新規糖尿病性腎症感受性遺伝子
【課題】糖尿病性腎症の発症や進行を予防しまたは治療するための有効成分となりえる物質を探索する方法の提供。糖尿病性腎症を発症する潜在的危険性の高い患者を選択する方法、ならびに当該方法に有効に利用することのできる試薬キットの提供。
【解決手段】抗糖尿病性腎症剤の有効成分のスクリーニングに際して、下記の工程を行う：
（１）被験物質とＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【解決手段】抗糖尿病性腎症剤の有効成分のスクリーニングに際して、下記の工程を行う：
（１）被験物質とＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症の罹患およびその進行に関連する遺伝子に関する新たな知見を提供するものである。この新たな知見に基づいて、本発明は、具体的には糖尿病性腎症の発症やその進行を予防ないしは治療するために有用な成分をスクリーニングする方法に関する。さらに本発明は、被験者について、糖尿病性腎症を発症する蓋然性が高いか否かを判断し、糖尿病性腎症を発症する潜在的危険性の高い患者を選択する方法、ならびに当該方法に有効に利用することのできる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病性腎症は、世界的に末期腎不全の主原因である。わが国でも１９９８年以降、糖尿病性腎症が慢性糸球体腎炎を抜いて新規透析導入の原因疾患の第１位となり、２００３年には透析導入患者の４割を超えるほどに増加している。The United Kingdom Prospective Diabetes Study（UKPDS）の結果によると、糖尿病性腎症患者では１年間に２〜３％の割合で次の病期へ進行し、また腎不全期以降の年間死亡率は約２０％にも達し、その予後は極めて不良である。従って、早期からの適切な治療介入により腎症の進展と透析導入を抑制することは、患者の予後と医療経済の両面から非常に重要である（非特許文献１参照）。
【０００３】
近年の糖尿病性腎症に関する疫学的研究・家系調査の結果から、腎症の発症が一部の糖尿病患者に限定されていること、および腎症患者に家族内集積が認められることから、腎症の発症・進展に何らかの遺伝因子の存在が示唆され、これまでに多くの遺伝子が糖尿病性腎症感受性候補遺伝子として検討されてきた。こうした糖尿病性腎症の遺伝因子解明により、個々の症例に対する治療法をあらかじめ予測、選択する事、いわゆるオーダーメイド医療の実現が可能となる。しかしながら、未だ明確に糖尿病性腎症感受性候補遺伝子としてのコンセンサスが得られる遺伝子の同定には至っていない。
【０００４】
当該候補遺伝子として最もよく解析されている遺伝子は、アンジオテンシン変換酵素（ACE）遺伝子の第１６イントロンに存在する２８７塩基対の挿入（I）／欠失（D）遺伝子多型である。通常のケース・コントロールスタディでは、Ｄ対立遺伝子と腎症との相関を示した成績が多く、また１８のケース・コントロールスタディのメタアナリシスおよび１型糖尿病症例の前向き追跡研究から、Ｄ対立遺伝子は腎症のリスク遺伝子と考えられるものの、いわゆるmajor geneとは考えにくいとされている（非特許文献２参照）。
【０００５】
また近年、上記候補遺伝子としてＮＣＡＬＤ遺伝子が見出された。具体的には、当該遺伝子は、糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わる糖尿病性腎症感受性遺伝子であり、糖尿病性腎症の発症や進行を予防しまたは治療するための方法を開発するための有用なターゲット遺伝子となること、また、当該ＮＣＡＬＤ遺伝子内に位置する３ＳＮＰｓ（SNP999, SNP1307, SNP1340）が糖尿病性腎症の潜在的発症リスクと有意な関係を有していることが報告されている（特許文献１参照）。
【０００６】
ところでpodocalyxin（ポドカリキシン）は、糸球体上皮細胞のpodocyteの膜表面に硫酸基を有する糖蛋白として存在する１回膜貫通型タンパクであり、細胞内ドメインでNa(+)/H(+)-exchanger regulatory factor 2（NHERF2）およびezrinと結合し、これを介してアクチンファイバーと結合している（非特許文献３参照）。このタンパク質は、糸球体の濾過隙の開放に働き、NHERF2、ezrin及びアクチンとの相互作用によって足突起形態の維持に関与することが知られており、podocalyxin遺伝子を欠失させたノックアウトマウスは、podocyteの足突起およびスリット膜が形成されず無尿のため生後１日で死亡することが報告されている（非特許文献４参照）。すなわち糸球体上皮細胞でのpodocalyxin発現の低下や発現不全は、糸球体濾過機能を低下させ腎機能を不全にする要因となることから、その正常な発現は腎機能を正常に維持するうえで極めて重要である。
【０００７】
一方、ＥＨＦ（ets homologous factor）は、上皮細胞に特異的に発現することを特徴とするETS転写因子のサブファミリー（ESEs）に属するタンパク質であり、転写レプレッサーとして機能することが知られているが（非特許文献５）、その他、喘息の感染や発癌に関連することも報告されている（例えば、特許文献２〜５、非特許文献６等）。
【０００８】
当該ＥＨＦには、同一遺伝子内に複数の多型（SNPs）が存在することが報告されており（特許文献６）、近年の研究では、この因子における遺伝子多型が糖尿病を含む自己免疫疾患の診断に役立つことも記載されているが（特許文献７）、腎疾患、特に糖尿病性腎症との関連については報告されていない。
【非特許文献１】「糖尿病合併症」最新医学別冊 新しい診断と治療のＡＢＣ（30）、最新医学社発行、第101頁
【非特許文献２】「糖尿病合併症」最新医学別冊 新しい診断と治療のＡＢＣ（30）、最新医学社発行、第93頁
【非特許文献３】The Journal of Clinical Investigation, Vol.108, No.2, 2001, p.289-301
【非特許文献４】J. Exp. Med. Volume 194, Number 1, July 2, 2001, p.13-27
【非特許文献５】J. Biol. Chem., Vol.276, No.23, 2001, p.20397-20406
【非特許文献６】Mol. Cancer Ther., 2006, 5(12), 2006, p.3191-3196
【特許文献１】特開２００７−１２９９０５号公報
【特許文献２】US 6087485
【特許文献３】WO2006/062118
【特許文献４】WO2000/055320
【特許文献５】WO2001/022920
【特許文献６】US 6812339
【特許文献７】WO2006/062118
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述するように、糖尿病性腎症の遺伝因子を解明し、糖尿病性腎症の発症やその進行との関連を明確にすることは、個々の症例に最も適した治療法の選択（オーダーメード医療の実現）に繋がると同時に、糖尿病性腎症発症やその進行に対する予防剤や治療剤の有効成分を探索する手段を提供し、さらには特異的かつ安全性の高い医薬品を開発することを可能にするものと考えられる。
【００１０】
本発明の目的は、糖尿病性腎症の発症やその進行に関連する遺伝子（以下、本明細書では「糖尿病性腎症感受性遺伝子」ともいう）を提供するとともに、当該遺伝子と糖尿病性腎症の発症やその進行との関係を明確にすることを目的とする。また本発明の目的は、糖尿病性腎症の発症や進行を予防しまたは治療するための有効成分となりえる物質を探索する方法（スクリーニング方法）を提供することである。
【００１１】
さらに本発明は、被験者について、糖尿病性腎症を発症する蓋然性が高いか否かを判断し、糖尿病性腎症を発症する潜在的危険性の高い患者を選択する方法、ならびに当該方法に有効に利用することのできる試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、糖尿病性腎症に関するゲノムワイドな相関解析を行ったところ、糖尿病性腎症と強い関連を認めるＳＮＰ（一塩基多型）が、ヒトのＥＨＦ（ets homologous factor）の遺伝子（以下、「ＥＨＦ遺伝子」ともいう）のイントロン1領域内に１箇所〔＋48位 T/C（rs717582）〕存在し、当該ＳＮＰ座（rs717582）にシトシン（Ｃ）を有するＣ対立遺伝子保有者（CCまたはCT）は、Ｃ対立遺伝子非保有者（TT）に比して、糖尿病性腎症の発症リスクが有意に高いことを見出した。ＥＨＦ遺伝子のイントロン1の１位〜１００位の塩基配列を配列番号１に示す。
【００１３】
また、本発明者らは、ＥＨＦを過剰発現させた糸球体上皮細胞では、糸球体濾過機能に係わるpodocalyxinの発現が有意に低下する一方、当該ＥＨＦの発現をsiRNAで抑制することにより、podocalyxinの発現が回復することを確認した。このことは、ＥＨＦの発現が腎機能の低下に深く関与し、糖尿病性腎症の病態を悪化させる因子であることを示唆するものである。
【００１４】
これらの知見から、本発明者らは、ＥＨＦ遺伝子が糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わる糖尿病性腎症感受性遺伝子であり、糖尿病性腎症の発症や進行を予防しまたは治療するための方法を開発するための有用なターゲット遺伝子となることを確信した。さらに、本発明者らは、ＥＨＦ遺伝子内に位置する糖尿病性腎症と有意な関連性を有するＳＮＰ（rs717582）と糖尿病性腎症の潜在的発症リスクとの関係を見出し、これから被験者について当該ＳＮＰの塩基（T/C）を測定することによって、当該被験者の糖尿病性腎症の潜在的発症リスクを評価することができることを確信した。
【００１５】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の具体的態様を有するものである。
【００１６】
Ｉ．糖尿病性腎症の予防または治療に有効な成分をスクリーニングする方法
項１．下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１）被験物質とＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００１７】
項２．下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１’）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（２’）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＥＨＦの産生量を測定する工程、及び
（３’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞もしくはその細胞画分のＥＨＦの産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００１８】
項３．下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（1”）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分を接触させる工程、
（2”）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＥＨＦの作用を検出する工程、及び
（3”）上記の検出した作用が、被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画分のＥＨＦの作用よりも低い被験物質を選択する工程。
【００１９】
項４．ＥＨＦの作用が転写抑制作用である、項３記載のスクリーニング方法。
【００２０】
項５．ＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞またはＥＨＦを産生可能な細胞が、糸球体上皮細胞である項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００２１】
項６．糖尿病性腎症の予防または治療剤の有効成分を探索する方法である項１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００２２】
II．糖尿病性腎症の罹患リスクが高い被験者の選別方法
項７．被験者由来の生体試料（被験試料）におけるＥＨＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該発現量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＥＨＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いとの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【００２３】
項８．被験者由来の生体試料（被験試料）におけるＥＨＦの産生量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該産生量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＥＨＦの産生量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【００２４】
項９．被験者由来の生体試料（被験試料）におけるＥＨＦ遺伝子のイントロン1に存在する48番目における塩基を検出する工程を含み、当該塩基がシトシンであることを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【００２５】
III．糖尿病性腎症の罹患リスク診断キット
項１０．ＥＨＦ遺伝子のイントロン1に存在する48番目における塩基を検出するための試薬を含む、糖尿病性腎症の罹患性診断キット。
【００２６】
IV．糖尿病性腎症の予防又は治療剤
項１１．ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するsiＲＮＡを有効成分として含む糖尿病性腎症の予防又は治療剤。
【００２７】
項１２．上記siＲＮＡが、配列番号７に記載する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に記載する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡである、項１１に記載する糖尿病性腎症の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のスクリーニング方法によれば、糖尿病性腎症の発症や進行を予防または治療するのに有効な成分を取得することが可能になる。また当該方法は、糖尿病性腎症の予防または治療に有効な新規薬剤の開発に有効に利用することができる。
【００２９】
さらに本発明が提供する糖尿病性腎症感受性遺伝子ならびに糖尿病性腎症感受性ＳＮＰによれば、被験者（特に糖尿病患者）について腎症を発症する相対的な危険度を簡便に検出することができる。本発明の検出方法は、in vitroでしかも医師等の専門的な知識を要することなく簡単に実施することができる方法である。本発明の方法によって腎症を発症する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者（糖尿病患者）に対しては、その旨を告知し、予め腎症の発症を防ぐか、または少しでも遅延させるための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、糖尿病性腎症の発症を予防するための、または糖尿病性腎症の発症を遅延させるための検査方法として極めて有用である。さらに本発明は上記方法において使用される試薬を提供するものであり、これにより上記方法を簡便に実施することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
１．本発明で使用する用語の定義
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００３１】
本明細書中において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及び１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが含まれる、また、本明細書で「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００３２】
また、本明細書中において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」と読み替えられるものとする。
【００３３】
本明細書において「遺伝子多型」とは、２つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝子がある場合にそれらの対立遺伝子間に見られる相違のことを言う。具体的には、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転移、逆位などの変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計学的に確実か、または当該個体内特異変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。本明細書で用いる「遺伝子多型」の意味には、単一のヌクレオチドの変化によって引き起こされる多型であるいわゆる一塩基多型〔Single Nucleotide Polymorphism：ＳＮＰ〕が含まれる。「一塩基多型」とは、単一の核酸の変化によって引き起こされる多型である。多型は選択された集団の１％より大きな頻度、好ましくは１０％以上の頻度で存在する。また「ハプロタイプ」とは、一つのアレル（ハプロイド）に存在する遺伝子変異の組み合わせをいう。
【００３４】
本明細書において「糖尿病性腎症感受性遺伝子」とは、糖尿病患者のうち腎症を発症しやすい体質または腎症に進行しやすい体質を決める遺伝子のことをいう。
【００３５】
本明細書において「糖尿病性腎症」とは、糖尿病が進行して腎臓にも影響が及び、タンパク尿を伴う腎障害が起こる状態を言う。糖尿病性腎症の患者は高血糖による腎機能の障害から、原尿を作る能力が損なわれ、最終的には腎不全となる。統計によれば、糖尿病性腎症による末期腎不全で透析治療を始める患者数は年々増加しており、現在、透析導入患者の原因疾患として糖尿病性腎症は第１位になっている。より具体的には、本発明が対象とする「糖尿病性腎症」には、糖尿病網膜症を発症し、かつ尿中アルブミン排泄率が200μg/分以上であるかまたは尿中アルブミン／クレアチニン比が300mg/gCr以上である症例、ならびに糖尿病網膜症を発症し、且つ人工透析療法を受けている症例が含まれる。
【００３６】
本明細書に記載する各塩基番号は、The National Center for Biotechnology Information data baseの位置情報に基づくものである。また、本明細書において各ＳＮＰの位置番号である48位は、ＥＨＦ遺伝子のイントロン1の１番目の塩基を１としたときの位置情報を意味する。なお、ＥＨＦ遺伝子のイントロン1の塩基配列を配列番号１に記載する。
【００３７】
２．糖尿病性腎症感受性遺伝子および糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ
本発明者らは、糖尿病性腎症感受性遺伝子を探索するために、多くの日本人２型糖尿病患者を対象として、gene-based SNPsを用いたケースコントロール相関解析ならびに連鎖不平衡（LD）マッピングを行うことにより、第11番染色体p12（11p12）領域に存在するets homologous factor遺伝子（ＥＨＦ遺伝子）のイントロン1の塩基配列上に存在する１つのＳＮＰ（rs717582）を見出し、糖尿病性腎症を発症している患者は、当該ＳＮＰがシトシン（Ｃ）になっている頻度が有意に高く、このことから、当該ＳＮＰが糖尿病性腎症の発症やその進行に有意に関係していることが示唆された（糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ）。また本発明者らは、ＥＨＦを過剰発現している系では、腎臓の糸球体濾過機能に重要なpodocalyxinの発現が有意に低下していることから、ＥＨＦ遺伝子の発現の亢進（増加）が、腎症の悪化、すなわち糖尿病性腎症の発症と深く関わっていることを見出し、ＥＨＦ遺伝子が糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わる糖尿病性腎症感受性遺伝子であるとの結論に至った。
【００３８】
当該ヒトＥＨＦ遺伝子は、ヒト第11染色体のゲノム配列（Genbank Sequence Accession IDs: NC-_000011.8）中、塩基番号34599244番〜34639657番に位置する40414bpの遺伝子である（Genbank Sequence Accession:NM_012153.5/ NP_036285.2）。
【００３９】
ＥＨＦ遺伝子と疾患との関連性については、従来、糖尿病を含む自己免疫疾患との関連性（特許文献７参照）が報告されているが、腎疾患、特に糖尿病性腎症との関連については報告されていない。
【００４０】
実施例１で示すように、ＳＮＰ（rs717582）がシトシン（Ｃ）の対立遺伝子を有する２型糖尿病患者は、糖尿病性腎症を発症しやすい傾向にあった。従って、当該糖尿病性腎症感受性ＳＮＰは、糖尿病性腎症の発症または進行のしやすさを規定する糖尿病性腎症の遺伝的素因マーカーであり、ヒト被験者について、特に２型糖尿病患者について糖尿病性腎症の易発症性・易進行性を判断する指標となる。
【００４１】
すなわち、当該糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ（rs717582）の塩基がシトシン（Ｃ）である場合、当該ＳＮＰを有する被験者は、遺伝的に糖尿病性腎症を発症しやすいか、または糖尿病から腎症に発展進行しやすい体質を備えている（糖尿病性腎症に感受性）と判断することができる。
【００４２】
３．糖尿病性腎症の予防または治療に有効な成分をスクリーニングする方法
前述するように、本発明者らは、ＥＨＦ遺伝子の発現の亢進（増加）が、podocalyxin遺伝子の発現低下を伴い、糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わっていることを見出した。このことから、ＥＨＦが糖尿病性腎症の発症抑制またはその進行抑制に関わっており、ＥＨＦ遺伝子の発現（ｍＲＮＡ発現）を抑制させて、podocalyxin遺伝子の発現低下を防止しえる物質は、糖尿病性腎症の予防または治療に有効な成分として有用であると考えられる。
【００４３】
下記に説明する本発明のスクリーニング方法は、被験物質の中から、（3-1）ＥＨＦ遺伝子の発現（ｍＲＮＡ発現）抑制、（3-2）ＥＨＦの産生量の低下、または（3-3）ＥＨＦが有する作用の低下、を指標として、これらの作用を示す物質を探索することによって、糖尿病性腎症の予防剤または治療剤（以下、これらを総称して「抗糖尿病性腎症剤」ともいう）の有効成分を取得しようとするものである。
【００４４】
なお、抗糖尿病性腎症剤の有効成分となりえる候補物質としては、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物（低分子化合物、高分子化合物を含む）、無機化合物などを挙げることができる。本発明のスクリーニング方法は、これらの候補物質を含む試料を対象として実施することができる（これらを総称して「被験物質」という）。ここで、候補物質を含む試料には、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培養上清、および菌体成分などが含まれる。
【００４５】
(3-1) ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質を、ＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量を指標として探索し、抗糖尿病性腎症剤の有効成分として取得する方法である。
【００４６】
当該方法は、具体的には下記の工程（１）〜（３）を行うことによって実施することができる。
（１）被験物質とＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００４７】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、天然または組み換え体の別を問わず、ＥＨＦ遺伝子を発現し得る細胞であればよい。なおＥＨＦ遺伝子の由来も特に制限されず、ヒト由来であっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類やその他の生物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒト由来のＥＨＦ遺伝子である。かかる細胞として、具体的には、ＥＨＦ遺伝子を有する糸球体上皮細胞（ヒトおよびその他の生物種由来のものを含む）、および単離調製された糸球体上皮細胞の初代培養細胞を挙げることができる。
【００４８】
また、定法に従って、ＥＨＦ遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入してＥＨＦ ｍＲＮＡを発現可能な状態に調製された形質転換細胞を使用することもできる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法（3-1）の工程（１）において、被験物質とＥＨＦ遺伝子発現可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、当該細胞が死滅せず、且つＥＨＦ遺伝子が発現し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択することが好ましい。
【００５０】
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＥＨＦ遺伝子発現可能細胞とを接触させて、ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制させてそのｍＲＮＡの発現量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＥＨＦ遺伝子発現可能細胞を培養した場合のＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量が、被験物質非存在下で上記に対応するＥＨＦ遺伝子発現可能細胞を培養した場合に得られるＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量（対照発現量）よりも小さいことを指標として、細胞と接触させた当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００５１】
ＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量の測定（検出、定量）は、ＥＨＦ遺伝子発現可能細胞のＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量を、当該ＥＨＦ ｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドなどを利用したノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイム定量ＰＣＲ法などの公知の方法、またはＤＮＡアレイを利用した測定方法を実施することなどにより行うことができる。
【００５２】
(3-2) ＥＨＦの産生を低下させる作用を指標とした物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、ＥＨＦの産生を低下させる作用を有する物質を、ＥＨＦの産生量の低下を指標として探索し、抗糖尿病性腎症剤の有効成分として取得する方法である。
【００５３】
当該方法は、具体的には下記の工程（1’）〜（3’）を行うことによって実施することができる。
（1’）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（2’）被験物質を接触させた細胞または細胞画分のＥＨＦの産生量を測定する工程、及び
（3’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞（ＥＨＦを産生可能な細胞）または被験物質を接触させない細胞画分（ＥＨＦを産生可能な細胞から調製）のＥＨＦの産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００５４】
かかるスクリーニングに用いられる細胞（対照細胞を含む）としては、天然または組み換え体の別を問わず、ＥＨＦ遺伝子が発現してＥＨＦを産生し得る細胞であればよい。なおＥＨＦ遺伝子の由来も特に制限されず、ヒト由来であっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類やその他の生物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒト由来のＥＨＦ遺伝子である。かかる細胞として、具体的には、ＥＨＦ遺伝子を有する糸球体上皮細胞（ヒトおよびその他の生物種由来のものを含む）、および単離調製された糸球体上皮細胞の初代培養細胞を挙げることができる。
【００５５】
また、定法に従って、ＥＨＦ遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入してＥＨＦを産生可能な状態に調製された形質転換細胞を使用することもできる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法（3-2）の工程（1’）において、被験物質とＥＨＦ産生可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、当該細胞が死滅せず、且つＥＨＦ遺伝子が発現し且つＥＨＦが産生し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択することが好ましい。
【００５７】
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分とを接触させて、ＥＨＦの産生量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合のＥＨＦ産生量が、被験物質非存在下で上記に対応するＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合に得られるＥＨＦの産生量（対照産生量）よりも小さいことを指標として、細胞または細胞画分と接触させた当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００５８】
ＥＨＦ産生量の測定（検出、定量）は、ＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分から得られるＥＨＦの量を、当該ＥＨＦに対する抗体（抗ＥＨＦ抗体）を利用してウエスタンブロット法や免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ等の公知の方法を行うことによって実施することができる。
【００５９】
(3-3) ＥＨＦの作用を低下させる作用を指標とした物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、ＥＨＦの作用を低下させる作用を有する物質を、ＥＨＦ作用の低下を指標として探索し、抗糖尿病性腎症剤の有効成分として取得する方法である。
【００６０】
当該方法は、具体的には下記の工程（1”）〜（3”）を行うことによって実施することができる。
（1”）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分を接触させる工程、
（2”）被験物質を接触させた細胞または細胞画分のＥＨＦの作用を検出する工程、及び
（3”）上記の検出した作用が、被験物質を接触させない対照細胞（ＥＨＦを産生可能な細胞）または細胞画分（ＥＨＦを産生可能な細胞から調製）のＥＨＦの作用よりも低い被験物質を選択する工程。
【００６１】
当該スクリーニングで用いられる細胞、並びに工程(2”)において被験物質と接触させる方法や条件は、前述する(3-2)のスクリーニング方法にて記載したものを同様に使用することができる。
【００６２】
候補物質の選別は、上記条件で被験物質とＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分とを接触させて、ＥＨＦの作用を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合に生じるＥＨＦの作用が、被験物質非存在下で上記に対応するＥＨＦ産生可能細胞または細胞画分を培養した場合に得られるＥＨＦの作用（対照作用）よりも低いことを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００６３】
ここで、ＥＨＦの作用とは、ＥＨＦの有する機能をさす。例えば、ＥＨＦの発現量の上昇とともにpodocalyxinの発現量を低下させることが挙げられる。その他に、転写活性抑制作用（非特許文献５等参照）など従来からＥＨＦが有する機能として公知であったもの全てが含まれる。なお、糖尿病性腎症の関連因子である上記ＥＨＦまたはその遺伝子の発現量の測定は、当業者の周知の方法によれば可能である。またその転写活性抑制作用をはじめとする様々な機能も、標的因子のｍRNAを測定する方法、または転写活性を直接Run-on assay法で測定する方法など、公知の方法により測定することができる。
【００６４】
上記(3-1)〜(3-3)のスクリーニング方法で選別された物質は、糸球体上皮細胞においてＥＨＦ遺伝子の発現増加（亢進）を抑制して、腎機能に重要な役割を担うpodocalyxinの発現低下を抑制する作用を有するものであり、よって糖尿病性腎症の発症やその進行を予防する組成物または糖尿病性腎症を改善する組成物の有効成分として使用することが可能である。
【００６５】
上記のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに糖尿病性腎症を有する病態非ヒト動物を用いてスクリーニングにかけることもできる。かくして選別される候補物質は、さらに糖尿病性腎症を有する病態非ヒト動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに糖尿病性腎症を有する患者（ヒト）もしくはその前状態にある患者（ヒト）への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な糖尿病性腎症の予防または治療用組成物の有効成分を選別取得することができる。
【００６６】
このようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の種類に応じて、化学的合成、生物学的合成（発酵を含む）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができ、糖尿病性腎症予防・治療用組成物の調製に使用することができる。
【００６７】
４．糖尿病性腎症の罹患リスクが高い被験者（糖尿病性腎症易罹患者）の選別方法
本発明は、また被験者について糖尿病性腎症の罹患・進行リスク（糖尿病性腎症を発症し易いまたは進行易いか／発症し難いまたは進行し難いかの別）を測定し、当該被験者の中から上記リスクの高い被験者を選別する方法を提供する。なお、本発明では、これらのリスクが高い被験者を「糖尿病性腎症易罹患者」と称する。
【００６８】
その選別方法としては、被験者の被験試料について、(4-1) ＥＨＦ遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ発現量）を指標とする方法、(4-2) ＥＨＦの産生量を指標とする方法、および(4-3) ＥＨＦ遺伝子の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを指標とする方法、を挙げることができる。
【００６９】
(4-1) ＥＨＦ遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ発現量）を指標とする糖尿病性腎症易罹患者の選別方法
当該方法は、被験者由来の生体試料におけるＥＨＦ遺伝子の発現量、すなわちＥＨＦ ｍＲＮＡ発現量を測定することによって行うことができる。ここで生体試料としては、ＥＨＦ遺伝子を発現し得る細胞を含む試料であればよいが、具体的には、血液を挙げることができる。
【００７０】
ＥＨＦ ｍＲＮＡ発現量の測定方法は、上記(3-1)の方法で説明するように、定法に従って行うことができる。
【００７１】
かかる測定の結果、被験者の生体試料（被験試料）におけるＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量（対照発現量）よりも大きい場合に、前記被験者は糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い（糖尿病性腎症易罹患性）と判断することができる。
【００７２】
ここで「正常」とは、少なくとも腎症を発症していないか、または腎症を発症する前段階でもないという意味で用いられる。具体的には尿中アルブミン排泄率が20μg/分未満または尿中アルブミン／クレアチニン比が30mg/gCr未満である場合に、腎症に関して「正常」と判断することができる。
【００７３】
(4-2) ＥＨＦの産生量を指標とする糖尿病性腎症易罹患者の選別方法
当該方法は、被験者由来の生体試料におけるＥＨＦの産生量を測定することによって行うことができる。ここで生体試料としては、ＥＨＦ遺伝子を発現し、ＥＨＦを産生し得る細胞を含む試料であればよいが、具体的には血液を挙げることができる。
【００７４】
ＥＨＦ産生量の測定方法は、上記(3-2)の方法で説明するように、定法に従って行うことができる。
【００７５】
かかる測定の結果、被験者の生体試料（被験試料）におけるＥＨＦの産生量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＥＨＦの産生量（対照産生量）よりも大きい場合に、前記被験者は糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い（糖尿病性腎症易罹患性）と判断することができる。
【００７６】
(4-3) ＥＨＦ遺伝子の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを指標とする糖尿病性腎症易罹患者の選別方法
当該方法は、被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、ヒトＥＨＦ遺伝子のイントロン1の48位（rs717582）について塩基を検出し同定する工程を有するものである：
本発明の検出方法として好ましくは、ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、ヒトＥＨＦ遺伝子のイントロン1の48位（rs717582）について塩基を検出し同定する工程を有し、さらに、検出し同定した塩基がシトシン（Ｃ）である場合に、当該被験者を、糖尿病性腎症に罹りやすい者（糖尿病性腎症易罹患者）として判定し、選択する工程を有することができる。
【００７７】
当該方法によれば、糖尿病性腎症易罹患性及び糖尿病性腎症難罹患性の別、すなわち糖尿病性腎症罹患リスクを判定し診断することができる。当該糖尿病性腎症罹患リスクの判定（診断）は、上記ＳＮＰの塩基の別を判断基準（判断指標）として医師等の専門知識を有する者の判断を要することなく、機械的（自動的）に行なうことができる。このため、本発明の方法は、糖尿病性腎症の罹患危険度の検出方法と言うことができる。
【００７８】
なお、上記ゲノムＤＮＡの抽出および目的塩基の検出は、公知の方法〔例えば、Bruce, et al., Geneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1999)〕を用いて行うことができる。
【００７９】
ゲノムＤＮＡの抽出を行う検体は、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（培養細胞を含む。但し生殖細胞は除く）、組織（培養組織を含む）、臓器、または体液（例えば、唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿等）などを材料とすることができる。該材料としては末梢血から分離した白血球または単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。
【００８０】
例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロティナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮaseにより除去することができる。なお、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook J. et. al., “Molecular Cloning: A Laboratry Manual (2nd Ed.)”Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行なうことができる。さらに必要に応じて、ヒト第11染色体（11p12）上のＥＨＦ遺伝子またはそのイントロン1を含むＤＮＡを単離してもよい。当該ＤＮＡの単離は、ＥＨＦ遺伝子またはそのイントロン1にハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。
【００８１】
目的塩基を検出する工程において、上記のようにして得られたヒトゲノムＤＮＡを含む抽出物から、糖尿病性腎症に極めて関連性の深い糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを検出する。なお、当該塩基の検出は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料からさらに単離したヒト第11染色体上のＥＨＦ遺伝子、好ましくはそのイントロン1を含むＬＤブロック中の塩基配列を直接決定し、各ブロック内に位置する当該ＳＮＰの塩基の変異を調べる方法によってもよい。
【００８２】
例えば目的の塩基を検出する方法としては、上記のように該当領域の遺伝子配列を直接決定する方法の他に、多型配列が制限酵素認識部位である場合は、制限酵素切断パターンの相違を利用して、遺伝子型を決定する方法（以下、ＲＦＬＰという）、多型特異的なプローブを用いハイブリダイゼーションを基本とする方法（例えば、チップやガラススライド、ナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに対するハイブリダイゼーション強度の差を検出することによって、多型の種類を決定する、または、特異的なプローブのハイブリダイゼーションの効率を、鋳型２本鎖増幅時にポリメレースが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する方法、ある種の２本鎖特異的な蛍光色素が発する蛍光を温度変化を追うことにより２本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なオリゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子内で２次構造をつくるか、ターゲット領域にハイブリダイズするかの差を利用して遺伝子型を特定する方法など）がある。また、さらに鋳型特異的なプライマーからポリメレースによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定する方法（ダイデオキシヌクレオタイドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍光を検出する方法、取り込まれたダイデオキシヌクレオタイドをマススペクトロメトリーにより検出する方法）、さらに鋳型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な塩基対または非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などがある。
【００８３】
以下、従来公知の代表的な遺伝子多型の検出方法を列記するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００８４】
(a)ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、（b）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）〔Biotechniques, 16, 296-297 (1994)、及びBiotechniques, 21, 510-514 (1996)〕、（c）ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、（d）ダイレクトシークエンス法〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕、（e）ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)；Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)〕、（f）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）法〔Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)〕、（g）ＲＮaseＡ切断法〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕、（h）化学切断法〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、（i）ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕、（j）ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)；J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕、（k）インベーダー法〔Science, 5109, 778-783 (1993)；J. Biol. Chem., 30,21387-21394 (1999)；Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕、（l）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法〔Genome Res., 7, 378-388 (1997)；Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、（m）ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、（n）モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法〔Nat. Biotechnol., 1, 49-53 (1998)；遺伝子医学、4, 46-48 (2000)〕、（o）ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele-Specific Hybridization；ＤＡＳＨ）法〔Nat. Biotechnol.,1, 87-88 (1999)；遺伝子医学、4, 47-48 (2000)〕、（p）パドロック・プローブ（Padlock Probe）法〔Nat. Genet.,3, 225-232 (1998) ；遺伝子医学、4, 50-51 (2000)〕、（q）ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームぺージ（http://www.takara.co.jp ）参照〕、（r）ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ（「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）、（s）ＥＣＡ法〔Anal. Chem., 72, 1334-1341, (2000)〕。
【００８５】
以上は代表的な遺伝子多型検出方法であるが、本発明の糖尿病性腎症罹患リスクの判定には、これらに限定されず、他の公知または将来開発される遺伝子多型検出方法を広く用いることができる。また、本発明の遺伝子多型検出に際して、これらの遺伝子多型検出方法を単独で使用してもよいし、また２以上を組み合わせて使用することもできる。
【００８６】
以上、本発明の方法（（4-1）〜(4-3)）によって、糖尿病性腎症を発症するかまたはそれが進行する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予め糖尿病性腎症の発症または進行を防ぐための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、糖尿病性腎症の発症や進行を予防するための検査方法として、さらには糖尿病性腎症に伴って生じる他の疾患や症状発生の予防のための検査方法として極めて有用である。
【００８７】
５．糖尿病性腎症の罹患リスク診断キット
本発明はまた、糖尿病性腎症の罹患リスクを診断するための試薬キット（診断キット）を提供する。特に、上記（4-3)で説明する糖尿病性腎症易罹患者の選別方法に使用される診断キットを提供する。
【００８８】
(5-1)プローブ
上記(4-3)にて説明する糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ並びに当該塩基を含むヌクレオチドの検出には、ヒト第11染色体（11p12）のＥＨＦ遺伝子上の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該ＳＮＰを検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドが用いられる。かかるオリゴまたはポリヌクレオチドは、上記ＥＨＦ遺伝子上においてＳＮＰ４１３９を含む１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、上記塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。
【００８９】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 第２版、1989に記載の条件）において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出するＳＮＰを含む遺伝子領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましいが、かかる特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。
【００９０】
かかるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、下記(ａ)に示すオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００９１】
(a) ＥＨＦ遺伝子の塩基配列において、イントロン1の48位（rs717582）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【００９２】
当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、被験者について糖尿病性腎症に対する罹患性やその進行性を判定するために、ヒト第１１染色体上のＥＨＦ遺伝子上に位置する糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ（rs717582）を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴまたはポリヌクレオチド「プローブ」として設計される。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、ＥＨＦ遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
【００９３】
さらに好ましくは、当該プローブは、上記各ＳＮＰを含むオリゴヌクレオチドが検出できるように、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素等で標識される（後述）。
【００９４】
上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明はまた、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等）として提供するものである。当該プローブは、好適には糖尿病性腎症感受性遺伝子検出用のＤＮＡチップとして利用することができる。
【００９５】
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００９６】
例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法〔Livak KJ. Gene Anal. 14, 143 (1999), Morris T. et al., J. Clin. Microbiol. 34, 2933 (1996)〕の場合、糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを含む領域に相補的な２０塩基長程度のオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。当該プローブは、5’末端を蛍光色素、3’末端を消光物質により標識され、検体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするが、そのままでは発光せず、別に加えられたＰＣＲプライマーの上流からの伸長反応により5’側の蛍光色素結合が切断され、遊離した蛍光色素により検出される。
【００９７】
Ｉｎｖａｄｅｒ法〔Lyamichev V. et al., Nat. Biotechnol. 17, 292 (1999)〕では、多型部位に隣接する配列（3’側と5’側の２種）に相補的なオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。検出は、これら２種のプローブと検体とは無関係な第３のプローブによって達成される。
【００９８】
（5-2）プライマー
本発明は、またヒト第11染色体のＥＨＦ遺伝子上の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを含む配列領域を特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００９９】
かかるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、下記(a)に示すオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１５〜３０塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１００】
(a) ヒトＥＨＦ遺伝子の塩基配列において、イントロン1の48位（rs717582）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【０１０１】
このようなオリゴヌクレオチドは、ＥＨＦ遺伝子において、糖尿病性腎症感受性ＳＮＰの塩基（ヌクレオチド）を含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの一部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３０塩基長、好ましくは１８〜２５塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。増幅するオリゴまたはポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には１５〜１０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長、より好ましくは２０〜２００塩基長である。
【０１０２】
ヒト第11染色体のＥＨＦ遺伝子上の、糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ（rs717582）近傍の１５塩基長以上連続した塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する上記の各種オリゴヌクレオチドは、本発明においてプライマーとして利用することができる。なお、これらのオリゴヌクレオチドは、ヒトＥＨＦ遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作製することができる。
【０１０３】
Ｍａｓｓ Ａｒｒａｙ法にＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry）を応用した方法〔Haff LA. et al. Genome Res. 7, 378 (1997), Little DP. et al., Nature Medicine 3, 1413-1416 (1997)〕を例にとって、プライマーの具体的な利用方法を説明する。この場合、シリコンチップ上に固定した検体ＤＮＡに前記プライマーをハイブリダイズさせ、ｄｄＮＴＰを添加して一塩基だけを伸長させる。次いで、一塩基伸長産物を分離し、質量分析法により多型を検出する。この方法では、プライマーは通常１５塩基長以上で可能な限り短く設計することが望ましい。
【０１０４】
（5-3）標識物
上記本発明のプローブまたはプライマーには、遺伝子多型検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【０１０５】
なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ ３’−オリゴラベリングシステム等）。
【０１０６】
また、本発明のプライマーには、その末端に多型検出のためのリンカー配列が付加されたものも含まれる。このようなリンカー配列としては、例えば、前述したインベーダー法で用いられるオリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。
【０１０７】
以上の、プローブまたはプライマー（標識されていてもよい）は、糖尿病性腎症罹患リスクの診断用試薬として利用することができる。
【０１０８】
（5-4）糖尿病性腎症罹患リスク診断用試薬キット（診断キット）
本発明の診断キットは、糖尿病性腎症罹患リスクの診断に使用する試薬として、上記プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴまたはポリヌクレオチド（なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい）を少なくとも１つ含むものである。本発明の診断キットは上記プローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
【０１０９】
６．糖尿病性腎症の予防又は治療剤
後述する実施例３に示すように、ＥＨＦ遺伝子のsiＲＮＡによると、ＥＨＦ遺伝子を導入した細胞におけるＥＨＦ ｍＲＮＡの発現が抑制されるとともに、podocalyxin遺伝子の発現を促進することができる。このことから、ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するsiＲＮＡは、糖尿病性腎症の予防又は治療剤の有効成分として使用することができることがわかる。
【０１１０】
ゆえに本発明は、ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するsiＲＮＡを有効成分とする糖尿病性腎症の予防又は治療剤を提供する。
【０１１１】
本発明が対象とするsiＲＮＡは、二本鎖であり、ＥＨＦ遺伝子の標的配列に相補的な配列であるセンス鎖と該センス鎖に相補的な配列であるアンチセンス鎖がハイブリダイズしてなっている。かかるsiＲＮＡは、ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するものであれば特に制限されないが、好ましくは配列番号７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、その相補鎖として配列番号８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡを挙げることができる。
【０１１２】
本発明の予防または治療剤は、上記のＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するsiＲＮＡに加え、任意の担体や添加剤、例えば医薬上許容される担体および添加剤を含むことができる。
【０１１３】
医薬上許容される担体および添加剤としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤；クエン酸、メントール等の芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、生理食塩水等の希釈剤；ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１１４】
経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、非経口的な投与製剤としては、他に水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
【０１１５】
本発明の予防または治療剤の投与量は、投与対象となる被験者の体重や年齢、並びに病気の重篤度等によって異なり、一概に設定することはできないが、例えば、成人１日あたり有効成分量として約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重を挙げることができる。
【０１１６】
本発明の予防・治療剤は、糖尿病性腎症の予防または治療に有効に使用することができる。
【実施例】
【０１１７】
本発明を、下記実施例等により説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作、細胞培養等には、特に断りのない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)等に記載された方法を用いた。
【０１１８】
実施例１ ゲノムワイドSNPs解析
（１）対象２型糖尿病患者
インフォームドコンセントの下、滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学、川崎医科大学、岩手医科大学、取手協同病院、川井クリニック、大阪市立総合医療センター、千葉徳洲会病院、または大阪労災病院に定期的に来診する２型糖尿病患者を対象として実験を行なった。
【０１１９】
なお、対象とした２型糖尿病患者は、下記診断基準に従って２つのグループに分類した：
1）糖尿病性腎症症例（94症例）：糖尿病網膜症と、明らかな糖尿病性腎症（尿中アルブミン排泄率が200μg/分を超えるか、若しくは尿中アルブミン/クレアチニン比が300mg/gCrを超える)とを伴う患者、又は慢性透析療法を受けている患者、
2）対照群（94症例）：腎機能障害の兆候は示していないが糖尿病網膜症を伴う患者（尿中アルブミン排泄率が20μg/分未満か、若しくは尿中アルブミン/クレアチニン比が30mg/gCr未満）。
【０１２０】
（２）DNA試料の調製
前記２型糖尿病患者の末梢血液を採血し、得られた末梢血液10mlを3000回転で5分間遠心分離して、血清を除去した。ついで、得られた産物に、赤血球溶解液を添加して、室温で20分間インキュベートした。その後、インキュベーション後の混合物を、3000回転で5分間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈殿に、プロティナーゼＫを添加し、37℃で4時間以上インキュベートした。得られた産物を、フェノール−クロロホルムで処理し、得られた上層(水層)を回収し、これにイソプロパノールを添加して、DNAの沈殿を生じさせた。ついで、これを遠心分離(12000回転、10分）してDNAを回収し、1mlの70v/v%エタノール含有水溶液（含水エタノール）を添加し、得られたDNAのペレットをTE緩衝液（組成：10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH8.0)）に溶解し、DNA試料を得た。
【０１２１】
（３）遺伝子型の判定
斯くして調製したDNA試料を用いて、インベーダー法により遺伝子型の判定を行った。解析するSNPは、Japanese SNPデータベース(IMS-JST SNPsデータベース:http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp)から無作為に選択した。各SNP遺伝子座の遺伝子型を、Multiplex PCRと組み合わせたインベーダー法（例えば、オオニシ(Ohnishi Y.)ら，J. Human. Genet., 46, 471-477, 2001等を参照のこと）により解析した。
【０１２２】
より詳細な遺伝子多型の検索をダイレクトシーケンス法にて行った。ETS ホモローガス ファクター（EHF）を含むゲノム配列に関連するジーンバンク(GenBank)の情報を基にデザインしたPCRプライマーを用いて、標的部位を増幅した。また、PCRプライマーのデザインに際して、ベッデル(Bedell)ら、（Bioinformatics, 16, 1040-1041, 2000）に記載されたように、商品名「REPEAT MASKERプログラム」（ワシントン大学より供給。ウェブページアドレス：http://repeatmasker.genome.washington.eduにて利用可能）により、検索対象から反復エレメントを排除した。
【０１２３】
Multiplex PCRで採用した反応溶液および反応条件は、次の通りである：
反応溶液
組成：16.6mM (NH4)2SO4, 67mM Tris(pH8.8), 6.7mM MgCl2, 10mM 2-メルカプトエタノール, 6.7μM EDTA, 1.5mM dNTP, 10xTaqミックス(2.5U/μl Taq DNAポリメラーゼ, 31.25U/μl Taq Antibody), 0又は10% DMSO, 各0.25μMプライマー。
【０１２４】
反応条件
95℃, 5分の反応後、95℃で15秒と60℃で45秒と72℃で3分とを1サイクルとする反応を40サイクル。
【０１２５】
上記Multiplex PCRで増幅された産物をdH2Oで、1：11に希釈し、384プレートの各ウェルに分注した。ついで、プレートを風乾し、プレート上の各ウェルに、3μlインベーダー反応液(組成：10x緩衝液、10x FRETプローブ、10x cleavase、アレルプローブ）を添加した。その後、63℃で20分間インキュベートし、ついで、プレートの各ウェルについて、蛍光（励起波長：520nm, 蛍光波長：546nm）を測定した。
【０１２６】
一方、TaqMan PCR は、下記の反応条件で行った。
【０１２７】
ゲノムDNA（1ng/well）を384プレートの各ウェルに分注した後、風乾し、これに反応溶液（組成：10x ExTaq Buffer, dNTP 0.2mM, ExTaq HS 0.5U, primer & probe mix 0.125μl）5mlを加え、50℃で2分間、95℃で10分間反応させた後、92℃で15秒と60℃で1分とを1サイクルとする反応を35サイクル行なう。
【０１２８】
斯くしてTaqMan PCRで増幅された産物についても、上記と同様にして蛍光（励起波長：520nm, 蛍光波長：546nm）を測定して遺伝子型を判定した。
【０１２９】
（４）SNPの選択
糖尿病性腎症症例の94検体及び対照群の94検体のそれぞれに対し、81315個のSNP座について遺伝子タイピングを行なった。ついで、2x3分割表又は2x2分割表を用いた統計学的データを評価することにより、糖尿病性腎症症例と対照群との間の遺伝子型又は対立遺伝子頻度に、有意な差異を示したSNPを選択した。
【０１３０】
なお、相関解析、ハプロタイプ頻度及びHardy-Weinberg平衡の統計解析並びに連鎖不均衡係数(D’)の算出は、デブリン(Devlin B.)ら（Genomics, 29, 311-322, 1995）及びニールセン(Nielsen DM.)ら（Am. J. Hum. Genet., 63, 1531-1540, 1998）の方法に従って行なった。
【０１３１】
以上のスクリーニングにおいて、糖尿病性腎症症例の患者と対照群の個体との間で0.01未満のp値を示したSNP座を、さらに多数の患者を対象として、ゲノムワイドで解析した。
【０１３２】
その結果、ある特定のＳＮＰ座（rs717582）において、糖尿病性腎症との強い相関が認められた。当該ＳＮＰは、第11番染色体上のETS ホモローガス ファクター（EHF）遺伝子のイントロン1（配列番号１）に存在し、この48番目に位置するＳＮＰのシトシン対立遺伝子頻度が、糖尿病性腎症群で対照群に比し有意に高くなっていた。
【０１３３】
なお、このＳＮＰ座（rs717582）領域を増幅するために使用したプライマーの塩基配列を配列番号２および３に、またこの領域のＳＮＰを含む増幅領域を検出するために使用したインベーダープローブの塩基配列を配列番号４に示す。また当該ＳＮＰを含む増幅領域のＴ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子を検出するためのアレルプローブの塩基配列を、それぞれ配列番号５および６に示す。
【０１３４】
このSNPのアレル頻度を、糖尿病性腎症症例と対照群とで対比した結果を表１に示す。
【０１３５】
【表１】
【０１３６】
表２に遺伝子型分布を示す。
【０１３７】
【表２】
【０１３８】
かかる検討結果から、このＳＮＰ座(rs717582)におけるＣ対立遺伝子保有者では、糖尿病性腎症の発症リスクが、Ｔ対立遺伝子非保有者に比べて、有意に高くなっていることが明らかとなった。
【０１３９】
実施例２ Pod-7細胞へのEHF導入によるpodocalyxin発現変動の確認
ラット糸球体上皮細胞株Pod-7に、ETS ホモローガスファクター（EHF）を過剰発現させ、podocalyxin発現の変動を調べた。
【０１４０】
（１）方法
Pod-7細胞(2 x 104 cells/0.5ml/well)を10%血清入りD-MEM/F-12培地を用いて24ウェルプレートに蒔いて37℃, 5% CO2環境下で培養を開始した。翌日に、これにhuman EHF遺伝子またはGFP遺伝子の発現ベクターを含むレトロウィルスを添加し(各々0.4μl、2μl、10μl)、4時間感染させた後に培地を除いて、血清入り培地に置換した。感染3日後に6ウェルプレートに蒔いて培養を継続し、さらに3日後に100mmディッシュ3枚に蒔いて培養を継続した。2日後（感染からは8日後）に溶解剤を加えて、常法に従いtotal RNAをカラム抽出した。次に、5μg相当量のtotal RNAを逆転写してPCR用のtemplateとし、合成primerを用いて定量real-time PCR法にてEHF mRNA量、podocalyxin mRNA量およびNHERF2 mRNA量を測定した。この時、同時測定したGAPDH mRNA量によって補正し、相対値とした。
【０１４１】
（２）結果
Pod-7細胞を、human EHF遺伝子またはGFP遺伝子発現ベクターを含むレトロウィルスを用いて感染導入し、得られた細胞におけるpodocalyxin mRNA発現を定量real-time PCR法にて確認した。
【０１４２】
結果を図１a〜cに示す。図1aに示すように、EHF感染量が多くなるにつれて用量依存的にpodocalyxin mRNAの発現率が低下した。この時、図1bに示すように、EHF感染量が多くなるにつれて用量依存的にEHF mRNA発現が増加していた。一方、図1cに示すように、EHFの感染量が多くなるにつれてNHERF2発現率は低下傾向にあった。
【０１４３】
（３）考察
以上の結果から、糸球体濾過機能に重要なpodocalyxinの発現はEHFの導入によって低下することがわかり、EHFは腎症においては病態悪化因子であることが示された（図１a）。さらに、podocalyxinと細胞内アクチン骨格とを仲介しているpodocalyxinの細胞内裏打ちタンパクであるNHERF2の発現は、EHFの導入によって低下する傾向にあることが分かった（図１c）。すなわち、上記のことから、EHFがpodocalyxinのみならずpodocalyxinの細胞内結合因子の発現の抑制を介しても、腎症の悪化に関わっている可能性が示された。
【０１４４】
実施例3 EHF感染導入Pod-7細胞でのpodocalyxin発現量変動の可逆性の解析
EHF感染導入Pod-7細胞におけるEHF発現をsiRNAによって抑制し、podocalyxin発現の回復の有無を調べた。
【０１４５】
（１）方法
上記の結果から、EHF感染によるpodocalyxinの発現制御は可逆的であることが示された。このことは、EHFの発現を抑制することにより、podocalyxinの発現を促進させて腎症の治療が可能となることを示唆するものである。
【０１４６】
実施例4 糖尿病性腎症モデルマウスでのEHF発現の確認
糖尿病性腎症モデルマウス(db/dbマウス) の腎皮質におけるEHF発現を、定量PCRを用いて調べた。
【０１４７】
（１）方法
糖尿病性腎症モデルマウス（db/dbマウス）およびC57BL/6 leanマウス(いずれも13週齢)から腎臓を採取し、PBSにて灌流後、腎皮質組織片を採取し、溶解剤を加えて常法に従いtotal RNAを抽出した。次に、1.1μg相当量のtotal RNAを逆転写してPCR用のtemplateとし、合成primerを用いて定量real-time PCR法にてEHF mRNA量を測定した。この時、同時に測定した36B4 mRNA量によって補正し、36B4 mRNA量に対する相対値（EHF mRNA量/36B4 mRNA量）として算出した。
【０１４８】
また、上記方法で採取した腎皮質部位の一部を免疫組織化学用にTISSUE-TEK(MILES)に包埋して凍結した。クライオスタットで薄切片を作成後、2% PFA/4% Sucrose/PBSで10分間固定し、さらに0.3% Triton X-100/PBSで10分間透過化処理を行った。10% FBS/PBSで50分間ブロッキングした後、抗podocalyxin抗体(自製抗体、x100 diluted/10% FBS/PBS)を用いて室温で2時間反応を行った。0.1% Tween20/PBSによる5分間の洗浄を3回行った後、2次抗体（抗ウサギポリクローナル抗体; x100 diluted/PBS）を用いて室温で1時間反応を行った。0.1% Tween20/PBSによる5分間の洗浄を3回行った後、10% PBS/glycerolで包埋し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１４９】
（２）結果
db/dbマウスおよびC57BL/6 leanマウスの腎皮質におけるEHFの発現量（EHF mRNA量/36B4 mRNA量）を図３aに、また各腎皮質凍結切片の免疫組織画像を図３bに示す。
【０１５０】
図３aに示すように、腎皮質におけるEHF発現は、C57BL/6 leanマウスに比べて糖尿病性腎症モデルマウス（db/dbマウス）でEHF発現が増加していた(n=2 平均値をグラフ化)。また、図３bに示すように、podocalyxinの発現は糸球体上皮細胞で強く発現していたが、C57BL/6 leanマウスに比べて糖尿病性腎症モデルマウス（db/dbマウス）ではその発現が低下していた。
【０１５１】
（３）考察
以上示すように、糖尿病性腎症モデルマウス(db/dbマウス)ではEHFの発現が亢進しており（図３a）、逆に糸球体上皮細胞でのpodocalyxinの発現が低下していたことから（図３b）、糖尿病性腎症の病態において、EHF発現が増加し、その結果podocalyxin発現が低下して腎症を悪化させている可能性が示唆された。
【０１５２】
実施例5 EHF発現を亢進させる因子の探索
EHFの発現を増加させる因子を探索した。
【０１５３】
（１）方法
Pod-7細胞(1 x 105 cells/2ml/well)を、10%血清入りD-MEM培地を用いて6ウェルプレートに蒔いて37℃, 5% CO2環境下で培養を開始した。翌日に血清を除去して培養を続け、さらに翌日、(a)TNF-α(5ng/ml)添加、(b)IL-1β(5ng/ml)添加、または(c)両因子添加〔TNF-α(5ng/ml)＋IL-1β(5ng/ml)〕を行って刺激を開始し、7.5時間後に溶解剤を加えて常法に従いtotal RNAを抽出した。次いで1μg相当量のtotal RNAを逆転写してPCR用のtemplateとし、合成primerを用いて定量real-time PCR法にてEHF mRNA量を測定した。この時、同時測定したGAPDH mRNA量によって補正し、GAPDH mRNA量に対する相対値（EHF mRNA量/GAPDH mRNA量）を算出した。
【０１５４】
（２）結果
結果を図４に示す。図４に示すように、Pod-7細胞に対して(a)TNF-α添加、(b)IL-1β添加、および(c)両因子添加を行った際のEHF mRNA発現は、TNF-α添加によっては殆ど変化なかったが、IL-1β添加によって約1.4倍増加した。また、TNF-αおよびIL-1βを同時に添加することにより、EHF mRNA発現は約2倍にまで増加した。
【０１５５】
（３）考察
以上のことから、炎症性サイトカインであるIL-1βによってEHF発現が亢進すること、特にTNF-αおよびIL-1βの併用によってEHF発現が相乗的に亢進することが判明した。糖尿病には肥満を伴って炎症性サイトカインの発現亢進が認められる場合があることから、上記の結果は、糖尿病によりEHF発現が上昇する可能性を示唆するものであった。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】実施例２において、ＥＨＦ遺伝子を過剰に発現させるように導入したPod-7細胞における各遺伝子〔podocalyxin（図a）、EHF（図b）、NHERF2（図c）〕の発現を検討した結果を示す。対照として、通常のPod-7細胞（intact）、GFP（Green Fluorescent Protein）を過剰に発現させたPod-7細胞を用いて、同様に各遺伝子の発現を検討した結果を併せて示す。
【図２】実施例３において、ＥＨＦ遺伝子を発現させるように導入したPod-7細胞において、ＥＨＦの発現をsiRNAで抑制させた場合の、ＥＨＦの発現量（EHF mRNA量）（図a）とpodocalyxinの発現量（podocalyxin mRNA量）（図ｂ）を調べた結果を示す。対照として、EHF siRNAに代えてnegative control siRNAを用いて、同様に各遺伝子の発現を検討した結果を併せて示す。なお、結果は、同時に測定したGAPDH mRNAの量との相対比（Ratio）で示す。
【図３】実施例４において、糖尿病性腎症モデルマウス（db/dbマウス）と正常マウス（C57BL/6 leanマウス）の腎臓におけるＥＨＦの発現量（EHF mRNA量）（図ａ）、およびpodocalyxinの発現量（図ｂ）を調べた結果を示す。なお、図ａの縦軸は、同時に測定したGAPDH mRNAの量との相対比（Ratio）を示す。
【図４】実施例５において、ＥＨＦ遺伝子を発現させるように導入したPod-7細胞を、炎症性サイトカインである(a)TNF-α、(b)IL-1β、(c)TNF-α+IL-1βの存在下または非存在下（intact）で培養した場合における、ＥＨＦの発現量（EHF mRNA量）を調べた結果を示す。なお、縦軸は、同時に測定したGAPDH mRNAの量との相対比（Ratio）を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１５７】
配列番号１は、EHF遺伝子イントロン１における１位〜１００位の塩基配列を示す。
配列番号２および３は、rs717582領域を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４はSNPを含む増幅領域を検出するためのインベーダープローブの塩基配列を、配列番号５はSNPを含む増幅領域のＴ対立遺伝子を検出するためのアレルプローブの塩基配列を、また配列番号６はSNPを含む増幅領域のＣ対立遺伝子を検出するためのアレルプローブの塩基配列を、それぞれ示す。
配列番号７および８は、EHF siRNA（Invitrogen社の「STEALTH SELECT RNA」の二本鎖RNAの塩基配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病性腎症の罹患およびその進行に関連する遺伝子に関する新たな知見を提供するものである。この新たな知見に基づいて、本発明は、具体的には糖尿病性腎症の発症やその進行を予防ないしは治療するために有用な成分をスクリーニングする方法に関する。さらに本発明は、被験者について、糖尿病性腎症を発症する蓋然性が高いか否かを判断し、糖尿病性腎症を発症する潜在的危険性の高い患者を選択する方法、ならびに当該方法に有効に利用することのできる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病性腎症は、世界的に末期腎不全の主原因である。わが国でも１９９８年以降、糖尿病性腎症が慢性糸球体腎炎を抜いて新規透析導入の原因疾患の第１位となり、２００３年には透析導入患者の４割を超えるほどに増加している。The United Kingdom Prospective Diabetes Study（UKPDS）の結果によると、糖尿病性腎症患者では１年間に２〜３％の割合で次の病期へ進行し、また腎不全期以降の年間死亡率は約２０％にも達し、その予後は極めて不良である。従って、早期からの適切な治療介入により腎症の進展と透析導入を抑制することは、患者の予後と医療経済の両面から非常に重要である（非特許文献１参照）。
【０００３】
近年の糖尿病性腎症に関する疫学的研究・家系調査の結果から、腎症の発症が一部の糖尿病患者に限定されていること、および腎症患者に家族内集積が認められることから、腎症の発症・進展に何らかの遺伝因子の存在が示唆され、これまでに多くの遺伝子が糖尿病性腎症感受性候補遺伝子として検討されてきた。こうした糖尿病性腎症の遺伝因子解明により、個々の症例に対する治療法をあらかじめ予測、選択する事、いわゆるオーダーメイド医療の実現が可能となる。しかしながら、未だ明確に糖尿病性腎症感受性候補遺伝子としてのコンセンサスが得られる遺伝子の同定には至っていない。
【０００４】
当該候補遺伝子として最もよく解析されている遺伝子は、アンジオテンシン変換酵素（ACE）遺伝子の第１６イントロンに存在する２８７塩基対の挿入（I）／欠失（D）遺伝子多型である。通常のケース・コントロールスタディでは、Ｄ対立遺伝子と腎症との相関を示した成績が多く、また１８のケース・コントロールスタディのメタアナリシスおよび１型糖尿病症例の前向き追跡研究から、Ｄ対立遺伝子は腎症のリスク遺伝子と考えられるものの、いわゆるmajor geneとは考えにくいとされている（非特許文献２参照）。
【０００５】
また近年、上記候補遺伝子としてＮＣＡＬＤ遺伝子が見出された。具体的には、当該遺伝子は、糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わる糖尿病性腎症感受性遺伝子であり、糖尿病性腎症の発症や進行を予防しまたは治療するための方法を開発するための有用なターゲット遺伝子となること、また、当該ＮＣＡＬＤ遺伝子内に位置する３ＳＮＰｓ（SNP999, SNP1307, SNP1340）が糖尿病性腎症の潜在的発症リスクと有意な関係を有していることが報告されている（特許文献１参照）。
【０００６】
ところでpodocalyxin（ポドカリキシン）は、糸球体上皮細胞のpodocyteの膜表面に硫酸基を有する糖蛋白として存在する１回膜貫通型タンパクであり、細胞内ドメインでNa(+)/H(+)-exchanger regulatory factor 2（NHERF2）およびezrinと結合し、これを介してアクチンファイバーと結合している（非特許文献３参照）。このタンパク質は、糸球体の濾過隙の開放に働き、NHERF2、ezrin及びアクチンとの相互作用によって足突起形態の維持に関与することが知られており、podocalyxin遺伝子を欠失させたノックアウトマウスは、podocyteの足突起およびスリット膜が形成されず無尿のため生後１日で死亡することが報告されている（非特許文献４参照）。すなわち糸球体上皮細胞でのpodocalyxin発現の低下や発現不全は、糸球体濾過機能を低下させ腎機能を不全にする要因となることから、その正常な発現は腎機能を正常に維持するうえで極めて重要である。
【０００７】
一方、ＥＨＦ（ets homologous factor）は、上皮細胞に特異的に発現することを特徴とするETS転写因子のサブファミリー（ESEs）に属するタンパク質であり、転写レプレッサーとして機能することが知られているが（非特許文献５）、その他、喘息の感染や発癌に関連することも報告されている（例えば、特許文献２〜５、非特許文献６等）。
【０００８】
当該ＥＨＦには、同一遺伝子内に複数の多型（SNPs）が存在することが報告されており（特許文献６）、近年の研究では、この因子における遺伝子多型が糖尿病を含む自己免疫疾患の診断に役立つことも記載されているが（特許文献７）、腎疾患、特に糖尿病性腎症との関連については報告されていない。
【非特許文献１】「糖尿病合併症」最新医学別冊 新しい診断と治療のＡＢＣ（30）、最新医学社発行、第101頁
【非特許文献２】「糖尿病合併症」最新医学別冊 新しい診断と治療のＡＢＣ（30）、最新医学社発行、第93頁
【非特許文献３】The Journal of Clinical Investigation, Vol.108, No.2, 2001, p.289-301
【非特許文献４】J. Exp. Med. Volume 194, Number 1, July 2, 2001, p.13-27
【非特許文献５】J. Biol. Chem., Vol.276, No.23, 2001, p.20397-20406
【非特許文献６】Mol. Cancer Ther., 2006, 5(12), 2006, p.3191-3196
【特許文献１】特開２００７−１２９９０５号公報
【特許文献２】US 6087485
【特許文献３】WO2006/062118
【特許文献４】WO2000/055320
【特許文献５】WO2001/022920
【特許文献６】US 6812339
【特許文献７】WO2006/062118
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述するように、糖尿病性腎症の遺伝因子を解明し、糖尿病性腎症の発症やその進行との関連を明確にすることは、個々の症例に最も適した治療法の選択（オーダーメード医療の実現）に繋がると同時に、糖尿病性腎症発症やその進行に対する予防剤や治療剤の有効成分を探索する手段を提供し、さらには特異的かつ安全性の高い医薬品を開発することを可能にするものと考えられる。
【００１０】
本発明の目的は、糖尿病性腎症の発症やその進行に関連する遺伝子（以下、本明細書では「糖尿病性腎症感受性遺伝子」ともいう）を提供するとともに、当該遺伝子と糖尿病性腎症の発症やその進行との関係を明確にすることを目的とする。また本発明の目的は、糖尿病性腎症の発症や進行を予防しまたは治療するための有効成分となりえる物質を探索する方法（スクリーニング方法）を提供することである。
【００１１】
さらに本発明は、被験者について、糖尿病性腎症を発症する蓋然性が高いか否かを判断し、糖尿病性腎症を発症する潜在的危険性の高い患者を選択する方法、ならびに当該方法に有効に利用することのできる試薬キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、糖尿病性腎症に関するゲノムワイドな相関解析を行ったところ、糖尿病性腎症と強い関連を認めるＳＮＰ（一塩基多型）が、ヒトのＥＨＦ（ets homologous factor）の遺伝子（以下、「ＥＨＦ遺伝子」ともいう）のイントロン1領域内に１箇所〔＋48位 T/C（rs717582）〕存在し、当該ＳＮＰ座（rs717582）にシトシン（Ｃ）を有するＣ対立遺伝子保有者（CCまたはCT）は、Ｃ対立遺伝子非保有者（TT）に比して、糖尿病性腎症の発症リスクが有意に高いことを見出した。ＥＨＦ遺伝子のイントロン1の１位〜１００位の塩基配列を配列番号１に示す。
【００１３】
また、本発明者らは、ＥＨＦを過剰発現させた糸球体上皮細胞では、糸球体濾過機能に係わるpodocalyxinの発現が有意に低下する一方、当該ＥＨＦの発現をsiRNAで抑制することにより、podocalyxinの発現が回復することを確認した。このことは、ＥＨＦの発現が腎機能の低下に深く関与し、糖尿病性腎症の病態を悪化させる因子であることを示唆するものである。
【００１４】
これらの知見から、本発明者らは、ＥＨＦ遺伝子が糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わる糖尿病性腎症感受性遺伝子であり、糖尿病性腎症の発症や進行を予防しまたは治療するための方法を開発するための有用なターゲット遺伝子となることを確信した。さらに、本発明者らは、ＥＨＦ遺伝子内に位置する糖尿病性腎症と有意な関連性を有するＳＮＰ（rs717582）と糖尿病性腎症の潜在的発症リスクとの関係を見出し、これから被験者について当該ＳＮＰの塩基（T/C）を測定することによって、当該被験者の糖尿病性腎症の潜在的発症リスクを評価することができることを確信した。
【００１５】
本発明はかかる知見に基づいて完成したものであり、下記の具体的態様を有するものである。
【００１６】
Ｉ．糖尿病性腎症の予防または治療に有効な成分をスクリーニングする方法
項１．下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１）被験物質とＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００１７】
項２．下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１’）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（２’）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＥＨＦの産生量を測定する工程、及び
（３’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞もしくはその細胞画分のＥＨＦの産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００１８】
項３．下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（1”）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分を接触させる工程、
（2”）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＥＨＦの作用を検出する工程、及び
（3”）上記の検出した作用が、被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画分のＥＨＦの作用よりも低い被験物質を選択する工程。
【００１９】
項４．ＥＨＦの作用が転写抑制作用である、項３記載のスクリーニング方法。
【００２０】
項５．ＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞またはＥＨＦを産生可能な細胞が、糸球体上皮細胞である項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００２１】
項６．糖尿病性腎症の予防または治療剤の有効成分を探索する方法である項１〜５のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【００２２】
II．糖尿病性腎症の罹患リスクが高い被験者の選別方法
項７．被験者由来の生体試料（被験試料）におけるＥＨＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該発現量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＥＨＦ遺伝子のｍＲＮＡ発現量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いとの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【００２３】
項８．被験者由来の生体試料（被験試料）におけるＥＨＦの産生量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該産生量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＥＨＦの産生量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【００２４】
項９．被験者由来の生体試料（被験試料）におけるＥＨＦ遺伝子のイントロン1に存在する48番目における塩基を検出する工程を含み、当該塩基がシトシンであることを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【００２５】
III．糖尿病性腎症の罹患リスク診断キット
項１０．ＥＨＦ遺伝子のイントロン1に存在する48番目における塩基を検出するための試薬を含む、糖尿病性腎症の罹患性診断キット。
【００２６】
IV．糖尿病性腎症の予防又は治療剤
項１１．ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するsiＲＮＡを有効成分として含む糖尿病性腎症の予防又は治療剤。
【００２７】
項１２．上記siＲＮＡが、配列番号７に記載する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび配列番号８に記載する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡである、項１１に記載する糖尿病性腎症の予防又は治療剤。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のスクリーニング方法によれば、糖尿病性腎症の発症や進行を予防または治療するのに有効な成分を取得することが可能になる。また当該方法は、糖尿病性腎症の予防または治療に有効な新規薬剤の開発に有効に利用することができる。
【００２９】
さらに本発明が提供する糖尿病性腎症感受性遺伝子ならびに糖尿病性腎症感受性ＳＮＰによれば、被験者（特に糖尿病患者）について腎症を発症する相対的な危険度を簡便に検出することができる。本発明の検出方法は、in vitroでしかも医師等の専門的な知識を要することなく簡単に実施することができる方法である。本発明の方法によって腎症を発症する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者（糖尿病患者）に対しては、その旨を告知し、予め腎症の発症を防ぐか、または少しでも遅延させるための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、糖尿病性腎症の発症を予防するための、または糖尿病性腎症の発症を遅延させるための検査方法として極めて有用である。さらに本発明は上記方法において使用される試薬を提供するものであり、これにより上記方法を簡便に実施することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
１．本発明で使用する用語の定義
本明細書における塩基配列（ヌクレオチド配列）、核酸などの略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAc-IUB communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138; 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作製のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従うものとする。
【００３１】
本明細書中において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、及び１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、並びに当該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが含まれる、また、本明細書で「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【００３２】
また、本明細書中において、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は、核酸と同義であって、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むものとする。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」）といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）も包括的に意味するものとする。さらに、「ヌクレオチド」（または「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」）がＲＮＡである場合、配列表に示される塩基記号「Ｔ」は「Ｕ」と読み替えられるものとする。
【００３３】
本明細書において「遺伝子多型」とは、２つ以上の遺伝的に決定された対立遺伝子がある場合にそれらの対立遺伝子間に見られる相違のことを言う。具体的には、ヒトの集団において、ある一個体のゲノム配列を基準として、他の１または複数の個体ゲノム中の特定部位に、１又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、転移、逆位などの変異が存在するとき、その変異が当該１または複数の個体に生じた突然変異でないことが統計学的に確実か、または当該個体内特異変異でなく、１％以上の頻度で集団内に存在することが家系的に証明される場合、その変異を「遺伝子多型」とする。本明細書で用いる「遺伝子多型」の意味には、単一のヌクレオチドの変化によって引き起こされる多型であるいわゆる一塩基多型〔Single Nucleotide Polymorphism：ＳＮＰ〕が含まれる。「一塩基多型」とは、単一の核酸の変化によって引き起こされる多型である。多型は選択された集団の１％より大きな頻度、好ましくは１０％以上の頻度で存在する。また「ハプロタイプ」とは、一つのアレル（ハプロイド）に存在する遺伝子変異の組み合わせをいう。
【００３４】
本明細書において「糖尿病性腎症感受性遺伝子」とは、糖尿病患者のうち腎症を発症しやすい体質または腎症に進行しやすい体質を決める遺伝子のことをいう。
【００３５】
本明細書において「糖尿病性腎症」とは、糖尿病が進行して腎臓にも影響が及び、タンパク尿を伴う腎障害が起こる状態を言う。糖尿病性腎症の患者は高血糖による腎機能の障害から、原尿を作る能力が損なわれ、最終的には腎不全となる。統計によれば、糖尿病性腎症による末期腎不全で透析治療を始める患者数は年々増加しており、現在、透析導入患者の原因疾患として糖尿病性腎症は第１位になっている。より具体的には、本発明が対象とする「糖尿病性腎症」には、糖尿病網膜症を発症し、かつ尿中アルブミン排泄率が200μg/分以上であるかまたは尿中アルブミン／クレアチニン比が300mg/gCr以上である症例、ならびに糖尿病網膜症を発症し、且つ人工透析療法を受けている症例が含まれる。
【００３６】
本明細書に記載する各塩基番号は、The National Center for Biotechnology Information data baseの位置情報に基づくものである。また、本明細書において各ＳＮＰの位置番号である48位は、ＥＨＦ遺伝子のイントロン1の１番目の塩基を１としたときの位置情報を意味する。なお、ＥＨＦ遺伝子のイントロン1の塩基配列を配列番号１に記載する。
【００３７】
２．糖尿病性腎症感受性遺伝子および糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ
本発明者らは、糖尿病性腎症感受性遺伝子を探索するために、多くの日本人２型糖尿病患者を対象として、gene-based SNPsを用いたケースコントロール相関解析ならびに連鎖不平衡（LD）マッピングを行うことにより、第11番染色体p12（11p12）領域に存在するets homologous factor遺伝子（ＥＨＦ遺伝子）のイントロン1の塩基配列上に存在する１つのＳＮＰ（rs717582）を見出し、糖尿病性腎症を発症している患者は、当該ＳＮＰがシトシン（Ｃ）になっている頻度が有意に高く、このことから、当該ＳＮＰが糖尿病性腎症の発症やその進行に有意に関係していることが示唆された（糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ）。また本発明者らは、ＥＨＦを過剰発現している系では、腎臓の糸球体濾過機能に重要なpodocalyxinの発現が有意に低下していることから、ＥＨＦ遺伝子の発現の亢進（増加）が、腎症の悪化、すなわち糖尿病性腎症の発症と深く関わっていることを見出し、ＥＨＦ遺伝子が糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わる糖尿病性腎症感受性遺伝子であるとの結論に至った。
【００３８】
当該ヒトＥＨＦ遺伝子は、ヒト第11染色体のゲノム配列（Genbank Sequence Accession IDs: NC-_000011.8）中、塩基番号34599244番〜34639657番に位置する40414bpの遺伝子である（Genbank Sequence Accession:NM_012153.5/ NP_036285.2）。
【００３９】
ＥＨＦ遺伝子と疾患との関連性については、従来、糖尿病を含む自己免疫疾患との関連性（特許文献７参照）が報告されているが、腎疾患、特に糖尿病性腎症との関連については報告されていない。
【００４０】
実施例１で示すように、ＳＮＰ（rs717582）がシトシン（Ｃ）の対立遺伝子を有する２型糖尿病患者は、糖尿病性腎症を発症しやすい傾向にあった。従って、当該糖尿病性腎症感受性ＳＮＰは、糖尿病性腎症の発症または進行のしやすさを規定する糖尿病性腎症の遺伝的素因マーカーであり、ヒト被験者について、特に２型糖尿病患者について糖尿病性腎症の易発症性・易進行性を判断する指標となる。
【００４１】
すなわち、当該糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ（rs717582）の塩基がシトシン（Ｃ）である場合、当該ＳＮＰを有する被験者は、遺伝的に糖尿病性腎症を発症しやすいか、または糖尿病から腎症に発展進行しやすい体質を備えている（糖尿病性腎症に感受性）と判断することができる。
【００４２】
３．糖尿病性腎症の予防または治療に有効な成分をスクリーニングする方法
前述するように、本発明者らは、ＥＨＦ遺伝子の発現の亢進（増加）が、podocalyxin遺伝子の発現低下を伴い、糖尿病性腎症の発症やその進行に深く関わっていることを見出した。このことから、ＥＨＦが糖尿病性腎症の発症抑制またはその進行抑制に関わっており、ＥＨＦ遺伝子の発現（ｍＲＮＡ発現）を抑制させて、podocalyxin遺伝子の発現低下を防止しえる物質は、糖尿病性腎症の予防または治療に有効な成分として有用であると考えられる。
【００４３】
下記に説明する本発明のスクリーニング方法は、被験物質の中から、（3-1）ＥＨＦ遺伝子の発現（ｍＲＮＡ発現）抑制、（3-2）ＥＨＦの産生量の低下、または（3-3）ＥＨＦが有する作用の低下、を指標として、これらの作用を示す物質を探索することによって、糖尿病性腎症の予防剤または治療剤（以下、これらを総称して「抗糖尿病性腎症剤」ともいう）の有効成分を取得しようとするものである。
【００４４】
なお、抗糖尿病性腎症剤の有効成分となりえる候補物質としては、核酸、ペプチド、タンパク質、有機化合物（低分子化合物、高分子化合物を含む）、無機化合物などを挙げることができる。本発明のスクリーニング方法は、これらの候補物質を含む試料を対象として実施することができる（これらを総称して「被験物質」という）。ここで、候補物質を含む試料には、細胞抽出物、遺伝子ライブラリーの発現産物、微生物培養上清、および菌体成分などが含まれる。
【００４５】
(3-1) ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制する作用を有する物質を、ＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量を指標として探索し、抗糖尿病性腎症剤の有効成分として取得する方法である。
【００４６】
当該方法は、具体的には下記の工程（１）〜（３）を行うことによって実施することができる。
（１）被験物質とＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００４７】
かかるスクリーニングに用いられる細胞としては、天然または組み換え体の別を問わず、ＥＨＦ遺伝子を発現し得る細胞であればよい。なおＥＨＦ遺伝子の由来も特に制限されず、ヒト由来であっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類やその他の生物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒト由来のＥＨＦ遺伝子である。かかる細胞として、具体的には、ＥＨＦ遺伝子を有する糸球体上皮細胞（ヒトおよびその他の生物種由来のものを含む）、および単離調製された糸球体上皮細胞の初代培養細胞を挙げることができる。
【００４８】
また、定法に従って、ＥＨＦ遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入してＥＨＦ ｍＲＮＡを発現可能な状態に調製された形質転換細胞を使用することもできる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【００４９】
本発明のスクリーニング方法（3-1）の工程（１）において、被験物質とＥＨＦ遺伝子発現可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、当該細胞が死滅せず、且つＥＨＦ遺伝子が発現し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択することが好ましい。
【００５０】
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＥＨＦ遺伝子発現可能細胞とを接触させて、ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制させてそのｍＲＮＡの発現量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＥＨＦ遺伝子発現可能細胞を培養した場合のＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量が、被験物質非存在下で上記に対応するＥＨＦ遺伝子発現可能細胞を培養した場合に得られるＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量（対照発現量）よりも小さいことを指標として、細胞と接触させた当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００５１】
ＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量の測定（検出、定量）は、ＥＨＦ遺伝子発現可能細胞のＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量を、当該ＥＨＦ ｍＲＮＡの塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドなどを利用したノーザンブロット法やＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイム定量ＰＣＲ法などの公知の方法、またはＤＮＡアレイを利用した測定方法を実施することなどにより行うことができる。
【００５２】
(3-2) ＥＨＦの産生を低下させる作用を指標とした物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、ＥＨＦの産生を低下させる作用を有する物質を、ＥＨＦの産生量の低下を指標として探索し、抗糖尿病性腎症剤の有効成分として取得する方法である。
【００５３】
当該方法は、具体的には下記の工程（1’）〜（3’）を行うことによって実施することができる。
（1’）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（2’）被験物質を接触させた細胞または細胞画分のＥＨＦの産生量を測定する工程、及び
（3’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞（ＥＨＦを産生可能な細胞）または被験物質を接触させない細胞画分（ＥＨＦを産生可能な細胞から調製）のＥＨＦの産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【００５４】
かかるスクリーニングに用いられる細胞（対照細胞を含む）としては、天然または組み換え体の別を問わず、ＥＨＦ遺伝子が発現してＥＨＦを産生し得る細胞であればよい。なおＥＨＦ遺伝子の由来も特に制限されず、ヒト由来であっても、またヒト以外のマウスなどの哺乳類やその他の生物種に由来するものであってもよいが、好ましくはヒト由来のＥＨＦ遺伝子である。かかる細胞として、具体的には、ＥＨＦ遺伝子を有する糸球体上皮細胞（ヒトおよびその他の生物種由来のものを含む）、および単離調製された糸球体上皮細胞の初代培養細胞を挙げることができる。
【００５５】
また、定法に従って、ＥＨＦ遺伝子のｃＤＮＡを有する発現ベクターを導入してＥＨＦを産生可能な状態に調製された形質転換細胞を使用することもできる。なお、スクリーニングに用いられる細胞の範疇には、細胞の集合体である組織も含まれる。
【００５６】
本発明のスクリーニング方法（3-2）の工程（1’）において、被験物質とＥＨＦ産生可能細胞とを接触させる条件は、特に制限されないが、当該細胞が死滅せず、且つＥＨＦ遺伝子が発現し且つＥＨＦが産生し得る培養条件（温度、ｐＨ、培地組成など）を選択することが好ましい。
【００５７】
候補物質の選別は、例えば上記条件で被験物質とＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分とを接触させて、ＥＨＦの産生量を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合のＥＨＦ産生量が、被験物質非存在下で上記に対応するＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合に得られるＥＨＦの産生量（対照産生量）よりも小さいことを指標として、細胞または細胞画分と接触させた当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００５８】
ＥＨＦ産生量の測定（検出、定量）は、ＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分から得られるＥＨＦの量を、当該ＥＨＦに対する抗体（抗ＥＨＦ抗体）を利用してウエスタンブロット法や免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ等の公知の方法を行うことによって実施することができる。
【００５９】
(3-3) ＥＨＦの作用を低下させる作用を指標とした物質のスクリーニング方法
当該スクリーニングは、被験物質の中から、ＥＨＦの作用を低下させる作用を有する物質を、ＥＨＦ作用の低下を指標として探索し、抗糖尿病性腎症剤の有効成分として取得する方法である。
【００６０】
当該方法は、具体的には下記の工程（1”）〜（3”）を行うことによって実施することができる。
（1”）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分を接触させる工程、
（2”）被験物質を接触させた細胞または細胞画分のＥＨＦの作用を検出する工程、及び
（3”）上記の検出した作用が、被験物質を接触させない対照細胞（ＥＨＦを産生可能な細胞）または細胞画分（ＥＨＦを産生可能な細胞から調製）のＥＨＦの作用よりも低い被験物質を選択する工程。
【００６１】
当該スクリーニングで用いられる細胞、並びに工程(2”)において被験物質と接触させる方法や条件は、前述する(3-2)のスクリーニング方法にて記載したものを同様に使用することができる。
【００６２】
候補物質の選別は、上記条件で被験物質とＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分とを接触させて、ＥＨＦの作用を低下させる物質を探索することによって行うことができる。具体的には、被験物質存在下でＥＨＦ産生可能細胞またはその細胞画分を培養した場合に生じるＥＨＦの作用が、被験物質非存在下で上記に対応するＥＨＦ産生可能細胞または細胞画分を培養した場合に得られるＥＨＦの作用（対照作用）よりも低いことを指標として、当該被験物質を候補物質として選別することができる。
【００６３】
ここで、ＥＨＦの作用とは、ＥＨＦの有する機能をさす。例えば、ＥＨＦの発現量の上昇とともにpodocalyxinの発現量を低下させることが挙げられる。その他に、転写活性抑制作用（非特許文献５等参照）など従来からＥＨＦが有する機能として公知であったもの全てが含まれる。なお、糖尿病性腎症の関連因子である上記ＥＨＦまたはその遺伝子の発現量の測定は、当業者の周知の方法によれば可能である。またその転写活性抑制作用をはじめとする様々な機能も、標的因子のｍRNAを測定する方法、または転写活性を直接Run-on assay法で測定する方法など、公知の方法により測定することができる。
【００６４】
上記(3-1)〜(3-3)のスクリーニング方法で選別された物質は、糸球体上皮細胞においてＥＨＦ遺伝子の発現増加（亢進）を抑制して、腎機能に重要な役割を担うpodocalyxinの発現低下を抑制する作用を有するものであり、よって糖尿病性腎症の発症やその進行を予防する組成物または糖尿病性腎症を改善する組成物の有効成分として使用することが可能である。
【００６５】
上記のスクリーニング方法によって選別された候補物質は、さらに糖尿病性腎症を有する病態非ヒト動物を用いてスクリーニングにかけることもできる。かくして選別される候補物質は、さらに糖尿病性腎症を有する病態非ヒト動物を用いた薬効試験、安全性試験、さらに糖尿病性腎症を有する患者（ヒト）もしくはその前状態にある患者（ヒト）への臨床試験に供してもよく、これらの試験を実施することによって、より実用的な糖尿病性腎症の予防または治療用組成物の有効成分を選別取得することができる。
【００６６】
このようにして選別された物質は、必要に応じて構造解析を行った後、その物質の種類に応じて、化学的合成、生物学的合成（発酵を含む）または遺伝子学的操作によって、工業的に製造することができ、糖尿病性腎症予防・治療用組成物の調製に使用することができる。
【００６７】
４．糖尿病性腎症の罹患リスクが高い被験者（糖尿病性腎症易罹患者）の選別方法
本発明は、また被験者について糖尿病性腎症の罹患・進行リスク（糖尿病性腎症を発症し易いまたは進行易いか／発症し難いまたは進行し難いかの別）を測定し、当該被験者の中から上記リスクの高い被験者を選別する方法を提供する。なお、本発明では、これらのリスクが高い被験者を「糖尿病性腎症易罹患者」と称する。
【００６８】
その選別方法としては、被験者の被験試料について、(4-1) ＥＨＦ遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ発現量）を指標とする方法、(4-2) ＥＨＦの産生量を指標とする方法、および(4-3) ＥＨＦ遺伝子の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを指標とする方法、を挙げることができる。
【００６９】
(4-1) ＥＨＦ遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ発現量）を指標とする糖尿病性腎症易罹患者の選別方法
当該方法は、被験者由来の生体試料におけるＥＨＦ遺伝子の発現量、すなわちＥＨＦ ｍＲＮＡ発現量を測定することによって行うことができる。ここで生体試料としては、ＥＨＦ遺伝子を発現し得る細胞を含む試料であればよいが、具体的には、血液を挙げることができる。
【００７０】
ＥＨＦ ｍＲＮＡ発現量の測定方法は、上記(3-1)の方法で説明するように、定法に従って行うことができる。
【００７１】
かかる測定の結果、被験者の生体試料（被験試料）におけるＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＥＨＦ ｍＲＮＡの発現量（対照発現量）よりも大きい場合に、前記被験者は糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い（糖尿病性腎症易罹患性）と判断することができる。
【００７２】
ここで「正常」とは、少なくとも腎症を発症していないか、または腎症を発症する前段階でもないという意味で用いられる。具体的には尿中アルブミン排泄率が20μg/分未満または尿中アルブミン／クレアチニン比が30mg/gCr未満である場合に、腎症に関して「正常」と判断することができる。
【００７３】
(4-2) ＥＨＦの産生量を指標とする糖尿病性腎症易罹患者の選別方法
当該方法は、被験者由来の生体試料におけるＥＨＦの産生量を測定することによって行うことができる。ここで生体試料としては、ＥＨＦ遺伝子を発現し、ＥＨＦを産生し得る細胞を含む試料であればよいが、具体的には血液を挙げることができる。
【００７４】
ＥＨＦ産生量の測定方法は、上記(3-2)の方法で説明するように、定法に従って行うことができる。
【００７５】
かかる測定の結果、被験者の生体試料（被験試料）におけるＥＨＦの産生量が、正常人由来の生体試料（対照試料）におけるＥＨＦの産生量（対照産生量）よりも大きい場合に、前記被験者は糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い（糖尿病性腎症易罹患性）と判断することができる。
【００７６】
(4-3) ＥＨＦ遺伝子の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを指標とする糖尿病性腎症易罹患者の選別方法
当該方法は、被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、ヒトＥＨＦ遺伝子のイントロン1の48位（rs717582）について塩基を検出し同定する工程を有するものである：
本発明の検出方法として好ましくは、ヒト被験者から得られるゲノムＤＮＡを対象として、ヒトＥＨＦ遺伝子のイントロン1の48位（rs717582）について塩基を検出し同定する工程を有し、さらに、検出し同定した塩基がシトシン（Ｃ）である場合に、当該被験者を、糖尿病性腎症に罹りやすい者（糖尿病性腎症易罹患者）として判定し、選択する工程を有することができる。
【００７７】
当該方法によれば、糖尿病性腎症易罹患性及び糖尿病性腎症難罹患性の別、すなわち糖尿病性腎症罹患リスクを判定し診断することができる。当該糖尿病性腎症罹患リスクの判定（診断）は、上記ＳＮＰの塩基の別を判断基準（判断指標）として医師等の専門知識を有する者の判断を要することなく、機械的（自動的）に行なうことができる。このため、本発明の方法は、糖尿病性腎症の罹患危険度の検出方法と言うことができる。
【００７８】
なお、上記ゲノムＤＮＡの抽出および目的塩基の検出は、公知の方法〔例えば、Bruce, et al., Geneme Analysis/A laboratory Manual (vol.4), Cold Spring Harbor Laboratory, NY., (1999)〕を用いて行うことができる。
【００７９】
ゲノムＤＮＡの抽出を行う検体は、被験者および臨床検体等から単離されたあらゆる細胞（培養細胞を含む。但し生殖細胞は除く）、組織（培養組織を含む）、臓器、または体液（例えば、唾液、リンパ液、気道粘膜、精液、汗、尿等）などを材料とすることができる。該材料としては末梢血から分離した白血球または単核球が好ましく、特に白血球が最も好適である。これらの材料は、臨床検査において通常用いられる方法に従って単離することができる。
【００８０】
例えば白血球を材料とする場合、まず被験者より単離した末梢血から常法に従って白血球を分離する。次いで、得られた白血球にプロティナーゼＫとドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えてタンパク質を分解、変性させた後、フェノール／クロロホルム抽出を行うことによりゲノムＤＮＡ（ＲＮＡを含む）を得る。ＲＮＡは、必要に応じてＲＮaseにより除去することができる。なお、ゲノムＤＮＡの抽出は、上記の方法に限定されず、当該技術分野で周知の方法（例えば、Sambrook J. et. al., “Molecular Cloning: A Laboratry Manual (2nd Ed.)”Cold Spring Harbor Laboratory, NY）や、市販のＤＮＡ抽出キット等を利用して行なうことができる。さらに必要に応じて、ヒト第11染色体（11p12）上のＥＨＦ遺伝子またはそのイントロン1を含むＤＮＡを単離してもよい。当該ＤＮＡの単離は、ＥＨＦ遺伝子またはそのイントロン1にハイブリダイズするプライマーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ等によって行うことができる。
【００８１】
目的塩基を検出する工程において、上記のようにして得られたヒトゲノムＤＮＡを含む抽出物から、糖尿病性腎症に極めて関連性の深い糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを検出する。なお、当該塩基の検出は、ヒトゲノムＤＮＡを含む試料からさらに単離したヒト第11染色体上のＥＨＦ遺伝子、好ましくはそのイントロン1を含むＬＤブロック中の塩基配列を直接決定し、各ブロック内に位置する当該ＳＮＰの塩基の変異を調べる方法によってもよい。
【００８２】
例えば目的の塩基を検出する方法としては、上記のように該当領域の遺伝子配列を直接決定する方法の他に、多型配列が制限酵素認識部位である場合は、制限酵素切断パターンの相違を利用して、遺伝子型を決定する方法（以下、ＲＦＬＰという）、多型特異的なプローブを用いハイブリダイゼーションを基本とする方法（例えば、チップやガラススライド、ナイロン膜上に特定なプローブを張り付け、それらのプローブに対するハイブリダイゼーション強度の差を検出することによって、多型の種類を決定する、または、特異的なプローブのハイブリダイゼーションの効率を、鋳型２本鎖増幅時にポリメレースが分解するプローブの量を検出することにより遺伝子型を特定する方法、ある種の２本鎖特異的な蛍光色素が発する蛍光を温度変化を追うことにより２本鎖融解の温度差を検出し、これにより多型を特定する方法、多型部位特異的なオリゴプローブの両端に相補的な配列を付け、温度によって該当プローブが自己分子内で２次構造をつくるか、ターゲット領域にハイブリダイズするかの差を利用して遺伝子型を特定する方法など）がある。また、さらに鋳型特異的なプライマーからポリメレースによって塩基伸長反応を行わせ、その際に多型部位に取り込まれる塩基を特定する方法（ダイデオキシヌクレオタイドを用い、それぞれを蛍光標識し、それぞれの蛍光を検出する方法、取り込まれたダイデオキシヌクレオタイドをマススペクトロメトリーにより検出する方法）、さらに鋳型特異的なプライマーに続いて変異部位に相補的な塩基対または非相補的な塩基対の有無を酵素によって認識させる方法などがある。
【００８３】
以下、従来公知の代表的な遺伝子多型の検出方法を列記するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００８４】
(a)ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、（b）ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）〔Biotechniques, 16, 296-297 (1994)、及びBiotechniques, 21, 510-514 (1996)〕、（c）ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法〔Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)〕、（d）ダイレクトシークエンス法〔Biotechniques, 11, 246-249 (1991)〕、（e）ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法〔Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)；Nuc. Acids. Res., 20, 4831-4837 (1992)〕、（f）変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis；ＤＧＧＥ）法〔Biotechniques, 27, 1016-1018 (1999)〕、（g）ＲＮaseＡ切断法〔DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)〕、（h）化学切断法〔Biotechniques, 21, 216-218 (1996)〕、（i）ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法〔Genome Res., 8, 549-556 (1998)〕、（j）ＴａｑＭａｎ−ＰＣＲ法〔Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)；J. Clin. Microbiol., 34, 2933-2936 (1996)〕、（k）インベーダー法〔Science, 5109, 778-783 (1993)；J. Biol. Chem., 30,21387-21394 (1999)；Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999)〕、（l）ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法〔Genome Res., 7, 378-388 (1997)；Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 545-548 (1997)〕、（m）ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)〕、（n）モレキュラー・ビーコン（Molecular Beacons）法〔Nat. Biotechnol., 1, 49-53 (1998)；遺伝子医学、4, 46-48 (2000)〕、（o）ダイナミック・アレル−スペシフィック・ハイブリダイゼーション（Dynamic Allele-Specific Hybridization；ＤＡＳＨ）法〔Nat. Biotechnol.,1, 87-88 (1999)；遺伝子医学、4, 47-48 (2000)〕、（p）パドロック・プローブ（Padlock Probe）法〔Nat. Genet.,3, 225-232 (1998) ；遺伝子医学、4, 50-51 (2000)〕、（q）ＵＣＡＮ法〔タカラ酒造株式会社ホームぺージ（http://www.takara.co.jp ）参照〕、（r）ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ（「ＳＮＰ遺伝子多型の戦略」松原謙一・榊佳之、中山書店、p128-135）、（s）ＥＣＡ法〔Anal. Chem., 72, 1334-1341, (2000)〕。
【００８５】
以上は代表的な遺伝子多型検出方法であるが、本発明の糖尿病性腎症罹患リスクの判定には、これらに限定されず、他の公知または将来開発される遺伝子多型検出方法を広く用いることができる。また、本発明の遺伝子多型検出に際して、これらの遺伝子多型検出方法を単独で使用してもよいし、また２以上を組み合わせて使用することもできる。
【００８６】
以上、本発明の方法（（4-1）〜(4-3)）によって、糖尿病性腎症を発症するかまたはそれが進行する潜在的な危険度が相対的に高いことが判明した被験者に対しては、その旨を告知し、予め糖尿病性腎症の発症または進行を防ぐための的確な対策を講じることができる。従って、本発明は、糖尿病性腎症の発症や進行を予防するための検査方法として、さらには糖尿病性腎症に伴って生じる他の疾患や症状発生の予防のための検査方法として極めて有用である。
【００８７】
５．糖尿病性腎症の罹患リスク診断キット
本発明はまた、糖尿病性腎症の罹患リスクを診断するための試薬キット（診断キット）を提供する。特に、上記（4-3)で説明する糖尿病性腎症易罹患者の選別方法に使用される診断キットを提供する。
【００８８】
(5-1)プローブ
上記(4-3)にて説明する糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ並びに当該塩基を含むヌクレオチドの検出には、ヒト第11染色体（11p12）のＥＨＦ遺伝子上の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズし、当該ＳＮＰを検出することができるオリゴまたはポリヌクレオチドが用いられる。かかるオリゴまたはポリヌクレオチドは、上記ＥＨＦ遺伝子上においてＳＮＰ４１３９を含む１６〜５００塩基長、好ましくは２０〜２００塩基長、より好ましくは２０〜５０塩基長の連続した遺伝子領域と特異的にハイブリダイズするように、上記塩基長を有するオリゴまたはポリヌクレオチドとして設計される。
【００８９】
ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら、Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA, 第２版、1989に記載の条件）において、他のＤＮＡとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。好適には当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、上記検出するＳＮＰを含む遺伝子領域の塩基配列に対して相補的な塩基配列を有することが望ましいが、かかる特異的なハイブリダイゼーションが可能であれば、完全に相補的である必要はない。
【００９０】
かかるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、下記(ａ)に示すオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【００９１】
(a) ＥＨＦ遺伝子の塩基配列において、イントロン1の48位（rs717582）に位置するヌクレオチドを含む１６〜５００塩基長の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【００９２】
当該オリゴまたはポリヌクレオチドは、被験者について糖尿病性腎症に対する罹患性やその進行性を判定するために、ヒト第１１染色体上のＥＨＦ遺伝子上に位置する糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ（rs717582）を含むオリゴまたはポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴまたはポリヌクレオチド「プローブ」として設計される。なお、これらのオリゴまたはポリヌクレオチドは、ＥＨＦ遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作成することができる。
【００９３】
さらに好ましくは、当該プローブは、上記各ＳＮＰを含むオリゴヌクレオチドが検出できるように、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、または酵素等で標識される（後述）。
【００９４】
上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）は任意の固相に固定化して用いることもできる。このため本発明はまた、上記プローブ（オリゴまたはポリヌクレオチド）を固定化プローブ（例えばプローブを固定化した遺伝子チップ、ｃＤＮＡマイクロアレイ、オリゴＤＮＡアレイ、メンブレンフィルター等）として提供するものである。当該プローブは、好適には糖尿病性腎症感受性遺伝子検出用のＤＮＡチップとして利用することができる。
【００９５】
固定化に使用される固相は、オリゴまたはポリヌクレオチドを固定化できるものであれば特に制限されることなく、例えばガラス板、ナイロンメンブレン、マイクロビーズ、シリコンチップ、キャピラリーまたはその他の基板等を挙げることができる。固相へのオリゴまたはポリヌクレオチドの固定は、予め合成したオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上に載せる方法であっても、また目的とするオリゴまたはポリヌクレオチドを固相上で合成する方法であってもよい。固定方法は、例えばＤＮＡマイクロアレイであれば、市販のスポッター（Amersham社製など）を利用するなど、固定化プローブの種類に応じて当該技術分野で周知である〔例えば、photolithographic技術(Affymetrix社)、インクジェット技術(Rosetta Inpharmatics社)によるオリゴヌクレオチドのin situ合成等〕。
【００９６】
例えば、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法〔Livak KJ. Gene Anal. 14, 143 (1999), Morris T. et al., J. Clin. Microbiol. 34, 2933 (1996)〕の場合、糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを含む領域に相補的な２０塩基長程度のオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。当該プローブは、5’末端を蛍光色素、3’末端を消光物質により標識され、検体ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするが、そのままでは発光せず、別に加えられたＰＣＲプライマーの上流からの伸長反応により5’側の蛍光色素結合が切断され、遊離した蛍光色素により検出される。
【００９７】
Ｉｎｖａｄｅｒ法〔Lyamichev V. et al., Nat. Biotechnol. 17, 292 (1999)〕では、多型部位に隣接する配列（3’側と5’側の２種）に相補的なオリゴヌクレオチドがプローブとして設計される。検出は、これら２種のプローブと検体とは無関係な第３のプローブによって達成される。
【００９８】
（5-2）プライマー
本発明は、またヒト第11染色体のＥＨＦ遺伝子上の糖尿病性腎症感受性ＳＮＰを含む配列領域を特異的に増幅するためのプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドを提供する。
【００９９】
かかるオリゴまたはポリヌクレオチドとしては、下記(a)に示すオリゴまたはポリヌクレオチド（但し、当該オリゴ若しくはポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、配列表中の塩基記号「ｔ」は「ｕ」に読み替えるものとする）にハイブリダイズする１５〜３０塩基長のオリゴまたはポリヌクレオチドを挙げることができる。
【０１００】
(a) ヒトＥＨＦ遺伝子の塩基配列において、イントロン1の48位（rs717582）に位置するヌクレオチドを含む１６塩基長以上の連続したオリゴまたはポリヌクレオチド。
【０１０１】
このようなオリゴヌクレオチドは、ＥＨＦ遺伝子において、糖尿病性腎症感受性ＳＮＰの塩基（ヌクレオチド）を含む連続したオリゴまたはポリヌクレオチドの一部に特異的にハイブリダイズし、当該オリゴまたはポリヌクレオチドを特異的に増幅するための１５〜３０塩基長、好ましくは１８〜２５塩基長程度のオリゴヌクレオチドとして設計される。増幅するオリゴまたはポリヌクレオチドの長さは、用いられる検出方法に応じて適宜設定されるが、一般的には１５〜１０００塩基長、好ましくは２０〜５００塩基長、より好ましくは２０〜２００塩基長である。
【０１０２】
ヒト第11染色体のＥＨＦ遺伝子上の、糖尿病性腎症感受性ＳＮＰ（rs717582）近傍の１５塩基長以上連続した塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列を有する上記の各種オリゴヌクレオチドは、本発明においてプライマーとして利用することができる。なお、これらのオリゴヌクレオチドは、ヒトＥＨＦ遺伝子の塩基配列に基づいて、例えば市販のヌクレオチド合成機によって常法に従って作製することができる。
【０１０３】
Ｍａｓｓ Ａｒｒａｙ法にＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry）を応用した方法〔Haff LA. et al. Genome Res. 7, 378 (1997), Little DP. et al., Nature Medicine 3, 1413-1416 (1997)〕を例にとって、プライマーの具体的な利用方法を説明する。この場合、シリコンチップ上に固定した検体ＤＮＡに前記プライマーをハイブリダイズさせ、ｄｄＮＴＰを添加して一塩基だけを伸長させる。次いで、一塩基伸長産物を分離し、質量分析法により多型を検出する。この方法では、プライマーは通常１５塩基長以上で可能な限り短く設計することが望ましい。
【０１０４】
（5-3）標識物
上記本発明のプローブまたはプライマーには、遺伝子多型検出のための適当な標識物、例えば蛍光色素、酵素、タンパク質、放射性同位体、化学発光物質、ビオチン等が付加されたものが含まれる。
【０１０５】
なお、本発明において用いられる蛍光色素としては、一般にヌクレオチドを標識して、核酸の検出や定量に用いられるものが好適に使用でき、例えば、ＨＥＸ（4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxylfluorescein、緑色蛍光色素）、フルオレセイン（fluorescein）、ＮＥＤ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄色蛍光色素）、あるいは、６−ＦＡＭ（商品名、アプライドバイオシステムズ社製、黄緑色蛍光色素）、ローダミン（rhodamin）またはその誘導体〔例えば、テトラメチルローダミン（TMR）〕を挙げることができるが、これらに限定されない。蛍光色素でヌクレオチドを標識する方法は、公知の標識法のうち適当なものを使用することができる〔Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)参照〕。また、市販の蛍光標識キットを使用することもできる（例えば、アマシャム・ファルマシア社製、オリゴヌクレオチドＥＣＬ ３’−オリゴラベリングシステム等）。
【０１０６】
また、本発明のプライマーには、その末端に多型検出のためのリンカー配列が付加されたものも含まれる。このようなリンカー配列としては、例えば、前述したインベーダー法で用いられるオリゴヌクレオチド５’末端に付加される、フラップ（多型近傍の配列とは全く無関係な配列）等が挙げられる。
【０１０７】
以上の、プローブまたはプライマー（標識されていてもよい）は、糖尿病性腎症罹患リスクの診断用試薬として利用することができる。
【０１０８】
（5-4）糖尿病性腎症罹患リスク診断用試薬キット（診断キット）
本発明の診断キットは、糖尿病性腎症罹患リスクの診断に使用する試薬として、上記プローブまたはプライマーとして用いられるオリゴまたはポリヌクレオチド（なお、これらは標識されていても、また固相に固定化されていてもよい）を少なくとも１つ含むものである。本発明の診断キットは上記プローブまたはプライマーの他、必要に応じてハイブリダイゼーション用の試薬、プローブの標識、ラベル体の検出剤、緩衝液など、本発明の方法の実施に必要な他の試薬、器具などを適宜含んでいてもよい。
【０１０９】
６．糖尿病性腎症の予防又は治療剤
後述する実施例３に示すように、ＥＨＦ遺伝子のsiＲＮＡによると、ＥＨＦ遺伝子を導入した細胞におけるＥＨＦ ｍＲＮＡの発現が抑制されるとともに、podocalyxin遺伝子の発現を促進することができる。このことから、ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するsiＲＮＡは、糖尿病性腎症の予防又は治療剤の有効成分として使用することができることがわかる。
【０１１０】
ゆえに本発明は、ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するsiＲＮＡを有効成分とする糖尿病性腎症の予防又は治療剤を提供する。
【０１１１】
本発明が対象とするsiＲＮＡは、二本鎖であり、ＥＨＦ遺伝子の標的配列に相補的な配列であるセンス鎖と該センス鎖に相補的な配列であるアンチセンス鎖がハイブリダイズしてなっている。かかるsiＲＮＡは、ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するものであれば特に制限されないが、好ましくは配列番号７に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、その相補鎖として配列番号８に示される塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる二本鎖ＲＮＡを挙げることができる。
【０１１２】
本発明の予防または治療剤は、上記のＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するsiＲＮＡに加え、任意の担体や添加剤、例えば医薬上許容される担体および添加剤を含むことができる。
【０１１３】
医薬上許容される担体および添加剤としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤；セルロース、メチルセルロース等の結合剤；デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤；クエン酸、メントール等の芳香剤；安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤；クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤；メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤；界面活性剤等の分散剤；水、生理食塩水等の希釈剤；ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１１４】
経口投与に好適な製剤としては、液剤、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤、懸濁液剤、乳剤等を挙げることができる。非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、非経口的な投与製剤としては、他に水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。
【０１１５】
本発明の予防または治療剤の投与量は、投与対象となる被験者の体重や年齢、並びに病気の重篤度等によって異なり、一概に設定することはできないが、例えば、成人１日あたり有効成分量として約０．１〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重を挙げることができる。
【０１１６】
本発明の予防・治療剤は、糖尿病性腎症の予防または治療に有効に使用することができる。
【実施例】
【０１１７】
本発明を、下記実施例等により説明するが、本発明は、かかる実施例に限定されるものではない。また、以下の実施例において、遺伝子操作、細胞培養等には、特に断りのない限り、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience)等に記載された方法を用いた。
【０１１８】
実施例１ ゲノムワイドSNPs解析
（１）対象２型糖尿病患者
インフォームドコンセントの下、滋賀医科大学、東京女子医科大学、順天堂大学、川崎医科大学、岩手医科大学、取手協同病院、川井クリニック、大阪市立総合医療センター、千葉徳洲会病院、または大阪労災病院に定期的に来診する２型糖尿病患者を対象として実験を行なった。
【０１１９】
なお、対象とした２型糖尿病患者は、下記診断基準に従って２つのグループに分類した：
1）糖尿病性腎症症例（94症例）：糖尿病網膜症と、明らかな糖尿病性腎症（尿中アルブミン排泄率が200μg/分を超えるか、若しくは尿中アルブミン/クレアチニン比が300mg/gCrを超える)とを伴う患者、又は慢性透析療法を受けている患者、
2）対照群（94症例）：腎機能障害の兆候は示していないが糖尿病網膜症を伴う患者（尿中アルブミン排泄率が20μg/分未満か、若しくは尿中アルブミン/クレアチニン比が30mg/gCr未満）。
【０１２０】
（２）DNA試料の調製
前記２型糖尿病患者の末梢血液を採血し、得られた末梢血液10mlを3000回転で5分間遠心分離して、血清を除去した。ついで、得られた産物に、赤血球溶解液を添加して、室温で20分間インキュベートした。その後、インキュベーション後の混合物を、3000回転で5分間遠心分離して、上清を除去した。得られた沈殿に、プロティナーゼＫを添加し、37℃で4時間以上インキュベートした。得られた産物を、フェノール−クロロホルムで処理し、得られた上層(水層)を回収し、これにイソプロパノールを添加して、DNAの沈殿を生じさせた。ついで、これを遠心分離(12000回転、10分）してDNAを回収し、1mlの70v/v%エタノール含有水溶液（含水エタノール）を添加し、得られたDNAのペレットをTE緩衝液（組成：10mM Tris-HCl, 1mM EDTA(pH8.0)）に溶解し、DNA試料を得た。
【０１２１】
（３）遺伝子型の判定
斯くして調製したDNA試料を用いて、インベーダー法により遺伝子型の判定を行った。解析するSNPは、Japanese SNPデータベース(IMS-JST SNPsデータベース:http://snp.ims.u-tokyo.ac.jp)から無作為に選択した。各SNP遺伝子座の遺伝子型を、Multiplex PCRと組み合わせたインベーダー法（例えば、オオニシ(Ohnishi Y.)ら，J. Human. Genet., 46, 471-477, 2001等を参照のこと）により解析した。
【０１２２】
より詳細な遺伝子多型の検索をダイレクトシーケンス法にて行った。ETS ホモローガス ファクター（EHF）を含むゲノム配列に関連するジーンバンク(GenBank)の情報を基にデザインしたPCRプライマーを用いて、標的部位を増幅した。また、PCRプライマーのデザインに際して、ベッデル(Bedell)ら、（Bioinformatics, 16, 1040-1041, 2000）に記載されたように、商品名「REPEAT MASKERプログラム」（ワシントン大学より供給。ウェブページアドレス：http://repeatmasker.genome.washington.eduにて利用可能）により、検索対象から反復エレメントを排除した。
【０１２３】
Multiplex PCRで採用した反応溶液および反応条件は、次の通りである：
反応溶液
組成：16.6mM (NH4)2SO4, 67mM Tris(pH8.8), 6.7mM MgCl2, 10mM 2-メルカプトエタノール, 6.7μM EDTA, 1.5mM dNTP, 10xTaqミックス(2.5U/μl Taq DNAポリメラーゼ, 31.25U/μl Taq Antibody), 0又は10% DMSO, 各0.25μMプライマー。
【０１２４】
反応条件
95℃, 5分の反応後、95℃で15秒と60℃で45秒と72℃で3分とを1サイクルとする反応を40サイクル。
【０１２５】
上記Multiplex PCRで増幅された産物をdH2Oで、1：11に希釈し、384プレートの各ウェルに分注した。ついで、プレートを風乾し、プレート上の各ウェルに、3μlインベーダー反応液(組成：10x緩衝液、10x FRETプローブ、10x cleavase、アレルプローブ）を添加した。その後、63℃で20分間インキュベートし、ついで、プレートの各ウェルについて、蛍光（励起波長：520nm, 蛍光波長：546nm）を測定した。
【０１２６】
一方、TaqMan PCR は、下記の反応条件で行った。
【０１２７】
ゲノムDNA（1ng/well）を384プレートの各ウェルに分注した後、風乾し、これに反応溶液（組成：10x ExTaq Buffer, dNTP 0.2mM, ExTaq HS 0.5U, primer & probe mix 0.125μl）5mlを加え、50℃で2分間、95℃で10分間反応させた後、92℃で15秒と60℃で1分とを1サイクルとする反応を35サイクル行なう。
【０１２８】
斯くしてTaqMan PCRで増幅された産物についても、上記と同様にして蛍光（励起波長：520nm, 蛍光波長：546nm）を測定して遺伝子型を判定した。
【０１２９】
（４）SNPの選択
糖尿病性腎症症例の94検体及び対照群の94検体のそれぞれに対し、81315個のSNP座について遺伝子タイピングを行なった。ついで、2x3分割表又は2x2分割表を用いた統計学的データを評価することにより、糖尿病性腎症症例と対照群との間の遺伝子型又は対立遺伝子頻度に、有意な差異を示したSNPを選択した。
【０１３０】
なお、相関解析、ハプロタイプ頻度及びHardy-Weinberg平衡の統計解析並びに連鎖不均衡係数(D’)の算出は、デブリン(Devlin B.)ら（Genomics, 29, 311-322, 1995）及びニールセン(Nielsen DM.)ら（Am. J. Hum. Genet., 63, 1531-1540, 1998）の方法に従って行なった。
【０１３１】
以上のスクリーニングにおいて、糖尿病性腎症症例の患者と対照群の個体との間で0.01未満のp値を示したSNP座を、さらに多数の患者を対象として、ゲノムワイドで解析した。
【０１３２】
その結果、ある特定のＳＮＰ座（rs717582）において、糖尿病性腎症との強い相関が認められた。当該ＳＮＰは、第11番染色体上のETS ホモローガス ファクター（EHF）遺伝子のイントロン1（配列番号１）に存在し、この48番目に位置するＳＮＰのシトシン対立遺伝子頻度が、糖尿病性腎症群で対照群に比し有意に高くなっていた。
【０１３３】
なお、このＳＮＰ座（rs717582）領域を増幅するために使用したプライマーの塩基配列を配列番号２および３に、またこの領域のＳＮＰを含む増幅領域を検出するために使用したインベーダープローブの塩基配列を配列番号４に示す。また当該ＳＮＰを含む増幅領域のＴ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子を検出するためのアレルプローブの塩基配列を、それぞれ配列番号５および６に示す。
【０１３４】
このSNPのアレル頻度を、糖尿病性腎症症例と対照群とで対比した結果を表１に示す。
【０１３５】
【表１】
【０１３６】
表２に遺伝子型分布を示す。
【０１３７】
【表２】
【０１３８】
かかる検討結果から、このＳＮＰ座(rs717582)におけるＣ対立遺伝子保有者では、糖尿病性腎症の発症リスクが、Ｔ対立遺伝子非保有者に比べて、有意に高くなっていることが明らかとなった。
【０１３９】
実施例２ Pod-7細胞へのEHF導入によるpodocalyxin発現変動の確認
ラット糸球体上皮細胞株Pod-7に、ETS ホモローガスファクター（EHF）を過剰発現させ、podocalyxin発現の変動を調べた。
【０１４０】
（１）方法
Pod-7細胞(2 x 104 cells/0.5ml/well)を10%血清入りD-MEM/F-12培地を用いて24ウェルプレートに蒔いて37℃, 5% CO2環境下で培養を開始した。翌日に、これにhuman EHF遺伝子またはGFP遺伝子の発現ベクターを含むレトロウィルスを添加し(各々0.4μl、2μl、10μl)、4時間感染させた後に培地を除いて、血清入り培地に置換した。感染3日後に6ウェルプレートに蒔いて培養を継続し、さらに3日後に100mmディッシュ3枚に蒔いて培養を継続した。2日後（感染からは8日後）に溶解剤を加えて、常法に従いtotal RNAをカラム抽出した。次に、5μg相当量のtotal RNAを逆転写してPCR用のtemplateとし、合成primerを用いて定量real-time PCR法にてEHF mRNA量、podocalyxin mRNA量およびNHERF2 mRNA量を測定した。この時、同時測定したGAPDH mRNA量によって補正し、相対値とした。
【０１４１】
（２）結果
Pod-7細胞を、human EHF遺伝子またはGFP遺伝子発現ベクターを含むレトロウィルスを用いて感染導入し、得られた細胞におけるpodocalyxin mRNA発現を定量real-time PCR法にて確認した。
【０１４２】
結果を図１a〜cに示す。図1aに示すように、EHF感染量が多くなるにつれて用量依存的にpodocalyxin mRNAの発現率が低下した。この時、図1bに示すように、EHF感染量が多くなるにつれて用量依存的にEHF mRNA発現が増加していた。一方、図1cに示すように、EHFの感染量が多くなるにつれてNHERF2発現率は低下傾向にあった。
【０１４３】
（３）考察
以上の結果から、糸球体濾過機能に重要なpodocalyxinの発現はEHFの導入によって低下することがわかり、EHFは腎症においては病態悪化因子であることが示された（図１a）。さらに、podocalyxinと細胞内アクチン骨格とを仲介しているpodocalyxinの細胞内裏打ちタンパクであるNHERF2の発現は、EHFの導入によって低下する傾向にあることが分かった（図１c）。すなわち、上記のことから、EHFがpodocalyxinのみならずpodocalyxinの細胞内結合因子の発現の抑制を介しても、腎症の悪化に関わっている可能性が示された。
【０１４４】
実施例3 EHF感染導入Pod-7細胞でのpodocalyxin発現量変動の可逆性の解析
EHF感染導入Pod-7細胞におけるEHF発現をsiRNAによって抑制し、podocalyxin発現の回復の有無を調べた。
【０１４５】
（１）方法
上記の結果から、EHF感染によるpodocalyxinの発現制御は可逆的であることが示された。このことは、EHFの発現を抑制することにより、podocalyxinの発現を促進させて腎症の治療が可能となることを示唆するものである。
【０１４６】
実施例4 糖尿病性腎症モデルマウスでのEHF発現の確認
糖尿病性腎症モデルマウス(db/dbマウス) の腎皮質におけるEHF発現を、定量PCRを用いて調べた。
【０１４７】
（１）方法
糖尿病性腎症モデルマウス（db/dbマウス）およびC57BL/6 leanマウス(いずれも13週齢)から腎臓を採取し、PBSにて灌流後、腎皮質組織片を採取し、溶解剤を加えて常法に従いtotal RNAを抽出した。次に、1.1μg相当量のtotal RNAを逆転写してPCR用のtemplateとし、合成primerを用いて定量real-time PCR法にてEHF mRNA量を測定した。この時、同時に測定した36B4 mRNA量によって補正し、36B4 mRNA量に対する相対値（EHF mRNA量/36B4 mRNA量）として算出した。
【０１４８】
また、上記方法で採取した腎皮質部位の一部を免疫組織化学用にTISSUE-TEK(MILES)に包埋して凍結した。クライオスタットで薄切片を作成後、2% PFA/4% Sucrose/PBSで10分間固定し、さらに0.3% Triton X-100/PBSで10分間透過化処理を行った。10% FBS/PBSで50分間ブロッキングした後、抗podocalyxin抗体(自製抗体、x100 diluted/10% FBS/PBS)を用いて室温で2時間反応を行った。0.1% Tween20/PBSによる5分間の洗浄を3回行った後、2次抗体（抗ウサギポリクローナル抗体; x100 diluted/PBS）を用いて室温で1時間反応を行った。0.1% Tween20/PBSによる5分間の洗浄を3回行った後、10% PBS/glycerolで包埋し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。
【０１４９】
（２）結果
db/dbマウスおよびC57BL/6 leanマウスの腎皮質におけるEHFの発現量（EHF mRNA量/36B4 mRNA量）を図３aに、また各腎皮質凍結切片の免疫組織画像を図３bに示す。
【０１５０】
図３aに示すように、腎皮質におけるEHF発現は、C57BL/6 leanマウスに比べて糖尿病性腎症モデルマウス（db/dbマウス）でEHF発現が増加していた(n=2 平均値をグラフ化)。また、図３bに示すように、podocalyxinの発現は糸球体上皮細胞で強く発現していたが、C57BL/6 leanマウスに比べて糖尿病性腎症モデルマウス（db/dbマウス）ではその発現が低下していた。
【０１５１】
（３）考察
以上示すように、糖尿病性腎症モデルマウス(db/dbマウス)ではEHFの発現が亢進しており（図３a）、逆に糸球体上皮細胞でのpodocalyxinの発現が低下していたことから（図３b）、糖尿病性腎症の病態において、EHF発現が増加し、その結果podocalyxin発現が低下して腎症を悪化させている可能性が示唆された。
【０１５２】
実施例5 EHF発現を亢進させる因子の探索
EHFの発現を増加させる因子を探索した。
【０１５３】
（１）方法
Pod-7細胞(1 x 105 cells/2ml/well)を、10%血清入りD-MEM培地を用いて6ウェルプレートに蒔いて37℃, 5% CO2環境下で培養を開始した。翌日に血清を除去して培養を続け、さらに翌日、(a)TNF-α(5ng/ml)添加、(b)IL-1β(5ng/ml)添加、または(c)両因子添加〔TNF-α(5ng/ml)＋IL-1β(5ng/ml)〕を行って刺激を開始し、7.5時間後に溶解剤を加えて常法に従いtotal RNAを抽出した。次いで1μg相当量のtotal RNAを逆転写してPCR用のtemplateとし、合成primerを用いて定量real-time PCR法にてEHF mRNA量を測定した。この時、同時測定したGAPDH mRNA量によって補正し、GAPDH mRNA量に対する相対値（EHF mRNA量/GAPDH mRNA量）を算出した。
【０１５４】
（２）結果
結果を図４に示す。図４に示すように、Pod-7細胞に対して(a)TNF-α添加、(b)IL-1β添加、および(c)両因子添加を行った際のEHF mRNA発現は、TNF-α添加によっては殆ど変化なかったが、IL-1β添加によって約1.4倍増加した。また、TNF-αおよびIL-1βを同時に添加することにより、EHF mRNA発現は約2倍にまで増加した。
【０１５５】
（３）考察
以上のことから、炎症性サイトカインであるIL-1βによってEHF発現が亢進すること、特にTNF-αおよびIL-1βの併用によってEHF発現が相乗的に亢進することが判明した。糖尿病には肥満を伴って炎症性サイトカインの発現亢進が認められる場合があることから、上記の結果は、糖尿病によりEHF発現が上昇する可能性を示唆するものであった。
【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】実施例２において、ＥＨＦ遺伝子を過剰に発現させるように導入したPod-7細胞における各遺伝子〔podocalyxin（図a）、EHF（図b）、NHERF2（図c）〕の発現を検討した結果を示す。対照として、通常のPod-7細胞（intact）、GFP（Green Fluorescent Protein）を過剰に発現させたPod-7細胞を用いて、同様に各遺伝子の発現を検討した結果を併せて示す。
【図２】実施例３において、ＥＨＦ遺伝子を発現させるように導入したPod-7細胞において、ＥＨＦの発現をsiRNAで抑制させた場合の、ＥＨＦの発現量（EHF mRNA量）（図a）とpodocalyxinの発現量（podocalyxin mRNA量）（図ｂ）を調べた結果を示す。対照として、EHF siRNAに代えてnegative control siRNAを用いて、同様に各遺伝子の発現を検討した結果を併せて示す。なお、結果は、同時に測定したGAPDH mRNAの量との相対比（Ratio）で示す。
【図３】実施例４において、糖尿病性腎症モデルマウス（db/dbマウス）と正常マウス（C57BL/6 leanマウス）の腎臓におけるＥＨＦの発現量（EHF mRNA量）（図ａ）、およびpodocalyxinの発現量（図ｂ）を調べた結果を示す。なお、図ａの縦軸は、同時に測定したGAPDH mRNAの量との相対比（Ratio）を示す。
【図４】実施例５において、ＥＨＦ遺伝子を発現させるように導入したPod-7細胞を、炎症性サイトカインである(a)TNF-α、(b)IL-1β、(c)TNF-α+IL-1βの存在下または非存在下（intact）で培養した場合における、ＥＨＦの発現量（EHF mRNA量）を調べた結果を示す。なお、縦軸は、同時に測定したGAPDH mRNAの量との相対比（Ratio）を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１５７】
配列番号１は、EHF遺伝子イントロン１における１位〜１００位の塩基配列を示す。
配列番号２および３は、rs717582領域を増幅するためのプライマーの塩基配列を示す。
配列番号４はSNPを含む増幅領域を検出するためのインベーダープローブの塩基配列を、配列番号５はSNPを含む増幅領域のＴ対立遺伝子を検出するためのアレルプローブの塩基配列を、また配列番号６はSNPを含む増幅領域のＣ対立遺伝子を検出するためのアレルプローブの塩基配列を、それぞれ示す。
配列番号７および８は、EHF siRNA（Invitrogen社の「STEALTH SELECT RNA」の二本鎖RNAの塩基配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１）被験物質とＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【請求項２】
下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１’）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（２’）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＥＨＦの産生量を測定する工程、及び
（３’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞もしくはその細胞画分のＥＨＦの産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【請求項３】
下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（1”）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分を接触させる工程、
（2”）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＥＨＦの作用を検出する工程、及び
（3”）上記で検出した作用が、被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画分のＥＨＦの作用よりも小さい被験物質を選択する工程。
【請求項４】
ＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞またはＥＨＦを産生可能な細胞が、糸球体上皮細胞である請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
糖尿病性腎症の予防または治療剤の有効成分を探索する方法である請求項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
被験者由来の被験試料におけるＥＨＦのｍＲＮＡ発現量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該発現量が、正常人由来の対照試料におけるＥＨＦのｍＲＮＡ発現量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いとの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【請求項７】
被験者由来の被験試料におけるＥＨＦの産生量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該産生量が、正常人由来の対照試料におけるＥＨＦの産生量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【請求項８】
被験者由来の被験試料におけるＥＨＦ遺伝子のイントロン1に存在する48番目における塩基を検出する工程を含み、これらの塩基がシトシンであることを、上記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【請求項９】
ＥＨＦ遺伝子のイントロン1に存在する48番目における塩基を検出するための試薬を含む、糖尿病性腎症の罹患性診断キット。
【請求項１０】
ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するsiＲＮＡを有効成分として含む糖尿病性腎症の予防又は治療剤。
【請求項１】
下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１）被験物質とＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞とを接触させる工程、
（２）被験物質を接触させた細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量を測定する工程、及び
（３）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞のＥＨＦ遺伝子の発現量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【請求項２】
下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（１’）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分とを接触させる工程、
（２’）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＥＨＦの産生量を測定する工程、及び
（３’）上記の測定量が、被験物質を接触させない対照細胞もしくはその細胞画分のＥＨＦの産生量よりも小さい被験物質を選択する工程。
【請求項３】
下記の工程を有する、糖尿病性腎症の予防または治療剤をスクリーニングする方法：
（1”）被験物質とＥＨＦを産生可能な細胞またはこの細胞から調製した細胞画分を接触させる工程、
（2”）被験物質を接触させた細胞またはその細胞画分のＥＨＦの作用を検出する工程、及び
（3”）上記で検出した作用が、被験物質を接触させない対照細胞またはその細胞画分のＥＨＦの作用よりも小さい被験物質を選択する工程。
【請求項４】
ＥＨＦ遺伝子を発現可能な細胞またはＥＨＦを産生可能な細胞が、糸球体上皮細胞である請求項１〜３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
糖尿病性腎症の予防または治療剤の有効成分を探索する方法である請求項１〜４のいずれかに記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
被験者由来の被験試料におけるＥＨＦのｍＲＮＡ発現量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該発現量が、正常人由来の対照試料におけるＥＨＦのｍＲＮＡ発現量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いとの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【請求項７】
被験者由来の被験試料におけるＥＨＦの産生量を測定する工程を含み、ここで、被験試料における当該産生量が、正常人由来の対照試料におけるＥＨＦの産生量よりも大きいことを、前記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【請求項８】
被験者由来の被験試料におけるＥＨＦ遺伝子のイントロン1に存在する48番目における塩基を検出する工程を含み、これらの塩基がシトシンであることを、上記被験者が糖尿病性腎症に罹患する可能性が高いことの指標とする、糖尿病性腎症に罹患する可能性が高い被験者の選別方法。
【請求項９】
ＥＨＦ遺伝子のイントロン1に存在する48番目における塩基を検出するための試薬を含む、糖尿病性腎症の罹患性診断キット。
【請求項１０】
ＥＨＦ遺伝子の発現を抑制するsiＲＮＡを有効成分として含む糖尿病性腎症の予防又は治療剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−１１５１１５（Ｐ２０１０−１１５１１５Ａ）
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２８８３４８（Ｐ２００８−２８８３４８）
【出願日】平成２０年１１月１１日（２００８．１１．１１）
【出願人】（０００００１９２６）塩野義製薬株式会社 (229)
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２７日（２０１０．５．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１１月１１日（２００８．１１．１１）
【出願人】（０００００１９２６）塩野義製薬株式会社 (229)
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【Ｆターム（参考）】
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