本発明は、ヒト癌療法に使用するための組み換え抗体の分野に関する。より具体的には、本発明は、ヒトＥＧＦＲに結合することが可能な抗体の組成物または混合物を提供する。３つもしくはそれ以上の抗体を伴う抗体組成物は、代表的な癌細胞系統の増殖の減少において相乗作用を示している。迅速かつ効率的な受容体内在化、最終分化の誘導および動物モデルにおけるその後の腫瘍根絶に基づく新たな作用機序を示す異なる２つのキメラ抗ｈＥＧＦＲ抗体を含んでなる組成物に関してもまた、有利な結果が得られている。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体として１つのバイオリアクターにおいて製造することができる。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体がＥＧＦＲの別々の第１、第２および第３のエピトープに結合する、少なくとも３個の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子を含んでなる、組み換え抗体組成物。
【請求項２】
エピトープが重複していない、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
少なくとも１つの別々の抗体分子が、ＥＧＦ結合を阻害することが可能である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
少なくとも１つの別々の抗体分子が、ＥＧＦＲのリン酸化を防止することが可能である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
少なくとも１つの別々の抗体分子が、ＥＧＦＲの内在化／分解を増強することが可能である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
さらなる抗体が第４の別々のエピトープに結合する、少なくとも１つのさらなる別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
さらなる抗体が第５の別々のエピトープに結合する、少なくとも１つのさらなる別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子を含んでなる、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
さらなる抗体が第６の別々のエピトープに結合する、少なくとも１つのさらなる別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子を含んでなる、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
少なくとも１つのドメインＩＩＩ抗体および少なくとも１つのドメインＩ／ＩＩ抗体を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
少なくとも２つのドメインＩＩＩ抗体および１つのドメインＩ抗体を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
少なくとも２つのドメインＩＩＩ抗体、例えば、少なくとも３つのドメインＩＩＩ抗体を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
少なくとも１つのさらなる抗体の、異なる別々のエピトープへの結合を増強することが可能な少なくとも１つの抗体を含んでなる、請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
抗体が、マウス可変鎖およびヒト定常鎖を伴うキメラ抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
ヒト定常鎖がＩｇＧ１またはＩｇＧ２である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
少なくとも１つの抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
少なくとも１つの抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
ＥＧＦＲが、ヒトＥＧＦＲ、変異型ヒトＥＧＦＲ、およびヒトＥＧＦＲの欠失変異からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
ＥＧＦＲがヒトおよび非ヒト霊長類ＥＧＦＲの両方のものである、請求項１７に記載の抗体。
【請求項１９】
１つの別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体：９９２、１０２４、１０３０、１０４２、１２０８、１２２９、１２５４、１２５７、１２６０、１２６１、１２７７、１２８４、１３０８、１３２０、１３４４、および１３４７のＣＤＲを有する抗体よりなる群から選択される、少なくとも２つの別々のＥＧＦＲ抗体分子を含んでなる、組み換え抗体組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つの別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体９９２、１０３０、１０２４、１３４７、１２７７、１２５４、１３２０、１２６０、１２６１、および１２８４のＣＤＲを有する抗体よりなる群から選択される、請求項１９に記載の組み換え抗体組成物。
【請求項２１】
２つの別々のＥＧＦＲ抗体分子が、抗体：９９２＋１０３０、９９２＋１０２４、９９２＋１０４２、９９２＋１３２０、１２７７＋１０２４のＣＤＲを伴う抗体よりなる組み合わせの群から選択される、請求項１９に記載の組み換え抗体組成物。
【請求項２２】
少なくとも２つの別々の抗ヒトＥＧＦＲ抗体分子を含んでなる抗体組成物であって、
ａ．第１の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体９９２、抗体９９２のＶＬ（配列番号７２のアミノ酸３〜１０９）およびＶＨ（配列番号４０のアミノ酸３〜１２４）配列を含んでなる抗体、抗体９９２のＣＤＲ３（配列番号１１６および１１１）を有する抗体、抗体９９２と同じエピトープに結合する抗体、および抗体９９２のヒトＥＧＦＲへの結合を阻害することが可能な抗体よりなる群から選択され；ならびに
ｂ．第２の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体１０２４、抗体１０２４のＶＬ（配列番号７３のアミノ酸３〜１１４）およびＶＨ（配列番号４１のアミノ酸３〜１２０）配列を含んでなる抗体、抗体１０２４のＣＤＲ３（配列番号１２０および１１４）を有する抗体、抗体１０２４と同じエピトープに結合する抗体、および抗体１０２４のヒトＥＧＦＲへの結合を阻害することが可能な抗体よりなる群から選択される、
抗体組成物。
【請求項２３】
ａ．前記第１の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体９９２、抗体９９２のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体、抗体９９２のＣＤＲ３を有する抗体、および抗体９９２と同じエピトープに結合する抗体よりなる群から選択され；ならびに
ｂ．前記第２の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体１０２４、抗体１０２４のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体、抗体１０２４のＣＤＲ３を有する抗体、および抗体１０２４と同じエピトープに結合する抗体よりなる群から選択される、
請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ａ．前記第１の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体９９２、抗体９９２のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体、および抗体９９２のＣＤＲ３を有する抗体よりなる群から選択され；ならびに
ｂ．前記第２の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体１０２４、抗体１０２４のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体、および抗体１０２４のＣＤＲ３を有する抗体よりなる群から選択される、
請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
ａ．前記第１の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体９９２、および抗体９９２のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体よりなる群から選択され；ならびに
ｂ．前記第２の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体１０２４、および抗体１０２４のＶＬおよびＶＨ配列を含んでなる抗体よりなる群から選択される、
請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
抗体９９２および１０２４を含んでなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２７】
第１および第２の抗ＥＧＦＲ抗体が、ヒトＥＧＦＲへの結合を相互に阻害しない、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２８】
抗体の少なくとも１つが、ヒトＥＧＦＲに関する他の抗体の最大結合能を増加させることが可能である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２９】
組成物における第２の抗体に対する第１の抗体の割合が、５〜９５％の間、例えば、１０〜９０％の間、好ましくは、２０〜８０％の間、より好ましくは、３０〜７０の間、より好ましくは、４０〜６０の間、例えば、４５〜５５の間、例えば、約５０％である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３０】
第１および第２の抗体がアイソタイプＩｇＧ１、またはＩｇＧ２である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３１】
抗体９９２と同じエピトープに結合する抗体が、クローン１２０９、１２０４、９９２、９９６、１０３３、および１２２０を含んでなる抗体クラスターから選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３２】
抗体１０２４と同じエピトープに結合する抗体が、クローン１０３１、１０３６、１０４２、９８４、１０２４、１２１０、１２１７、１２２１、および１２１８を含んでなる抗体クラスターから選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３３】
抗体９９２のＣＤＲ３を含んでなる抗体が、抗体９９２のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１およびＣＤＲ２をさらに含んでなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３４】
抗体１０２４のＣＤＲ３を含んでなる抗体が、抗体１０２４のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１およびＣＤＲ２をさらに含んでなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３５】
抗体９９２と競合する抗体が、抗体１２０８、１２５４、および１２７７よりなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３６】
抗体１０２４と競合する抗体が、抗体１０４２および１３２０よりなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３７】
組成物が、前記第１および第２の抗体の他にさらなる抗ＥＧＦＲ抗体を含有しない、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３８】
前記第３の別々の抗ＥＧＦＲ抗体分子が、抗体１０３０、抗体１０３０のＶＬ（配列番号７４のアミノ酸３〜１１４）およびＶＨ（配列番号４２のアミノ酸３〜１２０）配列を含んでなる抗体、抗体１０３０のＣＤＲ３（配列番号１１２および１１９）を有する抗体、抗体１０３０と同じエピトープに結合する抗体、ならびに抗体１０３０のヒトＥＧＦＲへの結合を阻害することが可能な抗体よりなる群から選択される、第３の別々の抗ＥＧＦＲ抗体をさらに含んでなる、請求項２２に記載の組成物。
【請求項３９】
前記第３の抗体が、前記第１および／または第２の抗体のヒトＥＧＦＲへの増強された結合を生じる、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
抗体１０３０と同じエピトープに結合する抗体が、クローン１１９５、１０３０、１０３４、１１９４、９８０、９８１、１２４６、および１２２３からなる抗体クラスターから選択される、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４１】
抗体１０３０のＣＤＲ３を含んでなる抗体が、抗体１０３０のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ１およびＣＤＲ２をさらに含んでなる、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４２】
組成物が、前記第１、第２、および第３の抗体の他にさらなる抗ＥＧＦＲ抗体を含有しない、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４３】
別々の抗体が、同時、連続または個別投与のために調製される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項４４】
組成物が受容体内在化をもたらす、請求項２２に記載の組成物。
【請求項４５】
組成物が、インビボにおけるＡ４３１ＮＳ腫瘍の退行をもたらす、請求項２２に記載の組成物。
【請求項４６】
組成物が、インビボでＡ４３１ＮＳ細胞における最終分化を誘導することが可能である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項４７】
組成物が、インビボで腫瘍のインボルクリン発現を上方調節することが可能である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項４８】
請求項２２に記載の抗体組成物の結合特異性を有する二重特異性結合分子。
【請求項４９】
抗体９９２および１０２４のＣＤＲを含んでなる、請求項４８に記載の二重特異性結合分子。
【請求項５０】
二重可変ドメイン抗体である、請求項４８に記載の二重特異性結合分子。
【請求項５１】
二重特異性Ｆａｂフラグメントまたは二重特異性ｓｃＦＶである、請求項４８に記載の二重特異性結合分子。
【請求項５２】
ａ）第１の別々のＥＧＦＲエピトープに結合することが可能なＶ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖の第１の同族ペアを含んでなる第１の抗体をコードする第１の発現構築物で真核細胞の第１の集団をトランスフェクトすること；
ｂ）第２の別々のＥＧＦＲエピトープに結合することが可能なＶ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖の第２の同族ペアを含んでなる第２の抗体をコードする第２の発現構築物で真核細胞の第２の集団をトランスフェクトすること；
ｃ）任意選択的に、第３またはさらなる集団、発現構築物、同族ペア、およびＥＧＦＲエピトープについて工程ｂ）を反復すること；
ｄ）トランスフェクトされた第１、第２集団、任意選択的にさらなる細胞集団を選択すること；
ｅ）トランスフェクトされた集団を１つのポット中で混合して細胞バンクを得ること；
ｆ）抗体の発現を可能にする条件下で細胞バンク由来の細胞を培養すること；次いで
ｇ）上清から抗体組成物を回収し、精製すること、
を含んでなる、抗体組成物を製造するための方法。
【請求項５３】
抗体組成物が、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体組成物である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
細胞が部位特異的組み込みによりトランスフェクトされる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ＶＨおよびＶＬ鎖がマウス由来であり、抗体の定常領域がヒト由来である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
全ての抗体が同一の重鎖定常領域を含んでなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
真核細胞の少なくとも２つのサブ集団を含んでなる細胞バンクであって；各サブ集団が、別々のＥＧＦＲエピトープに結合することが可能なＶ_ＨおよびＶ_Ｌ鎖の同族ペアを含んでなる抗体をコードする１つの発現構築物でトランスフェクトまたは形質導入される、細胞バンク。
【請求項５８】
細胞バンクが、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の抗体組成物をコードする、請求項５７に記載の細胞バンク。
【請求項５９】
細胞が、部位特異的組み込みによりトランスフェクトされる、請求項５７に記載の細胞バンク。
【請求項６０】
ＥＧＦＲを発現する細胞の組成物に、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の抗体組成物、または請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子を投与し、次いでＥＧＦＲシグナリングを減少させることを含んでなる、ＥＧＦＲシグナリングを減少させる方法。
【請求項６１】
ＥＧＦＲを発現する細胞の組成物に、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の抗体組成物、または請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子を投与し、次いでＥＧＦＲ発現細胞を死滅させることを含んでなる、ＥＧＦＲを発現する細胞を死滅させる方法。
【請求項６２】
ＥＧＦＲを発現する細胞の組成物に、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の抗体組成物、または請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子を投与し、それによりアポトーシスを誘導することを含んでなる、ＥＧＦＲを発現する細胞においてアポトーシスを誘導する方法。
【請求項６３】
ＥＧＦＲを発現する細胞の組成物に、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の抗体組成物、または請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子を投与し、それにより増殖を阻害することを含んでなる、ＥＧＦＲを発現する細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項６４】
癌を患う個体に、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の抗体組成物、または請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子を投与し、それにより腫瘍細胞の分化を誘導することを含んでなる、インビボで腫瘍細胞の分化を誘導する方法。
【請求項６５】
前記分化が最終的である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記分化が、インボルクリン発現の増加により達成される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
ＥＧＦＲを発現する細胞に、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の抗体の有効量、または請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子を投与し、それによりＥＧＦＲの内在化を誘導することを含んでなる、ＥＧＦＲの内在化を誘導するための方法。
【請求項６８】
癌療法における同時、個別もしくは連続投与のための組み合わせとして、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の２つもしくはそれ以上の抗体、または請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の二重特異性結合分子を含んでなる、医薬組成物。
【請求項６９】
癌療法における同時、個別または連続投与のための組み合わせとして、癌細胞の分化を誘導することが可能な少なくとも１つの化合物をさらに含んでなる、請求項６８に記載の物品。
【請求項７０】
化合物が、レチノイン酸、フェニル酪酸、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ−レチノイン酸、活性型ビタミンＤよりなる群から選択される、請求項６９に記載の物品。
【請求項７１】
癌療法における同時、個別または連続投与のための組み合わせとして、少なくとも１つの化学療法化合物または抗悪性腫瘍化合物をさらに含んでなる、請求項６８に記載の物品。
【請求項７２】
化学療法化合物が、アドリアマイシン、シスプラチン、タキソール、ドキソルビシン、トポテカン、フルオロピリミジン、オキサリプラチン、およびイリノテカンよりなる群から選択される、請求項７１に記載の物品。
【請求項７３】
ａ．配列番号１００に示される核酸配列を有する核酸；
ｂ．配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸；
ｃ．配列番号１０２に示される核酸配列を有する核酸；
ｄ．配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸；および
ｅ．ａ〜ｄのいずれかの相補配列を有する核酸、
よりなる群から選択されるポリヌクレオチド。
【請求項７４】
前記核酸の発現を指令することが可能なプロモーター配列に作動可能に連結された、請求項７３に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項７５】
請求項７４に記載の発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞。
【請求項７６】
配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド。
【請求項７７】
配列番号１０３に示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド。
【請求項７８】
以下の工程
ａ．少なくとも１つの試験抗体を提供すること；
ｂ．
ｉ）カニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号１０１）もしくは全長カニクイザルＥＧＦＲ（配列番号１０３）；または
ｉｉ）カニクイザルＥＧＦＲの細胞外ドメイン（配列番号１０１）もしくは全長カニクイザルＥＧＦＲ（配列番号１０３）を発現する細胞の表面；
に結合する抗体を決定するためのアッセイを実施すること、
ｃ．次いで、カニクイザルＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合する少なくとも１つの抗体を選択すること、
を含んでなる、カニクイザルＥＧＦＲに結合する抗体をスクリーニングするための方法。
【請求項７９】
ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメインへの結合またはヒトＥＧＦＲを発現する細胞への結合についてスクリーニングすることをさらに含んでなる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ＥＧＦＲに対する別の抗ＥＧＦＲ抗体の同時結合を増強することが可能な抗ＥＧＦＲ抗体を同定するための方法であって、前記方法が、
ａ．第１のアッセイにおいて、一定量のＥＧＦＲ抗原に関して第１の抗体の最大結合能を決定すること、
ｂ．第２のアッセイにおいて、一定量のＥＧＦＲ抗原を第２の抗ＥＧＦＲ抗体で飽和すること、
ｃ．ＥＧＦＲ−抗体複合体と、前記第１の抗体とを接触させ、最大結合能を決定すること、
ｄ．結合能を比較して、工程Ｃの最大結合能が工程ａの最大結合能を超えるかどうかを決定すること、
を含んでなる方法。
【請求項８１】
前記ＥＧＦＲ抗原が、固体表面上に固定化された組み換えタンパク質である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＥＧＦＲ抗原が、ＥＧＦＲを発現する細胞の表面上に提示される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
細胞がＥＧＦＲをコードする発現構築物を含んでなる、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
第１の抗体が免疫グロブリンであり、前記第２の抗体がＦａｂフラグメントである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８５】
アッセイがＥＬＩＳＡである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
ＥＧＦＲ抗原が、ヒトＥＧＦＲ細胞外ドメイン（配列番号１０８）またはカニクイザルＥＧＦＲ細胞外ドメイン（配列番号１０１）を含んでなる、請求項８０に記載の方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１−１】

【図１１−２】

【図１１−３】

【図１１−４】

【図１１−５】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６−１】

【図１６−２】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３Ａ】

【図２３Ｂ】

【図２４−１】

【図２４−２】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１Ａ】

【図３１Ｂ】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【図３３Ａ】

【図３３Ｂ】

【図３３Ｃ】

【図３４Ａ−１】

【図３４Ａ−２】

【図３４Ｂ】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０−１】

【図４０−２】

【図４０−３】

【図４１Ａ】

【図４１Ｂ】

【図４２−１】

【図４２−２】

【公表番号】特表２０１０−５３５０１２（Ｐ２０１０−５３５０１２Ａ）
【公表日】平成２２年１１月１８日（２０１０．１１．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５１１０２（Ｐ２００９−５５１１０２）
【出願日】平成２０年２月２７日（２００８．２．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＤＫ２００８／０５００４７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０４１８３
【国際公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【出願人】（５０５２５７６８２）シムフォゲン・アクティーゼルスカブ (24)
【氏名又は名称原語表記】ＳＹＭＰＨＯＧＥＮ　Ａ／Ｓ
【Ｆターム（参考）】