−０７５)の６８％と比較しても同等以上の回避効果があるという優れた結果が得られた。抗ポリヒスチジンタグ抗体のＨＡＭＡ回避効果は極めて有効であることが確認できた。評価に用いた抗体は同じマウス抗体であり定常領域は同じであると考えられることから、抗原との反応性に寄与しているＣＤＲ領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）を含めた可変領域の違いがＨＡＭＡ回避効果に影響していることが示唆される。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
本発明により、免疫測定法において非特異反応を排除できるため、非特異因子を含む生体由来の試料についても該非特異因子により生じる非特異反応を抑制して、抗原を正確に測定することができ、偽陽性の削減および特異性の向上が達成され、より信頼性の高い臨床検査が可能となることから産業界に大きく寄与することが期待される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１及び／又は配列番号２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを含む抗体。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドを含む抗体断片。
【請求項４】
抗体断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖである請求項３に記載の抗体断片。
【請求項５】
免疫測定法を用いてアナライトを定量する方法において、非特異的な干渉による影響を除去する非特異反応回避方法であって、請求項１〜４のいずれかに記載の物質を反応系中に共存させる工程を含む非特異反応回避方法。
【請求項６】
免疫測定法がサンドイッチ法による測定である請求項５に記載の非特異反応回避方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の物質を含む非特異反応回避剤。
【請求項８】
請求項７に記載の非特異反応回避剤を含む免疫測定キット。
【請求項１】
配列番号１及び／又は配列番号２に記載の塩基配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドを含む抗体。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドを含む抗体断片。
【請求項４】
抗体断片がＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2又はｓｃＦｖである請求項３に記載の抗体断片。
【請求項５】
免疫測定法を用いてアナライトを定量する方法において、非特異的な干渉による影響を除去する非特異反応回避方法であって、請求項１〜４のいずれかに記載の物質を反応系中に共存させる工程を含む非特異反応回避方法。
【請求項６】
免疫測定法がサンドイッチ法による測定である請求項５に記載の非特異反応回避方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の物質を含む非特異反応回避剤。
【請求項８】
請求項７に記載の非特異反応回避剤を含む免疫測定キット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１１−１６７７３（Ｐ２０１１−１６７７３Ａ）
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６３８６５（Ｐ２００９−１６３８６５）
【出願日】平成２１年７月１０日（２００９．７．１０）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１月２７日（２０１１．１．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１０日（２００９．７．１０）
【出願人】（０００００３１６０）東洋紡績株式会社 (3,622)
【Ｆターム（参考）】
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